FI93277C - Testikoostumus ja -väline vetyperoksidin määrittämiseksi visuaalisesti - Google Patents
Testikoostumus ja -väline vetyperoksidin määrittämiseksi visuaalisesti Download PDFInfo
- Publication number
- FI93277C FI93277C FI884131A FI884131A FI93277C FI 93277 C FI93277 C FI 93277C FI 884131 A FI884131 A FI 884131A FI 884131 A FI884131 A FI 884131A FI 93277 C FI93277 C FI 93277C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- indicator
- hydrogen peroxide
- oxidized
- color
- oxidation
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
- C12Q2326/90—Developer
- C12Q2326/96—4-Amino-antipyrine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/805—Test papers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
- Medical Preparation Storing Or Oral Administration Devices (AREA)
- Color Image Communication Systems (AREA)
- Electrical Discharge Machining, Electrochemical Machining, And Combined Machining (AREA)
Description
1 93277
Testikoostumus ja -väline vetyperoksidin määrittämiseksi visuaalisesti
Esillä oleva keksintö käsittelee yleisesti testi-5 koostumuksia, joilla voidaan visuaalisesti määrittää vetyperoksidia, erityisesti testikoostumuksia ja testivälinei-tä, jotka voivat tuottaa erilaisia värisävyjä erilaisilla vetyperoksidin konsentraatioilla.
Kolorimetrisia testejä on konventionaalisesti käy-10 tetty visuaalisina testeinä, joiden avulla suhteellisen harjaantumattomat henkilöt voivat rutiinimaisesti saada tuloksia yksinkertaisesti vertaamalla sopivaan värikarttaan. Visuaaliset testit ovat halpoja ja käyttökelpoisia, koska laitteita ei tarvita lainkaan. Tällä hetkellä vi-15 suaalisia testejä käytetään seulottaessa rutiinimaisesti virtsanäytteitä joukolle diagnostisesta merkittäviä ana-lyyttejä. Tällaisia testejä käyttävät esimerkiksi sokeritautiset kotona tutkiessaan virtsan tai veren glukoosia, ja visuaalisia testejä käytetään myös muilla alueilla, 20 kuten veden rautapitoisuuden määrityksessä. Monet tällaiset kokeet perustuvat vetyperoksidin havaitsemiseen perok-sidaasin ja hapetusindikaattorin läsnä ollessa.
Tällä hetkellä käyttökelpoiset testit tavallisesti vertaavat erityisen värin intensiteettiä analyytin konsen-*:25 traatioon. Esimerkiksi testiväline voi muuttua värittömästä vaaleansiniseen ja sinisen tummempiin sävyihin glukoosin konsentraation kasvaessa. Suurempi visuaalinen erottelu ja siten tarkempi tulos on mahdollista saavuttaa, kun saadaan eri värien sarja pikemmin kuin yhden yksittäisen 30 värin erilaisia sävyjä tai voimakkuuksia. Siten testikoos- . · · _* tumus, jolla saadaan erilaisia värejä (värisävyjä) erilai silla analyyttipitoisuuksilla, olisi helpompi käyttää ja sillä saataisiin tarkempia visuaalisia tuloksia.
Keksinnön mukaiset koostumukset tarjoavat käyttö-35 kelpoisen hapetusindikaattorisysteemin, ja ne ovat erityi- 2 93277 sen käyttökelpoisia määritettäessä visuaalisesti kliinisesti tärkeitä analyyttejä, kuten glukoosia ja kolesterolia, kun lisätään oksidaasia, joka on spesifinen kiinnostavalle analyytille.
5 On esitetty monia systeemejä, joita käytetään mää ritettäessä kolorimetrisesti vetyperoksidia tai analyyttejä, jotka voidaan määrittää käyttäen vetyperoksidia vapauttavia systeemejä. Glukoosin määrityksen tärkeyden takia esitetään monissa havainnointisysteemeissä glukoosi-10 oksidaasi ja peroksidaasi/hapetusindikaattorisysteemi, jotta saadaan kolorimetrinen tuote. Vetyperoksidin määrittämiseen perustuvien kolorimetristen testien määrä ja laajuus kirjallisuudessa ja patenteissa osoittaa sitä, että suuri määrä aikaa, ponnisteluja ja kokeita on suoritettu, 15 jotta käyttäjille saataisiin parempia visuaalisia testejä.
US-patentti nro 4 132 527, myönnetty Maekawa et ai.'Ile, edustaa patentteja, joissa esitetään monihapetus-indikaattoreiden käyttäminen. Kuitenkin kukin indikaattoreista hapetetaan muotoon, jolla on erillinen, näkyvä vä-20 ri. Käyttäjälle näkyvä väri on hapetusindikaattoreiden värien summa. Siten reagenssikoostumuksen tai -tikun väri tulee tummemmaksi ja tummemmaksi analyytin konsentraation kasvaessa.
US-patentissa nro 4 234 313, myönnetty Faulkneril- •:25 le, esitetään koekoostumus, jolla määritetään virtsahappo ja jossa käytetään indikaattorikoostumusta, joka menettää väriä läsnä olevan virtsahapon määrän kasvaessa. Edullinen indikaattorisysteemi on kompleksoitu jodidilähde, tärkkelys-^, joka on sininen ja menettää väriä virtsahapon mää-30 rän lisääntyessä. Vaikka Faulkner esittää, että muita yh- • · j disteitä voitaisin käyttää ja mainitsee, että esimerkiksi "tietyt värilliset yhdisteet muuttuvat palautumattomasta, jolloin väri muuttuu tai häviää hapetettaessa ja muodostuu värittömiä tuotteita", mutta ei esitä lainkaan esimerkkiä 35 indikaattoreista, jotka tulevat värittömiksi hapetettaessa.
• · 3 93277
Lisäksi on esitetty joitakin systeemejä, jotka perustuvat värillisen indikaattorin muodostumiseen, jossa toinen aineosa reagoi indikaattorin hapetetun muodon (värillinen) kanssa pelkistäen hapetetun indikaattorin takai-5 sin värittömään muotoonsa. US-patentti nro 4 042 329, myönnetty Hochstrasserille, esittää systeemin, jossa indikaattori hapetetaan värittömästä muodosta värilliseen muotoon, mutta voidaan pelkistää takaisin värittömään muotoon titrauksen standardiliuoksella. Vain silloin, kun analyy-10 tin konsentraatio on suurempi kuin titrauksen standardi-liuoksen konsentraatio, on väri näkyvä.
US-patentissa nro 3 008 879, myönnetty Havillille, esitetään systeemi, jolla määritetään glukoosia käyttäen entsyymisysteemiä, jossa on glukoosioksidaasi ja peroksi-15 daasi, primaarinen indikaattorimateriaali, joka hapetetaan värilliseen muotoonsa vetyperoksidin ja peroksidaasin läsnä ollessa, ja sekundaarinen indikaattori, joka hapetetaan edullisesti hapetetulla primaarisella indikaattorilla ja jolla on oma erityinen värillinen muoto, jolloin muodostuu 20 sekoitettu värisävy. Edullisesti hapetettu primaarinen indikaattoriaine voidaan siten osittain tai kokonaan muuttaa pelkistettyyn tai värittömään muotoonsa.
DE-patentti nro 3 247 894 esittää pelkistävän koe-systeemin ja pelkistetyn nikotiiniadeniinidinukleotidin •:25 määritysmenetelmän, jonka avulla saadaan laajentunut mittausalue NAD(P)H:n määrittämiselle tai sellaisten substraattien tai entsyymien määrittämiselle, jotka reagoivat siten, että muodostuu tai kuluu NAD(P)H:ta. Systeemille on tyypillistä se, että se sisältää samanaikaisesti useita 30 aineita, joilla on erilaiset sähkökemialliset potentiaalit »· ja jotka toimivat toisistaan riippumattomasti elektronin akseptoreina NAD(P)H:lle. Esitettyyn systeemiin kuuluu dikloori-indofenolin käyttäminen, ja tämä on sininen hapettuneessa muodossaan (reagoimaton muoto pelkistävässä 35 systeemissä) ja väritön pelkistyneessä muodossa (reagoinut > · 4 93277 muoto pelkistävässä systeemissä). Hapetusindikaattorisys-teemeistä ei esitetä mainintaa tai anneta esimerkkejä.
Yhdessäkään viitejulkaisuista ei esitetä tai ehdoteta käytettäväksi monihapetusindikaattoreita, joista ku-5 kin reagoi suoraan vetyperoksidin kanssa peroksidaasin läsnä ollessa ja jossa vähintään yksi menettää värinsä hapetuksessa.
Keksintö koskee testikoostumusta, testivälinettä ja -menetelmää, jolla visuaalisesti määritetään vetyperoksi-10 dia nestenäytteessä ja joka pystyy muodostamaan eri värejä, kun se yhdistetään vetyperoksidin erilaisiin pitoisuuksiin.
Siten voidaan siis määrittää analyyttejä, jotka osallistuvat reaktioihin muodostaen vetyperoksidia, lisää-15 mällä vetyperoksidia tuottavaa systeemiä.
Tarkemmin sanottuna keksintö koskee testikoostumusta vetyperoksidin määrittämiseksi visuaalisesti nestemäisestä näytteestä, jolloin testikoostumus sisältää koostumusta, jolla on ensimmäinen väri, ennen kuin se saatetaan 20 kosketukseen nestemäisen näytteen kanssa, ja lopullinen väri sen jälkeen, kun se on saatettu kosketukseen nestemäisen näytteen kanssa, jolloin lopullinen väri on visuaalisesti erilainen kuin ensimmäinen väri ja riippuu vetyperoksidin pitoisuudesta nestemäisessä näytteessä, ja *:25 koostumukselle on tunnusomaista, että se sisältää a) peroksidatiivisesti aktiivista ainetta; ja b) monihapetusindikaattorisysteemiä, joka muodostuu vähintään ensimmäisestä ja toisesta hapetusindikaattori-komponentista, jotka molemmat hapettuvat vain vetyperoksi- 30 din ja peroksidatiivisesti aktiivisen aineen läsnä olles- • · j sa; jolloin ensimmäinen indikaattorikomponentti hapetetaan ensimmäisestä värillisestä muodosta oleellisesti värittömäksi ja toinen indikaattorikomponentti hapetetaan lopulliseen värilliseen muotoon, joka on visuaalisesti erilai-35 nen kuin ensimmäinen väri, ja mahdollisesti « il 5 93277 c) kolmannesta hapetusindikaattorista, joka voidaan hapettaa vetyperoksidin ja peroksidatiivisesti aktiivisen komponentin läsnä ollessa, jolloin saadaan kolorimetrinen vaste.
5 Indikaattoriaineosa voi olla yksittäinen yhdiste tai kytketty indikaattoripari. Edullista voi olla lisätä kolmas hapetusindikaattori.
Edullisessa systeemissä, indikaattoriaineosat hapetetaan peräkkäin siten, että tuotetaan sarja erillisiä vä- 10 rejä (siis "sateenkaari”). Erityisesti diagnostista mielenkiintoa omaavat analyytit, kuten glukoosi, voidaan määrittää lisäämällä tälle analyytille spesifistä oksidaasia, joka pystyy tuottamaan vetyperoksidia analyytin läsnä ollessa.
15 Keksintö koskee myös testivälinettä, joka käsittää a) kantajamatriisin; ja b) kantajamatriisiin yhdistettynä testikoostumus-ta, joka sisältää peroksidaasia ja moninhapetusindikaatto-risysteemiä, joka koostuu vähintään ensimmäisestä ja toi- 20 sesta indikaattorikomponentista, jotka molemmat voidaan hapettaa vain vetyperoksidin ja peroksidaasin läsnä ollessa; jolloin ensimmäinen indikaattorikomponentti voidaan hapettaa värillisestä muodosta oleellisesti värittömään muotoon ja toinen indikaattorikomponentti voidaan hapettaa •:25 muotoon, jolla on väri, joka on visuaalisesti erilainen ensimmäisen indikaattorin toiseen muotoon verrattuna; ja jolloin lopullinen, reagoineen koostumuksen selvä väri saa aikaan visuaalisesti erilaisia värejä erilaisilla vetyper-oksidipitoisuuksilla.
30 Koostumus voidaan liittää kantajaan, jotta saadaan • · : kuivafaasi-reagenssitikku. Indikaattorien sijoittaminen erillisiin kerroksiin voi parantaa värien erottamista erilaisilla vetyperoksidikonsentraatioilla.
Esitetään myös sopiva menetelmä valmistaa koostu- 35 musta liuosanalyysiä varten.
• · 6 93277
Visuaalinen värisovitus on helppoa ja sen avulla voidaan saada analyyttipitoisuuden tarkka määritys ilman, että tarvitaan kalliita laitteita. Tavallisesti reagoineen koeliuoksen tai koetikun "väriä” sovitetaan silmämääräi-5 sesti värijoukkoon, jotka on painettu värikarttaan. Arviointia hankaloittavat monet tekijät: henkilöstä toiseen vaihteleva erilainen visuaalinen värihavainnointi, valais-tuserot ja erot, joita on kuivan painetun värikartan ja värien välillä, jotka nähdään reagoineessa (siis kosteas-10 sa) paperissa tai kalvotestitikussa. Kuitenkin pääongelmana on se, että värikartoissa on usein eroja kirkkaudessa tai intensiteetissä yksittäisen "värin" kohdalla.
Vaikka "väri" on yleisesti käytetty termi, voidaan väri jakaa osiksi, kuten värikylläisyys, kirkkaus ja sävy. 15 Värisävyyn tavallisesti viitataan "värinä", jokin "näyttää" joko siniseltä, punaiselta tai keltaiselta. Tässä selitysosassa käytetään termiä "värisävy" selitysosan selventämiseksi. Keksinnössä tapahtuu muutoksia värisävyssä, ei merkittäviä muutoksia yksittäisen värisävyn kirkkaudes-20 sa tai värikylIäisyydessä.
Tavallisesti yksi värisävy liittyy yhden indikaattorin yhteen muotoon. Siten jotta voidaan muodostaa väri-sävyjen alue, tarvitaan joukko erilaisia indikaattoriaine-osia tai yhden indikaattorin erilaisia muotoja. Kuitenkin . ·:25 tyypillisen testikoostumuksen tai -välineen lopullinen värisävy tulee jatkuvasti tummemmaksi siirtyen mustaa kohti, mitä enemmän värisävyjä muodostetaan, ellei käytettävissä ole yhden värisävyn poistamiseen soveltuvaa menetelmää. Suuri parannus tuotettaessa visuaalisesti erillisiä 30 värisävyjä on saatu käyttämällä vähintään yhtä indikaatto- • · • riaineosaa, joka menettää värinsä hapetettaessa. Häviävään värisävyyn kuuluvat sekä tapaus, jossa indikaattorin hapettunut muoto on värillinen, mutta erilainen värisävy verrattuna hapettumattoman indikaattorin värisävyyn ja 35 tapaus, jossa hapetettu muoto on väritön. Termi "väritön" 7 93277 tarkoittaa tässä ilman näkyvää värisävyä olemista ja ilmaus "lähes väritön" tarkoittaa niin heikkoa värisävyä, ettei indikaattorin värisävy tehokkaasti lisää testikoos-tumukseen esiintyvää värisävyä.
5 Tässä esitettyjä testikoostumuksia voidaan käyttää vetyperoksidin määrittämiseen. Koostumuksia voidaan käyttää laitteilla, joita voidaan käyttää monilla aallonpituuksilla. Kuitenkin ne ovat erityisen käyttökelpoisia ja ne on erityisesti suunniteltu visuaalista määrittämistä 10 varten. Testikoostumukset koostuvat peroksidatiivisesti aktiivisesta aineesta ja monihapetusindikaattorisysteemis-tä.
Monihapetusindikaattorisysteemi sisältää vähintään kaksi hapetusindikaattoriaineosaa. Hapetusindikaattori 15 määritellään indikaattoriksi, joka voidaan hapettaa vetyperoksidin ja peroksidatiivisesti aktiivisen aineen läsnä ollessa. Testikoostumus koostuu peroksidatiivisesti aktiivisesta aineesta ja ensimmäisestä ja toisesta indikaatto-riosasta, jotka molemmat ovat pelkistetyssä muodossa ja 20 jotka molemmat voidaan hapettaa siten, että syntyy havaittavissa oleva vaste. Ensimmäisellä indikaattoriyhdisteellä (pelkistetty) on yksi värisävy ja se voidaan hapettaa muotoon, jolla on erilainen värisävy (oleellisesti väritön). Toinen indikaattoriosa (pelkistetty) voidaan hapettaa muo- ••25 toon, jolla on värisävy, joka on visuaalisesti erilainen ensimmäisen indikaattorin havaittavaan värisävyyn verrattuna, hapettamattomana ja hapetettuna. Esimerkiksi mikäli ensimmäinen indikaattoriosa (pelkistetty) on sininen ja toinen indikaattoriosa (pelkistetty) on väritön, on näkyvä 30 reagoimattoman koekoostumuksen värisävy sininen. Koekoos- • « • tumuksen ja näytteen yhdistämisen jälkeen hapettuvat molemmat indikaattorit, jos vetyperoksidia on läsnä ja seurauksena syntyy muu värisävy kuin sininen riippuen vetyperoksidin (tai analyytin) konsentraatiosta, indikaattori- 35 reaktioiden järjestyksestä ja indikaattoriaineosien pitoisuudesta verrattuna vetyperoksidin konsentraatioon.
• f 8 93277
Mikäli reaktiot ovat peräkkäisiä ja mikäli vetyperoksidin pitoisuus on riittävä hapettamaan kaikki indikaat-torimolekyylit, siten että ensimmäinen indikaattoriaineosa C1 (pelkistetty) hapettuu täydellisesti tai lähes täydel-5 lisesti, ennen kuin toinen indikaattoriaineosa C2 (pelkistetty) hapetetaan, voidaan saada aikaan hyvin vahva väri-muutos. Esimerkiksi mikäli C.^ (sininen) hapetetaan C'^ksi (väritön) ja C2 (väritön) hapetetaan C'2:ksi, on koekoos-tumuksen esiintyvä väri sininen ja reaktion jälkeinen vä-10 risävy on punainen. Tämä aiheuttaa selvän värisävymuutok-sen sinisestä punaiseksi, jota käyttäjä voi seurata helpommin kuin erilaisia sinisen sävyjä. Vetyperoksidin matalammilla pitoisuuksilla voi koekoostumuksen näkyvä värisävy olla väritön. Mikäli indikaattorien reaktiot menevät 15 jossakin määrin päällekkäin, siis kaikki ensimmäisen indikaattorin aineosat eivät hapetu ennen kuin toisen indi-kaattoriaineosan hapettuminen alkaa, on seurauksena hapettuneiden ja pelkistyneiden indikaattoriaineosien seos joillakin vetyperoksidipitoisuuksilla, josta seurauksena 20 on purppura tai toinen värisävy. Lisää värisävyjä voidaan saada käyttämällä lisäindikaattoriaineosia, jotka voidaan hapettaa vetyperoksidin läsnä ollessa siten, että syntyy havaittava muutos koekoostumuksen esiintyvässä värisävyssä.
‘.25 Kukin yksittäinen aineosa voi olla yksittäinen ai neosa tai yhdistepari, joka muodostaa kytketyn indikaatto-riparin. Erityisen tärkeää on ensimmäisen hapetusindikaat-torin valinta. Värinsä hapettuessaan menettävien indikaattorien lukumäärä on huomattavavasti rajoittuneempi kuin 30 niiden indikaattorien lukumäärä, joka tulee värittömäksi _ pelkistyessään, koska hapettuminen tavallisesti lisää in dikaattorin konjugaatiota, johon tavallisesti liittyy värin esiintyminen. Kuitenkin käytettävissä olevien väriaineiden määrä on valtava ja kasvaa jatkuvasti. Tuntien eri-35 tyisen edulliset tulokset, joita voidaan saada tällaisten . · ·
II
9 93277 indikaattorien avulla ja käyttäen tässä esitettyä ohjausta, voidaan löytää monia tällaisia indikaattoreita.
Erityisen edullinen ensimmäinen hapetusindikaatto-riaineosa on Acid Black nro 1, 4-amino-5-hydroksi-3-(p-5 nitrof enyyliatso) -6- (f enyyliatso) -2,7-naftaleenidisulfoni- happo, dinatriumsuola, jonka rakenne esitetty seuraavassa:
NaO^S SOjNa 10 ^ N=N NSN—^— N02 OH NH2 Tämä yhdiste on sininen pelkistyneessä muodossa ja 15 väritön hapettuneessa muodossa. Acid Black nro l:n lisäksi on löydetty muita indikaattoreita, jotka tulevat niin lähelle väritöntä hapetettaessa, että hapetetun muodon värisävy, joka on hyvin heikko värisävy, mikäli se on hapetettu yksin, ei vaikuta reagoineen koekoostumuksen värisä-20 vyyn. Tällaisia ovat Nitro Red, Acid Orange 8, Acid Red nro 1 ja Acid Red nro 4. Pelkistettyjen ja hapetettujen muotojen värisävyt esitetään taulukossa 1. Näiden kaikkien indikaattorien rakenteet esitetään esimerkkiosan liite-osassa.
,.:25 Taulukko I
Ensimmäiset hapetusindikaattorit Värisävy Värisävy
Yleinen nimi Pelkistetty muoto Hapetettu muoto 30 Acid Black nro 1 sininen väritön :· Nitro Red purppura heikko sininen/ ruskea
Acid Orange nro 8 vahva oranss olki tai hyvin heikko keltainen
Acid Red nro 1 oranssi vaalea keltainen
Acid Red nro 4 pinkki/oranssi vaalea ruskea/ 35 vaalea malvanväri
Acid Yellow nro 34 keltainen väritön
Yhdisteet 1 ja 2 punainen sinivihreä 10 93277
Hapetettaessa värittömiksi tulevien sopivien yhdisteiden rakenteessa on yleisesti naftaleenirengas, jossa on diatsoryhmä ortoasemassa verrattuna fenoli- tai amiiniryh-mään, kuten seuraavassa esitetään:
X
jossa M on H, OH, NH2 tai NH-asetyyli; P on NH2 tai OH; 15 Z, ja Z2 ovat riippumattomasti H tai -S03H tai sen suola; Y on H tai substituoitu fenyyliatsorengas, ja X on H tai substituentti, joista OCH3 ja N02 ovat edullisia. -N02 on erityisen edullinen.
20 Acid Black nro l:lle M on OH, P on NH2, X on N02, Z, ja Z2 ovat NaSO 3, ja Y on fenyyliatsorengas.
Muita indikaattoreita, jotka tulevat lähes värittömiksi hapetettaessa, kuten Acid Yellow nro 34, voidaan myös käyttää.
•25 Indikaattoriaineosan värisävy voi riippua myös pH:sta. Siten joissakin tapauksissa on toivottavaa kontrolloida koekoostumuksen pH:ta lisäämällä puskurlainetta.
Yhdisteitä, joita voidaan käyttää toiseksi ja valinnaiseksi kolmanneksi tai neljänneksi indikaattoriaine-30 osaksi, on hyvin paljon. Indikaattoreita, joilla tapahtuu . muutos värisävyssä hapetettaessa, ovat yksittäiset ja kyt ketyt indikaattorit. Näitä voivat olla indikaattorit, jotka hapetetaan värittömistä muotoon, jolla on selvä värisävy, ja joita ovat valtaosaltaan hapettuvat indikaattorit, 35 kuten myös indikaattorit, jotka hapetetaan värisävystä 1
II
· 11 93277 toiseen (värinmuutosindikaattorit). Yksittäisten indikaattorien tyyppiin kuuluvat 3,3',5,5'-tetrametyylibentsidii-ni, o-toluidiini ja guajakkikumi; käyttökelpoisia kytkettyjä indikaattoreita ovat 4-aminoantipyriini yhdessä 2-5 metyyli-indolin,4,5-dikloori-2-hydroksibentseenisulfonaa-tin (DCHBS) tai CNSP:n kanssa.
Värinmuutos värittömästä muodosta hapetettuun muotoon, jolla on primaarinen värisävy, kuten keltainen, punainen tai sininen, on edullinen toiseksi indikaattoriyh-10 disteeksi. Edullisin on testikoostumus, joka sisältää ensimmäistä indikaattoria, joka voidaan hapettaa sinisestä värittömäksi, ja toista ja kolmatta indikaattoria, jotka voidaan hapettaa värittömästä keltaiseksi tai värittömästä punaiseksi. Hapetettava sateenkaari valmistetaan testi-15 koostumuksella, joka on sininen reagoimattomana ja jolla on vihreä, keltainen, oranssi ja punainen värisävy etukäteen määritetyillä vetyperoksidin pitoisuuksilla.
Peroksidatiivisesti aktiivinen aine on testikoostu-muksessa edullisesti peroksidaasi, joka on saatu luonnon-20 lähteistä, kuten piparjuuresta ja perunasta. Muita yhdisteitä, joilla on peroksidatiivista aktiivisuutta, ovat epäorgaaniset yhdisteet, joilla on peroksidaasiaktiivi-suutta, kuten kaliumjodidin ja natriummolybdaatin seokset, kuten myös muut jodidit, kuten natrium- ja ammoniumjodi-....:25 dit, ja muut molybdaatit, kuten kalium- ja ammoniummolyb-daatit. Lisäksi voidaan käyttää urohemiiniä ja joukkoa muita porfyriiniaineita, joilla on peroksidatiivista aktiivisuutta. Lisäksi voidaan käyttää erilaisia kompleksin-muodostusyhdisteitä, jotka aktivoivat metalloporfyriinejä 30 mutta jotka eivät sellaisenaan ole toimintakykyisiä, kuten j1 esimerkiksi 2-aminobentsotiatsoli, pyridiini, bipyridyyli, bipyridyylipyridiini, nikotiinihappo tai vastaavat. Muita yhdisteitä, jotka eivät ole entsyymejä mutta joilla on peroksidatiivista aktiivisuutta, ovat sellaiset yhdisteet 35 kuin rautasulfosyanaatti, rautatannaatti, rautaferrosyani-di, kaliumkromisulfaatti ja vastaavat.
m » · 12 93277
Muita aineosia, kuten puskureita, pinta-aktiivisia aineita ja stabilaattoreita, voidaan myös lisätä koostumuksiin. pH ja siten puskurointiaineen lisääminen voi määrätä indikaattoriyhdisteen erityisen muodon värisävyn.
5 Esimerkiksi Acid Organge 8 hapetetaan oranssista vaalean oljen väriseksi pH:ssa 7,5 mutta se hapetetaan (vaalean) keltaiseksi pH:ssa 9,5. Nitro Red hapetetaan purppurasta heikoksi ruskeaksi pH:ssa 7,5, mutta hapetetaan vaaleansiniseksi pH:ssa 9,5. Toinen pH-alue voi olla toivottavam-10 pi kuin toinen tuotettaessa toivottua värisävyjen aluetta. Alan ammattilaiset tuntevat monia puskuriaineita, ja niitä voidaan käyttää edellyttäen, ettivät ne häiritse peroksi-daasin ja vetyperoksidin toimintaa hapetettaessa indikaat-toriaineosia.
15 Koekoostumusta voidaan käyttää myös määritettäessä monia diagnostisesti kiinnostavia analyyttejä lisämäällä tälle analyytille spesifistä oksidaasia, joka pystyy tuottamaan vetyperoksidia kyseisen analyytin läsnä ollessa. Erityisen kiinnostavien analyyttien lista ja niiden vas-20 taavat oksidaasit esitetään seuraavassa taulukossa II.
Taulukko II
Analvvtti Oksidaasi 1. glukoosi glukoosioksidaasi
GO
glukoosi + H20 + 02 —> glukonihappo + H202 '.25 2. alkoholi alkoholioksidaasi
AOD
C2H5OH + 02 — > CH3CHO + H202 3. kolesteroli kolesterolioksidaasi kolesteroli- kolesteroli + 02 —> kolest-4-en-3-oni + H202 oksidaasi • « - - . ·
Muita aineosia voidaan tarvita lisäaineosiksi koe-koostumuksiin. Kuitenkin nämä reaktiot ja niiden käyttäminen testikoostumuksissa ja kuivafaasitestivälineissä on 35
alalla hyvin tunnettua. Testikoostumuksen edullinen pH
• · 13 93277 määräytyy usein sen pH:n mukaan, joka vaaditaan oksidaasi-entsyymille. Tästä lähtökohdasta lähtien täytyy valita sopivat hapetusindikaattoriaineosat, jotta saadaan halutut muutokset värisävyssä.
5 Koostumus voidaan liuottaa, jotta saadaan testi- liuos, tai liittää kantajamatriisiin, jotta saadaan testi-välinemuoto. Molemmat muodot voivat määrittää vetyperoksidin läsnäolon ruumiin nesteessä tai voivat määrittää jonkin muun kiinnostavan analyytin läsnäolon, kun aineosia 10 lisätään testikoostumuksiin, jotta vetyperoksidia tuotetaan tästä kyseisestä analyytistä.
Sopiva tapa valmistaa testiliuos voidaan saada esimerkeistä. Kukin komponentti liuotetaan kunkin indikaatto-riaineosan erilliseen liuokseen tai valmistetaan kukin osa 15 kytketyistä pareista. Valmistetaan entsyymiliuos, joka sisältää peroksidaasia ja sopivaa oksidaasia. Tämän jälkeen yhdistetään annokset kutakin indikaattoria ja entsyy-miliuosta, jotta saadaan testiliuos.
Indikaattoriliuosten konsentraatioiden tasapainot-20 taminen riippuu määritettävän analyytin pitoisuusalueesta ja etukäteen määritellyistä pitoisuuskohdista, jotka ovat käyttökelpoisimpia. Esimerkiksi edullista on tuottaa yksi värisävy hyvin alhaisella analyytin tasolla (sininen), vihreä "normaalilla" kliinisellä alueella ja punainen tai ..:25 oranssi korkeilla tai vaarallisilla alueilla. Tämä voidaan suorittaa tässä annetuilla rutiinikokeilla ja esimerkeissä esitettyjen neuvojen avulla. Sen lisäksi, että kouluttamaton henkilö voi helposti määrittää tulokset erityisesti kokeesta, on etuna myös se, että lääkäri voi luottaa väri-30 sävyjen muutokseen helpottamassa maallikolle annettavia ·* ohjeita.
Testikoostumus voidaan antaa käyttöön testipakkauksena, joka sisältää liuoksen tai joukon liuoksia, jotka on sekoitettava. Kuitenkin kuivafaasireagenssitikut ovat hy-35 vin tunnettuja ja muodostavat käyttökelpoisen muodon. Kui- 14 93277 van reagenssitikun valmistamisessa käytettävä kantajamat-riisi voi olla mikä tahansa teollisuudessa tunnetuista matriiseista, kunhan matriisi voidaan yhdistää koostumuksen kanssa ja kunhan se ei häiritse reaktioita, joita vaa-5 ditaan värin muodostumiseen. Näitä ovat paperi; kalvot, jotka on valmistettu luonnon polymeereistä, latekseista, polyuretaaneista, silikoneista tai niiden yhdistelmistä; ja membraanit, kuten mikrohuokoiset membraanit, jotka on esimerkiksi valmistettu koaguloimistekniikalla polyure-10 taanista.
Esivalmistettu kantaja, kuten paperi, voidaan yhdistää koekoostumuksen kanssa suihkuttamalla, maalaamalla tai kastamalla. Jälkimmäinen on edullista ja siihen viitataan tavallisesti kyllästämisenä. Membraanit voidaan 15 myös yhdistää testikoostumukseen tai testikoostumuksiin näitä menetelmiä käyttäen. Näillä membraaneilla on se lisäetu, että yksi tai useampia aineosia voidaan lisätä membraania valmistettaessa, jotta saadaan tasainen jakauma membraanien sisällä. Tavallisesti on edullista lisätä yksi 20 tai useampia indikaattoreita näiden membraanien valmistuk sen aikana, lisätä sitten muita aineosia, kuten entsyymiä ja puskureita, yhdistämällä, edullisimmin kyllästämällä.
Paperi- tai membraanikantaja voidaan asettaa kovalle alustalle tai tukiosalle kaksipuoleisella sideaineella.
....•25 Membraanit tai kalvot voidaan valmistaa myös suoraan kantajalle. Tällaisia kantajia ovat tavallisesti vedenpitävät tasaiset polymeer ikä Ivot, kuten polyetyleenitereftalaatti, polystyreeni, polyesteri tai vastaavat. Tuki lisää käyttökelpoisuutta, koska tällaisiin kokeisiin tarvittava rea-30 genssialue on hyvin pieni. Tausta voi olla opaalinen tai ·* läpinäkyvä, vaikka opaalin valkoinen tausta on edullinen visuaalisesti luettaviin testeihin. Lisäkerroksia voidaan lisätä testivälineeseen, jotta pyyhkiminen on mahdollista tai voidaan poistaa punasolut pinnalta ennen lukemista.
35 Tämä voidaan suorittaa polymeeripäällystyksellä tai lisää- > · 15 93277 mällä kerros, joka suodattaa punasolut, jotka voidaan pyyhkiä pois tai poistaa itse kerros.
Indikaattoriaineosat voidaan eristää erillisiin kerroksiin monikerroksellisessa testivälineessä. Tällaisia 5 kerroksia voidaan valmistaa tunnetuilla menetelmillä paperille membraanien tai kalvojen avulla. Näin voidaan saada lisää värierilaisuutta ja voidaan hyvin kontrolloida värisävyjen kehittymisjärjestystä lopullisessa välineessä. Tähän tarkoitukseen on havaittu erityisen käyttökelpoisiksi 10 monikerrokselliset gelatiinikalvomatriisit.
Tämä kuvaus esittää riittävästi tietoja, jotta voidaan valmistaa testikoostumuksia tai testivälineitä vetyperoksidin tai diagnostisten analyyttien määrittämistä varten siten, että nämä kehittävät visuaalisesti erillisiä 15 värisävyjä vetyperoksidin erilaisilla pitoisuuksilla. Vetyperoksidi voidaan muodostaa oksidaasisysteemillä monista analyyteistä, joilla on kliinistä mielenkiintoa.
Keksinnössä on tarpeellista käyttää vähintään kahta indikaattoriaineosaa. Ensimmäisen indikaattoriaineosan 20 täytyy menettää värinsä hapetuksessa värittömäksi muodok si. Toisen indikaattoriaineosan täytyy myös muuttaa värisävyä esimerkiksi muuttua värittömästä pelkistetystä muodosta hapetettuun muotoon, jolla on erillinen, suhteellisen voimakas värisävy. Muodostettavat värisävyt ovat yhtä •‘25 lukuisia kuin käytössä olevien indikaattoriyhdisteiden lukumäärä. Koostumuksen lopullinen selvä värisävy riippuu myös indikaattoriaineosien suhteellisista pitoisuuksista. Tätä tosiasiaa voidaan käyttää siirtämään käytössä olevien värisävyjen aluetta ja analyyttikonsentraatioita, joissa 30 värisävyn siirtäminen on nähtävissä.
Keksintöä selvennetään nyt esimerkkien avulla. Kuitenkaan keksintöä ei tule rajoittaa esimerkkien kautta ja vain patenttivaatimukset määrittävät keksinnön suojapii-rin. Alan ammattilaiset pystyvät valmistamaan monia muun-35 nelmia niiden lisäksi, joita esitetään selostuksessa.
16 93277
Lyhenteet HEPES puskuri, N-2-hydroksietyylipiperatsiini- N'-2-etaanisulfonihappo TAPSO puskuri, 3-[N-tris(hydroksimetyyli)- 5 metyyliamino]-2-hydroksipropaanisulfo nihappo TRIS puskuri, tris(hydroksimetyyli)amino- metaani (tris)2SC>4 tris-puskuri säädettynä annettuun pH- 10 arvoon rikkihapolla ® . ....
Triton X-100 pinta-aktuvinen aine, polyoksietyleeni- eetteri, saatavissa: Sigma Chemical Co.
U kansainvälisiä yksiköitä, entsyymiak tiivisuuden mitta (yksi U on entsyymi-15 aktiivisuus, joka tarvitaan katalysoi maan yhden mikromoolin substraattia konversio minuutissa spesifisissä lämpötila- ja pH-olosuhteissa)
Me metyyli 20 POD peroksidaasi GO glukoosioksidaasi AOD alkoholioksidaasi PET polyetyleenitereftalaatti dl desilitra ..:25 ml millilitra μΐ mikrolitra g gramma μ mikrometri
RT huoneenlämpötila, tavallisesti 25 °C
30 MW molekyylipaino :1 qs lisätty tiettyyn tilavuuteen asti
Taulukoissa 0 visuaalisesti erillinen värisävy = visuaalisesti erottumaton värisävy « > ·
II
17 93277 Värilyhenteet or oranssi pu punainen vp vaaleanpunainen 5 si sininen ru ruskea vi vihreä ha harmaa sp sinipunainen 10 ke keltainen v vaalea
Yhdistelvhenteet 4AP 4-aminoantipyriini DCHBS 3,5-dikloori-2-hydroksibentseeni- 15 sulfonaatti 1 · 18 93277
Indikaattorit ^ Nitro Red (yhdiste 4)
NaS03 S03Na [ f n=nV'()\_ no, 10 OH NH2 \W/ 2
Acid Orange 8 (yhdiste 6) 15 OQl
( OH N
&
Me^N
20 l·
V
SO,Na
Acid Red 1 J
NaO,S SO,Na 25 3 3 Υγν/^
MeCONH OH \=y 30
Acid Red 4 SO-Na OH /^7 OMe 35 19 93277
Acid Yellow 34
<^V N=N\_/PH
S03Na 10 CNSP (RNG-3608) - 3-karboksi-4-/4"-(2"-N-4-(2'",4,,,-bis-tert-amyylifenoksi)butyylikarbamoyyli)-l"-hydroksinaftlok-si-fenyyliatso7-l-sulfofenyyli-5-pyratsoloni 15 CH3 / 3 C\^ /CH3 20 0H CH3/C\ cH3 r^YY'”' «**2» —=2 kJU <*3 “3
.C0,H
il o<K J* Φ
SOjH
• I
20 93277 1-(4-fenoksi-3-sulfofenyyli)-3(oktadekamido)-5-pyratsolo-ni (yhdiste 7) 5 !-^nhcoc17h35
"X
ίο I
S03H
15 N,N-dietyyli-p-fenyleenidiamiini (yhdiste 1) 20 j^C2H5^ 2 25 nh2 »·« 93277 1- hydroksi-4-(2'-N'-tolyyli-N-sulfamoyyliamiini)fenyyli-atso-2-N-(2"-N"-metyyli-N"-oktadekyyli)fenyylinaftoamidi (yhdiste 2) 5
Me c.pH^.
OH 18 37 /- CONH\ 10 N SO-,Η
Il 3
N
/L/NHS02NH
tr ^ 15 N-Z2 ' -oktadekyylioksi-5- (N-metyylisulfainoyyli )Jfenyyli- 2- (4-metoksi)bentsoyyliasetanilidi (yhdiste 3) 20 \C18H37 25 hö/°-^>-coch2conh^9)
NH
30 A
• · I
• · 22 93277
Esimerkki 1
Erilaisten värisävyjen tuottaminen reaktiolla vetyperoksidin kanssa
Valmistettiin kaksi testikoostumusta käyttäen eri-5 laisia monihapetusindikaattorisysteemejä, jotka pystyivät tuottamaan erilaisia värisävyjä vasteena kasvaville vety-peroksidikonsentraatioille. Testikoostumukset testattiin liuoksina käyttäen kasvavaa vetyperoksidilisäystä. Väri-vertauksen suorittamista varten annos (30 μΐ) reagoinutta 10 liuosta vietiin puhtaalle, valkoiselle paperille. Loppu-piste saavutettiin noin kahden neljän minuutin kuluessa.
A. Valmistettiin monihapetusindikaattorisysteemi käyttäen Nitro Red -indikaattoria ensimmäisenä indikaatto-riaineosana, joka muuttuu värillisestä muodosta värittö-15 mään muotoon, ja toisena indikaattoriaineosana käytettiin 2-amino-3-hydroksi-5-bromipyridiiniä. Nitro Red hapettuu vetyperoksidin ja peroksidaasin läsnä ollessa purppurasta hyvin heikoksi siniseksi/ruskeaksi. Vaikka hapettunut muoto voidaan nähdä, mikäli ensimmäinen indikaattoriaineosa 20 hapetetaan yksin, muodostunut väri on niin heikko, että se saa aikaan vähän tai ei lainkaan moni-indikaattorisystee-missä näkyvää väriä. Toinen indikaattoriaineosa hapetetaan värittömästä vahvaksi keltaiseksi.
Näiden kahden yhdisteen liuokset valmistettiin ve-’*25 typeroksidianalyysiä varten (taulukko 1). Koeliuokset sisälsivät myös puskuria, (tris)2S04, 0,1 M, pH 8,5, ja pe-roksidaasia (200 U/ml). Vetyperoksidia lisättiin koeliuos-ten annoksiin, ja kun loppupiste saavutettiin noin 2-4 minuutin kuluessa, vietiin 30 μΐ kutakin reagoinutta ...30 liuosta valkoiselle absorbenttisuodatinpaperille, jotta voitiin verrata tuotettuja värisävyjä.
Näillä liuoksilla voidaan havaita värisävyjen alue, joka vastaa vetyperoksidien kasvavia konsentraatioita, siis sininen matalalla konsentraatiolla, vihreä keskinker-35 täisellä konsentraatiolla, keltainen korkealla konsentraa tiolla.
23 93277
H
α.
β · <υ +> > ή m α) >ι <ϋ ^ Μ ιη Μ ιΗ
a a II
« X!
aO (d <U
> Λ -© a n Ή
•H M
> X «-H
in > <0 r— .¾ -h - a n > n o
-rH
H M
f 3 0 1—1 ·Η id ·Η (N 2 in > ^ > ^ ~ o a a n
(0 -H
x! m
CN -H -H
- in > o a a il
rH
0 o o λ; -η ,1 M rH m > λ; ^ «· -H I -rl 3 O 0) ft -rl <U ft rH x; m in Λ > 3 ui aa1©
Eh ft ft ft ora ra ra
1 I I
H -H -H
ra ra ra
. I
··; -H
1 Ή I m Ό
ro I -H
I -H P —.
0 m >1 S
C ϋ ft E m m •H O -H ^
£ >H E rH rH O
ΛΑΟ 1 >1 M -rl
in Xi Λ G
Q) ps .—. m m m 0 2 in r- r- >h E io ro ro -P — o o o •rl ^ ^ ^ 2 o o o « 24 93277 B. Valmistettiin toinen monihapetusindikaattorisys-teemi käyttäen Acid Organge 8 (yhdiste 6) -indikaattoria ensimmäisenä indikaattoriaineosana ja yhdisteitä 1 ja 7 kytkettynä indikaattoriparina, joka muodostaa toisen indi-5 kaattoriaineosan. Acid Orange 8 (yhdiste 6) hapettuu vetyperoksidin ja peroksidaasin läsnä ollessa vahvasta oranssista hyvin heikoksi keltaiseksi tai oljen väriseksi. Vaikkakin hapettuneen muodon värisävy voidaan erottaa visuaalisesti, kun se on hapetettu yksinään ja asetettu lä-10 helle valkoista taustaa, on värisävy niin vaalea, että sillä on vähän tai ei lainkaan vaikutusta yhdistettäessä muihin värillisiin indikaattoreihin. Yhdiste 7 hapettuu yhdisteen 1, vetyperoksidin ja peroksidaasin läsnä ollessa värittömästä sinipunaiseksi. Koeliuokset valmistettiin ja 15 testattiin kuten esitetään osassa A. Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa 2. Samanlainen erottuminen havaittiin, vaikka lopulliset värisävyt olivat erilaisia.
• · « « • · 1
II
· 25 93277 (d 0 0 a m 04
» 0 II
|H 0 04
II
id 0 0 O 04 - 04 i—I 0
0 II
04 > J0 in td 04 Γ" 04 >co * cn o || Ό 04 Λ 0 2 m ai id 04 n £ » > to iK ^ o ·© ^ -Qi 04 04
(0 CO
0 >
<N (NO
» -Si
O o «I
λ: 0 M 04
0 I
Ή 0 0
0 '—I 0 O
(0 - >
Eh O O O
0
0 O
O I
O I CD
0 X
X
> · ¢0 ____· -H r-' —» m m ^ s ^ ^
Ä <D s O O
^ ~
CO
-H ih’ —» in in
Ό 2 CN CN
Λ 0) E
I >4 -P ^ O O
^1 • · • 00 <l· 01 — Ό G 2 •H id fc 00 N· O 0 '—' < O o o 26 93277
Esimerkki 2
Monien värisävyjen tuottaminen glukoosimääritystä varten
Valmistettiin testiväline, joka on tarkoitettu glu-5 koosin määrittämiseen ja joka pystyy tuottamaan erilaisia värisävyjä erilaisilla glukoosipitoisuuksilla, kun glukoo-sioksidaasia käytetään vetyperoksidia tuottavana systeeminä.
Koeliuos sisälsi glukoosioksidaasia (50 U/ml), pe-10 roksidaasia (50 U/ml), TAPSOta (pH 8,5, 20 mM) ja polyvi-nyylialkoholia (88-%:isesti hydrolysoitu, 10 000 molekyy-lipaino, 1,5 paino-% painoa kohti) ja yhdisteitä 1, 2 ja 3 indikaattoriaineosina. Yhdiste (punainen-vaaleanpunainen), hapettuvasta kytkettynä yhdisteen 1 kanssa, muodostaa ve-15 typeroksidin ja peroksidaasin vaikutuksesta sinivihreän värisävyn. Samalla tavalla yhdiste 3 (väritön) tuottaa keltaisen värin hapetettavasti kytkettynä yhdisteen 1 kanssa. Taulukossa 3 esitetään käytetyt indikaattoriaine-osien suhteet.
20 Whatman 31 ET -suodatuspaperia kastettiin edellä olevaan liuokseen ja kuivattiin. Paperi leikattiin palasiksi ja testattiin glukoosiliuoksilla, puskuroitiin (tris)2S04:11a, 0,1 M, pH 8,5.
Lopulliset värisävyt saatiin noin 10 minuutissa ja -.-.:25 myös ne esitetään taulukossa 3.
• · 1 · 27 93277
•H
>
•H
λ;
m X
rH rH tl lö
Ai
II
H
>
H
H (0 > X Φ in X i—I -h
- H
r~ (O (O X
X > rH (0
O «I X
X
rH 1rl m -H Q) <Ö > n- > Λ< Ai
* -H
n S S O Ai
n) I
•rl φ φ CC
> X rH Sd Q)
Oli (Ö Q) C
» M -H (ö -rl M -rl
(N O > > > Λ C
•rl -rl n O O ·©. > tn O dl C di X > Sh m
X I Sh I I
C Sh O Sh -h rH O O O >
C - O
(0 rH Oi 0 0
EH
Sh Sh Sh -h O O O >
Il I I
di di di dl in > > > tn
o O O O O
O.
o di di di tn > > > i i di ' tn i^, > •h m -—. m T3 2 r~ o m Λ as B - - o
|>H H-> ·—' O rH O
^1 tn pv, m m •h cn' i— in o r~ Ό 2 1 «. 1 1· £ ai g o o rH o • vl tn pv,
•rl i—I
Ό -v ,C as 2 in in in tn ΙΪΗ. +> E - -
*^^l t—H (—I rH rH
» · ,. 93277 28
Tuotettuja värisävyjä voidaan muuttaa vaihtelemalla yhdisteiden 2 ja 3 suhteita: esimerkiksi tasolla 1 μΜ voi tuotettu värisävy olla or-vp, or, or-ru tai vi-sp. Lisäämällä lisäindikaattori, lisätään värisävyt oranssi, vaa-5 leanruskea ja ruskea. Viimeinen taulukossa 3 esitetty koe on vertailu.
Koe osoitti, että erilaisia värisävyjä voidaan tuottaa siten, että ne liittyvät glukoosin kasvavaan kon-sentraatioon näytteessä. Nämä värisävyt voidaan erottaa 10 toisistaan helpommin kuin saman värisävyn voimakkuus- tai aste-erot. Suuret pitoisuudet voidaan määrittää helpommin, koska esiintyvät värit eivät ole tulleet niin tummiksi, että olisivat visuaalisesti erottamattomia.
Esimerkki 3 15 Sateenkaaren tuottaminen glukoosin määrittämistä varten
Acid Black nro 1 on edullinen ensimmäinen indikaat-toriaineosa, koska se on sininen pelkistetyssä muodossa ja väritön, kun se hapetetaan vetyperoksidin ja peroksidaasin 20 läsnä ollessa. Tämä yhdiste tarjoaa lähtökohdan moni-indi- kaattorisysteemille, joka pystyy tuottamaan sateenkaaren värit glukoosin konsentraation kasvaessa. Tämä tulos on erityisen edullinen, koska erillisten värisävyjen sinisestä vihreään ja punaiseen tarjoaa suurimman visuaalisen .....25 erottamismahdollisuuden diabeetikoille.
Koekoostumus valmistettiin käyttäen ensimmäistä indikaattoriaineosaa Acid Black nro 1, toista indikaatto- riaineosaa 3,5-dikloori-2-hydroksibentseenisulfonaatti (DCHBS) ja 4-aminoantipyriini (4-AP); ja kolmatta indi- 30 kaattoriaineosaa, 2-metyyli-indoli ja 4-aminoantipyriiniä.
Seuraavassa esitetään näistä indikaattoreista hapetuksessa saatavat muutokset värisävyissä.
pelkistetty hapetettu 1. Acid Black nro 1 sininen väritön 35 2. 4-AP ja DCHBS väritön oranssi 3. 4-AP ja 2-metyyli- ruskea oranssi indoli • « 29 93277
Koekoostumus valmistettiin seuraavasti:
Valmiste nro 1
Acid Black nro 1 60 mg 4-AP 365 mg 5 DCHBS 50 mg H20 qs 100 ml
Valmiste nro 2
Glukoosioksidaasi (1,221 U/ml) 20 ml
Peroksidaasi (60 U/mg) 1 g 10 Valmiste nro 3
Valmiste nro 1 2 ml
Valmiste nro 2 2 ml 4-AP (10~2 M) 1 ml 2-metyyli-indoli (10 2 M) 1 ml 15 Menetelmä: 100 μΐ valmistetta nro 3 sekoitettiin 100 Ml:aan vesiliuosta, joka sisältää erilaisia glukoosikonsentraa-tioita. Kahden minuutin kuluttua määritettiin testiliuos-ten värisävy panemalla annos kutakin liuosta suodatinpape-20 rin palaselle.
Glukoosikonsentraatio_värisävy 0 sininen 50 mg/dl vihreä-sininen 200 mg/dl sammalenvihreä ** 25 1000 mg/ml oranssi-punainen
Glukoosin konsentraation kasvaessa tuotettiin erillisiä värisävyjä (sininen, vihreä, oranssi).
B. Valmistettiin toinen liuosten sarja perustuen valmisteisiin nro 1 ja nro 2 ja erilaiseen kolmanteen in-30 dikaattoriaineosaan CNSP. Tämä indikaattori muuttuu pel- kistyneen muodon keltaisesta hapettuneen muodon punaiseksi. Siten koostumuksen värisävy oli vihreä, kun glukoosia ei ollut läsnä ja hapetuksen aikana muodostuneet värisävyt olivat erilaisia kuin esimerkissä 3A havaitut. Kuitenkin 35 myös tällä koostumuksella saatiin visuaalisesti erillisiä värisävyjä.
· 30 93277
Valmiste nro 4
Valmiste nro 1 2 ml
Valmiste nro 2 2 ml 4-AP (10-2 M) 2 ml 5 CNSP (10“2 M) 2 ml
Menetelmä: 100 μΐ valmistetta nro 4 sekoitettiin 100 Miraan vesi-liuosta, jossa oli erilaisia glukoosin konsentraatioita. Kahden minuutin kuluttua määritettiin liuosten värisävyt 10 kuten osassa A.
Glukoosikonsentraatio_värisävy 0 vihreä 50 mg/dl sammalenvihreä 200 mg/dl ruskea 15 1000 mg/dl oranssi-punainen Jälleen kerran tuotettiin erotettavissa olevia värisävyjä laajalla glukoosikonsentraatioiden alueella.
Valinnaisesti monia muunnelmia ja variaatioita voidaan tehdä tässä esitettyyn keksintöön ilman, että poike-20 taan keksinnön hengestä ja suojapiiristä, ja siten ainoiksi rajoittaviksi tekijöiksi tulisi katsoa seuraavana esitetyt patenttivaatimukset.
• · I
« * »
II
Claims (7)
1. Testikoostumus vetyperoksidin määrittämiseksi visuaalisesti nestemäisestä näytteestä, jolloin testikoos- 5 tumus sisältää koostumusta, jolla on ensimmäinen väri, ennen kuin se saatetaan kosketukseen nestemäisen näytteen kanssa, ja lopullinen väri sen jälkeen, kun se on saatettu kosketukseen nestemäisen näytteen kanssa, jolloin lopullinen väri on visuaalisesti erilainen kuin ensimmäinen väri 10 ja riippuu vetyperoksidin pitoisuudesta nestemäisessä näytteessä, tunnettu siitä, että se sisältää a) peroksidatiivisesti aktiivista ainetta; ja b) monihapetusindikaattorisysteemiä, joka muodostuu vähintään ensimmäisestä ja toisesta hapetusindikaattori- 15 komponentista, jotka molemmat hapettuvat vain vetyperoksidin ja peroksidatiivisesti aktiivisen aineen läsnä ollessa; jolloin ensimmäinen indikaattorikomponentti hapetetaan ensimmäisestä värillisestä muodosta oleellisesti värittömäksi ja toinen indikaattorikomponentti hapetetaan 20 lopulliseen värilliseen muotoon, joka on visuaalisesti erilainen kuin ensimmäinen väri, ja mahdollisesti c) kolmannesta hapetusindikaattorista, joka voidaan hapettaa vetyperoksidin ja peroksidatiivisesti aktiivisen komponentin läsnä ollessa, jolloin saadaan kolorimetrinen •*:25 vaste.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen testikoostumus, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää entsyymi-systeemiä, joka pystyy tuottamaan vetyperoksidia nestemäisessä näytteessä olevasta analyytistä.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen testikoos- • · | tumus, tunnettu siitä, että ensimmäinen indikaat torikomponentti hapetetaan värillisestä muodosta värittömäksi tai lähes värittömäksi ja sillä on rakenne > · 32 93277 ‘w'! 5 Ν=Ν-^Γ~^) M P X jossa M on H, OH, NH2 tai NH-asetyyli; 10. on NH2 tai OH; Zi ja Z2 ovat toisistaan riippumattomasti H tai -SOjH tai niiden suola; Y on H tai substituoitu fenyyliatsorengas; ja X on -N02.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen testikoostumus vetyperoksidin määrittämiseksi nestemäisestä näytteestä, tunnettu siitä, että a) peroksidatiivisesti aktiivinen aine on peroksi-daasi; ja 20 b) monihapetusindikaattorisysteemi koostuu yhdis- teestä4-amino-5-hydroksi-3-(p-nitrofenyyliatso)-6-(fenyy-liatso)-2,7-naftaleenidisulfonihappo, dinatriumsuola (Acid Black nro 1) ja vähintään toisesta hapetusindikaattorikom-ponentista, joka voidaan hapettaa vetyperoksidin ja perok-....:25 sidaasin läsnä ollessa, jolloin saadaan kolorimetrinen vaste.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen testikoostumus nestemäisessä näytteessä olevan analyytin määrittämiseksi visuaalisesti, tunnettu siitä, että toinen hape- 30 tusindikaattori koostuu kahdesta kytketystä hapetusindi- * ;* kaattorikomponentista, 4-aminoantipyriini/2-metyyli-indo- lista ja 4-aminoantipyriini/3,5-dikloori-2-hydroksibent-seenisulfonaatista.
6. Testiväline vetyperoksidin määrittämistä varten 35 tunnettu siitä, että se käsittää » » 93277 a) kantajämätriisin; ja b) kantajamatriisiin yhdistettynä testikoostumus-ta, joka sisältää peroksidaasia ja monihapetusindikaatto-risysteemiä, joka koostuu vähintään ensimmäisestä ja toi- 5 sesta indikaattorikomponentista, jotka molemmat voidaan hapettaa vain vetyperoksidin ja peroksidaasin läsnä ollessa; jolloin ensimmäinen indikaattorikomponentti voidaan hapettaa värillisestä muodosta oleellisesti värittömään muotoon ja toinen indikaattorikomponentti voidaan hapettaa 10 muotoon, jolla on väri, joka on visuaalisesti erilainen ensimmäisen indikaattorin toiseen muotoon verrattuna; ja jolloin lopullinen, reagoineen koostumuksen selvä väri saa aikaan visuaalisesti erilaisia värejä erilaisilla vetyper-oksidipitoisuuksilla.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen testiväline, tunnettu siitä, että siinä vähintään yksi indikaattorikomponentti on lokeroitu kerrostamalla. > · · « « j · 93277
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9514387 | 1987-09-11 | ||
| US07/095,143 US4855228A (en) | 1987-09-11 | 1987-09-11 | Multiple oxidative indicator system for visual determination of hydrogen peroxide |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI884131A0 FI884131A0 (fi) | 1988-09-08 |
| FI884131A FI884131A (fi) | 1989-03-12 |
| FI93277B FI93277B (fi) | 1994-11-30 |
| FI93277C true FI93277C (fi) | 1995-03-10 |
Family
ID=22250089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI884131A FI93277C (fi) | 1987-09-11 | 1988-09-08 | Testikoostumus ja -väline vetyperoksidin määrittämiseksi visuaalisesti |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4855228A (fi) |
| EP (1) | EP0306803B1 (fi) |
| JP (1) | JPH0690199B2 (fi) |
| AT (1) | ATE96178T1 (fi) |
| AU (1) | AU594254B2 (fi) |
| CA (1) | CA1321535C (fi) |
| DE (1) | DE3885048T2 (fi) |
| DK (1) | DK168024B1 (fi) |
| FI (1) | FI93277C (fi) |
| IE (1) | IE61442B1 (fi) |
| IL (1) | IL87438A (fi) |
| NO (1) | NO172869C (fi) |
| ZA (1) | ZA886281B (fi) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5436133A (en) * | 1989-06-20 | 1995-07-25 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Enzyme assay of biochemical substances |
| JP2642527B2 (ja) * | 1991-03-22 | 1997-08-20 | 淳一 岩村 | カタラーゼ活性測定法 |
| JPH07155196A (ja) * | 1993-12-10 | 1995-06-20 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 生体成分の測定法 |
| US5702955A (en) * | 1995-05-22 | 1997-12-30 | Bayer Corporation | Ascorbate resistant detection of hydrogen peroxide |
| JP3304985B2 (ja) | 1997-04-17 | 2002-07-22 | ジョンソン・エンド・ジョンソン株式会社 | ケミカルインジケーターシートおよびそれを使用した滅菌用包装袋 |
| AU781034C (en) | 1999-08-06 | 2006-05-11 | Imi International Medical Innovations Inc. | Spectrophotometric measurement in color-based biochemical and immunological assays |
| US6790411B1 (en) * | 1999-12-02 | 2004-09-14 | 3M Innovative Properties Company | Hydrogen peroxide indicator and method |
| US6635439B2 (en) | 2000-12-21 | 2003-10-21 | Ethicon, Inc. | Hydrogen peroxide indicator employing enzyme and dye |
| CN104380086A (zh) | 2013-04-26 | 2015-02-25 | 松下知识产权经营株式会社 | 氧化物质定量方法以及氧化物质定量装置 |
| WO2017044806A1 (en) * | 2015-09-10 | 2017-03-16 | Ecolab Usa Inc. | Self indicating antimicrobial chemistry |
| US11208675B2 (en) | 2016-07-13 | 2021-12-28 | Kikkoman Corporation | Reaction accelerating agent |
| US20210349085A1 (en) * | 2018-09-27 | 2021-11-11 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Immunochromatographic test strip |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2981606A (en) * | 1955-06-20 | 1961-04-25 | Lilly Co Eli | Glucose indicator and method |
| NL98884C (fi) * | 1957-01-08 | |||
| US3008879A (en) * | 1960-03-18 | 1961-11-14 | Miles Lab | Diagnostic composition for the quantitative determination of glucose |
| US4132527A (en) * | 1974-01-09 | 1979-01-02 | Shionogi & Co., Ltd. | Diagnostic compositions, diagnosing instruments, and methods of manufacturing same |
| AT347600B (de) * | 1974-11-11 | 1979-01-10 | Wellcome Found | Testeinrichtungen |
| US4042329A (en) * | 1974-12-18 | 1977-08-16 | Becton, Dickinson And Company | Method and device for detecting cholesterol |
| JPS5645198A (en) * | 1979-09-20 | 1981-04-24 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Determination of amount of hydrogen peroxide of activity of peroxidase |
| DE3211167A1 (de) * | 1982-03-26 | 1983-09-29 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Testsystem und verfahren zur bestimmung von substanzen in fluessigkeiten |
| JPS59230161A (ja) * | 1983-06-13 | 1984-12-24 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 還元性物質の分解方法及び分解用試薬 |
| US4810633A (en) * | 1984-06-04 | 1989-03-07 | Miles Inc. | Enzymatic ethanol test |
| JPS6152300A (ja) * | 1984-08-22 | 1986-03-14 | Eiken Kagaku Kk | 過酸化水素測定用組成物 |
| US4898813A (en) * | 1986-04-04 | 1990-02-06 | Albarella James P | Catalytic test composition intended to produce a range of colors |
| CA1295216C (en) * | 1986-04-04 | 1992-02-04 | James P. Albarella | Rainbow test device |
-
1987
- 1987-09-11 US US07/095,143 patent/US4855228A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-08-12 CA CA000574646A patent/CA1321535C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-08-12 IL IL87438A patent/IL87438A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-08-24 ZA ZA886281A patent/ZA886281B/xx unknown
- 1988-08-30 NO NO883861A patent/NO172869C/no unknown
- 1988-08-30 EP EP88114109A patent/EP0306803B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-30 AT AT88114109T patent/ATE96178T1/de active
- 1988-08-30 DE DE88114109T patent/DE3885048T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-09-07 AU AU21952/88A patent/AU594254B2/en not_active Ceased
- 1988-09-08 FI FI884131A patent/FI93277C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-09-09 DK DK501388A patent/DK168024B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-09-09 JP JP63224884A patent/JPH0690199B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-09 IE IE276388A patent/IE61442B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL87438A (en) | 1992-12-01 |
| NO883861D0 (no) | 1988-08-30 |
| IE61442B1 (en) | 1994-11-02 |
| CA1321535C (en) | 1993-08-24 |
| JPH01109261A (ja) | 1989-04-26 |
| EP0306803B1 (en) | 1993-10-20 |
| AU594254B2 (en) | 1990-03-01 |
| ZA886281B (en) | 1989-05-30 |
| DE3885048T2 (de) | 1994-02-10 |
| NO172869B (no) | 1993-06-07 |
| DK168024B1 (da) | 1994-01-17 |
| DK501388A (da) | 1989-03-12 |
| DE3885048D1 (de) | 1993-11-25 |
| FI93277B (fi) | 1994-11-30 |
| FI884131A0 (fi) | 1988-09-08 |
| ATE96178T1 (de) | 1993-11-15 |
| FI884131A (fi) | 1989-03-12 |
| IL87438A0 (en) | 1989-01-31 |
| NO172869C (no) | 1993-09-15 |
| IE882763L (en) | 1989-03-11 |
| JPH0690199B2 (ja) | 1994-11-14 |
| AU2195288A (en) | 1989-03-16 |
| NO883861L (no) | 1989-03-13 |
| DK501388D0 (da) | 1988-09-09 |
| US4855228A (en) | 1989-08-08 |
| EP0306803A3 (en) | 1990-08-22 |
| EP0306803A2 (en) | 1989-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI77939C (fi) | Askorbatstoerningsfri komposition, anordning och foerfarande foer bestaemning av peroxidativt aktiva substanser. | |
| AU645902B2 (en) | Ascorbate interference-resistant composition, device and method of assaying for a predetermined analyte | |
| FI85774C (fi) | Stabil komposition foer bestaemning av peroxidativt aktiva aemnen. | |
| US4247297A (en) | Test means and method for interference resistant determination of oxidizing substances | |
| FI93277C (fi) | Testikoostumus ja -väline vetyperoksidin määrittämiseksi visuaalisesti | |
| US3558435A (en) | Diagnostic agents for use in the determination of hydroperoxides and of peroxidate-active substances and methods for manufacturing and using the same | |
| PL114343B1 (en) | Preparation for determining enzymatic substrates or enzyme activity | |
| GB1575947A (en) | Analytical compositions and elements | |
| JP2003232789A (ja) | 安定化したテトラゾリウム試薬組成物およびこれを使用するための方法 | |
| EP1112376A1 (en) | Chromogen combinations for (per)oxidase-based determinations | |
| EP0444263A1 (en) | Improved composition, device and method of assaying for peroxidatively active substances | |
| JPS5948099A (ja) | アスコルビン酸塩耐性広濃度域用グルコ−ス試験組成物、試験具および試験方法 | |
| JPS6054624B2 (ja) | 試料中の講成成分測定用試験具 | |
| JPS6134799B2 (fi) | ||
| CN107807244A (zh) | 一种尿液潜血检测试纸及其制备方法 | |
| EP0043469B1 (en) | Interference-resistant test device for determining a peroxidatively active substance in a test sample and method for preparing it | |
| CA1289443C (en) | Test aids and method for the preparation thereof | |
| AU742373B2 (en) | Competitive apo-peroxidase assay | |
| CS260408B1 (cs) | Diagnostické proužky ke stanovení peroxidu vodíku | |
| JPS62291567A (ja) | 過酸化水素又はそれを生成する被検体の分析に対するメチン染料の使用 | |
| CS253138B1 (cs) | Diagnostické proužky ke stanovení součásti biologických kapalin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: MILES INC |