FI91166C - Ternimaitofraktio, menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö kasvualustojen täydennysaineena - Google Patents

Description

i 91166

Ternimaitofraktio, menetelmS sen valmistamiseksi ja sen kSyttd kasvualustojen t&ydennysaineena

KeksintO koskee ternimai tof rakt iota, menetelmaa sen 5 valmistamiseksi sek& sen kfcyttdS kasvualustojen taydennys-aineena. Keksinndn mukaisella ternimaitofraktiolla on al-hainen endotoksiini-, proteiini- ja immunoglobuliinipitoi-suus ja se valmistetaan ultrasuodattamalla esik&siteltyå ternimaitoa.

10 Nisdkassolujen viljelyssé in vitro kSytetaan perin- teisesti perusalustan lisSna nisakkaiden veren seerumia, joka sisaltaa useita osin tuntemattomia solujen kasvua stimuloivia aineita, mm. kasvutekijbita, vitamiineja, hi-venaineita, hormoneja ja tarttumistekijdita. Useimpiin 15 kayttOtarkoituksiin sopivin on naudan sikiOseerumi, jonka hinta on viime vuosina noussut voimakkaasti kysynnan laa-jetessa. Toisena syyna hinnan nousuun on ollut kyllin puh-taan seerumin saannin vaikeus. Korkean hinnan lisaksi on-gelmana on seerumin kompleksinen koostumus ja erityisesti 20 korkea proteiinipitoisuus, mika haittaa soluviljelylia tuotettujen aineiden eristamista soluviljelyalustasta. Kontaminaatiovaara on lisaksi suuri kSytettaesså seerumia kasvualustojen taydennysaineena.

Monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen muodos-25 taa seka teknisesti etta taloudellisesti merkittavån osan eiainsoluviljelyteknologiasta. Monoklonaalisia vasta-ai-neita tuotetaan suuria maariå erilaisiin kliinisiin ja tieteellisiin tarkoituksiin. Monoklonaalisten vasta-aineiden suuren mittakaavan tuotannossa on tarkeaa kayttaa so-30 pivaa viljelyalustaa. Vasta-aineiden tuoton tulisi olla jatkuvaa ja toisinnettavissa, prosessikustannusten tulisi olla mahdollisimman alhaiset, vasta-aineiden puhdistuksen tulisi olla helppoa ja mikrobien ja endotoksiinien aiheut-tamia kontaminaatio-ongelmia tulisi vaitt&å. T3ma koskee 35 mybs muiden kliinisesti k&ytettdvien biologisten aineiden, 2 kuten kasvutekijOiden, hormonien ja rokotteiden, valmis-tusta geenitekniikan keinoin. Naita vaatimuksia on kuiten-kin hyvin vaikea tayttaa, kun naudan sikiOseerumia kSyte-tåån viljelyalustan tSydennysaineena.

5 Nain olien on pyritty lOytamaan vaihtoehtoja seeru- mille kehittamaiia erilaisia perusalustoja ja seerumin korvikkeita. Nama sisaitavat kokonaan tai osittain puhdis-tettuja kasvua stimuloivia aineita, jotka on joko tuotettu biosynteettisesti tai eristetty suoraan biologisesta mate-10 riaalista. Tailaisia kasvua stimuloivia aineita, joita esiintyy paitsi seerumissa myOs naudan ternimaidossa, ovat esimerkiksi eri peptidikasvutekijat kuten insuliini ja in-suliinin kaltaiset kasvutekijat (IGF-1 ja IGF-2). Kasvute-kijOiden synteesi, eristaminen ja puhdistaminen on yleenså 15 vaikeaa, eikå suuren mittakaavan tuotantoon soveltuvia me-netelmia ole kuvattu alan kirjallisuudessa. Puhdistettujen kasvutekijOiden kéyttoa rajoittaa myOs niiden sikiOseeru-miakin korkeampi hinta.

Maidon ja juuston valmistuksen sivutuotteena syn-20 tyvan heran fraktioiden kayttoa soluviljelyalustojen tay-dennysaineena on kuvattu alan kirjallisuudessa. Maidon kasvutekijaaktiivisuus laskee kuitenkin jyrkasti poikimi-sen jaikeen ja on jo kolmen vuorokauden kuluttua ja my6-henunissa laktaation vaiheissa hyvin alhainen, lahes olema-25 ton. Maito sisaltaa tosin mahdollisesti muita solujen kasvua edistavia aineita, ravinteita ym, jotka voivat edes-auttaa solujen viljelya.

On myOs tunnettua, etta naudan ternimaito ja sen fraktiot stimuloivat nisakassolujen kasvua in vitro. Nau-30 dan ternimaito sisaitaa kuitenkin muiden solulle vaitta-mattOmien aineiden lisaksi suuria maaria immunoglobuliine-ja, paaosin IgG:ta, ja muita proteiineja, kuten kaseiini-miselleja, α-laktalbumiinia, β-laktoglobuliinia ja albu-miinia. Heti laktaation jaikeen IgG-pitoisuus voi olla 35 jopa 40 - 60 g/1. Kun ternimaitoa kdytetaan sellaisenaan li 91166 3 hybridomien viljelyyn, tåmå on selvå haitta, koska hybri-domatuotteiden eriståminen ja puhdistaminen vaikeutuvat.

Toinen vakava ongelma liittyy psykrotrooppisiin mikro-organismeihin, låhinnå gram-negatiivisiin bakteerei-5 hin, jotka ovat tavallisimmat xnaidon pilaajat såilytyksen aikana. Mikro-organismien tuottamat lipopolysakkaridit (endotoksiinit) ovat vastuussa monista gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamiin infektioihin liittyvistå patofy-siologista vaikutuksista. Endotoksiinit ovat siten erit-10 tain haitallisia kontaminantteja ja niiden poistaminen on vålttåmåtontå etenkin silloin, kun soluviljelyssa tuotet-tuja aineita annetaan ihmisille.

EP-hakemusjulkaisussa 219 372, Linden et al., kuva-taan tavallisen maidon tietyn molekyylipainoisia frak-15 tioita, niiden valmistusta ja kåyttbå soluviljelysså. Jul-kaisun mukaan maito ensin ultrasentrifugoidaan, mikå on teknisesti vaikeaa suuren mittakaavan puhdistuksessa. Var-sinainen fraktiointi suoritetaan sitten aineiden erilai-seen molekyylikokoon perustuvalla ultrasuodatuksella, jon-20 ka erottelukyky on karkea. Nåin olien proteiinipitoisuus lopputuotteessa on hyvin korkea kasvutekijåaktiivisuuteen nahden. Keksijat ovat kuvanneet myos juuston valmistuksen sivutuotteena syntyvan heran tai sen fraktioiden kayttbå nisakåssolujen viljelysså (Biotechnology Techniques 2 25 (1988) s. 253 - 258, Damerdhjii et al. ja Lait 70 (1990) s. 313 - 324, Oerouiche et al.). Ongelmana nåissåkin on hyvin korkea proteiinipitoisuus ja kemiallisen sekå mikrobiologisen kontaminaation mahdollisuus.

EP-hakemusjulkaisussa 313 515, Biirk, R. R. & Cox, 30 D., kuvataan maidon polypeptidikasvutekijåå, menetelmiå sen eriståmiseksi ja puhdistamiseksi maidosta ja maito-tuotteista, sekå sen kåyttoå farmaseuttisena aineena, ra-vintokoostumusten lisåaineena ja soluviljelyalustojen tåy-dennysaineena. Julkaisussa kuvattu menetelmå kåsittåå ka-35 tioninvaihtokromatografiaa, hydrofobista interaktiokroma- 4 tografiaa, kokoon perustuvaa ekskluusiokromatografiaa ja polyakryyliamidigeelielektroforeesia. Kuten jo aikaisemmin todettiin laskee maidon kasvutekijaaktiivisuus jyrkåsti poikimisen jalkeen. Ternimaitoa ja sen kasittelya el kui-5 tenkaan julkaisussa mainita.

US-patenttijulkaisussa 4 440 860, Klagsbrun, kuva-taan maitoa tal ternimaitoa ja fibronektiinia sisaitavia soluviljelyalustoja ja niiden valmistusta. Julkaisun mu-kaan fraktiot valmistetaan geelisuodatuksella ja isoelekt-10 risella fokusoinnilla, joka ei sovellu suuren mittakaavan tuotantoon. Julkaisussa ei ole esitetty, miten taataan lopputuotteen mikrobiologinen puhtaus. Julkaisussa kuvat-tujen fraktioiden kasvutekijaaktiivisuutta ei ole verrattu naudan sikittseerumiin, joka on yleisin soluviljelyalus-15 toissa kaytOssa oleva seerumityyppi, vaan oleellisesti vahemmån aktiivisuutta sisaitavaan vasikan seerumiin. Fraktioiden endotoksiinipitoisuutta ei mainita lainkaan. Lisaksi on todettava, etta julkaisussa kasiteliaan saman-laisina eri nisSkSslajien ternimaidon kasvutekijSfraktioi-20 ta. MyOhemmin on kuitenkin todettu, etta esimerkiksi naudan ja ihmisen ternimaidon paaasialliset kasvutekijat poikkeavat niin paljon toisistaan, ettei niiden eristami-seksi voida kåyttaa samaa menetelmaa (Endocrinology 115 (1984) s. 273 - 282, Shing, Y. W. & Klagsbrun, M.).

25 Shing et al. ovat teoksessa Methods in Enzymology, vol. 146, toimittajat Barnes D. ja Sirbasku, D. A., kuvan-neet naudan ternimaidon kasvutekijan (BCGF:n) puhdistusme-netelman, joka perustuu kationinvaihtoon, isoelektriseen fokusointiin ja suuren erotuskyvyn ekskluusiokromatogra-30 fiaan. Menetelma ei sovellu kasvutekijan eristamiseen tuo-tannollisessa mittakaavassa.

Francis et al. ovat julkaisussa Biochem. J. 251 (1988) s. 95 - 103 kuvatun menetelman mukaisesti erista-neet ja karakterisoineet naudan ternimaidosta insuliinin-35 kaltaiset kasvutekijat IGF-1 ja IGF-2. Nama ovat molekyy- 91166 5 lipainoltaan 8000 ja 7000 D ja rakenteeltaan lahes ident-tiset ihmisen vastaavien tekijOlden kanssa. Monlvalhelnen ja hankala menetelma kasittaa nun. uselta kationinvaihto-kromatografia- ja kaanteisfaasi-HPLC-vaiheita, eika siten 5 sovellu suuren mlttakaavan tuotantoon.

Tunnetut menetelmat ovat slls kalkkl monlvaihelsla ja hankalia suorlttaa eivatka sovellu suuren mlttakaavan tuotantoon. Monimutkaiset ja aikaavievét puhdistusoperaa-tlot lisaavat myiis tuottelden hlntaa. Lisaksi on huomat-10 tava, etta julkaisuissa el ole esitetty, miten taataan lopputuotteen mikrobiologinen puhtaus. Lopputuotteen endo-toksiinipitoisuutta el myOskaan julkaisuissa mainita. En-dotoksiineja ja niiden aiheuttamia ongelmia ei julkaisuissa kuvata, eika niissa siten myOskaan ole esitetty rat-15 kaisua naihin ongelmiin.

Ternimaidon suurimmat haittapuolet viljelyalustojen taydennysaineena ovat sen korkea proteiini- ja IgG-pitoi-suus seka yleensa korkea endotoksiinipitoisuus. Ternimai-dossa olevat virukset saattavat myiis estaa solujen kasvua 20 ja jopa tappaa soluja. Ternimaidon korkea proteiinipitoi- suus ja sen sisaltamat liukenemattomat sedimentit vaikeut-tavat my6s ternimaidon kasittelya ja tekevat esimerkiksi rasvattoman ternimaidon steriloinnin mikrosuodattimien avulla lahes mahdottomaksi. Mikali suuria maaria rasvaton-25 ta ternimaitoa lisataan viljelyalustaan, perusalustaan muodostuu lisaksi saostumia.

Nyt on yliattaen havaittu, etta naudan ternimaidos-ta voidaan tassa hakemuksessa kuvatulla menetelmaiia muo-dostaa fraktio, jolla on hyvin alhainen proteiini- ja im-30 munoglobuliinipitoisuus ja jonka endotoksiinipitoisuus on kaytannOllisesti katsoen nolla. Lopputuote sisaitaa kaikki ternimaidossa olevat kasvutekljat, hivenaineet, vitamiinit ja muut soluviljelyn kannalta vaittamattOmat pienimoleku-laariset yhdisteet. Maidossa olevat haltalliset endotok-35 siinit sen sijaan poistetaan prosessin aikana. MyOs mah- 6 dolliset viruspartikkelit todennåkoisesti poistuvat, mika tietysti våhentaå soluviljelyn lopputuotteiden kontaminaa-tiovaaraa.

Keksinto koskee siten ternimaitofraktiota, jolla on 5 alhainen endotoksiini-, proteiini- ja immunoglobuliinipi-toisuus.

Keksinnon mukainen ternimaitofraktio voidaan val-mistaa keksinnon mukaisella menetelmållå, jolle on tunnus-omaista, ettå esikåsitellylle ternimaidolle suoritetaan 10 ultrasuodatuskåsittely kåyttåen membraania, jonka cut off on 100 000, ja suodos otetaan talteen.

Keksinnon mukainen menetelma perustuu siis ultra-suodatukseen. Ternimaito esikåsitellåan ensin rasvan ja mahdollisten solujåanteiden poistamiseksi. Haluttaessa 15 rasvattomasta ternimaidosta voidaan muodostaa heraliuos poistamalla kaseiini esimerkiksi happo- tai entsyymisaos-tuksella. Muodostunut rasvaton ternimaito tai hera ultra-suodatetaan sitten kayttåen membraania, jonka cut off on 100 000 ja suodos otetaan talteen. MenetelmS soveltuu ai-20 kaisemmin esitettyihin menetelmiin verrattuna erittåin hyvin suuren mittakaavan tuotantoon ja lopputuotteen puh-taus voidaan varmistaa esimerkiksi steriilisuodatuksella.

Menetelmåvaihtoehto, jossa kaseiinisaostusta ei suoriteta, on edullisempi, koska se on yksinkertaisempi ja 25 halvempi suorittaaa. Toisaalta, jos kaseiinisaostus suoritetaan, saadaan jonkin verran parempi tuote, eli saadulla ultrasuodoksella on alempi proteiini- ja immunoglobuliini-pitoisuus.

Keksinnon mukainen ternimaitofraktio on erittåin 30 kåyttokelpoinen joko sellaisenaan tai tehostettuna muilla tåydennysaineilla yleisesti kåytetyisså soluviljelyyn tar-koitetuissa alustoissa korvaamaan osittain tai kokonaan naudan sikioseerumin. Fraktion vaikutusta voidaan tehostaa lisååmållå yhtå tai useampaa tåydennysainetta, kuten esi-35 merkiksi natriumseleniittiå, insuliinia, etanoliamiinia,

II

91166 7 β-merkaptoetanolia, naudan seerumialbumiinia tms.

Keksinndn mukainen ternimaitofraktio valmistetaan siis naudan ternimaidosta. Edullisesti raaka-aineena kay-tetéén parin vuorokauden sisaiia poikimisen jalkeen lyp-5 settyå ternimaitoa. Ternimaito voidaan pakastaa tilalla ennen kasittelyjen aloittamista.

Ternimaidosta poistetaan aluksi rasva ja mahdol-liset solujaanteet esimerkiksi sentrifugoimalla, kayttåen tavanomaista meijeriseparaattoria tai suodattamalla.

10 Haluttaessa rasvattomalle ternimaidolle suoritetaan steriilisuodatuskasittely, joka kasittaa ternimaidon suo-dattamisen joko yhden tai useamman erikokoisen mikrosuo-dattimen lapi. Steriilisuodatus ei ole vaittamatiinta, mut-ta se nopeuttaa ultrasuodatusta ja vahentaa fraktion bak-15 teeripitoisuutta.

Haluttaessa voidaan rasvaton ternimaito mytts kasi-telia edelleen, esimerkiksi kaseiini voidaan poistaa hap-posaostuksella laskemalla seoksen pH:ta. Saostukseen kay-tetaan esimerkiksi suolahappoa tai etikkahappoa, ja pH 20 lasketaan noin arvoon 4,5. Saostus voidaan suorittaa koro-tetussa lampdtilassa mikrobiologisten kontaminanttien va-hentamiseksi. Saostus voidaan myds suorittaa entsyymien avulla. Sakka voidaan erottaa seoksesta eri menetelmilia, esimerkiksi sentrifugoimalla tai tangentiaalisella kalvo-25 suodatuksella. Kun sakka on erotettu, neutraloidaan seos ja syntynyt sakka poistetaan. Nain saadaan ternimaidon heraa.

Muodostetulle vaaleankeltaiseile ternimaidon heralle suoritetaan haluttaessa steriilisuodatuskasittely edel-30 la kuvatulla tavalla.

Saatu tuote ultrasuodatetaan sitten kayttaen memb-raania, jonka nimellinen molekyylipainoraja on 100 000, ja membraanin lapi meneva suodos otetaan talteen.

Ultrasuodosfraktiota voidaan haluttaessa konsen-35 troida, steriilisuodattaa ja/tai lyofilisoida. Fraktiota δ voidaan haluttaessa myos puhdistaa edelleen.

KMyttoå vårten keksinnon mukainen ternimaitofraktio lisStSån kasvualustaan. Fraktion optimikonsentraatio on noin 5 - 15 %, vaikka myos pienempia maåria voi kåyttåa.

5 Hyvin suurina pitoisuuksina fraktiolla on solukasvua inhi-boiva vaikutus. Haluttaessa fraktiota tMydennetaan apuai-neilla tai kasvua ediståvillS aineilla. Kaytetyt aineet ja niiden pitoisuus vaihtelevat solutyypeittain. Esimerkkinå voidaan mainita, ettå viljeltåesså LPCl-hybridomasoluja 10 10 prosenttisessa ternimaitofraktiossa tåydennettynå natrium- seleniitillå, natriumseleniitin optimikonsentraatio on noin 0,4 -2 μΜ, kun taas 3T3-solujen osalta optimikonsentraatio on noin 0,4 -100 nM. Vaikka solujatkot tehdåån pienilla solutiheyksilla (esim. 15 000 solua/ml) hybrido-15 mat voidaan lisata soluviljelyalustaan ilman adaptiovai-hetta.

Keksinnon mukaisella ternimaitofraktiolla taydenne-tysså kasvualustassa saavutettu maksimi solutiheys on pie-nempi kuin kaytettåesså naudan sikioseerumia. Fraktio on 20 kuitenkin taloudellisesti hyvinkin kilpailukykyinen sikio- seerumin kanssa. Tuloksia voidaan myos parantaa optimoi-malla viljelyolosuhteita. Fraktion alhaisen proteiinipi-toisuuden ansiosta viljeltyjen solujen tuottamia proteii-neja kuten monoklonaalisia vasta-aineita on helpompi puh-25 distaa kuin sellaisesta soluviljelyalustasta, johon on lisatty seerumia. Terapeutt isten proteiinien puhdistamista helpottaa myos ultrasuodoksen alhainen endotoksiinipitoi-suus. Alhaiset proteiini- ja endotoksiinipitoisuudet ta-kaavat osaltaan sen, etta tuotettuja proteiineja, voi an-30 taa myos ihmiselle ilman terveyshaittoja.

Keksintoa valaistaan seuraavien esimerkkien avulla, joiden tarkoituksena ei ole rajoittaa keksintoa. Kaikissa kuvatuissa solukasvatuksissa, joissa kåytettiin ultrasuo-dosta, oli transferriinia mukana (5 mg/ml).

Il 91166 9

Esimerkki 1

Fraktion valmistaminen naudan ternimaidosta

Naudan ternimaitoa kerattiin 16 lehmaita viidelta eri maatilalta. Jokaiselta lehmaita kerattiin viidesta 5 ensimmaisesta lypsykerrasta laktaation alkamisesta yksi litra ternimaitoa, joka jaahdytettiin vaiittdmasti. 80 litran era valmistettiin sekoittamalla sama maara ternimaitoa jokaisesta lypsykerrasta. Ternimaitopooli jaettiin yhden litran eriin ja sailytettiin -20 °C:ssa jatkokasit-10 telya vårten.

Ternimaito sulatettiin ja sentrifugoitiin 10 000 g 60 min. Rasvaa sisaltava paailimmainen kerros ja solujaan-teita ja muuta liukenematonta materiaalia sisaitava poh-jakerros heitettiin pois. Kaseiini saostettiin 56 eC:ssa 15 saatamana pH arvoon 4,6 2 M HClilia. Seosta sekoitettiin tunnin ajan, jonka jaikeen sakka poistettiin sentrifugoi-malla 4 °C:ssa 10 000 g 60 min. Heraa inkuboitiin 4 °C:ssa y5n yli, minka jaikeen pH saadettiin arvoon 7,0 4 M NaOHrlla. Sakka poistettiin sentrifugoimalla huoneen lam-20 pdtilassa edelia kuvatulla tavalla. Kirkastettu hera suo- datettiin peråkkain 0,8 ym:n ja 0,22 μπι:η suodattimien lapi (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) ja suodos ultrasuodatettiin Minitan-laitteessa (Millipore) kayttaen polysulfoniultrasuodatuskalvoja, joiden nimellinen mole-25 kyylipainoraja oli 100 000. Ultrasuodos suodatettiin 0,22 pm:n suodattimen lapi ja sailytettiin -20 °C:ssa.

Esimerkki 2

Fraktion valmistaminen naudan ternimaidosta, vaih- toehtoinen tapa 30 Esimerkin 1 mukaisesti valmistettu ternimaitoera sulatettiin ja rasva, solujaanteet ja muu liukenematon materiaali erotettiin separaattorilla. Saatu rasvaton ter-nimaitofraktio suodatettiin perakkain 0,8 pm:n ja 0,22 ym:n suodattimien lapi (Millipore Corporation, Bedford, 35 MA, U.S.A.) ja suodos ultrasuodatettiin Minitan-laitteessa 10 (Millipore) k&yttSen polysulfoniultrasuodatuskalvoja, joi-den nimellinen molekyylipainoraja oli 100 000. Ultrasuodos suodatettiin 0,22 pm:n suodattimen l&pi ja sSilytettiin -20 °C:ssa.

5 Esimerkki 3

Fraktion ja vAlituottelden karakterisointi

Esimerkkien 1 ja 2 mukaisesti saatujen lopputuot-teiden ja vSlituotteiden proteiinipitoisuus måSritettiin kolorimetrisesti julkaisussa Anal. Biochem. 72 (1976) s. 10 248 - 254 kuvatulla tavalla kSyttSen vakiona naudan immu- noglobuliinia. Monoklonaalisten vasta-aineiden pitoisuus maaritettiin FPLC:11S (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) kfiytta-en ProAna™Mabs -proteiini G-kolonnia (Perstorp Biolytica, Lund, Ruotsi) ja vakiona puhdistettua hiiren IgG-1 julkai-15 sussa J. Immunol. Meth. 114 (1988) s. 175 - 180 kuvatulla tavalla. Saatujen tuotteiden kokonaisproteiinipitoisuus ja IgG-pitoisuus on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1

Naudan ternimaidon, heran ja ultrasuodoksen pro-20 teiini- ja IgG-pitoisuus NSyte IgG Kokonaisproteiinipitoisuus [g/i] [g/i] 25

Rasvaton 22,5 ± 1,0 67,1 ± 7,5 ternimaito

Hera 12,8 ± 1,1 19,6 ± 0,35 30

Ultrasuodos 0,24 ± 0,01 1,15 ± 0,027 (esim. 1)

Ultrasuodos 0,830 ± 0,341 3,48 ± 0,88 35 (esim. 2) 91166 11

Endotoksiinit maaritettiin julkaisussa Bull. John Hopkins Hospital 115 (1964) s. 265 - 274 kuvatulla Limulus Amebocyte Lysate (LAL) gel-clot-menetelmaiia ja testipak-kaus oli Whittaker Bioproducts Inc.:n (Walkersville, MD, 5 USA) tuote. Endotoksiinivakio on valmistettu E. coli-kan-nasta 055:B5. Kontrollivakioendotoksiinin (CSE, Control Standard Endotoxin) pitoisuus oli 10 EU/ng ja lysaatin herkkyys oli 0,06 EU/ml. Analyysit suoritettiin valmis-tajan ohjeiden mukaisesti. Laimennoksiin kSytettiin pyro-10 geenivapaata vetta (Leiras Oy, Turku, Suomi) ja laimen-nokset tehtiin aseptisesti. Endotoksiinipitoisuus lasket-tiin kertomalla testiliuoksen suuremman laimennoksen, joka antoi positiivisen loppupistearvon, kaanteisarvo lysaatin herkkyydelia. Tunnetun endotoksiinipitoisuuden omaavaa 15 positiivista kontrollia ja pyrogeenivapaasta vedesta rauo-dostuvaa negatiivista kontrollia kaytettiin jokaisessa analyysissa. Tuotteiden endotoksiinipitoisuus on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 2 20 Naudan ternimaidon, heran la ultrasuodoksen endo toksiinipitoisuus

Nayte Endotoksiinipitoisuus [EU/ml] 25 _

Rasvaton ternimaito 7,7 ± 5,5 30 Hera 0,66 ± 0,36

Ultrasuodos <0,24 (esim. 1) 35 Ultrasuodos <4,6 (esim. 2) 12

Esimerkln 1 mukaisesti valmistettu ultrasuodos sisalsi siis endotoksiineja vdhemmån kuin 0,24 EU/ml. Esimerkin 2 mukaisessa tuotteessa on enemmån endotoksiineja, mutta ei kuitenkaan enemmån kun seerumista valmiste-5 tuissa tuotteissa. Seka ultrasuodos etta ternimaito sisal-sivat LAL-analyysin inhibiittoreita, mutta naiden vaikutus vaitettiin laimentamalla naytteet (1:2) ja kuumentamalla ne 100 °C:ssa noin 2 min.

Esimerkki 4 10 Fraktion kåyttd hybridomasolujen viljelyssa

Hybridomien valmistus

Balb/c-hiiria immunisoitiin intraperitoneaalisesti joka kolmas viikko joko 200 pg:lla laktoferriinia (Sigma Chemical Co., St.-Louis, MO, USA) tai 200 pg:lla laktope-15 roksidaasia (Sigma). Ensimmainen ja kaksi seuraavaa annos-ta annettiin Freunds'in taydellisessa ja vastaavasti epå-taydellisessa adjuvantissa. Viimeinen annos annettiin fos-faatilla puskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Eiainten perna kerattiin fuusiota vårten kolme paivaa viimeisen an-20 noksen jalkeen. Pernan lymfosyytit fuusioitiin X63.Ag8.653 hiiren myeloomasoluilla julkaisussa Methods Enzymol 73 (1975) s. 3-46 kuvatulla tavalla ja anti-laktoferriini-ja anti-laktoperoksidaasi-vasta-aineita tuottavat hybridit seulottiin ELISA-maaritykselia (enzyme linked immunosor-25 bent assay) teoksessa Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, toimittajat Burdon R. H. ja Knippenberg P. H., Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Hollanti, kuvatulla tavalla. Vasta-aineiden alaluokat maa-ritettiin kaupallisia kitteja kayttaen valmistajan ohjei-30 den mukaisesti (Mouse-Typer Sub-Isotyping Kit, Bio-Rad, Richmond, CA, USA ja Serotec Ltd., Oxford, UK). Kloonit LFC6 ja LFC1 tuottivat IgG-1 alaluokkaa olevia anti-lakto-ferriini-vasta-aineita ja LPC1 samaa alaluokkaa olevia anti-laktoperoksidaasi-vasta-aineita.

91166 13

Hybridomien viljely

Soluja kasvatettiin DMEM-alustassa (Dulbeccos's Modified Eagles Essential Medium, Flow Laboratories Ltd., Scotland, UK), johon oli lisétty 4 mM glutamiinia, 100 5 U/ml penisilliinia ja 100 pg/ml streptomysiinia (perus-alusta). Kantaviljelmia pidettiin 75 cm2 muovipulloissa (Costar, Cambridge, MA, USA), joihin oli lisatty 7 % nau-dan sikibseerumia (Flow). Alaviljelmien muodostamiseksi eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa olevia soluja sentrifu-10 goitiin 400 g 5 min. Supernatantti heitettiin pois ja soluja pestiin kerran PBS:lia. Sitten solut suspendoitiin kasvualustaan, jossa oli tunnetut maarat (0 - 20 %) naudan sikibseerumia, rasvatonta naudan ternimaitoa, heraa tai ultrasuodosta taydennettyna ihmisen transferriinilia, 5 15 mg/ml (Sigma). Solut maljattiin tassa koeviljelyalustassa 6 kuopan mikrotiitterilevyihin (Costar) 15 000 solua/ml ja inkuboitiin 0-12 vrk vaihtamatta viljelyalustaa. Solu-laskennat suoritettiin rinnakkaismaarityksina hemasytomet-rilia kayttaen trypaanisiniekskluusiota solujen elinkel-20 poisuuden maarittamiseksi.

Tulokset on esitetty graafisesti kuviossa 1, joka kuvaa eiavien LPC1-solujen lukumaaråa ajan funktiona jat-kuvan kasvatuksen aikana ultrasuodoksella (A), heralla (B) ja rasvattomalla ternimaidolla (C) taydennetyssa kasvu-25 alustassa. Kasvualustaan oli lisatty seuraavat maardt esi-merkin 1 mukaisesti valmistettua taydennysainetta: 1 % (·), 5 % (f), 10 % (), 15 % (A) ja 20 % (X). Suurin solu-tiheys 5,31 x 105/ml saatiin kayttamaiia 10 % ultrasuodosta (kuvio 1A), rasvattomassa ternimaidossa suurin solutiheys 30 4,61 x 105/ml saatiin kayttamaiia 1 % ternimaitoa (kuvio 1C). Solutiheys jai alhaiseksi kaikilla herakonsentraa-tioilla (kuvio IB).

Kuviossa 2 verrataan LPCl-solujen kasvua 10-pro-senttisessa naudan sikibseerumissa (·), 10-prosenttisessa 35 esimerkin 1 mukaisesti valmistetussa ultrasuodoksessa () 14 ja 10-prosenttisessa esimerkin 2 mukaisesti valmistetussa ultrasuodoksessa (▼).

Eri tavalla taydennetyssa perusalustassa kasvatet-tujen LFCl-, LFC6- ja LPCl-hybridomien kasvukåyråt on esi-5 tetty kuviossa 3. Hybridoma LPCl kasvatettiin 10-prosent-tisessa naudan sikioseerumissa (·), 10-prosenttisessa ul-trasuodoksessa (o) ja perusalustassa, johon oli lisåtty ainoastaan transferriinia 5 mg/ml (▲), hybridoma LFC1 kasvatettiin 10-prosenttisessa naudan sikidseerumissa (ψ) ja 10 10-prosenttisessa ultrasuodoksessa (V) ja hybridoma LFC6 kasvatettiin 10-prosenttisessa naudan sikioseerumissa () ja 10-prosenttisessa ultrasuodoksessa (e).

Solulinjojen kasvuominaisuuksissa ei havaittu muu-toksia. Suurimmat hybridomasolutiheydet olivat 13,6 - 15,8 15 x 105/ml 10-prosenttisessa naudan sikioseerumissa ja 5,12 -5,64 x 105/ml 10-prosenttisessa ultrasuodoksessa. Ultrasuo-doksen aikaansaama suurin solutiheys oli siis noin 35-40 % sikioseerumiin verrattuna. Hybridomien jakautumisaika 011 noin 17 tuntia ja vastaavasti noin 35 tuntia sikiosee-20 rumissa ja ultrasuodoksessa. Kun perusalustaan 1isattiin vain transferriinia, hybridomat eivåt kaytMnnollisesti katsoen kasvaneet lainkaan. Toisaalta, ultrasuodos ei pys-tynyt edistamaan hybridomien kasvua ilman transferriiniå. Monoklonaalisten vasta-aineiden tuotto 25 LFCl- ja LFC6-hybridomasolujen vasta-aine-tuotto kasvualustassa, joka sisMlsi 10 % naudan sikioseerumia (FBS) ja vastaavasti 10 % ultrasuodosta (UF), on esitetty kuviossa 4 [LFCl: FBS (·), UF (o); LFC6: FBS (), UF (o)].

12 vuorokauden jatkuvan kasvatuksen jalkeen vasta-ainepi- 30 toisuudet kåytettaesså 10 % ultrasuodosta olivat 40 % (LFCl) ja 42 % (LFC6) siitå, mita saatiin kaytettaessa 10 % sikioseerumia (83,5 mg/1 LPCl ja 72,0 mg/1 LPC6).

91166 15

Esimerkki 5

Fraktion kSyttd mulden solujen viljelyyn

Esimerkin 1 mukaisesti valmistetun fraktion vaiku-tusta muiden solujen kasvuun tutkittiin kayttamaiia kolmea 5 eri solutyyppia. Vero-(Afrikkalaisen vihrean apinan munu-aissolulinja, ATCC CCL 81), CHO-Ki- (Kiinalaisen hamsterin munasolulinja, ATCC CCL 61) ja 3T3- (Hiiren sikidn fibro-blastisolulinja, ATCC CCL 92) soluja kasvatettiin perus-alustassa, joka sisaisi vaihtelevia maaria ultrasuodosta.

10 Kantaviljelraat sailytettiin 10-prosenttisessa naudan si-kiOseerumissa. Alaviljelmien muodostamiseksi soluja pes-tiin kerran PBSrlia ja suspendoitiin perusalustaan, joka oli taydennetty vaihtelevilla maarilia (0 - 20 %) ultrasuodosta ja transferriinilia, 5 mg/ml. Solut maljattiin 15 koealustaan 24-kuopan mikrotiitterilevyilia (Costar) kåyt-taen pitoisuutta 20 000 eiavaa solua/ml ja inkuboitiin vaihtamatta kasvualustaa 7 vrk. Solulaskennat suoritettiin rinnakkaismaarityksina hemasytometrilia kayttaen trypaani-siniekskluusiota. Tulokset on esitetty taulukossa 3.

20 Taulukko 3

Ultrasuodoksen vaikutus eri solutyyppien kasvuun

Ultrasuodos- Soluja/ml pitoisuus Vero CHO-Ki 3T3 25 _ 20 % 26000 13000 46000 15 % 116000 17000 108000 10 % 133000 16000 81000 5 % 51000 7800 47000 7: 30 1 % 11000 0 7800 0 % 19000 5600 2200 16

Tuloksista ilmenee, etta ultrasuodos stimuloi kaik-kien solulinjojen kasvua, joskin eri solutyypit reagoivat eri tavalla. Ultrasuodoksella on vaikutusta jo niinkin pienena pitoisuutena kuin 1 %, ja pitoisuudet 5 - 15 % 5 pidetaan edullisina. Erityisen edullisia ovat 10 - 15 % pitoisuudet.

Esimerkki 6

Fraktion supplementointi

Keksinndn mukainen ultrasuodostuote sisaitaa aina 10 transferriinia. Lisaksi sen vaikutusta solukasvua stimu- loivana aineena voidaan tehostaa erilaisilla supplemen- teilla. Natriumseleniitti- ja B-merkaptoetanolilisdyksen vaikutus 3T3-solujen kasvuun maaritettiin seuraavalla tavalla. Solut pestiin kerran PBS:1la ja suspendoitiin pe-15 rusalustaan, johon oli lisatty 15 % ultrasuodosta, 5 mg/ml transferriinia ja vaihtelevia maaria natriumseleniittia tai B-merkaptoetanolia. Solujen kasvatus ja laskeminen suoritettiin esimerkeissa 4 ja 5 kuvatulla tavalla. Tulok-set on esitetty taulukossa 4.

20 Taulukko 4

Natriumseleniitilia ja B-merkaptoetanolilla supplemento idun ultrasuodoksen vaikutus solukasvuun B-MeOH Soluja/ml Na-seleniitti Soluja/ml 25 [μΜ] [nM] 0 69000 0 69000 0,5 61000 0,4 111000 1,0 159000 4,0 128000 30 5,0 147000 40 109000 10 130000 100 136000 20 90000 300 74000

II

91166 17

Kuvioissa 5 ja 6 esitetaan natriumseleniitin ja vastaavastl β-merkaptoetanolin tehostava vaikutus LPC1-hybridomasolujen kasvuun. Soluja kasvatettiin 10-prosent-tlsessa ultrasuodoksessa, johon oli lisatty 0,4 μΜ (o), 2 5 μΜ (Δ), 6 μΜ (α) ja 20 μΜ (^7) natriumseleniittia (kuvio 5) ja vastaavastl 5 μΜ (o), 15 μΜ (Δ), 50 μΜ (o) ja 100 μΜ (^) β-merkaptoetanolia (kuvio 6). (·) ja (ψ) edustavat LPCl-soluja, joita oli kasvatettu 10-prosenttisessa naudan sikiOseerumissa ja vastaavastl 10-prosenttisessa ultrasuo-10 doksessa lisaamatta em. aineita.

Tuloksista ilmenee, etta supplementtien teho ja kayttiJkonsentraatio-alueet vaihtelevat solutyypeittain. Esimerkiksi natriumseleniitilia on tehostava vaikutus jopa hyvin pienina pitoisuuksina (nanomoolitasolla), kun taas 15 β-merkaptoetanolilla vaikutusta saadaan vasta mikromooli-tasolla.

Claims (7)

1. Naudan ternimaitofraktio, joka soveltuu kaytet-tMvaksi soluviljelyalustojen taydennysaineena, t u n - 5. e t t u siita, etta sillå on alhainen kokonaisproteii-ni-, endotoksiini- ja immunoglobuliinipitoisuus ja se val-mistetaan ultrasuodattamalla rasvatontå ternimaitoa, josta kaseiini mahdollisesti on poistettu tavanomaisiin menetel-min, kayttaen membraania, jonka cut off on 100 000, ja 10 ottamalla suodos talteen.

2. Menetelma naudan ternimaitofraktion valmistami-seksi, jolla fraktiolla on alhainen kokonaisproteiini-, endotoksiini- ja ixnmunoglobuliinipitoisuus, t u η n e t -t u siita, ettS rasvatonta ternimaitoa, josta kaseiini 15 mahdollisesti on poistettu tavanomaisin menetelmin, ultra- suodatetaan kayttSen membraania, jonka cut off on 100 000, ja suodos otetaan talteen.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelma, tunnettu siitS, etta kaseiini on poistettu saos- 20 tamalla.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen naudan ternimaitofraktion kaytto soluviljelyalustojen taydennysaineena.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen naudan ternimaitofraktion kaytto, tunnettu siita, etta sen vai- 25 kutusta tehostetaan lisaåmallå muita tåydennysaineita.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen naudan ternimaitofraktion kaytto, tunnettu siita, etta ternimai-tofraktioon lisåtaan natriumseleniittia tai β-merkaptoeta-nolia.

7. Soluviljelyalusta, tunnettu siita, etta se sisaltaa patenttivaatimuksen 1 mukaista naudan terni-maitofraktiota. 91166