FI91711C - Menetelmä monoklonaalisten anti-lipidi A-vasta-aineiden valmistamiseksi ja niiden käyttö gram-negatiivisten bakteerien määrityksessä - Google Patents

Description

91711

Menetelmå monoklonaalisten anti-lipidi A-vasta-aineiden valmistamiseksi ja niiden kaytto gram-negatiivisten bak-teerien måårityksesså 5 Keksinnon ala Tåmå keksinto kuuluu immunologian ja mikrobiologian piiriin ja koskee nisåkkåån monoklonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat gram-negatiivisten bakteerien lipopolysak-karidin (LPS) antigeenideterminanttien kanssa, jotka ovat 10 yhteisiå eri sukuihin kuuluville gram-negatiivisille bak-teereille.

Keksinnon tausta

Gram-negatiivisista bakteereista on viimeksi kulu-neina 20 vuotena tullut pååasiallisia, sairaalapotilaissa 15 kohtalokkaita bakteeri-infektioita aiheuttavia agensseja. Nosokomiaalinen (sairaalassa saatu) bakteremia kehittyy joka vuosi noin 194 000 potilaassa Yhdysvaltojen sairaa-loissa; naista potilaista noin 75 000 kuolee, Maki, D.G. teoksessa Nosocomial Infections, toim. Dixon, R.E. Yorke 20 Medical Books, USA, 1981, s. 183-196. Tåsså tuoreessa no-sokomiaalisia infektioita koskevassa epidemiologisessa katsauksessa ilmoitettiin, ettå kuusi huomattavaa gram-ne-gatiivista basillia on vastuussa useimmista etiologisista agensseista; ne ovat Escherichia coli, Pseudomonas aeru-25 ginosa, Proteus, Klebsiella, Enterobacter ja Serratia.

Antibiootit ovat nykyaan pååaseita kamppailussa no-sokomiaalista infektiota vastaan. Antibioottihoito ei kui-tenkaan tunnu våhentåvan gram-negatiivisten bakteerien ai-heuttamasta bakteremiasta johtuvien kuolemien mååråå ko-30 vinkaan merkittavasti, Braude et al., J. Infect. Dis. 136 (1977) S167-S173. Antibioottien heikkoudet saattaisivat aiheutua siitå, ettå gram-negatiivisten bakteerien ulko-kalvo ei låpåise lååkeaineita ja ettå ne eivåt kykene es-tåmåån bakteeriendotoksiinin aiheuttamia tappavia shokke-35 ja.

_ _ - T-- ---- 91711 2

Viime vuosikymmenellå useat ryhmåt ovat yrittåneet kehittåå passiivista Immunisaatiota antibioottien vaihto-ehdoksi tai tåydennykseksi nosokomiaalisten infektioiden torjunnassa. Odotettiin, ettå endotoksiinin vastainen an-5 tiseerumi voisi eståå ja kumota toksiinin vaikutukset ja voisi helpottaa gram-negatiivisten bakteerien poistumista retikuloendoteelijårjestelman kierrosta.

Koska gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamasta verenmyrkytyksestå johtuvan shokin kliininen kuva on 10 identtinen kokeellisesti endotoksiinilla aiheutetun shokin kanssa, gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamasta bakte-remiasta johtuvaa shokkia nimitetaån usein "endotoksiini-shokiksi". Tåman arvellaan johtuvan siitå, etta endotok-siinia esiintyy gram-negatiivisten bakteerien ulkokalvon 15 pinnalla ja se pystyy siten reagoimaan kehon nesteiden kanssa ja aiheuttamaan samoja håirioitå, joita havaitaan endotoksiini-injektion jålkeen.

Gram-negatiivisten bakteerien endotoksiinit ovat lipopolysakkarideja (LPS). Endotoksiineissa on våhintåån 20 kolme pååantigeenialuetta, Luderitz et al., Curr. Top.

Membr. Transp. 17 (1982) 79-151. Teoriassa kukin niista on suojaavan vasta-aineen tai antiendotoksiinin kohde. LPS:n kolme antigeenialuetta ovat lipidi A, ydinpolysakkaridi ja O-spesifinen polysakkaridi (jota nimitetaan myos 0-spesi-25 fiseksi ketjuksi tai yksinkertaisesti O-anti geeniksi). Kaaviokuva LPS:stå esitetåån kuviossa 1A. O-spesifinen polysakkaridi vaihtelee huomattavasti kunkin lajin myotå ja bakteerien serologisen tyypin mukaan. Useimpien gram-negatiivisten bakteerien lipidi A:lla ja ydinpolysakkaridilla 30 on kuitenkin samankaltainen, ellei identtinen rakenne.

Tåmå påtee erityisesti ydin-lipidi A -yhtymiskohdan kum-mallakin puolella olevaan alueeseen. Tåmå LPS:n alue si-såltåå kåytånnollisesti katsoen aina fosfaattia, 2-keto-3-deoksi-D-manno-oktonaattia (KDO) ja D-glukosamiinia sekå 35 tavallisesti L-glyseroli-D-mannoheptoosia (ks. kuvio IB).

91711 3

Aggressiivisissa bakteerikannoissa O-spesifinen po-lysakkaridi håviåå sellaisen mutaation seurauksena, joka riiståå bakteereilta jonunankumman O-antigeenin synteti-sointiin tarvittavista entsyymeistå tai entsyymin, joka 5 tarvitaan niiden kiinnittåmiseksi ytimeen. Ziegler et al. kåyttivat hyvåksi tåta geneettistå muuntamista kehittaåk-seen tavanomaisia (polyklonaalisia) antiseerumeja paljaana olevia ydinalueita vastaan olettaen, ettå LPS:n ytimen vasta-aine reagoisi yhtålåisesti kaikkien gram-negatiivis-10 ten bakteerien endotoksiinien kanssa, koska niiden ydinan-tigeenit ovat samankaltaisia, Ziegler et al., J. Immunol. Ill, (1973) 433-438. Ydinglykolipidin vasta-aineen tuotta-miseksi he valmistivat rokotetta E. coli 0111:B4:n aggres-siivisesta mutantista, joka tunnetaan J5:nå. Tåmån E. coli 15 -mutantin LPS-kemotyyppi (ydinhiilihydraattiket jun pituus) on samankaltainen kuin S. minnesota Rc:n LPS-kemotyyppi (kuvio 1C). Immunisoinnin jålkeen saatua kaniinin antisee-rumia nimitettiin J5-antiseerumiksi. Kuluneiden kahdeksan vuoden aikana tama ryhmå on osoittanut, ettå J5-antiseeru-20 mi kykenee eståmåån er i gram-negatiivisista bakteereista peråisin olevien endotoksiinien vaikutukset ja antamaan suojan tappavaa bakteremiaa vastaan elåimisså, joiden im-muniteettia on heikennetty.

Samanlaista låhestymistapaa kåyttåen McCabe kollee-25 goineen osoitti, ettå Salmonella minnesotasn aggressiivi- sen Re-mutantin (kuvio 1C) vastaiset antiseerumit suojasi-vat granulosytopeenisiå kaniineja tappavalta bakteremialta ja antoivat hiirille suojan heterologisilla endotoksii-neilla suoritettua tappavaa kåsittelyå vastaan, McCabe et 30 al., J. Infect. Dis. 136 (1977) S161-S166. Eri kokeessa Pseudomonas aeruginosasn vastainen polyvalenttinen ihmisen globuliini suojasi hiiriå tappavilta infektioilta. Tåmå antiseerumi ei saanut juuri ollenkaan aikaan ristikkåis-suojausta, Fisher, M.W., J. Infect. Dis. 136 (1977) S181-35 S185.

91711 4

Aivan hiljattain valmistettiin anti-LPS-ydinglyko-lipidiå ihmiskohteita rokottamalla, Zeigler et al., N. Eng. J. Med. 307 (1982) 1225-1230. Annettaessa antiseeru-meja vakavasti sairaille bakteremiapotilaille bakteremian 5 aiheuttamien kuolemien måårå våheni kåytånnollisesti kat-soen puoleen vertailupotilaisiin verrattuna. Potilaiden, jotka olivat voimakkaassa gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamassa shokissa, joukossa toipumisten måårå kohosi vertailupotilaissa saavutetusta 24 %:sta 45 %:iin niiden 10 potilaiden keskuudessa, joita hoidettiin antiseerumilla. Alustavat tiedot viittaavat siihen, ettå profylaksiaan kåytettåvå ihmisen antiseerumi voisi alentaa kuumetta ja våhentåå kuolleisuutta ja bakteremiaa gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamia infektioita sairastavissa neutro-15 peenisisså potilaissa.

Edellå mainituissa raporteissa esitetyn anti-LPS-seerumin suojausmekanismia ei kuitenkaan vielå ymmårretå hyvin. Joissakin tapauksissa havaittiin påinvastainen vai-kutus, Davis et al., J. Immunol. 102 (1969) 563-572, tote-20 sivat esimerkiksi, ettå LPS:n vastainen rotan antiseerumi aiheutti tappavan yliherkkyyden endotoksiinia kohtaan hii-risså, vaikka he samassa raportissa totesivat, ettå kanii-nin antiseerumit LPSråå vastaan våhensivåt endotoksiinista aiheutuvien kuolemien mååråå. Yhteenvetona esitettynå ha-25 vaittu suojausvaikutus voisi vaihdella kåytettyjen tavan- omaisten antiseerumien koostumuksesta ja tiitteristå, tes-tattujen bakteerien tåsmållisestå kannasta, antigeenin tai vasta-aineen antotiestå ja seroterapiassa kåytetyistå oh-jelmista riippuen.

30 Vålttååkseen tavanomaisten antiseerumien vaihtele- van tehon seroterapiassa Young et al., Clin. Research 30 (1982) 522a, valmistivat monoklonaalisia vasta-aineita kåyttåen immunogeenina S. minnesota R595:n LPS:åå. Niiden havaittiin bakteremiaelåinmallissaan antavan vain vaati-35 mattoman suojan gram-negatiivisten bakteerien yksittåisiå li 91711 5 lajeja vastaan.

Vaikka LPSin lipidi A -osan tiedetåån olevan vålt-tamåton endotoksiinin aktiivisuudelle, myrkyllisyyden ai-heuttavan lipidi A:n sisåltåmå tarkka antigeenidetermi-5 nantti (tai determinantit) on pysynyt epåselvånå. Luderitz et al., supra.

Yhteenveto keksinnostå Tåmå keksinto koskee menetelmåå monoklonaalisten anti-lipidi A -vastaaineiden valmistamiseksi, jotka rea-10 goivat spesifisesti gram-negatiivisille bakteereille yh-teisen LPS:n lipidi A -determinantin kanssa, ja menetel-måå sen måårittåmiseksi, ovatko bakteerit gram-negatiivi-sia seka anti-LPS-vasta-aineiden diagnostista kåyttoå. Keksinnon mukaisille menetelmille ja kaytolle on tunnus-15 omaista se, mitå patenttivaatimuksissa esitetåån. Tåmån keksinnon mukaisesti valmistetut monoklonaaliset anti-LPS-vasta-aineet reagoivat eri sukuihin kuuluvien gram-nega-tiivisten bakteerien kanssa. Vasta-aineiden laaja risti-reaktiivisuus voidaan lukea sen seikan ansioksi, ettå vas-20 ta-aineet reagoivat gram-negatiivisten bakteerien tuotta-man endotoksiinin lipidi A -alueen kanssa, jotka ovat yh-teisiå kaytannollisesti katsoen kaikentyyppisille gram-negatiivisille bakteereille. Ja mikå tårkeåå, tåssa kuvatut mukaiset anti-LPS-vasta-aineet antavat hiirille suojan 25 gram-negatiivisten bakteerien aiheuttaman infektion tappa-vaa vaikutusta vastaan ja lisaksi anti-LPS-vasta-aineet kumoavat gram-negatiivisten bakteerien endotoksiinin tap-pavan vaikutuksen in vivo. Tåssa kuvataan myos immortaali-sia, vasta-aineita tuottavia soluja, kuten nisåkåshybri-30 doomasolulinjoja, jotka tuottavat monoklonaalisia anti-LPS-vasta-aineita.

Tåmån keksinnon mukaisesti valmistettavat nisåkkåån monoklonaaliset anti-LPS-vasta-aineet soveltuvat moniin diagnostisiin ja terapeuttisiin kåyttotarkoituksiin, mu-35 kaan luettuina gram-negatiivisten bakteerien tai gram-ne- 91711 6 gatiivisten bakteerien tuottaman endotoksiinin toteamismene t elmå t, gram-negatiivisten bakteerien aiheuttaman infektion hoito nisåkkåisså ja bakteeri-infektion profylaksia nisåkkåisså.

5 Lvhvt selostus piirroksista

Kuvio 1 on yhteenveto lipopolysakkaridin, gram-negatiivisten bakteerien endotoksiinin, påårakennepiirteis-tå. Se kåsittåå lohkokaavion LPS:n antigeenialueista (kuvio 1A) ja kaavioesityksen Salmonella-LPS:stå (kuvio IB) 10 ja osoittaa hiilihydraattiketjun pååtekohdan kolmen agg-ressiivisen Salmonella-mutant in LPS-kemotyypin tapauksessa (kuvio 1C).

Kuvio 2 esittåå antigeenilaimennuskåyriå E. coli J5sn LPS:n (kuvio 2A), S. minn. Resn LPS:n (kuvio 2B) ja 15 vapaan lipidi A:n (kuvio 2C) vastaiselle hiiren monoklo-naaliselle anti-LPS-vasta-aineellef jotka kåyråt on saatu radioimmuunimittauksella (RIA).

Kuvio 3 esittåå hiiren monoklonaalisen anti-LPS-vasta-aineen 8A1 sitoutumista eri sukuihin ja lajeihin 20 kuuluvista gram-negatiivisista bakteereista peråisin ole-viin LPS-molekyyleihin elektroforeettisella immuunitåplå-analyysillå mååritettynå.

Kuvio 4 esittåå ihmisen monoklonaalisen anti-LPS-vasta-aineen HM16A sitoutumista kuvion 3 mukaisesti.

25 Kuvio 5 esittåå hiiren monoklonaalisen anti-LPS- vasta-aineen 5E4 sitoutumista P. aeruginosa:n 17 serotyy-pin kanssa kunkin serotyypin edustaessa kemiallisesti eri-laista LPS:n O-spesifistå polysakkaridia.

Kuvio 6 esittåå vapaan lipidi A:n tappavien toksis-30 ten vaikutusten kumoamista in vivo hiiren monoklonaalisten * anti-LPS-vasta-aineiden 8A1 ja 5E4 seoksella.

Kuvio 7 esittåå S. minn. Re:n LPS:n tappavien tok-sisten vaikutusten kumoamista in vivo hiiren monoklonaalisten anti-LPS-vasta-aineiden 8A1 ja 4A10 seoksella.

35 Kuvio 8 valaisee anti-LPS-vasta-aineen 8A1 kykyå 91711 7 ristireagoida gram-negatiivisten bakteerien kolmen heimon ja kahdeksan suvun 19 tyypilllsestå jåsenestå peråisin olevan vapaan lipidi A:n kanssa.

Yksitviskohtainen selostus keksinnostå 5 Tåman keksinnon mukaisesti valmistetut monoklonaa- liset anti-LPS-vasta-aineet reagoivat gram-negatiivisten bakteerien kanssa kautta sukujen. Vasta-aineet reagoivat nimenomaan tiettyjen LPS-molekyylin sisåltåmien antigeeni-determinanttien kanssa ja nåmå antigeenideterminantit ovat 10 useimmille gram-negatiivisille bakteereille yhteisiå. Toi-sin kuin serotyyppispesifiset vasta-aineet/ keksinnon mukaisesti valmistetut monoklonaaliset vasta-aineet sitoutu-vat sellaisiin LPS-molekyylin alueisiin, jotka ovat gram-negatiivisten mikro-organismien ulkokalvon oleellisia ra-15 kennekomponentteja ja kenties olennaisia toiminnallisia komponentteja. Tåstå syystå nåisså alueissa esiintyy hyvin våhån vaihtelua erilaisten gram-negatiivisten bakteerien kesken; ne ovat yhteisiå eri sukuihin, lajeihin ja sero-tyyppeihin kuuluville gram-negatiivisille bakteereille.

20 Sitå paitsi mutaatioiden, joista saattaisi olla seuraukse-na nåiden alueiden håviåminen tai merkittåvå muuttuminen ja siten vasta-aineen reaktiivisuuden håviåminen/ esiinty-minen on epåtodennåkoistå.

Tåmån keksinnon mukaisesti valmistetut anti-LPS-25 vasta-aineet tunnistavat LPS:n lipidi A -alueen ja sitou-tuvat siihen. Lipidi A:n tiedetåån olevan kaikkien gram-negatiivisten bakteerien ulkokalvon olennainen komponentti; yhtåån mutanttia/ josta lipidi A puuttuu, ei todella-kaan tiedetå olevan olemassa. Påinvastoin kuin LPS:n O-an-30 tigeeniosa, joka vaihtelee suuresti, lipidi A ei vaihtele merkittåvåsti eri serotyypin/ lajin tai suvun gram-negatiivisten bakteerien kesken. Anti-lipidi A -vasta-aineet reagoivat siis gram-negatiivisten bakteerien kanssa kautta serotyyppien/ lajien ja sukujen.

35 Monoklonaalisten vasta-aineiden kyky reagoida gram- » 91711 8 negatiivisten bakteerien kanssa osoitetaan måårittåmållå bakteerisoluihin sitoutuminen. Anti-LPS-vasta-aineet si-toutuvat hyvin monenlaisiin gram-negatiivisiin bakteerei-hin, mukaan luettuina Escherichia coli, Salmonella minne-5 sota, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa ja Ser-ratia marcescens, jotka kaikki edustavat eri bakteerisuku-ja. Lisåksi kaikki nåmå organismit ovat patogeenisia. Itse asiassa epidemiologiset tutkimukset osoittavat, ettå nama viisi lajia ovat syyna vahintåan kahteen kolmasosaan kai-10 kista nosokomiaalisista, gram-negatiivisten bakteerien ai-heuttamista bakteremioista. Nåmå vasta-aineet eivåt kykene reagoimaan gram-positiivisten mikro-organismien kanssa.

Kuten kokonaisten bakteerisolujen suhteenkin, vas-ta-aineilla on laaja ristireaktiivisuus LPS-molekyylien 15 suhteen. Anti-LPS-vasta-aineet reagoivat gram-negatiivisten bakteerien puhdistettujen LPS-molekyylien kanssa, jol-laisiin gram-negatiivisiin bakteereihin kuuluvat kaikki seuraavat tai useimmat seuraavista bakteereista: E. coli J5, E. coli 0111:B4, E. coli 055:BS, S. minnesota R595, K.

20 pneumonia, P. aeruginosa ja S. marcescens. Tåmå osoittaa, ettå anti-LPS-vasta-aineiden reaktiivisuus kokonaisten bakteerisolujen suhteen johtuu niiden kyvystå reagoida so-lun pinnalla olevan LPS-molekyylin kanssa. Lisåksi vaikut-taa siltå, ettå LPS:n lipidi A -osalla olevien determi-25 nanttien kanssa reagoivien vasta-aineiden ollessa kysymyk-sessa nåitå determinantteja on tarjolla bakteerien pinnalla vasta-aineen sitoutumista vårten.

Lisåksi anti-LPS-vasta-aineet ristireagoivat yksit-tåisen gram-negatiivisen bakteerilajin serotyypiltåån eri-; 30 laisten kantojen kanssa. Vasta-aineet esimerkiksi sitoutu- vat LPS-molekyyleihin, joita saadaan kaikkien 17 klassi-sesti erilaisen serologisen Pseudomonas aeruginosa -kannan membraaniraakapreparaateista. Sitå vastoin P. aeruginosa International Antigen Typing Scheme (IATS) -serotyyppiå 5 35 olevasta kannasta peråisin olevalle O-antigeenille spesi- 91711 9 finen monoklonaalinen vasta-aine reagoi ainoastaan huonos-ti serotyyppia 17 olevan kannan kanssa eikå reagoinut ol-lenkaan 15 muuta IATS-serotyyppiå edustavista kannoista peraisin olevan LPS:n kanssa, Hancock et al., Infect. Im-5 mun. 37 (1982) 166-171.

Lisaksi erååt anti-LPS-vasta-aineet sitoutuvat serologisesti luokittelemattomista P. aeruginosa -kannoista, jotka on eristetty kystistå fibroosia sairastavista poti-laista, saatuun LPS:åån. Siten nåmå monoklonaaliset anti-10 LPS-vasta-aineet eivåt tunnista pelkåståån kaikista serologisesti eri P. aeruginosa -kannoista peraisin olevaa LPSsåå, vaan myos serologisesti luokittelemattomista luon-nonisolaateista peraisin olevan LPS:n, mikå osoittaa, ettå anti-LPS-vasta-aineet tunnistavat lipopolysakkaridimole-15 kyylillå olevan antigeenideterminantin, joka såilyy gram-negatiivisissa bakteereissa ja on todennåkoisesti mukana uusissa luokittelemattomissa P. aeruginosa -kannoissa.

Keksinnon mukaisesti valmistetut monoklonaaliset vasta-aineet suojaavat gram-negatiivisten bakteerien in-20 fektoimia hiiriå mikro-organismien tappavilta vaikutuksilta. Anti-LPS-vasta-aineiden suojauskyky osoitetaan kahdel-la erilaisella bakteremiamallijarjestelmållå hiirisså, suora verenmyrkytys -mallilla ja palohaavaverenmyrkytys-mallilla. Suora verenmyrkytys -mallissa hiiriin ruiskute-25 taan vasta-aineiden seosta, ja ne infektoidaan sen jålkeen laskimonsisåisesti lukuisilla serotyypiltåån erilaisilla gram-negatiivisilla bakteereilla. Palohaavamallissa hiiriå poltetaan alkoholiliekillå ja vaurioitunut nahka inokuloi-daan åårimmåisen virulentilla P. aeruginosa -kannalla. Mo-30 noklonaalisia anti-LPS-vasta-aineita annetaan joko yhtenå ruiskeena 24 tuntia ennen polttamista tai kahtena ruiskee-na, ensimmåinen 24 tuntia ennen polttoa ja toinen 20 tuntia sen jålkeen.

Kummassakin mallijårjestelmåsså monoklonaaliset 35 vasta-aineet joko eståvåt hiirten kuoleman tai viivåstyt- ___ - t— 91711 10 tåvåt sitå. Tåmå osoitetaan useiden eri sukujen gram-nega-tiivisille bakteereille. Suora verenmyrkytys -mallissa useimmat vasta-aineilla hoidetut hiiret olivat elossa seitseman vuorokauden kuluttua bakteeri-inokulaatiosta, 5 kun taas kaikki vasta-aineita saamattomat hiiret kuolivat muutamassa påivåsså. Kaikki poltetut hiiret, jotka saivat vasta-aineita jommankumman hoito-ohjelman mukaan, pysyivåt hengisså huomattavasti pitempåån. Huomattavaa on se, ettå poltetut hiiret, jotka saivat anti-LPS-vasta-aineita, te-10 kivåt kuolemaa vasta pidentyneen elinaikansa viime vai-heissa, kun taas hiiret, jotka eivåt saaneet vasta-aineita, tekivåt kuolemaa nopeasti. Hiirten lopulta tapahtuva kuolema saattaa liittyå suojaavan vasta-aineen loppumi-seen. Vasta-aineiden toistuva antaminen nåille hiirille 15 saattaa pidentåå elinaikaa rajattomasti.

Arvellaan, ettå anti-LPS-vasta-aineiden suojaava vaikutus on tulosta vasta-aineen sitoutumisesta bakteeri-soluun. Tåmå sitoutuminen saattaa ediståå opsonisaatiota tai aktivoida komplementtia. Bakteerisolujen opsonointi 20 vasta-aineella ediståå granulosyyttien ja makrofagien ra-vinnonottoa solusta. Komplementin aktivoituminen johtaa solun hajoamiseen.

Monoklonaaliset anti-LPS-vasta-aineet pystyvåt ku-moamaan LPS:n tappavat myrkylliset vaikutukset in vivo. 25 Erilaiset monoklonaalisten vasta-aineiden seokset esimer- kiksi pidensivåt elinaikaa hiirillå, joihin ruiskutettiin aggressiivisista mutanteista peråisin olevaa vapaata lipi-di A:ta tai LPS:åå, joiden kummankin tiedetåån sisåltåvån LPS:n toksisen aineosan. Siten nåyttåå siltå, ettå vasta-30 aineet peittåvåt LPS:n toksiset alueet in vivo ja tåmå te-kee mahdolliseksi vasta-aineiden suojaavan vaikutuksen en-dotoksiinin tappavilta vaikutuksilta.

Monoklonaalisia anti-LPS-vasta-aineita tuottavat vasta-aineita tuottavat solulinjat. Anti-LPS-vasta-ainetta 35 tuottavat solulinjat voivat olla hybridoomasolulinjoja, 91711 11 joista tavallisesti kaytetåån nimitysta hybridooma. Hybri-disolut muodostetaan liittamålla yhteen anti-LPS-vasta-ai-netta tuottava solu ja immortalisoitu solulinja, so. solulinja, joka antaa hybridisolulle pitkåån kestavån stabii-5 lisuuden kudosviljelmasså. Muodostettaessa hybridisolulin- joja, voi ensimmainen liittåmisosapuoli, anti-LPS-vasta-ainetta tuottava solu, olla gram-negatiivisia bakteereita tai gram-negatiivisten bakteerien endotoksiinla vastaan immunoituneen elåimen pernasolu. Anti-LPS-vasta-ainetta 10 tuottava solu voi vaihtoehtoisesti olla pernasta, ååreis-verestå, imusolmukkeista tai muusta kudoksesta saatu anti-LPS:åå muodostava B-lymfosyytti. Toinen liittåmisosapuoli, immortaalisolu, voi olla lymfoblastoidisolu tai plasmasy-toomasolu, kuten myeloomasolu, joka itse on vasta-aineita 15 tuottava solu, mutta myos pahanlaatuinen.

Hiirihybridoomia, jotka tuottavat monoklonaalisia anti-LPS-vasta-aineita, muodostetaan liittåmallå yhteen hiiren myeloomasoluja ja pernasoluja hiiristå, jotka on immunisoitu kokonaisia gram-negatiivisia bakteerisoluja 20 (esimerkiksi lammollå inaktivoitua E. coli J5:å) tai gram-negatiivisista bakteereista eristettya lipopolysakkaridia (esimerkiksi E. coli J5:n LPS:aå) vastaan. Hiirten immu-noimisessa voidaan noudattaa valikoimaa erilaisia immuni-sointiohjelmia. Hiirille voidaan esimerkiksi tehda ensisi-25 jainen ja tehosteimmunisoinnit kokonaisilla grcun-negatii-visilla bakteerisoluilla. Vaihtoehtoisesti voivat seka en-sisijainen ettå tehosteimmunogeeni olla lipopolysakkaridi-molekyylejå tai lipopolysakkaridiseoksia tai ensisijainen immunogeeni voi olla kokonainen bakteerisolu, jonka jål-30 keen seuraa LPS-tehosteimmunogeeni. Liittåmiset tehdåan tavanomaisin menettelytavoin, Kohier ja Milstein, Nature (London) 256 (1975) 495-497; Kennet, R. teoksessa Monoclonal Antibodies, toim. Kennet et al., Plenum Press, NY 1980 s. 365-367.

35 Hybridoomista tutkitaan sitten kokonaisten gram-ne- 91711 12 gatiivisten bakteerisolujen tai gram-negatiivisista bak-teereista saatujen vapaiden LPS-molekyylien kanssa reagoi-van vasta-aineen tuotanto. Ne, jotka erittåvåt reaktiivi-sia vasta-aineita, kloonataan.

5 Monoklonaalisia anti-LSP-vasta-aineita tuotetaan suurina maårinå injektoimalla anti-LPS-vasta-ainetta tuot-tavia hybridoomia hiirten vatsaonteloon, ottamalla sopivan ajan kuluttua talteen vesivatsaneste, joka sisåltåå hyvin suuren måårån homogeenista vasta-ainetta ja eriståmållå 10 monoklonaaliset anti-LPS-vasta-aineet siitå. Vierasta al-kuperåå olevat hybridoomat tulisi ruiskuttaa såteilytet-tyihin tai kateenkorvattomiin karvattomiin hiiriin. Vasta-aineita voidaan vaihtoehtoisesti tuottaa viljelemallå an-ti-LPS:åå tuottavia soluja in vitro ja eriståmålla eritty-15 neet monoklonaaliset anti-LPS-vasta-aineet soluviljelmå-alustasta.

Tåmån keksinnon mukaisesti valmistetuilla monoklo-naalisilla anti-LPS-vasta-aineilla on joukko tårkeitå terapeuttis ia kåyttotarkoituksia. Tårkein on gram-negatii-20 visten bakteerien aiheuttaman bakteremian hoito nisåkkåis-så. Monoklonaaliset anti-LPS-vasta-aineet ovat tehokkaita mikrobien vastaisia aineita taistelussa nosokomiaalisia tai endogeenisia gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamia infektioita vastaan. Nåitå vasta-aineita voidaan kåyttåå 25 immunoterapiassa nisåkkåiden suojaamiseksi gram-negatii visten bakteerien aiheuttaman bakteremian ja endotoksiini-shokin tappavilta vaikutuksilta. Koska anti-LPS-vasta-ai-neet antavat ristiin suojaavan immuuniteetin kaikkia tårkeitå patogeenisia gram-negatiivisia mikro-organismeja 30 vastaan, ne ovat laajaspektrisiå gram-negatiivisten mikro bien vastaisia aineita. Nåitå vasta-aineita voidaan lisåk-si kåyttåå hoidettaessa muita gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamia infektioita, kuten virtsatieinfektiota tai eståmåån mikro-organismin leviåminen pååasiallisesta 35 infektiokohdasta verenkiertoon.

i 91711 13

Tehokkaimman immunoterapian aikaansaamiseksi olisi ilmeisesti edullista antaa anti-LPS-vasta-aineiden yhdis-telmiå, jotka reagoivat LPS-molekyylisså esiintyvien eri-laisten yleisten antigeenideterminanttien kanssa. Lisåksi 5 voidaan antaa vasta-aineita yhdesså antibioottien tai mui-den mikrobien vastaisten aineiden kanssa.

Vasta-aineet tulisi yleenså antaa lasklmon- tai li-haksensisåisesti fysiologisesti hyvåksyttåvåsså liuokses-sa.

10 Keksinnon mukaisesti valmistettu jen anti-LPS-vasta- aineiden toinen tårkeå kåyttokohde on gram-negatiivisten bakteerien aiheuttaman bakteremian ehkåisy. Tietyt poti-lasryhmåt, jotka ovat suuressa vaarassa, voidaan immuni-soida passiivisesti gram-negatiivisia bakteereita vastaan 15 antamalla nåitå vasta-aineita. Tållaisiin riskiryhmiin kuuluvat potilaat, joiden immuunijårjestelmå on tukahdu-tettu tai heikennetty, kuten syovån kemoterapiahoidossa olevat potilaat, hankittua immuniteetin puutostilaa (AIDS) sairastavat ja ikååntyneet potilaat. Muita gram-negatii-20 visten bakteerien aiheuttamalle bakteremialle erityisen alttiita potilasryhmiå ovat palovammapotilaat, kystistå fibroosia sairastavat tai leikkauksen tai muun voimakkaan toimenpiteen låpikayvat potilaat. Naisså tapauksissa vas-ta-ainetta tai vasta-aineseosta annettaisiin potilaille 25 antamaan ristiin suojaava immuniteetti, joka eståå gram-negatiivisten bakteerien aiheuttaman bakteremian. Samoin kuin bakteremian hoidossa, voi bakteremian ehkaisyyn si-såltyå antibioottien tai muun mikrobien vastaisen aineen antaminen samanaikaisesti anti-LPS-vasta-aineiden kanssa. 30 Monoklonaalisten anti-LPS-vasta-aineiden laajan ristireaktiivisuuden gram-negatiivisten bakteerien kanssa ansiosta ovat nåmå vasta-aineet kåyttokelpoisia erilaisis-sa menettelyisså gram-negatiivisten bakteerien havaitsemi-seksi. Nåitå vasta-aineita voidaan kåyttåå mååritettåesså 35 se, ovatko bakteerit gram-negatiivisia. Tåhån tarkoituk- 91711 14 seen voidaan anti-LPS-vasta-aineita kåyttåå joukossa eri-laisia gram-negatiivisille bakteereille tarkoitettuja im-muunitutkimuksia. Naihin kuuluvat tavanomaista tyyppiå olevat radioimmuunitutkimukset ja tutkimukset, joissa kåy-5 tetåån entsyymiin liitettyå immuuniadsorbenttia. Anti-LPS-vasta-aineita voidaan vaihtoehtoisesti kåyttåå fluoresens-simikroskooppimenetelmisså sen måårittåmiseksi, ovatko bakteerit gram-negatiivisia. Eråasså toteutustavassa lei-mataan itse anti-LPS-vasta-aineet fluoresoivalla yhdis-10 teellå, kuten fluoreseiinilla ja ne saatetaan sitten kos-ketukseen bakteerinåytteen kanssa. Vaihtoehtoisessa tavas-sa leimaamattomat anti-LPS-vasta-aineet saatetaan koske-tukseen bakteerinåytteen kanssa, ja lisåtåån sitten toista fluoresoivalla aineella leimattua vasta-ainetta, joka on 15 anti-LPS-vasta-aineen vastainen. Kummassakin tavassa anti-LPS-vasta-aineiden sitoutumista bakteereihin voidaan seu-rata mikroskoopilla. Lopuksi, koska gram-negatiivisten bakteerien pinnalla on lukuisia LPS-antigeeneja, voidaan keksinnon mukaisesti valmistettujen anti-LPS vasta-aineita 20 kåyttåå erilaisissa agglutinaatiotutkimuksissa tai muissa gram-negatiivisille bakteereille kåytettåvisså tavanomai-sissa immunologisissa tutkimuksissa.

Kunkin edellå kuvatun tutkimuksen herkkyyttå voidaan parantaa paljastamalla gram-negatiivisten bakteerien 25 pinnoilla olevat LPS-antigeenideterminantit, joihin anti- LPS-vasta-aineet sitoutuvat. Anti-lipidi A -vasta-aineiden ollessa kyseesså voidaan pååsyå antigeenideterminantteihin helpottaa esikåsittelemållå bakteerit lievåsti happamalla vesiliuoksella. Tåmå kåsittely poistaa edullisella tavalla * 30 LPS:n ydin- ja O-antigeenialueet, Galanos et al., Eur. J.

; Biochem. 24 (1971) 116-122.

Diagnostiset pakkaukset edellå kuvattujen tutkimus-ten tekemistå vårten voisivat sisåltåå monoklonaalista an-ti-LPS-vasta-ainetta tai leimattua anti-LPS-vasta-ainetta 35 tai leimattujen tai leimaamattomien vasta-aineiden seok- 91711 15 sia.

Edellå kuvatut tutkimukset antaisivat lååkåreille nopean ja luotettavan menetelman gram-negatiivisten bak-teerien poissulkemiseksi etiologisena agenssina baktere-5 miapotilaissa. Nykyinen gram-vårjåysmenetelmå sen måårit-tåmiseksi, onko kliininen bakteerinåyte gram-negatiivinen, vaatii våhintåån yhden påivån. Jotta våltettåisiin usein tappavan sairauden hoidon viivåstyminen, oletetaan etiolo-gisen agenssin usein olevan gram-negatiiviset bakteerit, 10 koska gram-negatiiviset bakteerit aiheuttavat pååosan no-sokomiaalisista bakteeri-infektioista. Tåmån seurauksena annetaan aminoglykosideja, tårkeimpiå gram-negatiivisten bakteerien vastaisia aineita. Aminoglykosidit ovat kuiten-kin vakavasti myrkyllisiå, erityisesti kuulo- ja tasapai-15 noelimille ja munuaisille. Tutkimukset, joilla voitaisiin nopeasti sulkea pois gram-negatiiviset bakteerit tulehduk-sen syynå, tekevåt lååkåreille mahdolliseksi vålttåå ami-noglykosidihoidon antaminen potilaille ja siihen liittyvå vakava myrkyllisyysriski ilman merkittåvåå hoidon viivås-20 tymistå potilailla, joilla on gramnegatiivisten bakteerien aiheuttama bakteremia.

Koska keksinnon mukaisesti valmistetuilla anti-LPS-vasta-aineilla on LPS:åån rajoittunut spesifisyys ja laaja ristireaktiivisuus eri gram-negatiivisten mikro-organis-25 mien LPSsien kanssa, niitå voidaan kåyttåå gram-negatiivi-sen bakteerin endotoksiinin havaitsemiseen ja mittaamiseen biologisesta nesteestå.

Vasta-aineita voidaan kåyttåå tåhån tarkoitukseen tavanomaisissa immuunitutkimuksissa, kuten radioimmuuni-30 tutkimuksessa tai tutkimuksessa, jossa kåytetåån entsyy-miin liitettyå immuuniadsorbenttia. Monissa nåistå tutki-muksista immunoadsorbentti muodostetaan kiinnittåmållå an-ti-LPS-vasta-aine kiinteåån faasiin. Esimerkiksi kompeti-tiivisessa immuunitutkimuksessa endotoksiinin toteamiseksi 35 saatetaan biologinen nestenåyte kosketukseen immuuniadsor- 91711 ie bentin kanssa. Seosta inkuboidaan, minkå jålkeen lisåtåån ennalta maåråtty måårå leimattua LPS:åå. Inkuboidaan edel-leen, erotetaan sitten immuuniadsorbentti ja siihen liit-tynyt LPS (so. LPS-anti-LPS-kompleksi) vapaasta LPSsstå ja 5 mitataan merkkiaineen aktiivisuus sidotussa tai vapaassa LPS-fraktiossa nåytteessa olevan endotoksiinimåårån måå-rittåmiseksi. Tållaisissa tutkimuksissa voi merkkiaine ol-la radioisotooppi, entsyymi tai fluoresoiva yhdiste.

Anti-LPS-vasta-aineet ovat lisaksi kåyttokelpoisia 10 toimenpiteisså gram-negatiivisten bakteerien tai gram-ne-gatiivisen bakteerin endotoksiinin poistamiseksi biologi-sesta nesteestå. Eras tållainen toimenpide, jolla on tera-peuttista arvoa, on veren kåsitteleminen elimiston ulko-puolella gram-negatiivisten bakteerien tai endotoksiinin 15 poistamiseksi. Tåmå voidaan tehdå johtamalla veri kiintean faasin yli/ johon anti-LPS-vasta-aine on kiinnitetty. Vas-ta-aine sitoo selektiivisesti bakteerit tai endotoksiinin.

Vasta-aineita voidaan analogisesti kayttaa gram-negatiivisten bakteerien tai endotoksiinin poistamiseen so-20 luviljelmaalustasta. Esimerkiksi viljelyalustat, joista luonnossa esiintyvåt tai geneettisesti kåsitellyt mikroor-ganismit on måårå eriståå, ovat usein gram-negatiivisten bakteerien tai endotoksiinin kontaminoimia. Kiinteåån faa-siin sidottuja vasta-aineita voidaan kåyttåå nåiden konta-25 minoivien aineiden poistamiseen alustasta samalla tavalla kuin edellå kuvattiin veren elimiston ulkopuolisen kåsit-telyn yhteydesså.

Keksinnon mukaisesti valmistettuja anti-LPS-vasta-aineita voidaan kåyttåå myos joukossa diagnostisia mene-30 telmiå in vivo. Leimattuja anti-LPS-vasta-aineita voidaan kåyttåå kuvausmenetelmisså gram-negatiivisia bakteereja sisåltåvien mårkåpesåkkeiden tai rakkuloiden paikallista-miseksi nisåkkååsså. Tållaisissa menetelmisså annetaan vasta-ainetta nisåkkåålle, jolla epåillåån olevan gram-ne-35 gatiivisia bakteereita sisåltåvå mårkåpesåke tai rakkula.

91711 17

Koska vasta-aineella on erityinen affiniteetti gram-nega-tiivisiin bakteereihin, se kerååntyy bakteremiapesåkkee-seen. Konsentroitunut leimattu vasta-aine antaa havaitta-vissa olevan signaalin, jolloin saadaan kuva pesåkkeestå 5 ja samalla selville sen sijaintikohta.

Anti-LPS-vasta-aineita voidaan kåyttåå esimerkiksi radiolååkeaineina radioimmunoskintigrafissa. Tåtå vårten vasta-aine leimataan gammasåteilyå emittoivalla radioiso-toopilla, kuten jodi-125:llå/ jodi-131:11a, teknetium-10 99m:llå tai indium-111:llå. On olemassa erilaisia menetel-miå radioisotooppien kiinnittåmiseksi vasta-aineisiin joko suoraan tai kelatoivan aineen, kuten dietyleenitriamiini-pentaetikkahapon avulla. Mi tå tahansa nåistå menettelyistå voidaan kayttåå anti-LPS-vasta-aineiden leimaamiseen. 15 Usein on edullista kåyttåå vasta-aineiden antigeeniin si-toutuvaa fragmenttia. Fab, vasta-aineen univalenttinen antigeeniin sitoutuva osa tai F(ab')2, bivalenttinen antigeeniin sitoutuva osa, valmistetaan pilkkomalla vasta-aine papaiini- ja vastaavasti pepsiinientsyymillå tavanomaisin 20 menettelytavoin. Nåmå antigeeniin sitoutuvat fragmentit poistuvat yleenså paljon nopeammin verenkeråytymåstå ja antavat siksi kontrastiltaan paremman radiokuvan mårkåpe-såkkeestå lyhyemmåsså ajassa.

Anti-LPS-vasta-aineet voidaan toimittaa reagenssi-25 pakkauksina nisåkkåiden radioimmunoskintigrafiaa vårten. Tållaiset pakkaukset sisåltåisivåt jollakin gammasåteilyå emittoivalla radioisotoopilla leimattua monoklonaalista anti-LPS-vasta-ainetta tai vasta-aine£ragmentteja.

Anti-LPS-vasta-aineita voidaan kåyttåå reagensseina 30 ydinmagneettinen resonanssi -kuvauksessa (NMR-kuvaukses- sa). Anti-LPS-vasta-aineet tai vasta-ainefragmentit voidaan esimerkiksi leimata paramagneettisella aineella, ku-ten mangaanilla. Leimattu vasta-aine muodostaa NMR-aktii-visen signaalin, joka antaa kuvan mårkåpesåkkeestå.

35 Kaksi hiiren monoklonaalista anti-LPS-vasta-ainet- 91711 18 ta, joista kåytetåån merkintojå 8A1 ja 4A10, talletettiin kokoelmaan the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, 7.10.1983. Vasta-ainetalletteille on annettu seuraavat ATCC-numerot: 5 8A1 ATCC-nro 40083 4A10 ATCC-nro 40084.

Keksintoa valaistaan seuraavaksi tarkemmin erityis-esimerkkien avulla.

Esimerkki 1 10 Gram-negatiivisten bakteerien lipopolysakkaridin vastaisten hiiren monoklonaalisten vasta-aineiden tuotta-minen

Bakteeriantiqeenien valmistus

Seuraavat lipopolysakkaridit (LPS:t) saatiin List 15 Biological Laboratories, Inc:sta (C simp bell, CA): Esche richia coli J5, Escherichia coli 0111 :B4, Escherichia coli 055:B5 (ATCC 12014), Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031), Pseudomonas aeruginosa FD Type I (ATCC 27312), Salmonella minnesota, villi tyyppi (ATCC 9700), Salmonella minnesota 20 R595 ja Serratia marcescens (ATCC 14756). Salmonella typ- himurium Re-mutantin (G30-C21) LPS:n hankintapaikka oli Ribi Immunochem Research, Inc. (Hamilton. MT). Naytteet saatettiin liuokseen valmistajan suosittelemalla tavalla eli kaikki LPS-naytteet sekoitettiin liuokseen, joka si-25 sålsi 0,5 tilavuus-% trietyyliamiinia (TEA) ja 0,9 % (paino/tilavuus) NaCl:a, pitoisuudeksi 2,0 mg/ml ja kaikki muut laimennukset tehtiin steriiliin ja pyrogeenivapaaseen fosfaattipuskuroituun (30 mM, pH 7,4) fysiologiseen suola-liuokseen (PBS).

30 Escherichia coli J5 on E. coli 0111:B4:n rosoinen mutantti, jolta puuttuu uridiinidifosfaattigalaktoosi-4-epimeraasientsyymi, Ziegler et al. J. Immunol. Ill, (1973) 433-438. Siten tåltå mutantilta puuttuu koko O-antigeeni-sivuketju samoin kuin osa ydinrakenteesta. Sekå mutantti-35 ettå låhtokannan samoin kuin kaikki muut bakteerikannat 91711 19 toimitti tri David Dunn (Minneapolis, MN): Escherichia co-li 055:BS (ATCC 12014), Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27312), Salmonella minnesota, Salmonella minnesota R595, Serratia marcescens (ATCC 5 14756), Streptococcus faecalis ja Staphylococcus aureus (ATCC 10832). American Type Culture Collection -merkinnåt annetaan niille kannoille, jotka ovat saatavissa.

Kutakin organismia inkuboitiin 18 tuntia aivosydån-infuusioliemesså (BHI) ravistinhauteessa 37 °C:ssa ja kå-10 siteltiin sitten kolmesti sentrifugointisyklisså, jossa sentrifugoitiin 4 °C:ssa kiihtyvyydellå 3 000 x g 10 mi-nuuttia ja suspendoitiin takaisin 0,9-%:iseen (paino/tila-vuus) NaCl-liuokseen. Bakteerilukumåårien alkuarviointi tehtiin Klett-Summerson-kolorimetrin avulla. Tehtiin sar-15 jalaimennukset ja tasmållinen laskenta agarkaatomaljoilla. Lammollå inaktivoitu bakteeriantigeeni valmistettiin auto-klavoimalla logaritmisessa vaiheessa olevaa kasvustoa BHI-liemesså, sen jålkeen kun oli poistettu annos laskentaa vårten.

20 Kiinteåfaasiradioimmuunitutkimukset lRIA) 50 μ1:η annoksia antigeenin PBS-liuosta lisåttiin polyvinyylistå valmistetun u-pohjaisen 96-syvennyksisen mikromaljan syvennyksiin (Dynatech Corp., Alexandria, VA), ja annettiin seistå 2-4 tuntia 37 °Csssa tai yon yli 4 25 °C:ssa. Lammollå inaktivoituja kokonaisia bakteerisoluja levitettiin maljoille tiheydeksi 10e-109 organismia/ml ja lisåttiin syvennyksiin LPS-variantteja 20 μ/ml. Kun oli poistettu antigeeni ja pesty kolmesti vedellå tai PBS:llå, maljoja inkuboitiin l-%:isen (paino/tilavuus) naudan see-30 rumialbumiinin (200 μΐ/syvennys) (BSA; Sigma Chemical Co., St. Louis. MO), 2- tai 20-%:isen (paino/tilavuus) (200 μΐ/syvennys) tai 2-%:isen (paino/tilavuus) naudan sikio-seerumin (200 μΐ/syvennys) (Sterile Systems, Inc., Logan, UT) låsnåollessa våhintåån 30 minuuttia 37 μΰ:883 ja pes-35 tiin uudelleen kolmesti. 50 μ1:η annokset hybridisuperna- 91711 20 tantteja tai puhdistettuja vasta-ainelaimennoksia lisat-tiin antigeenin peittåmiin syvennyksiin, inkuboitiin kaksi tuntia 37 °C:ssa, annokset poistettiin ja pestiin syven-nykset kolmesti.

5 Koettimina kåytettiin affiniteettipuhdistettuja vuohen anti-hiiri-F(ab')2 tai -IgM (Cappel Laboratories, Inc. West Chester, PA) tai vuohen anti-ihminen-IgG:tå, -IgA:ta tai -IgM:åå (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gathersburg, MD), jotka oli radionuklidileimattu jodi-10 125:11a (noin 10 μCi/μg) Iodogen (Pierce Chemical Co.,

Rockford, TL) -menetelmållå Markwellin et al. (Biochemistry 17 (1978) 4807-4817] kuvaamalla tavalla. Yleenså lisåt-tiin 50 000 cpm koetinta, joka oli laimennettu l-%:isella (paino/tilavuus) BSA-PBS:llå ja inkuboitiin kaksi tuntia 15 37 °C:ssa. Kun koetin oli poistettu ja malja pesty, syven- nykset lexkattxxn xrtx maljasta ja sxtoutunut I måårxtet-tiin gammalaskurissa (Nel600, Nuclear Enterproses, Edinburgh, Scotland, UK) laskenta-aikana yksi minuutti.

Immunisaatiot 20 Viittå hiiren anti-LPS-vasta-ainetta, joista kåyte- tåån merkintojå 1D4, 8A1, 5E4, 6B2 ja 4A10, tuotettiin kayttamålla seuraavaa immunisointiohjelmaa.

Hiiri A: 1D4. 16 BALB/c (Charles River Breeding Laboratories, Kingston, NY) -naarashiirtå immunoitiin påivi-25 nå 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14 ja 16 antamalla laskimonsisåises-ti 107 låmmollå inaktivoitua E. coli J5 -bakteeria suspen-doituna 0,5 ml:aan PBS:åå. Hiirelle, jolla oli RIA:ssa paras seerumitiitteri sekå låmmollå inaktivoituja E. coli J5 ettå samalla tavalla kåsiteltyjå S. minnesota R595 -bak-30 teereja vastaan, annettiin tehoste påivånå 23 samalla tavalla ja hiiri tapettiin pernan talteen saamiseksi kolmen vuorokauden kuluttua.

Hiiri B: 8A1 ja 5E4. 40 CAF/J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) -naarashiirtå immunisoitiin ruiskut-35 tamalla ihon alle (s.c.) 5 x 108 låmmollå inaktivoitua E.

91711 21 coli J5 -bakteeria tåydellisesså Freundin apuaineessa. Påivinå 7, 15, 21, 25 ja 27 hiiriin ruiskutettiin ihon alle 2,5 x 108 inaktivoitua J5-solua epåtåydellisesså Freundin apuaineessa. Påivånå 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71 5 ja 74 hiiret immunisoitiin ruiskuttamalla vatsakalvonsi-såisesti (i.p.) 2,5 x 105 låmpokasiteltyå J5-bakteeria PBSjssa. Tarkalleen kahdeksan viikon kuluttua hiirelle, jolla oli paras anti -E. coli J5 -seerumitiitteri, annet-tiin tehosteeksi ihonalaisesti seosta, joka sisålsi E. co-10 li J5 -LPS:åå ja S. minnesota R505 -LPS:åå 10 μς kumpaakin epåtåydellisesså Freundin apuaineessa. Hiiri tapettiin kolmen vuorokauden kuluttua.

Hiiri C: 6B2. 50 CAF/J-naarashiirtå immunisoitiin muuten, kuten 5E4:n ja 8Al:n yhteydesså edellå, mutta 15 i.p.-ruiskeet lopetettiin påivånå 50. Påivånå 57 hiirelle, jolla oli paras seerumitiitteri E. coli J5 vastaan, annet-tiin tehosteeksi vatsakalvonsisåisesti 2,5 x 105 inaktivoitua E. coli J5 -solua ja hiiri tapettiin kolmen vuorokauden kuluttua. Tåmån hiiren seerumi reagoi låmmollå inakti-20 voitujen bakteerien E. coli J5, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ja Serratia marcescens kanssa ja E. coli J5 -LPS:n kanssa.

Hiiri D. 4A10. Kolme BALB/c-naarashiirtå immunisoitiin i.p. påivinå 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14 ja 16 25 μg:lla S. 25 minnesota R595 -LPS:åå PBS:sså. Påivånå 23 hiirelle, jolla oli paras seerumitiitteri Re-LPS:åå vastaan (105), annet-tiin tehosteeksi 50 μg Re-LPS:åå, ja kolmen vuorokauden kuluttua hiiri tapettiin ja otettiin perna talteen.

91711 22

Taulukko 1

Yhteenveto primaari- ja tehosteimmunogeeneistå ja fuusiosyvennysten tutkimiseen kåytetyistå primaariantigee-neista 5 Fuusio Solu- Iramuno- Tehoste Primaarl- Positii- linja(t) geeni fuusio- visia tutkimus syvennyk- ______sia_

Hiiri A ID4__EcJ5 WCa EcJ5 WC__EcJ5 WC__96/96b

Hiiri B 6B2__EcJ5 WC EeJ5 WC__ECJ5-LPS 7/672_

Hiiri C 8A1 ja EcJ5 WC EcJ5-LPSc EcJ5-LPSc 5/13d __5E4___SmRe-LPSe SmRe-LPS__

Hiiri D 4A10 SmRe-LPS SmRe-LPS SmRe-LPS 8/480 10 aLåmmollå inaktivoidut E. coli J5 -bakteerit.

^Kaikkien syvennysten arvot olivat yli 3 x tausta. cHiirille annettavaksi tehosteeksi sekoitettiin kahta LPS-spesiestå; fuusiosyvennykset tutkittiin kummankin LPS:n 15 suhteen erikseen.

^Tutkittiin 13/576 syvennystå, kaikissa esiintyi jonkin verran hybridoomien kasvua, mutta valituissa 13 syvennyk-sessa oli solujen lisååntyminen merkittåvåsti parempaa ja viisi niistå oli positiivisia seka Re- ettå J5-LPS:n suh-20 teen.

eS. minnesota R595 -LPS, Re-mutantti.

Hybridisoluien tuottaminen

Hiirten A, B ja C pernalymfosyytit liitettiin NS-1-myeloomasoluihin kåyttåmallå Kohlerin ja Milsteinin [Natu-25 re (London) 256, (1975) 495-497] ensimmåisenå esittamåå muunnelmaa standardimenetelmistå. Kearneyn et al. [J. Immunol. 123, (1979) 1548-1550] kehittåmåå myeloomalinjaa P3 x 63Ag8.653 kåytettiin liittåmisosapuolena hiiren D-per-nasoluille.

30 Hiiresta poistamisen jalkeen perna yleenså huuhdot- tiin kahdesti DMEM-viljelyalustalla (GIBCO, Grand Island, NY) ja muodostettiin yksittåissolususpensio kåyttåmallå Cellector-laitetta (Bellco, Vineland, NH), joka varustet- 91711 23 tiin 140-mikroverkolla. Noin 10® pernasolua sekoitettiin 2 x 107 myeloomasolun kanssa pyoreåpohjaisessa sentrifugi-putkessa, sen jålkeen kun ne oli huuhdottu 2-3 kertaa DMEMtlla. Sentrifugoitiin kiihtyvyydellå 183 x g seitsemån 5 minuuttia, poistettiin supernatantti imemållå ja lisåttiin 1 ml 30-tilavuus-%:ista polyetyleeniglykoli 100 (PEG; Baker Chemical Co., Phillipsburg, NH). Solususpensiota sentrifugoitiin vålittomåsti kiihtyvyydellå 20-50 x g 3-4 minuuttia, poistettiin supernatantti ja lisåttiin 10 ml HT-10 DMEM-alustaa (DMEM, johon on lisåtty tåydennykseksi 15 ti-lavuus-% Hyclone-naudan sikioseerumia, 4 mmol/1 L-gluta-miinia, 50 μg/ml gentamysiinisulfaattia, 13,6 μg hypoksan-tiinia ja 7,6 μg/ml tymidiiniå). Solut laitettiin kahteen 100 mm:n petrimaljaan, jotka kummatkin sisålsivåt 20 ml 15 HT-DMEM:åå ja inkuboitiin 37 °C:ssa våhintåån 24 tuntia. Solususpensio siirrettiin HAT-DMEM-alustaan (HT-DMEM + 0,18 μg/ml aminopteriiniå), jaettiin sitten 96-syvennyksi-sille mikroviljelymaljoille (Costar, Cambridge, MA) pitoi-suudeksi 0,5 - 2,0 x 105 solua/200 μΐ/syvennys ja inkuboi-20 tiin 37 °C:ssa 8 % C02 sisåltåvåsså atmosfåårisså. Kun sy-vennykset, joissa esiintyi hybridoomien kasvua, saavutti-vat noin 50-%:isen yhtenåisyyden, yleenså 9+14 vuorokau-dessa, poistettiin yhtå suuret annokset supernatanttia ja tutkittiin niistå RIA-menetelmållå kyky sitoutua LPS:åån 25 ja/tai bakteereihin. Tåmån primaarifuusiotutkimuksen tu-lokset on koottu taulukkoon 1. Mielenkiinnon kohteina ole-vien fuusiomaljasyvennysten solut kloonattiin vålittomåsti tekemållå rajoittava laimennus pitoisuudeksi 2 solua/sy-vennys HT-DMEM-alustassa kerrokselle, jossa oli 1-2 x 105 ' 30 BALB/c-pernasolua, jotka oli ennalta såteilytetty absor- « boituneen annoksen ollessa 2 000 rad. Useiden påivien ku-luttua tutkittiin viljelmåneste RIA-menetelmållå kustakin syvennyksestå, jossa esiintyi hybridoomien kasvua, ja va-litut maljat kloonattiin samalla tavalla kuin ensimmåisel-35 lå kloonauskerralla. Kukin syvennys tutkittiin mikroskoo- 91711 24 pilla muutaman påivån kuluttua solujen kerrostamisesta ja useampaa kuin yhtå kloonia sisåltåvåt syvennykset poistet-tiin. Noin 10 påivån kuluttua solusupernatantit tutkittiin jålleen RIA:11a ja valittiin jatkotutkimuksia vårten yllå-5 pidettåvåt solulinjat. Tåsså vaiheessa solulinjat yleenså siirrettiin HT-DMEM-alustasta tåydelliseen DMEM-alustaan (DMEM, jossa tåydennyksenå 15 tilavuus-% Hyclonenaudan si-kioseerumia, 4 mmol/1 L-glutamiinia ja 50 μς/πιΐ gentamy-siinisulfaattia).

10 Vesivatsanesteiden tuotanto. analvsointi ja puhdis- tus

Klooneja lisåttiin tekemållå påivittåin siirrostus tåydelliseen DMEM:åån ja niitå inkuboitiin 37 °C:ssa 5 % C02 sisåltåvåsså atmosfåårisså. Kasvainvesivatsanesteiden 15 tuottamiseksi inokuloitiin 5-10 x 105 solua DMEMtsså vatsa-kalvonsisåisesti syngeneiisiin BALB/c-hiiriin, jotka oli esikåsitelty 10-15 påivåå aikaisemmin ruiskuttamalla i.p. 0,5 ml Pristanea (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI). Vesivatsanåytteet otettiin hiiriltå, joilla oli kasvain, 20 yhdistettiin, sentrifugoitiin ja pakastettiin.

Puhtaat IgG-immunoglobuliinifraktiot eristettiin vesivatsanesteestå tekemållå affiniteettikromatografia Protein A-Sepharose Cl-4B:llå (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) suurin piirtein Eyn et al. [Immunochemist-25 ry 15 (1978) 429-436] kuvaamalla tavalla. Ennen vesivatsa-nesteen laittamista affiniteettikolonniin, sitå pidettiin 37 °C:ssa kaksi tuntia ja sitten 50 °C:ssa vielå yksi tunti, sentrifugoitiin kiihtyvyydellå 40 000 x g 45 minuuttia 4 °C:ssa ja suodatettiin 0,22 μιη:η suodattimen låpi (Mil-30 lipore Corp., Bedford, MA).

Immunoglobuliinialaluokka mååritettiin puhdistetus-ta vesivatsanesteestå immuunidiffuusion avulla Ouchterlo-nyn menetelmållå kåyttåmållå 1 % (paino/tilavuus) agaroo-sia (Marine Colloids, Rockland, ME) PBS:sså ja vuohen spe-35 sifistå antiseerumia hiiren IgGlslle, IgG2a:lle, IgG2b:lle i.

91711 25 ja IgG3:lle (Gateway Immunosera Co., St. Louis, MO), jois-ta kolme ensimmåistå oli affiniteettipuhdistettuja. Vuohen anti-hiiri-IgG-F(ab')2:a kåytettiin positiivisena vertai-lunåytteenå. Nåmå tulokset osoittivat, ettå klooneista 5 1D4, 8A1 ja 5E4 peråisin olevat vasta-aineet kuuluvat kaikki IgGl-alaluokkaan ja 6B2 IgG2a-alaluokkaan. Klooni 4A10 antoi pååsaostumisvyohykkeen IgG3-antiseerumin kanssa ja hyvin pienen, mutta toistettavissa olevan, reaktion IgG2a-reagenssin kanssa. Klooni 4A10 erittåå pååasialli-10 sesti, mutta ei ehkå yksinomaan IgG3-immunoglobuliineja.

Esimerkki 2

Kokonaisten bakteerisolujen sitoutumiskokeet

Hiiren anti-LPS-vasta-aineet

Useista gram-negatiivisista organismeista tutkit-15 tiin RIA:11a sitoutuminen esimerkisså 1 kuvattuihin hiiren monoklonaalisiin anti-LPS-vasta-aineisiin. Tåsså tutkimuk-sessa peitettiin 96-syvennyksiset mikromaljat låmmollå in-aktivoiduilla kokonaisilla organismeilla, joita kåytettiin 5 x 107 solua/syvennys, lisåttiin 10, 1 tai 0,1 μg:n annos 20 puhdistettua (6B2:a lukuun ottamatta) monoklonaalista vas-ta-ainetta kuhunkin syvennykseen ja positiivista sitoutu-mista tarkkailtiin tekemållå kehitys 125I-leimatulla vuohen anti-hiiri-IgG-F(ab')2-immunoglobuliinin kanssa (50 000 cpm/syvennys). Sama koe tehtiin monoklonaalisella R11D10:-25 llå ja anti-myosiini-vasta-aineella (tri J. Mattis, West Chester, PA). Tåmå vasta-aine toimi negatiivisena vertai-lunåytteenå. Minkå tahansa monoklonaalisen vasta-aineen sitoutuminen erilaisiin bakteereihin mååriteltiin positii-viseksi, kun signaali oli kaksinkertainen negatiivisen 30 vertailunåytteen signaaliin nåhden. Taulukkoon 4 on koottu nåiden kokeiden tulokset.

Kolme tutkituista hiiren monoklonaalisista anti-LPS-vasta-aineista reagoi selvåsti kaikkien tutkittujen gram-negatiivisten organismien kanssa, eikå ollenkaan kum-35 mankaan tutkitun gram-positiivisen bakteerin kanssa. Erås 91711 26 monoklonaalinen vasta-aine, 4A10, sitoutui myos kaikkiin gram-negatiivisiin bakteereihin. Se sitoutui kuitenkin heikosti myos (2,2- ja vastaavasti 2,1-kertaisesti nega-tiiviseen vertailunåytteeseen nåhden) kumpaankin gram-po-5 sitiiviseen organismiin. Koska tamå vasta-aine samanaikai-sesti sitoutui epaspesifisesti maljaan voimakkaammin kuin seka negatiivinen vertailunayte ettå muut neljå hiiren an-ti-LPS-vasta-ainetta, tåtå tulosta pidetåån keinotekoisena ja sitoutuminen esitetåån merkillå ± taulukossa 2 kahden 10 gram-positiivisen kannan kohdalla. Tåtå pååtelmåå tukee lisåksi se tosiasia, ettå 4A10:n keskimååråinen ja pienin sitoutuminen gram-negatiivisiin organismeihin on 5,1 ja vastaavasti 2,1 kertaa niin suuri kuin negatiivisella ver-tailunåytteellå. Lopuksi mainittakoon, ettå kloonin 6B2 15 solusupernatantit sitoutuivat kaikkiin muihin, paitsi yh-teen tutkituista gram-negatiivisista organismeista eivåtkå ollenkaan gram-positiivisiin organismeihin.

Nåmå tulokset ovat merkittåviå, koska ne osoitti-vat, ettå monoklonaaliset anti-LPS-vasta-aineet sitoutuvat 20 eri sukujen gram-negatiivisiin bakteereihin ja, mikå tår-keåmpåå, patogeeneina tårkeiden sukujen bakteereihin.

91711 27

Taulukko 2

Hiiren anti-LPS-vasta-aineiden sitoutuminen 1ammo1lå inak-tivoituihin bakteereihin RIA:11a mååritettynå 5 Monoklonaalinen anti-LPS- vasta-aine

Bakteerit* “ ID4 5E4 8A1 4A10 6B2

Gram-negatiiviset

Escherichia coli J5 + + + + + 10 Salmonella minnesota R595 + + + + +

Salmonella minnesota + + + + ndd

Escherichia coli 0111 :B4 + + + + +

Escherichia coli 055:Bs + + + + ndd

Klebsiella pneumonia ++ ++ ++ ++ + 15 Pseudomonas aeruginosa ++ ++ ++ ++

Serratia marcesena +++++

Gram-positiiviset

Staphlococcus aureus - - ±e

Streptococcus faecalis ± 20 __

Asteikko mååriteltiin suhteessa negatiiviseen vertailu-nåytteeseen, kaikki arvot ovat kahden rinnakkaiskokeen keskiarvoja: -, pienempi kuin 2x; +, 2x - 6x; ++ suurempi 25 kuin 6x.

"Paallystettiin 50 μ1:1ΐ3 seosta, jossa oli 109 organis-mia/ml PBS:ssa; peitettiin 2 tilavuus-%:isella naudan si-kioseerumilla.

bInkuboitiin pitoisuutena 1 μg/30 ml PBS:aa kaksi tuntia.

30 cTulos on aiemmasta tutkimuskokeesta; tåsså tapauksessa kåytettiin soluviljelmåhybridoomasolujen supernatanttia. dEi maaritetty.

°4A10 antaa johdonmukaisesti suurempia tausta-arvoja kuin negatiivinen vertailunåyte; siksi tåtå signaalia pidetåån • 35 keinotekoisena; katso yksityiskohdat tekstistå.

91711 28

Esimerkki 3 RIA:11a tehdyt LPS-sitoutumistutkimukset

Determinanttien paikallistaminen hiiren anti-LPS-vasta-aineille 5 Puhdistetut ja I-leunatut monoklonaaliset anti- LPS-vasta-aineet tutkittiin suoraa sitoutumista seuraaval-la RIA:lla uselta sileitå (villi tyyppi) ja rosoisia (mu-tantti, jolta puuttuu O-spesifinen polysakkaridi) LPS-va-riantteja vastaan. Nåisså suoraa sitoutumista tutkivissa 10 kokeissa lisåttiin vakiomååråt radionuklidileimattua vas-ta-ainetta 96-syvennyksisiin mikromaljoihin, jotka oli paållystetty LPS-sarjalaimennoksilla, joissa laimennussuh-de oli 1:10. Alkukokeet tehtiin lipopolysakkarideilla, jotka oli laimennettu valmistajan suosittelemalla tavalla 15 pitoisuuksiksi 10 μς - 1 pg/syvennys. Naiden kokeiden tu-lokset osoittivat, ettå on olemassa selviå eroja eri vas-ta-aineiden valilla niiden sitoutumisessa rosoisiin lipo-polysakkarideihin ja vapaaseen lipidi Athan eika mikåån anti-LPS-vasta-aineista pystynyt sitoutumaan mihinkåån 20 tassa tutkimuksessa kåytettyyn sileåån LPSsåan. Alustavat yritykset mahdollistaa vasta-aineen sitoutuminen disper-goimalla O-spesifista polysakkaridia sisåltåvat LPS-va-riantit metanoliin, ionisiin ja ionittomiin detergenttei-. hin tai EDTA:aan, olivat tuloksettomia. Tama viittaa sii- 25 hen, ettå LPS:n kiinteåfaasimuodossa pååsy ydinalueelle on 0-ketjupolysakkaridialueen steerisesti eståmå.

Kokeet toistettiin E. coli J5 -LPS:llå, S. minne-sota R505 -LPS:lla ja vapaalla lipidi A:11a, joka oli pe-råisin S. minnesota R505 -LPS:stå. Tåsså tapauksessa kaik-” 30 ki vasta-aineet puhdistettiin steriileisså, pyrogeeniva-paissa olosuhteissa, leimattiin radionuklidilla ja kåytet-tiin kolmen viikon kuluessa. LPS-naytteet dispergoitiin seokseen, joka sisålsi 0,5 tilavuus-% TEA:ta ja 0,9 % (paino/tilavuus) NaCl:aa (steriili ja pyrogeenivapaa) ja 35 kåytettiin samoin kolmen viikon kuluessa dispergoinnista.

li 91711 29 Nåmå varotoimenpiteet tehtiin mahdollisten vastaionien (aggregaatiotila) tai iån aiheuttamien erojen minimoimi-seksi LPS-nåytteisså.

Tulokset kuuden monoklonaalisen vasta-aineen (viisi 5 anti-LPS:åå ja yksi negatiivinen vertailunåyte) sitoutumi-sesta E. coli J5 -LPSiåån, S. minnesota R505 -LPS:åån ja vapaaseen lipidi Athan esitetåån kuviossa 2. Kaikki viisi monoklonaalista anti-LPS-vasta-ainetta sitoutui samalla tavalla E. coli J5 -LPSiåån korkeilla antigeenipitoisuuk-10 silla (so. kåytettåesså suuria LPS-pitoisuuksia maljan påållystykseen) ja våhån tai ei ollenkaan LPS-pitoisuuk-sien ollessa pieniå (kuvio 2A). Nåmå tulokset itse asiassa toistivat alkuperåisten kokeiden havainnot. Ainoa ero on se, ettå alkuperåisesså kokeessa 6B2:lla esiintyi sitoutu-15 mista pienemmillå antigeenipitoisuuksilla (10° μς/βγνβηηγβ) ja suurempia sitoutuneita maksimi-cpm-arvoja (noin kaksin-kertaisia) suurilla LPS-pitoisuuksilla. Tåmå voi olla seu-rausta erilaisesta dispergointipuskurista. Ero ei kuiten-kaan anna aihetta mihinkåån tulkintoihin. S. minnesota 20 R505 -LPSiåån (kuvio 2B) sitoutui parhaiten 4A10 tiitterin mukaan laskettuna, 8A1 ja 5E4 sitoutuivat samalla tavalla keskinkertaisesti, 1D4 sitoutui våhåisesså måårin korkeilla Re-LPS-påållystyspitoisuuksilla ja 6B2 ei sitoutunut merkittåvåsti. Myos tåmå sopi yhteen alkuperåisen kokeen 25 kanssa, paitsi ettå 6B2 putosi ryhmåstå "heikko sitoutuja" ryhmåån "ei sitoudu" Re-LPS:n suhteen ja osoittautui mak-simisitoutumisarvoiltaan heikommaksi kuin mihin alkuperåi-set tulokset viittasivat. Lopuksi, kuten kuviosta 2C ilme-nee, 5E4:llå ja 8Al:llå oli låhes identtinen korkean tiit-- 30 terin sitoutuminen vapaaseen lipidi A:han, 4A10:llå ja lD4:llå on ilmeisesti keskinkertaiset tiitterit ja 6B2:lla ei ollut ollenkaan sitoutumiskykyå, mikå kaikki on sopu-soinnussa alkuperåisen tutkimuksen kanssa.

Vasta-aineilla oli yleisesti hyvin erilaiset taus-35 ta-arvot (0 μg/syvennys kuviossa 2). Niinpå 4A10sllå oli 91711 30 hyvin korkeat ja vaihtelevat tausta-arvot, mutta lD4:n tausta oli hyvin alhainen ja sen toistettavuus oli hyvå. Tåmå påtee useille ryhmille radionuklidileimattuja vasta-aineita hieman erilaisissa tutkimusolosuhteissa. Negatii-5 vinen vertailunåyte R11D10, IgG2a-vasta-aine, osoitti, et-tå ei tapahtunut merkitsevåå hiiren monoklonaalisten anti-LPS-vasta-aineiden epåspesifista sitoutumista mihinkåån tutkituista LPS-varianteista.

Nåiden sitoutumiskokeiden tulokset osoittivat, ettå 10 monoklonaaliset vasta-aineet 1D4, 4A10, 8A1 ja 5E4 tunnis-tivat determinantit, jotka ovat saatavilla E. coli J5 -LPSssså, S. minnesota R595 -LPS:sså ja vapaassa lipidi A:ssa. Tåstå ryhmåstå 8Al:llå, 5E4:lla ja lD4:llå oli seka paras sitoutumiskyky ettå suurin herkkyys detektoitaessa 15 mikrotiitterilevyillå olevaa vapaata lipidi A:ta. Tåmå viittaa vahvasti siihen, ettå niiden vastaavat sitoutumis-kohdat sijaitsevat lipopolysakkaridimolekyylin lipidi A -osassa. Monoklonaalinen 4A10 sitoutui voimakkaimmin Re-LPSråån. Se, ettå 4A10 sitoutui jonkin verran myos Re-20 LPS:stå peråisin olevaan vapaaseen lipidi A:han, viittaa siihen, ettå determinanttiin kuuluu osia KDO-alueesta ja lipidi A:sta (ks. kuvio IB). Determinantti voi vaihtoeh-toisesti sijaita kokonaan Re-LPS:n lipidi A -osassa, mutta tuhoutua osittain vapaan lipidi A:n kemiallisessa muodos-25 tumisessa. Lopuksi todettakoon, ettå 6B2 sitoutui vain J5-LPSiåån. Tåmå viittaa siihen, ettå sitoutuminen voisi ta-pahtua J5-LPS:n ytimen "heptoosi"-osaan (ks. kuvio IB). Esikokeissa 6B2 sitoutui myos S. typhimurium Re -LPS:åån. Siten 6B2:n J5-LPS:åån sitoutumisen tapahtumiskohta on 30 epåselvå. On selvåå, ettei 6B2 sitoudu S. minnesota R595 lipidi A:han olosuhteissa, joissa kuvio 2 saatiin aikaan.

91711 31

Esimerkki 4 LPS-sitoutumiskokeet immuunitåplåmenetelmallå

Koska hiiren monoklonaaliset vasta-aineet eivat pystyneet sitoutumaan kiinteåan faasiin absorboituihin si-5 leaå tai villiå tyyppiå olevista gram-negatiivisista bak-teereista eristettyihin LPS:iin RIA-menetelmåsså, kehi-tettiin erilainen sitoutumistesti.

Geelielektroforeesi ia LPStn elektroforeettinen siirto nitroselluloosaan 10 Eri LPS-nåytteille tehtiin polyakryyliamidigeeli- elektroforeesi (PAGE) natriumdodekyylisulfaatin (SDS) ja urean låsnå ollessa; nåytteet tehtiin sitten nåkyviksi kåyttåmållå hopeavårjåysmenetelmåå. Nåitå menetelmiå ovat kuvanneet Tsai et al. [Anal. Biochem. 119 (1982) 115-119].

15 Levy koostui 3-%:isesta (paino/tilavuus) konsentrointigee- listå ja 14-%:isesti (paino/tilavuus) ajogeelistå ja tyy-pillinen kuormitus oli 10 μg LPS:åå kaistaa kohden.

Kåytettiin vakiovirtaa 5-10 mA/geelilevy, kunnes indikaattorivåri saavutti ajogeelin, jolloin virta såådet-20 tiin arvoon 35 mA/geelilevy.

Tåsså SDS-PAGE-jårjestelmåsså LPS-nåytteet erottu-vat sarjaksi komponentteja. Kukin vyohyke vastaa yhtå yk-silollistå molekyylispesiestå; hitaammin liikkuvilla vyo-hykkeillå on suuremmat O-ketjualueet ja nopeimmin liikku-25 villa vyohykkeillå on pieni O-spesifinen hiilihydraatti- sivuketju tai sitå ei ole ollenkaan. 10 erilaista LPS-nåy-tettå analysoitiin tåsså systeemisså (kuvio 3A). On hel-posti havaittavissa, ettå suurimolekyylisten LPS-kompo-nenttien måårå ja jakautuma vaihtelee spesieksestå toi-" 30 seen. Kaikki LPS-nåytteet vapaata lipidi A:ta lukuun otta-matta sisåltåvåt komponentteja, joilla on samanlainen al-hainen molekyylipaino ja jotka voidaan tehdå nåkyviksi hopeavår j åysmenetelmållå.

Kehitettiin menetelmå LPS:n siirtåmiseksi elektro-35 foreettisesti polyakryyliamidigeelistå nitroselluloosale- 91711 32 vyille. Samanlaisia menetelmiå proteiinien siirtåmiseksi ovat kuvanneet Towbin et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, (1970) 4350-4354]. LPSsn elektroforeettinen tåplå- siirto SDS-geelistå 0,45 μιιι:η nitroselluloosapaperiin 5 (Schleicher and Schuell, Inc., Keene, NH) tehtiin kåyttå-mållå Transphor-elektroforeettista siirtoyksikkoa (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA). Lyhyesti il-maistuna nitroselluloosapala, joka oli esiliotettu siirto-puskurissa, joka sisalsi 24 mmol/1 Tris'iå, 192 mmol/1 10 glysiiniå ja 20 tilavuus-% metanolia (pH 8,3), sijoitet-tiin varovasti geelille. Tåmå yhdistelmå laitettiin sitten kahden Whatman 3 MM -paperin valiin, jotka oli ennalta kyllåstetty siirtopuskurilla ja rakennelma sijoitettiin laitteeseen siten, ettå geeli tuli katodin ja nitrosellu-15 loosa anodin puolelle. LPS siirrettiin nitroselluloosaan vakiovirralla 5 mA/geelilevy kåsittelemålla yon yli huo-neen lampotilassa. Taman alhaisen virrantiheyden havait-tiin olevan vålttamåton tehokkaan siirtymisen kannalta.

Nitroselluloosalla olevan LPS:n immunologinen ha-20 vaitseminen LPS:aa sisåltåviå taplia liotettiin l-%:isessa (paino/tilavuus) BSA-PBS:sså 30 minuuttia huoneen lampotilassa nitroselluloosan proteiineja sitovien kohtien sulke-miseksi. Lisåttiin niin paljon monoklonaalista vasta-ai-25 netta PBS:ssa, ettå saatiin lopulliseksi pitoisuudeksi 10 μg/ml ja siirrettyå tåplaå sekoitettiin varovasti kolme tuntia. Nitroselluloosalevyå inkuboitiin perusteellisen PBS-pesun jålkeen 100 ml:n kanssa l25I-leimattua vuohen an-ti-hiiri-IgG-F(ab')2 tai I-leimattua vuohen anti-ihmis-30 IgM-koetinta 2-3 tuntia huoneen lampotilassa. Radionukli- dileimattu koetin, jonka ominaisaktiivisuus oli noin 10 μCi/μg, valmistettiin esimerkin 1 mukaisesti ja sitå kåy-tettiin pitoisuutena 105 cpm/ml l-%:isessa (paino/tilavuus) BSA-PBS-puskurissa. Elektroforeesitåplå pestiin perusteel-35 lisesti PBS:llå ja kuivattiin låpikotaisin låmpopistoolil- I: 91711 33 la. Tåplåt kuvattiin Kodak X-Omat AR -filmille (XAR-5; Eastman Kodak Co., Rochester, NY) kayttaen Dupont Lightning Plus -kuvanvahvistuslevyå (Picker International, Highland Heights, OH).

5 Hiiren anti-LPS-vasta-aineet

Kahdesta aff initeettipuhdistetusta monoklonaalises-ta vasta-aineesta, 8Al:sta ja 4AlO:sta, tutkittiin LPS-si-toutuminen tållå SDS-PAGE-immuunitåplåtestillå. Molemmat reagoivat sileåstå organismista peråisin olevan LPSsn 10 kanssa. Tåmå on ristiriidassa RIA:lla tehtyjen LPS-sitou-tumiskokeiden tulosten kanssa. Tyypillinen 8Al:lla tehty koe esitetåån kuviossa 3B. Asia, joka heti havaitaan ver-rattaessa hopealla vårjåttyå geeliå (kuvio 3A) immunologi-seen detektioon (kuvio 3B), on 8Al:n sitoutuminen etupåås-15 så kaikkien tutkittujen LPS-varianttien pienimolekyylisiin komponentteihin. Jotta saataisiin selville, sitoutuuko 8A1 yksinomaan nopeasti liikkuviin vyohykkeisiin, koe toistet-tiin kåyttåen 5 LPS-variantin kaksinkertaista kuormitusta ja ylivalottamalla filmi (kuvio 3C). Tåsså havaitaan heik-20 ko sitoutuminen E. coli 0111:B4:n LPS:n kaikkiin komponentteihin, mutta ei S. minnesotan villin tyypin LPSsåån.

Tåplåsiirron tehokkuus tarkistettiin kahdella ta-valla. Sen osoittamiseksi, ettå kaikki LPS-spesiekset siirtyivåt polyakryyliamidigeelistå siirron aikana, ajet-25 tiin ensin kaksi geeliå samanlaisissa olosuhteissa. Toinen vårjåttiin suoraan hopealla ja toiselle tehtiin tåplåsiir-to ja vårjåttiin geeli sen jålkeen. Kaikki vyohykkeet oli-vat nåkyvisså geelisså, jolle oli tehty tåplåsiirto, mutta niiden intensiteetti oli huomattavasti heikompi kuin ver-' 30 tailugeelisså. Vaikka tåmå menetelmå ei ole ehdottoman kvantitatiivinen, viittaa tåmå tulos voimakkaasti siihen, ettei tiettyjen LPS-komponenttien selektiivistå siirtymis-tå geelistå esiintynyt. Toiseksi tehtiin kehitys E. coli 0111:B4 -spesifiselle monoklonaaliselle vasta-aineelle 35 5B10. Immuunitåplåkokeessa, joka tehdåån identtisellå ta- 91711 34 valla ylla olevan kanssa, tåmå vasta-aine reagoi voimak-kaasti kaikkien E. coll 0111:B4:n LPS:n komponenttien kanssa. Niinpå kaikki E. coli 0111:B4:n LPS-komponentit sitou-tuvat nitroselluloosalevyyn eika voimakkaasti erilainen 5 immuunivår jåytymisintensiteetti pieni- ja suurimolekyylis ten komponenttien vålilla johdu naiden komponenttien siir-tymisesta eri tavalla nitroselluloosaan. Voidaan pååtellå, ettå 8A1 sitoutuu ensisijaisesti, muttei yksinomaan, pie-nimolekyylisiin komponentteihin kaikissa LPS-naytteissa 10 sileåå tyyppiå olevista organismeista saadut preparaatit mukaan luettuina.

Immuunitåplåkokeella tutkittujen kahden hiiren mo-noklonaalisen vasta-aineen aktiivisuuksissa oli eroa. Vasta-aine 8A1 reagoi voimakkaimmin vapaan lipidi A:n kompo-15 nenttien kanssa, joita ei voitu havaita hopeavarjåyksellå (kuviot 3A ja 3B). Tåmå vahvistaa sitå paatelmaå, etta 8A1 on monoklonaalinen anti-lipidi A -vasta-aine. Monoklonaa-linen vasta-aine 4A10 sitoutui voimakkaimmin S. minnesota Re:n LPSiaan, rnika on sopusoinnussa esimerkin 4 RIA-tulos-20 ten kanssa.

RIA-kokeiden ia SDS-PAGE-immuunitaplakokeiden ver-taciminen RIA- ja immuunitåplåkokeet yhdesså tarkasteltuina osoittavat sitovasti, ettå hiiren (8A1, 5E4, 4A10, 1D4 ja 25 6B2) monoklonaalisten vasta-aineiden laaja ristireagointi- kyky on niiden anti-LPS-spesifisyyden ansiota. Voi hyvin-kin olla niin, ettå suuri osa ristireagointikyvystå koko-naisten solujen kanssa on sen ansiota, ettå anti-LPS-vas-ta-aineet ovat vuorovaikutuksessa organismin pinnalla ole-: 30 vien sellaisten LPS-komponenttien kanssa, joilla on joko pienet O-spesifiset sivuketjut tai sellaisia ei ole ollen-kaan. Sitoutumattomuus sileistå (O-spesifisen polysakkari-din sisåltåvistå) gram-negatiivisista bakteereista saatui-hin LPS:iin RIA-koemallissa viittaa siihen, ettå LPS 35 esiintyy polyvinyylimaljalla aggregaattina, jossa sellai- * % · 91711 35 set LPS-komponentit, joilla on pitkåt hiilihydraattisivu-ketjut, estavåt steerisesti vasta-aineen pååsyn pienimole-kyylisiin komponentteihin.

Tårkeimmåksi seikaksi jaa se, etta kaikilla ihmisen 5 ja hiiren monoklonaalisilla vasta-aineilla on anti-LPS-ak-tiivisuus.

Esimerkki 5

Anti-LPS-vasta-aineiden tutkiminen Pseudomonas ae-ruginosan ulkomembraaniraakapreparaatteja vastaan 10 Tutkittiin hiiren anti-LPS-vasta-aineet 8A1 ja 5E4 kayttaen sarjaa epåpuhtaita ulkomembraaneja, jotka olivat peråisin erilaisista Pseudomonas aeruginosa -kannoista ja esimerkissa 5 kuvattuja menetelmia. Ulkomembraanit olivat peraisin joukosta kantoja, jotka edustavat Liumin et al. 15 [Int. J. Syst. Bacteriol. 33 (1983) 256-264] våhan aikaa sitten maarittelemia 17 serologista ryhmaå seka P. aerugo-nosa PA101 -kannasta H103. Kyseesså olevia kantoja, kasva-tusolosuhteita ja ulkomembraanimenetelmia kuvaavat Hancock et al. [Infect, immun. 37 (1982) 167-171]. Toisen sarjan 20 ulkomembraaneja, jotka oli preparoitu kystista fibroosia sairastavien ihmispotilaiden 14 erilaisesta limaisolaatis-ta, toimitti tri Robert Hancock (Vancouver, British Columbia) .

Kuviossa 5A esitetåån monoklonaalisella vasta-ai-25 neella 5E4 tehtyjen immuunientsyymivarjaysten tulokset 17 serotyyppispesifiselle kannalle ja P. aeruginosa PA01 -kannalle H103; Fslla merkitty kaista on negatiivinen pro-teiinivertailunåyte. Samoin kuin esimerkissa 4 anti-LPS-vasta-aine sitoutui etupååsså pienimolekyyliseen LPS-kom-: 30 ponenttiin. Immuunivarjattyjen komponenttien erilaiset liikkuvuudet viittaavat lisåksi siihen, etta on olemassa rakenteellisia eroja nåiden LPS-komponenttien vålillå eri kannoissa. Nåmå erot eivåt kuitenkaan estå vasta-aineen sitoutumista.

35 Sama koe tehtiin kåyttåen ulkomembraaniraakaprepa- 91711 36 raatteja, jotka oli valmistettu kystista fibroosia sairas-tavista potilaista saaduista 14 P. aeruginosa -isolaatis-ta. Anti-LPS-vasta-aineet 8A1 ja 5E4 sitoutuivat jålleen kaikissa nåissa serologisesti luokittamattomissa kannoissa 5 esiintyvåan aggressiivista tyyppiå olevaan LPS:aan. 8Al:lle saadut tulokset esitetaan kuviossa 5B.

Siten E. colilla immunisoiduista hiiristå peråisin olevat monoklonaaliset vasta-aineet tunnistavat LPS:nf jo-ka on peråisin serologisesti erilaisista P. aeruginosa 10 -kannoista ja serologisesti luokittamattomista luonnoniso-laateista. Tåmå viittaa siihen, ettå sekå 8A1 ettå 5E4 tunnistavat lipopolysakkaridimolekyylissa olevan sellaisen antigeenideterminantin, joka on hyvin todennåkoisesti såi-lynyt uusissa luokittamattomissa P. aeruginosa -kannoissa. 15 Esimerkki 6

Passiivinen immunisointi

Lukuisten hiiren monoklonaalisten anti-LPS-vasta-aineiden teho immunoterapeuttisina aineina testattiin useissa mallijårjestelmisså kåyttåmållå hiiriå.

20 Suora verenmvrkvtvs -malli Tåsså mallissa hiiret inokuloitiin ensin vatsakal-vonsisåisesti pitoisuudeltaan erilaisilla hiiren monoklonaalisten anti-LPS-vasta-aineiden seoksilla ja tehtiin sitten infektointi laskimonsisaisesti 16-24 tunnin kulut-25 tua kåyttåen 2-3 x LDS0-annosta jotakin kolmesta haastebak-teerista. Kuolettavaa annosta kuvaavat kåyråt oli muodos-tettu esikokein ja bakteereja viljeltiin ja niiden maårå laskettiin esimerkisså 1 kuvatulla tavalla. Tåmå malli on samanlainen kuin se, jota Dunn et al. [Surgery 92, (1982) j' 30 212-219] kuvaavat marsujen yhteydesså, paitsi ettå fysio- loginen tarkkailu jåtettiin pois ja tehon mååråsi suojaa-minen kuolemalta. Nåisså kokeissa kåytetty vasta-aine oli seos, joka sisålsi yhtå suuret moolimååråt monoklonaalisia anti-LPS-vasta-aineita 8A1, 5E4, 6B2 ja 1D4. Monoklonaa-35 lista anti-myosiini-vasta-ainetta R11D10 samoin kuin fy- 91711 37 siologista suolaliuosta kåytettiin kumpaakin negatiivisina vertailunåytteina.

Kuten taulukosta 3 on nåhtåvisså, kaikki hiiret, jotka saivat negatiivisena vertailunåytteenå kåytettyå 5 vasta-ainetta tai suolaliuosta, kuolivat, kun taas anti-LPS-vasta-aineiden seos antoi huomattavan suojan kuolemaa vastaan vasta-aineannoksesta riippuvalla tavalla. Siten monoklonaalisten vasta-aineiden, joissa E. coli J5:ttå oli kåytetty immunogeenina, seos pystyy suojaamaan hiiret, 10 jotka mydhemmin infektoidaan E. coli J5:llå tax sen villin tyypin kantamuodolla E. coli 0111:B4:llå. Kaikkein tårkein-tå on kuitenkin se, etta anti-LPS-vasta-aineet pystyvåt suojaamaan hiiret Klebsiella pneumoniaen, eri suvun kuin E. colin bakteerikannan, aiheuttamalta kuolemalta. Siten 15 naiden vasta-aineiden in vitro osoitettu laaja ristirea- goimiskyky on såilytettåvissa myos in vivo.

Taulukko 3

Hiirten elossaolo seitsemån påivån kuluttua laski-monsisåisesta bakteeri-infektoinnista 20 ,=======^=^=====^====.

Intektoiva orga- Anti-LPSb Anti-myosiinic Fysio- nismi3 logi· ------ nen 1 mg 4 mg 8 mg 1 mg 4 mg 8 mg SUO|a.

liuos _ % Survival- E. coli J5 nd 80' 83f nd 0 0 0

Ecq![0111:B4 10 20 80’ 0 0 0 0 25 K. pneumoniae nd nd 83' nd nd 0 0 aAnnos 2-3 x LD50 bSeos, joka sisaltåa yhtå suuret moolimaarat monoklonaali-sia anti-LPS-vasta-aineita 8A1, 5E4, 1D4 ja 6B2.

30 cEsimerkissa 3 kuvattu RllDlO d10-12 hiirta/ryhma *Ei maåritetty fTulos on tilastollisesti erilainen kuin vertailuarvot 91711 38 99 %:n luotettavuustasolla.

Palovammaverenmvrkvtvs-malli

Yksi monoklonaalisista anti-LPS-vasta-aineista tut-kittiin palovammaverenmyrkytys-mallilla, jota kuvaavat 5 Cryz et al. [Infect, immun. 39 (1983) 1072-1079] ja jossa kåytettiin ihmiselle aårimmåisen virulenttia patogeenia, Pseudomonas aeruginosa PA220 (tri S. Cryz, Bern, Sveitsi) infektoivana organismina.

Elåimet, 18-20 g painavat Swiss Sebster -etåissii-10 toshiiret, nukutettiin metoksifluoraanissa (Penthrane; Abbot Laboratories, North Chicago, TL). Hiiriå poltettiin sitten 10 sekuntia etanoliliekillå 2 cm2:n alueelta selås-tå. Infektoivaa organismia ruiskutettiin vålittomasti ihonalaisesti vammaan. Hiirille annettiin passiivisena 15 siirtona monoklonaalista vasta-ainetta mååråttyina aikoina ennen bakteerihyokkåysta ja sen jalkeen. Vertailuhiiret, joita poltettiin ja jotka saivat vain PBS:åå, jåivåt eloon saannollisesti.

Koska kaytetty monoklonaalinen anti-LPS, 8A1, kuu-20 luu hiiren immunoglobuliinialaluokkaan IgGl, kåytettiin vastaavaan alaluokkaan kuuluvaa monoklonaalista vasta-ainetta negatiivisena vertailuaineena. Negatiivinen vertai-luaine on spesifinen hepatiitti B -pinta-antigeenille «, (HBsAg), ja se on monoklonaalinen IgGl-vasta-aine (tri. V.

i 25 Zurawski, Sest Chester, PA).

Monoklonaalista anti-LPS-vasta-ainetta 8A1 ja monoklonaalista HBsAg-vertailuvasta-ainetta annettiin erilli-sille hiiriryhmille 24 tuntia ennen infektointia. Kolmas hiiriryhmå sai 8A1 sekå 24 tuntia ennen infektointia ettå 30 20 tuntia sen jalkeen. Vaikka hiirten absoluuttinen kuol- leisuus ei ollut huomattavasti erilainen, viivåstyi kum-paankin monoklonaalisella 8A1:11a hoidettuun ryhmåån kuu-luvien hiirien kuolema merkittåvåsti (taulukko 4). Ehkå tårkeåmpåå oli hiirten suhteellinen kunto infektoinnin 35 jalkeen. Hiiret, jotka saivat kaksi 8Al-annosta, olivat 91711 39 paljon paremmassa kunnossa kuin vertailuhiiret ja elaimet nayttivat, kahta kuolemaa lukuun ottamatta, terveilta vielå 48 tunnin kuluttua infektoinnista. Narna tulokset viit-taavat siihen, etta vasta-aine salpasi bakteerien siirty-5 misen verenkiertoon ja kun suojaava vasta-aine kului lop-puun, hiiret kuolivat nopeasti.

Taulukko 4

Anti-LPS-vasta-aineen vaikutus hiirten elinaikaan palovamman Pseudomonas aeruginosa PA220 -inokuloinnin jal-10 keen

Monoklo- Kuoleman tu- naalinen Immunointi- Kuolleisuus loon kulunut vasta- ajankohta (%) keskim. aika ainea____(hj_

15 A2C6b -24h 72,2 (13/18) 44,6 ± 10,4C

8Ald -24h 75,0 (6/8) 60,0 ± 13 8A1_ -24h & +20h* 75,0 (6/8) 76,6 ± 30,5f 'Vasta-aineita annettiin passiivisesti laskimonsisaisesti 20 0,4 ml/hiiri bMonoklonaalinen anti-HBsAg-IgGl-vasta-aine, 4,0 mg/ml, jota kåytettiin negatiivisena vertailuaineena cKeskiarvon keskivirhe dMonoklonaalinen anti-LPS-IgGl, 10,0 mg/ml 25 *Ajankohtana +20 tuntia annettiin laskimonsisaisesti 0,2 ml ; 8A1 fKaksi hiirta kuoli ennen 48 tunnin kulumista ja muut nelja hiirta, jotka lopulta kuolivat, nåyttivåt terveilta 48 tunnin kuluttua.

30 Endotoksiinimalli

Lipopolysakkaridit (LPS:t) ovat gram-negatiivisten bakteerien endotoksiineja ja niilla on tårkeå osa gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamien infektioiden patogee-nisuudessa. LPSsn biologiset aktiviteetit ilmenevat lipidi 35 A -komponentissa. Tåstå syystå kaytettiin endotoksiinis-hokkimallia, jotta saataisiin tarkistetuksi monoklonaalis- 91 711 40 ten anti-LPS-vasta-aineiden teho lipidi A:n ja Re-LPS:n myrkkyvaikutusten kumoamisessa in vivo. Koska hiiret ovat suhteellisen kestaviå endotoksiinin tappavia vaikutuksia vastaan, kåytettiin Galanosin et al. [Proc. Natl. Acad.

5 Sci. USA 76 (1979) 5939-5934] jonkin aikaa sitten kehittå-måå galaktosamiini-indusoitu herkistys -menettelyå. Tama malli tekee mahdolliseksi endotoksiinin kayton suurina yliannoksina.

Ensimmaisessa kokeessa 10 CD-l-naarashiiren ryhma 10 (Charles River Breeding Laboratory, Kingston, NY) sai 10 mg seosta, joka sisalsi yhta suuret moolimaarat monoklo-naalisia vasta-aineita 8A1 ja 5E4, vatsakalvonsisaisesti inokuloituna 40 tuntia ennen infektointia ja uudestaan 16 tunnin kuluttua siita. Valittomasti ennen infektointia 15 sekoitettiin 12 μg lipidi A:ta, 15 mg galaktosamiinia ja yhteensa 3 mg vasta-aineita 8A1 ja 5E4 ja annettiin seos hantalaskimon kautta. Vertailuhiiriryhmå kåsiteltiin muu-ten samalla tavalla, mutta vasta-aineseos korvattiin PBS:1la. Aiemmat kokeet ovat osoittaneet, etta seos, joka 20 sisaltaå 12,0 μg lipidi A:ta ja 15,0 mg galaktosamiinia, on suurin piirtein pienin 100-%:isen kuoleman aiheuttava annos. Kuviossa 6 esitetyt tulokset osoittavat selvasti, ettå vasta-aineseoksella oli kyky osittain kumota lipidi A:n vaikutukset in vivo.

25 Toisessa kokeessa annettiin seosta, joka sisalsi yhta suuret moolimaarat monoklonaalisia vasta-aineita 4A10 ja 8A1 useina annoksina passiivisesti 5-6 hiiren ryhmille ja 16 tuntia ennen endotoksiiniruisketta. Tåsså tapaukses-sa kaytettiin infektoivana agenssina 0,1 μg Re-LPS ja 15 '30 mg galaktosamiinia. Tåhån seokseen ei sekoitettu vasta-aineita endotoksiinin kanssa. Taman Re-LPS-maaran havaittiin annoskokeissa olevan våhintåån 100 x LD100. Kuten kuviosta 7 on nåhtåvisså, vasta-aineseos selvasti antoi hiirille merkittavan suojan ensotoksiinin tappavia vaikutuksia vas-35 taan annoksesta riippuvalla tavalla. Asia, joka ei suoraan 91 711 41 nåy kuviossa 7, on se, etta kuudesta vertailuhiirestå nel-jå kuoli kuuden tunnin kuluttua infektoinnista, mutta yk-sikåån jonkin vasta-aineannoksen saaneista hiirista ei kultenkaan ollut kuollut siihen mennesså. On ilmeistå, 5 etta mitå suurempi vasta-aineannos on, sitå harvempi hiiri kuolee ja ne kuolevat hitaammin.

Nåmå kokeet osoittavat selvåsti, ettå monoklonaali-set anti-LPS-vasta-aineet pystyvåt suotuisalla tavalla kilpailemaan reseptorien kanssa endotoksiinista in vivo.

10 Esimerkki 8

Lipidi A -sitoutumistutkimukset TLC:llå Lipidi A oli peråisin kolmen heimon (Enterobacte-riaceae, Pseudomonadaceae ja Vibrionaceae) 19 edustavasta jåsenestå ja kahdeksasta gram-negatiivisesta bakteerisu-15 vusta. Nåihin kuuluivat kahdeksan Escherichia coli -sero-tyyppiå ja viisi Salmonella-lajia. Seuraavat LPS-nåytteet saatiin List Biological Laboratoriesista (Campbell, CA) s E. coli 0111:B4, E. coli 055:BS, E. coli 0127:Be, Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, 20 Yersinia enterocolitica, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholera Inaba; Ribi Immunochemistå (Hamilton, MT): E. coli 025:B6, E. coli 0128:B12, E. coli 0113, E. coli 11100:K235, Salmonella typhosa, Salmonelle ; abortus equi, Salmonella enteritidis, Shigella flexneri; 25 ja Lipidex Incssta (Middleton, WI): lipidi Y, lipidi Y*, lipidi X ja monoasyyliglukosamiini 1-P. Lajit, joista nåmå reagenssit saatiin, edustavat yli 70 * kaikista nosokomi-aalisista bakteremioista (Maki, supra; Braude et al., supra). Lipidi A tuotettiin erilaisista kaupallisista lah-30 teistå saatua LPS:åå kåsittelemållå ja kehitettiin ohut-kerroskromatografisesti (TLC) Amanon et al. menetelmållå [Biochem. Biophys. Res. Com. 106 (1982) 677-682]. Lyhyesti ilmaistuna 5 mg LPS:åå suspendoitiin 3 ml:aan 20 mM natriumase taattia (pH 4,5) ja keitettiin sitten 30 minuuttia.

35 Sitten nåytteitå sentrifugoitiin nopeudella 2 000 rpm 20 • * 91711 42 minuuttia. Sitten pelletti suspendoitiin takaisin 3 ml:aan 20 mM natriumasetaattia (pH 4,5) ja toistettiin menettely kahdesti.

Lipidi A, lipidi A -johdokset ja lipidi A:n esias-5 teet suspendoitiin liuokseen, joka sisålsi 0,5 tilavuus-% TEA vedesså, loppupitoisuudeksi 5 mg/ml. 25 μ9 kutakin nåytettå laitettiin 20 x 20 cm:n alumiinitaustaiselle si-likageeli 60 -TLC-levylle (VWR, Philadelphia, PA). TLC-le-vyt kehitettiin seoksella kloroformi:metanolisvesi:våkevå 10 ammoniakki (50:25:4:2). Antigeenit havaittiin uudella ent-syymiliittåmisimmuunikokeella. Tåmå menetelmå on samanlai-nen kuin radioimmuunikoe, joka on kehitetty syopåantigee-nien havaitsemiseksi TLC:lla ja jota ovat kuvanneet Hansson et al. [J. Biol. Chem. 258 (1983) 4091-4097]. Lyhyesti 15 ilmaistuna TLC-levyt suihkutettiin liuoksella, joka sisålsi 2 tilavuus-% BSA:ta PBS:sså ja inkuboitiin sitten 200 ml:ssa tåtå samaa liuosta kaksi tuntia huoneen låmpotilas-sa. Sitten liuos korvattiin tuoreella 2-%:isella BSAPBS-liuoksella, joka sisålsi mielenkiinnon kohteena olevaa 20 vasta-ainetta. Vasta-aine-pitoisuus oli 10 g/ml [mååritet-tynå RIA:lla kåyttåmållå vuohen anti-hiiri-F(ab')2] ja kå-sittelyaika kaksi tuntia. TLC-levyt pestiin sitten kolmes-ti 100 ml:lla PBS:åå ja sitten kerran 100 ml:lla 50 mM Tris-HCl (pH 8,0). Alkalinen fosfataasi - vasta-aine-vas-25 ta-aine-antigeeni-kompleksi havaittiin TLC-levyllå lisåå-mållå 100 ml entsyymisubstraattiliuosta, joka sisålsi 1 mg/ml naftoli-AS-MX-fosfaattia ja 2 mg/ml våriainetta, Fast Red TR -suolaa (Sigma). Reaktio pååtettiin 10 minuu-tin kuluttua huuhtomalla neljåsti tislatulla vedellå.

• 30 Kuviossa 8 esitetåån tulokset lipidi A:n entsyymi- liittåmisimmuunidetektoinnista ohutkerroskromatografiale-vyillå. Hiiren monoklonaalinen vasta-aine 8A1 tutkittiin lipidi A:ita vastaan, joiden låhteet olivat: kaista 1,

Escherichia coli 0111:B4; kaista 2, Salmonella minnesota; 35 kaista 3, Klebsiella pneumoniae; kaista 4, Yersinia ente- 91711 43 rocolitica; kaista 5, Serratia marcescens; kaista 6, Shigella flexneri; kaista 7, Pseudomonas aeruginosa FD, tyyp-pi I; kaista 8, S. typhimurium; kaista 9, S. typhosa 0901; kaista 10, E. coli 055:B5 (kuvio 8A). 8A1 testattiin myos 5 seuraavia aineita vastaan: kaista 1, S. minnesota Re:n LPS; kaista 2, S. minnesota Re:n lipidi A; kaista 3 E. coli J5:n lipidi A; kaista 4, S. typhumurium Re:n lipidi A; kaista 5, S. minnesota Re:n monofosforyylilipidi A; kaista 6, E. coli B:n de-esteroity monofosforyylilipidi A; 10 kaista 7, lipidi Y; kaista 8, lipidi X, kaista 9, lipidi Y*; ja kaista 10, monoasyyliglukesamiini-l-fosfaatti (ei reagoi; ei nay) (kuvio 8b).

Kuten kirjallisuudessa on aiemmin osoitettu, lipidi A ei ole homogeeninen aine (Amano et al., supra). Kuten 15 kuviosta 8 ilmenee, esiintyy lisåksi huomattavaa sukujen vålista heterogeenisyytta. Tåmå heterogeenisyys voi olla tulosta vaihtelusta esteriin sitoutuneiden rasvahappojen lukumåaråsså ja tyypisså, samoin kuin korvautumisista lipidi A:n fosfaattiryhmisså (kuvio 1). Koska tasså kuvatut 20 monoklonaaliset vasta-aineet saatiin E. coli J5:llå intmu-nisoiduista hiiristå, ei ole yllattåvaå, ettå 8A1 risti-reagoi E. coli 0111:B4:n lipidi A:n kanssa (kuvio 8). On merkittåvåå, ettå 8A1 (kuvio 8B) reagoi ristiin kaikkien tutkittujen gram-negatiivisten bakteerien lipidi A:iden 25 kanssa. Pseudomonas aeruginosa Fisher-D-tyypin I lipidi A:lla on selvåsti huomattavasti erilainen kemiallinen koosturnus kuin E. coli 0111:B4:n lipidi A:lla ja kuitenkin se on helppo havaita E. coli J5 -immunisoinnista saadulla anti-lipidi A-vasta-aineella. 8Al:n ristireagointikyky li-30 pidi Y:n kanssa, joka on monosakkaridi ja lipidi A:n esi-aste [Raetz, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 4624-4628], vahvistaa edelleen sitå våitettå, ettå vasta-aineiden epitooppi sijaitsee lipidi A:n kemiallisessa ra-kenteessa. Jotta varmistettaisiin suojaus luokittamatonta 35 patogeenia vastaan, 1) såilyneen antigeenin tulee esiintyå ♦ · 91711 44 kaikissa gram-negatiivisissa bakteereissa; 2) monoklonaa-lisen vasta-aineen/aineiden tulee kyeta tunnistamaan ku-viossa 8 esitettyjen kaltaiset variantit, joiden kemialli-sessa rakenteessa on pieniå eroja; lipidi A tåytti arvos-5 teluperusteen 1 ja tåsså kuvatut monoklonaaliset vasta-aineet tåyttavåt kriteerin 2.

Vastaavat suoritusmuodot

Alan asiantuntijat tietåvåt tai pystyvåt pelkin ru-tiinikokein varmistamaan monia tåmån keksinnon tåsså ku-10 vattuja erityissuoritusmuotoja vastaavia suoritusmuotoja. Seuraavat patenttivaatimukset on tarkoitettu tållaiset vastaavat suoritusmuodot kattaviksi.

I; t *

Claims (5)

91711 Patenttivaatlmukset

1. Menetelmå monoklonaalisten anti-lipidi A -vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka reagoivat spesifisesti 5 gram-negatiivisille bakteereille yhteisen LPS:n lipidi A -determinanten kanssa, tunnettu siitå, ettå vil-jellåan hybridoomaa ATCC 40083 ja/tai ATCC 40084 ja kerå-tåan talteen niiden tuottamat vasta-aineet.

2. Menetelmå sen måårittåmiseksi, ovatko bakteerlt 10 gram-negatiivisia, tunnettu siita, ettå bakteerit saatetaan kosketukseen monoklonaalisen anti-lipidi A -vas-ta-aineen kanssa, joka on tuotettu patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmållå, ja mååritetåån, sitoutuuko vasta-aine bakteereihin, jolloin vasta-aineen sitoutuminen on 15 osoituksena gram-negatiivisista bakteereista ja sitoutumi- sen puuttuminen on osoituksena bakteereista, jotka eivåt ole gram-negatiivisia.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmå, tunnettu siita, ettå se kåsittåå lisåksi vaiheen, jossa 20 bakteerit esikåsitellåån lievåsti happamella vesiliuoksel-la, joka paljastaa lipopolysakkaridin sisåltåmåt yhteiset antigeenideterminantit.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmå, t u n- ; n e t t u siitå, ettå bakteerit saatetaan kosketukseen 25 hybridooman ATCC 40083 ja ATCC 40084 tuottamien antilipidi A -vasta-aineiden seoksen kanssa.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmållå valmistettujen monoklonaalisten anti-lipidi A -vasta-aineiden kåytto gram-negatiivisten bakteerien tai gram-nega- 30 tiivisten bakteereiden endotoksiinin immunomåårityksesså. 91711