FI90566B - Mikrobiologinen menetelmä 4'-13(S)-dihydro-4'-jodidoksorubisiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

1 90566

Mikrobiologinen menetelmä 41 -13(S)-dihydro-4'-jodidokso-rubisiinin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee doksorubisiinijohdannaista , sen valmis-5 tusta ja sitä sisältäviä farmaseuttisia koostumuksia.

Näin ollen keksintö koskee 4'-deoksi-13(S)-dihydro-4 1 -jodi-doksorubisiinia, jonka kaava (II) on

j °k H^0H

Uf "OH

1 II f/C

OCH, o OH H 'o H3CTTH!—/ (Π) ja sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.

Streptomyces-sukuun kuuluvaa mikro-organismia käytetään kaa-10 van (I) mukaisen 4'-deoksi-4’-jodidoksorubisiinin funktionaalisen 13-ketoniryhmän pelkistykseen 2 90566 o oh o H I n

^ 3^·0H

1 V

!ν%Α^·χ/0H

i Ίι i /.

0CH3 0 °H / i, **T^ Λ * /*' '

4 f' NH2 I

jolloin saadaan spesifisesti 41-deoksi-13(S)-dihydro-4 1 --jodidoksorubisiini, toinen kahdesta mahdollisesta C-13--isomeerisesta 4'-deoksi-13-dihydro-4'-jodidoksorubisiinista. Uusi kaavan (II) mukainen yhdiste, jota tämän jälkeen merki-5 tään FCE 24883, on käyttökelpoinen kasvaimia estävänä aineena ja on osoittautunut kokeellisilla kasvaimilla aktiviteettia, joka on verrattavissa kaavan (I) mukaisen 41-deoksi-4 ' --jodidoksorubisiinin aktiivisuuteen. Mikrobisen stereoselek-tiivisen pelkistyksen substraatti on doksorubisiinin puoli-10 synteettinen analogi, joka on esitetty julkaisussamme US-A-4438105 (20. maaliskuuta 1984).

Aivan erityisesti tämä keksintö koskee biosynteettistä menetelmää, jolle on tunnusomaista, että Streptomyces peucetius-lajin mutantti, merkitty kanta M 87 F.I. ja tallennettu 1 ai-15 tokseen The Deutsche Sammlung von Microorganismen, jossa se on rekisteröity tai 1etusnumerol1 a DMS 2444, pystyy stereo-selektiivisesti pelkistämään 4'-deoksi-4'-jodidoksorubisii-nin (I) funktionaalisen 13-ketoryhmän. Yhdiste FCE 24883 (II), joka saadaan, saostuu käymisliemiin. FCE 24883 (II) voidaan 20 ottaa talteen käymisliemistä ja sen raa'at liuokset konsentroidaan ja puhdistetaan.

Keksintö koskee täten myös menetelmää kaavan (II) mukaisen 3 90566 4 1 -deoksi-13(S)-dihydro-4'-jodidoksorubisiinin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, jossa menetelmässä viljellään Streptomyces peucetius-kantaa M 87 F.I. (DMS 2444) 4 '-deoksi-4 '-jodidoksorubisiinin läs-5 näollessa ja muodostunut 4'-deoksi-13(S)-dihydro-4'-jodi- doksorubisiini otetaan talteen sellaisenaan tai farmaseuttisesti hyväksyttävänä suolana.

Keksinnön piiriin kuuluu uusi kasvaimia estävä kaavan (II) mukainen antrasykliini FCE 24883 puhtaassa muodossa sekä 10 hydrokloridina.

Keksintö koskee myös farmaseuttista koostumusta, joka sisältää kaavan (II) mukaisen yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan seoksessa farmaseuttisesti hyväksyttävän laimennusaineen tai kantoaineen kanssa.

15 Streptomyces peucetius subsp. aureus ATCC 31428 on mutantoi-tu käyttäen nitrosoguanidiin ia, jolloin on saatu labaratorio mikro-organismi, jota merkitään Streptomyces peucetius kanta M 87 F.I., joka selektiivisesti muuttaa kaavan (I) mukaisen yhdisteen kaavan (II) mukaiseksi yhdisteeksi. S. peucetius 20 kannalle M 87 F.I. on annettu tai 1etusnumero DSM 2444 laitoksella Deutsche Samlung von Mikroorganism, Länsi-Saksa, jossa se on tallennettuna pysyvään kokoelmaan.

Mutanttikannan M 87 F.I. morfologia ei eroa kantamikro-orga-nismin S. peucetius ATCC 31428:n morfologiasta, kun taas mo-25 lemmat viljelmät ovat selvästi erilaisia viljely- ja biokemiallisissa ominaisuuksissaan. Mutanttikanta M 87 F.I. ei tuota agarkasvualustal1 a väriltään oijenkeltäisestä sitruunankeltaiseen olevaa liukenevaa pigmenttiä, joka on tunnusomaista sen kantamikro-organismi11 e S. peucetius ATCC 30 31428:lie.

Lisäksi mutanttikanta M 87 F.I. voi selektiivisesti muuttaa kaavan (I) mukaisen yhdisteen kaavan (II) mukaiseksi yhdis- 4 90566 teeksi, kun taas kantaorganismi S. peucetius ATCC 31428 ei ole selektiivinen tässä suhteessa. Tämä mutantin M 87 F.I. ominaisuus tekee sen erittäin käyttökelpoiseksi kuten edellä on esitetty.

5 Tämän keksinnön mukainen stereoselektiivinen biotransfor-maatio voidaan suorittaa S. peucetius-kannan M 87 F.I. kasvuv i1jelmässä li säämällä inkubointijakson kuluessa viljelmään substraattina kaavan (I) mukaista yhdistettä.

Kaavan (I) mukainen yhdiste kuten hydrokloridikin voidaan 10 lisätä sen jälkeen kun se on liuotettu steriiliin, tislattuun veteen. Edullinen vaikka ei kuitenkaan rajoittava kaavan (I) mukaisen yhdisteen konsentraatio viljelmässä on noin 50-200 jjg/litra. Viljelmää kasvatetaan ravintoalustalla, joka sisältää hiili lähteen, esimerkiksi assimi1 oi -15 tuvan hiilihydraatin ja typpilähteen, esimerkiksi assimiloituvan typpiyhdisteen tai proteiinityyppisen aineen. Edullisia hi i1ilähteitä ovat glukoosi, sakkaroosi, glyseroli, tärkkelys, maissitärkkelys, dekstriini, melassi ja vastaavat. Edullisia typpi 1ähtei tä ovat maissiliuotusneste (corn steep 20 liquor), hiivauute, kuiva oluthiiva, soijapapu jauho, puuvilla ns i emenjauho, maissijauho, kaseiini, kalanliha, kiinteät tislausaineet (distiller's solids), eläinpeptoni, lihauute, ammoniumsuolat ja vastaavat. Näiden hiili- ja typpi 1ähteiden yhdistelmää voidaan käyttää edullisesti. Hivenaineita, esi-25 merkiksi sinkkiä, magnesiumia, mangaania, kobolttia, rautaa ja vastaavia ei välttämättä tarvitse lisätä käymisaiustaan ennen sterilointia, koska kasvualustan komponentteina käytetään vesijohtovettä ja puhdistamattomia aineosia.

Biotransformaatioprosessi voi kestää noin 72 tunnista 8 päi-30 vään. Inkubointi 1ämpöti1 a biotransformaatioprosessin kuluessa voi vaihdella noin 25°C:sta - noin 37°C:seen, lämpötilan 29°C ollessa edullinen. Transformaatioastioiden sisältö ilmastoidaan ravistelemalla noin 250 Merr./min Tai sekoitta- 5 9 O 5 6 6 maila steriloidulla ilmalla mikro-organismien kasvun nopeuttamiseksi ja tämä lisää transformaatioprosessin tehokkuutta.

Mikrobisen transformaatioreaktion etenemistä seurataan ottamalla näytteet käymisliemistä eri aikavälein ja uuttamalla 5 pH-arvossa 8,0 dikloorimetaani:metanoli-seoksella (9:1).

Kun orgaanisen uutteen näyte laitetaan ohutkerroskromato-grafialevylle (TLC) ja eluointi aineena käytetään kloroformin, metanolin, etikkahapon ja veden seosta (80:20:7:3, tilavuuksia), yhdisteen FCE 24883 (II) havaitaan löytyvän kes-10 kimäärin R^-arvosta 0,50 kun taas kaavan (I) mukainen 4'--deoksi-4 '-jodidoksorubisiini löytyy arvosta 0,60. Näiden kahden antrasykliinin kvantitatiivinen määritys voidaan suorittaa siten, että TLC:ssä käytetään edellä mainittuja eluointi systeemejä, jonka jälkeen vastaavat punaiseksi vär-15 jäytyneet vyöhykkeet kaavitaan ja eluoidaan metanolilla ja lopuksi suoritetaan spektrofotometrinen määritys aallonpituudella 496 nm.

Kaikki käymisliemet, joissa kaavan (I) mukainen yhdiste on saatettu alttiiksi muuttumiselle kaavan (II) mukaiseksi yh-20 disteeksi FCE 24883, suodatetaan käyttäen apuna pii maata.

Punainen myseelikakku uutetaan veteen sekoittuvalla orgaanisella liuottimena, kuten metanolilla tai muilla alemmilla alkoholeilla, di oksaani 11 a, asetoni trii1i11ä, asetonilla, mieluimmin käytetään asetonia. Myseeliuutteet kerätään, 25 konsentroidaan alennetussa paineessa ja yhdistetään suodatettuihin käymis 1iemiin, pH säädetään arvoon 8,0, jonka jälkeen uutetaan veteen sekoittumattomal1 a orgaanisella liuottimella, kuten n-butanolilla, kloroformilla, dikloori-metaanilla tai mieluimmin dikloorimetaanin ja metanolin 30 seoksella (9:1). Orgaaniset uutteet sisältävät yhdisteen FCE 24883 (II) yhdessä kaavan (I) mukaisen yhdisteen ja joidenkin pienempien hajoamistuotteiden kanssa.

6 90566

Orgaaninen uute konsentroidaan alennetussa paineessa kuiviin ja jäännös, liuotettuna dikloorimetaaniin, kromato-grafoidaan pH-arvoon 7 puskuroidussa piihappogeelipyivääs-sä käyttäen gradienttina dikloorimetaanin, metanolin ja 5 veden seosta. Ensin eluoituu kaavan (I) mukainen yhdiste seoksella 95:5:0,25, jonka jälkeen yhdiste FCE 24883 (II) seoksella 90:10:0,5. Yhdistetyistä fraktioista, sen jälkeen kun ne on pesty vedellä, konsentroitu pieneen tilavuuteen n-propanolin läsnäollessa, lisätty ekvivalenttien 10 määrä kloorivetyhappoa ja ylimäärin n-heksaania, saadaan puhtaan FCE 24883:n (II) sakka hydroklori dina.

Yhdiste FCE 24883 (II) vapaana emäksenä liukenee polaarisiin orgaanisiin liuottimiin ja vesipitoisiin aikoholei hi n, kun taas sen hydrokloridi liukenee veteen ja a 1 empiä 1koho-15 leihin mutta on huonosti liukeneva orgaanisiin liuottimiin. Yhdisteen FCE 24883 hydrokloridi11 a on seuraavat fysiko-kemialliset ominaisuudet: sulamispiste: 200°C (haj.) ominaiskierto:^]p3 +188° (c 0,05; CH^OH) \ H2° 20 UV- ja VIS-absorptiospektrit: A ^ 232, 254, 290 ja 480 nm (E1%cm = 492’ 370’ 127’ 163)· IR-spektri (KBr): piikit seuraavilla taajuuksilla: 3400, 2970, 2920, 1610, 1580, 1472, 1440, 1410, 1380, 1355, 1320, 1280, 1235, 1210, 1110, 1080, 1060, 1030, 1010, 985, 25 965, 940, 920, 900, 890, 870, 860, 830, 810, 785, 755, 730, 710, 540, 480, 450 ja 415 cm"1.

ΙΗ-NMR-spektri (DMSOdg, 200 MHz, 22°C): 14,03 (bs, 2H, OH-6, OH-11), 7,6-7,9 (m, 3H, H-1, H-2, H-3), 5,26 (m, 1H, H-Γ ) , 4,96 (d, J = 5,2 Hz, 1H, OH-13),4j92 (m, 1H, H-7), 4,55 (m, 1H, 30 H-4'), 4,51 (t, J =6,7 Hz, 1H, OH-14), 4,20 (s, 1H, OH-9), 7 90566 3,97 (s, 3H, 4-0CH3) , 3,76 (ddd, J=3,5, 6,7, 11,0 Hz, 1H, CH, (H)-OH), 3,60 (dq, J=1,0, 6,0 Hz, H-5'), 3,48 (ddd, J= 7,2, 6,7, 11,0 Hz, 1H, CH(H)-OH), 3,37 (ddd, J =5,2, 3,5, 7,2 Hz, 1 H , H- 1 3) , 3,02 (m, 1H, H-3 ' ), 2,81 (m, 2H, CH 2-10), 5 2,15 (dd, J = 2,0, 15,3 Hz, 1H, H-8e), 1,97 (dd, J-6,0, 15,3

Hz, 1H, H-8ax), 1,7-1,9 (m, 2H, CH2-2 ') ja 1,14 ^(d, J = 6,0 Hz, 3H, CH3-5 ')

Molekyyl1 kaava: C H NIO .HC1 27 30 10 10 m/z FD:ssä ekvivalentti vapaaseen emäkseen nähden: 656(MH+); 655(M+) ja 416(M+) vastaten aglykonia.

Selektiivisellä korkeapainenestekromatografi a(HPLC)-menetel -mällä voidaan erottaa (kaksi piikkiä, joilla retentioajat 15 18,8 min ja 19,3 min) kaksi C-13-stereoisomeerista alkoholia, jotka esiintyvät synteettisen 4'-deoksi-13-dihydro-4'-jodi-doksorubisiinin näytteessä, joka valmistetaan pelkistämällä kaavan (I) mukainen yhdiste NaBH^rllä.

Käyttäen samaa HPLC-menetelmää yhdisteellä FCE 24883 (II) 20 näyttää olevan vain yksi ainoa piikki, jonka retentioaika 19,3 minuuttia vastaa synteettisen 13-dihydrojohdannaisen hitaammin liikkuvaa aineosaa.

*HPLC-menetelmä kolonni: kaksi RP Spherisorb S30DS2:ta (C18, 3 y, Phase 25 Separation U.K.) 150x4,5 mm, yhdistettynä sarjaan,

lämpötila: 45°C

liikkuva faasi A: 0,05 M vesipitoinen ΚΗ3Ρ04, valmistettu pH-

arvoon 3,0 1 M H3P04/CH30H:11 a (80:20 , til.) liikkuva faasi B: CHjOH

30 eluointi: isokraattinen 30 minuuttia (42¾ A + 58% B) virtausnopeus: 0,6 ml/min havaitseminen: 254 nm.

8 9 O 566

Kaavan (II) mukaisen yhdisteen happohydrolyysi (0,2 N vesipitoinen HC1, 80°C, 30 min) tuottaa vastaavan kaavan (III) mukaisen aglykonin punaisen saostuman, jolloin sokeriosa, t.s. 3-amino-2,3,4,6-tetradeoksi-4-jodi-L-ksyloheksoheksoo-5 si (IV) on vesipitoisessa faasissa, on identifioitu vertailemalla luotettavaan näytteeseen, joka saadaan kaavan (I) mukaisen yhdisteen happohydrolyysin jälkeen.

FCE 24883 (II) happohydrolyysi (HC1)

/.8 T

|Λ/γγ 0H ^_o Ί I 11 P [-- t4 , HjC-7 0 / och3 s ; f \ r nv«c'

III: 1 3-(S)-di hydroadri amys i noni I_V

Kaavan (III) mukaisen yhdisteen absoluuttinen (S)-konfiguraatio C-13-asemassa on määritetty vertaamalla suoraan (1 H - NM R-10 ja massaspektrit, TLC) sen 9,13-0-isopropylideeni-14-0-tert.-butyylidifenyylisi1yylijohdannais ta 13-(S)-dihydroadriamysi-non in autenttisen näytteen vastaavaan johdannaiseen, joka saatiin kuten S. Penco et ai. ovat kuvanneet julkaisussa Gazzetta Chimica Italiana, 115, 195, 1985.

g 90566

Biologinen aktiivisuus

Yhdisteen FCE 24883 (II) sytotoksinen aktiivisuus testattiin in vitro HeLa- ja P 388-soluilla pesäkkeen muodostuksesta, verraten kaavan (I) mukaiseen yhdisteeseen ja dokso-5 rubisiiniin. Kuten taulukossa 1 on esitetty, kaavan (II) mukaisen yhdisteen tulokset ovat yhtä tehokkaita kuin 4'-deoksi--4'-jodidoksorubisiinin (I) ja doksorubisiinin tulokset.

Yhdisteen FCE 24883 (II) in vivo kasvaimia estävä aktiivisuus testattiin hajapesäkkeistä Gross-1eukemiaa vastaan.

£ 10 C3H-hiiret injektoitiin laskimonsisäisesti 2.10 solua/hiiri ja käsiteltiin yhdisteillä 24 tuntia tuumori-injektion jälkeen.

Taulukossa II on esitetty kahden kokeen tulokset. Optimi-annoksella yhdiste FCE 24883 (II) todettiin tehokkaammaksi 15 kuin doksorubisiini ja yhtä tehokkaaksi kuin 4'-deoksi-4 '--jodidoksorubisiini (I), myrkyllisyyden ollessa pienempi aktiiviannoksi11 a. Kaavan (II) mukaisen yhdisteen kasvaimia estävää aktiivisuutta, joka on arvioitu käsiteltyjen keskimääräisenä elinaikana kontrol1ihiiriin nähden, voidaan 20 verrata kaavan (I) mukaisen yhdisteen ja doksorubisiinin aktiivi suuteen.

10 90 566

(/) I

=> ' I I

= I +J

<Λ JO I «3 -.-3 1 S_ > S- I S- ·.— O l cu -— cn >

-4-) I

o I :,o <o “O I (/) I (/) O (O I ;(0 5— —. s_ +-> re I :¾ -.- ' I :(θ > re- -—- I £ LT) .— ( --— 3 C (Ti E I (J _3£ -Γ- *— 'x I 3 CO C7> I 00 I—

C I 00 r- LO

CO LlJ --- I CO " r. ςζ 00 O Old. 00CO00 (1) 00 Li_ ID I -Γ-3 «a- Q I 33 C\J « I—( I p— >—> I o UJ '—' I (/)

O I

Li_ C I C

•I— I φ ·* -T— I c mci .,- —. -r- I E c --- -r- I φ -r- </) I X3 C -C +-> C -r- I CO re- 0> T- 3 . JO I 03 « « ,— Φ ,— C3 i_i o o oo re .— o -r- S- 10) ,— 10 -r_ o c o :re (/) (Λ I (U S_ Q.

-r- -ii I c :o -Q ο -Γ- c >, 3D · · O (/) S- -r- feJä -r-

O D D

(Λ O O C -r-

,rO in -r- O

O I -r-

D - C E 0J

-I- *3- re :o +j

D I

0 -r- D 4-) 0-3 Ό (/) re .-(13 0) I—

<0 E O

- O (/) Φ C 10 re- <1> I— id 03 1 D ^—- (O QJ I— I—

O I <D ,—. I—I ,— +J3E

i- - -4-/ h—. t—i ,— +->,003 D -=3- p— (/) s— -— o ’I— >) X -r- -r-j (/) 3 *— -C (0 CO D re- CO :ro C 0) -.— c — n in oo * cu p— O D 3 >- 03 CO (/)(/)1 ^ I -)-) C -— -¾- O 10 -r- 00 ^ )---1 +->-r- C\J CM C C E 00

rot/). (13-.- C 3 _C CO

—I I--1 S-C UIUJ <C 4-J i—i CL

D I S- ·Γ- X (_> <_) •iCOOJ-r- Ω |_l_ Ll. .— I— *— > co re _o υ Π 90566 υ -ί α; rö Ρ pc c ro co cu 3 ^ E *r— c * 4-> X (U TD 'i- p Q i— sz ko CÖ '—· O >> S-

5- 13 OOOOOOOOO TO

S-C -X CNJ CVJ C\J CVJ C\J CVJ *— CVJ CVJ CTi C TO

CU 'f— CO \ N. \ \ \ \ \ \ \ ·γ- E

> -Γ- >5 O O C\l <3 «O- CTl OOOLf) -r- -r-

c -*-> <«— p -X

CO ·!- >> i— CO TO

3 ·ι- -X (U <U ·— 3 CO S- p -X i— CO *r- >> i— t— -I- -Q ΣΖ CO C S- >3 TO CU -r- •i- S- -r- *r-

•r- O r— XZ

P to ro i— -X -o O ro rO O i- i— "O ro +-> r-

COfO OOOOOO OOO .— O CU

0O ··“> O CM CO CO 3 -X 1“ OO ^ CVJ CVJ CVJ CVJ CVJ *— CVJ CVJ r— \ i— ^ ^ -Ω '—s· o ro o N «*,***#, * * co -X 3 LO OOOOOOOOO ro -r-

O CD O O CO LO LO LO 00 CNJ CNJ «r- rO

Lu *— \ CVJ CVJ Cvi CM CV] *— CM CM E C rO

* _X C »— <—

*-HLU OLOOOOLOOOOO 3 <U CU (U

»—♦<-) ocvjlo co c\j cvj <u a» cu

*— Li_ C CM CVJ CVJ CVJ C\J *— *— CVJ CVJ ^— r— -x c P

<o ·— CU to C ·» <0 LO TO C 3 •r- ·—· P O ,r3 *r~ i*

C —" CO *— TO <U

*r- rO X C i- Q-

•r- C > CVJ O TO

tO ·*- ^ ·ι- TO C

•r- *r- ro ro · P E CU

_Q C ro - > -X ·Γ- *1-3 3 ·ρ- ·ι— co en · cu -X :o

J.-I-E O -X O CvJ CO CVIOOCO ·(- -ro to P

O to CU C S, * #.#. #< * * ecu >> CO ·ι- -X CO OCOtO^lOVO^J-LDLOOO C ··“ -X :θ -X JD 3 < E <«- ·«- ι ίο 3 CU ^ *»-·«- e to “O S- I— P S- CU 3 *r~ Oi ·γ- O *r— ro “O co co O E i- > 0 -X to P 3 *r- ro ♦«-JOO _X 3 *r- · e 1 Ό i- a> -p .e o ·*- - *1—0 *1—3 o *«—

^3· T3 C TO C *- E

I O TO ^ *1- > QJ 3 O *»“D P <--** *—« *r- *r“3 χ 3 I CO v—t v—1 P TO >*> V.

“O - -I- ^ ^ (UQ.P^ >) «O- CU i- 1— ro 3

CM r I CU *3- PO -r- · CU -V P

•I- f -X P in (X) T- > P ·#- -r- “ O “O co to to eri 00 _c · ·ι— ro o ^ I -X to ··— I *r- to C *r— ^ 1---1 O CU “O CVJ CVJ ZE TO -I- > ID CO <U Q- -C ro TO ^ f—

-J - Ό fO >- LU LU O»— ^ CU C

H> I I ·*“3 X O O

C ΓΟ - ro O Ll Lu

I— ««— _e ro -O O

12 9 0 566

Seuraavat esimerkit on annettu tämän keksinnön menetelmän ja tuotteen kuvaamiseksi yksityiskohtaisemmin.

ESIMERKKI 1 5 Streptomyces peucetius-kannan M 87 F.I. (DMS 2444) viljelmää on kasvatettu 28°C:ssa agarvinopinnoi11 a, joilla seu-raava elatusalusta (kasvualusta SA): glukoosi 3 %, kuiva panimohiiva 1,2 %, NaCl 0,1 %, ΚΗ,,ΡΟ^ 0,05 %, CaCO^ 0,1 %, MgS04 0,005 %, FeS04.7H20 0,0005 %, ZnS04.7H20 0,0005 %, 10 CuS04.5H20 0,0005 %, agar 2 %, vesijohtovettä 100 ml:aan, pH 6,7; sterilointi suoritetaan kuumentamalla autoklaavissa 115°C:ssa 20 minuuttia.

Näin kasvatetun viljelmän itiöt kerätään ja suspendoidaan 3 ml:aan steriiliä tislattua vettä, tällä suspensiolla ym-15 pätään 300 ml:n erienmeyerpullot, jotka sisältävät 60 ml seuraavaa nestemäistä kasvualustaa: kuiva panimohiiva 0,3 %, peptoni 0,5 %, Ca(NO^)2-4H20 0,05 %, vesijohtovettä 100 mlraan. Steriloidaan kuumentamalla autoklaavissa 120°C:ssa 20 minuuttia. Tämän kasvualustan pH steriloinnin jälkeen 20 on 6,8-7,0. Ympättyjä pulloja ravistellaan 2 päivää 28°C:n lämpötilassa 250 kierr./min pyörivässä ravistelijassa, jonka kiertoympyrän halkaisija 7 cm. 1,5 ml viljelmää, joka on kasvatettu edellä kuvatulla tavalla, ympätään 300 ml:n er-lenmeyerpulloihin, jotka sisältävät 50 ml seuraavaa bio-25 transformaatiokasvua1ustaa: hiivauute 1,5 %, KH2P04 0,25 %, glukoosi 1,5 %, vesijohtovettä 100 mlraan, pH 6,9; sterilointi kuumentamalla autoklaavissa 115°C:ssa 20 minuuttia.

G1ukoosi1iuos steriloidaan erikseen ja lisätään jokaiseen steriloituun pulloon oikeassa konsentraatiossa.

30 Sen jälkeen pulloja inkuboidaan 24 tuntia 28°C:ssa olosuhteissa, jotka edellä kuvattiin ymppi1iuoksel1 e . Tänä aikana 1,0 ml kaavan (I) mukaisen yhdisteen liuosta steriilissä 13 90566 tislatussa vedessä konsentraatiossa 5 mg/ml lisätään jokaiseen pulloon. Ravisteltavia pulloja inkuboidaan edel- a leen 2 päivää, jolloin kaavan (I) mukainen yhdiste saadaan yli 70 %:isesti muuttumaan kaavan (II) mukaiseksi yhdis-5 teeksi.

ESIMERKKI 2 S.pecetius-kannan M 87 F.I. viljelmää kasvatetaan kiinteällä kasvualustalla, kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Kolmen vinopinnan itiöt yhdistetään ja kerätään 10 ml:aan sterii-10 liä tislattua vettä, näin saadulla suspensiolla ympätään 2 litran pyöreäpohjainen kolvi, joka sisältää 500 ml esimerkissä 1 kuvattua ymppi1iuosta. Pulloa inkuboidaan 28° C:n lämpötilassa 48 tuntia 120 kierr./min pyörivässä sekoi t-timessa, jonka kiertoympyrän halkaisija on 7 cm. Koko ymp-15 piliuos siirretään 10 litran ruostumatonta terästä olevaan fermenttoriin, joka sisältää 7,5 litraa esimerkissä 1 kuvattua biotransformaatiokasvualustaa, ja steriloidaan höyryllä 120°C:ssa 30 minuuttia, glukoosi1iuos steriloidaan erikseen ja lisätään sopivassa konsentraatiossa steriloi-20 tuun fermenttoriin. Viljelmän annetaan kasvaa 28°C:ssa sekoittaen 230 kierr./min ja ilmastaen ilmavirralla, joka on 0,7 1/kasvualustan 1/min.

48 tunnin kuluttua lisätään substraatti esimerkissä 1 esitetyssä konsentraatiossa ja viljelmää inkuboidaan edelleen 25 3 päivää, jolloin saadaan kaavan (I) mukainen yhdiste 60 %:isesti muutettua kaavan (II) mukaiseksi yhdisteeksi.

ESIMERKKI 3

Esimerkin 2 mukaisesti saadusta fermentaatiosta koko liemi (5 1) suodatettiin, suodatusapuaineena käytettiin 2 % pii-30 maata. Märkä suodatuskakku uutettiin asetonilla (3 1). Suodatuksen jälkeen uutettiin vielä kaksi kertaa asetonilla, 14 90566 jotta varmistuttiin punaisen pigmentin täydellisestä talteenotosta. Yhdisteyt asetoniuutteet konsentroitiin alennetussa paineessa ja konsentraatti (1 1) yhdistettiin suodatettuun liemeen ja uutettiin tyhjiin pH-arvossa 8 dikloori-5 metaanin ja metanolin 9:1-seoksel1 a. Orgaaninen uute, joka sisälsi kaavojen (I) ja (II) mukaiset yhdisteet muutamien hajoamistuotteiden kanssa, konsentroitiin alennetussa paineessa kuiviin. Jäännös, liuotettuna dikloorimetaaniin, kro-matografoitiin piihappogeelipylväässä, joka oli puskuroitu 10 pH-arvoon 7 (M/15 fosfaattipuskuri), eluointiin käytettiin gradienttia, jonka muodosti dikloorimetaanin, metanolin ja veden seos. Eräiden hajoamistuotteiden jälkeen kaavan (I) mukainen yhdiste eluoitui seoksella 95:5:0,25, jonka jälkeen yhdiste FCE 24883 (II) seoksella 90:10:0,5. Yhdistetyistä 15 fraktioista, sen jälkeen kun ne oli pesty vedellä, ko nsen-toitu pieneen tilavuuteen n-propanolin läsnäollessa, lisätty ekviva1enttinen määrä kloorivetyhappoa ja ylimäärin n-heksaania, saatiin puhdas FCE 24883 (II, 0,30 g, 60%) hyd-rokloridina (sul.p. 200°C, haj.). Noudattaen samaa menetel-20 mää otettiin talteen myös muuttumaton kaavan (I) mukainen yhdiste (0,13 g, 26 %) hydrokloridina.

ESIMERKKI 4 Näyte yhdisteestä FCE 24883 (II) liuotettiin 0,2 N vesipitoiseen kloorivetyhappoon (50 ml) ja kuumennettiin 30 min 25 100°C:ssa. Aglykonin (III) kiteinen punainen sakka (0,12 g) kerättiin suodattamalla, pestiin vedellä ja kuivattiin. Massaspektri: m/e 416 (M+). Aglykoni (111) identifioitiin 13-(S)-dihydroadriamysinonia vertaamalla autenttiseen näytteeseen.

Claims (4)

1. Mikrobiologinen menetelmä kaavan (II) mukaisen 4'-13(S)-dihydro-41 -jodidoksorubisiinin valmistamiseksi

5. OH Πμ OCHj o1 OH /\ J H3cy-0 / (n) fNH2 . HC1

15 I tunnettu siitä, että viljellään aerobisissa olosuhteissa vesipitoisessa viljelyalustassa, joka sisältää assimiloituvan hiililähteen, assimiloituvan typpilähteen 20 ja mineraalisuoloja, Streptomyces peucetius -kantaa M 87 F.I. (DSM 2444), hydrokloridinsa muodossa olevan, kaavan (I) mukaisen 4'-deoksi-4·-jodidoksorubisiinin läsnäollessa .25 0 OH 0 'Oh OCH. o OH

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että menetelmä suoritetaan lämpötilassa, joka 5 on 25°C:sta 37°C:seen (mieluimmin 29°C) reaktioajan ollessa 72 tunnista 8 päivään.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksessa 1 esitetyn 10 kaavan (II) mukainen antrasykliiniglykosidi uutetaan my-seelikakusta asetonilla ja suodatetuista käymisliemistä dikloorimetaanin ja metanolin seoksella (9:1, til./til.) PH -arvossa 8 ja yhdistetyt uutteet konsentroidaan kuiviin alennetussa paineessa. 15

3 H 0 :ö ” m2 . hci (i) 35 ja muodostunut kaavan (II) mukainen 4'-deoksi-13(S)-dihydro-4 1-jodidoksorubisiini otetaan talteen hydroklori- 16 90566 dina.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että raakatuote, joka saadaan patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä, liuotetaan dikloorime-taaniin ja tuotteelle suoritetaan kromatografinen puhdis- 20 tus piihappogeelipylväässä, joka on puskuroitu pH-arvoon 7, eluointisysteeminä käytetään ensin dikloorimetaanin, metanolin ja veden seosta (95:5:0,25, til./til./til.) kaavan (I) mukaisen reagoimattoman lähtöaineen poistamiseksi, jonka jälkeen eluoidaan dikloorimetaanin, metano-25 Iin ja veden seoksella (90:10:0,5, til./til./til.), elu-oidut fraktiot konsentroidaan pieneen tilavuuteen n-pro-panolin läsnäollessa ja haluttu 4'-deoksi-13(S)-dihydro-41 -jodidoksorubisiini (II) otetaan talteen hydrokloridina puhtaassa muodossa lisäämällä ekvivalenttinen määrä kloo-30 rivetyhappoa ja ylimäärin n-heksaania. 17 90566