FI72138B - Foerfarande foer framstaellning av en icke sporbildande stam av clostridium acetobutylicum - Google Patents

Description

1 72138

Menetelmä Clostridium acetobutylicum'in itiöttömän kannan valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmä C. acetobutylicum'in 5 itiöttömän kannan valmistamiseksi, jossa itiöitä muodostava C. acetobutylicum-kanta viljellään jatkuvana viljelynä. Keksinnön mukaisesti valmistettu C. aceotbutylicum-kanta on käyttökelpoinen käytettäessä hiilihydraatteja butanoliksi ja asetoniksi.

10 Weizmann julkisti US-patenttijulkaisussa 1 315 585 hiilihydraattien käymisen, jossa muodostetaan butanolia ja asetonia Clostridium acetobutylicum'in (lyhennetty C. acetobutylicum) avulla. Tätä prosessia käytettiin useita vuosia asetonin ja butanolin valmistamiseksi, ja sivutuotteena saa-15 tiin tietty määrä etyylialkoholia.

Lopulta kemialliset prosessit, jotka antavat samat tuotteet käyttämällä halpaa fossiilista polttoainetta raaka-aineena, syrjäyttivät mikrobisen prosessin. Kuitenkin fossiilisen raakaöljypolttoaineen asteittainen loppuunkulutta-20 minen yhdessä tuloksena olevan petrokemiallisten raaka-aineiden hintojen nousun kanssa on elvyttänyt kiinnostuksen tähän käymisreaktioon, joka käyttää hiilihydraatteja, jotka ovat uusiutuvia raaka-aineita.

Eräs ongelma, joka on kohdattu käymisprosessin avulla 25 tapahtuvassa butanolin tuotannossa on se, että kuluu pitkä aika ennen kuin mikro-organismi alkaa tuottaa huomattavia määriä liuotinta. Tämä on totta varsinkin, jos yritetään panna reaktio käyntiin yhtäjaksoisesti toimivassa fermen-torissa. Tästä syystä olisi huomattavan kiinnostavaa, jos 30 voitaisiin kehittää mikro-organismikanta, joka antaisi kiihdytettyjä panoskäymisiä tai joka vähentäisi aikaa, joka tarvitaan jatkuvan liuotintuotannon aikaansaamiseksi yhtäjaksoisesti toimivassa fermentorissa.

Aikaisemmin on uskottu, että C. acetobutylicum'in 35 itiön muodostus on välttämätön organismin pitämiseksi aktiivisessa liuotinta tuottavassa tilassa. Katso esimerkiksi 2 721 38

Bahl et ai., European J. Appi. Microbiol. Biotechnol., 14 (1982) 17-20. Äskettäin Jones et ai., Applied and Environ mental Microbiology, 43 (1982) 1434-1439, ilmoittivat, että tietyt C. acetobutylicumin itiöttömät mutantit tuottaisivat 5 liuottimia. Kuitenkin näiden täytyy olla sellaisia mutant-teja, jotka ovat silti sukkulanmuotoisten solumuotojen aktiivisia tuottajia.

Nyt on kehitetty C. acetobutylicum-kanta, joka on hyvä butanolin tuottaja, vaikkakin se osoittaa vähäistä 10 taipumusta muodostaa itiöitä tai muuttua sukkulanmuotoisiksi muodoiksi. Lisäksi tämä kanta kehittää butyylialkoholia kiihdytetyllä nopeudella panoskäymisessä ja saavuttaa liuo-tintuotannon jatkuvuustilan jatkuvassa käymisessä paljon lyhyemmässä ajassa kuin emäkanta.

15 Keksinnön mukaisesti annetaan käyttöön C. acetobutyli- cum'in itiöttömän kannan valmistusmenetelmä, jolle on tunnusomaista, että itiöitä muodostava kanta on ATCC 4259, jatkuva viljely suoritetaan laimennusnopeudella noin 0,1 -noin 0,5/h ja että itiötön kanta on C. acetobutylicum-kanta 20 ATCC 39236.

Keksinnön mukaisesti saadaan C. acetobutylicum-kannan ATCC 39236 biologisesti puhdas viljelmä, joka on käyttökelpoinen tuotettaessa asetonia ja butanolia hiilihydraateista käymisen avulla, ja jonka itiön muodostajiksi vaihtumisen 25 taajuus on vähemmän kuin noin 1 x 10 ®, kun sitä on kasvatettu 96 tuntia panosprosessilla 35°C:ssa väliaineessa, joka sisältää pääasiallisesti 10 D.E.:n tärkkelyshydrolysaa-tin vesiliuosta ja maissinliotusvettä.

Keksinnön mukainen menetelmä käsittää liuotinta tuot-30 tavan C. acetobutylicum1 in itiöitä muodostavan kannan muuttamisen itiöttömäksi kannaksi, joka on parempi liuottimen tuottaja kuin itiöitä muodostava emäkanta. Tämä muutos toteutetaan viljelemällä itiöitä muodostavaa kantaa jatkuvana viljelynä laimennusnopeudella, joka estää liuottimien ke-35 rääntymisen väliaineeseen.

li 3 72138 Tämän keksinnön kuvauksessa sana "laimennusnopeus" tarkoittaa arvoa, joka saadaan jakamalla reaktorin läpi kulkevan väliaineen virtausnopeus, joka on esitetty tilavuus-yksikköinä tuntia kohti, reaktorin toimintatilavuudella, 5 joka on mitattu samoissa tilavuusyksiköissä. Sen dimensiona on 1/h.

Mitä tahansa C. acetobutylicum'in itiöitä muodostavaa kantaa, joka muodostaa pääasiassa butanolia ja asetonia hiilihydraattien käymisen avulla, voidaan käyttää. Erityisen 10 käyttökelpoinen kanta, jota keksinnön mukaisesti käytetään, on C. acetobutylicum1in itiöitä muodostava kanta ATCC 4259, jota on saatavissa American Type Culture Collection'ilta, Rockvillesta, Marylandista.

Tämän keksinnön mukainen jatkuva viljelvprosessi to-15 teutetaan väliaineessa, joka käsittää vesiliuoksen, joka sisältää liuenneita hiilihydraatteja ja muita ravintoaineita, jotka soveltuvat mikro-organismin kasvuun. Väliaine steriloidaan ennen käyttöä lämmön avulla tai muilla alalla hyvin tunnetuilla tavoilla.

20 Tämän keksinnön käytännöllisessä suorituksessa sopi va väliaine parannetun kannan saamiseksi käsittää alhaisen D.E.:n (dekstroosiekvivalentti) tärkkelyshydrolysaatin vesi-liuoksen, johon on lisätty pieni määrä (noin 0,5 paino-%:sta noin 2 paino-%:n, kuiva-ainepohja) maissinliotusvettä. Al-25 haisen D.E.:n (noin 5 D.E. - noin 20 D.E.) tärkkelyshydro-lysaatteja, jotka on tuotettu tärkkelyksen osittaisen hydro-lyysin avulla, on helposti saatavissa maissinjauhatusteol-lisuudesta. Samoin maissinliotusvettä, jota syntyy, kun maissia liotetaan rikkidioksidin laimeassa liuoksessa, on 30 saatavissa maissin märkäjauhatusta suoritettavasta teollisuudesta .

Jatkuva vilejly pannaan alulle ymppäämällä steriili väliaine yhtäjaksoisesti toimivassa reaktorissa itiöitä muodostavan kannan siemenviljelmällä. Sopiva laimennusnopeus 35 jatkuvaa viljelyä varten on noin 0,1 - noin 0,5 1/h.

4 72138

Jatkuvassa viljelyssä käytettävät pH- ja lämpötila-olosuhteet ovat sellaiset, että ne soveltuvat käytettävän itiöitä muodostavan mikro-organismin kasvuun. Kun tämä mikro-organismi on C. acetobutyylicum'in kanta, sopiva lämpö-5 tila-alue on noin 34°C - noin 40°C ja sopiva pH noin 4,5 - noin 5,5.

Jatkuvaa viljelyä suoritetaan annetulla laimennusnopeu-della noin 1 - noin 2 viikkoa kunnes viljelmä osoittaa itiöttömyyttä. Tämä voidaan määrittää levittämällä viljel-10 män soluja agarlevyille, jotka sisältävät sopivaa kasvualustaa. Soluja, jotka kasvavat näillä levyillä anaerobisessa kammiossa, käytetään nestemäisen kasvualustan ymppää-miseen. Siinä muodostuneita soluja tutkitaan mikroskooppi-sesti itiöiden esiintymisen selvittämiseksi.

15 C. acetobutylicum-kanta ATCC 39236 saatiin tämän kek sinnön mukaisella menetelmällä. Se eristettiin jatkuvasta viljelmästä, joka oli suoritettu keksinnön mukaisen menetelmän mukaan käyttämällä ymppiä, joka oli valmistettu tunnetusta itiöitä tuottavasta C . acetobutylicum.-kannasta 20 ATCC 4259.

Kantaa ATCC 39236 nimitetään itiöttömäksi kannaksi.

Sanat "itiötön kanta" tarkoittavat tässä käytettynä kantaa, jonka itiön muodostajiksi vaihtumisen taajuus on vähemmän “6 kuin noin 1x10 , kun sitä on kasvatettu 96 tuntia panos- 25 prosessilla 35°C:ssa väliaineessa, joka sisältää pääasiallisesti 10 D.E.:n tärkkelyshydrolysaatin vesiliuosta ja maissinliotusvettä.

Yllättäen kanta ATCC 39236 tuottaa butanolia nopeammin ja paljon paremmalla saannolla kuin emäviljelmä, vaikka 30 itiötön kanta ei tuota sukkulanmuotoisia muotoja, joita on pidetty välttämättöminä liuotinten tuotannolle. Lisäksi tämä itiötön kanta saavuttaa liuotintuotannon jatkuvuustilan suunnilleen neljäsosassa siitä ajasta, joka emäkannalta vaaditaan tähän, kun niitä käytetään tuottamaan liuottimia 35 jatkuvassa käymisprosessissa.

Il 5 72138

Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen tämän keksinnön suoritusmuotoja. Kaikki osat ovat paino-osia ja kaikki prosentit paino-prosentteja, ellei nimenomaan ole toisin määrätty.

5 Liuotinpitoisuudet määritettiin käyttämällä suurte- hoista nestekromatografiaa (HPLC). Komponentit analysoitiin kromatografisesti eluoimalla 0,006 N H2SC>4:llä kationinvaih-tohartsista vetymuodossa. Eluoidut komponentit tunnistettiin differentiaalirefraktometrillä, piirrettiin piirturil-10 le ja niiden määrä määritettiin käyttämällä elektronista integraattoria. Käyrän alapuolella oleva pinta-ala, joka esittää kunkin komponentin pitoisuutta, ilmoitetaan prosentteina kokonaispinta-alasta. Yleinen menettelytapa on kuvattu artikkelissa "Analysis of Carbohydrate Mixtures by 15 Liguid Chromatography", Am. Soc. Brew. Chem. Proc., 1973, pp. 43-46. Erotukset tehtiin vetymuodossa 30,48 cm:n HPX-87-kolonnilla, joita on saatavissa Bio-Rad Laboratories'ilta, Richmondi, Kalifornia.

Esimerkki 1 20 C. acetobutlicum'in viljelmä, ATCC 4259, saatiin Ame rican Type Culture Collection'ilta, Rockwillestä, Marylandista, ja pidettiin itiöitä muodostaneessa tilassa mullan, hiekan ja kalsiumkarbonaatin seoksessa. Ymppi jatkuvan viljelmän alullepanemiseksi kehitettiin 125 ml:n Erlenmeyer-25 ymppäsypullossa, joka sisälsi 100 ml vesiväliainetta, joka sisälsi 10 %:a kuiva-ainepohjan mukaan 10 D,E.:n tärkkelys-hydrolysaattia (saatavissa Grain Processing Company'stä, Muscatine, Iowa, Maltrin M-100:na) ja 1 %:n kuiva-ainepohjan mukaan maissinliotusvettä (saatavissa Corn Products Unit of 30 CPC International Inc.'ilta, Englewood Cliffs, New Jersey, Code E801:nä). Väliaineen pH säädettiin arvoon 6,2 väke-vöidyllä NH^OH-liuoksella ennen kuin se steriloitiin kuumentamalla autoklaavissa 121°C:ssa 20 minuuttia. Ymppäys-pullossa oleva jäähdytetty steriili väliaine ympättiin 35 5 ml :11a samanlaiseen väliaineeseen sisältyvän viljelmän itiöiden iskukuumennetulla suspensiolla. Iskukuumennus suo- 6 72138 ritettiin suspendoimalla ensin noin 0,5 g:a multa-itiö-suspensiota 10 ml:aan ymppäysväliainetta. Suspensio asetettiin tämän jälkeen kiehuvaan veteen 90 sekunniksi ja jäähdytettiin nopeasti huoneen lämpötilaan. Ymppäyspulloa, 5 jossa oli ympätty väliaine, inkuboitiin anaerobisessa kammiossa 21 tuntia 35°C:ssa.

Jatkuva viljelyprosessi suoritettiin 2 litran ferment-torissa New Brunswick Bioflow, Model C-30 (New Brunswick Scientific Company, New Brunswick, New Jersey), joka sisäl-10 si pH:n säätimen ja pöhjakäyttöisen magneettisekoittimen.

Pullon toimintatilavuus oli 1,3 litraa. Fermenttori täytettiin 1200 ml:11a steriiliä väliainetta, jolla oli sama koostumus kuin sillä, jota käytettiin ympin valmistamiseksi, paitsi että sen pH oli säädetty arvoon 5,0 väkevöidyllä 15 NH^OHrlla. Väliainetta käsiteltiin CC^slla (anaerboinen laatu) 30 minuuttia ennen kuin se ympättiin 100 ml:11a ymppi-viljelmää. Tuoreen väliaineen virtausnopeus fermenttoriin säädettiin sellaiseksi, että se antoi laimennusnopeuden 0,1 1/h. Seosta sekoitettiin nopeudella 200 kierrosta mi-20 nuutissa (rpm). Lämpötilat pidettiin 37°C:ssa, ja pH säädettiin arvoon 5 + 0,1 lisäämällä tarvittaessa NH^OH:ta. Kun jatkuva viljelyprosessi oli ollut käynnissä 2 viikkoa, viljelmän soluja levitettiin Bacto MRS-agarlevyille (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) ja levyjä inkuboitiin 25 35°C:ssa anaerboisessa kammiossa. Kahdessa päivässä ilmestyi solupesäkkeitä. Nämä solut varastoitiin jäähdyttämällä glyseroliin tai lyofilisoinnilla.

Itiön muodostajiksi vaihtumisen taajuuden määrittämiseksi väliaine, jolla oli sama koostumus kuin sillä, jota 30 käytettiin kasvattamaan emäviljelmä tässä esimerkissä, ympättiin itiöttämän viljelmän soluilla. 48 tunnin kasvun jälkeen ei itiöitä havaittu kasvualustassa. Jopa 96 tunnin g kasvun jälkeen vähemmän kuin 1 x 10 :sta solusta sisälsi itiöitä. Päinvastoin emäviljelmä, kun sitä oli viljelty 35 samanlaisessa väliaineessa, kehitti korkean itiöpitoisuu-den (>10^/ml) 96 tunnin kasvun jälkeen. Tämä koe osoittaa, il 7 72138 ettS tämän esimerkin mukaisella menetelmällä eristetty kanta on itiötön.

Esimerkki 2

Esimerkin 1 mukaista menettelytapaa noudatettiin pait-5 si että jatkuvaa viljelyprosessia toteutettiin laimennus-nopeudella 0,28 1/h ja lämpötilassa 35°C. Tällä menetelmällä saatua itiötöntä viljelmää käytettiin muuttamaan hiilihydraatteja käymisen avulla asetoniksi ja butanoliksi seu-raavalla panosprosessilla. Itiötön pesäke poimittiin levyl-10 tä ja asetettiin 100 ml:aan tärkkelyshydrolysaatti/maissin-liotusvesi-väliainetta. Tässä ymppäyspuliossa olevaa viljelmää kasvatettiin 20 tuntia 35°C:ssa anaerobisessa kasvatus-kaapissa. Steriiliin liuokseen, joka sisälsi 10 %:a kuiva-ainepohjan mukaan 10 D.E.rn tärkkelyshydrolysaattia ja 1 15 %:n kuiva-ainepohjan mukaan maissinliotusvettä, ja jonka pH oli säädetty arvoon 6,5 NH^OHtlla, lisättiin 0,03 % kuiva-ainepohjan mukaan CaCO^a. Seos ympättiin 3 tilavuus-%:lla materiaalia, joka oli peräisin itiöttömän viljelmän ymppäyspullosta, ja käymistä suoritettiin anaerobisissa 20 olosuhteissa 72 tunnin ajan. Tarkistuserä tehtiin käyttämällä ymppinä materiaalia, joka oli peräisin C. acetobutyli-cum'in itiöitä muodostavan emäkannan ATCC 4259 21 tunnin ymppäyspulloviljelmästä, kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Käymislieminäytteet analysoitiin HPLC:llä asetonin ja bu-25 tanolin määrittämiseksi 24:n, 48:n ja 72:n tunnin jälkeen. Tulokset, esitettynä taulukossa I liuotingrammoina 100 ml:n elatusainemäärää kohti, osoittavat, että itiötön viljelmä tuottaa liuottimia nopeammin ja paljon paremmalla saannolla kuin emäviljelmä. Lisäksi tämä esimerkki osoittaa, että 30 kanta voi tuottaa liuottimia käyttämällä ainoastaan aineksia, jotka ovat helposti saatavissa maissin märkäjauhatus-prosessista.

8 72138

TAULUKKO I

Liuotintuotanto (g/100 ml) 5 Emäkanta

Aika Itiötön kanta (tarkistus) (tuntia) Asetoni Butanoli Asetoni Butanoli 24 - 0,18 - 0,09 48 0,34a) 1,02a) - 0,07 10 72 0,46 1,55 0,20b) 0,53b) a) 50:ssä tunnissa b) 70:ssä tunnissa 15 Esimerkki 3

Esimerkissä 2 kuvattua yleistä panoskäymisprosessia noudatettiin paitsi että käytettiin maissisoseväliainetta. Tämä väliaine saatiin nesteyttämällä jauhetusta maissista veteen 10 % suspensio kuiva-ainepohjan mukaan. Nestetyttä-20 minen suoritettiin lisäämällä 2 yksikköä Thermamyl®iä (alfa-amylaasientsyymi, jota on saatavissa Novo Enzyme Corporationilta, Mamaroneck, New York) maissigrammaa kohti, lämmittämällä seosta 30 minuuttia 90°C:ssa, antamalla sen jäähtyä huoneen lämpötilaan sekoittaen silloin tällöin ja ste-25 riloimalla sitä tämän jälkeen autoklaavissa 121°C:ssa 20 minuuttia. Itiötöntä pesäkettä, joka oli poimittu esimerkissä 1 valmistetulta levyltä, käytettiin ymppäyspullon ymppäämiseen ja ymppi kasvatettiin kuten esimerkissä 2 on kuvattu. 388 ml:aan steriiliä maissisoseväliainetta lisät-30 tiin 12 ml:a solususpensiota ymppäyspullosta ja seoksen annettiin käydä anaerobisessa kasvatuskaapissa 68 tuntia. Tarkistuserä valmistettiin käyttämällä siemenenä C. aceto-butylicum'in itiöitä muodostavan emäkannan viljelmää, joka oli valmistettu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Käymislie-35 minäytteet analysoitiin HPLC:llä asetonin ja butanolin määrittämiseksi 20:n, 44:n ja 68:n tunnin jälkeen. Tulokset, esitettynä taulukossa II liuotingrammoina 100 ml:n elatus- it 9 72138 ainemäärää kohti, osoittavat, että itiötön viljelmä tuottaa liuottimia nopeammin ja paljon paremmalla saannolla kuin emäviljelmä, kun molempia kasvatetaan maissisoseväliainees-sa.

5 TAULUKKO II

Liuotintuotanto (g/100 ml)

Emäkanta 10 Aika Itiötön kanta (tarkistus) (tunti) Asetoni Butanoli Asetoni Butanoli 20 0,07 0,06 44 0,47 0,79 0,16 0,23 68 0,75 1,59 0,57 0,89a) 15 a j 5 päivän jälkeen butanolipitoisuus oli 1,3 g/100 ml.

Esimerkki 4

Kaksi jatkuvaa käymistä toteutettiin käyttämällä vä-20 liainetta, ympin valmistusmenetelmää, ja yhtäjaksoisesti toimivaa fermenttoria kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Toisessa käymisessä käytetty viljelmä oli esimerkissä 1 saatu itiötön viljelmä. Toisessa käymisessä (tarkitus) käytetty viljelmä oli C. acetobutylicum'in emäviljelmä, ATCC 4259.

25 Molempia fermenttoreita käytettiin laimennusnopeudella 0,1 1/h ja poistonestenäytteet analysoitiin jaksoittaisesti HPLC:llä asetonin ja butanolin määrittämiseksi. Tulokset, esitettynä taulukossa III liuotingrammoina 100 ml:n poisto-elatusainemäärää kohti, osoittavat, että käyminen, joka 30 suoritettiin itiöttömällä viljelmällä, saavuttaa suhteellisen jatkuvan liuotintuotannon 48 tunnin jälkeen. Emävil- jelmä päinvastoin aloittaa huomattavan liuotintuotannon vasta 8 päivän jälkeen. Havaittiin, että tarvittiin noin 10 päivää ennen kuin emäkanta saavutti jatkuvan liuotin-35 tuotannon. Tämä esimerkki osoittaa tämän keksinnön mukaisen mutanttikannan toisen yllättävän ominaisuuden, nimittäin että se alkaa tuottaa liuottimia jatkuvassa käymisessä paljon pikemmin kuin emäviljelmä.

10 72138

TAULUKKO III

Jatkuva käyminen Liuotintuotanto (g/100 ml) 5 Emäkanta

Aika Itiötön kanta _(tarkistus)_ (tunti) Asetoni Butanoli Asetoni Butanoli 24 48 0,38 0,75 - 0,04 72 0,20 0,41 - 0,03 10 96 0,29 0,65 - 0,04 120 0,28 0,72 - 0,07 144 0,23 0,63 - 0,11 168 0,18 0,54 - 0,13 192 0,16 0,52 0,15 0,29

II