FI91753C - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen telluuripitoisen kompleksin valmistamiseksi - Google Patents

Description

91753

Menetelma terapeuttisesti kayttGkelpoisen telluuripitoisen kompleksin valmistamiseksi US-patenttihakemuksessa, jonka sarjanumero on 5 782 129 ja joka on jatetty 30.9.1985, ja joka liitetaan tahan viitteelia, kuvataan tiettyja orgaanlsia telluuri-ja seleeniyhdisteita, jotka ovat aktiivisia in vitro ja in vivosytokiinien tuotannossa. Nama yhdisteet ovat myOs kayttdkelpoisia joissakin sarjanumeron 782 129 patenttiha-10 kemuksessa esitetyissa sairauksissa. Eras naiden telluuri-ja seleeniyhdisteiden ominaisuus on se, etta ne ovat suh-teellisen liukenemattomia vesipitoiseen vaiiaineeseen, mika aiheuttaa hankaluuksia valmistettaessa ruoansulatus-kanavan ulkopuolelle annettavia farmaseuttisia koostumuk-15 sia. Patentinhakijat ovat todenneet, etta tietyt polykar-boksyylihapot muodostavat stabiilin kompleksin tiettyjen orgaanisten telluuri- ja seleeniyhdisteiden kanssa.

Siten taman keksinnGn avulla saadaan ensisijaisesti uusia komplekseja, jotka muodostuvat tietyista orgaanisis-20 ta telluuriyhdisteista sekå myrkyttGmista kompleksin muo-dostavista aineista, joilla on suuri liukenevuus veteen.

Keksintd koskee menetelmaa terapeuttisesti kayttO-kelpoisen telluuripitoisen kompleksin valmistamiseksi, joka muodostuu farmaseuttisesti hyvaksyttavasta kompleksin 25 muodostavasta aineesta ja yhdisteesta, jonka kaava on 0-ch2 C^Te^ NH4+ (A) 30 \ o-ch2

Nama yhdisteet pystyvat indusoimaan IL-2:n muodos-35 tumisen kuin myds IL-2-tuottajasolujen lisaantymisen seka IL-2-reseptorikohtien aktivoimisen.

2 91753

Keksinnblle on tunnusomaista, etta kaavan A mukai-nen yhdiste saatetaan reagoimaan sitraatti- tai tartraat-tipuskurin kanssa, joka muodostaa veteen liukenevan kom-pleksin mainitun telluuriyhdisteen kanssa.

5 Sopivia kompleksin muodostavia aineita ovat hydrok- sipolykarboksyylihapot, polykarboksyylihapot tai polyhyd-roksipolykarboksyylihapot. Tavallisesti on edullista val-mistaa keksinnOn mukaiset kompleksit saattamalla kaavojen A-E mukainen yhdiste reagoimaan sellaisen puskurisysteemin 10 kanssa, joka sisaitaa joko sitruuna- tai viinihappoa seka sen vastaavaa alkalimetallisuolaa, kuten natrium- tai ka-liumsuolaa.

YleensS voidaan yhdistaa ekvimolaariset maarat hap-poja ja vastaavia alkalimetallisuoloja, jotka ovat vesi-15 liuoksissa, kaavan A mukaisen yhdisteen kanssa, jolloin muodostuu keksinnOn mukainen kompleksi; 0,05 M - 0,5 M konsentraatiot puskuria ovat edullisia, mutta voidaan kayttaa suurempia tai alhaisempia maaria, edellyttaen, etta konsentraatio on riittava tietyn kaavan A mukaisen 20 yhdisteen liuottamiseksi. Voidaan kayttaa suurempia mooli-maaria, jolloin saadaan konsentraatioita, jotka voidaan laimentaa ennen suonensisaisesti antamista, tai ennen mui-den laakemuotojen valmistamista. Kaavan A mukaisen yhdisteen maara riippuu tuotteen lopullisesta kaytOsta. On to-•t 25 dettu, etta sitraatin tapauksessa ammoniumtrikloori-(diok-soetyleeni-0,0')-telluraatin konsentraatioita, jotka ovat 5 mg/ml ja suurempia, voidaan liuottaa esilia olevan kek-sinnbn mukaisesti. Fosfaattipuskurin (PBS) tapauksessa on painvastoin, ja siita voidaan liuottaa ainoastaan 200 pg/-30 ml ammoniumtrikloori-(dioksoetyleeni-0,0')-telluraattia.

On edullista kayttaa kompleksin vdsiliuosta suoraan otta- • · matta talteen ja uudelleen liuottamalla kompleksia. Kompleksi on stabiili jaatyneena, jaakaappilampdtilassa, huo-neenldmptttilassa tai kohotetuissa lampbtilassa tai kohote-35 tuissa lampOtiloissa. KeksinnOnmukaiset yhdisteet voidaan antaa nisakkaille hoidettaessa sydpaa, immuunipuutoksia, I: 3 91753 sairauksia, joissa tapahtuu imunoituminen omaa kudosta vastaan, seka infektiosairauksissa, kayttaen kullekin ti-lalle tehokkaita maaria. Hoidolla lievitetaan nåiden sai-rauksien oireita siten, etta nisakkaan keho saadaan tuot-5 tamaan suurempia maaria lymfokiineja. KeksintGGn sisaityy myGs sytokiinien, kuten lymfokiinien ja/tai niiden resep-torien, lisaantynyt tuotantomaara in vitro, seka naiden aineiden kayttG terapeuttisina aineina, jotka annetaan nisakkaille syGvan, immuunipuutostilojen ja infektiosai-10 rauksien lievittamiseen. On mahdollista, etta keksinndn mukaista koostumusta voidaan kayttaa yhdessa muiden sy6-vanvastaisten kemoterapeuttisten aineiden, kuten syklofos-famidin kanssa.

Termilia "syGpa" tarkoitetaan leukemiaa ja kiintei-15 ta kasvaimia, jotka syntyvat spontaanisti, ovat karsino-geenisen aineen, sateilytyksen tai onkoviruksien aiheut-tamia. Nama tilat ovat asiantuntijoiden tietamia, ja sel-laisia ovat munuaiskasvaimet, luukasvaimet, ruoansulatus-kanavan kasvaimet, aivokasvaimet, rintakasvaimet, ihokas-20 vaimet, keuhkokasvaimet, munasarjakasvaimet, virtsa-suku-elin-ja vastaavat kasvaimet. Merckin kasikirjan 13. pai-noksessa, Merck & Co. (1977), kuvataan monia tailaisia tiloja. Julkaisun sivut 647-650; 828-831; 917-920; 966; 970-974; 1273, 1277, 1271-1376; 1436-1441; 1563; 1612-1615 .· 25 liitetaan tahan viitteelia.

Termilia "immuunipuutossairaudet" kuvataan erilai-sia tilaryhmia, kuten hankittua immuunikato-oireyhtymaa (AIDS), jolle on paaasiallisesti tunnusomaista lisaantynyt alttius erilaisille infektioille, joista sesuraa vakava 30 akuutti, uusiutuva tai krooninen sairaus, joka johtuu yh-desta tai useammasta hairiOsta spesifisessa tai ei-spesi-fisessa immuunijarjestelmassa. Merckin kasikirjan 13. pai-noksessa sivuilla 205-220 kuvataan monia naista tiloista, ja sivut liitetaan tahan viitteelia.

35 Termi "sairaudet, joissa tapahtuu immunoituminen omaa kudosta vastaan" kasittaa hairiGt, joissa immuunijar- ______ Γ" 91753 4 jestelma tuottaa omavasta-aineita endogeeniselle antigee-nille, minka seurauksena kudokset vaurioituvat. Sivuilla 241-243 Merckin kasikirjan 13. painoksessa kuvataan tai-laisia tiloja, ja ne liitetaan tahan viitteelia.

5 Termilia "infektiotaudit" tarkoitetaan sellaisia patologisia tiloja, jotka ovat bakteeri-, virus- tai sie-niorganismien aiheuttamia, mainittujen organismien tunkeu-tuessa nisakkaan kehoon ja sekoittaessa kehon normaalitoi-minnan. Merckin kasikirjan 13. painoksessa sivuilla 3-149 10 kuvataan tailaisia tiloja ja ne liitetaan tahan viitteelia.

Yhdisteet voidaan antaa suun kautta, ruoansulatus-kanavan ulkopuolelle, ihon lapi, paikallisesti tai lima-kalvoille. Yhdisteet voidaan antaa suun kautta kovissa tai 15 pehmeissa nestemaisissa geelikapseleissa, liuoksissa tai suspensiokapseleissa, tai tableteissa, jotka voidaan val-mistaa kayttaen tunnettuja apuaineita, sideaineita, hajoi-tus-ja vastaavia aineita. Ruoansulatuskanavan ulkopuolelle annettaessa laake voidaan antaa lihakseen, suoneen, ihoon, 20 kayttaen pitkitetysti vapautuvaa kantaja-ainetta, tai ihon alle. Yhdisteiden, jotka ovat yhdistelmina farmaseuttisen kantaja-aineen kanssa, konsentraatio ei ole kriittisen tarkka ja se voidaan valita. Julkaisussa Remington's Practise of Pharmacy, 9., 15. tai 16. painoksessa kuvataan ·. 25 erilaisia farmaseuttisia kantaja-aineita, ja ne liitet&an tahan viitteelia.

On todettu, etta jotkut telluuriyhdisteet, jotka ovat kayttOkelpoisia keksintba toteutettaessa, hydrolysoi-tuvat vedessa. Ndma hydrolysoituvat koostumukset ovat ak-30 tiivisia in vivo ja in vitro, vaikka hydrolysoituneet koostumukset lopulta hajoavat ja menettavat kykynsa ai- • · kaansaada lymfokiinien erittyminen. Tasta syysta koostumukset tulee valmistaa juuri ennen kayttda. Jos yhdisteet annetaan suun kautta kuivassa muodossa, ne indusoivat te-35 hokkaasti lymfokiinien tuotannon. Yhdisteet tulisi edul- 5 91753 lisesti pitaå vedettdmissS olosuhteissa kåyttdhetkeen asti.

On todettu, etta tietyt yhdisteet, kuten Te02, yk-sistMSn indusoivat lymfokiinien tuotantoa tuottaja-T-solu-5 lymfosyyteissa in vitro ja in vivo, mutta ne eivat saa aikaan lymfokiinien lisaantymista tuottajasoluissa, kuten IL-2-tuottajasoluissa, eivatka ne aktivoi reseptorikohtia vsataaja-T-solulymfosyyteissa. Siten keksinnOn avulla on lisaksi mahdollista kayttaa yksistaan Te02- ja telluuriyh-10 disteita, jotka ovat aktiivisia lymfokiini-indusoijina.

Kun liuoksia, joissa oli esimerkin 1 mukaista sit-raattikompleksia, oli sailytetty eri lSmpdtiloissa noin kaksi ja puoli kuukautta, niista valmistettiin laimennok-set, ja hiiren pernakoe suoritettiin seuraavasti: 15 Pernat poistettiin Balb-c uroshiirista, jotka oli- vat 6-8 viikon ikaisia. Pernasolut tydnnettiin ruostumat-tomasta teraksesta valmistettujen, 60-seulakokoisten (US-standardi) verkkojen lapi, ja verkot olivat petrimaljois-sa, jotka sisaisivat PBS solujen erottamiseksi. Solut ke-20 rattiin sitten sentrifugiputkiin ja niita pyOritettiin nopeudella 1000 kierrosta/min 10 minuutin ajan. Sakan ylia oleva neste poistettiin ja soluja kasiteltiin 5 ml:11a hypotonista puskuria (0,15M, NH4C1; 0,01M KHC03 liuotet-tuna kahdesti tislattuun veteen, pH 7,2) tasmaileen kahden • 25 minuutin ajan. Sen jaikeen soluihin lisattiin PBS:a1 ja koeputkia sentrifugoitiin 10 minuutin ajan nopeudella 1000 kierrosta/min. Solut huuhdeltiin kahdesti ja laskettiin hemosytometrilia, kSyttSen trypaanisinistS elinkykyisyyden testaamiseksi. Solujen konsentraatio saatettiin arvoon 107 30 el&vaa solua/ml.

6 91753 *NaCl 8,0 g KC1 200 mg

Na2HP04 1150 mg KH2P04 2 00 mg

5 CaCl2 ei kirkas) 100 mg/L

MgCl26H20 100 mg/L

HzO riittavasti, jotta koko- naistilavuudeksi saadaan 1 litra 10

Solut saatettiin yhteen PMA:n, jota oli 25 mg/ml, sekå vedessS olevan kompleksin, jota oli vaihtelevia maaria, kanssa. Sen jaikeen soluja inkuboitiin 37°C:ssa, 7,5 % C02:ssa 96 tuntia. Sakan ylia oleva neste otettiin talteen 15 ja sen lL-2-aktiivisuus tutkittiin kayttaen tritioitua tymidiinia (3H-TdR). Tulokset kokeista, jotka suoritettiin 25 % ja 12,5 % sakan ylia olevalle nesteelle, esitetaan taysina lukuina miljoonassa (cpm) beta-tuikelaskimessa, ja ne esitetaan taulukossa 1. Taulukossa 1 esitetaan IL-2-20 vaikutuksen induktio, joka saadaan eri kompleksimaarilia. 1 « • · 7 91753

Taulukko 1

Ammoniumtri- Sakan ylla oleva neste (%) kloori-(dioksi-^ eteeni-0,0')- telluraatti yUg/ml _______ug/ml__25%_12 ,5 %_ 0,05 0.5 76133 99350 10 sitraatti

0.1 91022 6 5 51 S

0,05 5450 1723

0,1 0,5 65632 5077S

15 sitraatti 0,1 55127 27562 0 105 3432 1597 vertailu- 0,5 43333 35270 20 liuos, jos- . 9P-.T' sa PBS 0il 4^/c 2^-“ ++ 0,05 3/62 1565

Mg Ca ’ plasebo 1:10 -0- 5157 2373 1: 40 -0- 4 0S5 4172 25 1: 100 -0- 3320 21 92 91753 δ NSmS kokeet osoittavat ettS sitraattikompleksi on yhta tehokas kuin ei-kompleksoitu vertailuyhdiste.

Esimerkin 2 mukaisen kompleksin tehokkuus stimuloi-da IL-2-tuotantoa mSSritettiin hiiren pernakokeella. Tu-5 lokset esitetaån taulukossa 2.

Taulukko 2

Ammonium- Sakan ylla oleva neste trikloori- . .

(deoksietee- (cpm) 10 ni-0,0')- telluraatti (^ug/ml) _ u g /r, i___25%_12,5%__ 0,0 2M C, 5 64563 58015 15 tartraatti- 11258 5722 puskuri i 0.05 1152 887 t 0,04M 0rE 1513 610 tartraatti- . . ο-ιη - rc ,· C.l 2 o 10 1 d 9 8 puskuri ’ 20 Q f 05 1423 665 vertailu- 0,5 43233 35270 liuos, jos- - ^3-c 2SCr = sa PBS ^i 1 - - j /c

Mg++& Ca++ C,C5 3762 1255 • 25

Vertailuesimerkki

Ammoniumtrikloori-(dioksoetyleeni-O,O’ )-telluraatin sitraatti- ja tartraattikompleksien stimulointivaikutusta tutkitaan ihmisen yksitumaisille soluille.

30 Laskimokokoverta (jossa on mukana hepariinia; Evans ;; 10 IU/ml verta) laimennetaan RPMIilia suhteessa 1:1. Lai- mennettu veri asetetaan varovasti Lymphoprepille (Nylgard & Co., Oslo, Norja, tiheys 1,077 g/ml), kaksi osaa laimen-nettua verta yhdelle osalle LymphoprepiS. Kussakin put-35 kessa on 3 ml LymphoprepiS ja 6-7 ml laimennettua verta.

i 9 91753

Putkia sentrifugoidaan 30 minuuttia nopeudella 1600 kier-rosta/min. huoneeniamptttilassa. Sentrifugoinnin jaikeen yksitumaiset solut kerataan talteen faasien vaiisesta fraktiosta ja ne pestaan RPMIrlia kolme kertaa. Solut sus-5 pensoidaan uudelleen RPMI:hin, ne lasketaan hemosytomet-risså kayttaen trypaanisinista elinkykyisyyden testaami-seen, ja sitten niiden konsentraatio saatetaan arvoon 1 x 10-6 solua/ml rikstetussa RPMI:ssa. Taulukossa 3 esitetyt konsentraatiot lisattiin tilavuutena, jossa oil 10 % solu-10 seosta. 0,2 ml:n tasamaarat kustakin naytteesta laitettiin mikrolevyjen (NUNC) koloihin (triplikaatit). Mikrolevyja inkuboidaan 72 tuntia 37°C:ssa, minka jaikeen viljelmiin lisataan 3H-metyylitymidiinia, 1U Ci/kolo (Nuclear Research Center, Israel). Soluja inkuboitiin vieia ybn yli, ja 15 ne kerattiin talteen solujen kerayslaitteella. Lisaantymi-nen mitattiin beta-tuikelaskimella ja tulokset esitetaan taulukossa 3.

Taulukko 3

Ammoniumtrikloori- PMA 1,5 ng/ml 0,5 ng/ml 20 (deoksieteeni-0,0')- soluja soluja pg/ml 0,02M 0,5 1418 1680 ..: 25 JSiSr1- 0,1 0,05 22883 12800 0,04 0,5 2762 527 tartraatti- 20713 12990 puskun i 30 0,005 15327 16782 • « 0,05 0,5 1822 745 sitraatti 49402 8713 0,05 3937 5298 35 vertailu- 0,5 3287 2945 : PBS°S 0,1 42857 19810

Mg+ & Ca++ °<05 12923 6553 10 91753

Paikallisesti annettavat koostumukset voidaan val-mistaa dispergoimalla yhdisteet hydrofiiliseen tai hydro-fobiseen kosmeettiseen perusaineeseen. Paikallisesti an-nettavia koostumuksia ovat nesteet, voiteet, emulsiovoi-5 teet, liuokset, geelit ja pastat. Voidaan kayttaa vaselii-nia tai kaupallisia valmisteita, kuten Oil of Olay'ta. Konsentraatio voi olla 0,0001 - 10 paino-%.

Annokset keksinndn mukaisia yhdisteita joita kSy-tetaan stimuloimaan lymfokiinituotantoa tai joilla hoide-10 taan tiettyja tasså kuvattuja sairaustiloja, voivat vaih-della riippuen tietysta sairaudesta ja sairauden vaihees-ta. Yleisesti annettava yhdistemaara on 0,05 x 10‘3 - 1 x 10'3 g/kg, ja edullisesti se on 0,1 x 10'3 - 0,5 x 10"3 g/kg ruumiinpainoa kohti. Esimerkiksi annostus, joka on 1-3 15 mg/paiva 75 kiloiselle nisakkaaile, on mahdollinen riitta-va maara lymfokiinituotannon aikaansaamiseksi, mutta annostus voidaan sovittaa yksittaisen vastareaktion ja tie-tyn hoidettavan tilan mukaan. Hoidettaessa AIDSia, voidaan antaa 1,0-9,0 mg/m2 suonensisaisesti kolme kertaa vii-20 kossa. Lisaksi keksinndn mukainen yhdiste voidaan antaa samanaikaisesti aineiden, kuten 9-(1,3-dihydroksi-2-prop-oksimetyyli)guaniinin (DHPG) ja/tai AZT:n kanssa.

Sen lisaksi, etta yhdisteita voidaan kayttåa tassa edelia kuvattujen nisakkaiden hairiiiiden hoitoon, niita 25 voidaan kayttaa eiainiaakinnassa hoidettaessa virus- ja immuunisairauksia hevosissa, sorkkaeiaimissa ja siipikar-jassa. Naita hairiOita voidaan hoitaa siten, etta kayte-taan samoja maariå yhdisteita kuin hoidettaessa tassa ed-elia kuvattuja nisakkåiden hairiOita.

30 Kaytettaessa in vitro, solut voidaan stimuloida tuottamaan lymfokiineja, kåyttamaiia 1 x 10‘8 - 1 x 10"4, edullisesti 1 x 10'7 - 1 x 10‘5 g yhdistetta solumaaraa 106 solua/ml kohti.

Alustavissa hiirilia tehdyissa myrkyllisyyskokeis-35 sa on saatu LD50-arvoksi 300 pg/25 g ruumiinpainoa kohti 11 91753 kuusiviikkoisissa hiirissa, testattaessa esimerkin 1 yh-distetta. Yhdisteita voidaan kayttaa antibakteerisina ja virusvastaisina aineina kasvelssa ja eiaimlssa. Virusin-fektiot, kuten Lansi-Niilin virusinfektiot hiirissa ovat 5 herkkia esimerkin 1 yhdisteelle annoksella, joka on 10 pg/paiva/hiiri. Kasvien bakteeri-infektioita, kuten aka-mabakterioosia, jonka aiheuttaa Agrobacterium tumefaciens, voidaan hoitaa tai ennaltaehkaista levittamaiia 0,1 % liuosta, jossa on keksinndn mukaisia yhdisteita.

10 Eslmerkki 1

Valmistetaan kaksi sitraattipuskuriliuosta yhdis-tamaiia 0,05 M natriumsitraatin vesiliuos ja 0,05 M sit-ruunahappo, tai 0,01 M natriumsitraatti ja 0,1 M sit-ruunahappo. pH on noin 4, riippuen lisattavan yhdisteen A 15 maarasta. Naihin liuoksiin lisataan korkeintaan 5 mg/ml ammoniumtrikloori-(dioksoetyleeni-O,O')-telluraattia.

Esimerkki 2

Kayttéen esimerkin 1 menetelmaa valmistetaan 0,02 M tatraattipuskuri 0,02 M viinihaposta ja 0,02 M kaliumtart-20 raatista, ja mainittuja aineita on suhteessa 1:4. Samaa menetelmaa kayttaen valmistetaan myOs 0,04 M tartraatti-puskuri. Kompleksi muodostetaan lisaamaiia ammoniumtrikloori- (dioksoetyleeni-O, 0' )-telluraattiatartraattipusku-rin vesiliuokseen.

• ·

Claims (3)

12 91753

1. Menetelma terapeuttisesti kayttdkelpoisen kom-pleksin valmistamiseksi ammoniumtrikloori-(dioksoetyleeni- 5 0,0')-telluraatista, jonka kaava on o-ch2 Cl3Te/ NH4+ (A) 10 ^ °-ch2 _ seka myrkyttiimasta farmaseuttisesti hyvaksyttavasta komp-leksin muodostavasta aineesta, tunnettu sllta, 15 etta kaavan A mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan sit-raatti- tai tartraattipuskurin kanssa, joka muodostaa ve-teen liukenevan kompleksin mainitun telluuriyhdisteen kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, t u n-20 n e t t u siita, etta kompleksi sisaitaa sitraatti-ionin.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta kompleksi sisaitaa tartraatti-ionin. 1 «. 13 91753