FI67664C - Foerfarande foer framstaellning av en antigenberedning mot tandkaries - Google Patents

Description

rm M KUULUTUSJULKAISU s n s s A

®^51ΐ! B 11 UTLÄGG NIN GSSKRIFT 6 7664 C '> · : J 1 1 10 C5 1935 « (45) ";r; * (51) Kv.ik.«/Int.ci.‘ A 61 K 39/09, C 12 P 1/04 (21) Patenttihakemus — Patentansökning 792682 (22) Hakemispäivä — Ansökningsdag 29.08.79 fFh * ' (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 29.08.79 (41) Tullut julkiseksi — Blivit offentlig 02.03.80

Patentti· ia rekisterihallitus .... .... . , .....

* (44) Nahtavaksipanon ja kuul.julkaisun pvm. —

Patent- och registerstyrelsen Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 31.01 .85 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begärd prioritet 01.09 78 Englanti-England(GB) 35383/78 (71) The Secretary of State for Social Services, Alexander Fleming House, Elephant and Castle, London SE1 6BY, Eng 1 anti-Eng 1 and(GB) (72) Geoffrey Colman, Sevenoaks, Kent, Roy Robert Baird Russel 1 , Bromiey,

Kent, Englanti-England(GB) (7*0 Berggren Oy Ab (5*0 Menetelmä antigeeniva1 misteiden valmistamiseksi hammasmätää vastaan -Förfarande för f ramstä11 ning av en antigenberedning mot tandkaries

Keksintö koskee menetelmää antigeenivalmisteiden valmistamiseksi, joita käytetään hammaskarieksen (hammasmädän) kontrollointiin imettäväisellä.

Hammasmädän aiheuttajaksi uskotaan yleisesti hampaiden pinnalla olevien bakteerien synnyttämä happo, ja kyseessä on etupäässä bakteerilaji, joka tunnetaan nimellä Streptococcus mutans. Tämä tieto on johtanut useihin yrityksiin estää, tai ainakin vähentää, karieksen esiintymistä immunisoimalla S. mutans-bakteerin kokonaisilla soluilla tai solun aineosilla. On selostettu esimerkiksi kokeita (Bowen et ai, British Dental Journal, osa 139, 1975, sivut 45-48; Cohen et ai, British Dental Journal, osa 147, 1979 sivut 9-14), joissa on saatu vähenemään apinoiden kariesta immunisoimalla joko kokonaisilla soluilla tai solujen seinämiä sisältävällä materiaalilla, jota on sakkautunut sentrifugoimalla särkyneistä soluista. (Immunisoiminen glukosyylitransferaasientsyymi-valmisteilla ei aikaansaanut suojaa). G.E. Smith on myöskin kuvannut GB-patentissa 1 375 866 S. mutansin kokonaisista soluista tai 2 67664 kokonaisten solujen osista peräisin olevaa rokotetta. GB-paten-tissa 1 385 033 on kuvattu farmaseuttinen valmiste, joka sisältää S. mutansin kokonaisten solujen lysaatteja. Vaikka tällaisen immunisoinnin on osoitettu synnyttävän immuunivastetta muodostamalla vasta-aineita, S. mutans-bakteereille, on mainittujen vasta-aineiden tie oraalisiin bakteerikolonioihin epävarma. On havaittu karies-suojan syntymistä sen jälkeen kun on immunisoitu submukoosi-sesti suussa tai subkutaanisesti jalassa. Vaihtoehtoinen, vaikkakin luultavasti kalliimpi ratkaisu on vasta-ainevalmisteiden levittäminen paikallisesti esimerkiksi nautaeläinten maidossa, joka sisältää vasta-aineita S. mutans-antigeeneille (GB-patentti 1 505 513).

Vaikka immunisoiminen S.mutansin kokonaisilla soluilla tai solun-seinämä-valmisteilla näyttääkin aikaansaavan suojaa, siihen saattaa liittyä joitakin vaaroja, varsinkin silloin, kun käytetään kokonaisia eläviä soluja. Streptokokkien tiedetään olevan syynä joihinkin tauteihin, esimerkiksi reumaattisiin sydäntauteihin ja immunisoiminen kokonaisilla soluilla tai vaikkapa tarkkaan määrittelemättömillä solun aineosilla saattaa aiheuttaa epätoivottuja sivuvaikutuksia. Maksimaalisen turvallisuuden samoinkuin maksimaalisen tehokkuuden vuoksi tulisi rokotteen sisältää vain spesifistä antigeeniä tai antigeenejä, joita tarvitaan suojaamaan kariekselta. Esimerkkejä aikaisemmin eristetyistä S. mutans-anti-geeneistä jotka saattavat omata vaaditun spesifisyyden, ovat dekstraanisakkaroosi (G.E. Smith GB-1 375 866) , Levan-polysakka-ridi (A. Gaffer et ai, US-3 879 545 ja GB-1 343 755), polyfruk-taanipolysakkaridi (A. Gaffer et ai, US-3 931 398) ja polyglu-kaanipolysakkaridi (US-3 931 398).

Olemme nyttemmin identifioineet kaksi antigeeniproteiinia (joita tästä lähtien tullaan kutsumaan antigeeni A:ksi ja B:ksi), joita on edellä selostetuissa solunseinämävalmisteissa ja jotka näyttävät osallistuvan kariekselta suojaamiseen.

Antigeeni B:n on osoitettu stimuloivan vasta-aineita, jotka reagoivat ihmissydämen kudoksen kanssa (Hughes, Pathogenic Streptococci, 1979, sivut 222-223), toimittanut M.T. Parker, Reedbooks, Chertsey, Englanti). Se mahdollisuus, että rokotteet, jotka sisältävät antigeeni B valmisteita, aiheuttaisivat sydäntä vaurioittavaa auto-immuunivastetta merkitsee sitä, että antigeeni B

3 67664 määritellään nykyisin sopimattomaksi rokotteeseen.

Tällä keksinnöllä aikaansaadaan menetelmä sellaisen antigeeni-valmisteen valmistamiseksi, joka sisältää antigeeni A:ta (kuten jäljessä on määritelty), joka on käytännöllisesti katsoen täysin vapaa muista antigeeniproteiineista, jotka ovat peräisin Streptococcus mutansista. Tällaisesta antigeenivalmisteesta tai sen vasta-aineista voidaan yhdessä farmaseuttisesti sopivan kantaja-aineen kanssa muodostaa farmakologinen valmiste.

Termi farmakologinen valmiste käsittää tässä käytettynä sekä profylaktiset aineet, esimerkiksi rokotteet että aineet, joita käytetään infektion jälkeen vähentämään syntynyttä vahinkoa.

Antigeeni A on antigeeniproteiini, jolla on seuraavat ominaisuudet: se jää Streptococcus mutans serotyyppi c:n soluseinä-miin (kuten on selostanut Bratthall, Odont Revy 2_0, 1969, 2 31 — 243), josta kanta NCTC 10449 on esimerkki, sen jälkeen kun on uutettu soluja käyttäen 10 g/1 natriumdodekyylisulfaattia (SDS) vedessä 1 h ajan huoneenlämmössä tai 20 min keittäen, sen mole-kyylipaino on noin 29000 _+ 3000 ja isoelektrinen piste 4,1-4,5.

Lähes identtisiä proteiineja on löydetty muista S.mutansin geneettisen ryhmän I kannoista (Coykendall, J. Gen Microbiol, osa 83, sivut 327-338), joihin kuuluvat serotyypit e ja f, esimerkiksi kannoissa, joita on selostanut Russell, RRB,

Microbios Letters, osa 2 (1976), sivut 55-59.

Antigeeni A:ta ei voida helposti erottaa SDS-uutetuista solu-seinämistä, mutta kun kaniineja immunisoidaan uutetuilla solun-seinämillä, saadaan tulokseksi kahden proteiinin vastaseerumia (joita määritellään antigeeni A:lla ja B:llä), jotka voidaan löytää siitä ja erottaa kokonaisten solujen uutteista tai solu-vapaista viljelyuutteista. Antigeeniä voidaan siis valmistaa mukavasti viljelyuutteista cai kokonaisista viljelmistä solujen särkemisen jälkeen.

4 67664

Keksinnöllä aikaansaadaan siis menetelmä antigeenivalmisteen valmistamiseksi Streptococcus mutans-lajin bakteereista, jota valmistetta käytetään hammaskarieksen kontrollointiin imettäväisellä, viljelemällä S. mutans-lajin bakteereita elatusaineessa soluviljelmän muodostamamiseksi, poistamalla mainitusta soluviljelmästä ainakin soluseinämät, jolloin jäljelle jää proteiiniliuos, ja erottamalla antigeenivalmiste proteiiniliuoksesta, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että antigeenivalmiste erotetaan proteiiniliuoksesta erotusmenetelmällä, joka käsittää affini-teettikromatografiän, jolloin proteiiniliuos saatetaan kosketukseen immobilisoidun vasta-aineen kanssa, ei-toivotut aineet oestään immobilisoidusta vasta-aineesta ja antigeenivalmiste eluoidaan immobilisoidusta vasta-aineesta, joka vasta-aine on spesifinen yhden tai useamman antigeeniproteiinin suhteen, jona ovat proteiinit, joilla on seuraavat ominaisuudet: ne esiintyvät Streptococcus mutansin geneettisen ryhmän I soluseinämillä, ne eivät ole uutettavissa mainituista seinämistä keitettäessä 10 g/1 natriumdodekyylisulfaatin kanssa 20 minuutin ajan, niiden mole-kyylipaino on noin 29000 ja isoelektrinen piste noin 4,1-4,5 ja käsiteltäessä proteolyyttisellä entsyymillä ne eivät muodosta presipitiini-vyöhykkeitä testattaessa immunodiffuusion avulla natriumdodekyylisulfaatilla uutettujen Streptococcus mutansin solujen vastaseerumia vastaan.

Immobilisoitu vasta-aine voi olla tyypillisesti immunoglobuliini G (IgG) vasta-aineita, joita on kasvatettu sopivassa eläimessä kuten kaniinissa, immobilisoitu tavanomaiselle alustalle kuten ristiliitetyn agaroosin pallosille, jota seuraa alustan syano-bromidiaktivointi.

Bakteeri on edullisesti S. mutansin geneettisen ryhmän I kanta, erityisesti serotyyppi c.

Kyseessä oleva antigeenivalmiste voidaan myöskin valmistaa menetelmillä, jotka eivät vaadi affiniteetti-kromatografiavaihetta 5 67664 immobilisoidun vasta-aineen avulla. Näin ollen esillä olevan keksinnön erään toisen aspektin mukaan aikaansaadaan menetelmä antigeenivalmisteen valmistamiseksi Streptococcus mutans-lajin bakteereista, jota valmistetta käytetään hammaskarieksen kontrollointiin imettäväisellä, viljelemällä S. mutans-lajin bakteereita elatusaineessa soluviljelmän muodostamiseksi, poistamalla mainitusta soluviljelmästä ainakin soluseinämät, jolloin jäljelle jää proteeiniliuos, ja erottamalla antigeenivalmiste proteiiniliuoksesta, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että antigeenivalmiste erotetaan proteiiniliuoksesta sellaisella erotusmenetelmällä, jossa proteiiniliuokseen lisätään ammonium-sulfaattia noin 45 %:een kyllästykseen asti ensimmäisen kiinteän aineen saostamiseksi, ensimmäinen kiinteä aine poistetaan, proteiiniliuokseen lisätään ammoniumsulfaattia noin 65 %:een kyllästykseen asti toisen kiinteän aineen saostamiseksi, toinen kiinteä aine otetaan talteen, toinen kiinteä aine liuotetaan toisen proteiiniliuoksen muodostamiseksi, toinen proteiiniliuos saatetaan kosketukseen dietyyliaminoetyyli-substituoidun ioninvaihtomatriisin (DEAE-matriisi) kanssa, ei-toivotut aineet pestään DEAE-matriisista ja antigeenivalmiste eluoidaan DEAE-matriisista, jolloin valmisteen antigeeniproteiineilla on seu-raavat ominaisuudet: ne esiintyvät Streptococcus mutansin geneettisen ryhmän I soluseinämillä, ne eivät ole uutettavissa mainituista seinämistä keitettäessä 10 g/1 natriumdodekyylisulfaatin kanssa 20 minuutin ajan, niiden molekyylipaino on noin 29000 ja isoelektrinen piste noin 4,1-4,5 ja käsiteltäessä proteolyyt-tisellä entsyymillä ne eivät muodosta presipitiini-vyöhykkeitä testattaessa immunodiffuusion avulla natriumdodekyylisulfaatilla uutettujen Streptococcus mutansin solujen vastaseerumia vastaan.

Valmiste voidaan eluoida konventionaalisilla pH- tai ionigradi-enteilla, mutta mieluimmin antigeenivalmiste eluoidaan DEAE-matriisista ionigradientilla 0,1-0,2 M natriumkloridilla.

Tässä saostus/kromatografia-menetelmässä ensimmäinen kiinteä aine sisältää vain pienen osan antigeeni A:ta, kun taas toinen kiinteä aine sisältää pääosan antigeeni A:sta ja pienemmän osan muita proteiineja, nimenomaan antigeeni B:tä. Yllä olevan 67664 menetelmän erään vaihtoehtoisen suoritusmuodon mukaan antigeeni A voidaan erottaa kromatografisesti sekä ensimmäisen että toisen kiinteän aineen seoksesta. Vielä erään vaihtoehtoisen suoritusmuodon mukaan voidaan ioninvaihtomatriisin avulla suoritettu kromatografinen erottaminen korvata kromatografisella erottamisella käyttäen ristiiiitettyä dekstraania, agaroosigeeliä, dekstroosisubstituoitua triatsiiniväriainetta, joka on immobili-soitu agaroosigeelille tai immobilisoitua vasta-ainetta.

Elatusaine voi olla mikä tahansa konventionaalinen elatusaine S. mutansille, kuten (Todd Hewitt'in lihaliemi (Todd E.W. & Hewitt L.F., J. Path. & Bacteriol. _35, 1932 , sivut 973-974), tryptoni/ hiiva-uute, tai jokin kemiallisesti määritelty elatusaine. Jäljessä seuraavan puhdistamisen vuoksi pidetään kemiallista elatusainetta parhaana. Antigeeni A:ta erittyy kasvuväliainee-seen kaikissa viljelyn vaiheissa. Solut otetaan talteen edullisesti aikaisessa stationäärisessä vaiheessa (tyypillisesti 15-25 h lämpötilassa 37°C). Solu voidaan viljellä myös jatkuvana viljelynä.

Proteiiniliuos saattaa käsittää ainoastaan viljelmäsuodoksen, joka on saatu poistettaessa kokonaisia soluja, tai solun-seinämistä ja jäännöksistä vapautetun solu-uutteen tai se voi olla näiden seos, joka on muodostunut särjettäessä koko viljelmän solut, jonka jälkeen on poistettu solunseinämät ja jäännökset. Solunseinämät voidaan poistaa joko kokonaisina soluina tai osina hajottamisen jälkeen, käyttäen konventionaalista tekniikkaa kuten sentrifugoimista tai suodattamista.

Puhdistettu antigeeni A-valmiste voidaan formuloida rokotteeksi käyttäen konventionaalisia farmaseuttisesti sopivia kantaja-aineita ja apuaineita (esimerkiksi aluminiumhydroksidia), stabiloivia aineita ja bakteeriostaatteja. Rokote voi sisältää proteiinia yhdestä tai useammasta S. mutans-kannasta ja sitä voidaan antaa ihmiselle tai muille imettäväisille subkutaani-sesti, intramuskulaarisesti, intravenöösisti tai submukoosisti, annossuuruuden ollessa tyypillisesti 1-50, erikoisesti 10 ^,ug/kg ruumiinpainoa kohti. Mahdollisesti tarvitaan useita ruiskeita, jotta saataisiin syntymään riittävä vasta-ainevaste. Suoja voidaan saada aikaan myös immunisoimalla oraalisesti, esimerkiksi nielemällä antigeeniä sisältävä kapseli.

7 67664

Farmakologinen valmiste voi olla ruiskutettava valmiste, tai se voi olla paikallisesti annettavassa muodossa, esimerkiksi hammastahna tai suuvesi. Se voi sisältää ainoastaan antigeeni A:n vasta-aineita tai se voi sisältää muiden S. mutans-antigee-nien vasta-aineiden seoksen. Vasta-aineet voidaan valmistaa konventionaalisen tekniikan mukaan injektoimalla S. mutans-an-tigeenivalmistetta, johon sisältyy myös antigeeni A:ta, sopiviin eläimiin kuten lehmiin tai kaniineihin. Sopivia antigeenival-misteita ovat erikoisesti SDS-pestyt solunseinämät ja puhdistettu antigeeni A, valmistettuna kuten on selostettu edellä.

On otettava huomioon, että kaikkien keksinnön mukaisten aineiden vaikutus johtuu antigeeni A:n vasta-aineista, jotka joko ovat lääkkeeksi annetussa tuotteessa tai jotka syntyvät immuunivasteena sillä, jolle lääke annetaan. Näiden vasta-aineiden kariesta ehkäisevää vaikutusta ei ymmärretä täysin, mutta tämä ymmärtäminen ei ole tärkeintä keksinnön toteuttamiselle. On mahdollista, että ne vaikuttavat bakteerisolujen metabolismiin ehkäisten joko glukaanin tai hapon muodostumisen.

Seuraavassa selostetaan keksinnön mukaisia tyypillisiä valmistusmenetelmiä ja yhdisteitä esimerkin vuoksi viitaten mukana oleviin piirustuksiin, joista kuva 1 esittää IgG-vastetta antigeeni A:lie immunisoiduissa (käyrä a) ja kontrollieläimissä (käyrä b) kuva 2 esittää IgG-vastetta antigeeni A:lie yhdessä ainoassa eläimessä.

Vastaseerumin valmistaminen SDS-uutetuille solunseinämille Käytettiin Streptococcus mutansia, hyvin tunnettua Ingbrittiä.

Tätä kantaa on selostanut Krasse B., Archs.Oral Biol. _1_1_ sivut 429-436 ja se on luokiteltu Coykedalin systeemin geneettisenä tyyppinä 1 (J.Gen .Microbiol. 8_3 , 1974 , 327-338) ja serotyyppinä c Bratthallin mukaan (Odont.Revy 2_0, 1969 , 231-243) ja talletettu NCIB:hen, Aberdeenissä, Skotlanti, talletustunnuksella NCIB:11516.

8 67664

Bakteereja viljeltiin Todd-Hewitt-lihaliemessä (kuten Todd,E.W. ja Hewitt,L.F. ovat selostaneet, J. Path and Bacteriol., osa 35, 1 932 sivut 973-974) , kunnes stationäärinen vaihe oli saavutettu (16 h). Solut otettiin sitten talteen sentri-fugoiraalla ja suspendoitiin natriumdodekyylisulfaattia (SDS) sisältävään liuottavaan Laemmlin puskuriin (Nature 227, 1970 sivut 680-685) kiehuvassa vesihauteessa 20 min. ajan. Soluja pestiin sitten runsaalla vedellä sentrifugoimalla, pakaste-kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen veteen konsentraatioon 10 mg/ml. Kaniini immunisoitiin näillä SDS-uutetuilla soluilla, 1 ml + 0,1 ml aluminiumhydroksidi-apuainetta ruiskutettiin intramuskulaarisesti 0, 21 ja 48 päivinä. 55. päivänä kaniinista vuodatettiin veri sydämeen punktioimalla.

Samanlaisia tuloksia saatiin, kun soluja uutettiin SDS:n vesi-liuoksella 10 g/litra keittämällä 20 min., tai 1 h huoneenlämmössä .

Antigeenien A ja B karakterisoiminen

Vastaseerumia, joka oli valmistettu kuten edellä, kokeiltiin immunodiffuusion avulla Ingbritt-solujen komponentteihin (kokonaisten solujen sentrifugaatti-uutteen muodossa) samoin kuin proteiineihin Ingbrittin viljelysuodoksessa, joka oli konsentroitu ammoniumsulfaattisaostuksella. Havaittiin kaksi presipitiini-vyöhykettä ja nämä olivat antigeenisesti identtiset sentrifugaatin ja sakan päällä olevan liuoksen kanssa.

Kun käsiteltiin kumpaakin antigeenivalmistetta ei-spesifisen proteolyyttisen entsyymi Pronaasin (Sigma Chemical Co) kanssa, ei tuloksena ollut minkäänlaista presipitiini-vyöhykettä, mikä osoitti antigeenien proteiiniluonnetta.

n 67664

Kun vastaseerumia testattiin solusentrifugaatin ja viljelysuo-doksen suhteen herkemmällä risti-immuunoelektroforeesilla, voitiin todeta vain kaksi antigeeni/vasta-aine saostusreaktiota.

Samat kaksi antigeeniä voitiin todeta, kun vielä yhtä serotyyppi c kantaa,jota on saatavana National Collection of Type Cultures, Colindale, Englanti NCTC 10449:nä, uutettiin ja käytettiin vasta-seerumin muodostamiseen kuten yllä on selostettu.

Näiden molempien antigeenien fysikaalisista ominaisuuksista saatiin tietoja risti-immuunoelektroforeesin avulla, jossa ensimmäinen dimensioerotus tapahtui isoelektrisellä fokusoinnilla polyakryy-liamidigeelissä (proteiinien erottamiseksi niiden varauserojen mukaan) tai SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesin avulla(proteiinien erottamiseksi niiden molekyylipainon mukaan). Saadut tulokset osoittivat, että antigeeni A:n isoelektrinen piste oli 4.3 ja molekyyli-paino 29 000 + 3000, kun taas B:n isoelektrinen piste oli 5.4 ja molekyylipaino lähellä 200 000:tta. Tarkempi SDS-polyakryyliamidi-gradientti geelielektroforeesi vahvisti arvon 29 000 A:lle ja antoi arvon 190 000 B:lle. Molekyylipainon standardeina käytetyt merkki-proteiinit olivat kaniinin myosiini, 200 000; 6-galaktosidaasi, 116 000; fosforylaasi A, 94 000; naudan seerumialbumiini, 68 000; munan albumiini, 43 000; chymotrypsinogeeni A, 25 700; B:n arvo on vielä ehdollinen, koska erilaiset värjäysmenetelmät ilmoittivat B:n sisältävän jonkin verran hiilihydraattia ja glykoproteiinien tiedetään osoittavan tavallisuudesta poikkeavaa vaeltamista geelielektro-foreesissa.

SDS-uutettuja Ingbrittin soluja vastaan kehitettyä vastaseerumia käytettiin osoittamaan, että A:n ja B:n kanssa identtisiä antigeenejä muodostivat 6 muuta serotyyppikantaa c (mukaanluettuna myös FW293, C67-1, GS-5 ja OMZ-70, kuten on selostanut Russell RRB, Microbios Letters, osa 2 (1976), sivut 55-59) ja samoin serotyyppiä e (kanta P4) ja f (kanta 151) edustavat kannat. Nämä kaksi jäl- kirrmäistä serotyyppiä ovat siimassa geneettisessä ryhmässä kuin serotyyppi c (s.o.) Coykendallin geneettinen ryhmä I, jolle nimi S.mutans Clarke on ehdotettu (Coykendall, 1977, Int. J.Syst. Bacteriol 2j7, sivut 26-30) ja niiden on osoitettu olevan läheistä sukua antigeenisestä (Bratt-hall et ai J.Dent.Res 55 A, 1976, sivut 60-64; Perch et ai, Acta Path Microbiol.Scand Sec B 82, 1974, sivut 357-370) ja omaavan samanlaiset proteiinikokoomukset (Russell, Microbios Letters 2, 1976 10 67664 sivut 55-59). Serotyyppi c kannat sisältävät antigeenin, joka reagoi ristiin antigeeni A:n kanssa, sitä vastoin antigeenejä, jotka reagoivat ristiin antigeeni B:n kanssa, on havaittu serotyypeissä a, d ja g ja S.sanguis kannoista.

Puhdistetun antigeeni A:n valmistaminen

Proteiinien A ja B keksimisen jälkeen viljelysuodoksissa ovat lisä-kokeet osoittaneet, että molempia antigeenejä erittyy läpi koko kasvusyklin joko Todd-Hewitt lihaliemessä, trvptooni/hiiva/uutteessa, tai kemiallisesti määrätyssä (CD) Jandan ja Kuramitsun elatusainees-sa (Infect. Immun 1_4 1976, sivut 191-202). Koska CD-elatusaine sisältää vähimmin aineosia, joiden voisi olettaa häiritsevän puhdis-tusvaiheita, se valittiin käytettäväksi. S.mutans kantaa Ingbritt viljeltiin CD-elatusaineessa aikaiseen stationääriseen vaiheeseen ja solut poistettiin sentrifugoimalla, jota seurasi suodattaminen lasikuidun läpi. Jos halutaan valmistaa puhdasta antigeeni B:tä, täytyisi suodos laskea kromatografia-pylvään läpi, joka sisältää liukenematonta glukoosipolymeeri-mutania ja polyakryyliamidigeeli-pallosia (BioGel P 2), jotka on valmistettu siten kuin ovat selostaneet Mc Cabe ja Smith (Infect.Immun. 1977, 16:760-765), jotta poistettaisiin glukosyylitransferaasi-entsyymit, joiden taipumuksena on tavallisesti puhdistua antigeeni B:n kanssa. Lisättiin hitaasti kiinteää ammoniumsulfaattia, niin että syntyi 45-prosenttisesti kyllästetty liuos, ja sakka joka muodostui yön aikana 4°C:ssa, otettiin talteen sentrifugoimalla. Esikokeet olivat osoittaneet, että antigeeni B saostui maksimaalisesti 45-prosenttisesti kyllästetyssä ammoniumsulfaatissa, kun taas antigeeni A saostui maksimaalisesti 65-prosenttisessa. Lisää ammoniumsulfaattia lisättiin sen vuoksi, että viljelysuodos saatiin 65-prosenttisesti kyllästetyksi ja koottiin taas sakka talteen. Molemmat fraktiot dialysoitiin 50 mM Tris HC1 puskuria vasten (pH 7,5), jota puskuria käytettiin läpi koko puhdistuksen, ennen seuraavaa vaihetta, joka oli kromatograa-finen puhdistus DEAE ristiliitetyllä dekstraanilla (DEAE Sephadex A 25-rekisteröitv tavaramerkki). Käytettiin näytteitä pylväiden erottamiseksi, jotka oli aikaisemmin tasapainoitettu Tris-puskurin avulla. Pylväät eluoitiin antamalla yhden tilavuuden Tris-puskuria valua alas ennen kuin käytettiin lineaarista gradienttia 0-0,3 M NaCl Tris-puskurissa. Otettiin talteen peräkkäiset fraktiot ja analysoitiin SDS-polyakryyliamidilevygeeli-elektroforeesin avulla ja 11 1 1 6 7 6 6 4 "fused rockef-immuunoelektroforeesin avulla vastaseerumia vastaan, joka oli valmistettu SDS-uutettuja soluja vastaan.

Antigeeni B (45-prosenttinen ammoniumsulfaatti) eluoitui suunnilleen C,08 M"NaCl:lla, kun taas antigeeni A eluoitui suunnilleen 0,13 M NaCl:lla. Kussakin tapauksessa antigeeniproteiinit arvioitiin 90-prosenttisesti puhtaiksi. Antigeeniä sisältävät fraktiot pantiin pooleihin, dialysoitiin Tris-puskuria vastaan ja konsentroitiin ultrasuodattamalla. Kutakin osittain puhdistettua antigeeniä pantiin agaroosigeelipylvääseen (Sepharose CL-6 B-rekisteröity tavaramerkki) ja eluoitiin Tris-puskurilla. Fraktiot otettiin taas talteen ja analysoitiin antigeenit ja proteiinikompositiot.

Edellä olevan menettelytavan avulla saatiin proteiini A:n ja B:n valmisteita, jotka ovat ilmeisen puhtaita, kun käytetään kriteeri-ona SDS-polyakryyliamidi-geeli-elektroforeesia ja isoelektristä fokusointia polyakryyliamidigeelissä.

Kun näitä antigeeni A:n ja B:n valmisteita injektoitiin kaneihin lisäaineen kanssa immunisointiohjelman jälkeen, joka on identtinen sen kanssa, joka on selostettu edellä SDS-uutetuista soluista, saatiin monospesifisiä vastaseerumeja jotka, kun niitä testattiin puhdista-mattomiin antigeenivalmisteihin käyttäen saostaminen-geelissä-tekniik-kaa, saostivat vain homologista antigeeniä.

Monospesifisiä vastaseerumeja, jotka on kehitetty antigeenejä A ja B vastaan, voidaan käyttää antigeenien immunosorbent-affiniteetti kromatograafiseen puhdistukseen. Tyypillisessä valmisteessa seerumin inmuunoglobuliini G fraktio yhdistettiin ristiliitettyihin agaroosi-pallosiin (CnBr-aktivoitu Sepharose, Pharmacia) valmistajien suosittelemalla tavalla. Konsentroitua S.mutans Ingbritt-kannan viljelysuo-dosta 0,5 M Tris/HCl puskurissa pH 7,5, joka sisälsi 1 % Triton X-100, annettiin valua alas pylväässä. Pylväs pestiin sitten käyttäen useita tilavuuksia Tris-puskuria ennen kuin eluoitiin joko Tris puskurilla, joka sisälsi 3 M natriumtiosyanaattia, tai 0,1 M glysiini/HCl puskurilla pH 2,8 (vaikka muut eluointiaineet voivat osoittautua yhtä tyydyttäviksi). Menetelmällä saadaan halutun antigeenin puhtaita valmisteita. Mikäli sattuisi jonkin verran IgG:n vapautumista pylväästä, tämä voidaan helposti erottaa antigeenistä ioninvaihto-kromatografiän avulla, kuten edellä on jo selostettu.

67664 12

Affiniteetti-puhdistetun antigeenin aminohapporakenne määrättiin hydrolyysin jälkeen, joka tapahtui 48 h 105°C:ssa 6 N HCl:ssä, ja on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1

Proteiinihydrolysaattien aminohappokokoomus Jäännökset 1000 jäännöstä kohti

antigeeni A antigeeni B

Asparagiinihappo 101 103

Treoniini 56 60

Seriini 91 61

Glutamiinihappo .106 111

Proliini 65 44

Glysiini 190 212

Alaniini 89 117

Kystiini - Väliini 53 58

Metioniini

Isoleusiini 38 38

Leusiini 61 53

Fenyylialaniini 28 25

Tyrosiini - 10

Histidiini 50 18

Lysiini 46 64

Arginiini 27 26

Aminosokeri - 4

Antigeenisten ja suojaominaisuuksien arviointi

Antigeenejä A ja B pannaan bakteerien pinnalle ja ne toimivat immu-nogeeneina. Kokeet, joissa immunisoitiin useita kymmeniä kaniineja ja apinoita ovat osoittaneet, että vasta-ainevasteet antigeeni A:lie ja B:lle ovat huomattavasti vahvempia kuin muille antigeeneille.

Tämä vaikutus on vieläkin selvempi, kun eläimet immunisoidaan solun-seinämärikaste-valmisteilla. Kuten edellä on selostettu, SDS-uutetut seinämät synnyttävät vasta-aineita ainoastaan A:lie ja B:lle, kun taas seinämät, joita uutetaan vähemmän tarkasti, antavat kuitenkin n 13 67664 voimakkaimman vasteensa A:lle ja B:lle, ja heikompia vasteita on havaittu ainoastaan kahdelle muulle antigeenille.

Vasta-aineita voidaan löytää käyttämällä konventionaalista tekniikkaa, risti-immuunoelektroforeesia tai "reserved-rocket line" elektroforeesia .

Vasta-aine-vasteiden suuruuden määritys on suoritettu entsyymi-sidos-immuunosorbent-kokeen avulla (enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)), jota seuraa mikrolevy-tekniikka, Voller, Bidwell ja Bartlett (1977, Flowline Publications). Muoviset mikrotiitteri-laitteet päällystettiin immunoaffiniteetti-puhdistetuilla antigeeneillä A tai B, konsentraatioilla suunnilleen 1 ^ug/ml.

Koe apinan vasta-aineen sitoutumisen määrästä antigeeniin suoritettiin inkuboimalla ei ihmisestä peräisin olevan IgG:n kanssa, joka oli konjugoitunut alkalisen fosfataasin kanssa (Don Whitley Ltd). Tulokset on ilmaistu joko loppupiste-tiitterinä (s.o. laimennussarjan kuoppalevyn viimeinen kaivo, joka näyttää selvän värin), tai mittaamalla absorptio 405 nmrllä, joka on saatu seeruminäytteestä jollakin määrätyllä laimennuksella.

Kokonaisten solujen immunogeenisyys

Useita kokeita, joissa on immunisoitu onnistuneesti apinoita S.mu-tansin kokonaisilla soluilla, on selostettu, kuten edellä on lainattu (Bowen et ai, Brit.Dent.J. 1975 ja Cohen et ai Brit.Dent.J.1979), ja karieksen vähentyminen on ollut 50 % tai yli. Eräässä edustavassa kokeessa käsiteltiin 4 koe-eläintä ja 2 kontrollieläintä samalla tavoin tapetuilla kokonaisilla soluilla (Group 14, Cohen et ai, British Dental Journal osa 147, 1979 sivut 9-14). Injektiot annettiin 0., 2., 5., 6., 12. ja 18. kuukautena. Vasta-aineen (IgG) keskiarvota-sot koe- ja kontrolliryhmissä on esitetty kuvassa 1. Vasta-aineiden taso 12 kuukauden jälkeen oli antigeeni A:lie vähintäin 30-kertainen kontrolliin nähden, vaikka tämä taso putoaakin "booster"-injektioiden välissä. On korostettava, että on epätodennäköistä, että näin monia injektioita tarvittaisiin välttämättä suojan saamiseksi, mutta tätä keksinnön aspektia ei ole vielä tutkittu.

Neljä vuotta kokeen alkamisesta oli kontrollieläimillä keskimääräi- 14 67664 nen luku 5 kariesvauriota pysyvissä hampaissaan, kun taas immunisoiduilla eläimillä oli keskimäärin 2 vauriota.

Näistä tuloksista voidaan nähdä, että on olemassa selvä korrelaatio antigeeni A:n vasta-aine-tasojen ja hammaskarieksen suojan välillä. Antigeeni A:n vasta-aineita esiintyy vain harvoin ja matalalla tasolla ei-immunisoiduissa yksilöissä. Tällainen "luonnollinen vasta-aine" on myös havaittu antigeeni B:lle joissakin tapauksissa. Ei ole tiedossa,milloin nämä vasta-aineet syntyvät, tai olivatko ne peräisin S.mutansin antigeenisestä stimulaatiosta hampailla, S.mutansin systeemisestä infektiosta, tai muiden bakteeriantigeeni-nien risti-reagoinnista, joihin eläimellä ei ole immuunivastetta.

Eräässä toisessa kokeessa immunisoitiin 8 apinan ryhmä kokonaisilla soluilla plus apuaineena alumiinihydroksidia injektoimalla subkutaani-sesti jalkaan, (Group 11, Cohen et ai, British Dental Journal, kuten yllä) ja verrattiin 8:an kontrollieläimeen. Tässä ryhmässä antigeeni A:n vasta-aine-tasot olivat kohonneita kaikissa kontrollieläimissä, keskimääräinen tiitteri oli 1/520. (Huom., ei ole mahdollista menetelmien variaatioiden vuoksi verrata tässä eri ryhmistä esitettyjä tiittereitä). Mutta keskimääräinen tiitteri kokonaisilla bakteereilla immunisoiduilla eläimillä, 6 kk toisen "teho"- eli "booster"-injektion jälkeen oli 1/2830 - yli 5 kertaa kontrollitaso. Antigeeni B:n vasta-aineita oli myös läsnä immunisoiduissa eläimissä. 55-pro-senttinen väheneminen karieksessa havaittiin immunisoitujen ja kont-rollieläinten välillä.

Särjettyjen soluseinämien immunogeenisyys

Ingbritt-kannan särjetyillä soluilla tehdyn immunisoinnin, jonka on selostanut Bowen et ai (British Dental Journal 1975, sivut 45-58), on osoitettu antavan suojan tätä kantaa vastaan.

Immunisointi trypsinisoiduilla soluseinämillä ei anna suojaa, mikä viittaa siihen, että suojaamisprosessissa on mukana proteiinia.

Koottiin seerumia neljästä koeapinasta, jotka oli immunisoitu Ingbritt-kanran solunseinämä-valmisteella ja ne pantiin alttiiksi saman kannan vaikutukselle, kuin on selostettu Group C:n suhteen, Bowen et ai.

5 kontrolliapinaa joutui samalla tavoin alttiiksi ilman immunisointia .

15 67664

Kontrollieläimillä olivat antigeeni A:n vasta-aineen tiitterit<1/20 (3 eläintä), 1/80 (1 eläin) ja 1/1280 (1 eläin), kun taas immunisoiduilla ja suojatuilla eläimillä olivat tiitterit välillä 1/80 - 1/640 keskiarvon ollessa 1/220. Nämä arvot oli saatu seeruminäytteistä, jotka oli otettu 20 kk viimeisen "booster"-injektion jälkeen.

Viisi vuotta kokeen alkamisesta oli kariesvaurioiden kokonaislukumäärä neljässä koe-eläimessä 4. Viidessä kontrollieläimessä oli vaurioiden kokonaislukumäärä 64 ja luku oli päinvastaisessa suhteessa vasta-aineiden tasoon seerumissa, ja kahdella kontrollieläimellä ei ollut minkäänlaista vasta-aine vastetta, vaan niissä esiintyi kariesta.

Yhdeksän vuoden kuluttua kokeen alkamisesta oli 5 eläintä vielä elossa, kaksi immunisoidusta ryhmästä ja kaksi kontrolliryhmästä olivat kuolleet. Kolmessa eloonjääneessä kontrollieläimessä esiintyi kaikissa kariesta ja niillä oli vastaavasti 56, 69 ja 93 vaurioitunutta pintaa. Vain yksi ainoa pieni vaurio oli kehittynyt yhden immunisoidun eläimen hampaassa, mutta toinen oli vapaa karieksesta .

Puhtaan antigeeni A:n immunogeenisyys

Edellä olevista tuloksista selviää, että antigeenit A ja B, jotka on injektoitu kokonaisten bakteerien tai bakteerien soluseinämien aineosina, pystyvät synnyttämään immuunivasteen, kun läsnä ei ole mitään apuainetta (ryhmä C) tai kun lisätään aluminiumhydroksidi-apuainetta (ryhmä 11). Immunisointi puhtailla antigeeneillä vaatii kuitenkin mukaan jotakin apuainetta, jotta nopea ja jatkuva vaste syntyisi. Erään apinan (ruumiinpaino noin 5 kg) vasteet, joka oli immunisoitu 50 ^ug:lla antigeeni A:ta (joka oli valmistettu kuten edellä on selostettu käyttäen ammoniumsulfaatti-saostusta) alumini-umhydroksidin kanssa, on kuvattu kuviossa 2.

Claims (5)

67664 16

1. Menetelmä antigeenivalmisteiden valmistamiseksi Streptococcus mutans-lajin bakteereista, jota valmistetta käytetään hammas-karieksen kontrollointiin imettäväisellä, viljelmällä S.mutans-lajin bakteereita elatusaineessa soluviljelmän muodostamiseksi, poistamalla mainitusta soluviljelmästä ainakin soluseinämät, jolloin jäljelle jää proteiiniliuos, ja erottamalla antigeeni-valmiste proteiiniliuoksesta, tunnettu siitä, että antigeenivalmiste erotetaan proteiiniliuoksesta erotusmenetelmällä, joka käsittää affiniteettikromatografiän, jolloin prote-iiniliuos saatetaan kosketukseen immobilisoidun vasta-aineen kanssa, ei-toivotut aineet pestään immobilisoidusta vasta-aineesta ja antigeenivalmiste eluoidaan immobilisoidusta vasta-aineesta, joka vasta-aine on spesifinen yhden tai useamman antigeeni-proteiinin suhteen, jona ovat proteiinit, joilla on seuraavat ominaisuudet: ne esiintyvät Streptococcus mutansin geneettisen ryhmän I soluseinämillä, ne eivät ole uutettavissa mainituista seinämistä keitettäessä 10 g/1 natriumdodekyy1isulfaatin kanssa 20 minuutin ajan, niiden molekyylipaino on noin 29000 ja iso-elektrinen piste noin 4,1-4,5 ja käsiteltäessä proteolyyttisellä entsyymillä ne eivät muodosta presipitiini-vyöhykkeitä testattaessa immunodiffuusion avulla natriumdodekyylisulfaatilla uutettujen Streptococcus mutansin solujen vastaseerumia vastaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeri on S.mutansin geneettisen ryhmän I kanta.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeri on serotvyppi c-kanta.

4. Menetelmä antigeenivalmisteen valmistamiseksi Streptococcus mutans-lajin bakteereista, jota valmistetta käytetään hammas-karieksen kontrollointiin imettäväisellä, viljelemällä S. mutans-lajin bakteereita elatusaineessa soluviljelmän muodostamiseksi, poistamalla mainitusta soluviljelmästä ainakin soluseinämät, jolloin jäljelle jää proteiiniliuos, ja erottamalla antigeeni-valmiste proteiiniliuoksesta, tunnettu siitä, että antigeenivalmis te erotetaan proteiiniliuoksesta sellaisella erotusmenetelmällä, jossa proteiinilluokseen lisätään ammoniumsulfaattia 6 7 6 6 4 noin 45 %:een kyllästykseen asti ensimmäisen kiinteän aineen saostamiseksi, ensimmäinen kiinteä aine poistetaan, proteiini-liuokseen lisätään ammoniumsulfaattia noin 65 %:een kyllästykseen asti toisen kiinteän aineen saostamiseksi, toinen kiinteä aine otetaan talteen, toinen kiinteä aine liuotetaan toisen proteiini-liuoksen muodostamiseksi, toinen proteiiniliuos saatetaan kosketukseen dietyyliaminoetyyli-substituoidun ioninvaihtomatriisin (DEAE-matriisi) kanssa, ei-toivotut aineet pestään DEAE-matrii-sista ja antigeenivalmiste eluoidaan DEAE-matriisista, jolloin valmisteen antigeeniproteiineilla on seuraavat ominaisuudet: ne esiintyvät Steptococcus mutansin geneettisen ryhmän I solu-seinämillä, ne eivät ole uutettavissa mainituista seinämistä keitettäessä 10 g/1 natriumdodekyylisulfaatin kanssa 20 minuutin ajan, niiden molekyylipaino non noin 29000 ja isoelektrinen piste noin 4,1-4,5 ja käsiteltäessä proteolyyttisellä entsyymillä ne eivät muodosta presipitiini-vyöhykkeitä testattaessa imnu-nodiffuusion avulla natriumdodekyylisulfaatilla uutettujen Streptococcus mutansin solujen vastaseerumia vastaan.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeenivalmiste eluoidaan ionigradientilla 0. 1-0,2 M natriumkloridilla.