FI64045C - Foderblandning innehaollande 7-isopropoxiisoflavon - Google Patents

Description

- -^—.1 r„, .... KUULUTUSJULKAISU * λ η Λ C

J$är& B 11 UTLAGG NINGSSKRI FT 6404 5 ffejg C (45) Ι;·.ΐ —i li r:y::-,,.ai.y U 10 1933 ^ ^ (51) Kv.lk.^lnt.CI.3 A 23 K 1/16 SUOM I —Fl N LAN D (21) P«*nttlh»lwmii* — Pat«nuns6lcnlng 791702 (22) H*k*ml«pilvt — An*öknlng*d*g 28. Of .79 (23) Alku pilvi — Glltlghatsdtg 27.05.71 (41) Tullut |ulkl«ektl — Blivlt offmtllg 28. 05.79

Patentti- ja rekisterihallitus (44) Nlhtivikslpanon ja kuuLJullaliun pvm. —

Patent- och registerstyrelsen 7 Ansökan utlagd och utl.skrHtan publicarad 30.06.83 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begird prlorltst 27.05.70 Unkari-Ungern(HU) CI-996 (71) Chinoin Gyögyszer €s Vegyeszeti Termlkek Gyära RT., To utca 1-5,

Budapest IV, Unkari-Ungern(HU) (72) Laszlo Feuer, Budapest, Mihäly Nogrädi, Budapest, Agnes Gottsegen, Budapest, Borbäla Vermes, Budapest, Janos Streliszky, Budapest,

Andras Wolfher, Budapest, Lorant Farkas, Budapest, Sandor Antus,

Budapest, Maria Koväcs, Budapest, Unkari-Ungern(HU) (7M Oy Kolster Ab (5l) 7~isopropoksi-isoflavonia sisältävä rehuseos - Foderblandning inne-hällande 7~isopropoxiisoflavon (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta 1163/71 (patentti 57106) -Avdelad frän ansökan 1163/71 (patent 57106) Tämän keksinnön kohteena on rehuseos, joka sisältää 100 kg rehua kohti 1 - 20 g 7-isopropoksi-isoflavonia.

Koko maailmassa suoritetaan tällä hetkellä erittäin laajoja ja merkityksellisiä tutkimuksia proteiinipuutteen pienentämiseksi tai poistamiseksi. Tämän päämäärän saavuttamiseksi on eräs luonnol-lisimmista menetelmistä sellaisten ravintolisäaineiden käyttö, jotka parantavat nautittujen ravintoaineiden hyväksikäyttöä.

On kuitenkin erittäin vaikeata kehittää sopivia aineita ruumiinpainon nostamiseksi, koska sellaisten aineiden käyttö, joilla on hormonivaikutusta tai jotka ovat antibioottisia aineita, on kielletty useissa maissa.

Painonlisäyksen kannalta on isoflavoniyhdisteitä tutkittu perusteellisesti. Näitä yhdisteitä esiintyy kasvimaailmassa suhteellisen runsaasti ja huomattavalla osalla isoflavoneista on estrogee- 2 64045 nisiä ominaisuuksia (Virtanen, A. I.: Angew. Chem. 70, 544 (1958); Virtanen, A. I., ja Hietala, P. K.: Acta, Chem. Scand. 12, 579 (1958)). Nautittuaan määrättyjä apilalajeja eivät laitumella olevat eläimet pystyneet lisääntymään. Tätä koskevissa tutkimuksissa todettiin, että eläinten laitumella syömissä kasveissa olevat yhdisteet, genisteiini ja daidseiini, joilla on huomattava estrogeeninen vaikutus, ovat tämän vahingollisen vaikutuksen aiheuttajia ( Cheng, W. E. ym. Ann. N. Y. Acad. Sei. 61, 625 (1955)).

Erään menetelmän isoflavoniyhdisteiden estrogeenisen vaikutuksen määrittämiseksi on kehittänyt J. East, (J. Endocrin, 13, 94 (1955)). Sen jälkeen useat tutkijat ovat tutkineet erittäin perusteellisesti tätä ongelmaa (Matrone, G. ym.: J. Am. Chem. Soc. 85, 5258 (1958)).

Uudella isoflavonijohdannaisella on tähän asti tunnetun ruumiinpainoa nostavan vaikutuksen ylittävä vaikutus, mutta se on kuitenkin muissa suhteissa eläville organismeille käytännöllisesti katsoen vaaraton (DL^q >5 g/kg ruumiinpainoa); se on huomattavan riippumaton ravinnon koostumuksesta; sitä voidaan valmistaa teollisesti helposti ja taloudellisesti; se on stabiili, rajoittamattoman varas-tointikelpoinen, mauton ja hajuton yhdiste.

Keksinnön mukaisessa rehuseoksessa käytettynä 7-isopropoksi-isoflavonilla ei ole estrogeenista vaikutusta, vaan ainoastaan ruumiin painoa nostava vaikutus. Lisäksi sillä on myös androgeenivaiku-tuksesta vapaata anabolista vaikutusta (osoitettu N-retention ja Musculus levator-kokeen avulla tai lihaksia vahvistavan vaikutuksen mittauksen perusteella).

Seuraavassa esitetään eräitä metabolisia tutkimustuloksia.

Aineenvaihduntavaikutuksen tutkiminen:

Tutkimus suoritettiin käyttäen kastroituja rottia Musculus levator ani- ja Vesicula seminalis-näytteiden avulla. Preparaatteja annettiin 3 viikon tutkimusjakson aikana suun kautta. Tutkimukset suoritettiin Eisenberg'in ja Gordanin menetelmällä (Eisenberg, E., Gordan, G. S. J.: J. Pharmacol. 99, 38 (1950)). Lisäksi punnittiin eläinten preparoidut palleat. Näiden tutkimusten mukaan kasvoi Musculus levator ani1n paino merkitsevästi (p = 0,10), Vesicula semi-nalis'in paino ei lisääntynyt. Eläinten preparoidun pallean paino 3 64045 kasvoi samoin merkitsevästi (p = 0,05). Yhdisteellä oli siten anabolinen vaikutus ilman androgeenivaikutusta.

Kokeissa annettiin eläimille 30 mg/kg aktiivista yhdistettä.

Typen retentio tutkittiin myös rottakokeissa. Systemaattisen käsittelyn aikana pieneni typen erottuminen käsitellyistä eläimistä 20 - 30 päivästä alkaen merkitsevästi (p = 0,05).

Myös nämä tutkimukset vahvistavat yhdisteellä olevan anabolista vaikutusta.

S-35:llä merkityllä metioniinilla suoritettu tutkimus osoitti, että käsittelyn vaikutuksesta metioniini kiinnittyy suuremmassa määrässä käsiteltyjen eläinten lihaskudokseen.

Lihasten toimintaa lisäävää vaikutusta tutkittiin rottien uintircenetelmällä. Eläimiä kuormitettiin painolla 3 g/100 g ruumiinpainoa niiden uidessa vedessä, jonka lämpötila oli 29°C. Eläimille annetun ravinnon ravintoarvo ja määrä olivat samat kuin käsittelemättömällä vertailuryhmällä.

Uintiaikojen erot väsymiseen saakka 45 päivää käsitellyillä, päivittäin uitetuilla eläimillä ja vertailuryhmän eläimillä (joita käsiteltiin lukuunottamatta aktiivisen aineen antamista täysin samalla tavoin) oli 33 minuuttia, so. uintikyky kasvoi vertailuryhmän eläimillä 162 minuutista 196 minuuttiin, kun taas käsitellyillä eläimillä 162 minuutista 225 minuuttiin.

Nämä kokeet suoritettiin antamalla samalla päivittäinen annos, jonka suuruus oli 5 mg/kg ruumiinpainoa.

Lisäkokeissa onnistuttiin osittain eliminoimaan kortisonin antikatabolinen vaikutus kysymyksessä olevien yhdisteiden avulla, ja todettiin, että anabolisilla steroideilla samaa annostusta käytettäessä ei ollut voimakkaampaa anabolista vaikutusta kuin keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuilla yhdisteillä.

Ruumiinpainoanalyysissä todettiin, että lihasmassan lisäys oli spesifisesti suurempi kuin rasvamassan, ja että rasvan määrä pieneni lihaskudoksessa ja proteiinin määrä lisääntyi siinä.

Myrkyllisyyskokeet osoittivat yhdisteen täydellisen vaarattomuuden. Hiirikokeissa ei 48 tunnin pituisen tarkkailujakson aikana annoksella 4000 mg/kg ruumiinpainoa, voitu todeta yhtään kuolemantapausta. Myöskään subkutaanisella annoksella 3500 mg/kg ei kuolemantapauksia ollut.

64045 4

Rottakokeissa annoksella 3500 mg/kg ruumiinpainoa ei 48 tunnin kuluessa ollut todettavia muutoksia, ja subkutaanisella annoksella 3500 mg/kg ruumiinpainoa saatiin samanlaiset tulokset.

Koirakokeissa ei 3500 mg/kg suuruinen annos ruumiinpainoa kohden viikon pituisen tarkkailuajan kuluessa aikaansaanut todettavia muutoksia.

Subkutaaniset myrkyllisyyskokeet suoritettiin rottien avulla. Tällöin päivittäisen peroraalisen annostuksen ollessa 200 mg/kg ruumiinpainoa ja 500 mg/kg ruumiinpainoa ei kuukauden pituisen tarkkailuajan kuluessa voitu todeta minkäänlaisia muutoksia.

Samanlaiset tulokset saatiin suoritettaessa subkutaanisia kokeita hiirillä.

Kroonisissa myrkyllisyyskokeissa rotilla ja koirilla 3 kuukautta kestävän päivittäisen annostelun aikana ei annoksilla 100 mg/kg ja 10 mg/kg ruumiinpainoa todettu minkäänlaisia muutoksia urospuolisissa eikä naaraspuolisissa rotissa (täydellinen verentut-kimus, histologiset ja muut kliiniset kokeet).

Samanlaiset negatiiviset tulokset saatiin myrkyllisyyskokeis-ta koiria käytettäessä ensimmäisen neljännesvuoden jakson päätyttyä. (Annostus 20 mg/kg ja 50 mg/kg ruumiinpainoa).

Yhdisteen estrogeenivaikutus tutkittiin uterus-kokeella hiiren poikasilla antamalla koeyhdistettä oraalisesti ja subkutaanisti. Yhdisteellä ei todettu olevan minkäänlaista estrogeenista vaikutusta.

Kanoilla saatettiin endokriiniset rauhaset 30 päivän pituisen annostelun jälkeen (5mg/kg ruumiinpainoa) perusteellisiin his-tologisiin tutkimuksiin, jolloin kuitenkaan ei voitu todeta huomattavia histologisia muutoksia.

Rotilla tutkittiin myös vaikutusta lisääntymiseen varsin perusteellisesti. Lisääntymiskapasiteetti ja poikueiden lukumäärä olivat aktiivisella aineella käsitellyillä uros- ja naarasrotilla samat kuin vertailuryhmällä.

Myös C-14:lla merkityn 7-isopropoksi-isoflavonin resorboitu-mista ja erottumista tutkittiin. Tällöin todettiin, että resorboi-tuminen tapahtuu sekä käytettäessä lihakseen annettuna että oraalista annosteltuna sangen nopeasti. Oraalisen annon jälkeen tapahtuu erittyminen puoliksi virtsaan ja puoliksi ulosteisiin.

κ 64045

Useissa elimissä todettiin 48 tunnin kuluttua käsittelyn päättymisestä radiografisesti osoitettavissa oleva aktiivisuus.

Toinen tunnusmerkki yhteytettävästä anabolisesta vaikutuksesta on kalsiumia ja fosfaattia pidättävä vaikutus. Kokeita suoritettiin nuorilla pässeillä ja rotilla, ja niissä todettiin koeyhdis-teiden kohottavan huomattavasti kalsiumia ja fosfaattia pidättävää vaikutusta annoksella 20 mg/kg ruumiinpainoa kohden. Näissä koesarjoissa todettiin lisäksi kaliumia ja typpeä pidättävä vaikutus. Menetelmässä on oleellista, että kalsium-, fosfaatti-, kalium- ja typpikierron suhteen tasapainoon saatettavien eläinten kokonais-ionikierto kontrolloitiin ennen käsittelyä ja käsittelyn jälkeen. Metalli-ionit määritettiin rehusta ja ulostuksesta hajoittamisen jälkeen liekkifotometrisesti ja virtsasta ja juomavedestä laimennuksen jälkeen liekkifotometrisesti. Epäorgaanisen fosforin pitoisuus määritettiin Fiske-Subbarowin menetelmällä ja typpipitoisuus Mikro-Kjeldahlin menetelmällä. Kalsiumia pidättävä vaikutus todettiin rotilla myös isotooppimenetelmällä. Näiden kokeiden jälkeen testattiin lääkevalmisteen kalsiumia pidättävä vaikutus liikuntakyvyttömäksi tekevässä luuston haurastumisessa. Tällöinkin todettiin kalsiumia pidättävä vaikutus, kun päiväannos oli 300 mg/dieet-ti. Potilaiden subjektiiviset vaivat ja myös kivuntunne vähenivät huomattavasti.

Syöttökokeiden tulokset.

Koe-eläimille annettiin 1-4 kuukauden ajan keksinnön mukaista rehuseosta, sekä vertailuryhmälle normaalia rehua, johon ei ollut lisätty isoflavonijohdannaista. Koe-eläimet eivät nauttineet enempää rehua kuin vertailuryhmän eläimet, pikemminkin esiintyi rehun säästöä.

Ruumiinpainoa nostava vaikutus oli väkevyyden ollessa 2 g aktiivista ainetta 100 kg kohden rehua eri eläinlajeilla seuraava: Vasikoilla 8 - 15 %

Naudoilla 7 - 10 %

Sioilla 7 - 10 %

Kanoilla 8 - 20 % Jäniksillä 10 - 20 %

Marsuilla 8 - 12 % 6 64045 Käsittelyssä voitiin todeta, että käsitellyillä eläimillä oli suurempi vitaalisuus ja että painon kasvu johtui pääasiallisesti lihasmassan kasvusta. Tämä ilmeni erikoisesti siankasvatuksessa, jolloin kysymyksen ollessa lihotussiasta rasvaköyhien, luokkaan A kuuluvien sikojen määrä oli huomattavasti suurempi.

Kananpoikasilla suoritettujen ruokintakokeiden tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon. Toiselle koe-eläinryhmälle (vertailuryhmälle) annettiin tavanomaista rehuseosta, ja toiselle koe-eläinryhmälle 2 g 7-isopropoksi-isoflavonia/100 kg rehua sisältävää rehuseosta.

Eläinten Eläinten Käsitte- Alku- Loppu- Painon- Rehun

Koeyhdiste luku- ikä ko- lyn kes- paino paino muutos hyväksi-määrä keen toaika (keskimääräis- (vertai- käyttö alussa arvot) lukohde) % % vrk viikkoa g + 7-isopropoksi- isoflavoni 20 3 4 42 374 + 9 93 vertailuryhmä 20 3 4 41 343

Seuraavat esimerkit valaisevat keksinnön mukaisia rehuseoksia.

Esimerkki 1

Siipikarjan rehuseoksen koostumus:

Maissia 40,0 kg

Rehuvehnää 20,0 kg

Leseitä 6,0 kg

Soijapapu-uutetta 13,0 kg

Maapähkinäuutetta 11,5 kg

Alfalfa jauhetta 1,4 kg

Auringonkukkasiemenuutetta 4,0 kg

Kalium-fosforilisäainetta ("Foszkal") 0,5 kg

Rehukalkkia 2,3 kg

Rehusuolaa 0,3 kg

Vitamiiniseosta 0,5 kg

Mineraaliseosta 0,5 kg 7-isopropoksi-isoflavonia 2 g