FI60859C - Foerfarande foer framstaellning av ovulationsframkallande dekapeptidamidderivat - Google Patents

Description

frSSrYl Tri ^kuulutusjulkaisu /τπβςα

Wa W WUTLÄGGNINGSSKRIFT60 8b9 + 9fS<jl£ C(<45) Patentti oyännetty 13 04 1002

Patent meddelat ^ ^ (51) Kv.lk.3/lnt.CI.3 C 07 C 103/52 SUOMI —FINLAND <n> Ptt«ntt(hak«mut— PuantantSknlng 750682 (22) H*k«mltpllvi — Antdknlngsdag 10.03*75 ' ' (23) Alkuptlvi — GlMghttKUf 10.03-75 (41) Tullut Julkiseksi — Uhrit offtntllg 09.09.75

Patentti- ja rekisterihallitus .... . , . .....

_ ., (44) Nlhtiviktlptnon jt kuul.Julkalsun pvm. —

Patent- och registerstyrelsen ' Antfkan utlagd oeh utl.tkrifun publtcsrad 31.12.8l

(32)(33)(31) Pyy4t«y «uoikeui —Begird prlorltet 08.03.7U

Japani-Japan(JP) 27UU2/7U

(71) Takeda Chemical Industries, Ltd., 27, Doshomachi 2-chome,

Higashi-ku, Osaka, Japani-Japan(JP) (72) Masahiko Fujino, Takarazuka, Hyogo, Tsunehiko Fukuda, Suita,

Osaka, Susumu Shinagawa, Higashi-Osaka, Osaka, Japani-Japan(JP) (7U) Oy Borenius & Co Ab (5U) Menetelmä ovulaatiota aikaansaavien dekapeptidiamidijohdannaisten valmistamiseksi - Förfarande för framställning av ovulationsfram-kallande dekapeptidamidderivat

Keksintö kohdistuu menetelmään uusien dekapeptidiamidijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on voimakas ovulaatiota edistävä vaikutus ja joita esittää kaava: (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R1-R2~R3-Arg-Pro-Gly-NH2 (I) jossa on Tyr tai Phe; R2 on D-Nle, D-Nva, D-Abu, D-Phe, D-Ser, D-Thr tai D-Met ja R^ on Leu, Ile tai Nle.

Tässä selityksessä ja vaatimuksissa aminohappoja ja peptidejä sekä niiden aktivoituja karboksyyli- tai suojaryhmiä esitetään lyhennyksillä, joita tällä alalla käytetään yleisesti ja jotka IUPAC-IUB:n biokemian nimistökomitea on hyväksynyt. Aminohappo on L-rakenteinen, jollei muuta ole mainittu.

Tässä käytetään esimerkiksi seuraavia lyhenteitä:

Abu: a-aminovoihappo

Arg: argiini B0C: t-butoksikarbonyyli

Bzl: bentsyyli 2 60859 DCC: N,N -disyklohekayylikarbodi-imidi

Gly: glysiini

His: histidiini HONB: N-hydroksi-5-norborneeni-2,3-dikarboksi-imidi lie: isoleusiini

Leu: leusiini

Nle: norleusiini

Nva: norvaliini

Met: metioniini OMe: metyyliesteri OBzl: bentsyyliesteri ONB: N-hy dr ok si-5-norborneeni-2,3-diknrbok si-in, idi esteri OSu: N-hydroksisukkinimidiesteri

Phe: fenyylialaniini

Pro: proliini (Pyr)Glu: pyroglutamiinihappo

Ser: seriini

Thr: treoniini

Tos: tosyyli

Trp: tryptofaani

Tyr: tyrosi ini

On jo kauan tiedetty, että hypotalamus käsittää tekijöitä, jotka säätelevät trooppisten hormonien eritystä aivolisäkkeestä· Kun aikaisemmin on tyrotro-piinia vapauttavaa hormonia (TRH) eristetty, on sittemmin uutettu keltahor-monia vapauttavaa hormonia (LH-RH) puhtaana sioista ja lampaista ja osoitettu sen olevan dekapeptidiä, jonka rakenne on: (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg—Pro—Gly- ffl!· (Α·Υ· Schally et ai, Biochem. Biophys, Res. Cornmun., 43, 1334 (1971)| B. Guiliemin et ai, Proc. Nat. Acad. Sei., U.S.A., 69, 278 (1972)). Tämän havainnon jälkeen on syntetisoitu joukko samanlaisia peptidejä, ja on myös tehty biologisia kokeita näillä analogisilla peptideillä· Pienikin muutos edellämainitussa aminohapporakenteessa alentaa kuitenkin merkittävästi peptidin fysiologista vaikutusta, ja mainitun kemiallisen rakenteen on katsottu olevan oleellinen maksimaalisen fysiologisen vaikutuksen syntymiseksi· (A«V· Schally et ai, Biochem. Biophys, Ros· Cornmun., 4, 366 (1972)).

Hiljattain ovat Monahan et ai julkaisseet "Biochemistry”:ssa, voi· 12, No 23, sivut 4616—4620 (ly73), että heidän syntetisoimistaan LH—RH—analogeista, kuten (Ala6)LH-RH-, (D-Ala6)LH-RH, (Val6)LH-RH, (D-Val6)LH-RH, (Pro6)LH*RH

3 60859 ja (D-Pro^)LH-RH, (D-Ala^)LH-RH:11a oli voimakkain teho, joka oli 350...450% alkuperäisen LH-RH:n arvosta. Kirjallisuudesta nähdään edelleen, että LH-RH-analogit, joiden 6-asemassa on D-aminohappo, jonka sivuketjumäärä on suurempi kuin D-Ala:n, ovat pienitehoisempia kuin alkuperäinen hormoni. Edellämainituista tunnetuista seikoista huolimatta keksijät valmistivat polypeptidejä (I), joissa on 6-asemassa suuremman sivuketjumäärän omaava D-aminohappo kuin D-Ala:ssa, sekä tutkivat niiden LH-RH-tehoa ja havaitsivat yllättäen, että näiden polypeptidien (I) teho oli ainakin 1000 % suurempi kuin alkuperäisen LH-RH:n teho.

Tämä keksintö on tuloksena näistä yllättävistä havainnoista.

Tämän keksinnön päätarkoituksena on siten aikaansaada uusia dekapeptidi-amidijohdannaisia (I), joilla on voimakas ovulaatiota aikaansaava vaikutus .

Toisena tämän keksinnön tarkoituksena on aikaansaada menetelmä deka-peptidiamidijohdannaisten (I) valmistamiseksi.

Keksintöä selvitetään tarkemmin seuraavassa.

Dekapeptidiamidijohdannaista (I) valmistetaan menetelmällä, jolle on tunnusomaista, että reagenssi (A), jona on L-pyroglutamiinihappo tai peptidiketju, jonka N-pääteaminohappona on L-pyroglutamiinihappoyksikkö ja joka samalla käsittää siitä eteenpäin edellämainitun aminohapposar-jan, kondensoidaan reagenssin (B) kanssa, joka on amiinikomponentti, joka vastaa dekapeptidiamidijohdannaisen (I) muuta osaa, jolloin molemmat reagenssit (A) ja (B) voidaan haluttaessa suojata suojaryhmän tai -ryhmien avulla sekä sitten poistetaan suojaryhmä tai -ryhmät, silloin kun näitä on käytetty.

Reagenssi (A) on siis L-pyroglutamiinihappo tai peptidiketju, jonka N-pääteaminohappona on L-pyroglutamiinihappoyksikkö ja jossa samanaikaisesti on tästä eteenpäin kaavan (I) mukainen aminohapposarja, sekä reagenssi (B), joka kondensoidaan reagenssin (A) kanssa, on amiinikomponentti, joka vastaa dekapeptidiamidijohdannaisen (I) muuta osaa, ja reagenssit (A) ja (B) ovat valinnaisesti suojattuja.

Reagenssin (A) sekä reagenssin (B) perusyhdistelmiä on esitetty seuraavassa taulukossa 1.

i ϊ ! ; 4 60859 j

Taulukko 1 P.eagenssi Yhdis^v telmä \. ! ____-__! 1 (Pyr)Glu-OH H-His-Trp-Ser-I^-R2- R^-Arg-Pro—Gly-I'IH2 2 (Pyr)Glu-His-OH H-Trp-Ser-R-j-Rg-Rj-

Arg-Pro-Gly-WH2 3 (Pyr)Glu-His- H-Ser-Rj-H^-R^-Arg-

Trp-OH Pro-Gly-NH2 4 (Pyr)Glu-His- H-R^-Rp-R-j-Arg-Pro-

Trp-Ser-OH Gly-NH2 5 (Pyr )Glu-His- II-R^R^-Arg-Pro-

Trp-Ser-R-j-OH Gly-NH2 6 (Pyr)Glu-His- H-R^-Arg-Pro-Gly-

Trp-Ser-R^-R2-0H NH2 7 (Pyr)Glu-His- H-Arg-Pr o—Gly-MH2

Trp-Ser-R^-Rp-

R^-GH

8 (Pyr)Glu-His-Trp- H-Pro-Gly-NH2

Ser-R1~R2-R^-Arg-

OH

9 (Pyr)Glu-His-Trp- H-Gly-ÄL,

Ser-R-,-Rp-R,-Arg-

Pro-OH

10 (Pyr)Glu-His-Trp- NHj

Ser-R^-Rg-R^-Arg-Pro-Gly-OH

-1------*-1---- 5 60859

On myös ennestään tunnettua, että yleiskaavan (II) b4co-ch2ch2ch(nh2)co- (II) esittämä auojattu L-glutamyyliryhmä (jossa kaavassa on alkoksiryhmä (esim* netoksi, etoksi, n-propokei, i-propoksi, n-butoksi jne.), aralkyyli-oksiryhmä (esim. bentsyylioksi jne.) tai amino) voidaan helposti muuttaa itse Ir-pyroglutamyyliryhmäksi:

H

°VA C0“ ly saattamalla se kosketukseen emäksen kanssa (esim· ammoniakin) tai hapon kanssa (esim. etikkahapon) sekä että ryhmä (il) on tässä suhteessa ekvivalentti itse L-pyroglutamyyliryhmän kanssa. Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä on ymmärrettävä, että reagensain (a) L-pyroglutamyyli (te. (Pyr)-Glu) ei tarkoita ainoastaan itse I^-pyroglutamyy li ryhmää vaan myös kaavan (II) suojattua L-glutamyyliryhmää. Silloin kun reagensain (i) (Pyr)Glu-tarkoittaa ryhmää (il), tämä ryhmä (il) on helposti muutettavissa itse Ir-pyroglutamyyliryhmäksi sinänsä tunnetuilla tavoilla.

Tämän keksinnön mukainen kondenseitioreaktio voidaan suorittaa kondensaa-tiomenetelmillä, joita käytetään peptidi sidosten muodostamis·saa. Tällaisia ovat DCC/feONB-menetelmä (Belgialainen patentti No 796 399), atsidi-meneteinä, happoanhydridimenetelmä, sekoitettu happoanhydridimenetelmä, DCC**mene-telmä, aktiivista esteriä käyttävä menetelmä, Woodward-reagenssi—K-menetel-mä, karbodi-imidiatsoli-menetelmä, hapetus-pelkisty«-menetelmä ynnä muut (The Peptides, Voi. 1 (I960), Schröder and Lubke, Academic Press, New York, Ό.Ι.Α.).

Ennen kondensaatioreaktiota karboksyyli- ja aminoryhmät, jotka eivät ole mukana mahdollisessa reaktiossa tai aktivoi karboksyyli- tai/ja aminoryhmiä, jotka osallistuvat reaktioon, voidaan suojata sinänsä tunnetulla tavalla. Lähtöaineen karboksyyliryhmät voidaan suojata metallisuoloinaan (esim. natrium- ja kaliumsuoloina) tai estereinä (esim. metyyli-, etyyli, bentsyyli-p—nitrobentsyyli-, t-butyyli- tai t-amyyliestereinä).

Lähtöaineiden aminoryhmien suojaryhmät voivat olla mitä tahansa tavallisia arainoryhciien suojaryhmiä peptidisynteeseissä, esim. bentsyylioksikarbonyyli, β 60859 t-butoksikarbonyyli, isobornyylikarbonyyli jne. Hietidiinin iminoryhmä voidaan suojata jollakin tavallisella suojaryhmällä, kuten bentsyyli-, toayy-li-2,4-dinitrofenoli-, t-butokeikarbonyyli- tai karbobentsoksiryhmillä. Seriinin hydrokayyliryhmä voidaan suojata tavallisella suojaryhmällä, kuten bentsyyli-, t-butyyli- ja muilla eetteriä muodostavilla ryhmillä· Tyrosiinin hydroksyjrliryhmä voidaan suojata bentsyyli-, t-butyyli— ja muilla eetteriä muodostavilla ryhmillä, arginiinin guanidinoryhmä voidaan suojata sellaisilla ryhmillä kuin nitro, tosyyli, karbobentaoksi, isobornyylioksikarbonyyli tai adamantyylioksikarbonyyli. Esimerkkeinä lähtöaineiden aktivoiduista kar-boksyyliryhmistä voidaan mainita vastaava happoanhydridi, atsidi, aktiiviset esterit (alkoholien kanssa muodostetut esterit (esim· pentakloorifenoli, 2,4,5—trikloorifenoli, 2,4-dinitrofenoli, syaanometyylialkoholi, p-nitro— fenoli, N—hydroksi—5—norborneeni—2,3—dikarhoksi-imidi, N—hydroksi«ukkinimi— di, N—hydroksiftaalihappoimidi tai N-hydroksibentsotriatsoli) jne. Lähtöaineiden aktivoituna aminoryhmänä voi olla esimerkiksi vastaava fosforihappo-amidi·

Seuraavassa taulukossa on esitetty eräitä tällaisia karboksyylin ja amino-ryhmien yhdistelmiä aineissa (A) ja (B).

Taulukko 2

Yhdi s teiniä-_Lähtöaine esimerkki (A) (B) COOH NH^ COOH NH^ 1* vapaa suojattu suojattu vapaa 2 aktivoitu suojattu vapaa vapaa 3 vapaa suojattu suojattu aktivoitu (Huomautus) Tähdellä * merkityssä tapauksessa reaktioaysteemissä on edullisesti mukana dehydrausaine (esim. karbodi-imidi, kuten di syklohekayylikarbodi-imidi).

Tämän keksinnön mukaisen reaktion kulku on esitetty seuraavassa kaaviossa· 60859 7 <ο h 1 3 as

0 P

a »

. M

a «-n «o I

•H <0 » TJ

IS P ® ft φ I—I ®

O H

'—x ® *P i>%

o « p OP

p gO ¢0 ;(0 W

B « -P a ·Η N rl ® M ® Jd

a or* p :® —I

2; a, ι-t ο ih ® 1 o cm ® e» ►» a -.a ad p a —· :ot a 1¾ a a ·· a OE® I Ο β> CM « 1 JS :0 ►> Ä -H 0 "Τ' 0 h h :d *h U *h e u u a a» a -p r-i ft a a 1 «λ m +j r-i j ·η .. o :d o >» ·· CM be Oh h rH U · >> £j

Oh 3 (S 0« Ό Brnca 55 -<4 CO a 1 a ►, CM .H <n cm 1 eg bt a a w » p -h w eo w o M J4I5K»®*Ä

« --.> » -<ί ^ I λ p I

1 ~ ) · \ ί» ►»

CM 00 g Ο <P O ·* β rH

rt rt ·ρ o ca p :® <p e> t 7 « o 7 » * ^ i

ώ CM « Ο -Η « P O

rt ^ .p m o ® t» m d Pt ft ·β e it * o v 1 « i .p cm bt a > a be P « O h :S 1 -H h

« -25 *-HC BOM

«rt I Λ ft o ] »25 eo ►, ft P eo a o rt w> « -p rt

® a I <a Xi as I

a I CM ··“» * CM

a u rt o -h » rt o o I a « ►» i

(4 0 -t « a r-H rP

rt rt

l I

• 'o' ...........\ ® V ®

\ B PH ^ CO ^ CO

Ο -P ® rH I I

O » ►> p A A

:® Q :eJ ® P > M h

S B ' « H H

J3 · Μ ·Ρ 1 1 >»Β>»θΛβ * « Μ ·ρ M P <ρ ·ρ ·Η ·Ρ eo β ο οο φ Cm CÖ

•*-J φ ·Γ-3 -H Pi o 1 I

0 — o o -*-> a a a a o. a -p ή >p

« o » φ « O O

1 -p i a a « --- ^

rH P p ΐ4 >H M H M M

rt « rt a p ►* rt ►* >* 1 « I 3 P >p I rt rt h»M>>>.«M '-p — φ a » m t>> p φ (O Φ A CQ«fP« CO + O iz 1 -o as M ! a, a o o o p i ft m o a m a ® a m

EH M H CO Jd rt H

1 i l

•H «H «H

ta V rt v rt b * I * Ä

pH fp pH

o o ca

7Γ M M

£ 5 £ β 60859 Tämä reaktio voidaan suorittaa, kun läsnä on liuotinta. Liuotin voi olla jokin peptidikondensaatioreaktiossa yleensä käytetty liuotin. Esimerkkeinä voidaan mainita vedetön tai vettä sisältävä dimetyyliformamidi, dimetyyli-suli ok ei di, pyridiini, kloroformi, dioksaani, dikloorimetaani, tetrahydro-furaani sekä näiden liuotinten sopivat seokset.

Reaktioläcpötila on alueella, jota voidaan käyttää peptidisidosten muodostumiseen johtavissa reaktioissa, esim. alueella noin —20 °C - 30 °C. Edelleen tämän keksinnön mukaisten mahdollisten yhdisteiden aikaisemmat vaiheet (suojatut peptidit) voidaan myös helposti valmistaa kiinteässä faasissa tapahtuvilla reaktioilla.

Kun tarkoitettu kondensaatioreaktio on tapahtunut loppuun, suojaryhmät poistetaan tavalliseen tapaan, milloin näitä ryhmiä on. Tällaisia tavallisia menetelmiä on katalyyttinen pelkistys, kun läsnä on katalysaattoria, esim. palladiummustaa, palladiumhiiltä, platinaa tai vastaavaa, solvolyysi fluo-rivedyn, trifluorietikkahapon tai vastaavan avulla, sekä pelkistys natrium-metallilla nestemäisessä ammoniakissa· Käin valmistettu peptidi (l) voidaan ottaa talteen reaktiotuotteesta menetelmillä, joita tunnetaan peptidien talteenotosta, esim. uuttamalla, hajoittamalla, pylväskromatografialla jne.

Tämä reaktio voidaan suorittaa sinänsä tunnetulla kiinteää faasia käyttö»· väliä menetelmällä.

Peptidi (i) voidaan ottaa talteen myös suolana tai kompleksisena metalli-yhdisteenä·

Hapoista, jotka voivat muodostaa suoloja peptidin (i) kanssa, voidaan mainita epäorgaaniset hapot, kuten suolahappo, bromivetyhappo, perkloorihap-po, typpihappo, tiosyaanihappo, rikkihappo, fosforihappo jne., sekä orgaaniset hapot, kuten muurahaishappo, etikkahappo, propionihappo, glykolihappo, maitohappo, pyruviinihappo, oksaalihappo, ntclonihappo, raeripibkahappo, male-iinihappo, fumaarihappo, antranyylihappo, kanelihappo, naftaleenisulfonihap-po ja sulfanyylihappo.

Peptidien (I) kanssa kompleksisia metalliyhdisteitä muodostavista metalleista voidaan mainita mm. sinkki, nikkeli, koboltti, kupari ja rauta. Näitä metallikompleksiybdisteitä voidaan valmistaa tavallisilla menetelmillä, 9 60859 esim. saattamalla peptidi (l) reagoimaan metallihydroksidin tai -oksidin kanssa, kun pH on noin 6-8· Tämän keksinnön mukaisilla polypeptideillä (i) on LH—RH-vaikutus (keltahor-monia vapauttava hormoni-) ja siksi ne pystyvät edistämään LH:n (keltahormo-nin) eritystä sekä FSH:n (munarakkulahormonin) eritystä. Näin ollen poly-peptidit (l) ovat käyttökelpoisia lääkkeinä ovulaation aikaansaamiseksi naisilla ja eräillä eläimillä (esim. rotilla, lampailla, sioilla, lehmillä, tammoilla, viiriäisillä ja kanoilla). Peptidejä voidaan käyttää myös muihin lääketarkoituksiin, joihin käytetään tavallista LH-RH-, LH- ja FSH- valmistetta.

Koska polypeptidien (i) LH-RH-vaikutua on noin 10-26-kertainen luonnossa esiintyvään LE-RH:aan verrattuna, niiden annostus voidsan määrätä kutakin tarkoitusta varten ottamalla huomioon tämä moninkertainen vaikutus samanaikaisesti muiden vaikutusten (esim. kohde sekä taudin laatu) kansaa. Sopiva annos voi olla esimerkiksi noin 5 ng (nanogrammaa) - 10^ug päivässä ruumiinpainon kiloa kohti·

Polypeptidejä (i) annetaan anaisijaisesti muuta tietä kuin suun kautta (esim· ruiskeena tai peräsuolen tai vaginan kautta), vaikkakin eräissä tapauksissa antotapa voi olla myös suun kautta.

Käytettävisaä annostuamuodoisaa voivat olla esim· ruiske, auppoaitoriot, pessaarit ja jauheet· Ruiskeet voidaan valmistaa liuottamalla noin 10 )T — SOOjf* polypeptidiä (l) 1 ml:aan fysiologista keittosuolaa. Pöly-peptidejä voidaan myös valmistaa lyofiileiksi ampulleiksi, joihin on lisätty mannitolia täyteaineeksi, niin että niitä voidaan antaa ruiskeina satunnaisesti käytettäessä· Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käyttökelpoisia lähtöaine-peptidejä voidaan valmistaa joko peptidisynteeseistä tunnetuilla menetelmillä tai käyttämällä kulloinkin sopiviksi havaittua menetelmää·

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu selventämään keksintöä·

Esimerkeissä seuraavat lyhenteet tarkoittavat ohutkerroskromatografian Rf-arvoa piigeelillä seuraavi11a liuotinaineilla: ιο 60 8 5 9

Bf*: kloroformi - metanoli - etikkahappo, 9:1:0,5 2

Bf : etyyliasetaatti - pyridiini - etikkahappo - reel, 30:10:3:5 0

Bf : n-butanoli - etyyliasetaatti - etikkahappo - vesi, 1:1:1:1

Esimerkki 1 (Pyr)Glu-Ei a—Trp—Ser—Phe—(d)—Nva—Leu-Arg—Pro—Gly—NH^: n valmi etus a) Z-(D)-Nva—Leu—Arg(N0g)-Pro—Gly-NHgi valmistus

Liuokseen, joka sisältää Z—(D)-Nva-OH:a (380 mg), Η-Leu—Arg(N0g)-Pro-Gly-NHgja (690 mg) ja H0NB:a (300 mg) 5 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään 340 mg DCC:a 0 C:ssa, samalla sekoittaen· Sekoitusta jatketaan 2 tunti a 0 °C:esa sekä vielä 10 tuntia huoneen lämpötilassa* Beaktioseos suodatetaan muodostuneen disykloheksyyliurean poistamiseksi ja suodos haihdutetaan kuiviin. Saatu jäännös liuotetaan 100 ml:aan kloroformia ja liuos pestään 4-prosenttisells natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja vedellä· Pesty liuos kuivataan vedettömän magnesiumsulfaatin yläpuolella ja haihdutetaan kuiviin, Sitten jäännös hierretään etyyliasetaatin (25 ml) ja eetterin (25 ml) seokselle, jolloin saadaan valkeaa jauhetta, joka otetaan talteen suodattamalla sekä seostetaan uudelleen etanoli—eetteristä; 23 o 1 saanto 1,12 g, (¢^)^-50,5 (c-1,1, metanoliasa), Bf -0,32.

Analyysi kaavalla Cg^O^ lasketut arvot C 03,32, H 7,27, N 19,43 aatu C 53,49, H 7,56, N 19,19 b) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser—Phe-(D)-Nva-Leu— Arg-Pro-Gly-NH^n valmistus Z-(D)-Nva-Leu-Arg(N02)-Pro-Gly~NH2:a (1,0 g) liuotetaan 10 mitään 25-prosenttista bromivetyä etikkahapossa ja liuos sekoitetaan 50 minuutin a— jän. Beaktioseos laimennetaan 200 ml:11a kuivaa eetteriä, jolloin syntyy saostuma, joka otetaan talteen suodattamalla ja pestään hyvin kuivalla eetterillä, Saatu jauhe kuivataan natriumhydroksidin yläpuolella alennetussa paineessa. Tämä jauhe liuotetaan 10 ml;aan dimetyyliformamidia yhdessä (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OHtn (1,0 g) ja H0NB:n (400 mg) kanssa. Liuos jäähdytetään 0 °C;een ja tähän lisätään DCC:a (400 mg), samalla sekoittaen. Sekoitusta jatketaan 6 tunnin ajan 0 °C:ssa sekä vielä 16 tuntia huoneen lämpötilassa. Beaktioseos suodatetaan muodostuneen disyklohekqryliurean poistamiseksi, ja suodokseen lisätään 100 ml eetteriä, jolloin saadaan saostuma, joka erotetaan suodattamalla. Tämä saostuma liuotetaan 10-prosenttiseen etanolin vesiliuokseen ja liuos saatetaan kulkemaan polystyreenihartsipylvään läpi (Amberlite XAS—2 (150—250 mesh, 3,5 x 25 cm), Bohm & Haas Co.Ltd. U.S.A.^ li 6 0 8 5 9 ja pylväs eluoidaan asteittaisella menetelmällä 10-prosentti sei la etanolin vesiliuoksella ja 100-prosenttisella etanolilla (500:550 ml). Pääfraktio (380—520 ml) otetaan talteen ja haihdutetaan kuiviin· Jäännös liuotetaan 5 rljaan kuumaa metanolia ja säestetään lisäämällä etyyliasetaattia, jolloin saadaan suojattu dekapeptidiamidi. 1,41 gt ( )2"* - 35,4 0 (c-0,12 metano- lissa), Rf2«0,20, Rf3~0,56.

Suojattu dekapeptidiamidi (500 mg) liuotetaan 5 mljaan vedetöntä fluori-vetyä, ja samalla liuotetaan myös 0,5 ml anisolia, -70 °C:ssa. Kun liuosta on sekoitettu 30 minuutin ajan -5 °C:ssa, fluorivety poistetaan haihduttamalla· Saatu jäännös liuotetaan 20 ml:aan vettä, ja liuos uutetaan kahdesti 10 ml:lla etyyliasetaattia. Yesikerros saatetaan karboksimetyyliselluloosa-pylvääseen (2 x 33 cm) ja pylväs eluoidaan asteittaisella menetelmällä käyttäen eluaattina ammoniumssetaattipuskuria (0,005 M, pH 6,8 (500 ml) —-0,2 M, pH 6,8 (500 ml))· Pääfraktio (420 ml - 680 ml) otetaan talteen ja no lyofiloidaan, jolloin saadaan valkeaa jauhetta» Saanto 380 mg, (o()£ - 32,4° (c-0,52,1 etikkahapossa), Rf2»Q,05, Rf3«Q,68.

Aminohappoanalyysi: His 1,01) Arg 0,98) Trp 0,87) Ser 0,94) Glu 1,00)

Pro 1,02) Gly 1,00) Nva 1,01} Leu 1.,00) Phe 0,97 (peptidipitoi suu s 84 jt).

Esimerkki 2 (Pyr)G1u-Hi s-Trp-Ser-Tyr-(D)-N1e-Leu-Arg-Pro —Gly—NH^tn valmistus menetelmällä kiinteässä faasissa a) BOC-Gly-hartsin valmistus 60 mljaan kloroformi-etanolia (2:1) lisätään 10 g kloorimetyylihartsia (Cl-pitoisuus 2,0 mmol/g), minkä jälkeen lisätään 10,5 g B0C-Gly:a ja 8,4 ml trietyyliamiinia. Sekoitetaan huoneen lämpötilassa 1,5 tuntia ja sitten kuumennettuna 24 tuntia. Hartsi otetaan talteen suodattamalla ja pestään hyvin dimetyyliformamidilla sekä edelleen etanolilla, vedellä, etanolilla ja eetterillä sanotussa järjestyksessä, sekä kuivataan· Saanto 17,55 g. Amino-happoanalyyei osoittaa, että tämä hartsi sisältää 0,88 millimoolia/gramma BOC-Gly:a* b) (Pyr)Glu-His(Tos)-Trp-Ser{Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Nle-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly- hartsin valmistus 12 608 5 9

Automaattisen peptidi-syntetisoi jän (malli: APS-800, Simadzu Seisakusho K.K., Japani) reaktioastia panostetaan 2,177 g:11a BOC-Gly-hartsia, joka on saatu kohden a) mukaisesti, ja annetaan sen paisua dikloorimetaanin kanssa 12 tunnin ajan. Sitten seuraajat aminohapot syötetään allamainitussa järjestyksessä.

BOC-Pro, BOC—Arg(Tos), BOC-Leu, BOC-D-Nle, BOC-Tyr(Bxl), BOC-Ser(Bzl), BOC-Trp, BOC-His(Tos), (Pyr)Glu.

Bikloorimetaani (3x3 minuuttia) 50 trifluorietikkahappo/dikloorime- taani (10 min ja 30 min) ·* dikloorimetaani (3x3 min) ^ etanoli (3x3 min) dikloorimetaani (3x3 min) ·> 10 tri e tyyli amiini /kloroformi (10 min) > kloroformi (3x3 min) -e dikloorimetaani (2x3 min) BOC-aminohappoanhyd-ridi (valmistettu BOC-aminohaposta ja DCC:sta tavalliseen tapaan) (30 min ja 60 min) > asetylointi (etikkahappoanhydridillä dikloorimetaanissa ja tri-etyyliamiinissa) (1 tunti) -► dikloorimetaani (3x3 min) (vain (Pyr)Glu kon-densoidaan suoraan DCC:n kanssa dimetyyliformamidissa).

Lopuksi hartsi pestään etanolilla, kloroformilla ja dimetyyliformamidilla* Sitten se pestään eetterillä ja kuivataan. Saanto 6,20 g· e) (Pyr)Glu-His(Toe)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Leu-Leu-Arg(Toe)-Pro-Gly- NHgjn valmistus 50 ml:aan ammoniakilla kyllästettyä metanolia suspendoidaan 2,622 g kohdan b) mukaisesti valmistettua hartsia ja suspendiota sekoitetaan huoneen lämpötilassa 70 tunnin ajan.

Hartsi otetaan talteen suodattamalla ja peatään dimetyyliformamidilla· Suo-dos ja pesunesteet yhdistetään ja yhdistettyä liuosta käsitellään eetterillä. Menetelmällä saadaan 1,187 g epäpuhdasta jauhetta.

588 mg tätä tuotetta puhdistetaan kuivassa pylväässä, jossa on 50 g pii-geeliä, ja käytetään kehittimenä metanolin ja kloroformin seosta, jolloin saadaan 186mg haluttua tuotetta.

d) (PyrjGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-NHgjn valmistus

Sun liuoksessa on mukana 0,2 ml anisolia ja 0,2 ml merkaptoetanolia, 173,3 mg suojattua, kohdan c) mukaisesti saatua peptidiä liuotetaan 5 mljaan 13 60859 kuivaa iluorivetyä ja Huoata sekoitetaan O °C:saa 1 tuimin ajan. Sitten ae väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa ja jäännös liuotetaan 20 ml;aan vettä· Liukenematon aines poistetaan suodattamalla ja suodos saatetaan kulkemaan voimakkaasti emäksisen anioninvaihtohartsi—pylvään (Amberlite IRA-410, asetaattimuoto, Rohm & Haas, Co·, Ltd#, U»S»A.) (1,5 cm x 20 cm) läpi· Sitten neste puhdistetaan karboksyylimetyyliselluloosan avulla (1,5 x 22 cm; asteittainen eluutiomenetelmä, jossa käytetään 0,005 M - 0,2 M ammoniumsse-taattia, jonka pH on 6,8) sekä polystyreenihertsin avulla (Amberlite XA]>~2, Rohm & Haas Co., Ltd·, U.S*A·) (1,5 z 7,5 cm) asteittainen eluutiomenetelmä, jossa käytetään 5 - 70-prosenttista etanolin vesiliuosta)· Eluaatti geeli suodatuskromatografoidaen sitten Sephadez LH—20$Ha (Pharmacia Pine

Chemical?, Ruotsi) (0,9 z 53,5 cm) 0,1 N etikkahappo). Menetelmällä saadaan , , v 24 o / 39 mg haluttua yhdistettä· (r\ )p - 40,5 (c-0,5 5-prosentti sesaa etikkaha— possa). Aminohappoanalyysi (happohydrolyyei, kun läsnä on tioglykolihappoa)j Glu 0,97» His 0,97) Trp 0,94) Ser 0,88) Tyr 1,0) Leu 1,00) Nle 1,06)

Arg 1,03) Pro 1,00) Gly 1,03 (87 %),

Esimerkit 3-13

Esimerkissä 2 selostetulla menetelmällä, mutta käyttäen eeuraavaasa taulukos» sa lueteltuja lähtöaineita, valmistettiin taulukossa luetellut dekapeptidi- amidit (i).

14 60859 3 2 P* pi 0 <D Φ Ο) φ φ , η! η! h! Hl h! » ,1 I I I f - •go o o o o 3 ® .> o o o o o 2 .0 t _w Μ_ «__m__m *> •SqC)>-t Pi cö ft •H -3 Η Φ rO > X!

Φ CQ Hh CO EH

O :o I I I I I

••H-pQ O'-' O pq pq

<0 J3 I I H I I I

:o :aj o O tSJ O O O

ti^oom o o o % v m__pq ^ pq__m__pg , Π £ — — ^ ^ ^

n « H H H H H

.2 N Cs! N N N

« m pq pq pq #iC ft ft ft Ph ft ft ^ P^> Φ ® Eh Eh £h Eh eh

B « 1 1 1 < I

•g ® o o o o o " * o o o o o W pq pq pq pq pq •H |H H rH r- OcsjOf-go ct>h o h co co o o cn co ® οσ>ο<τ\ oomoomts crscrsocqcq σ>οοσ>σ^ ···· ····· ····· ·«···

.£· rlHHO HOHOO OOHOO OHHOO

Λ S M ft O q ttf) ft o pi ft ttf ft O cö ft H3 ft pi >> ft X 5 ΡΦΡΦ ft φ ft X) >> P 0) P > >! ΡΛΗΗ >,

3 O <q CO PM Hi <a) CO Pq << Eh <; CO pq a &h < Eh ΰϋ B

3 c-

S* gj, ««· * ·> ·* 4». · * · ». I» »·. · ·> · *- * *· «·. · ·. «*. «*. ·» *«S MS 4*S

£, « CM C"- Ο MO so cnoc^o O CM O H CO HsnCMOO

^ JO ΟΦΟΟσι CPCOOCTsO OC^OOCO OOMPOO

o ....................

® HO H I—I O OOi—I O Η H O H HO ) rf Ο Ο i—I rH

•H

£ rapqp3>>pH rapqpJ^pS n pi, 3 >, pi o ftp o p ~ tH ft i—1(-1-¾ Ή ft H H (1) ·Η ft rH Η Φ -H ft Φ ft φ __^_ffitqci)ci>6-H κ επ e> ci> hi cg eh e? ei hi pq co pq i-q ITS - — 'l • I I o I !

O H ® O ja o o O O

II 5 „ ?« 2 ® CM cr> its £8-.2-51 ^ ro· ^

M ^ flOOD I III

Ο *H *H ©«* o rt ·-* ________________________ Ή PS pi pl pi 6 (¾ ω φ φ φ β} fti nq h! h! -------—- Ό •H ^ H PS CÖ ft vh w <υ x> > x- ph-— .¾ co <tj fe; e-t

® I I I I I

g- pq q pq q

CO

J*------ Λ rH ft ft U ft

Ph

Eh H C-h__6h_ , ä

-H t, fH, Hf IPs MO

9) 0) H b 60859 ί 2 d Γ< 3 Φ

Φ 0) φ Φ H

, Ρ Ρ P P M

'll I I I

•goo o o o ® o o o o o fl w__p__E__E3__EB_ φ m .

Ό a Φ 0) 4-5 Φ £3 •h *h ( i xJ φ xi P 3 0)®i3 PM S PM 3 ö :o I I I I I £ •H-PQ p p p P £ 5-5 1 ί I 1 ί * ;o« O o o o o ^ ^ o o o o o 3 v pq__w__«__«__w_ ^___ CJ ο ί—I <—I rH Ή

V N N N N

0 pq pq pq pq •X -X U Pi Pi Φ Pi

Pi ί>> κΌ Xj « ® E-t Em eh PM &m £ 3 ί ί ί ί ί 3 " o o o o o m .2, o o o o o w ^ pq pq pq PQ pq

CTI σ> CT. 00 m3 OOJCO^O 00 00 00 O OCOOPOOO

„ CTi CO CTi CTI σ> ΟσΌίΡΌ CTiCTNCTiO ocooc^ct» £ ddddd HodoH oooh hopoo *3 tiDM O q M ty) Pi O -E> Pi tiD M O q tlQ Pi O pi Pi a Ph Φ Ph Φ >i Pn <D Pi <D >J Pi 1’ P O P 0) pq >1

« < CO PM P Em <J CO PM S EH < CO PM P <!C0PM<=JEM

0 01 o t— oho οοσ>σ>οο o^-hoco ocMt^ooo 3 ocoooo cncocnoo ocoootri ocnoocn

0 γΗΟγΜγΗιΗ O O O H H rlOrlrI rl rl O rl H O

*e m P< 2 >. a) w pm pi >5 2 ra pm qs >> φ co cm ps >> φ «s; -H Pi Η Η P ·Η P r—I Η Φ Ή Pi r—I Η x! ΉΡγΗΗΗ __ pqeneiOPM qqEMctiOi-q pq Em o c!> pm «επόΟΗ LP>

• I I fl I

o v ύ o V O o o o II B p, o ^ O Ir\ ir\ Ο Φ a CO 3 · · · * '— ® ® J3 -*i CM CM CTi 00 O ® CO ·—ICO LTi 'ί' ^ fC\

cm Q M o ja -ri® I I I I

rs A « JC «I® a μ ή φφ kO -P -t-> >® £ t<~\ qi pi P Φ

£ pq Φ Φ Φ H

e p p p m Q.........

•H

Ό ' · φ -P 0) Pi

•H M CM ,£j Φ P X

£ —· « PM S PM <J

£· ί ί ί ί

£ Q P « Q

« *2 h Pi Pi φ Pi « (¾ >> >> XJ >> EM £h PM Em

•H

•M

•A *£ c- oo c* o

« φ «“"I

pa t i i ie !

60859 I

t 0 φ Φ φ . <U H H 1-1

J. »f S3 S3 V

nil I I

P o o o °

0 » O O o Q

® « PP pq pq PP

Ό Q------ •Η ·Η CD £-1 φ frt

«S H s ö I

:SS 4 4h 4 «

Ph ,1 I H I I

ji O ON O O

:aJ -P Q O pq O O

H pq pq ^ pq pq P---- cm v -—

P rH

0 X tSJ

•h :«J co x ja C- g e P ω Φ Φ £ 5 >> xj xj x<

μ λ Ε-» Ph Ph PM

n a I I I I

w ·-> ^ pq o o C O O o PP PP PP pq •h •«i· c~- στ vx η^οιλ o σι o o σι n CT CO CT CT OCOOO O CO O O"' ···· ···» ·····

O rH O O HOHN H O H O O

5 M Ph O Φ M Ph O Φ MP( O ö (1) e ij <W PH P O PH P Φ P > q o < co Ph t3 <scaPqt3 «a; ra Ph fe pm a o, ..... ·► .. ·- ·. ·- ·- ..

« y> r- o o cm oh(\i o>- vdvdococm Λ OMDOOO O CO O O (Τ' (Τ' CO O CT (Τ' 0 ...............

C O O H H rH rH O H H O O O rH O O

B ra p. ps >, φ co a q> s>5 φ ra fti >j(ij

^ Ή P H H ί H p H H H

_^ a s-hq o ph π&ποοΡΗ bhooh LT —

• I

O J ® o o o s I: h “? m. ^ n n jg m (^ tn ur

_ o n * ·η n KT KT KT

C'l R P « ^ <n m I I I

r? a ® λ v «> ö -H -H > Λ ^ »n -P -»a _

d KT CD CD CD

•h pH »—I H rH

I; S tn hH

.«----

•H

Ό ^ ^ <D CÖ H l-i C\J d) H > ^ ^ CO fe 5¾

£ I . I I

S.__Q · Q__Q

O

jb Ή φ CD Φ

See: -C X! x; 1 __Pj__Pj__Pj_

•H

Jri 1 Jd

H >« H CM NT

^ H H H ! i 17 60859

Luettelo esimerkeistä LH-RH-analogi (IV) 1 2 3 4567 8 9 10 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R1-R2-R3-Arg-Pro-Gly-NH2 (I) _ R1 R2 R3

Vaatia Tyr,Phe D-Nle, Leu, muksessa D-Nva, Nle, esiinty- D-Ser, Ile vät mer- D-Abu, kitykset D-Phe, D-Thr, D-Met

Esimerkki _1__Ph e__D-Nva Leu 2 Tyr D-Nle Leu 3 Tyr D-Ser Leu _4__Tyr__D-Abu Leu _5__Tyr__D-Nva Leu _6__Tyr_ D-Thr Leu 7 Tyr D-Phe Leu _8 Tyr D-Met Leu 9 Phe D-Phe Leu 10 __Tyr_ D-Abu Ile 11 __Phe__D-Ser Nle 12 Phe__D-Nle Nle 13 Phe D-Nva Ile