FI81120B - Foerfarande foer bestaemning av glukos ur biologiska vaetska samt reagensblandning foer tillaempning av foerfarandet. - Google Patents

Description

811 20

MENETELMÄ GLUKOOSIN MÄÄRITTÄMISEKSI BIOLOGISESTA NESTEESTÄ SEKÄ MENETELMÄN SOVELTAMISEEN TARKOITETTU REAGENSSI SEOS

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä glukoosin määrittämiseksi biologisesta nesteestä, jossa menetelmässä glukoosipi-toiseen nestenäytteeseen lisätään reagensseja, jotka aikaansaavat enstymaattisia reaktioita, ja jossa menetelmässä nesteen absorbanssia mitataan niin, että glukoosin määrä on laskettavissa havaitusta absorbanssin muutoksesta, ja jossa menetelmässä suoritetaan kaksivaiheinen entsymaattinen reaktio, jonka ensimmäisessä vaiheessa glukoosi muutetaan ATP:n (ade-nosiini-5-trifosfaatin) ja heksokinaasin avulla glukoosi-6-fosfaatiksi ja toisessa vaiheessa glukoosi-6-fosfaatti muutetaan NAD:n (nikotiiniamidi-adeniinidinuk1eotidin ) ja glukoo-si-6-fosfaa11idehydrogenaasin avulla 6-fosfoglukonaatiksi .

Keksinnön tarkoittamia biologisia nesteitä ovat veri ja sen komponentit, kuten veriplasma ja veriseerumi, sekä muut elimistön nesteet, kuten esim. virtsa ja selkäydinneste.

Glukoosin entsymaattisten reaktioiden seuranta perustuu siihen, että reaktiossa syntyy valoa tietyllä aallonpituudella absorboiva yhdiste, jonka vaikutuksesta täten reaktioseoksen absorbanssi ko. aallonpituudella kasvaa. Reaktion alku- ja loppupisteissä mitattujen absorbanssien erotuksesta on voitu laskea nestenäytteen glukoosipitoisuus.

Lisäksi tunnettua tekniikkaa edustava EP-patenttihakemus 120 220, jossa on esitetty menetelmä veren glukoosipitoisuuden määrittelemiseksi. Keksinnön mukainen menetelmä eroaa tunnetusta tekniikasta ennen kaikkea siinä, että menetelmän kaksivaiheisessa entsymaattisessa reaktiossa, sen ensimmäisessä vaiheessa kuluu ainoastaan pieni osa käytetystä ATP:sta ja jäljelle jäänyt, pitoisuudeltaan lähes alkuperäinen, ATP hidastaa reaktion toista vaihetta niin, että glukoosin määrittäminen saadaan kineettisesti mitattua noin minuutissa. Keksinnön mukaisen menetelmän etuina on ennen kaikkea sen no- 2 81120 peus sekä, sen lineaarisuus, joka sallii glukoosipitoisuudel-le vaihtelun alueella 1-40 mmol/1.

Keksinnön mukaiselle kineettiselle glukoosimääritykselle on tunnusomaista se, että ATP:n alkukonsentraatio on niin suuri, että vain pieni osa ATP:sta kuluu 1. vaiheessa ja jäljelle jäänyt, pitoisuudeltaan lähes alkuperäinen, ATP hidastaa 2. vaihetta ja että reaktiota seurataan kineettisesti mittaamalla sen toisessa vaiheessa syntyvän NADH:n aikaansaama absorptio kahdesti noin minuutin kuluessa ensimmäisen reaktiovai-heen alkamisesta.

Keksinnön mukaisen menetelmän perustana olevat reaktiovaiheet ovat seuraavat:

Glukoosi + ATP heksokinaasi^ Giukoosi_6_fosfaatti + ADP

NAD + Glukoosi-6-fosfaatti dehy5rogInäasifaat^1'^6~fOSf0glukonaatti + NADH

Reaktioyhtälöistä nähdään, että syntyvän NADH:n määrä on suoraan verrannollinen tutkittavan näytteen glukoosipitoisuu-teen. NADH absorboi aallonpituudella 340 nm, ja mitatusta ab-sorbanssin lisääntymisestä voidaan glukoosipitoisuus laskea.

Keksinnön mukaisen menetelmän eräänä etuna on se, että se on huomattavasti nopeampi kuin aikaisempi loppupistemittaukseen perustuva menetelmä. Keksinnön mukaan meneteltäessä määritys-tulos saadaan noin minuutin kuluessa reaktion alkamisesta, kun taas tunnetussa menetelmässä tulosta joudutaan odottamaan ainakin 5 minuuttia. Keksintöä kokeiltaessa absorptiomittauk-set on suoritettu onnistuneesti aikavälillä 35-50 sek reaktion käynnistymisestä, ja käytännössä saattaa olla mahdollista päästä vieläkin nopeampaan määritykseen.

Menetelmän nopeudesta seuraa se, että etenkin automaattianalysaattoreita käytettäessä ehditään samassa ajassa käsitellä huomattavasti entistä suurempia näytemääriä. Kuitenkaan keksintö ei ole kriittinen käytettävien laitteiden 3 81120 suhteen, sillä mittaukset voidaan suorittaa millä tahansa 340 nm:n aallonpituutta mittaavalla laitteella, jonka tarkkuus on riittävä pienten absorbanssierojen luotettavaan toteamiseen.

Keksinnön etuna on edelleen se, että menetelmä on lineaarinen g 1ukoosipitoisuuksi1la 1-40 mmol/1, eli laajemmalla alueella kuin aikaisempi 1oppupistemittaukseen perustuva menetelmä. Tämä vähentää tarvetta laimentaa korkeampia g1ukoosipitoisuuksia sisältäviä näytteitä määritystä varten.

Keksintöä kokeiltaessa on myös todettu, että keksinnön mukainen menetelmä on tunnetuista menetelmistä poiketen erittäin sopiva kokoverihemolysaatin sisältämän glukoosin määritykseen. Hemolysaatti aikaansaadaan sekoittamalla verinäyte sellaisenaan hemolysointi1iuokseen. Tällä menetelmällä määritys voi tapahtua niin nopeasti, että tulos on selvillä miltei välittömästi näytteen ottamisen jälkeen.

Keksinnön kohteena on myös edellä esitettyyn glukoosimääri-tykseen soveltuva reagenssiseos. Seokselle on tunnusomaista se, että sen muodostaa ATP:n, NAD:n, heksokinaasin ja glukoo-si-6-fosfaattidehydrogenaasin sisältävä puskuroitu, tutkittavaan glukoosipitoiseen näytteeseen kerralla yhdistettävä vesiliuos.

Keksinnön mukainen reagenssiseos sisältää sopivasti kaikki glukoosimääritykseen tarvittavat kemialliset aineosat, ja eri reagenssien pitoisuudet seoksessa on säädetty niin, että keksinnön edellyttämä nopea kineettinen mittaus on mahdollinen. Tätä silmälläpitäen on erityisesti ATP:n pitoisuuden oltava riittävän korkea, sillä tämä hidastaa glukoosi-6-fosfaattide-hydrogenaasin katalysoimaa toista reaktiovaihetta niin, että kineettinen mittaus noin minuutin kuluessa reaktion alkamisesta tulee mahdolliseksi.

Eräs sopiva keksinnön mukaisen reagenssiseoksen koostumus on sellainen, jossa ATP:n pitoisuus on noin 17 mmol/1, NAD:n pitoisuus on noin 5 mmol/1, heksokinaasin aktiivisuus on noin 4 81120 2500 U/l ja glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasin aktiivisuus on noin 2500 U/l. Mainittujen komponenttien lisäksi seos sisältää sopivasta tris-puskuria 0,25 mmol/1, jolloin seoksen pH-arvo on 7,5, sekä magnesiumsuolaa 5,25 mmol/1.

Keksinnön mukaista reagenssiseosta käytettäessä on sopiva glukoosipitoi sen nestenäytteen ja reagenssiseoksen sekoitussuhde 1/51. Tällaisella sekoitussuhteella ovat entsyymien aktiivisuudet näytteen sisältävässä reaktioseoksessa suurin piirtein samat kuin reagenssiseoksessa, so. sopivasti noin 2500 U/l. Suoritettaessa glukoosimääritys kokoverihemolysaa-tista on sopiva näytteen ja reagenssiseoksen sekoitussuhde kuitenkin 1/15. Tällöin entsyymien aktiivisuudet jäävät reaktioseoksessa nestemäärän lisääntymisen johdosta hieman rea-genssiseoksen arvoja alhaisemmiksi ja voivat olla esim. noin 2340 U/l.

Keksinnön mukaisen menetelmän lineaarista mittausaluetta ja täsmäävyyttä testattiin laimentamalla tunnetun korkean glu-koosipitoisuuden sisältävää seerumia toisella seerumilla, jossa oli tunnettu matala glukoosipitoisuus. Laimennussarjan kuhunkin näytteeseen lisättiin reagenssiseosta, jonka pH oli 7,5 ja jonka kokoomus oli seuraava: tris-puskuri 0,25 mmol/1, magnesiumsuo1 a 5,25 mmol/1, NAD 5,0 mmol/1, ATP 17,0 mmol/1, heksokinaasi 2500 U/l ja glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi 2500 U/l. Näytteen ja reagenssiseoksen sekoitussuhde oli kussakin tapauksessa 1/51. Laimennossarja mitattiin lämpötilassa 37°C Kone Dynamic-laitteella mittaamalla kustakin näytteestä saadun reaktioseoksen absorbanssin muutos aallonpituudella 340 nm aikavälillä 35-50 sek reaktion alkamisesta. Absorbans-simuutoksen perusteella keksinnön mukaisesti saatuja glukoo-sipitoisuuden arvoja on oheisessa kuviossa 1 verrattu laskettuihin glukoosipitoisuuksiin. Kuvion käyrä osoittaa, että keksinnön mukaisen menetelmän lineaarinen mittausalue kattaa glukoosipitoisuudet 1-40 mmol/1, joilla mittaustulokset täs- 5 81120 määvät erittäin hyvin laskettujen glukoosipitoisuuksien kans- s a .

Edelleen testattiin keksinnön mukaisen menetelmän luotettavuutta kokoverihemolysaatista tehtävässä glukoosimääritykses-sä vertaamalla sen antamia tuloksia tunnetulla glukoosidehyd-rogenaasimenetelmällä saataviin tuloksiin. Neljäkymmentä ko-koverihemolysaattinäytettä valmistettiin pipetoimalla 50 ui kokoverta 1 ml:aan Merck Oy:n hemolysointi1iuosta. Näytteiden glukoosipitoisuudet mitattiin ensin glukoosidehydrogenaasimenetelmällä käyttäen Eppendorf EPOS-laitetta ja sen jälkeen Kone Oy:n 1äpivirtausproto1aittee 1la keksinnön mukaisella menetelmällä, jossa reaktio-olosuhteet olivat samat kuin edellä lineaarisen mittausalueen testauksessa, paitsi että näytteen ja reagenssiseoksen sekoitussuhde oli 1/15. Eri menetelmillä saatujen tulosten korre 1 aatiokuvaaja on esitetty oheisessa kuviossa 2. Korre 1 aatiosuora on y = 0,851x + 0,341;r = 0,993. Tuloksista voidaan nähdä, että keksinnön mukaisen menetelmän antamat glukoosipitoisuudet täsmäävät varsin hyvin glukoosi-dehydrogenaasimenetelmällä saatavien tulosten kanssa.

Alan ammattimiehelle on selvää, että keksinnön erilaiset so-vellutusmuodot eivät rajoitu edellä esimerkkeinä esitettyyn vaan voivat vaihdella oheisten patenttivaatimusten puitteissa .

Claims (10)

1. Menetelmä glukoosin määrittämiseksi biologisesta nesteestä, jossa menetelmässä glukoosipitoiseen nestenäytteeseen lisätään reagensseja, jotka aikaansaavat entsymaattisia reaktioita, ja jossa menetelmässä nesteen absorbanssia mitataan niin, että glukoosin määrä on laskettavissa havaitusta absor-banssin muutoksesta, ja jossa menetelmässä suoritetaan kaksivaiheinen entsymaattinen reaktio, jonka ensimmäisessä vaiheessa glukoosi muutetaan ATP:n (adenosiini-5-tri fosfaatin) ja heksokinaasin avulla glukoosi-6-fosfaatiksi ja toisessa vaiheessa glukoosi-6-fosfaatti muutetaan NAD:n (nikotiiniami-di-adeniinidinukleotidin ) ja glukoosi-6-fosfaattidehydroge-naasin avulla 6-fosfoglukonaatiksi , tunnettu siitä, että ATP:n alkukonsentraatio on niin suuri, että vain pieni osa ATP:sta kuluu 1. vaiheessa ja jäljelle jäänyt, pitoisuudeltaan lähes alkuperäinen, ATP hidastaa 2. vaihetta ja että reaktiota seurataan kineettisesti mittaamalla sen toisessa vaiheessa syntyvän NADH:n aikaansaama absorptio kahdesti noin minuutin kuluessa ensimmäisen reaktiovaiheen alkamisesta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että absorptiomittaukset suoritetaan aikavälillä 35-50 sek ensimmäisen reaktiovaiheen alkamisesta.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukoosi määritetään verestä tai sen komponentista.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukoosi määritetään kokoverihemolysaatista.

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heksokinaasin aktiivisuus reak-tioseoksessa on ainakin noin 2340 U/l. 7 81120

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaa-sin aktiivisuus reaktioseoksessa on ainakin noin 2340 U/l.

6 81120

7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ATP:n konsentraatio reaktioseoksessa on välillä 15-20 mmol/1 ja sopivimmin noin 17 mmol/1.

8. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ATP, NAD, heksokinaasi ja glukoo-si-6-fosfaattidehydrogenaasi sisällytetään reagenssiseokseen, joka yhdistetään kerralla tutkittavaan glukoosipitoiseen näytteeseen.

9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukaisen menetelmän soveltamiseen tarkoitettu reagenssiseos, tunnettu siitä, että sen muodostaa ATP:n, jonka pitoisuus on vähintään 15 mmol/1, NAD:n, heksokinaasin ja glukoosi-6-fosfaattidehyd-rogenaasin sisältävä puskuroitu, tutkittavaan glukoosipitoiseen näytteeseen kerralla yhdistettävä vesiliuos.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen reagenssiseos, tunnettu siitä, että ATP:n pitoisuus on noin 17 mmol/1, että NAD:n pitoisuus on noin 5 mmol/1, että heksokinaasin aktiivisuus on noin 2500 U/L ja että glukoosi-6-fos faa11idehydroge-naasin aktiivisuus on noin 2500 U/l. β 81120