FI80293B - Foerfarande foer framstaellning av intakt rekombinent humanimmuninterferon. - Google Patents

Description

Menetelmä ihmisen muuttumattoman yhdistelmäimmuuni-inter feronin tuottamiseksi 1 80293 Tämä keksintö koskee menetelmää ihmisen muuttumat-5 toman yhdistelmäimmuuni-interferonin, jolla on seuraava aminohappojärjestys,

Cys Tyr Cys Gin Asp Pro Tyr Vai Lys Glu Ala Glu

Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp 10 Vai Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu

Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met

Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe

Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gin Ser Ile Gin Lys Ser

Vai Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Vai Lys Phe 15 Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu

Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Vai Thr Asp Leu Asn Vai

Gin Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gin Vai Met

Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg

Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala 20 Ser Gin joka aminohappoketju voi mahdollisesti sisältää ylimääräisen metioniiniryhmän aminopäässään, joka interferoni on suurin piirtein vapaa proteolyysifragmenteistaan, tuotta-25 miseksi tätä proteiinia sisältävistä transformoiduista E. coli-soluista.

Tähän mennessä on kehitetty monenlaisia menetelmiä interferonina tunnetun, virusten vastaisista proteiineista koostuvan ryhmän uuttamiseksi ja puhdistamiseksi. Tällä 30 hetkellä tunnetaan kolme pääryhmää interferoneja: IFN-a-(valkosolu), IFN-β (sidekudos) ja IFN- (immuuni). Vaikka eri interferoniryhmät saattavat olla sukua toisilleen virusten vastaisten, jakaantumista estävien ja rakenteellisten ominaisuuksiensa suhteen, ei tähän mennessä ole pys-35 tytty kehittämään yhtenäistä menetelmää kaikkien näiden 2 80293 ryhmien uuttamiseksi ja puhdistamiseksi. Itse asiassa monilla menetelmillä, jotka soveltuvat valkosoluinterferonin uuttamiseen ja puhdistamiseen muita proteiineja ja solu-jätteitä sisältävästä raakaseoksesta, ei onnistuta uutta-5 maan ja puhdistamaan sidekudos- tai immuuni-interferonia samanlaisesta preparaatista.

Tunnettujen puhdistusmenetelmien uuttovaiheessa mikro-organismit, jotka ovat tuottaneet, usein yhdistelmä-tekniikan kautta, haluttua "vierasta" proteiinia, tyypil-10 lisesti hajotetaan mekaanisesti (so. äänikäsittelyllä) tai kemiallisesti. Tämän mekaanisen tai kemiallisen hajotuksen aikana vapautuu seokseen kuitenkin myös erilaisia solun proteaaseja. Nämä proteaasit ovat sitten vapaita vaikuttamaan entsymaattisesti seoksen sisältämään "vieraaseen" 15 proteiiniin ja hajottamaan sitä. Nämä proteaasit voivat siten estää "vieraan" proteiinin homogeenisen puhdistamisen valmiiseen, biologisesti aktiiviseen muotoon.

Tämän keksinnön tavoitteena on sen vuoksi saada aikaan menetelmä, jolla ei ole tähänastisten uutto- ja 20 puhdistusmenetelmien puutteita ja jonka avulla saadaan muuttumaton immuuni-interferoniketju ja jolla proteolyyt-tisestä hajoamisesta seuraavat fragmentit poistetaan puhdistetusta immuuni-interferoni preparaatista.

Lisäksi tämän keksinnön tavoitteena on saada aikaan 25 homogeenista ja muuttumatonta immuuni-interferonia.

Nyt on havaittu immuuni-interferonin suhteen, että millään aiemmin kuvatulla tavanomaisella menetelmällä tapahtuva uutto ja puhdistus ei tuota immuuni-interferonia, jolla on muuttumaton tai täydellinen aminohappoketju, si-30 sältävää täysin homogeenista preparaattia. Vasta viime aikoina on yhdistelmätekniikka edistynyt siihen pisteeseen, että on mahdollista tuottaa riittäviä määriä rlFN-a sen karakterisoimiseksi ja sen aminohappojärjestyksen määrittämiseksi. Käytettäessä tavanomaisia tunnettuja 35 menetelmiä rlFN-^-preparaattien uuttamiseen ja määritet-

II

3 80293 täessä puhdistetun materiaalin aminohappojärjestys havaittiin, että puhdistettu materiaali koostui itse asiassa joukosta toisilleen läheisiä proteiinilajeja, joilla oli eri molekyylipaino. Nyt on todettu aminohapposekvenssiana-5 lyysillä, että nämä proteiinilajit koostuvat itse asiassa immuuni-interferonin muuttumattoman muodon ja muuttumattoman proteiinin fragmenttien, jotka muodostavat suurimman osan seosta, yhdistelmästä. Vaikka nyt on todettu tunnetun seoksen sisältäneen sekä muuttumatonta immuuni-in-10 terferoniproteiinia että sen fragmentteja, on yllättäen havaittu, että ilmeisesti jokin tämän seoksen komponentti on myös säilyttänyt biologisen aktiivisuutensa.

rIFN-?T:n uuttaminen voidaan toteuttaa äänikäsitte-lyä tai kemiallista hajotusta käyttäen. rlFN-/f(jota koo-15 daavaa DNA emäsjaksoa ja sitä vastaavaa aminohappojaksoa kuvataan viitteessä 1) hajoaa äänikäsittelyä tai kemiallista hajotusta käyttäen toteutettavan uuttovaiheen aikana. Jäähdytettyjen solujen äänikäsittelyllä on kuitenkin saatu pääasiassa 15 K:n rlFN-ifca, so. rlFN-<T:a, josta 20 C-terminaaliset aminohappotähteet no 132-146 puuttuvat.

Tämä hajoaminen voidaan estää käyttämällä uuttamiseen rea-genssia, kuten esimerkiksi guanidiinihydrokloridia, joka ei vaikuta rIFN-iT:n biologiseen aktiivisuuteen eikä amino-happoketjuun uutto-olosuhteissa. Lisäksi on yllättävästi 25 todettu, että immuuni-interferoni säilyttää biologisen aktiivisuutensa guanidiinihydrokloridiuuttovaiheen jälkeen, vaikka guanidiinihydrokloridi tuhoaa biologisen aktiivisuuden lisättäessä sitä puhdistettuun immuuni-inter-feronipreparaattiin.

30 Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että suspendoidaan transformoidut E. coli-solut 3-7 M gua-nidiniumsuolaliuokseen ja puhdistetaan ihmisen yhdistelmä-immuuni -interferoni uutteen supernatant!sta käyttämällä ihmisen yhdistelmä-immuuni-interferonin karboksipäätteisen 35 peptidin vastaista monokloonalista vasta-ainetta.

4 80293

Keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan siis ihmisen yhdistelmäimmuuni-interferonia, jolla on muuttumaton ja täydellinen aminohappoketju. Menetelmässä käytetty gua-nidiinihydrokloridi on proteiineja denaturoiva aine, 5 joka, kuten oletetaan, alentaa proteaasien tai entsyymien aktiivisuutta uuton aikana mutta ei vaikuta halutun proteiinin aktiivisuuteen uutto-olosuhteissa. Puhdistettua rlFN- iT:a saadaan lopulta käsittelemällä uutosta saatava supernatantti, edullisesti sopivan laimennuksen jälkeen, 10 suoraan puhdistuslaitteessa, edullisesti monoklonaalista vasta-ainetta sisältävässä pylväässä. Nämä uutto- ja puhdistusprosessit voidaan automatisoida laajamittaista tuotantoa varten. Näin keksintö tekee mahdolliseksi saada ensimmäisen kerran suuria määriä homogeenista rIFN-^:a ja 15 mahdollistaa siten laajamittaiset kliiniset kokeet, biologiset tutkimukset, röntgenkristallografiän sekä rakenne-toiminta-tutkimukset.

Menetelmässä käytetty antiproteolyyttinen aine voi olla mikä tahansa guanidiniumsuola. Sellaisia guanidinium-20 suoloja ovat suolat, joita guanidiini muodostaa orgaanisten happojen, kuten esimerkiksi etikkahapon, tai mineraa-lihappojen, kuten vetyhalogenidien, so. vetybromidin, vetykloridin, vetyfluoridin ja vetyjodidin, kanssa. Edullinen guanidiniumsuola on guanidiinihydrokloridi. On 25 edullista, että kyseistä suolaliuosta käytetään vähintään noin 3-kertaisesti, erityisesti noin 3-9 -kertaisesti ti-lavuusmäärään nähden, joka vastaa grammaa transformoituja mikro-organismeja. Suolan pitoisuus voidaan säätää sekoittamalla suola liuottimeen, esimerkiksi veteen tai vettä 30 sisältävään puskuriin, kuten ammoniumasetaatti- tai pyri-diini-etikkahappopuskuriin tai vastaavaan.

Kuvio 1 valaisee ihmisen puhdistetun yhdistelmäim-muuni-interferonin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyli-amidigeelielektroforeesia (SDS-PAGE) pelkistävissä olosuh-35 teissä (A, 0,7 M β-merkaptoetanoli) ja ei-pelkistävissä

II

5 80293 olosuhteissa (B).

Kuviossa 2 verrataan keskenään ihmisen yhdistelmä-immuuni-interferonin ennustettua aminohappojärjestystä sekä 15 ja 18 kilodaltonin (K) rlFN- lajia koodaavaa to-5 dellista DNA-jaksoa.

Kuvio 3 valaisee 15 K:n ja 18 K:n rlFN-/‘-lajin C-terminaalisten peptidien HPLC-erotusta CNBr-käsittelyn jälkeen.

Kuvio 4 on trypsiinikäsitellyn 18 K:n riFN-\':n pep-10 tidikartta.

Keksinnön edullisia suoritusmuotoja valaistaan seu-raavassa selityksessä ja esimerkeissä.

E.colissa tuotettu ihmisen yhdistelmäimmuuni-inter-feroni uutetaan edullisesti jäädytetystä solumassasta 7 M 15 guanidiinihydrokloridilla ja puhdistetaan edullisesti uudenlaista, monoklonaalista vasta-ainetta sisältävää affi-niteettipylvästä käyttäen. Puhdistettua interferonia, jonka näennäinen molekyylipaino on 18000 daltonia (18 K) SDS-PAGE:lla, on saatu guanidiinia käyttämällä, kun taas ääni-20 käsittelyllä ilman guanidiiniuuttoa eristettiin lajeja, joilla oli alempi molekyylipaino (päälajeilla noin 15000 daltonia, 15 K). Sekä 18 K:n ja 15 K:n proteiinien amino-terminaalinen jakso vastasi tätä ihmisen immuuni-interfe-roniproteiinia koodaavan DNA:n perusteella ennustettua 25 jaksoa.

18 K:n immuuni-interferonia koodaavan DNA-jakson, jota käytetään läpi koko tämän selityksen, kaava on seu-raava: 6 80293

_X

AGGAGGAATTC ATG TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA GAA AAC CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA GGT CAT TCA GAT GTA GCG

GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG

5 GAG AGT GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT TAC

TTC AAA CTT TTT AAA AAC TTT AAA GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG

AGT GTG GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG TTT TTC AAT

AGC AAC AAA AAG AAA CGA GAT GAC TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT

TCG GTA ACT GAC TTG AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC

10 ATC CAA GTG ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA GGG AAG

CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA AGA GCA TCC CAG TAA

Y

jossa kaavassa MX":llä merkityt nukleotidit koodaavat ri-bosomien sitoutumiskohtaa ja luennan aloitussignaalia ja 15 "Y":llä merkityt nukleotidit koodaavat luennan lopetussig-naalia.

C-terminaalinen jakso, joka määritettiin analysoimalla ja sekventoimalla 18 K:n rIFN-v‘:sta saatu puhdistet- tu C-terminaalinen peptidi, vastasi rIFN-A:n ennustettua 20 aminohappojaksoa, mikä osoittaa 18 K:n lajin olevan muuttumaton molekyyli. 18 K:n immuuni-interferonin aminohappojärjestys, jota käytetään läpi koko tämän selityksen, on seuraava:

Cys Tyr Cys Gin Asp Pro Tyr Vai Lys Glu Ala Glu 25 Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp

Vai Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu

Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met

Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe

Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gin Ser Ile Gin Lys Ser 30 Vai Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Vai Lys Phe

Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu

Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Vai Thr Asp Leu Asn Vai

Gin Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gin Vai Met

Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg 35 Lys Arg Ser Gin met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala

Ser Gin

Keksinnön mukainen menetelmä koskee myös sellaista li 7 80293 tapausta, että immuuni-interferoniproteiini sisältää ami-nopäässä ylimääräisen metioniinitähteen (Met). Siten muuttumaton 18 K:n rlFN )j~- käsittää polypeptidit, joissa ensimmäisenä happotähteenä aminopäässä on joko metioniini 5 tai kysteiini, sekä niiden seokset.

Tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa fer-mentointiprosesseissa vastaanottajana käytettävä mikro-organismi on, ellei toisin mainita, Escherichia coli K-12, kanta 294, jota kuvataan GB-patenttijulkaisussa 2 055 382Ά 10 ja joka on talletettu 28. lokakuuta 1978 the American Type Culture Collectioniin numerolla ATCC 31446. Lisäksi kaikki tämän keksinnön yhteydessä suoritettu yhdistelmä-DNA-työskentely toteutettiin the National Institutes of Healthin sovellettavissa olevien ohjeiden mukaisesti.

15 Keksinnön piiriin kuuluu kuitenkin paitsi edellä mainitun E.coli K-12-kannan 294 käyttö myös muiden tunnettujen E.coli- kantojen, kuten E.coli MA210 tai E.coli RR1 (ATCC no 31343)- kannan, tai muiden mikro-organismien, joista monia on yleisesti saatavissa tai talletettuina 20 hyväksyttyihin mikro-organismien talletuslaitoksiin, kuten the American Type Culture Collectioniin, ja saatavissa niistä (ks. esimerkiksi ATCC-luettelo), käyttö.

Tämän keksinnön mukaisesti edellä mainittua uutta immuuni-interferonia voidaan käyttää samoihin tarkoituk-25 siin kuin muita tunnettuja interferoneja, esimerkiksi virus- tai kasvainsairauksien ennaltaehkäisyyn tai hoitoon tai heikentyneen immuniteetin hoitoon. Sitä voidaan antaa farmaseuttisesti hyväksyttävissä suun kautta, ruiskeina tai paikallisesti annettavissa koostumuksissa ja muodois-30 sa. Annostukset ja annostiheydet voivat olla vastaavia kuin ne, joita tällä hetkellä käytetään tunnettujen interferonien kliinisissä sovellutuksissa, tavallisesti noin 1 - 200 x 106 yksikköä vuorokaudessa. Mitä tahansa tavanomaista kantaja-ainetta voidaan käyttää. Kantaja-aine voi 35 olla orgaaninen tai epäorgaaninen inertti kantaja-aine, 8 80293 joka soveltuu enteraalisesti, ihon kautta tai parenteraa-lisesti annettavaksi. Sopivia kantaja-aineita ovat vesi, gelatiini, arabikumi, laktoosi, tärkkelys, magnesiumstea-raatti, talkki, kasviöljyt, polyalkyleeniglykolit, vase-5 liini ja vastaavat. Farmaseuttiset valmisteet voivat sisältää lisäksi muita farmaseuttisesti aktiivisia aineita. Muita lisäaineita, kuten aromiaineita, säilymistä edistäviä aineita, stabilointiaineita, emulgaattoreita, puskureita ja muita vastaavia on mahdollista lisätä lääkkeiden 10 valmistuksessa hyväksyttyjen toimin tatapojen mukaisesti.

Farmaseuttiset valmisteet voidaan valmistaa mihin tahansa tavanomaiseen muotoon, joihin kuuluvat: a) suun kautta annettavat kiinteät valmisteet, kuten tabletit, kapselit, pillerit, pulverit, rakeet ja muut vastaavat; 15 b) suun kautta annettavat nestemäiset valmisteet, kuten liuokset, siirapit, suspensiot, eliksiirit ja vastaavat; c) parenteraalisesti annettavat valmisteet, kuten steriilit liuokset, suspensiot ja emulsiot; ja d) paikallisesti käytettävät valmisteet, kuten liuokset, suspensiot, sal-20 vat, voiteet, hyytelöt, hienojakoiset pulverit, aerosolit sekä muut vastaavat. Farmaseuttiset valmisteet voidaan steriloida ja/tai ne voivat sisältää apuaineita, kuten säilymistä edistäviä aineita, stabilaattoreita, kostutus-aineita, emulgaattoreita, osmoottisen paineen muuttamiseen 25 tarkoitettuja suoloja ja/tai puskureita.

Parenteraalisesti annettavat muodot voivat olla infuusioliuoksina tai ruiskeina annettavina liuoksina, jotka voidaan antaa laskimoon tai lihakseen. Nämä valmisteet voivat sisältää myös muita lääkeaineita. Muita, ku-30 ten säilymistä edistäviä aineita, stabilointiaineita, emulgaattoreita, puskureita, yms. voidaan lisätä lääkkeiden valmistuksessa hyväksyttyjen toimintatapojen mukaisesti.

Esimerkki 1 35 Antigeeninä käytettävän kantajaproteiini-polypep- tidikompleksin synteesi 9 80293

Polypeptidi H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH liitettiin tyroglobuliiniin (tästä eteenpäin TG) Goodfriend'in et al. [Science 144 (1964) 1334] esittämällä menetelmällä.

5 Itse peptidi voidaan valmistaa tavanomaisin pepti- disynteesimenetelmin. Voidaan käyttää joko kiinteäfaasi-tai nestefaasimenetelmää, vaikkakin nestefaasissa toteuttava synteesi on edullinen monissa tapauksissa. Tällaisia peptidisynteesimenetelmiä kuvaavat esimerkiksi 10 Schröder ja Liibke teoksessa "The Peptides", osa 1, Academic Press, New York, USA, 1966; Izumiya et ai. teoksessa "Peptide Synthesis", Maruzen, Tokio, Japani, 1975; tai Haruaki Yajima teoksessa "Experiments in Biochemistry", osa 1, s. 207 - 400, Tokyo Kagaku Dojin, 1977; ja niihin 15 kuuluvat muun muassa atsidimenetelmä, kloridimenetelmä, happoanhydridimenetelmä, sekahappoanhydridimenetelmä, DCC-menetelmä, aktiivinen esteri-menetelmä, menetelmä, jossa käytetään Woodward-reagenssi K;a, karbodi-imidatsolimene-telmä, hapetus-pelkistysmenetelmä ja DCC/lisäaine (esim.

20 HONB, HOBt, HOSu) -menetelmä.

IFN-^;n 131-146 -fragmentin valmistusta kuvataan yksityiskohtaisesti EP-hakemusjulkaisussa 103 898.

2,5 mg mainittua polypeptidiä sekoitettiin 3,75 mg:aan TG:a, ja sen jälkeen kun oli lisätty 2 ml 50 mM 25 fosfaattipuskuria, seosta sekoitettiin hyvin jäävedessä. Seokseen lisättiin pisaroittain liuos, joka sisälsi 30,4 mg karbodi-imidihydrokloridia 200 ml:ssa tislattua vettä. Sen jälkeen seosta sekoitettiin jäävedessä 3 tuntia. Reaktion mentyä loppuun tuotetta dialysoitiin riit-30 tävässä määrin tislattua vettä vastaan, jonka jälkeen se kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 4,7 mg proteiinikompleksia.

Esimerkki 2

Entsyymiin sidotun antigeenin valmistaminen vasta-35 aineiden havaitsemiseen käytettävää EIA-testiä (Enzyme 10 80293

Immunoassay) varten EIA-testiln tarvittava entsyymiin sidottu antigeeni valmistettiin Kitagawan et ai. [Journal of Biochemistry 79 (1976) 233] mukaisesti.

5 (i) Maleimidoryhmän liittäminen polypeptidiin

Esimerkin 1 mukaisesti valmistettu polypeptidi (350 ml) liuotettiin 1 ml:aan 100 mM fosfaattipuskuria (pH 6,8) ja tämä liuos lisättiin liuokseen, joka sisälsi 585 pg (1,75 umol) N-(4-karboksi-sykloheksyylimetyyli)ma-10 leimidi-N-hydroksisukkinimidiesteriä 70 pl:ssa N,N-dime-tyyliformamidia. Seosta sekoitettiin 30eC:ssa 30 minuuttia. Reaktion mentyä loppuun suoritettiin fraktiointi Sep-hadex ® G-25 -kolonnissa, jolloin saatiin 185 nmol poly-peptidifraktiota, johon polypeptidiin oli liittynyt male-15 imidoryhmä.

(ii) Maleimidoryhmän sisältävän polypeptidin liittäminen β-D-galaktosidaasiin

Maleimidoryhmän sisältävä polypeptidi (16,5 nmol) sekoitettiin 3,3 nmol:iin β-D-galaktosidaasia. 4°C:ssa 20 tapahtuneen 18 tunnin reaktion jälkeen lisättiin 412,5 nmol β-merkaptoetanolia reaktion päättämiseksi. β-D-galaktosidaasiin liitetty polypeptidi saatiin fraktioimalla Sepharose ® 6B-kolonnissa ja käytettiin myöhempiin kokeisiin.

25 Esimerkki 3

Immunisointi

Kullekin kuudelle BALB/C-hiirinaaraalle, joiden ikä oli 7-8 viikkoa, annettiin ihon alle 40 pg (proteiinin mukaan laskettuna) esimerkin 1 mukaista, antigeeninä toi-30 mivaa proteiinikompleksia sekoitettuna huolellisesti

Freund'in täydelliseen apuaineeseen (Freund's complete adjuvant) (ensimmäinen immunisointi). Kahden viikon kuluttua ensimmäisestä immunisoinnista hiirille annettiin jälleen ihon alle sama annos antigeeniä kuin edellä sekoitet-35 tuna hyvin Freund'in epätäydelliseen apuaineeseen

II

n 80293 (Freund's incomplete adjuvant) (toinen immunisointi). Taas kahden viikon kuluttua tehtiin kolmas immunisointi samalla tavalla kuin toinenkin. Kuuden vuorokauden kuluttua kolmannesta immunisoinnista hiiristä otettiin osaverinäyt-5 teet, ja seerumin vasta-ainepitoisuudet määritettiin jäljempänä kuvattavalla EIA-menetelmällä [vrt. Immunopharma-cology 1 (1978) 3]. Hiirellä no $-2 oli suurin vasta-ainepitoisuus, ja sille tehtiin viimeinen immunisointi antamalla laskimoon 120 pg antigeeniä liuotettuna 0,5 ml:aan 10 natriumkloridiliuosta. Kunkin hiiren vasta-ainepitoisuudet esitetään taulukossa 1.

Taulukko 1

Antipeptidivasta-aineiden määrät immunisoiduissa hiirissä 15 ---- -........

B/T (%)

Hiiri Ensimmäinen Toinen Kolmas no immunisointi1* immunisointi2 ’ immunisointi3 > 20 Y-l - 4) N.D. 24,5 2 N.D. 5) 19,3 35,3 3 - N.D. 24,7 4 N.D. 1,3 1,7 25 5 N.D. 1,8 5,0 6 - N.D. 0,8

Normaali 30 hiiri 0,6 0,1 N.D.

12 80293

Taulukon I selitykset: 1 > Seerumin laimennussuhde: 1/1000 2) Seerumin laimennussuhde: 1/6300 3) Seerumin laimennussuhde: 1/7800 5 4) Havaittavuusrajan alapuolella 51 N.D.: Ei määritelty B/T: (Sitoutunut entsyymiaktiivisuus/lisätty kokonais-entsyymiaktiivisuus)xl00 10 EIA-menetelmä

Vasta-aineaktiivisuus selvitettiin esimerkin 2 mukaisella proteiinikompleksilla immunisoitujen hiirien seerumissa tai hybridoomasupernatantista EIA-menetelmällä [Immunology 1 (1978) 3], Menetelmässä seerumi tai hybri-15 doomasupernatantti laimennettiin puskurilla A (20 mM

Na2HP04:n suhteen, 100 mM NaCl:n suhteen, 0,1 % NaN3 , 1 mM MgCl2:n suhteen, pH 7,0), 100 μΐ tätä laimennosta sekoitettiin 100 pl:aan entsyymiin sidottua polypeptidijohdannaista (esimerkki 2), ja reaktion annettiin edetä 20 24°C:ssa 24 tuntia. Sen jälkeen lisättiin 100 μΐ 3 %:ista selluloosaa, johon oli liitetty kaniinin hiirenvastaista IgGrtä, ja reaktion annettiin edetä 24°C:ssa 4 tuntia. Reaktion mentyä loppuun selluloosa pestiin hyvin puskurilla A, joka sisälsi 0,5 % Tween® 20:ä, sitten lisättiin 25 500 μΐ liuosta, joka sisälsi 20 pg/ml 4-metyyliumbelli- feryyli-p-D-galaktosidia, ja 37°C:ssa tapahtuneen 2 tunnin reaktion jälkeen lisättiin 3 ml 100 mM karbonaattipusku-ria (pH 10,5) reaktion päättämiseksi. Fluoresenssi-intensiteetti mitattiin fluorometrillä (eksitaatio: 365; emis-30 sio: 450 nm).

Esimerkki 4 Solufuusio 3 vuorokauden kuluttua viimeisestä immunisoinnista (esimerkki 3) hiiren $-2 perna poistettiin, suodatettiin 35 paineen avulla ruostumatonta terästä olevan verkon läpi 13 80293 ja suspendoitiin MEM:iin (Eagle's minimum essential medium), jolloin saatiin pernasolususpensio. Solufuusioon käytettiin BALB-C-hiiristä saatuja P3-x63.Ag8.Ul (P3Ul)-mye-loomasoluja [Current Topics in Microbiology and Immuno-5 logy 81 (1978) 1]. Solufuusio tehtiin KiJhler'in ja Mils-tein'in [Nature 256 (1975) 495-497] alkuperäisellä menetelmällä. Sen mukaisesti pernasolut ja P3Ul-solut pestiin erikseen kolmesti seerumivapaalla MEM:11a ja sekoitettiin suhteessa 5:1 (solujen lukumääräsuhde). Seosta sentrifu-10 goitiin nopeudella 800 rpm 15 minuuttia, jolloin solut laskeutuivat. Supernatantin huolellisen poiston jälkeen sedimentti irrotettiin varovasti, lisättiin 0,3 ml 45 % polyetyleeniglykoli (PEG) 6000:a (Koch-Light), ja seoksen annettiin seistä 37°C:n vesihauteessa 7 minuuttia solufuu-15 sion aikaansaamiseksi. Sen jälkeen siihen lisättiin MEM:ä nopeudella 2 ml/min. Kun kaikkiaan 12 ml MEM:ä oli lisätty, saatua seosta sentrifugoitiin nopeudella 600 rpm 15 minuuttia, minkä jälkeen supernatantti poistettiin. Solu-sedimentti suspendoitiin RPMI-1640 -väliaineeseen, johon 20 oli lisätty 10 % vasikan sikiöseerumia (RPMI1640-10FCS), niin että pitoisuudeksi tuli 2 x 105 P3Ul-solua/ml, ja 24 syvennyksen monimaljasysteemin (Lindbro) kuhunkin 144 syvennykseen siirrostettiin 1 ml suspensiota. Siirrostuksen jälkeen soluja inkuboitiin 37°C:ssa 5 % C02:a sisältävässä 25 kaasuinkubaattorissa. 24 tunnin kuluttua aloitettiin HAT-selektiivinen viljely lisäämällä kuhunkin syvennykseen 1 ml HAT-väliainetta (1 x 10' * M hypoksantiinin, 4 x 10'7 M aminopetriinin ja 1,6 x 10'5 M tymidiinin suhteen).

HAT-selektiivistä viljelyä jatkettiin korvaten 1 ml van-30 haa väliainetta 1 ml:11a HAT-väliainetta 3, 5 ja 7 vrk:n kuluttua viljelyn aloittamisesta. Hybridoomien kasvu havaittiin 10-14 vuorokauden kuluttua solufuusiosta. Kasvatus liemen muuttuessa keltaiseksi (n. 1 x 106 solua/ml) supernatantti kerättiin, ja siitä tutkittiin vasta-aineen 35 läsnäolo EIA-menetelmällä. Näin tutkittiin supernatantit 14 80293 niistä 141 syvennyksestä, joissa hybridoomakasvua oli havaittu. Kahdessa syvennyksessä (^2-11 ja ^2-100) havaittiin voimakas vasta-aineaktiivisuus ja kahdessa muussa (f 2-62 ja $2-70) heikko vasta-aineaktiivisuus.

5 Esimerkki 5

Kloonaus 3 syvennyksessä 0f2-ll, %2-62 ja ^2-100), jotka antoivat positiivisen tuloksen vasta-aineaktiivisuustes-tissä, olleet hybridoomat kloonattiin rajoittavalla lai-10 mennusmenetelmällä. Sen mukaisesti hybridoomasolut suspen-toitiin RPMI1640-20FCS väliaineeseen, niin että pitoisuudeksi tuli vähintään 2 hybridoomasolua/ml, ja suspensio jaettiin 0,1 ml:n annoksina 96 syvennyksisen mikromaljan syvennyksiin. Mainitun jaon yhteydessä kuhunkin syvennyk-15 seen lisättiin 5 x 105 BALB-C-hiiren tymosyyttiä syöttö-soluiksi. Tämän tuloksena havaittiin solujen jakautuminen noin 2 viikon kuluessa. Sen jälkeen supernatantti kerättiin, ja siitä tutkittiin vasta-aineiden läsnäolo esimerkissä 3 kuvatulla EIA-menetelmällä. Vasta-aineaktiivisuus 20 havaittiin 8:ssa 19:stä ^2-11-syvennyksestä saadusta kloonista, 3:ssa 54:stä ^2-62 -syvennyksestä saadusta kloonista ja 5:ssä 47:stäY2-100 -syvennyksestä saadusta kloonista (taulukko 2).

Il 15 80293

Taulukko 2

Kloonattujen hybridoomien anti-peptidivasta-aine-aktiivi-suus 5

Hybridooma no B/T (%) Y 2-11 10 1 68 2 31 3 63 6 68 7 67 15 9 69 12 42 18 60 Y 2-62 20 14 20 16 21 34 16 f 2-100 25 2 69 3 70 16 56 25 80 46 33 30--

Hyperimmuunin hiiren seerumi 35

Esimerkki 6

Monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumiskapasi-teetti IFN-)f:an 35 Monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumiskapasi- teetti IFN-<^:an määritettiin seuraavalla menetelmällä.

16 80293 300 pl:aan liuosta, joka sisälsi 3 % kanin anti-hiiren IgG-vasta-aineeseen liitettyä selluloosaa, lisättiin 300 μΐ viljelmäsupernatanttia, joka oli saatu syvennyksestä ’^2-11, ^"2-61 tai V~2-100 peräisin olevasta kloonatusta 5 solulinjasta (2 tai 3 kpl kutakin), ja annettiin reagoida huoneen lämpötilassa 12-20 h. Sitten selluloosa pestiin huolellisesti fysiologisella suolaliuoksella ja siihen lisättiin 550 yksikköä/ml edellä mainitulla menetelmällä saatua IFN-)|Sa. Annettiin reagoida 3-4 h, kerättiin super-10 natantti, ja siinä oleva IFN- '^-aktiivisuus määritettiin sytopaattiseen vaikutukseen perustuvalla menetelmällä (CPE) käyttäen mikromaljaa [Applied Microbiology 16 (1968) 1706]. Tämän menetelmän mukaisesti laitettiin 50 μΐ MEM:ä kuhunkin 96-syvennyksisen mikromaljan syvennykseen ja en-15 simmäiseen syvennykseen laitettiin 50 μΐ IFN-näytettä, mitä seurasi kaksinkertainen sarjalaimennus. Kuhunkin siten preparoituun syvennykseen lisättiin 50 μΐ WISH-solu-suspensiota (4 x 10'5 solua/ml) 20 % FCS:a sisältävässä MEMrssä ja inkuboitiin hiilidioksidi-kaasuinkubaattorissa 20 37eC:ssa 24 h. Sen jälkeen kuhunkin syvennykseen lisättiin 50 μΐ preparaattia, joka sisälsi rakkulaista suutulehdusta aiheuttavaa virusta (New Jersey -kanta) pitoisuutena 2000TCID50 (TCID50: kudosviljelmän infektoiva keskiverto-annos), ja inkuboitiin hiilidioksidi-inkubaattorissa 25 37°C:ssa. Noin 35 h:n kuluttua, kun IFN:a sisältämättömän syvennyksen soluissa havaittiin 100 %:n CPE, tutkittiin kukin syvennys mikroskooppisesti CPE:n arvioimiseksi, ja maljan, jossa havaittiin 50 %:n CPE, sisältämän IFN-näyt-teen laimennuskertoimen käänteislukua pidettiin IFN-tiit-30 terinä.

Käytetty IFN-näyte oli supernatantti, joka kerättiin 72 h:n kuluttua siitä, kun ihmisen ääreislymfosyytit oli stimuloitu konkanavaliini A:11a (40 pg/ml) ja 12-0-tetradekanoyyliforboli-13-asetaatilla (15 ng/ml). 1 ml 35 tätä viljelmäsupernatanttia sisälsi 4400 yksikköä ihmisen 17 80293 IFN-^:a (herkkä lämmölle ja hapoille). Jos kloonattuja soluja sisältävän viljelmän supernatantti sisältää vasta-aineita, joilla on sitomiskapasiteetti IFN-/:n suhteen, tulisi lisätyn IFN-^:n sitoutua selluloosalla oleviin 5 vasta-aineisiin, ja pitäisi tapahtua supernatantin IFN- ^aktiivisuuden lasku. Tuloksena oli, että kloonilla '^-2-11 havaittiin olevan suhteellisen voimakas IFN-n sitomis-kyky ja 50-75 % lisätystä IFN-'^sta (550 yksikköä/ml) sitoutui vasta-aineisiin (taulukko 3).

10 Taulukko 3 IFN-aktiivisuuden sitoutuminen monoklonaalisiin vasta-aineisiin i !

Hybridoomavil- IFN-jäännösaktiivisuus (yksikköä/ml) 15 jelmä

Koe 1_Koe 2 <2-11,1 138 275 <2-11,2 207 N.D.

<2-11,6 N.D. 275 20 j '2-62,2 275 550 <2-62,3 275 550 <2-100,2 550 N.D.

<2-100,3 550 N.D.

550 550 25 ---

Esimerkki 7

Monoklonaalista vasta-ainetta tuottavien hybridoo-mien aiheuttama vesivatsan muodostuminen 30 Vesivatsan muodostuminen aiheutettiin inokuloimalla vatsakalvon sisäisesti BALB/C-hiiret, jotka oli esikäsi-telty vatsakalvon sisäisesti 0,5 ml:11a mineraaliöljyä, jf2-ll.l -kloonisoluilla (1 x 106 ), joilla oli kyky tuottaa vasta-aineita, joilla on sitornisaktiivisuus IFN-)l:n suh-35 teen. 10 vuorokauden kuluttua hybridoomien vatsakalvon 18 80293 sisäisestä antamisesta vesivatsa kerättiin ja siitä tutkittiin vasta-aineaktiivisuus 107-kertaiseen laimennukseen asti. Vaikka vastaavan kloonisoluviljelmän supernatantin vasta-aineaktiivisuus havaittiin aina 104-kertaiseen lai-5 mennukseen asti, johti vesivatsan muodostus noin 1000-ker-taiseen vasta-aineaktiivisuuden nousuun.

Esimerkki 8

Monoklonaalisen vasta-aineen puhdistus Käyttäen 4 ml esimerkin 7 mukaisesti saatua vesi-10 vatsanestettä lähtöaineena, tehtiin monoklonaalisen vasta-aineen puhdistus Staehelin'in et ai. menetelmällä [Journal of Biological Chemistry 256 (1981) 9750]. Tämän menetelmän mukaisesti vesivatsanestettä sentrifugoitiin ensin nopeudella 10 000 rpm 15 min fibriinimäisten ainei-15 den poistamiseksi siitä ja laimennettiin sitten fosfaat-tipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (PBS: 8,1 mmol/1 NaH2P04, 1,5 mmol/1 KH2 P04 , 2,7 mmol/1 KC1 ja 137 mmol/1 NaCl; pH 7,2) pitoisuuteen, jossa UV-absorptio aallonpituudella 280 nm (A280) oli 12-14. Sitten laimennet-20 tuun näytteeseen lisättiin kylläistä ammoniumsulfaatin vesiliuosta niin paljon, että sulfaattipitoisuudeksi tuli 47 %. Seosta sekoitettiin 4°C:ssa 60 min suolan erottumisen aikaansaamiseksi ja sentrifugoitiin sitten (10 000 rpm, 15 min), jolloin saatiin sakka. Sakka liuotettiin 20 25 mM Tris puskuriin (pH 7,9), joka sisälsi 50 mmol/1 NaCl, ja dialysoitiin samaa puskuria (2 1) vastaan. Kahden tunnin kuluttua dialysointiliuos korvattiin 2 1:11a tuoretta samanlaista liuosta ja dialyysiä jatkettiin vielä 15 h.

Sen jälkeen sakka poistettiin sentrifugoimalla nopeudella 30 10 000 rpm 15 min ja supernatantin pitoisuus säädettiin vastaamaan A280-arvoa 20 - 30. Tälle näytteelle tehtiin fraktiointi DEAE-selluloosapylväässä (8 ml, Whatman DE52), joka oli tasapainotettu riittävällä määrällä Tris-puskuria (pH 7,9), joka sisälsi 50 mmol/1 NaCl, tehden eluointl 50 35 mmol/1 NaCl sisältävällä Tris-puskurilla virtausnopeudel-

II

ig 80293 la 1,5 ml/min. Näissä olosuhteissa vasta-aineaktiivisuus esiintyi pääasiassa effluenttifraktioissa. Se, että puhdistettu näyte oli vasta-aine, varmistettiin Laemmlin et ai.[Nature 227 (1970) 680] SDS-PAGE -menetelmällä. Tämän 5 menetelmän mukaisesti tehtiin joillekin fraktioille, jotka oli saatu ammoniumsulfaattierotuksella ja DEAE-selluloo-safraktioinnilla, pelkistys 2-merkaptoetanolilla, mitä seurasi elektroforeesi 17 % SDS-geelillä jännitteellä 30 V 24 h. Vasta-aineaktiivisuuspiikkien kanssa sopusoinnussa 10 havaittiin kaksi vyöhykettä asemissa, jotka vastasivat molekyylipainoja noin 55 kilodaltonia (H-ketju) ja noin 28 kilodaltonia (L-ketju). Siten puhdistetusta fraktiosta 17 tutkittiin IFN- J^-sitomisaktiivisuus lisäämällä IFN-)^:a (2200 yksikköä/ml). Tällöin havaittiin, että noin 15 50 % IFN-^:sta sitoutui vastaaineeseen (taulukko 4).

Taulukko 4 Näyte Laimennus IFN-jäännösaktii- visuus (yksikköä/ml) 20--- Y2-11.1 fraktio 17 10'1 1100 10-2 1100 10-3 2200 10-4 2200 25 IgE:n vastainen 10"1 2200 monokloi.aalinen 10"2 2200 vasta-aine 10"3 2200 10-4 2200 i __ 30

Esimerkki 9

Alaryhmä, johon monoklonaalinen vasta-aine kuuluu

Puhdistettu vasta-ainefraktio 17 (esimerkki 8) laimennettiin 10-kertaiseen tilavuuteen ja sille tehtiin im-35 muunisaostusreaktio agarissa (Ouchterlony-testi: Immunolo- 80293 20 gical Methods, Gel-Diffusion Techniques, Blackwell,

Oxford, 1964) käyttäen vuohen anti-hiiren IgGl-, G2a-, G2b- ja G3-vasta-aineita (Miles), niin että IgG-alaryhmä, johon )^2-11.1 -monoklonaaliset vasta-aineet voisivat kuu-5 lua, voitiin identifioida. Havaittiin yksi selvä vyöhyke monoklonaalisen vasta-aineen ja vuohen anti-hiiren IgG2b-vasta-aineen välillä, kun taas monoklonaalisen vasta-aineen ja muiden anti-vasta-aineiden välillä ei havaittu vyöhykkeenmuodostusta. Siten mainitun monoklonaalisen vas-10 ta-aineen havaittiin kuuluvan ryhmään IgG2b (taulukko 5).

Taulukko 5

Monoklonaalisen vasta-aineen alaluokka Antigeeni Vasta-aine Saostumiskäyrä 15---

Keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine (fraktio 17) Anti-IgGl " Anti-IgG2a 20 " Anti-IgG2b +

Anti-IgG3 25 Esimerkki 10

25 ml (65,3 mg) esimerkin 8 mukaisesti puhdistettua, effluenttifraktioista saatua monoklonaalista vasta-ainetta dialysoitiin 0,1 M NaHC03:a (pH 8,3) vastaan. 22 ml AFFI-GEL 10:ä (Bio-Rad) pestiin erikseen huolellisesti 30 vedellä lasisuodatinta käyttäen, suspendoitiin 0,1 M

NaHC03:een (pH 8,3) ja sekoitettiin edellä mainittuun vasta-aineeseen. Seosta sekoitettiin varovasti 4*C:ssa 4 h reaktion aikaansaamiseksi ja annettiin sitten seistä 4°C:ssa yön yli. AFFI-GEL 10 pestiin hyvin 0,1 M 35 NaHC03:lla (pH 8,3) lasisuodatinta käyttäen. Geeliin li-

(I

21 80293 sättiin 25 ml liuosta (pH 8,0), joka sisälsi 0,1 mol/1 etanoliamiinia ja 0,15 mol/1 NaCl. Seosta ravisteltiin 4°C:ssa 1 h mahdollisesti jäljellä olevien reagoimattomien ryhmien sitomiseksi. Sitten geeli pestiin hyvin PBS:llä 5 ja suspentoitiin 25 mitään PBS, joka sisälsi 0,1 % NaN3. Suspensio säilytettiin 4°C:ssa. Lisätyn vasta-ainemäärän ja kerätyssä suodoksessa olevan vasta-ainemäärän perusteella havaittiin, että vasta-ainemäärän sitoutui geeliin suhteessa 2,35 mg vasta-ainetta/1 ml geeliä. Tällä tavalla 10 saadulla tuotteella pakattiin pylväs ja käytettiin sitä vasta-ainepylväänä.

Esimerkki 11 rlFN-i^-tuotantoon käytettiin E.coli RR1:a (pRK248cIt. , pRC231 (IFI-900) (tämän yhdistelmäorganismin 15 muodostamista kuvataan yksityiskohtaisesti EP-hakemusjulkaisussa 99 084). Plasmidit pRK248cIte ja pRC231/IFI-900 sisälsivät lämpöherkän Lambda-repressorin geenin ja vastaavasti IFN- (-geenin. rlFN-^-geenin ilmentyminen oli PL-promoottorin kontrollin alainen.

20 E.coli RR1:a (pRK248cIt., pRC231/IFl-900) kasvatet tiin yön yli LB-liemessä 30°C:ssa. 1 1 yön yli kasvatettua viljelmää laimennettiin 10 l:ksi minimal M-9 -väliaineella, joka sisälsi kasaminohappoja. Logaritmisessa kasvuvaiheessa viljelmä siirrettiin 30eC:sta 42eC:seen ja se jat-25 koi kasvua 42°C:ssa 2-3 h. Bakteerit kerättiin sentrifu-goimalla ja bakteeripelletit säilytettiin -20°C:ssa käyttöön asti. Kaikki fermentoinnit ja muut menettelyt tehtiin the National Institutes of Healthin yhdistelmä-DNA -ohjeiden mukaan.

30 Edellä kuvatulla tavalla valmistettiin monoklonaa- lisia vasta-aineita rIFN-^:n synteettistä C-terminaalista 131-146 -peptidiä vastaan. Monoklonaalista vasta-ainetta Mo 211.1 käytettiin rIFN-^:n puhdistamiseen. Monoklonaalista vasta-ainetta sisältävä pylväs valmistettiin esimer-35 kissä 10 kuvatulla tavalla.

_______ - I- 22 80293 rIFN-/':n karboksimetylointi 1 * -C- jodietikkahapolla tehtiin 6 M guanidiinihydrokloridin läsnäollessa viitteen (3) mukaisesti. Ylimääräinen reagenssi poistettiin HPLC:llä C8-vastafaasipylväässä. Karboksipeptidaasihajotus 5 tehtiin 0,2 M NH4HC03:ssa viitteessä (4) kuvatulla tavalla.

rlFN-.'^"käsiteltiin CNBrrlla (100-kertainen mooli-ylimäärä metioniiniin nähden) 70 % muurahaishapossa viitteen (5) mukaisesti. CNBr-peptidi erotettiin HPLCrllä C-10 18 -vastafaasipylväässä. Peptidien eluointiin käytettiin lineaarista gradienttia 0 -♦ 70 % CH3CN 0,1 % trifluori- etikkahapossa.

Proteiini- tai peptidinäytteitä hydrolysoitiin 20-24 h suljetuissa, typellä huuhdotuissa, tyhjiksi imetyissä 15 putkissa vakiolämpötilassa kiehuvassa HCl:ssa, joka sisälsi 4 % tioglykolihappoa. Aminohappoanalyysit tehtiin käyttäen fluoresamiiniaminohappoanalysaattoria viitteessä (6) kuvatulla tavalla.

Karboksimetyloitujen proteiinien sekvenssianalyy-20 siin käytettiin ABI (Applied Biosystem, Inc.) -kaasufaa-sisekventoijaa 470 A viitteen (7) mukaisesti. PTH-amino-happonäytteet identifioitiin vastafaasi-HPLC:llä käyttäen Ultrasphere ODS-pylvästä viitteessä (8) kuvatulla tavalla.

Kaikki puhdistusvaiheet tehtiin 4°C:ssa. Pakastetut 25 solut (25 g) suspendoitiin kolminkertaiseen tilavuuteen (75 ml) 7 M guanidiinihydrokloridia (pH 7). Seosta sekoitettiin 1 h ja sentrifugoitiin sitten 1 h kiihtyvyydellä 30 000 x g. Supernatantti laimennettiin 10-kertaiseen tilavuuteen Dulbeccon fosfaattipuskuroidulla fysiologisella 30 suolaliuoksella (PBS) tai 0,15 M natriumboraattipuskurilla (pH 9,5) ja sentrifugoitiin sitten 30 min kiihtyvyydellä 30 000 x g. Vaihtoehtoisesti pakastetut solut (25 g) suspendoitiin 1,5-kertaiseen tilavuuteen (37,5 ml) 0,15 M natriumboraattipuskuria (pH 9,5) ja sentrifugoitiin sit-35 ten 1 h kiihtyvyydellä 30 000 x g. Joko guanidiinihydro- 23 80293 kloridiuutosta tai äänikäsittelystä saatua supernatanttia sekoitettiin 1 h pyörivässä ravistelijassa 25 ml:n kanssa piidioksidia ja esipestiin PBSillä. Seos kaadettiin pylvääseen ja pylväs huuhdottiin 20-30 -kertaisena tilavuu-5 della 1 M NaCl. Sitten pylväs eluoitiin 0,01 M natriumbo-raattipuskurilla, joka sisälsi 0,5 mol/1 tetrametyyliam-moniumkloridia (pH 8,0). Interferoniaktiivisuus eluoitui noin 200 ml:n aikana ja otettiin talteen 4 fraktiona. Kukin fraktio laitettiin monoklonaalista vasta-ainetta ( 2-10 11.1) sisältävään affiniteettipylvääseen (kerroksen tila vuus 4 ml), joka oli tasapainotettu PBS:llä. Kun kolonni oli pesty 10-kertaisella tilavuudellaan PBS-puskuria, se eluoitiin joko 1 M guanidiinihydrokloridilla tai 50 % ety-leeniglykolilla, joka sisälsi 1 mol/1 NaCl, ja 20 mM nat-15 riumfosfaattipuskurilla (pH 7,0). Interferoni eluoitui ensimmäisten 20 ml:n mukana.

SDS-PAGE tehtiin Laemmlin (viite 8) kuvaamalla tavalla. Proteiini määritettiin fluoresamiinianalyysillä käyttäen referenssiaineena kiteistä naudan seerumialbumii-20 nia. Interferoniaktiivisuus määritettiin sytopaattisen vaikutuksen estotestillä käyttäen rakkulaista suutulehdus-ta aiheuttavaa virusta ja ihmisen WISH-soluja viitteen (10) mukaisesti. Kaikki interferonitiitterit ilmoitetaan referenssiyksikköinä/ml kalibroituna regerenssiainetta 25 vastaan (osittain puhdistettu ihmisen immuuni-interferoni ).

Yhteenveto uutto-puhdistus -menettelystä esitetään taulukossa 6 (sivu 27 ). Kokonaissaanto oli 25 - 32 % ja puhdistuminen noin 100 - 769 -kertainen keskimääräisen 30 ominaisaktiivisuuden ollessa 1 x 107 yksikköä/mg. rlFN- n kokonaissaanto oli 3-4 kertaa suurempi käytettäessä guanidiiniuuttoa. Viimeisen puhdistusvaiheen SDS-PAGE esitetään kuviossa 1. Materiaalilla, joka oli puhdistettu guanidiiniuutteesta, esiintyi yksi vyöhyke noin 18 000 35 daltonin kohdalla ( 18 K:n rlFN-^), kun taas materiaali!- 24 80293 la, joka saatiin äänikäsittelystä, esiintyi päävyöhyke noin 15 000 daltönin kohdalla (15 K:n rlFN-fr) ja pienempi vyöhyke noin 17 000 daltonin kohdalla (kuvio IA). Ei-pelkistävällä geelillä muodostui rlFN-^:n dimeerejä ja 5 oligomeerejä (kuvio IB).

18 K:n rlFN-^" oli homogeenista ja aminohappokoostumus sopi yhteen DNA-jakson perusteella ennustetun kanssa. 15 ja 18 K:n rIFN-^:n aminohappokoostumus annetaan taulukossa 7. Usealle sadalle pikomoolille pelkistettyä 10 ja karboksimetyloitua 15 ja 18 K:n proteiinia tapahtui

Edman-hajoaminen automaattisessa proteiini/peptidi -kaa-sufaasisekventoijassa. 15 ja 18 K:n proteiinin 32 ja vastaavasti 26 ensimmäistä tähdettä sisältävä N-terminaalinen aminohappoketju oli DNA-jakson perusteella ennustetun mu-15 kainen (kuvio 2). 14C-karboksimetyloidut kysteiinit havaittiin sekvenssianalyysien ensimmäisessä ja kolmannessa syklissä. N-terminaalista metioniinia ei havaittu. 18 ja 15 K:n rIFN-^:n N-terminaalinen sekvenssianalyysi osoitti, että aminohappojärjestys kummankin proteiinin tällä alu-20 eella vastaa DNA-jakson perusteella ennustettua. Myös C-terminaaliset peptidit on karakterisoitu sen määrittämiseksi, onko tällä alueella tapahtunut poistumisia tai muutoksia. Karboksipeptidaasi A (CPA) -pilkkomisseoksen ami-nohappoanalyysi osoitti, että seriiniä ja/tai glutamiinia 25 (C-terminaalisia amino-happoja) vapautui 18 K:n rlFN-^ :sta, kun taas 15 K:n rlFN-/" ei pilkkounut CPA:n vaikutuksesta samoissa olosuhteissa. Koska Ser-Gln on rIFN-^:n C-terminaalinen jakso, ilmeni, että 18 K:n lajilla on muuttumaton C-pää, kun taas 15 K:n lajilla on erilainen C-30 terminaalinen tähde (Lys), joka ei lohkea CPA:11a.

DNA-jakson perusteella ennustetut C-terminaaliset tähteet varmistettiin lisäksi analysoimalla ja sekventoi-malla C-terminaaliset peptidit CNBr-käsittelyn jälkeen. C-terminaaliset peptidit erotettiin HPLC:llä käyttäen C-35 18 -vastafaasikolonnia (kuvio 3). 15 K:n rIFN-^:sta saa- 25 80293 tiin terävä peptidipiikki (piikki II), joka eluoitui gradientin alkuosassa, ja tämä peptidi puuttui 18 K:n rlFN-/:n CNBr-pilkkomisseoksesta. Tämän peptidin aminohappoana-lyysi osoitti, ettei tässä peptidissä ollut homoseriiniä 5 tai homoseriinilaktonia ja sen täytyy siksi olla 15 K:n proteiinin C-terminaalinen CNBr-peptidi. Aminohappoanalyy-sin perusteella (taulukko 8) tämä peptidi vastasi IFN-,])Sn aminohappotähteitä 121 - 131 (arginiinia ei ollut havaittavissa). Näiden 11 aminohapon järjestys varmistettiin 10 sekvenssianalyysillä (kuvio 2). 18 K:n rIFN-'l:n ollessa kyseessä havaittiin suhteellisen leveä piikki eluution alkuvaiheessa. Tämä piikki jakautui lisäksi kahdeksi piikiksi kapeaa gradienttia käytettäessä. Aminohappoanalyy-sit osoittivat, että ensimmäinen piikki on 18 K:n proteii-15 nin C-terminaalinen CNBr-peptidi (taulukko 8) ja että aminohappokoostumus vastaa aminohappotähteitä 138-146. Näiden 9 aminohapon järjestys varmistettiin sekvenssimäärityksel-lä (kuvio 2). 15 K:n proteiinin C-terminaalisen aminohapon määritettiin olevan lysiini.

20 Nämä tulokset osoittavat, että 18 K:n laji oli muuttumaton rIFN-^-molekyyli, kun taas 15 K:n laji oli proteolyysituote. Peptidisidos aminohappotähteiden 131 ja 132 (Lys-Arg) välillä oli katkennut 15 K:n lajissa. Esimerkki 12 25 Trypsiinikäsittelyn 18 K:n rlFN-j^jn peptidikartta

Tehtiin trypsiinikäsitellyn 18 K:n rlFN-^:n pep-tidikartoitus. 18 K:n rlFN-V* (43 pg) pilkottiin TPCK-tryp-siinillä (1,1 pg, Worthington, USA) 37°C:ssa 18 h 147 pl:ssa 24 mM ammoniumasetaatti-NaOH -puskuria (pH 30 8,0). Pilkkomisseokseen lisättiin 0,6 pl 2-merkaptoetano- lia ja inkubointia jatkettiin 2 h. Reaktion päättämiseksi lisättiin 53 pl % trifluorietikkahappoa (TFA). Koko pilkottu näyte käsiteltiin kromatografisesti Ultrasphere-oc-tylpylväässä (5 pm, 4,6 x 250 nm, Altex, USA), joka oli 35 tasapainotettu 0,02 % TFA - 5 % CH3CN:llä. Eluointi teh- 26 80293 tiin nopeudella 1,0 ml/min käyttäen lineaarista gradient-tia 5 -+ 70 % CH3 CN 30°C:ssa. Effluenttia seurattiin fluo-rimetrisesti fluoresamiinia käyttäen. Saatu kartta on kuviossa 4.

5 Esimerkki 13 18 K:n rlFN-^Sn C-terminaalisen aminohapon määritys 18 K:n rIFN-^:n C-terminaalinen aminohappo määritettiin hydratsinolyysillä Narita'n et ai. [J. Biochem. (Tokio) 59 (1966) 170] mukaan. 18 K:n rlFN- (185 pg) pi-10 dettiin 100°C:ssa 6 h vedettömän hydratsiinin läsnäollessa. Kylmäkuivattu hydratsinolysaatti liuotettiin veteen ja lisättiin bentsaldehydiä. Seosta ravisteltiin voimakkaasti 1 h huoneen lämpötilassa ja sentrifugoitiin sitten. Super-natantti kylmäkuivattiin ja sille tehtiin aminohappoana-15 lyysi. Aminohappoja ei kuitenkaan havaittu. Tämä tulos sopii yhteen sen kanssa, että 18 K:n lajin C-terminaalinen aminohappo on glutamiini.

Katso taulukot 6-8 sivuilla 27-29.

Il 27 8 0 2 9 3

Taulukko 6 rIFN-^:n puhdistus

Kokonais- Kokonais- Ominais- Puhdistu-Puhdistus- proteiini 'aktiivi- aktiivi- ir.inen Saanto 5 vaihe mg suus suus (-kertai- * (yks) yks/mg nen)

Guanidiiniuutto

Supernatantti 2 ,806 2,5xl08 9xl04 - 100

Piidioksidi 98 1,0x10 1x10 11 40 10 Monoklonaalinen vasta-aine 8 0,8xl08 lxlO7 110 32 jj Äänikäsittelv

Supernatantti6.136 8f0xl07 l,3xl04 - 100 15 Piidioksidi 87 4r5xl0? 5,2xl06 400 56 MÖnoklonaalinen vasta-aine 2 2,0xl07 Ι,ΟχΙΟ7 769 25 28 80293

Taulukko 7 15 K:n ja 18 Κ:η rlFN- ^:η aminohappokoostumus (Tähteiden lukumäärä) 5 18K (1-146) 15K (1-1311

Asp 20,9 (20) 19,9 (20)

Thr 5,1 (5) 4,9 (5)

Ser 9,8 (11) 6,7 (9)

Glu 18,5 (18) 15,1 (16) 10 P^o * (2) * (2)

Gly 5,9 (5) 5,6 (4)

Ala 8,2 (8) 7,3 (7) cys * (2) * (2)

Vai 9,1 (8) 9,1 (8)

Met 4,7 (4) 3,8 (3)

He 7,2 (7) 6,6 (7)

Leu 10,5 (10) 9,6 (9)

Tyr 5,5 (5) 4,8 (5)

Phe 10,3 (10) 8,2 (9) 2Q His 1,8 (2) 2,5 (2)

Lys 19,9 (20) 16,9 (19)

Arg 8,6 (8) 5,6 (3)

Trp * (1) * (1) 25 Suluissa olevat luvut ilmoittavat DNA-jakson perusteella ennustetun tähteiden määrän.

* Ei määritetty.

Il 29 80293

Taulukko 8 15 Km ja 18 K:n proteiinien C-terminaaliset CNBr-peptiöit

15K 18K

Thr 0,9 (1) 5 Ser 1,1 (l) 0;84 (l) 1,1 (1) 1,1 (1)

Pro * (1) SIV 1,5 (1) 1,3 (1)

Aia 2,4 (3) 1,1 (i) 10 Leu 1,0 (1) 1,1 (i)

Phe 1/0 (1)

Lys 1,9 (2) 2,8 (3)

Sijainti ketjussa 121-131 138-146 15

Suluissa olevat luvut ilmoittavat DNA-jakson perusteella ennustetun tähteiden määrän.

* Ei määritetty.

30 80293

Kirjallisuus: 1. Gray, P.W., et ai.. Nature 295. 503-508 (1982) 2. Stahelin. T.. et ai., J. Biol. Chem. 256. 9750-9754 (1981) 5 3. Allen. G., Sequencing of Protein and Peptides, pp.

30-31 (1981). North-Holland Publishing Co., Amsterdam. New York 4. Amber. R.P., Methods in Enzymology .11.. 436-445 (1967) 5. Wolfe. R.A. ja Stein. S.. Modern Methods in Pharma- 10 cology, pp. 55-77 (1982), Alan R. Liss, Inc.. New York, NY.

6. Stein, S. ja Brink, L., Methods in Enzymology, 79. 20-25 (1981) 7. Hewick, R.M., Hunkapillar. M.W., Hodd. L.E. ja Dreyer.

15 W.I.. J. Biol. Chem. 256. 7990-7997 (1981) 8. Hawke. D., Yuan. P-M., and Shively. J.E., Anal. Bio-chem. 120, 302-311 (1982) 9. Laemmli, U.K.. Nature 227. 680-685 (1970) 10. Rubinstein. S.. Familletti, P.C.. ja Pestka. S.. J.

20 Virol. 37. 755-758 (1981).

II

Claims (3)

3i 80293 Patentt ivaat imukset

1. Menetelmä ihmisen muuttumattoman yhdistelmäim-muuni-interferonin, jolla on seuraava aminohappojärjestys, 5 Cys Tyr Cys Gin Asp Pro Tyr Vai Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Vai Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met

10 Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gin Ser Ile Gin Lys Ser Vai Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Vai Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Vai Thr Asp Leu Asn Vai

15 Gin Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gin Vai Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gin 20 joka aminohappoketju voi mahdollisesti sisältää ylimääräisen metioniiniryhmän aminopäässään, joka interferoni on suurin piirtein vapaa proteolyysifragmenteistaan, tuottamiseksi tätä proteiinia sisältävistä transformoiduista E. coli-soluista, tunnettu siitä, että suspendoidaan 25 transformoidut E. coli-solut 3 - 7 M guanidiniumsuola- liuokseen ja puhdistetaan ihmisen yhdistelmäimmuuni-inter-feroni uutteen supernatantista käyttämällä ihmisen yhdis-telmä-immuuni-interferonin karboksipäätteisen peptidin vastaista monoklonaalista vasta-ainetta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että guanidiniumsuola on guanidii-nihydrokloridi.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että guanidiniumsuolaliuosta käyte-35 tään vähintään noin 3-kertainen tilavuus kutakin grammaa kohden transformoituja E. coli-soluja. 32 80293