FI69450C - Foerfarande foer framstaellning av nya som immunstimulanter anaendbara di-o-n-alkylglycerolderivat - Google Patents

Description

ΓΒ1 /11! KUULUTUSJULKAISU ^9450

jfSr@ β 11 UTLÄG G NIN G SSKRI FT O 7 H U U

C (45) myönnetty .P: t_ !t no ’ ’ t 10 CO 10C0 (51) Kv.lk.*/lnt.CI.* C 07 D 211/26 (21) Patenttihakemus — Patentansöknlng 791531 (22) Hakemispäivä — Ansökningsdag 1 k. 05.79 (F*) (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 1^.05-79 (41) Tullut julkiseksi — Blivit offentlig 1 6.1 1 .79

Patentti- ja rekisterihallitus /44^ Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisur» pvm. — 10 85

Patent- ooh registerstyrelsen v 1 Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begärd prioritet 15. 05.78 USA(US) 906260 (71) Pfizer Inc., 235 East 42nd Street, New York, New York, USA(US) (72) Allen Richard Kraska, East Lyme, Connecticut, USA(US) (7*0 Oy Koi ster Ab {Sk) Menetelmä uusien, immuunistimulantteina käyttökelpoisten di-0-η--a1 kyy 1iglyserolijohdannaisten valmistamiseksi - Förfarande för framstäI Ining av nya, som immunstimuIanter användbara di-O-n--a1 ky 1 g 1ycerolderi vat

Tämä keksintö koskee menetelmää uusien, immuunistimulantteina käyttökelpoisten di-O-n-alkyyliglyserolijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava I tai II

\ /Ph R.O-CH--^ V 1 2 .' \ Ph

fV» A CH-N

R,O-CH V J CH NH ' ' \ R O-iH, (I) (II) joissa ja R2 ovat kumpikin 8-11 hiiliatomia sisältävä n-alkyyli, ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen valmistamiseksi, ______ ·· 1; 2 69450

Edullisissa yhdisteissä Reissä ja :ssa on sama määrä hiiliatomeja. Edullisimmin R^ ja R2 ovat kumpikin n-dekyyli ja niillä on kaava I.

Uudet 1,2- ja 1,3-(di-O-n-alkyyli)-glyserolijohdannaiset ovat soluvälitteisen vastustuskyvyn käyttökelpoisia ei-spesifisiä stimulantteja lämminverisissä eläimissä. Erityisesti nämä uudet yhdisteet on havaittu käyttökelpoisiksi kasvainten vastaisen tehon stimuloimiseksi ja erityisesti käytettäessä tavanomaisia soluja vähentävän hoidon yhteydessä. Nämä yhdisteet ovat myös käyttökelpoisia rokotteita voimistavina aineina, so. ne ovat käyttökelpoisia tunnettujen immunologisten aineiden kanssa jälkimmäisten immunologisen reaktion synnyttämiseksi tai voimistamiseksi.

On tunnettua, että biologiset rokotteet kuten Corynebacte-rium parvum ja BCG, joka on Mycobacterium boviksen elinkelpoinen kanta, sekä synteettinen levamisoli ovat käyttökelpoisia retikulo-endoteelisysteemin immuunistimulantteja ja ne pystyvät lisäämään lämminverisen eläimen kasvainten vastustuskykyä. Mutta maksaan ja munuaisiin kohdistuva myrkyllisyys, jyväiskasvaman muodostuminen, neutrosoluniukkuus ja vaihtelevat hoitotulokset ovat rajoittaneet näiden lääkkeiden käyttöä. Siten on jatkuvasti ollut kiinnostusta kehittää ei-biologisia, elinryhmäaktiivisia immuunistimulantteja. Edelleen on ollut kiinnostusta kehittää yhdisteitä, jotka ovat käyttökelpoisia rokotteita voimistavia aineita tavanomaisten rokotteiden vaikutusten synnyttämiseksi tai voimistamiseksi. Soluvälitteisiin vastustuskykyyn ja kasvainten vastaiseen tehoon liittyvien tarkastelujen suhteen ks. Herberman, Adv. Cancer Res. 19 (1971) 207, Jordan ja Merigan, Ann. Rev. Pharmacol. 15 (1975) 15 , Levy ja Wheelock, Adv. Cancer Res. 20 (1972) 131 ja Sinkovics, Post Graduate Medicine 59 (1976) 110.

US-patenttijulkaisussa 2 738 351 kuvataan yhdisteitä, joilla on yleinen kaava r1-x-ch2

CH-Z-ALK-B

R2-y-CH2 jossa R^ ja R2 voivat kumpikin olla alkyyli, substituoimaton tai substituoitu aryyli tai aralkyyli, X, Y ja Z voivat kukin olla 3 69450 happi, rikki tai sulfonyyli, ALK on suora tai haarautunut, 1-6 hiiliatomia sisältävä alkyleeni ja B voi olla di(alempi alkyyli)-amino, pideridino, morfolino, pyrrolidino, (alempi alkyyli)pyrro-lidino, N1-alkyylipiperatsino tai pipekolino, paikallispuudutusaineina. Lisäksi vaihtoehtoisten synteesisiteiden tarkastelussa mainitussa US-patentissa esitetään yllä olevan kaavan mukaisia välituotteita, joissa B on amino tai (alempi alkyyli)amino. Mutta mitkään mainitussa US-patentissa erityisesti luetellut yhdisteet eivät sisällä R^- tai R2~alkyyliä, joka on suurempi kuin n-pentyyli. Lisäksi näihin yhdisteisiin ei kuulu yhtään sellaista yhdistettä, jossa R^ ja R^ ovat alkyylejä ja X ja Y merkitsevät molemmat happea.

Insektisidi- ja mitisidiyhdisteitä, joilla on kaava

Rl"CH2 CH-(CH-) -A f ^ 4 R2_CH2 jossa R^ ja R2 voivat kumpikin olla mm. alempi alkyylitio, q on 0-5 ja A voi mm. olla 1-piperidino tai di(alempi alkyyli)amino, on kuvattu JP-patenttijulkaisussa J7-6042-177.

US-patentissa 4 166 132, haettu 18.8.1977, kuvataan mm. yhdisteitä, joilla on jokin seuraavista kaavoista:

R.0-CH„ ?H

i \

i f ^ ' XCH NHR

CH-O-CH.-, Ι-f ) 1 ! k > R20-CH ^ R. -0-CH-

1 I 2 OH

R^-O-CH 1 i - ^

‘ f S~'. f CH„HNR

CH2-0-CH2 -J- { J 2 ja R,-0-CHn 1 I 2

λ 1 CH NH

RL-O-CH .---\ / 2 2 2 I \/

CH2 N X

v A

' ./ Ph 4 69450 joissa R on vety tai 1-6 hiiliatomia sisältävä alkyyli ja R^ ja R2 ovat kumpikin 12-20 hiiliatomia sisältävä n-alkyyli. Näiden yhdisteiden on esitetty olevan käyttökelpoisia virusten vastaisia aineita.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle uusien 1,2- ja l-3-(di-0-n-alkyyli)-glyserolijohdannaisten valmistamiseksi on tunnusomaista, että

a) pelkistetään yhdiste, jolla on kaava III tai IV

?VN V CH-N ¥

Rl° , \_____/ \N R2°"^H2 7 - 7 ' CN

r2o-ch2 (III) (IV) joissa R^ ja R2 merkitsevät samaa kuin edellä, ja b) haluttaessa muutetaan saatu kaavan I tai II mukainen yhdiste farmaseuttisesti hyväksyttäväksi happoadditiosuolaksi.

Menetelmässä lähtöaineina käytetyt 1,2-(di-O-n-alkyyli)-glyserolit voidaan valmistaa menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Kates et ai. Biochemistry 2 (1963) 394. Lähtöaineina käytetyt 1,3-(di-O-n-alkyyli)-glyserolit voidaan valmistaa menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Damico et ai. J. Lipid Res. 8 (1967) 63.

Käsiteltävänä olevan keksinnön yhdisteet voidaan valmistaa tällaisista 1,2- ja 1-3-(di-O-n-alkyyli)-glyseroleista esim. muodostelmalla ensin lähtöaineksen tosyylijohdannainen antamalla reagoida p-tolueenisulfonyylikloridin ja pyridiinin kanssa inertissä liuottimessa kuten metyleenikloridissa n- 10...40°C:ssa, mieluiten n. 10 - 25°C:ssa. Sitten tosyylijohdannaisen annetaan reagoida 4-syaani-4-fenyylipiperidiinin kanssa kuumentamalla reaktant-teja n. 75 - 250°C:ssa. Mieluiten tämä suoritetaan lisäämättä liuotinta, mutta haluttaessa voidaan käyttää inerttiä liuotinta kuten dimetyyliformamidia. Sitten muodostunut nitriili pelkistetään halutuksi amiini esim. käyttämällä raneynikkeliä ja vetyä.

ti 5 69450

Yllä kuvatulla tavalla muodostuneiden amiinien farmaseuttisesti hyväksyttävät happoadditiosuolat voidaan valmistaa tavanomaisin keinoin esim. sekoittamalla asianmukaista amiinia ja happoa inertissä liuottimessa ja eristämällä suola haihduttamalla luotin tai saostamalla suola. Hydrokloridisuolat valmistetaan helposti johtamalla kloorivetykaasua inertissä liuottimessa olevan amiiniliuoksen läpi. Näin saadut hydrokloridi- ja dihydroklo-ridisuolat pyrkivät sisältämään hieman kidevettä tai sulkeutunutta vettä. Tämä ei haittaa uusien yhdisteiden käyttöä ja tällaiset yhdisteet voidaan formuloida ja annostella ilman lisädehydratoin-tia. Nämä yhdisteet voivat siten olla hydratoituneita tai hydra-toitumattomia yhdisteitä. Sopiviin, farmaseuttisesti hyväksyttäviin happosuoloihin kuuluu tällaisia vesiliukoisia ja veteen liukenemattomia suoloja kuten hydrokloridi, hydrobromidi, fosfaatti, nitraatti, sulfaatti, asetaatti, heksafluorofosfaatti, sitraatti, glukonaatti, bentsoaatti, propionaatti, butyraatti, sulfosalisy-laatti, maleaatti, lauraatti, malaatti, fumaraatti, sukkinaatti, oksalaatti, tartraatti, amsonaat£i, (4,41-diaminostylbiini-2,2'-disulfonaatti), pamoaatti, (l,l'-metyleeni-bis-2-hydroksi-3-naf-toaatti), stearaatti, 3-hydroksi-2-naftoaatti, p-tolueenisulfo-naatti, metaanisulfonaatti, laktaatti ja suramiinisuolat.

Kaavojen I ja II mukaiset uudet yhdisteet on havaittu käyttökelpoisiksi soluvälitteisen vastustuskyvyn ei-spesifisiksi stimulointiaineiksi lämminverisissä eläimissä ja erityisesti ne ovat käyttökelpoisia stimuloitaessa retikuloendoteliaalisystee-miä. Yllä kuvattuja yhdisteitä voidaan antaa lämminverisille eläimille monien tavanomaisten antotapojen avulla, erityisesti laskimoon tai vatsaonteloon. Tällä tavoin annettaessa sopiva annos on n. 0,5 - 5 mg/kg hoidettavan kohteen kehonpainoa. Lääkäri voi kuitenkin määrittää kullekin potilaalle sopivimmin erityisannok-sen, joka riippuu hoidettavasta kohteesta ja ko. käytetystä yhdisteestä. Yleensä alussa annetaan pieniä annoksia, joita voidaan asteittain lisätä ko. kohteen optimiannoksen määrittämiseksi.

Annon jälkeen seurataan yleensä kohteen vastustuskykyisyyttä käyttäen alan tavanomaisia tekniikkoja kuten alla kuvattuja mo-nosyyttien aktivointimakrofagien aktivointimääritysmenetelmiä.

6 69450

Tyypillisesti maksimiaktivointi havaitaan n. 24-48 tuntia ensimmäisen annon jälkeen ja ilman lisäantoa aktivointi palaa alkuperäiselle tasolle samoin 24-48 tunnin kuluttua. Sitten antamalla toinen annos n. 24-72 tuntia ensimmäisen annoksen jälkeen vastustus-kykyisyys säilyy halutulla tasolla.

yleensä annetaan tällä tavoin 2-4 annosta ja määritetään kohteen reaktio hoitoon. Tarvittaessa voidaan yllä kuvatulla tavalla antaa lisäannoksia.

Yhdisteitä voidaan käyttää farmaseuttisissa valmisteissa, jotka sisältävät yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa sekä farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa tai laimenninta. Tähän tarkoitukseen erityisen suositeltava farmaseuttinen kantaja-tyyppi on steriili rasva- tai lididiemulsioväliaine. Jälkimmäinen väliainetyyppi on havaittu erityisen tehokkaaksi ruoansulatuskanavan ulkopuoliseen ja laskimoon antoon kohottaen hoitoindeksin arvoon n. 15-25. Tween 80-glyseroli-vesiformuloinneilla on hiiren ja rotan esikokeissa havaittu hoitoindeksejä n. 3 käytettäessä tämän keksinnön (alempi alkyyli)eettereitä, esim. 4-aminometyyli-l-/2,3-(di-n-oktyylioksi)-n-propyyl£7-4-fenyylipiperidiiniä. Tällaisia etuja on raportoitu muille yhdisteille käytettäessä niitä tällaisten rasvaemulsioväliaineiden kanssa, ks. esim. Fortner et ai., American Journal of Hospital Pharmacy 32 (1975) 502 ja Jeppsson et ai., First International Conference on Pharmaceutical Technology, Faculty of Pharmacy, Paris-Sud, June 1977. Esimerkki erityisen sopivasta väliaineesta on Intralipid (Currer Laboratories, Berkely, California), joka on soijaöljyyn perustuva 10 %:nen rasvaemulsio. Sopivia ovat myös muut vastaavat väliaineet ja ne ovat asiantuntijoiden helposti valmistettavissa.

Kaavojen I ja II mukaiset yhdisteet ovat myös käyttökelpoi-sai rokotteita voimistavia aineita ja niitä voidaan käyttää samoihin tarkoituksiin ja antaa samalla tavoin kuin nykyään tunnetut voimistavat aineet, ks. esim. "Immunological Adjuvants", World Health Organization Technical Report Series, No 595. Käsiteltävänä olevan keksinnön yhdisteet ovat käyttökelpoisia esim. influenssa-, suu- ja sorkkatauti- ja kurkkumätärokotteiden yhteydessä. Yhdistettä voidaan lisätä rokoteannokseen määränä n. 1-20 mg/rokoteannos li 7 69450 ja mieluiten farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa kuten rasva- tai lipidiemulsiossa tai glyserolissa. Sitten rokotteen ja voimistavan aineen yhteisannos annetaan kohteelle ko. rokotteelle ominaisella tavalla yleensä yhtenä annoksena ihon alle tai lihakseen. Vaihtoehtoisesti voimistava aine voidaan antaa rokotteesta riippumatta joko samanaikaisesti kuin rokote tai mieluummin 8-24 tuntia ennen rokotetta.

Kaavojen I ja II mukaisten yhdisteiden immuunistimulantti-ja kasvainten vastainen aktiivisuus voidaan määrittää farmakologisin kokein. Sopivia kokeita ovat vatsakalvon makrofagiaktivoinnin määrityskoe, kasvaimen hylkimisen määrityskoe (sarkooma 180J-malli), hidastuneen ihon yliherkistymisen määrityskoe ja ääreismonosyytti-aktivoinnin määrityskoe. Seuraavassa näitä kokeita on kuvattu yksityiskohtaisemmin koe-esimerkin sekä esitetty niissä käsiteltävänä olevan keksinnön yhdisteillä saatuja tuloksia. Lisäksi on kuvattu sopivia kokeita rokotteiden voimistusaineiden aktiivisuuden määrittämiseksi .

Koe-esimerkki 1

Sarkooma 180J-malli kasvaimen hylkimisen määrittämiseksi

Kuusi CD-I naarashiirtä (20-25 g) ryhmää kohti saivat vatsaonteloon 5-8 vrk vanhoja 106S-180J-soluja. Vuorokausi kasvaimen inokuloin-nin jälkeen hiiret saivat 0,1 ml koeyhdistettä formuloituna rasva-emulsioväliaineeseen Intralipid (Currer Laboratories) haluttuna annoksena ja tämän jälkeen hiiriä tarkkailtiin kuolemaan saakka tai 40 vuorokautta riippuen siitä, kumpi tapahtui ensin. Tulokset on ilmoitettu lisääntyneenä prosentuaalisen elinaikana (% LE) seuraavasti: %LE = /^ääkehoidettujen hiirien keskimääräinen eloonjääminen/ x 100 /Hoitamattomien kontrollihiirien keskin, eloonjääminen/

Yllä olevan koemenetelmän tulokset olivat seuraavat:

Taulukko 1

Ro-0-CH~ 2 i 2 !

Rr°-CH , V CH NH

I \ / Z Z

CH2 N ^ V----ph 69450 ΊΓ 8 ---

R^ , R2 % LE

Annos (mg/kg) 0/25 1 4 16 n-C8H17 113 109 154(1) 192(4) n-c10H2i 127 139(1) 110 108

Yllä olevan taulukon 1 suluissa olevat luvut tarkoittavat 40 vuorokauden eloonjääneiden määrää.

Koe-esimerkki 2

Vatsakalvon makrofagioinnin määritys

Hiirien vatsaonteloon ruiskutettiin ruokasuolaliuosta tai koeyhdistettä. Makrofageja eristettiin 72 tuntia myöhemmin ruiskuttamalla vatsaonteloon 3 ml 8 %:sta vasikkasikiöseereumia - väliaine 92 %:nen RPMI 1640 (Grans Insland Biological Co., N.Y.) (1640^ PC£5g) plus 5 yksikköä/ml hepariinia kaikkien väliaineiden lämpötilan ollessa 37°C, elintä huuhdeltiin 1-2 minuuttia, avattiin ja vatsa-onteloneste poistettiin täysin steriilillä, silikonoidulla pipetillä 50 ml:n jäissä pidettyyn muoviputkeen. Makrofagit laskettiin verisolujen laskukammiossa ja konsentraatio säädettiin arvoon 1,5 x 10 /ml 1640g2F<3Sg: 11a. Sitten solut asetettiin monilokero-maljoihin 1,5 x 10b solua/lokero ja inkuboitiin 1-2 tuntia 37°C:ssa 5 %:ssa hiilidoksidikehässä. Päällä oleva neste hylättiin ja soluja pestiin kerran väliaineella makrofagien tarttuessa lokeroiden pohjalle. Sitten lisättiin kuhunkin lokeroon 1 ml 1 x 103 solua/ml L 1210-soluja (eristetty DBA-hiirien vesivatsasta n. 5 vrk ennen inokulointia) 1640g2FCSg:ssa ja inkuboitiin 24-30 tuntia 37°C:ssa 5 %:ssa hiilidioksidikehässä. Sitten soluja säteilytettiin 3H-Tdr:llä (1,0 Ci/ml, Amersham/Searles) kuusi tuntia 37°C:ssa, päällä oleva neste poistettiin solujen keruulaitteella Reeve-Angelsuodattimen läpi ja pestiin viidesti ruokasuolaliuoksella. Suodatinkiekkojen annettiin kuivua ja asetettiin tuikelaskuriputkiin LSC-tuikelasken-tanesteen kera (5,0 g PPO ja 0,2 g POPOP/1 tolueeni, Yorktown Research). Laskentaa suoritettiin kaksi minuuttia käyttäen Beekman LS-250-laskuria. Tällä menetelmällä saadut tulokset olivat seu-raavat: 9 69450

Taulukko 2 r9-o-ch9

Rl-O-Ol /-V /CH2NH2

CH2—N X

\____/ ' Ph R.,R? Annos DNA-synteesin prosen- —=—- mg/kg tuaalinen esto_ n-c10H21 1,25 76 n“C10H21 0,625 94 n-cioH2i 0,313 56

Koe-esimerkki 3 Ääreisverimonosyyttiaktivoinnin määritys

Rottien laskimoon ruiskutettiin koeyhdistettä tai kontrolli-eläimiin ruokasuolaliuosta. Monosyyttejä eristettiin 72 tuntia myöhemmin imemällä 2 ml verta EDTA-putkeen ja laimentamalla 2 ml:11a ruokasuolaliuosta. Sitten näiden päälle kerrostettiin varovasti 3 ml LSM:ää (lymfosyyttierotusväliainetta, Bionetics) ja lingottiin 800 kierr/min 40 minuuttia huoneen lämpötilassa. Eristettiin pipetillä monosyyttejä ja lymfosyyttejä sisältävä samea välikerros. Näitä soluja pestiin kahdesti Hanksin balansoidulla suolaliuoksella, sus-pendoitiin uudelleen monilokeromaljoissa olevalle 1640g2FCSg : He ja inkuboitiin 37°C:ssal,5 tuntia 5 %:ssa hiilidioksikehässä. Soluja pestiin voimakkaasti väliaineella kiinnittymättömien solujen poistamiseksi. Jäljelle jääneet monosyytit muodostivat uudelleen-syöttöväliaineen ja L 1210-soluja lisättiin efektorin ja kohtion suhteessa 15:1. Seuraten koe-esimerkissä 2 kuvattua menetelmää soluja säilytettiin H-Tdr:llä ja laskettiin tuikelaskurisssa.

Käyttäen tätä menetelmää 1,25 mg/kg 4-aminometyyli-l-/2,3-di-n-dekyylioksi)-n-propyyli7-4-fenyylipiperidiiniä aiheutti DNA-synteesin 80 %:sen eston.

Koe-esimerkki 4

Rokotteen voimistusasteen punasolujen yhteenliimautumis-estokoe

Influenssavirus vaikuttaa punasoluihin ja aiheuttaa yhteen- 10 69450 liimautumista. Jos seeruminäytteessä on viruksen vasta-aineita, viruksen punasolujen yhteenliimautumiseen johtava vaikutus estyy. Siten punasolujen yhteenliimautumisen puuttumien osoittaa viruksen vasta-aineiden läsnäolon ja määrittämällä yhteenliimautumistitteri alla kuvatulla tavalla saadaan mitta vasta-aineen määrälle.

Koe-yhdisteet formuloitiin halutulle annostasolle liuottamalla 0,3 mlraan etanolia, lisäämällä 0,1 ml Tween 80:ä ja lisäämällä muodostunut seos 4,6 ml:aan Intralipidiä (Currer Laboratories). Valmistettiin myös vastaavia väliaineita ilman koeyhdistettä. Kuhunkin väliaineeseen sekoitettiin Fluogen-influenssavirusta (Parke-Davis & Co.) ja saatiin 250 CCA:ta/0,5 ml ruisketilavuutta. Yhteen ryhmään Hartleyn naarasmarsuja (Camm Laboratories) ruiskutettiin lihakseen 0,5 ml Fluogenia ja koeyhdistettä sisältävää väliainetta. Marsujen kontrolliryhmään ruiskutettiin väliainetta, joka sisälsi Fluogenia, mutta ei koeyhdistettä. Kolmekymmentä vuorokautta ensimmäisen herkistyksen jälkeen eläimiä käsiteltiin vielä ruiskuttamalla lihakseen vasta-ainehomologia, jolla ne alkujaan immunoi-tiin. Ensimmäisen herkistyksen jälkeen eläimistä otettiin useita kertoja verta sydänpunktion avulla. Seerumi eristettiin Corvac Integrated Serum Separator-putkella (Corning Glass Works) ja pidettiin -20°C:ssa ennen titraamista alla kuvatussa yhteenliimautu-mismäärityskokeessa.

Koeseerumit, joita oli käsitelty 0,011-m kaliumjodaatilla ei-spesifisten, yhteenliimautumista estävien seerumitekijoiden poistamiseksi, jaettiin kaksoissarjalaimennuksina 0,025 ml:n tilavuuksiksi mikrotitrauskuppeihin (Linbro Scientific Company, New Haven, Conn., tyyppi IS-MRC-96), joissa oli 0,025 ml 0,01-m fosfaatilla puskuroitua fysiologista ruokasuolaliuosta, seuraavassa lyhenteenä PBS), pH 7,2. Kuhunkin kuppiin lisättiin koevirussus-pensiota, jossa oli HA-4 yksikköä/O,025 ml PBS. Mukana oli solu-(vain PBS) ja vasta-aine-kontrolleja (PBS ja vastavirus-aine).

Kun maljoja oli inkuboitu 30 minuuttia huoneen lämpötilassa kuhunkin kuppiin lisättiin 0,05 ml 0,5 %:lla pestyjä kananpojan punasoluja (Flow Laboratories, Rockville, Md.). Inkubointia jatkettiin, kunnes solukontrollissa tapahtui normaalilaskeutuminen. Lisättiin normaalimarsuista saatuja perjodaattikäsiteltyjä seerumeja, jotta voitaisiin määrittää kaliumjodaattikäsiteltyihin koeseerumeihin 11 69450 jääneen ei-spesifisen yhteenliimautumiseston taso. Punasolujen yhteenliimautumisen estotitteri määriteltiin seerumin suurimmaksi laimennusarvoksi, jolla punasolujen yhteenliimautuminen estyy täysin. Arvo on korjattu ei-spesifisellä estolla.

Kokeissa 4-aminometyyli-l-/12,3- (di-n-dekyylioksi) -n-propyy-li/-4-fenyylipiperidiinillä saadut tulokset ilmenevät taulukosta 3. Suurempi punasolujen yhteenliimautumistitteri, joka havaittiin käsiteltäessä uudelleen koeyhdistettä saaneita eläimiä, osoittaa yhdisteen voimistavan tehon.

12 69450

Taulukko 3

Vasta-aine Punasolujen yhteenliimautumistitteri Päivä1 15 30»» 44 65 0 0 40 40 0 0 160 80

Fluogen 0 0 40 10 10 0 80 10 10 0 80 80 10 0 160 160 10 10 80 1280

Fluogen ja 4-aminometyyli-i- 10 10 640 2560 /2,3-(di-n-dekyylioksi)-n- 10 40 640 1280 propyyli/-4-fenyylipiperi- 0 10 640 1280 diini (5 mg) 0 20 640 160 10 10 10 20 0 10 40 10 10 10 10 10 10 0 10 10 o 0 - - Päivä ensimmäisen herkistyksen jälkeen »h Uudelleenkäsittely 30 päivää ensimmäisen herkistyksen jälkeen. Yllä olevat tulokset koskevat ko.ryhmien kutakin eläintä.

13 6945 0

Seuraavat esimerkit kuvaavat käsiteltävänä olevaa keksintöä.

Esimerkki 1 4-syaani-l-/2,3- (di-n-dekyylioks j.) -n-propyyli7-4-fenyyli-piperidiini

Yhdistettiin ja kuumennettiin 180°C:ssa 20 minuuttia 20 g (0,0189 moolia) 1,2-(di-O-n-dekyyli)-3-0-(p-tosyyli)-glyserolia /valmistettu 1,2-di-O-(n-dekyyli)-glyserolikloridista/ ja 4,5 g (0,024 moolia) 4-syaani-4-fenyylipiperidiiniä. Jäähtyneeseen tuotteeseen lisättiin 50 ml vettä ja 100 ml eetteriä. Eetterikerros eristettiin ja pestiin 2 x 100 ml:11a kyllästettyä natriumbikar-bonaattiliuosta, 100 ml:11a 1-n kloorivetyhappoa, 2 x 100 ml :11a vettä, 100 ml:11a kyllästettyä natriumbikarbonaattiliuosta ja 100 ml :11a vettä. Sitten eetteriliuos kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä, käsiteltiin puuhiilellä, suodatettiin, haihdutettiin ja saatiin 10 g öljyä, öljy absorboitiin silikageeliin, jota pestiin 3 x 200 ml:lla heksaania, 3 x 200 ml:lla tolueenia, 3 x 200 ml:lla kloroformia ja 3 x 200 ml:lla etyyliasetaattia. Etyyliasetaatti haihdutettiin ja saatiin puhdas syaaniyhdiste öljynä, IR (puhdas): 200 cm

Esimerkki 2 4-aminometyyli-l-/.2,3- (di-n-dekyylioksi) -n-propyyli7~4-fenyylipiperidiini

Liuotettiin 1,2 g (0,0022 moolia) esimerkissä 1 muodostunutta nitriiliä 50 ml:aan etanolia ja liuos kyllästettiin ammo- niakkikaasulla. Sitten liuosta hydrattiin kolme tuntia paineessa 2 3,5 kp/cm käyttäen katalyyttinä 0,7 raneynikkeliä. Pelkistyksen päätyttyä seos suodatettiin, suodos haihdutettiin vakuumissa ja saatiin 1,1 g öljyä, öljy kromatografoitiin silikageelillä bent-seeni-etanolilla eluoiden, muutettiin hydrokloridisuolaksi, kiteytettiin uudelleen etyyliasetaatista ja saatiin 0,32 g (saanto 24 %) puhdasta hydrokloridia, sp. 138 - 140°C.

Analyysi C35H64N2°2.2HC1.3/4H20 Laskettu: C 66,59 H 10,78 N 4,44 Saatu: C 66,46 H 10,56 N 4,43.

14 69450

Esimerkki 3

Seuraten esimerkkien 1 ja 2 menetelmiä valmistettiin seu-raavat yhdisteet: / \ AH2NH2

CH--CH-CH0-N )C

i 21 2 Λ Λ OR2 01^ - R^/R2 Sp.°C Molekyylikaava Laskettu % Saatu %

CqH17 176-178 C31H5602N2.2HC1.1/2H20 C 65,24 C 65,27 H 10,42 H 9,90 N 4,90 N 4,95 R~0-CHo z j z ___ I / \ ch»nh9 CH-N * I \ As 1 V ' Ph R^O-CI^ - Fn R^,R2 Sp.°C Molekyylikaava Laskettu % Saatu % C10H21 190-192 c35H64N202.2HC1. 3/4H20 C 66,58 C 66,70 H 10,78 H 10,20 N 4,43 N 4,27

Samalla tavoin voidaan valmistaa muita tämän keksinnön yhdisteitä asianmukaisesta 1,2- tai 1,3-(di-n-O-alkyyli)-glyserolista tosyylijohdannaisen välityksellä.

Il

Claims (3)

69450

1. Menetelmä uusien, immuunistimulantteina käyttökelpoisten di-O-n-alkyyliglyserolijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava I tai II / VPh El°'fH2 7 \/ Ph CH -N ch-n X R1°-?H N---f CH2NH2 R2°"^H2 7 ^CH,NH. R20-0H2 (I) (II) joissa R^ ja R2 ovat kumpikin 8-11 hiiliatomia sisältävä n-alkyy-li, ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosuolo-jen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) pelkistetään yhdiste, jolla on kaava III tai IV -v Ph \0-CH2 -v Ph X H X R]^0-CH V_/ \ CN R2°"CH2 N____ VCN r2o-ch2 (III) (IV) joissa R^ ja R2 merkitsevät samaa kuin edellä, ja b) haluttaessa muutetaan saatu kaavan I tai II mukainen yhdiste farmaseuttisesti hyväksyttäväksi happoadditiosuolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että pelkistin on raneynikkeli ja vety.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että R1 ja R2 ovat kumpikin n-dekyyli.