FI81118C - Foerfarande foer framstaellning av vaesentligen rent interleukin-2 protein. - Google Patents

Description

1 81118

Menetelmä olennaisesti puhtaan interleukiini-2 proteiinin valmistamiseksi Förfarande för framställning av väsentligen rent interleukin-2 protein Tämä keksintö liittyy ihmisen interleukiini-2 proteiinin tuotantomenetelmään geeninsiirtotekniikan avulla.

Interleukiini-2 (jota kutsutaan myös T-solukasvutekijäksi (TCGF); lyhennetään tämän jälkeen IL-2) on T-solujen lektiini-tai alloantigeenistimulaation jälkeen tuottama lymfokiini (Science, 193, 1007 (1976); Immunological Reviews, 51, 257 (1980)). IL-2 tekee mahdolliseksi T-solujen pitkäaikaisen kasvatuksen sallimalla niiden kasvaa in vitro samalla pitäen yllä niiden toimintoja. IL-2: den on lisäksi ilmoitettu edistävän kateenkorvan solujen mitogeenireaktiota (kostimulaattori), säilyttävän pernasolujen vasta-ainetuoton T-soluista riippuvaisia antigeenejä vastaan nude-hiirillä (nude mouse, kateen-korvaton hiiri) (T-solujen korvaava tekijä) tai edistävän tappajasolujen (killer cells) erilaistumista ja lisääntymistä (killer helper-tekijä) (The Journal of Immunology, 123, 2928 ( 1979); Immunological Reviews, 5_1, 257 ( 1980)).

IL-2: ta hyväksi käyttäen on tähän mennessä saatu useita tap-paja-T-soluklooneja, T-auttajasoluklooneja (helper T cell clones) ja lisäksi luonnollisia tappajasoluklooneja (esim. Nature, 268, 154 (1977); The Journal of Immunology, 130, 981 (1983)). Tällaisen suoran käytön lisäksi T-solun tai luonnollisen tappajasolun kloonauksessa voidaan IL-2:ta käyttää sellaisten tappajasolujen, jotka ovat spesifisiä tietyille antigeeneille, esim. tuumoriantigeenin tunnistavien ja kasvaimen tuhoavien tappaja-T-solujen selektiiviseen kasvattamiseen in vitro. Injektoimalla tällä tavoin kasvatettuja tuumorispesifi-siä tappaja-T-soluja eläimeen on mahdollista estää ja ehkäistä kasvaimen kasvu (The Journal of Immunology, 125, 1904 (1980)). Tiedetään myös, että IL-2 indusoi IFN^: n tuotantoa (The Journal of Immunology, 130, 1784 (1983)) ja että IL-2 aktivoi luonnollisia tappajasoluja (The Journal of Immunology, 130, 2 81118 1970 (1983)).

Yllämainitut kokemusperäiset seikat tuovat mieleen ajatuksen, jonka mukaan IL-2 voisi mahdollisesti olla käyttökelpoinen antituumorisena aineena. IL-2:den tiedetään säilyttävän aut-taja-T-solutoiminnon nudehiirissä, joilta puuttuu kateenkorvan toiminta (European Journal of Immunology, 10, 719 (1980)) tai säilyttävän tappaja-T-solujen induktion homologisia soluja vastaan (Nature, 284, (1980)), ja siksi IL-2: den voidaan odot taa olevan käyttökelpoinen hoidettaessa sairauksia, joiden epäillään olevan immunologisperäisiä.

Kuitenkin laajan mittakaavan IL-2: den tuotanto on tähän saakka ollut vaikeaa, niin että sen kliiniset sovellutukset ovat olleet toistaiseksi mahdottomia. Tämän johdosta on odotettu tekniikkaa, joka tekee mahdolliseksi tuottaa suuria määriä hyvin puhdistettua IL-2:ta helposti ja yksinkertaisella tavalla alhaisin kustannuksin.

Taniguchi ym., jotka kloonasivat ihmisen IL-2-geenin käyttämällä lähtömateriaalina ihmisen leukeemisesta T-solulinjasta Jurkatista eristettyä IL-2 mRNA: ta, ilmoittivat siitä johdetun ihmisen IL-2-proteiinin aminohappojärjestyksen ja että geeni ilmentyi COS-7 soluissa (Nature, 302, 305 (1983)). Myöhemmin

Devos ym. ilmoittivat, että ihmisen pernan soluista peräisin oleva IL-2-geeni oli kloonattu ja että se ilmentyi Escherichia colissa (Nucleic Acids Research, ^Λ, 4307 (1983)). Kuitenkin tähän asti IL-2: den kaltaisen aineen olemassaolo on arvioitu ainoastaan todetun TCGF-aktiivisuuden perusteella. Raporttia, joka ilmoittaisi että transformantin, jossa on ihmisen IL-2:ta koodaava DNA, tuottamaa ihmisen IL-2-proteiinia olisi todella eristetty puhdistetussa muodossa ei ole.

Tämän keksinnön keksijät johtivat intensiivisiä tutkimuksia joiden päämääränä oli kehittää tekniikka, jonka avulla haluttu IL-2-proteiini voidaan 6aada kloonaamalla ihmisen IL-2-geeni käyttämällä hyväksi geeninsiirtotekniikkaa, siirtämällä aikaansaatu yhdistelmä-DNA-molekyyli isäntään ja ilmentämällä 3 81118 ihmisen IL-2-geeni mainitussa isännässä, ja tuloksena voidaan esittää menetelmä olennaisesti puhtaan, glykosyloimattoman IL-2-proteiinin tuottamiseksi.

Keksintö määritellään oheisissa patenttivaatimuksissa ja se antaa käyttöön menetelmän olennaisesti puhtaan glykosyloimattoman ihmisen IL-2-proteiinin tuottamiseksi, jonka proteiinin spesifinen aktiivisuus on vähintään 10* U/mg, jonka puhtaus on vähintään 99 % ja joka on olennaisesti endotoksiinia ja pyro- geenia sisältämätön. Menetelmässä kasvatetaan Escherichia colin trans formanttia, jossa on ihmisen IL-2: ta koodaavan emäsjärjestyksen omaava DNA, ja proteiini puhdistetaan kään-teisfaasi pylvästä käyttävän HPL-kromatografian avulla kasvatusalustasta.

Ihmisen IL-2:ta koodaava DNA, jota käytetään tämän keksinnön käytännön suorituksessa on esim. DNA (I), jonka emäsjärjestystä määräävät kodonit 1-133 kuvassa 2. Tällä DNA (I):llä voi vaihtoehtoisesti olla 5' -päässään joko ATG tai signaalisek-venssi, jota kuvaavat kodonit S1-S20 kuvassa 2 ja 3' -päässään TAA, TGA, tai TAG, mieluiten TGA.

DNA (I) on liitetty mieluummin promoottorin alapuolella olevalle alueelle esim. tryptofaanipromoottorin (trp), rec A- promoottorin tai λpl-promoottorin alle, sopivia ovat trp- tai ^^-promoottori. Keksinnön mukaisesti ihmisen IL-2: ta koodaava mRNA eristetään kasvatetuista ihmisen periferaalisista leukosyyteistä, joita on stimuloitu esim. konkavaliini-A: 11a. Sitten syntetisoidaan yksijuosteinen cDNA käyttämällä käänteis-kopioijaentsyymiä ja syntetisoidaan edelleen kaksijuosteinen DNA. DNA liitetään plasmidiin, yhdistelmäplasmidia käytetään esim. Escherichia coli- tai Bacillus subtilis-kannan transfor-moimiseen ja cDNA:ta sisältävä plasmidi kloonataan. Tällä tavoin voidaan tuottaa ihmisen IL-2: ta koodaavaa kaksijuos-teista DNA: ta.

Yksityiskohtaisemmin ilmoitettuna tämän keksinnön käytännön suorituksessa käytettävä ihmisen IL-2:ta koodaava mRNA voidaan 4 81118 saada Hinuman ym. käyttämällä menetelmällä (Biochemical and Biophysical Research Communications, 109, 363 (1982)). Tällä tavalla saatua ihmisen IL-2 mRNA: ta templaattina käyttäen syntetisoidaan cDNA sinänsä tunnetulla menetelmällä käyttäen käänteiskopioijaentsyymiä ja cDNA muutetaan kaksijuosteiseksi DNA: ksi (Maniatis, T. et ai. Cell, 8, 163 (1976); Land, H. et ai., Nucleic Acids Research, 9_ 2251 (1981)). Tämä DNA liite tään esimerkiksi plasmidiin pBR322 PstI-restiktioendonukle-aasin katkaisukohtaan esim. dG-dC homopolymeeriligaatiomene-telmällä (Nelson, T. S., Methods in Enzymology, 6j), 41 (1979)). Lisäksi oligonukleotidi, jolla on osaa ihmisen IL-2: den aminohappojärjestystä vastaava emäsjärjestys, syntetisoidaan esim. kemiallisesti ja leimataan sitten P: 11a. Käyttämällä tätä koettimena haluttu klooni valikoidaan tetrasykliini- tai ampisilliiniresistenttien transformanttien joukosta sinänsä tunnetulla pesäkehybridisaati©menetelmällä (Grunstein, M. and Hogness, D. S. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72, 3961 ( 1975); Alwine, J. C. et ai., Methods in Enzymology, 68, 220 (1979)). Ihmisen IL-2-geenin läsnäolo varmistetaan määrittämällä em. hybridisaatiomenetelmässä positiiviseksi osoittautuneesta kloonista saadun DNA: n emäsjärjestys Maxam-Gilbert menetelmällä (Maxam, A. M. et ai. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 560 (1977)) tai menetelmällä, jossa dinukleotidiketju päätetään synteettisesti käyttämällä faagia M13 (Messing, J. et ai., Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)). Sitten koko ihmisen IL-2-geeni tai osa siitä pilkotaan irti saadusta kloonista ja liitetään plasmidiin sopivan promoottorin ja SD-emäsjärjestyksen (Shine-Dalgarno) alle myöhemmin tapahtuvaa sopivaan isäntään siirtämistä varten.

Mm. trp-promoottorin käyttäminen promoottorina on edullista. Isäntänä on edullista käyttää mm. Escherichia coli-kantaa (esim. kanta 294, kanta DHI, kanta N4830).

Kannat Escherichia coli 294 (Beckman et ai. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 73 4174 ( 1976)), E. coli DHI (Seison, M. E. et ai., Nature, 217, 1110 (1968)) ja E. coli N4830 (Cell, 25, 713 i 5 81118 (1981)) ovat tunnettuja kantoja.

Tällaisten isäntien transformointi DNA:11a voidaan suorittaa tunnetulla menetelmällä (Cohen, S.N. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972)). Tällä tavoin saatua isäntää kasvatetaan sinänsä tunnetussa kasvatusliuoksessa kuten glukoosia ja kasaminohappoa sisältävässä M9-kasvatusliuoksessa (Miller, J. Experiments in Molecular Genetics, sivut 431-433 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972)). Tapauksissa, joissa käytetään trp-promoottoria voidaan lisätä vaikuttavaa ainetta kuten 3-/ö-indolyyliakryylihappoa lisäämään mainitun promoottorin tehokkuutta. Kasvatus suoritetaan yleensä 15-43 °C:ssa 3-24 tuntia ilmastaen ja/tai sekoittaen tarpeen mukaan.

Tapauksessa, jossa käytetään ^pL-promoottoria kasvatus suoritetaan mieluummin suhteellisen alhaisessa noin 30-36 °C:n lämpötilassa transformanttien kasvattamiseksi ja sitten noin 37-42 °C:ssa, jotta transformanttien repressori inaktivoituisi ja ihmisen IL-2:ta koodaava DNA ilmentyisi tehokkaasti.

Tällä tavoin tehdyn ihmisen IL-2:den pitoisuus voidaan määrittää käyttämällä IL-2:sta riippuvaista solulinjaa. Koska ihmisen IL-2:den tiedetään edistävän rotan, hiiren tai jonkin muun eläimen lL-2:sta riippuvaisien solujen kuten myös ihmisen IL-2:sta riippuvaisien solujen kasvua (Immunological Reviews, 51, 257 (1980)) , ei ainoastaan IL-2:sta riippuvaisia ihmisen solulinjoja, mutta myös rotan tai hiiren IL-2:sta riippuvaisia solui injo ja voidaan myös käyttää (Journal of Immunology, 130, 981 and 988 (1983)).

Erityisesti hiiren IL-2:sta riippuvaisia solulinjoja voidaan pitää yllä pysyvästi jatkoviljelemällä niitä pitkän aikaa niin, että niiden käyttäminen voi antaa hyvin toistettavia määritystuloksia.

Uutettaessa IL-2:ta tämän keksinnön mukaisesti kasvatetuista 6 81118 soluista solut kerätään kasvatuksen jälkeen tunnetulla menetelmällä, suspendoidaan proteiinia denaturoivan aineen liuokseen kuten guadiinin mineraalihapposuolaan (esim. vetykloridi, nitraatti, sulfaatti), suspensiota sekoitetaan kylmässä ja sitten se sentrifugoidaan, jolloin saadaan IL-2:ta sisältävä supernatantti, tai kerätyt solut suspendoidaan puskuriin ja rikotaan sonikoimalla, lysotsyymikäsittelyllä ja/tai jäähdyttämällä ja sulattamalla, mitä seuraa sentrifugointi, josta saadaan IL-2:ta sisältävä supernatantti. Myös mitä hyvänsä muuta sopivaa menetelmää voidaan käyttää.

IL-2:den eristäminen em. supernatantista ja sen myöhempi puhdistus voidaan suorittaa yhdistämällä sopivasti sinänsä tunnettuja eristys- ja puhdistusmenetelmiä. Tällasiin tunnettuihin eristys- ja puhdistusmenetelmiin kuuluvat mm. menetelmät, joissa käytetään hyväksi liukoisuuseroja kuten poistosuolaus-menetelmä ja liuotinsaostusmenetelmä, menetelmät, joissa käytetään hyväksi pääasiallisesti molekyylipainoeroja kuten dialyysi, ultrasuodatus, geelisuodatus ja SDS-polyakrylamidigee-lielektroforeesi, menetelmät, joissa käytetään hyväksi varaus-eroja kuten ioninvaihtokromatografia, menetelmät, joissa käytetään hyväksi spesifisiä affiniteetteja kuten affiniteetti-kromatografia, menetelmät, joissa käytetään hyväksi hydrofobi-suuseroja kuten käänteisfaasi, HPL-kromatografia (high performance liquid chromatography) ja menetelmät, joissa käytetään hyväksi isoelektrisen pisteen eroja kuten isoelektrinen fokusointi. Koska ihmisen IL-2-proteiini on erittäin hydrofobinen, hydrofobinen pylväskromatografia, erityisesti HPL-kromatogra-fia käänteisfaasipylvästä käyttäen on erittäin tehokas mainitun proteiinin puhdistuksessa.

Tällä tavalla esim. ihmisen IL-2:ta koodaavaa geeniä kantavaa Escherichia coli-kantaa kasvattamalla saadut solut suspendoidaan liuokseen, mieluummin proteiinia denaturoivaa ainetta sisältävään puskuriin kuten guaniinivetykloridiin (pitoisuutena 2-8 M, mieluummin 6-8 M) ja suspensiota sekoitetaan, mieluummin 0-5 °C:ssa 0,5-3 tuntia ja sitten sentrifugoidaan.

i 7 81118 Tällä tavoin kerätty supernatantti dialysoidaan joko sellaisenaan tai käyttämällä ultrasuodatuslaitetta tai vastaavaa suoritetun konsentroinnin jälkeen. Syntynyt sakka poistetaan sentrifugoimalla, supernatantti sijoitetaan anioninvaihtokro-matografiaan käyttämällä esim. dietyyliaminoetyyliselluloosaa (esim. DE 52 selluloosapylväs (Whatman, Iso-Britannia)) ja aktiivinen fraktio kerätään.

Ultrasuodatuslaitetta käyttäen suoritetun konsentroinnin jälkeen aktiivinen fraktio laitetaan geelisuodatukseen, jossa käytetään N,N '-metyleenibisakrylamidi-ristisidottua allyyli-dekstraanipylvästä kuten Sephacryl S-200 (Pharmacia, Ruotsi) pylvästä tai vastaavaa. Kerätty aktiivinen fraktio laitetaan sen jälkeen em. HPL-kromatografiaan. Tällä tavalla voidaan saada keksinnön mukainen glykosyloimaton ihmisen IL-2.

HPL-kromatogr af iässä käytettävänä käänteisf aas i rakennelmana käytetään mm. tehokkaasti hartsia, joka on päällystetty alky-loidulla (C^-iq) silaaneilla. Eluenttina on edullista käyttää Ci_6 alempaa alkoholia (esim. etanolia, propanolia) tai aseto-nitriiliä ja eluentin pH on 1,5-8, mieluummin 1,5-4. Eluutio-nopeus on mieluummin 0,1-100 ml/min.

Täten saatu ihmisen IL-2-proteiini voidaan muuttaa jauheeksi lyofilisoimalla mikäli se on tarpeellista. Lyofilisoitaessa voidaan lisätä stabilisaattoria kuten sorbitolia, mannitolia, dekstroosia, maltoosia, glyserolia tai ihmisen seerumialbumii-nia (HSA).

Kun IL-2:den aktiivisuutta määritetään käyttämällä osoittimena solun sisäänsä ottamaa radioaktiivista tydimiiniä IL-2:sta riippuvaisissa hiiren soluissa tämän keksinnön mukaan saatu ihmisen lL-2-proteiinin spesifinen aktiivisuus on yli 1 x 104 U/mg. Keksinnön mukaisesti voidaan saada erittäin puhdasta, glykosyloimatonta ihmisen IL-2-proteiinia, jonka spesifinen aktiivisuus on yli 2 x 104 U/mg ja on aina 4 104 U/mg asti.

s 81118 IL-2 aktiivisuus yksiköissä (U) laskettiin seuraavalla tavalla: IL-2:ta sisältävä näyte lisättiin liuokseen, joka sisälsi hiiren solulinjan soluja, jotka kasvavat IL-2:den pitoisuudesta riippuen ja koko seosta inkuboitiin 37 °C:ssa yli yön 5% C02:den läsnäollessa, mainitun solulinjan solujen kasvu määritettiin käyttäen tritioitua tymidiiniä. Aktiivisuuden laskemiseksi yksikköinä (U) kyseessä olevassa näytteessä, standardi IL-2:ta (1 U/ml) käytettiin aina vertailuun ja mainittu aktiivisuus yksikköinä laskettiin aktiivisuussuhteesta näytteen ja standardin välillä.

Yksityiskohtaisemmin IL-2:sta riippuvaisia hiiren solulinjan (NKC3) soluja (Hinuma ym., Biochem. Biophys. Res. Commun., 109, 363 (1982)) pidetään jatkoviljelyn avulla yllä RPMI 1640-kasvuliuoksessa, johon on lisätty 20% FCS:a jota on täydennetty IL-2: ta sisältävällä ilmastetulla liuoksella 37 °C:ssa 5% CC>2:den läsnäollessa, pestään kahdesti seerumittomalla RPMI 1640-1iuoksella ja suspendoidaan uudelleen 6 x 10^ solua/ml RPMI 1640-liuokseen, johon on lisätty 20% FCS:a.

IL-2:ta sisältävä näyte jaetaan 50 jul:n eriin 96-kaivoisen tasapohjaisen mikrotiitterilevyn (Nunc, Tanska) ensimmäisen rivin kaivoihin. Käyttämällä 50 jul:n eriä RPMI 1640-liuokses-ta, johon on lisätty 20% FCS:a, tehdään kaksinkertainen lai-mennossarja 12:sta riville saakka. Sitten em. NKC3-solusus-pensio jaetaan 50 jul:n erissä kaikkiin kaivoihin, mitä seuraa inkubaatio 37 °C:ssa 5% C02:den läsnäollessa 24 tuntia. 24 tunnin inkubaation jälkeen lisätään jokaiseen kaivoon 1 yuCi tritioitua tymidiiniä (Amersham, Iso-Britannia) . Inkubaation jatkuttua 4 tuntia solut kerätään lasisuodattimelle käyttäen solujen kerääjää (Flow, USA) ja tritioidun tymidiinin kerääntyminen niihin mitataan käyttäen nestetuikelaskinta. Suoritettaessa em. määritystä standardi IL-2-näyte on samojen toimenpiteiden kohteena kuin määritettävä näyte ja tritioidun tymidiinin kerääntyminen siihen määritetään.

9 81118

Aktiivisuuden laskeminen yksikköinä (U) suoritetaan probit-menetelmällä (Journal of Immunology, 120, 2027 (1978)) mukaisesti. Siten maksimikerääntymistä standardi IL-2-näytteen laimennossarjassa pidetään 100%:na ja kerääntymisprosentti (%) kutakin laimennusvaihetta kohti lasketaan. Näin saadut arvot pisteytetään tavalliselle todennäköisyyspaperille ja laimen-noskerroin, jossa kerääntyminen on 50% määritetään graafisesti. Myös jokaiselle IL-2:ta sisältävälle näytteelle määritetään laimennoskerroin, jossa kerääntyminen on 50% samalla tavalla. IL-2 aktiivisuuden määrä, jonka kasvatussupernatantti sisältää ihmisen periferaalisen veren lymfosyyttien (5 x 10^ solua/ml) 48 tunnin inkubaation 37 °C:ssa jälkeen 5% CC>2:den läsnäollessa RPMI 1640-liuoksessa, johon oli lisätty 10% FCS:a ja jota oli täydennetty 40 ug/ml:lla konkanavaliini-A: ta ja 15 ng/ml:lla 12-0-tetradekanoyyliforboli-13-asetaattia, on määritetty 1 U/ml:ksi.

Näytteen IL-2 pitoisuus (U/ml) lasketaan seuraavalla kaavalla: Näytteen laimennoskerroin, jossa saavutetaan 50%:n kerääntyminen

Standardi IL-2:n laimennoskerroin, jossa saavutetaan 50% kerääntyminen

Luonnollisella ihmisen per iferaalisesta verestä saadulla IL-2:lla spesifisinen aktiivisuus oli 20 000-70 000 U/mg määritettynä em. määritysmenetelmällä. Tämä aktiivisuus on lähes yhtä suuri kuin tämän keksinnön mukaisen ihmisen glykosyloi-mattoman IL-2-proteiinin aktiivisuus.

Keksinnön mukainen glykosyloimaton ihmisen IL-2-proteiini koostuu mieluummin polypeptidistä (II) , jonka aminohappojärjestys osoitetaan kuvassa 3 missä X on Met tai vety.

Keksinnön mukaisesti tuotetulla ihmisen IL-2-proteiinilla on seuraavat ominaisuudet: 10 81118 1) Se on homogeeninen SDS-polyakryyl iamid igeel ielektr of or ee-sissa ja sen molekyylipaino on 15 000 + 1000 daltonia määritettynä mainitulla elektroforeesilla; 2) Sen aminoterminaalinen aminohappo on alaniini tai metio-niini; 3) Sen karboksiterminaalinen aminohappo on treoniini; 4) Sillä on kasvavien T-solujen tai luonnollisten tappajasolujen vaikutus samalla kun se pitää yllä niiden toiminnot.

Tämän keksinnön mukaisesti tuotettu ihmisen IL-2-proteiini reagoi negatiivisesti limulus lysaattikokeeseen (Haemostasis, 7 , 183 (1978)) ja sen proteiiniepäpuhtaus ja pyrogeenisisältö ovat hyvin alhaisia, niin että sitä voidaan turvallisesti käyttää suurina määrinä tuotettuna aineena injektioiden valmistukseen jne.

Tämän keksinnön mukaisesti saadulla glykosyloimattomalla ihmisen IL-2-proteiinilla on tavallisten T-solujen tai luonnollisten tappajasolujen kasvua edistävä vaikutus samalla kun se pitää yllä niiden toimintoja. Siksi keksinnön mukaista IL-2-proteiinia voidaan käyttää T-solujen tai luonnollisten tappajasolujen kasvattamiseen tai jatkoviljelyyn in vitro pitkinä ajanjaksoina, tai niiden kloonaamiseen.

Tätä ominaisuutta voidaan lisäksi käyttää hyväksi ihmisen IL-2:den aktiivisuuden mittaamisessa.

Lisäksi keksinnön mukainen ihmisen IL-2- proteiini tekee mahdolliseksi kasvattaa valikoivasti antigeenispesifisiä tappaja-T-soluja in vitro, jotka tunnistavat ja tuhoavat tuumorianti-geenejä, tai luonnollisia tappajasoluja, jotka kykenevät tappamaan kasvainsoluja riippumatta antigeenisen herkistymisen olemassaolosta tai sen puuttumisesta. Kun tämän keksinnön n 81118 mukainen ihmisen IL-2 ympätään elävään organismiin samanaikaisesti mainittujen tappajasolujen siirtämisen kanssa, se lisää tappaja-T-solujen antituumorivaikutusta. Siksi sitä voidaan käyttää kasvainten ehkäisyyn tai hoitoon tai immunodesienssi-sairauksien hoitoon lämminverisillä eläimillä (esim. hiiri, rotta, kani, koira, kissa, sika, hevonen, nauta, ihminen).

Keksinnön mukainen ihmisen IL-2-proteiini on hyvin puhdistettu tuote, sen antigeenisuus ihmistä kohtaan on vähäinen ja sen toksisuus on alhainen.

Kasvainten hoitoon ja ehkäisyyn käytettävänä aineena keksinnön mukainen ihmisen IL-2-proteiini voidaan antaa joko parenteraa-lisesti tai oraalisesti esim. injektioina tai kapseleina, jotka on valmistettu sekoittamalla tai laimentamalla sitä sopivasti sellaisenaan tunnetun kantajan kanssa. Sitä voidaan käyttää joko yksinään tai yhdessä tappaja-T-solujen tai luonnollisten tappajasolujen kanssa, jotka on kasvatettu in vitro kuten tässä edellä on mainittu.

Keksinnön mukaisella ihmisen IL-2-proteiinilla on suurin piirtein sama biologinen aktiivisuus kuin luonnollisella ihmisen IL-2:lla ja niinpä sitä voidaan käyttää samalla tavoin kuin mainittua luonnollista ainetta. Sen dissosiaatiovakio suhteessa reagoivien solujen IL-2-reseptoreihin on hyvin pieni, niin että hyvin pieni annos on riittävä useimmissa tapauksissa.

T-solujen in vitro kasvattamista varten keksinnön mukaista ihmisen IL-2:ta voidaan lisätä liuokseen pitoisuutena noin 0,01-1 U/ml, mieluummin noin 0,1-0,5 U/ml.

Esimerkissä keksinnön mukaisen IL-2-proteiinin käytöstä T-solujen kasvattamiseen in vitro sitä lisätään pitoisuutena 0,1-0,5 U/ml solususpensioon, joka sisältää esim. alloanti-geeniherkistettyjä T-soluja, jotka on saatu ihmisen periferaa-lisesta verestä peräisin olevien T-solujen 3 vrk sekoitetusta lymfosyyttikasvatuksesta (1 x 10^ solua/ml) yhdessä B-solu- 12 81118 transformanttien kanssa (1 x 10^ solua/ml) joita on röntgen-säteilytetty (1500 radia) RPMI 1640 liuoksessa, joka sisältää 20% naudan sikiön seerumia. Kasvatusta jatketaan noin 1 kk vaihtaen kasvatusliuos noin viikon välein.

Seuraavissa esimerkeissä esiintuotu transformantti,

Escherichia coli DHl/pTF4, on talletettu Institute for Fermen-tationiin, Osakaan (IFO) talletusnumerolla IFO-14299, ja myös Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industryn, Japanin (FRI) talletusnumerolla FERM BP-628 Budapestin sopimuksen mukaisesti.

Tässä selityksessä ja piirustuksissa emäkset ja aminohapot, milloin ne on osoitettu lyhentein, on lyhennetty IUPAC-IUB Comission on Biochemical Nomenclaturen sääntöjen tai vallitsevan käytännön mukaan. Esimerkkejä esitetään taulukossa 1. Kun kyseessä on optinen isomeria mainitut aminohapot ovat L-muo-dossa ellei erityisesti muutoin osoiteta.

Taulukko 1 DNA: Deoksiribonukleiinihappo cDNA: Komplementaarinen deoksiribonukleiinihappo A: Adeniini T: Tyrniini G: Guaniini C: Sytosiini RNA: Ribonukleiinihappo mRNA: Lähetti-ribonukleiinihappo dATP: Deoksiadenosiinitrifosfaatti dTTP: Deoksitymidiinitrifosfaatti dGTP: Deoksiguanosiinitrifosfaatti dCTP: Deoksisytidiinitrifosfaatti ATP: Adenosiinitrifosfaatti EDTA: Etyleenidiamiinitetraetikkahappo SDS: Natriumdodekylsulfaatti i 13 81118

Gly: Glysiini

Ala: Alaniini

Vai: Väliini

Leu: Leusiini lie: Isoleusiini

Ser: Seriini

Thr: Treoniini

Cys: Kysteiini 1/2 Cys: Puoli kysteiiniä

Met: Metioniini GLu: Glutamiinihappo

Asp: Asparagiinihappo

Lys: Lysiini

Arg: Arginiini

His: Histidiini

Phe: Fenyylialaniini

Tyr: Tyrosiini

Trp: Tryptofaani

Pro: Proliini

Asn:, Asparagiini

Gin: Glutamiini

Lyhyt piirrosten kuvaus:

Kuva 1 ja kuva 2 kuvaavat plasmidin pILOTl35-8, joka on saatu viite-esimerkissä 1 (vii) , restriktoientsyymikartan (KS3 osoittaa signaalipeptidiä koodaavaa aluetta ja ΈΖΖΖΖλ osoittaa IL-2:ta koodaavaa aluetta) ja mainitun plasmidin primaari-rakenteen (emäsjärjestyksen) tässä järjestyksessä. Kuva 3 kuvaa keksinnön mukaisen glykosyloimattoman ihmisen IL-2-proteiinin aminohappojärjestyksen, missä X on Met tai vety-ioni. Kuva 4 osoittaa ekspressiovektorin pTF4:n suunnittelu-kaavion siten kun se on tehty viite-esimerkissä 2. Kuva 5 osoittaa esimerkissä 1(V) (1) ja (2) suoritetun SDS-poly- akrylamidi slabgeeli elektroforeesi tulokset. Kuvassa 6 on trypsiinillä pilkkomalla saatu peptidikartta, joka on mainittu esimerkissä 1 (V) (6), ja kuvassa 7 ja kuvassa 8 keksinnön 14 81118 mukaisen ihmisen IL-2-proteiinin vaikutukset tritioidun tymi-diinin kerääntymisen NKC3-solulinjassa ja ihmisen solulinjassa tässä järjestyksessä kuten esimerkissä 1 (V) (7) osoitetaan. Kuva 9 osoittaa pitkäaikaisen NKC3-solulinjän jatkokasvatuksen, joka on tehty esimerkissä 1 (V) (7), tulokset.

Viite-esimerkki 1 (i) Ihmisen IL-2:ta koodaavan mRNA:n eristäminen

Ihmisen per if eraalisesta verestä valmistettuja lymfosyyttejä inkuboitiin RPMI 1640-kasvuliuoksessa, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 12-o-tetradekanoyyliforboli-13-ase-taattia (TPA) (15 ng/nl) ja konkavaliini-A:ta (40 yug/ml) 37 °C:ssa, jotta IL-2 indusoituisi. 24 tunnin inkubaation jälkeen 1 x 1010 näin indusoitunutta ihmisen lymfosyyttiä hajoitettiin ja denaturoitiin liuoksessa, joka sisälsi 5 M guanidi initiosyanaa11ia, 5% merkaptoetanolia, 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) ja 10 mM EDTA käyttämällä Tef lon-homogen isaat tor ia, sitten lisättiin natrium-N-lauroyylisarkosinaattia 4%:n pitoisuuteen ja homogenisaation jälkeen seos pantiin kerrokseksi 6 ml:n 5,7 M kesiumkloridiliuoksen päälle (5,7 M kesiumkloridia, 1 M EDTA) ja sentrifugoitiin käyttämällä Beckman SW28 roottoria 24000 rpm 15 °C:ssa 48 tuntia, jotta saataisiin RNA-sakka. Tämä RNA-sakka liuotettiin 0,25% natrium-N-lauroyylisarkosi-naattiin ja sakkautettiin etanolilla, jolloin saatiin 10 mg RNA:ta. Tämä RNA kiinnitettiin hyvin suolapitoisessa liuoksessa (0,5 M Nacl, 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,3% SDS) oligo(dT)selluloosapylvääseen. Eluutio vähäisen suolapitoisuuden omaavalla liuoksella (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,3% SDS) antoi 300 ^ug poly(A):ta sisältävää mRNA:ta. Tämä mRNA sakkautettiin edelleen etanolilla, liuotettiin sitten 0,2 ml:aan liuosta (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 2 mM EDTA, 0,3% SDS), käsiteltiin 65 °C:ssa 2 minuuttia ja fraktioitiin 10-35% sokeri tiheysgradienttisentrifugaatiolla (20 °C:ssa 25000 rpm 21 tuntia käyttämällä Beckman SW28 roottoria) 22 fraktioon. Yhtä suuri erä kustakin fraktiosta injektoitiin Xenopus laeviksen oosyytteihin ja IL-2 aktiivisuus näin syntetisoiduissa prote- i 15 81118 iineissa mitattiin. Fraktioissa no 11-15 (sedimentaatiovakio 8S-15S) havaittiin olevan IL-2 aktiivisuutta. Näihin fraktioihin sisältyi noin 25 yug IL-2 mRNA:ta.

(ii) Yksijuosteisen DNA:n syntetisoiminen

Edellä saatua mRNA:ta ja käänteiskopijoijaentsyymiä käyttämällä suoritettiin inkubaatio 100 yul:ssa reaktioliuosta (5 ^jg oligo (dT) : tä, 100 yksikköä käänteiskopi joi jaentsyymiä, 1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 1 mM dTTP, 8 mM MgCl2r 50 mM KC1, 10 mM ditiotreitol, 50 mM Tris*HCl pH 8,3) 42 °C:ssa 1 tunti, mitä seurasi proteiinien poisto fenolilla ja käsittely 0,1 N NaOH:lla 70 °C:ssa 20 minuuttia RNA:n poistamiseksi hajoittamalla se.

(iii) Kaksijuosteisen DNA:n syntetisoiminen

Kaksijuosteinen DNA syntetisoitiin käsittelemällä edellä syntetisoitu yksijuosteinen komplementaarinen DNA 50 yul:ssa reaktioliuosta (sama kuin em. reaktioliuos paitsi että mRNA ja oligo(dT) puuttuvat) 42 °C:ssa 2 tuntia.

(iv) dC-hännän lisääminen Tämä kaksijuosteinen DNA käsiteltiin Sl-nukleaasilla 50 yul:ssa reaktioliuosta (kaksijuosteinen DNA, 0,1 M natrium-asetaatti pH 4,5, 0,25 M Nacl, 1,5 mM ZnS04, 60 yksikköä Sl-nukleaasia) huoneenlämpötilassa 30 minuuttia, mitä seurasi proteiinien poisto fenolilla ja DNA:n saostaminen etanolilla. DNA käsiteltiin terminaalitransferaasilla 50 yul:ssa reaktio-liuosta (kaksijuosteinen DNA, 0,14 M kaliumkakodylaatti, 0,3 M Tris (emäs) pH 7,6, 2 mM ditiotreitol, 1 mM C0CI2# 0,15 mM dCTP, 30 yksikköä terminaalitransferaasia) 37 °C:ssa 3 minuuttia, mikä aiheutti kaksijuosteisen DNA:n pidentymisen noin 15 deoksisytidiinillä molemmissa 3'-päissä. Tämä reaktiosarja tuotti noin 300 ng deoksisytidiiniketjua sisältävää kaksijuos-teista DNA:ta.

16 81 Π 8 (v) Escherichia coli-plasmidin katkaiseminen ja dG-hännän liittäminen 10 yug Escherichia coli-plasmidin pBR322 DNA:ta käsiteltiin yksitellen restriktioentsyymi Pstl:llä 50 yul:ssa reaktio-liuosta (10 yug DNA:ta, 50 mM Nacl, 6 mM Tris-HCl pH 7,4, 6 mM MgCl2/ 6 mM 2-merkaptoetanoli, 100 yug/ml naudan seerumialbu-miinia, 20 yksikköä PstI:tä) 37 °C:ssa 3 tuntia plasmidin katkaisemiseksi pBR322 DNArssa sijaitsevassa yhdessä Pstl-tunnistuskohdassa, mitä seurasi proteiinien poisto fenolilla. Katkaistua plasmidi pBR322 DNA:ta pidennettiin noin 17 deoksi-guaniinillä molemmissa 3'-päissä käsittelemällä sitä termi-naalitransferaasilla 50 yul:ssa reaktioliuosta (10 yug DNA:ta, 0,14 M kaliumkakodylaattia, 0,3 M Tris-emästä pH 7,6, 2 mM ditiotreitol, 1 mM CoCl2r 0,15 mM GTP, 30 yksikköä terminaali-transferaasia) 37 °C:ssa 3 minuuttia.

(vi) cDNA:n liittäminen ja Escherichia colin transformointi Näin saatu synteettinen kaksijuosteinen DNA (0,1 yug) ja 0,5 yug em. plasmidi pBR322:ta liitettiin yhteen kuumentamalla niitä 0,1 M Nacl, 50 mM Tris-HCl pH 7,6 ja 1 mM EDTA sisältävässä liuoksessa 65 °C:ssa 2 minuuttia ja pitämällä sitten 45 °C:ssa 2 tuntia, mitä seurasi liuoksen asteittainen viilentäminen, ja tuotetta käytettiin Escherichia coli MM294:n transformointiin Enean ym. (J. Mol. Biol., 96, 495 (1975)) menetelmän mukaisesti.

(vii) cDNA:ta sisältävän plasmidin eristäminen

Tällä tavalla eristettiin noin 20000 tetrasykliiniresistenttiä transformanttia. Kaikkien näiden DNA:t sidottiin nitrosellu-loosasuodattimelle. Taniguchin ym. (Nature, 302, 305 (1983)) ilmoittamaan IL-2:den aminohappojärjestykseen perustuen syntetisoitiin kemiallisesti vastaavien emäsjärjestysten oligo-nukleotidit (5' AAA CAT CTT CAG TGT3' ja 5'ACA TTC ATG TGT

17 81118 GAA3') , jotka vastasivat aminohappoja no 74-78 (Lys-His-Leu-Gln-Cys) ja aminohappoja no 122-126 (Thr-Phe-Met-Cys-Glu) tässä järjestyksessä fosfotriesterimenetelmällä (Crea, R. ym., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 5765 (1978)).

Nämä oligonukleotidit leimattiin 32P:llä 5'-päästään käsittelemällä ne T4-polynukleotidikinaasilla 50 ul:ssa reaktio-liuosta (0,20 ug oligonukleotidiä, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2* 10 mM 2-merkaptoetanoli, 50 uCi -32P-ATP, 3 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia) 37 °C:ssa 1 tunti. Nämä leimatut oligonukleotidit, jotka toimivat koettimina, liitettiin nitroselluloosasuodattimeen sidottuihin DNArhin Lawn'in ym. (Nucleic Acids Res., 9, 6103 (1981)) menetelmällä. Neljä transformanttia, jotka reagoivat kahden oligonukleotidikoetti-men kanssa, havaittiin autoradiografiällä. Plasmidi-DNA eristettiin kaikkien näiden transformanttien soluista Birnboim-Doly aikai imene telmällä (Birnboim, H. C. & Doly, J., Nucleic Acids Res., ]_, 1513 (1979)). Sitten plasmidissa oleva insertti leikattiin irti käyttämällä restriktioentsyymi Pstlstä. Eristetyistä plasmideista valittiin se, joka sisälsi pisimmän inserttifragmentin ja sille annettiin nimi pILOT 135-8. Tämän plasmidin restriktioentsyymikartta esitetään kuvassa 1.

Tähän pILOT 135-8:aan liitetyn cDNA:n primaarirakenne (emäs-järjestys) määritettiin dideoksimenetelmällä ja Maxam-Gilbert-menetelmällä. Näin määritetty primaarirakenne esitetään kuvassa 2. Tämän emäsjärjestyksen pohjalta määritetty peptidi käsittää 153 aminohappoa ja se alkaa synteesin aloitussignaalil-la (no:t 64-66 ATG). Näistä signaalipeptidinä pidetään 20 ensimmäistä aminohappoa N-terminaalista lähtien. Em. primaari-rakenne on paljastanut, että tässä plasmidissa on koko ihmisen IL-2-proteiinia koodaava emäsjärjestys. Tämä osoittaa, että mainittuun plasmidiin liittyneen geenin liittäminen sopivaan ekspressioplasmidiin voi johtaa IL-2-proteiinin polypeptidi-osan tuottamiseen.

ie 81 Γ. 8

Viite-esimerkki 2

Viite-esimerkissä 1 saatu plasmidi pILOT 135-8 pilkottiin restr iktioentsyymillä Hg iAl. Näin saatu 1294 emäsparia pitkä DNA-fragmentti, joka sisälsi IL-2-geeninf käsiteltiin T4-DNA-polymeraasilla, siihen liitettiin Clal-linkkeri CGATA ATG GCA, joka sisälsi alaniinin kodonin ja metioniinin kodonin ATG, ja tuote käsiteltiin Clal:llä ja PstI;llä, mitä seurasi liittäminen ptrp 771:een Clal-PstI kohdalla. Näin saatua ekspressio-plasmidia kutsuttiin pTF4:ksi (kuva 4).

Viite-esimerkki 3

Escherichia coli DH1 transformoitiin viite-esimerkissä 2 saadulla plasmidilla pTF4:llä Cohen'in ym. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972)) menetelmän mukaisesti, jolloin saatiin mainitun plasmidin sisältävä transformantti (Escherichia coli DHl/pTF4).

Esimerkki 1 (i) Escherichia coli DHl/pTF4 (saatu viite-esimerkissä 3) ympättiin 50 ml:aan kasvatusliuosta (pH 7,0), joka sisälsi 1% Bacto tryptonia (Difco Laboratories, USA), 0,5% Bacto hiiva-uutetta (Difco Laboratories, USA), 0,5% natriumkloridia ja 7 yug/ml tetrasykliiniä 250 ml:n erlenmeyer-pullossa. Kasvatus-liuosta inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa ravistelussa, jonka jälkeen se siirrettiin 5 litran pöytäfermentoriin, joka sisälsi 2,5 litraa M9-kasvatusliuosta, joka sisälsi 0,5% kas-aminohappoja, 0,5% glukoosia ja 7 yug/ml tetrasykliiniä. Inkubaatiota jatkettiin sitten ilmastaen ja sekoittaen 37 °C:ssa 4 tuntia ja edelleen 4 tuntia 3-/3-indolyyliakryyli-hapon (25 yug/ml) lisäämisen jälkeen. Solut kerättiin näin saadusta 2,5 litran kasvatusliuoksesta sentrifugoimalla, jäädytettiin -80 °C:ssa ja varastoitiin.

(ii) Esimerkissä 1(i) saadut jäädytettynä säilytetyt solut 19 3Π18 (12,1 g) suspendoitiirv 100 ml:aan uuttopuskuria (pH 7,0), joka sisälsi 7 M guanidiinivetykloridia ja 0,1 M Tris-HCl, suspensiota sekoitettiin 4 °C:ssa 1 tunti ja lysaattia sentrifugoi-tiin 28000 x g 20 minuuttia, jolloin saatiin 93 ml superna-tanttia.

(iii) Useita menetelmiä käytettiin yksitellen IL-2:den uuttamiseksi transformantti Escherichia coli DHl/pTF4 soluista, jotka oli saatu esimerkin 1(i) menetelmällä kunkin menetelmän uuttamistehokkuuden vertailemiseksi.

Lysotsyymi-EDTA-menetelmässä 2 g Escherichia coli DHl/pTF4 soluja, jotka oli saatu esimerkissä l(i) sekoitettiin 16 ml:aan liuosta (pH 7,0), joka sisälsi 0,1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA ja 250 mg/1 lysotsyymiä, seosta sekoitettiin 4 °C:ssa 1 tunti ja myöhemmin 37 °C:ssa 5 minuuttia ja lysaattia sentri-fugoitiin 28000 x g 20 minuuttia.

Sonikaatiomenetelmässä 2 g em. soluja suspendoitiin 16 ml:aan liuosta (pH 7,0), joka sisälsi 0,1 M Tris-HCl, suspensiota sonikoitiin 0 °C:ssa 5 minuuttia ja lysaattia sentrifugoitiin 28000 x g 20 minuuttia.

Guanidiini-HCl-menetelmässä 2 g em. soluja sekoitettiin 16 ml:aan liuoksia (pH 7,0), jotka sisälsivät 0,1 M Tris-HCl ja 2 M, tai 4 M tai 7 M guanidiini-HCl, seoksia sekoitettiin 4 °C:ssa 1 tunti ja lysaatteja sentrifugoitiin 28000 x g 20 minuuttia. Näin saaduista supernatanteista määritettiin proteiinipitoisuus ja IL-2-aktiivisuus.

Tulosten yhteenveto esitetään taulukossa 2.

20 81 1 1 8

Taulukko 2. IL-2:den uuttaminen

Uuttamis- Proteiini- Uutteen IL-2 Suhdeluku menetelmä pitoisuus aktiivisuus (%) (mg/ml) (U/ml)

Lysotsyymi- 5,40 3,3 0,02

EDTA

Sonikaatio 6,54 2,2 0,01 2M GU-HC1 2,60 46 0,2 4M Gu·HC1 4,12 144 0,8 7M Gu·HC1 7,22 19100 100

Gu*HCl: Guanidiinivetykloridi (iv) Esimerkissä 1(ii) saatu supernatantti dialysoitiin 0,01 M Tris-HCl-puskuria (pH 8,5) vastaan ja sitten se sentrifugoi-tiin 19000 x g 10 minuuttia, jolloin saatiin 94 ml dialysoitua supernatanttia. Tämä pantiin DE 52 (DEAE-selluloosa, Whatman, Iso-Britannia) pylvääseen (50 ml:n tilavuudessa), joka oli tasapainotettu 0,01 M Tris-HCl-puskurilla (pH 8,5) proteiinien adsorptiota varten. Proteiinit eluoitiin lineaarisella NaCl-pitoisuusgradientilla (0-0,15 M NaCl, 1 litra). Aktiiviset fraktiot (53 ml) konsentroitiin 4,8 ml:ksi käyttämällä YM-5 membraania (Amicon, USA) ja geelisuodatettiin käyttämällä Sephacryl S-200 (Pharmacia, Ruotsi) pylvästä (500 ml tilavuudeltaan) , joka tasapainotettiin 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0)-1 M Nacl puskurilla. Saadut aktiiviset fraktiot (28 ml) konsentroitiin 2,5 mlrksi käyttäen YM-5 membraania. Konsentraatti pantiin Ultrapore RPSC (Altex, USA) pylvääseen adsorptiota varten ja HPL-kromatografia suoritettiin käyttäen liikkuvana faasina tr ifluorietikkahappoasetönitriilisysteemiä.

Käytetyt olosuhteet: pylväs, Ultrapore RPSC (4,6 x 75 mm); pylvään lämpötila, 30 °C; liuotin A, 0,1% tr ifluorietikka-happo-99,9% vesi; liuotin B, 0,1% tr if luor iet ikkahappo-99,9% 2i 81118 asetonitriili; eluutio-ohjelma, minuutti 0 (68% A + 32% B) -minuutti 25 (55% A + 45% B) -minuutti 35 (45% A + 55% B) -minuutti 45 (30% A + 70% B) -minuutti 48 (100% B); eluutio-nopeus, 0,8 ml/min.; määritys allonpituudella 230 nm. Aktiivinen fraktio kerättiin noin 39 minuutin retentioaikana. Näin saatiin 10 ml liuosta, joka sisälsi 0,53 mg glykosyloimatonta ihmisen IL-2-proteiinia (spesifinen aktiivisuus 30000 U/mg; aktiivisuuden takaisin saaminen aloitusmateriaalista 30,6%; proteiinin puhtaus 99% (määritettynä densitometrisesti SDS-polyakryyliamidigeelielektroforefogrammilla)):

Em. liuoksen lyofilisointi tuotti valkeaa jauhetta. Jauheen spesifinen aktiivisuus oli 26000 U/mg.

(V) Esimerkissä l(iv) saadusta ihmisen IL-2-proteiinistä tutkittiin seuraavat ominaisuudet; (1) Homogeenisuus; Värjäys Coomassie Brillian Blue:11a, jota seurasi SDS-poly-akryyliamidigeelielektroforeesi Laemmlin ym. mukaan (Nature, 227, 680 (1970)) toi näkyviin ainoastaan yhden mainittua ihmisen IL-2-proteiinia edustavan juovan (katso kuva 5) . Juovan sijainti oli muuttumaton sekä pelkistävissä olosuhteissa että ei-pelkistävissä olosuhteissa.

(2) Molekyylipaino:

Mainitun ihmisen IL-2-proteiinin molekyylipainon laskettiin olevan noin 15000 daltonia perustuen SDS-polyakryyliamidigee-lielektroforeesiin (ks. kuva 5).

(3) Aminohappokoostumus: 20 yug:n erä mainittua ihmisen IL-2-proteiinia laitettiin lasiseen koeputkeen hydrolyysiä varten, johon lisättiin vakio-määrä kiehuvaa suolahappoa, joka sisälsi 4% tioglykolihappoa, 22 8 1 1 1 8 putki suljettiin vakuumiin ja hydrolyysi suoritettiin 110 °C:ssa 24, 48 ja 72 tuntia. Hydrolyysin jälkeen putki aukaistiin, suolahappo poistettiin alennetussa paineessa ja tähde liuotettiin 0,02 N suolahappoon ja aminohappoanalyysi suoritettiin käyttämällä Hitachin malli 835 aminohappoanaly-saattoria. Kystiinin ja kysteiinin määrittämiseksi mainittu ihmisen IL-2-proteiini hapetettiin per formihapolla Hirsin menetelmän mukaan (Methods in Enzymol., 11, 197 (1967)), mitä seurasi hydrolyysi vakiomäärässä kiehuvaa suolahappoa alennetussa paineessa 24 tuntia. Hydrolysaatista määritettiin kyste-iinihappo käyttämällä aminohappoanalysaattor ia . Em. analyyseistä saadut tulokset osoitetaan taulukossa 3. Kaikki arvot ovat keskiarvoja kolmesta 24, 48, ja vastaavasti 72 tunnin hydrolyysin jälkeen saadusta arvosta paitsi seriinin ja treo-niinin arvot, jotka määritettiin ekstrapoloimalla hydrolyysin aloitusaikaan.

Taulukko 3

Aminohappo Mooli %

Asp/Asn 8,8

Thr 9,3

Ser 5,7

Glu/Gln 13,7

Pro 3,4

Gly 1,7

Ala 3,8 1/2 Cys 2,3

Vai 3,1

Met 3,7

Ile 6,3

Leu 16,3

Tyr 2,3

Phe 4,5

Lys 8,3

His 2,5 i 23 81 1 1 8

Arg 3,1

Trp 1,1 (4) N-terminaalinen aminohappojärjestys 34 g:n erä mainittua ihmisen IL-2-proteiinia analysoitiin N-terminaalisen aminohappojärjestyksen määrittämiseksi käyttämällä hyväksi automaattista Edman degradaatiomenetelmää käyttämällä kaasufaasiproteiinisekvenssoijaa (malli 470A, Applied Biosystems, USA). Fenyylitiohydantoiiniaminohapot (PTH-amino-hapot) tunnistettiin HPL-kromatografiällä käyttämällä Micro-pak-SP pylvästä (Varian, USA). Kussakin vaiheessa havaittu aminohappo tai aminohapot osoitetaan taulukossa 4.

Taulukko 4

Vaihe Havaittu PTH-aminohappo 1 Ala

Met 2 Pro

Ala 3 Thr

Pro 4 Ser

Thr 5 Ser 6 Ser 7 Thr 8 Lys 9 Lys 10 Thr 11 Gin 12 Leu 13 Gin 14 Leu 24 81 1 1 8 15 Glu 16 Y* 17 Leu 18 Leu 19 Leu 20 Asp * ei ole vielä määritetty (5) C-terminaalin aminohappo: 33 yug:n erä mainitusta ihmisen IL-2-proteiinistä laitettiin lasiseen koeputkeen hydratsiinilla hajoittamista varten, 0,05 ml vedetöntä hydratsiinia lisättiin siihen ja putki suljettiin vakuumiin ja lämmitettiin 100 °C:een kuudeksi tunniksi. Saatu hydratsiinilla hajoitettu tuote lyof ilisoi t iin ja liuotettiin tislattuun veteen. Liuokseen lisättiin bentsalde-hydiä, seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 1 tunti ja sitten se sentrifugoiti in. Näin saatu vesikerros lyofilisoi-tiin ja siitä tehtiin aminohappoanalyysi käyttämällä Hitachi malli 835 aminohappoanalysaattoria. Ainoastaan treoniini havaittiin.

(6) Peptidikartoitus trypsiinin avulla 15 ^ig:n erä mainittua IL-2 näytettä pilkottiin 0,4 yug:lla trypsiiniä (Washington, USA) 120 yul:ssa 0,02 M natriumvety-karbonaattia 37 °C:ssa 18 tuntia. Sitten lisättiin 5 jal 2-merkaptoetanolia ja reaktiota jatkettiin 37 °C:ssa edelleen 2 tuntia. Tämän jälkeen reaktio lopetettiin lisäämällä 75 ^j1 1% triEluorietikkahappoa. HPL-kromatografia, joka suoritettiin alla annetuissa olosuhteissa, antoi reaktioseoksesta kuvassa 6 osoitetun kartan.

Pylväs: Ultrasphere-Octyl (5 Jjm, 4,6 x 250 mm; Altex, USA); Pylvään lämpötila: 30 °C; ( 25 81 1 1 8

Liikkuva faasi:

Liuotin A, 0,02% trifluorietikkahappo-99,98% vesi Liuotin B, 0,02% trifluorietikkahappo-99,98% asetonit-riili

Minuutti 0 (95% liuotin A + 5% liuotin B) - minuutti 40 (30% liuotin A + 70% liuotin B)

Virtausnopeus: 1,0 ml/minuutti;

Osoitus: Fluoresenssimenetelmä (Analytical Biochem., 62, 438 (1975)) fluoreskamiinia käyttäen (Roche, USA) (7) Vaikutus IL-2:sta riippuvaisiin soluihin

Keksinnön mukaisen glykosyloimattoman ihmisen IL-2-proteiinin määritys on kuvattu Biochem. Biophys. Res. Commun., 109 , 363 (1982). Se osoitti, että mainitulla IL-2-proteiinilla on kyky edistää tritioidun tymidiinin sisäänottoa IL-2:sta riippuvai-*-sessa hiiren solulinjassa (ks. kuva 8).

Lisäksi mainittu IL-2-proteiini liuotettiin RPMI-1640 liuokseen, johon oli lisätty 20% FCS:ää, pitoisuuteen 0,5 U/ml, ja 2 x 105 solua/ml NKC3 solulinjaa suspendoiti in liuokseen. Jatkokasvatusta jatkettiin Linbro Multi dish-astioissa (Flow, USA) 37 °C:SSA 5% CC^sssa toistaen samalla elävien solujen laskenta ja kasvatuksen suspendointi uuteen tuoreeseen liuokseen 2 tai 3 päivän välein. Tuloksena havaittiin mainitulla IL-2-proteiinilla olevan kykyä pitää yllä NKC3-solulinjän kasvua pitkän ajanjakson aikana kuten kuvassa 9 osoitetaan.

Esimerkki 2 (injektion valmistus)

Esimerkissä l(iv) saatu glykosyloimaton ihmisen IL-2-prote-iinia sisältävä liuos laitettiin CM Toyopearl (Toyo Soda, Japani) pylvääseen, joka oli tasapainotettu 0,025 M ammonium-asetaattipuskurilla (pH 5,0) aseptisissa olosuhteissa adsorptiota varten, mitä seurasi eluutio yllä mainitulla puskurilla, joka sisälsi 0,15 M NaCl. Eluaatti liuotettiin lisäämällä riittävä määrä 0,15 M NaCl, sitten lisättiin HSA:ta pitoisuu- 26 31 1 1 8 teen 0,5% ja seos suodatettiin membraanisuodattimen läpi (huokosen halkaisija 0,22 yum). Suodos jaettiin aseptisesti 1 ml: n eriin pieniin lääkepulloihin, minkä jälkeen seurasi lyo-filisointi. Ihmisen IL-2-valmiste injektioita varten liuotettiin 1 ml: aan tislattua vettä kussakin pienessä lääkepullossa ennen käyttöä.

Claims (6)

27 81 1 1 8

1. Menetelmä olennaisesti puhtaan glykosyloimattoman ihmisen interleukiini-2-proteiinin valmistamiseksi, jonka proteiinin spesifinen aktiivisuus on vähintään 10* U/mg, jonka puhtaus on vähintään 99 %, jolla esiintyy vain yksi juova SDS-poly- akryyliamidi-geeli-elektroforeesianalyysissä sekä pelkistävissä että ei-pelkistävissä olosuhteissa ja joka on olennaisesti endotoksiinia ja pyrogeenia sisältämätön, tunnettu siitä, että kasvatetaan Escherichia colin transformanttia, joka sisältää ihmisen interleukiini-2: ta koodaavan emäsjärjestyksen omaavan DNA: n, siten, että aiheutuu ihmisen interleu-kiini-2: den tuotto ja karttuminen kasvatusliuokseen, ja saatetaan näin saatu ihmisen interleukiini-2: ta sisältävä liuos puhdistusmenetelmään, joka soveltaa HPL-kromatografiaa, jossa käytetään käänteisfaasipylvästä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromatografia suoritetaan käyttämällä eluenttia, jonka pH on 1, 5-8.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromatografia suoritetaan virtausnopeudella 0, 1-100 ml /mi n.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ihmisen interleukiini-2: ta tuotetaan ja kartutetaan kasvavissa transformanttisoluiesa ja ihmisen interleukiini-2 uutetaan soluista, jolloin saadaan ihmisen interleukiini-2: ta sisältävää nestettä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ihmisen interleukiini-2 uutetaan liuoksella, jossa on proteiinia denaturoivaa ainetta.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ihmisen interleukiini-2 uutetaan guanidiinisuolan liuoksella, jonka konsentraatio on 2-8 M. 2« 81118