FI78117C - Foerfarande foer framstaellning av ett stabilt glukosisomeraskoncentrat. - Google Patents

Description

1 78117

Menetelmä stabiilin glukoosi-isomeraasikonsentraatin valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää kirkkaan liuoksen muodos-5 sa olevan stabiilin glukoosi-isomeraasikonsentraatin valmistamiseksi. Keksinnön mukaisesti saatava konsentraatti on kemiallisesti ja mikrobiologisesti stabiili ilman mikro-bisideja ja se sopii sellaisenaan hyvin käytettäväksi entsyymin sitomiseen kantajamateriaaliin reaktiokolonnissa.

10 Glukoosi-isomeraasin käyttö glukoosin isomeroimisek- si fruktoosiksi on tunnettu teollinen prosessi, jossa entsyymiä käytetään aina sidotussa muodossa. Kaikissa käytössä olevissa teknisissä prosesseissa sidottu entsyymivalmiste valmistetaan erillisenä prosessina, jossa joko entsyymi si-15 dotaan kantajaan adsorptiotekniikalla tai koko mikrobiso-lumassa entsyymeineen sidotaan matriisiksi. Reaktiokolonni täytetään valmiilla sidotulla entsyymillä. Kun entsyymi on kulutettu loppuun, tyhjennetään kolonni ja täytetään uudelleen tuoreella sidotulla entsyymivalmisteella.

20 On selvää, että jos kolonnissa inaktivoitunut entsyy mi voidaan korvata uudella entsyymillä tavallista regene-rointitekniikkaa käyttäen, on saavutettavissa huomattavia säästöjä. Kantaja-aineen kulutus pienenee ja lisäksi vältetään sidotun entsyymin valmistuksen yhteydessä tapahtuva 25 aktiivisuushäviö. Kun entsyymi sidotaan kantajaan suoraan kolonnissa, ei tarvita kuivausta eikä mekaanista käsittelyä, jossa entsyymiä aina jonkin verran tuhoutuu.

On tunnettua, että puhdas entsyymi sitoutuu kantajaan paljon paremmin kuin puhdistamaton raakavalmiste (US-30 patentti 4 347 322). Ongelmana on ollut valmistaa sellainen stabiili, helposti käsiteltävä ja varastoitava entsyymival-miste, joka voidaan käyttää suoraan entsyymin sitomiseen kantajaan kolonnissa.

Saostamiseen tai kiteyttämiseen perustuvista glu-35 koosi-isomeraasin puhdistusprosesseista saatava saostuma tai kidemassa sisältää vähintään 60 paino-% vettä, jota ei 2 78117 voida poistaa, ilman että entsyymirakenne tuhoutuu. Kidemas-sa sellaisenaan ei ole mikrobiologisesti stabiili, se on hankala käsitellä ja annostella. Vaihtoehtona on kidemassan liuottaminen liuokseksi, joka varastointia, säilyvyyttä ja 5 kuljetuksia ajatellen on edullista valmistaa mahdollisimman konsentroituna. Luonnollisin tapa on liuottaa entsyymikiteet veteen tai laimeaan suolaliuokseen. Käytännössä on kuitenkin havaittu, että suhteellisen alhaisen liukoisuuden vuoksi isomeraasista ei ole mahdollista valmistaa riittävän väke-10 vää liuosta liuottamalla kiteitä veteen. Isomeraasin laimea vesiliuos on erittäin huonosti säilyvä ja menettää aktiivisuutensa mikrobiologisen ja kemiallisen pilaantumisen johdosta muutamassa päivässä.

On myös ehdotettu entsyymin liuottamista orgaaniseen 15 liuottimeen (US-patentti 4 077 842). Elintarviketuotantopro-sessissa orgaanisten liuottimien käyttö ei kuitenkaan ole suositeltavaa, joten tämä tekniikka soveltuu huonosti entsyymiin, jota käytetään suoraan elintarvikkeen valmistukseen.

Glukoosi-isomeraasin valmistusta, puhdistamista ja 20 käyttöä koskevaa kirjallisuutta on hyvin runsaasti johtuen siitä, että glukoosi-isomeraasi on eräs tärkeimmistä nykyään käytössä olevista entsyymeistä. Kuitenkin kaikki julkaistut puhdistusmenetelmät ovat varsin mutkikkaita ja johtavat yleen-; sä melko pieniin saantoihin.

25 Entsyymien ja proteiinien puhdistaminen kiteyttämällä on sinänsä hyvin tunnettua ja esimerkiksi käsikirjassa Enzymes (Dixon, M. and Webb, E.C., Enzymes, 3rd ed., Longman Group Ltd., Bungay 1979, 1116 p.) esitetään 192 valokuvaa entsyymikiteistä. Lisäksi tiedetään, että ammoniumsulfaatti 30 soveltuu useissa tapauksissa kiteyttämisen aikaansaavaksi liukoisuutta alentavaksi aineeksi. Ammoniumsulfaatin lisäksi voidaan kiteyttäminen usein suorittaa jollain muulla suolalla tai orgaanisella liuottimella, kuten asetonilla tai alkoholilla. Tällä kemian alalla on kuitenkin yleisesti tunnus-35 tettu, että ei ole koskaan itsestään selvää, että isomeraasi tai mikään muukaan proteiini kiteytyy jollain sinänsä hyvin

II

3 78117 tunnetulla saostimella. Tunnetaan lukuisia proteiineja ja entsyymejä, joita ei ole vielä onnistuttu kiteyttämään, vaikka biokemian puhdistusmenetelmät ovat kehittyneet huimasti.

Fraktioivan sulfaattisaostuksen (ammonium- ja/tai mag-5 nesiumsulfaatti) käyttö glukoosi-isomeraasien puhdistusmenetelmänä tai sen osana tunnetaan useista julkaisuista (US-pa-tentti 4 237 231, US-patentti 4 077 842, Agr. Biol. Chem.

45 (1981) 619-627, sama 28 (1965) 1123-1128, sama 34 (1970) 1795-1804, sama 29 (1965) 1 129-1134, Biochem. Biophys. Acta 10 151 (1968) 670-680).

Näissä isomeraasien puhdistusmenetelmissä käytetyt liuosten sulfaattipitoisuudet ovat tavallisesti olleet suhteellisen korkeita. Esimerkiksi US-patentin 4 237 231 mukaisessa menetelmässä isomeraasiliuoksesta saostetaan ensin 15 tarpeettomat proteiinit ammoniumsulfaatin kyllästysasteella 40 % (noin 240 g (NH^^SO^ litrassa liuosta), minkä jälkeen korkeammalla kyllästysasteella (aina 60 % saakka) saostetaan itse isomeraasi.

Kun fraktioivassa saostuksessa käytetään korkeita am-20 moniumsulfaattipitoisuuksia, saostuu isomeraasin mukana aina runsaasti muita proteiineja sitä enemmän, mitä korkeampaa ammoniumsulfaattipitoisuutta käytetään ellei isomeraasia ole jollain tavoin jo ennakolta puhdistettu muulla menetelmällä.

Fraktioivaan saostukseen perustuvissa puhdistusmene-25 telmissä on tuloksena tavallisesti amorfinen sakka, joka on hyvin vaikeaa tai jopa mahdotonta erottaa emäliuoksesta hyvällä saannolla teollisuuskäyttöön tarkoitetuilla sentrifu-geilla tai separaattoreilla.

Amorfinen sakka on yleensä sekasaostuma, joka sisältää 30 isomeraasin lisäksi muita proteiineja, jos raaka-aine on ennalta puhdistamaton mikrobisoluneste. Tällainen amorfinen sakka on vaikea erottaa emäliuoksesta ja saostuksella ei saavuteta tavoiteltua puhdistusvaikutusta isomeraasin suhteen.

35 Glukoosi-isomeraasien kiteytyksiä ammoniumsulfaatin, muiden suolojen tai orgaanisten liuottimien avulla on esi- 4 78117 tetty joissakin julkaisuissa (Biochem. Biophys. Acta 151 (1968) 670-680, Agr. Biol. Chem. 34 (1970) 1795-1804, sama 45 (1981) 619-627, sama 33 (1969) 1527-1534). Näissä julkaisuissa esitetyille kiteytysmenetelmille ominaisia seikkoja 5 ovat alhainen saanto, hyvin pitkä kiteytysaika tai suhteellisen suuri kemikaalikulutus. Kaikissa tapauksissa tavoitteena on ollut valmistaa pieni määrä puhdasta isomeraasia perustutkimustarkoituksiin. Tällöin isomeraasi on ensin puhdistettu jollakin menetelmillä (uutto orgaanisella liuotti-10 mella, DEAE-Sephadex-kolonnikromatografia, ammoniumsulfaat-tisaostus, dialyysi), jonka jälkeen on suoritettu puhdistetun isomeraasin kiteyttäminen puhtaasta vesiliuoksesta ammoniumsulfaatilla, fosfaattipuskurilla tai asetonilla.

Mitään edellä mainituissa julkaisuissa kuvattua me-15 netelmää ei ole käytetty teollisessa mittakaavassa niiden epäedullisuuden vuoksi.

On havaittu, että keksinnön mukaisesti saatava kon-sentraatti on sekä kemiallisesti että mikrobiologisesti stabiili ja sopii erittäin hyvin käytettäväksi prosesseissa, 20 joissa glukoosi-isomeraasien sitominen kantajamateriaaliin tapahtuu regenerointitekniikalla reaktorikolonnissa. Erityisen sopivia sokereita ja sokerialkoholeja ovat sellaisenaan elintarvikkeina käytettävät sokerit ja elintarvikkeissa sallitut sokerialkoholit. Koska isomeroinnissa loppu-25 tuotteena on glukoosi-fruktoosisiirappi, soveltuu näiden so- kereiden seos eli invertterisokeri tarkoitukseen erinomaisesti.

Konsentraatin sisältämän kokonaiskuiva-aineen tulee olla sellainen, että se on itsestään mikrobiologisesti stabiili, ts. kuiva-ainepitoisuuden tulisi olla noin 60-70 pai-30 no-% (veden aktiivisuuden tulee olla riittävän pieni).

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu glu-koosi-isomeraasikonsentraatti sisältää edullisesti 5-15 paino-% glukoosi-isomeraasia, 30-60 paino-% sokeria tai so-kerialkoholia, kuten glukoosia, maltoosia, fruktoosia, sak-35 karoosia, sorbitolia, ksylitolia tai näiden seosta, esim. inverttisokeria, glukoosisiirappia tai isomeroitua glu-koosisiirappia, enintään 15 paino-% ammonium- ja/tai mag- 5 78117 nesiumsulfaattia ja loput vettä.

Konsentraatin pH on edullisesti 6,0-8,0 ja entsyymi-aktiivisuus on 2000-5000 (GlU/g konsentraattia (GIU = glucose isomerase units).

5 Seuraavassa on esitetty esimerkkejä sopivasta keksinnön mukaisesti valmistetuista entsyymikonsentraateista: 1. 50 paino-% invertterisokeria 30 paino-% vettä 15 paino-% entsyymiä 10 1 paino-% puskuria (Na-K-fosfaatti) 4 paino-% ammoniumsulfaattia 2. 50 paino-% sorbitolia 40 paino-% vettä 10 paino-% entsyymiä 15 Konsentraatin koostumusta voidaan kuitenkin vaihdel la tarpeen mukaan pitäen huolta siitä, että kokonaisväke-vyys on riittävän suuri ja liuos kuitenkin juokseva ja helposti käsiteltävissä.

Keksinnön mukaisesti saadut glukoosi-isomeraasikonsent-20 raatit ovat puhtaita, säilyviä ja helposti annosteltavia.

: Entsyymiaktiivisuus on säädeltävissä. Käytön kannalta sopi va aktiivisuusalue on 2000-5000 GlU/g valmistetta.

Käytetyt sokerit, sokerialkoholit ja suolat ovat mieluimmin elintarvikelaatua (esimerkiksi Food Chemicals Codes 25 -standardi). Entsyymin tulee olla kiteyttämällä riittävästi puhdistettu.

Glukoosi-isomeraasi on konsentraatista helposti sidottavissa suoraan reaktorikolonnissa olevaan kantaja-aineeseen. Konsentraatti laimennetaan vedellä ja laimea liuos 30 syötetään kolonniin, jolloin entsyymi sitoutuu kantajaan. Tekniikka muistuttaa ioninvaihtokolonnin regenerointia.

Kun entsyymi on käytetty ja siten inaktivoitunut, proteiini pestään pois kolonnista alkalilla, minkä jälkeen tuore entsyymi voidaan syöttää kolonniin sen regeneroimiseksi.

35 Kantaja-aineeksi sopii anioninvaihtokapasiteettia omaava materiaalia, esimerkiksi lasipalloset, ioninvaihto- 6 78117 hartsi tai piidioksidipohjainen kantaja. Erityisen sopivia ovat proteiineja absorboivat dietyyliaminoetyyli (DEAE)-johdannaiset, kuten DEAE-sellu ja DEAE-dekstraani. Kirjallisuudessa on esitetty useita tarkoitukseen sopivia 5 kantajamateriaaleja.

Käytettäessä kantajana DEAE-sellua, saavutetaan helposti yli 1000 IGIU/g sidottua entsyymiä aktiivisuusko-lonnissa (IGIU = immobilized glucose isomerase aktivity).

Glukoosi-isomeraasin saostaminen suolalla on sinän-10 sä konventionaalinen ja kuvattu esim. julkaisussa Agr. Biol. Chem. 29 (1965) s. 1129-1134 (Isumure ja Sato).

Aikaisemmin ei kuitenkaan ole esitetty menetelmää, jossa tapahtuu varsinainen kiteiden muodostus. Esitetyissä menetelmissä muodostuu amorfinen sakka.

15 Olosuhteista riippuen isomeraasista voidaan aikaan saada joko amorfinen saostuma tai kiteinen saostuma saunaa kemikaalia, ammoniumsulfaattia tai magnesiumsulfaattia käyttämällä. On yleisesti tunnettua, että lukuisat entsyymit käyttäytyvät samalla tavoin.

20 Keksinnön mukaiselle menetelmälle on ominaista ja yllättävää, että isomeraasi saostuu kiteisenä aineena ja ennen kaikkia muita mahdollisesti saostuvia aineita. Menetelmässä käytetään tarkoin valittuja olosuhteita ja niin alhaista ammoniumsulfaattipitoisuutta, että mitään : . 25 muita aineita ei liuoksesta saostu. Tässä suhteessa mene- telmä erottuu oleellisesti kaikesta mitä alan kirjallisuudessa on aiemmin esitetty. Aikaisemmin ei isomeraasia ole kiteytetty suoraan ja yksinään ainoana saostuvana komponenttina tuotantomikrobin solunesteestä tai solunesteen 30 konsentraatista. Menetelmällä saavutetaan myös erittäin hyvä saanto, mikä poikkeaa oleellisesti aikaisemmin julkaistusta.

Yleisesti tunnettua on, että entsyymivalmisteiden säilyvyyttä ja stabiilisuutta voidaan lisätä esimerkiksi 35 glyserolilla, polyalkoholeilla ja sokereilla. Tällaiset V 78117 entsyymivalmisteet tehdään tavallisesti lisäämällä väkevään entsyymiliuokseen kyseisiä aineita.

On yllättävästi voitu havaita, että sekoitettaessa kuivaa vedetöntä sokerialkoholia tai sokeria (erikoi-5 sesti glukoosia) väkevään isomeraasikidelietteeseen tai kiinteään kidemassaan, jonka korkein mahdollinen aktiivisuus on noin 10 000 GlU/g, liukenevat isomeraasikiteet ja syntyy aito kirkas liuos. Tällainen liuos on stabiili silloin, kun sen vesipitoisuus on riittävän alhainen ja iso-10 meraasiaktiivisuus riittävän suuri. Sokerialkoholilla tai sokerilla on oleellinen merkitys isomeraasikiteiden liuotuksen kannalta, jotta voidaan saavuttaa mahdollisimman korkea isomeraasiaktiivisuus liuokselle.

Aikaisemmin ei ole esitetty esimerkkejä isomeraa-15 siliuoksista, joiden entsymaattinen aktiivisuus olisi niin korkea kuin po. keksinnön mukaisesti valmistetussa tuotteessa eikä menetelmiä valmistaa tällaisia liuoksia.

Glukoosi-isomeraasikonsentraatin valmistus suoritetaan edullisesti seuraavasti: 20 a) Valmistetaan Streptomyces rubiginosus -organis mista lysoimalla soluneste (US-patentti 4 410 627) ja siitä ultrasuodattamalla isomeraasipitoinen konsentraat-ti raaka-aineeksi kiteytysprosessiin; konsentraatin edullinen isomeraasipitoisuus on 200 - 800 GlU/g.

25 b) Säädetään isomeraasiliuoksen pH alueelle 5,7 - 8,0, edullisesti arvoon pH 7,0.

c) Jäähdytetään liuos lämpötilaan 16°C tai sen alle.

d) Lisätään liuokseen ammonium- ja/tai magnesium-30 sulfaattia 50-170 g litraan liuosta. Lisättävä sulfaatti- määrä riippuu alkuperäisestä isomeraasipitoisuudesta ja kiteytyksen lämpötilasta. Edullisin lisättävä sulfaat-timäärä on sellainen, jolla vain isomeraasi kiteytyy, mutta muut proteiinit eivät vielä ala saostua.

35 e) Sulfaattien lisäys suoritetaan edullisesti vä- e 78117 hitellen lisäämällä siten, että koko annoksen lisäämiseen kuluu aikaa 2-4 tuntia, tosin äkillisellä lisäykselläkin voidaan aikaansaada käyttökelpoinen tulos, mutta silloin isomeraasikiteiden koko jää epädullisen pieneksi.

5 f) Jäähdytetään luos edullisesti usean tunnin ai kana mieluimmin lähelle kyseisen seoksen jäätymispistettä, joka alhaisimmilla kokeilluilla sulfaattipitoisuuk-silla on noin -2°C ja korkeimmilla -6°C, jäähdytys voidaan aloittaa joko samanaikaisesti sulfaattilisäyksen 10 aloittamisen kanssa tai vasta sen päätyttyä, asteittaisella jäähdytyksellä saadaan aikaan jäähdytyskiteytysefekti, joka kasvattaa edullisesti isomeraasikiteiden kokoa sen lisäksi, että jäähdytyksellä on liukoisuutta alentava vaikutus, mikä puolestaan parantaa saantoa.

15 g) Isomeraasikiteet erotetaan liuoksesta laskeut- tamalla ne astian pohjalle, suodattamalla tai suuressa mitassa edullisimmin sentrifugoimalla jatkuvatoimisella separaattorilla.

h) Erotettu kidemassa liuotetaan lisäämällä sii-20 hen kuivaa sokeria tai sokerialkoholia tai niiden väkevää vesiliuosta, jolloin isomeraasikiteet liukenevat ja syntyy stabiili glukoosi-isomeraasikonsentraatti.

Haluttaessa kiteyttäminen voidaan toistaa, jolloin kidemassa täytyy liuottaa erottamisen jälkeen (vai-25 he g) runsaaseen vesimäärään korkeahkossa lämpötilassa (20-30°C). Sopiva vesimäärä on tällöin sellainen, että liuoksen isomeraasiaktiivisuus on 500 - 2 000 GIU/ml, toisin sanoen vettä on käytetty tyypillisesti 4-10 -kertainen painomäärä kidemassaan verrattuna.

30 Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

9 781 1 7

Esimerkki 1

Streptomyces rubiginosus -mikrobia fermentoitiin aiemmin tunnetulla (viite US 4 410 627) tavalla n. 40 m3 erä. Solumassa lysoitiin tunnetulla tavalla (viite sama). Solu-5 jätteet ja muu kiintoaines poistettiin suodattamalla tavanomaisella piimaarumpusuotimella, jolloin saatiin 32 tonnia isomeraasipitoista suodosta. Tämä suodos suodatettiin PCI (Patterson-Candy Inc.) -ultrasuotimella, jolloin saatiin 3 000 kg isomeraasipitoista konsentraattia, jonka aktiivi-10 suus oli 960 000 000 GIU. Ultrasuodatuskalvon läpi mennyt permeaatti poistettiin.

Konsentraattiin lisättiin 120 kg magnesiumsulfaattia ja 300 kg ammoniumsulfaattia (MgSO^VI^O ja (NH^^SO^, elin-tarvikelaatu). Seosta jäähdytettiin 10°C lämpötilaan kitey-15 tymisen edistämiseksi. Muodostuneet kiteet erotettiin de-kantoimalla ja kiteytys toistettiin lisäämällä 411 kg vettä sekä 17 kg magnesiumsulfaattia ja 41 kg ammoniumsulfaattia. Kiteet erotettiin jälleen dekantoimalla. Kidemassa liuotettiin lisäämällä 402 kg vettä ja liuoksen pH säädettiin 1 M 20 ammoniakkiliuoksella arvoon 6,5. Liuos suodatettiin levysuo-timella ja kiteytys toistettiin vielä kerran käyttäen 16 kg magnesium- ja 40 kg ammoniumsulfaattia.

Saaliiksi saatiin 90 kg kidemassaa, josta 29 kg oli entsyymiä, 3,7 kg suoloja (MgSO^, (NH,j)2S04) ja loput vettä. 25 Kidemassaan lisättiin 45 kg glukoosia ja 45 kg fruktoosia sekä 20 kg inverttisokeria, jonka kuiva-ainepitoisuus oli 70 paino-%. Näin saatiin 200 kg entsyymivalmistetta, jonka koostumus oli seuraava: 29,2 paino-% vettä 30 52,0 paino-% sokereita 14,5 paino-% glukoosi-isomeraasia 4,3 paino-% suoloja (magnesium-ammonium-sulfaatti)

Entsyymikonsentraatin glukoosi-isomeraasiaktiivisuus oli 4 500 GlU/g.

10 781 1 7

Esimerkki 2

Ultrasuodatettu fermentaatti valmistettiin esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. 4 000 kg:aan ultrasuodatettua fer-mentaattia lisättiin 244 kg kiteistä ammoniumsulfaattia ja 5 sen jälkeen ammoniumsulfaattiliuosta, jossa 600 kg suolaa oli liuotettu 900 kg:aan vettä. Liuos jäähdytettiin 13°C:seen ja pidettiin tässä lämpötilassa 20 tuntia. Muodostunut kide-massa erotettiin Westfalia ΝΑ 7 -separaattorilla. Kiteet liuotettiin veteen ja liuos suodatettiin. Suodosta oli 2 000 10 litraa. Kiteytys toistettiin käyttäen 122 kg kiteistä ammoniumsulf aattia ja ammoniumsulfaattiliuosta/ joka sisälsi 300 kg ammoniumsulfaattia liuotettuna 460 litraan vettä.

Saatu kidemassa erotettiin jälleen separaattorilla. Kidemas-saan (525 kg) lisättiin saman verran kiteistä fruktoosia, 15 jolloin massa liukeni ja fruktoosi isomeroitui osittain glukoosiksi. Näin saatiin stabiili entsyymikonsentraatti, jonka koostumus oli seuraava:

Sokereita (glukoosi + fruktoosi) 50,0 paino-%

Entsyymiä 11,2 paino-% 20 Ammoniumsulfaattia 3,5 paino-%

Vettä 35,3 paino-%

Konsentraatin glukoosi-isomeraasiaktiivisuus oli 3 000 GIU grammaa kohti.

Esimerkki 3 25 Ultrasuodatettu fermentaatti valmistettiin esimer kissä 1 esitetyllä tavalla. Glukoosi-isomeraasin kiteytykseen käytettiin 4 000 litraa ultrasuodatettua fermentaat-tia, jonka aktiivisuus oli 2 400 000 000 GIU. Liuoksen pH säädettiin 5 %:n NaOH-liuoksella arvoon 7,0 ja liuoksen läm-30 pötila säädettiin arvoon 12^C. Glukoosi-isomeraasin kiteyt-tämiseksi liuokseen lisättiin kahden tunnin aikana tasaisella syöttönopeudella 500 kg ammoniumsulfaattia liuotettuna 750 litraan vettä. Sitten liuos jäähdytettiin -2°C:n lämpötilaan ja liuosta sekoitettiin yhden vuorokauden ajan.

35 Glukoosi-isomeraasikiteet erotettiin Westfalia NA-7 -separaattorilla. Saaliiksi saatiin 390 kg kidemassaa, jonka li 11 78117 kuiva-aine oli 23,6 paino-% ja aktiivisuus 2 300 000 000 GIU. Kidemassaan lisättiin 30 kg natriumkloridia ja 180 kg glukoosia ja saadun entsyymikonsentraatin pH säädettiin 5 %:n NaOH liuoksella arvoon 7,0. (glukoosi isomeroitui osittain) 5 Tällä tavoin saatiin 600 kg stabiilia entsyymikonsentraattia, jonka koostumus oli seuraava: 49.7 paino-% vettä 30.0 paino-% sokereita 12.8 paino-% entsyymiä 10 2,5 paino-% ammoniumsulfaattia 5,0 paino-% natriumkloridia

Entsyymikonsentraatin glukoosi-isomeraasiaktiivisuus oli 3 400 GlU/g.

Esimerkki 4 15 Ultrasuodatettu fermentaatti valmistettiin esimerkis sä 1 esitetyllä tavalla. Glukoosi-isomeraasin kiteytykseen käytettiin 4 000 litraa ultrasuodatettua fermentaattia, jonka aktiivisuus oli 2 400 000 000 GIU. Liuoksen pH säädettiin 5 %:n NaOH-liuoksella arvoon 7,0. Liuoksen lämpötila säädet-20 tiin arvoon 12°C. Glukoosi-isomeraasin kiteyttämiseksi liuokseen lisättiin kahden tunnin aikana tasaisella syöttönopeu-della 500 kg ammoniumsulfaattia liuotettuna 750 litraan vettä. Tämän jälkeen liuos jäähdytettiin -2°C:n lämpötilaan ja liuosta sekoitettiin yhden vuorokauden ajan. Glukoosi-iso-25 meraasikiteet erotettiin dekantoimalla. Saaliiksi saatiin 230 kg kidemassaa, jonka kuiva-aine oli 40,0 paino-% ja aktiivisuus 2 300 000 000 GIU. Kidemassaan lisättiin 115 kg glukoosia ja 115 kg fruktoosia sekä 50 kg inverttisokeria, jonka kuiva-ainepitoisuus oli 70 %. Näin saatiin 510 kg ent-30 syymivalmistetta, jonka koostumus oli seuraava: 30.0 paino-% vettä 52.0 paino-% sokereita (glukoosi, fruktoosi) 15.1 paino-% entsyymiä 2,9 paino-% ammoniumsulfaattia 35 Entsyymikonsentraatin glukoosi-isomeraasiaktiivisuus oli 4 500 GlU/g.

12 781 1 7

Esimerkki 5

Ultrasuodatettu isomeraasikonsentraatti valmistettiin esimerkin 1 mukaisella tavalla. 0,95 litraan isomeraasikon-sentraattia, jonka aktiivisuus oli 600 GIU/ml ja jonka läm-5 pötila oli 25°C, lisättiin 50 g ammoniumsulfaattia. Liuokseen ei syntynyt mitään saostumaa tässä vaiheessa. Liuos jäähdytettiin 16 tunnin kuluessa 0°C lämpötilaan ja pidettiin siinä hiljaisen sekoituksen alaisena jatkuvasti.

Isomeraasi alkoi kiteytyä kahden vuorokauden kulut-10 tua ja kiteytyminen jatkui siten, että viiden vuorokauden kuluttua 97,5 paino-% isomeraasista oli kiteisenä ja 2,5 pai-no-% edelleen liukoisena emäliuoksessa. Kiteet erotettiin liuoksesta laboratoriosentrifugilla. Märkää kidemassaa saatiin tällöin 56 g.

15 Tämän esimerkin mukaisesti on mahdollista kiteyttää isomeraasi hyvin alhaisella ammoniumsulfaattipitoisuudella verrattuna niihin tyypillisiin määriin, joita kirjallisuudesta tunnetaan. Tämä on samalla esimerkki puhtaasta jääh-dytyskiteytyksestä. Tämän esimerkin valossa on helposti ym-20 märrettävissä, että suoritettaessa saostaminen ammoniumsulfaatilla nopeasti, ja sen jälkeen sakan erottaminen sentri-fugilla välittömästi esim. 15 minuutin kuluttua, kuten US-patentin 4 237 231 mukaisessa menetelmässä, jää isomeraasi alhaisella ammoniumsulfaattipitoisuudella kokonaisuudessaan 25 liuokseen ja jos se saostuu, jää kiteytyminen havaitsematta ja sen edut hyväksikäyttämättä. Tämän esimerkin mukaisesti valmistettu kidemassa voidaan liuottaa aivan samoin kuin muissakin esimerkeissä.

il

Claims (3)

781 1 7 13

1. Menetelmä kirkkaan liuoksen muodossa olevan stabiilin glukoosi-isomeraasikonsentraatin valmistami- 5 seksi, joka konsentraatti sisältää noin 30 - 60 paino-% sokeria tai sokerialkoholia, noin 5-17 paino-% glukoo-si-isomeraasia, enintään noin 15 paino-% ammonium-ja/tai magnesiumsulfaattia ja loput vettä, jolloin glu-koosi-isomeraasia tuottavaa mikro-organismia fermentoi-10 daan sinänsä tunnetulla tavalla, solumassa lysoidaan ja solujätteet ja muu kiintoaines poistetaan suodattamalla, jolloin saadaan glukoosi-isomeraasipitoinen suo-dos, johon lisätään ammonium- ja/tai magnesiumsulfaattia glukoosi-isomeraasin saostamiseksi, minkä jälkeen saatu 15 saostuma otetaan talteen ja stabiloidaan, tunnet-t u siitä, että glukoosi-isomeraasipitoinen suodos ultrasuodatetaan, saatuun konsentraattiin lisätään ammonium- ja/tai magnesiumsulfaattia ja mahdollisesti vettä seoksen muodostamiseksi, joka sisältää 50 - 170 g ammo-20 nium- ja/tai magnesiumsulfaattia litraa kohti, seos jäähdytetään lämpötilaan 16°C tai sen alle glukoosi-isomeraasin kiteyttämiseksi, saatu kidemassa erotetaan ja suoritetaan mahdollisesti yksi tai useampi uudelleenki-teytys, minkä jälkeen kidemassaan lisätään sokeria tai 25 sokerialkoholia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kidemassaan lisätään glukoosia ja/tai fruktoosia.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että ultrasuodatuksen jälkeen saadun konsentraatin pH säädetään arvoon 7,0 ja konsentraatin lämpötila säädetään 12°C:seen, konsentraattiin lisätään ammoniumsulfaattia ja vettä seoksen muodostamiseksi, joka sisältää noin 105 g ammoniumsulfaattia litraa 35 kohti, seos jäähdytetään lämpötilaan -2°C glukoosi-iso meraasin kiteyttämiseksi, minkä jälkeen kidemassaan lisätään glukoosia. i4 781 1 7