FI57128C - Saett att identifiera mikroorganismer - Google Patents

Description

rBl KUULUTUSjULKAISU r Π ή O O jST4 l J () UTLAeGNIN«S$IUUFT 0/lZö fjtfXK· C (45) Patentti r.yanr.etty 10 06 1930 £jKjn Patent meddelat

^ ^ (51) Kv.ik.3/tata.3 C 12 Q 1/0A

SUOM I—Fl N LAN D (21) P**»«hdwmu·—NtmtaMMurini 783555 (22) Hkkwntaptivl—Aiwekninfid·· 21.11.78 (23) AJkupUv·—Glltlfh«tarf<g 21.11.78 (41) Tullut lulktMfcil — Riivit offamllg ntmttu 1· r«ki*t*rlh*llltu· mMM+rnm |. kuuL|ulk*un pvm.-

Patent· och ragltteratyralaan ' / Ameicu uttagd oeh uti^kriftM puMiewvd 29.02.80 (32)(33)(31) Pyydetty «tuolkuu» —Rcgird priorltet (71) Qrion-yhtyma, Oy, Nilsiänkatu 10-lU, 00510 Helsinki 51, Suomi-Finland(Fl) (72) Jouko Savolainen, Järvenpää, Suomi-Finland(FI) (7*0 Fermion Oy, patenttiosasto (51+) Tapa tunnistaa mikro-organismeja - Sätt att identifiera mikroorganismer

Keksinnön tarkoituksena on esittää yksinkertainen tapa suorittaa mikro-organismien kvalitatiivinen tunnistaminen lokeromaljassa hiilihydraatti- ja typpiaineenvaihduntakokeiden, ureakokeen sekä morfologian avulla. Tässä yhteydessä mikro-organismeilla eli mikrobeilla tarkoitetaan lähinnä sädesieniä, hiivoja ja bakteereja.

Lääketieteessä, eläinlääketieteessä, elintarvike- ja käymisteollisuudessa mikro-organismien tunnistaminen on tärkeää. Mikrobien tunnistaminen on välttämätöntä valittaessa menetelmää mikro-organismien tuhoamiseksi ja niiden kasvuolosuhteiden säätelemiseksi. Tautia aiheuttavien mikro-organismien identifioiminen on tärkeää niiden patogeenisuuden selville saamiseksi ja oikean hoitomenetelmän valitsemiseksi. Elintarvike-ja käymisteollisuudessa mikro-organismit ovat hyötyorganismeja, mutta ne esiintyvät usein myös saastuttajina. Nämä saastuttajat on tunnistettava, jotta päästäisiin selville niiden , : ,W, ...

, V ·1 2 57128 alkulähteistä ja, jotta voitaisiin valita oikeat menetelmät niiden kasvun ja leviämisen estämiseksi.

Mikrobien tunnistaminen perustuu fjääasiassa mikrobikasvuston morfologiaan, erilaisten hiilihydraattien ja typpi lähteiden käyttökykyyn, erilaisiin kasvuolosuhdevaatimuksiin sekä eräiden muiden ominaisuuksien hyväksikäyttöön.

Hiilihydraattien assimilaatiokokeet sekä typpiaineenvaihduntakokeet voidaan suorittaa periaatteeltaan kolmella eri tavalla. Menetelmät ovat auksanografinen menetelmä, Wickerhamin liemiputkimenetelmä sekä Wickerhamin liemiputkimenetelmästä kehitetty vinopintamenetelmä.

Nämä menetelmät on kuvattu julkaisuissa Manual of Clinical Microbiology 2nd ed. 1974, p. 491-507 ja Journal of Clinical Microbiology 2, No 1, 1975, p. 21-34.

Edellä mainituilla menetelmillä ja useilla niiden sovellutuksilla on tiettyjä haittoja. Menetelmät vaativat paljon materiaalia koeputkina, maljoina, alustoina jne., ovat aikaa- ja tilaavieviä sekä työläitä suorittaa. Samoin haittana on kasvava kontaminaatiovaara materiaalin ja työvaiheiden määrän ollessa suuri.

Näiden haittojen poistamiseksi on kehitetty keksinnön mukainen menetelmä, jossa kaikki tarvittavat testit, käymistestejä lukuunottamatta, tehdään samalla lokeromaljalla, jolloin materiaalin kulutusta, valmistukseen tarvittavaa aikaa ja työtä sekä työvaiheita voidaan ratkaisevati vähentää.

Esillä olevan keksinnön olennaisena tarkoituksena on aikaansaada yksinkertainen tapa suorittaa mikro-organismin tunnistaminen lokero-maljassa hiilihydraatti- ja typpiaineenvaihduntakokeiden, ureakokeen sekä morfologian perusteella. Kaikki kokeet suoritetaan samalla lokeromaljalla, jonka lokeroista yksi on varattu morfologista koetta varten. Tämä sisältää menetelmän ainoan täydellisen kiinteän kasvualustan ja lokeromaljan muut lokerot sisältävät hiilihydraatti- ja typpiaineenvaihduntakokeita sekä ureakoetta varten erilaisia kiinteitä agaralustoja, jotka saattavat myös sisältää indikaattoria ja puskuria.

' i 3 57128

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että hiilihydraatti- ja typpiaineenvaihduntakokeissa sekä ureakokeessa käytettävät kiinteät agaralustat eivät ennen kokeen alkua sisällä mikro-organismin kasvulle välttämättömiä ravinteita. Nämä lisätään lokeroihin vasta tutkittavan mikro-organismin siirrostamisen jälkeen tablettien muodossa. Tabletit sisältävät farmakologisesti hyväksyttäviä, tavanomaisia täyte- ja sidosaineita sekä kulloinkin mikro-organismin identifioimiseen soveltuvia sinänsä tunnettuja hiilihydraatteja ja typenlähteitä. Lisäksi tabletit sisältävät erilaisia mikro-organismille välttämättömiä ravinteita, jotka sopivasti täydentävät tabletissa olevia hiilihydraatteja ja typen-"" lähteitä. Esimerkiksi hiilenlähteen ollessa kyseessä täydentävä ravinne on typenlähteitä sisältävä ja typenlähteen ollessa kyseessä täydentävä ravinne on hiilenlähteitä sisältävä.

Keksinnössä käytetty laite on steriili neliskulmainen kannellinen malja, joka on jaettu pohjalta nousevien, toisiaan kohtisuoraan leikkaavien, läpäisemättömien väliseinien avulla useampiin neliskulmaisiin lokeroihin. Lokeroiden koot ja lukumäärät voivat vaihdella.

Lokeroiden pohjalla on jokaista suoritettavaa testiä varten sopiva, kiinteä, lievästi puskuroitu tai puskuroimaton agaralusta, joka voi sisältää tai olla sisältämättä indikaattoria, jolloin indikaattori voidaan valinnaisesti lisätä kasvatuksen jälkeen. Agaralusta siirrostetaan sopivalla määrällä tutkittavan mikro-organismin suspensiota. Siirrostamisen jälkeen agaralustan päälle asetetaan sinänsä tunnetulla maljaan sopivalla annostus laitteella tabletit, jotka sisältävät mikrobien kasvulle välttämättömät ravinteet, testattavat aineet sekä farmakologisesti hyväksyttäviä täyte- ja sidos-aineita.

Jotta kulloinkin tutkittavana oleva mikro-organismi voitaisiin tunnistaa, voidaan testien lukumäärää ja laatua vapaasti vaihdella. Tämä aikaansaadaan vaihtelemalla keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettyjä alustoja sekä näiden kiinteiden alustojen päälle asetettavia tabletteja.

V · * .*· 4 57128

Esimerkiksi hiivojen morfologista tutkimista varten varatussa lokerossa oleva alusta on yleisesti tunnettu maissiagari, mutta myös muita niukkaravinteisia alustoja voidaan käyttää. Nämä morfologisiin tutkimuksiin tarkoitetut alustat ovat ainoat tunnistusmenetelmässä käytetyt täydelliset alustat ja näihin alustoihin ei lisätä keksinnössä muuten käytettyjä tabletteja. Lokeroon mahtuu juuri sopivasti peitinlasi, joten mikroskopointi eli morfologinen tutkiminen voidaan suorittaa suoraan maljalta ja vältytään erillisten mikroskooppipreparaattien valmistamiselta. Mikroskopoinnin helpottamiseksi alustaan voidaan lisätä tunnettuja väriaineita.

Hiilihydraattikokeita ja kontrollikoetta varten alustat sisältävät agaria ja indikaattoria sekä puskuria. Indikaattoreina voidaan käyttää mitä tahansa pH-indikaattoria, joka osoittaa hapon muodostuksen ja pH:n laskun alle pH 5,5:n, esimerkiksi bromkresolipurppuraa tai bromtymolsinistä. Alustan pH säädetään indikaattorin värinvaihtoalueen puoliväliin ja puskuroidaan lievästi satunnaisia pH:n vaihteluja vastaan esim. 5-10 mM fosfaattipuskurilla .

Typpiaineenvaihdunnan nitraatin ja ammoniumin käyttökyvyn testaamista varten alusta sisältää agaria ja indikaattoria esimerkiksi bromtymolsineä, jonka pH säädetään sinisen ja keltaisen välille esimerkiksi pH 6,4:ään.

Ureaasikoetta varten alusta sisältää agaria ja indikaattoria. Indikaattorina voidaan käyttää esimerkiksi fenolipunaa. Alustan pH säädetään pH 6,9:ään.

Tunnistusmenetelmässä tarvitaan vain 4 eri alustaa, joista ainoastaan yksi eli morfologia-alusta on täydellinen. Muut alustat eivät sisällä ravinteita, joten niiden koostumus rajoittaa tehokkaasti kontaminanttien kasvua.

Koska tunnistusmenetelmässä tarvitaan vain 4 eri alustaa, työmäärä 5 57128 verrattuna tunnettuihin menetelmiin, joissa jokaista koetta varten on valmistettava oma alusta, pienenee huomattavasti. Samalla menetelmässä käytettyjen alustojen säilyvyys paranee ja työvaiheiden määrä vähenee. Indikaattoria ei välttämättä tarvitse lisätä alustaan, vaan sitä voidaan pipetoida kasvatuksen jälkeen lokerossa olevalle alustalle.

Maljan testialustojen muut tarpeelliset aineosaset kuten hiilenläh-de, typenlähde, hivenaineet ja vitamiinit ovat tabletissa, joka maljan alustan kanssa yhdessä muodostaa kasvua ylläpitävän kokonaisuuden. Jokainen tabletti sisältää mikro-organismien kasvulle välttämättömät ravinteet, esimerkiksi Wickerhamin liemiputkimene-- telmän alustojen aineosaset, testattavat aineet sekä tabletin iner- tit täyteaineet. Täyteaineena voidaan käyttää mitä tahansa farmakologiassa käytettävää tabletin täyteainetta, joka luovuttaa kasvulle tärkeät aineosaset alustaan kasvatuksen aikana. Tällaisia täyteaineita ovat esimerkiksi selluloosa johdannaisineen. Tableteissa voidaan käyttää sidosaineita parantamaan tabletin koossapysymistä ja helpottamaan valmistamista. Sidosaineena voidaan käyttää esimerkiksi eräitä farmakologiassa käytettäviä muovivalmisteita.

Hiilihydraattitabletin prosentuaalinen koostumus on seuraava: hiilihydraattia 12,7-25,4 %, mikro-organismin kasvulle välttämättömiä ravinteita, esimerkiksi Difcon Yeast Nitrogen Base:ä 4,3 %, täyteainetta 60,6-74,5 % ja sidosainetta 9,5 %.

Hiilihydraattitableteissa voidaan käyttää erilaisia kiteytyviä, kiinteitä monosakkarideja, disakkarideja, oligosakkarideja ja polysakkarideja. Myös muita kiinteitä hiilenlähteitä voidaan käyttää tablettien valmistukseen.

Kontrollikoetta varten valmistetaan tabletti, jossa on kaikki muut aineet paitsi hiilihydraatti. Tätä tablettia voidaan myös käyttää, mikäli testattavana on hiilenlähde, joka ei kiteydy, esimerkiksi etanoli tai glyseroli. Tällöin testi lokeroon asetetaan tabletti, jossa ei ole hiilihydraattia ja päälle pipetoidaan mikro-organismin 6 57128 tunnistamista varten sopiva määrä hiilenlähdettä fysiologisesti siedettävänä konsentraationa. Etanolia tai glyserolia voidaan käyttää esimerkiksi 20 %:na liuoksena, jolloin kokeeseen sopiva määrä on 50 /jl/tabletti.

Nitraatti-, ammonium- ja ureatabletin koostumus on vastaavasti: ty-penlähdettä 2,5 %, mikro-organismin kasvulle välttämättömiä ravinteita, esimerkiksi Difcon Yeast Carbon Base:ä 3,0 %, täyteainetta 85,0 % ja sidosainetta 9,5 %.

Perustablettivalikoima maljaa kohti on seuraava: typenlähteen positiivinen kontrolli eli (NH^l^SO^, nitraatti, hiilihydraattikontro11i (ilman hiilihydraattia), glukoosi, maltoosi, sakkaroosi, inositoli, laktoosi, sellobioosi, raffinoosi, melibioosi, erytritoli, ksyloosi, dulsitoli ja trehaloosi seka urea. Tähän luetteloon voidaan lisätä ja tästä luettelosta voidaan poistaa aineita niin, että testissä käytettävät aineet parhaiten soveltuvat tutkittavana olevan mikro-organismin identifioimiseen.

Tabletit on edullista asettaa paikoilleen laitteella, joka on suunniteltu ja valmistettu juuri tähän maljaan sopivaksi. Laitteeseen on sijoitettu putkilo jokaista tablettia varten, joten yhdellä painalluksella jokainen tabletti tulee oikealle paikalle. Tabletit valmistetaan tietyn painoisiksi puristamalla massa riittävän kovaksi tabletiksi niin ettei se hajoa alustan pinnalle kostut-tuaan.

Kuvatulla menetelmällä saavutetaan huomattavia etuja. Materiaalin käyttö ja käsittely pienenee, koska kaikki testit ovat samalla maljalla eikä jokainen testi erikseen koeputkessa. Säilytys-, työskentely- ja kasvatustilaa säästyy ja testien suorittaminen nopeutuu ja on varmempaa. Valmistus on helpompaa ja nopeampaa, koska malja voidaan valaa yhdellä kertaa ja samassa asennossa. Alustoja tarvitaan vain neljä sensijaan että jokaiseen koeputkeen joudutaan annostelemaan erilainen alusta. Tabletin valmistus on yksinkertaista ja nopeaa.

\ t; · t , 7 57128

Ei tarvita helposti kontaminoituvia ravintoaineliuoksia, joiden tekeminen ja steriloiminen voi olla hankalaa, kuten esimerkiksi sokeriliuosten steriloiminen suodattamalla. Tabletteja ei välttämättä tarvitse steriloida kunhan ne valmistetaan tarpeellisia aseptisia työskentelytapoja noudattaen. Samalla vältytään suodatinpaperikiek-kojen kuivaamiselta, liuosten pipetoimiselta jne. Kontaminaatiovaara vähenee, koska järjestelmä morfologia-alustaa lukuunottamatta, ei sisällä yhtään täydellistä alustaa. Maljat ja tabletit voidaan säilyttää huoneenlämpötilassa. Lisäksi identifioimi sjärjestelmä on nopea. Tulokset voidaan lukea neljän vuorokauden kuluttua maljan siirrostamisesta.

Seuraavat hiivoja, sädesieniä ja bakteereja koskevat sovellutusesimerkit kuvaavat keksinnön käyttöä.

Esimerkki 1

Kliinisestä näytteestä viljeltiin hiiva Sabouraud-agarilla puhdas-viljelmäksi. Suspensio valmistettiin steriloituun tislattuun veteen 1-2 hiivapesäkkeestä. Suspensiosta siirrostettiin neulalla hiiva maissiagarille raapaisemalla pinta rikki laidasta laitaan. Raapaisun toinen puoli peitettiin steriilillä peitinlasilla ja toinen puoli sai olla sellaisenaan. Monilokeromaljan jokaiseen muuhun lokeroon tipautettiin samaa hiivasuspensiota kaksi tippaa Pasteur pipetillä. Hiivasuspensio säilytettiin huoneenlämpötilassa tulevaa tarvetta varten. Tämän jälkeen tabletit, jotka sisältävät hiivojen kasvulle välttämättömät ravinteet, testattavat aineet, täyte- ja sidosaineet, asetettiin omiin lokeroihinsa alustojen pinnoille sitävarten valmis-- tetulla asettime 11a. Hiivojen tunnistamisessa testattiin seuraavia yhdisteitä, glukoosia, maltoosia, sakkaroosia, inositolia, laktoosia, sellobioosia, raffinoosia, melibioosia, erytritolia, ksyloosia, dulsitolia, trehaloosia, ammoniumia, nitraattia ja ureaa. Malja siirrettiin 25°C:een lämpökaappiin kasvatusta varten oikein päin.

Kahden ja kolmen vuorokauden kuluttua mikroskopoitiin maissiagarin kasvusto suoraan maljalta 700 kertaisella suurennoksella kirkkaan kentän valaistuksella. Tulokseksi saatiin, että tutkittava hiiva muodosti hyyfiä,· mutta klamydosporeja ja artrosporeja ei esiintynyt. Muista testeistä saatiin seuraavat tulokset: 3 vrk:n kasvatuksen β 57128 jälkeen typen positiivinen kontrolli oli positiivinen. Hiiva kasvoi alustalla ja alustan väri oli keltainen, kuten sen täytyy aina ollakin. Nitraatti oli negatiivinen eli alustan väri oli keltainen. Hiilihyd-raattikontrolli oli tummanvihreä eli alkuperäisen värinen, kuten sen kuuluu ollakin. Sokereista glukoosi, maltoosi, sakkaroosi, ksyloosi ja trehaloosi olivat positiivia. Muut sokerit ja urea olivat negatiivisia.

Näiden tulosten perusteella hiiva olisi voinut olla Candida neoformans tai Candida parapsilosis. Fermentaatiokokeen avulla varmistettiin, että hiiva oli Candida parapsilosis.

Esimerkki 2

Pitkäaikaista utaretulehdusta sairastavan lehmän maidosta eristettiin ja viljeltiin puhtaaksi hiiva. Hiivan identifioimiseen käytettiin edellä kuvattua menetelmää. Alkutoimenpiteet olivat samat kuin edellisessä esimerkissä.

Tulostusvaiheessa kasvusto mikroskopoitiin suoraan maissiagarilta 2 vuorokauden kasvatuksen jälkeen. Hiiva muodosti hyyfiä ja pseudo-hyyfiä sekä artrosporeja, jotka muodostuvat katkeamalla hyyfien kärjistä. Typpi ja hiilihydraattikontrollit antoivat oikean reaktion, mikä osoitti, että malja ja näyte olivat käyttökelpoiset.

Nitraattitestin tulos oli negatiivinen. Sokereista glukoosi, laktoosi, ksyloosi ja dulsitoli antoivat positiivisen tuloksen. Maltoosi, sakkaroosi, inositoli, sellobioosi, raffinoosi, melibioosi, erytritoli ja trehaloosi olivat heikosti positiivisia. Urea oli positiivinen.

Näiden tulosten perusteella hiiva identifioitiin Trichosporon cuta-neumi ks i.

Esimerkki 3

Pilaantuneesta appelsiinituoremehusta eristettiin ja viljeltiin puhtaaksi hiiva. Hiiva identifioitiin kuvatulla järjestelmällä. Alkutoimenpiteet olivat samat kuin edellisissä esimerkeissä.

, ' j·

O

9 571 28

Maissiagarilla hiiva muodosti pseudohyyfiä. Muut tulokset olivat 4 vuorokauden jälkeen seuraavat: kontrollit olivat oikein; nitraatti oli positiivinen, sokereista glukoosi, maltoosi, sakkaroosi, sello-bioosi, raffinoosi, erytritoli ja trehaloosi olivat selvästi positiivisia, ksyloosi oli heikosti positiivinen sekä inositoli, laktoosi, melibioosi ja dulsitoli olivat negatiivisia. Urea oli positiivinen.

Näiden tulosten perusteella hiiva identifioitiin Hansenula anomalaksi.

^ Esimerkki 4

Kuvatulla tunnistamismenetelmällä tutkittiin Escherichia coli-bak-teerien (seroryhmä 0149) hiilihydraattien assimilaatio- ja nitraatin pelkistämiskykyä sekä ureaasin tuottoa.

Escherichia coli kasvatettiin yön yli ravintoliemessä 37°C:ssa, Kasvusto eristettiin alustasta sentrifugoimalla ja suspendoitiin steriiliin tislattuun veteen alkuperäiseen tilavuuteen. Samoin kuin hiivojen identifioinnissa, yksi tippa suspensiota tipautettiin maljan jokaiselle alustalle, minkä jälkeen asetettiin vastaavat tabletit paikoilleen. Maljat kasvatettiin yön yli 37°C:ssa. Tulokset luettiin samoin kuin hiivoja identifioitaessa.

Escherichia coli (seroryhmä 0149) pelkisti nitraatin nitriitiksi (punainen väri lisättäessä tippa sulfaniliinihappoa ja alfanaftyylaminia), - ei muodostanut ureaasia, assimiloi glukoosia, maltoosia, laktoosia, raffinoosia, melibioosia, ksyloosia ja trehaloosia; ei assimiloinut sakkaroosia, inositolia, sellobioosia, erytritolia eikä dulsitolia. Positiiviset ja negatiiviset reaktiot olivat selviä ja vastasivat kirjallisuudessa annettuja reaktioita.

Tunnistusmenetelmä soveltuu Escherichia colin ja etenkin Enterobacteriaceae-heimon lajien identifioinnissa tarvittavien vastaavien ominaisuuksien tutkimiseen.

Esimerkki 5

Edellä kuvattua hiivojen tunnistamismenetelmää käytettiin Strepto-myces-suvun lajien hii1ihydraattien ja nitraatin käyttökyvyn sekä t

Claims (1)

10 5 71 2 8 ureaasin tuotannon tutkimiseen tunnistusta varten. Järven pohjamudasta eristetystä ja natriumkaseinaattiagarvinopinna1la säilytetyn streptomykeetin kasvustosta tehtiin tislattuun veteen suspensio samoin kuin hiivojen ollessa kyseessä. Suspensiota tipautettiin tippa jokaiselle agarpinnalle ja vastaavat tabletit asetettiin paikoilleen. Malja pidettiin 10 vrk 25°C:ssa, minkä jälkeen luettiin tulokset. Tutkittava kanta kasvoi maissiagarilla ja muodosti hyyfiä sekä pieniä vihreitä pesäkkeitä. Kanta käytti tehokkaasti nitraattia mutta hydro-lisoi heikosti ureaa. Lisäksi kanta assimiloi kaikkia 12 hiilihydraattia, toisin sanoen kasvoi ja tuotti happoa kaikilla tutkituilla hiilihydraateilla, joita olivat glukoosi, maltoosi, sakkaroosi, ino-sitoli, laktoosi, sellobioosi, raffinoosi, melibioosi, erytritoli, ksyloosi, dulsitoli ja trehaloosi. Hiilihydraattien ja nitraatin positiiviset tulokset olivat hyvin selviä. Patenttivaatimus Yksinkertainen tapa suorittaa mikro-organismien kvalitatiivinen tunnistus lokeroina 1 jassa hiilihydraatti- ja typpiaineenvaihduntakokei-den, ureakokeen ja morfologian perusteella, jolloin kaikki kokeet suoritetaan samalla lokeroina 1 j a 1 la, jonka lokeroista yksi on varattu morfologista koetta varten ja sisältää menetelmän ainoan täydellisen kiinteän kasvualustan ja jonka muut lokerot sisältävät hiilihydraatti- ja typpiaineenvaihduntakokeita sekä ureakoetta varten erilaisia kiinteitä agaralustoja, jotka saattavat myös sisältää indikaattoria ja puskuria, tunnettu siitä, että hiilihydraatti- ja typpi-aineenvaihduntakokeissa sekä ureakokeessa käytettävät kiinteät agar-alustat eivät ennen kokeen alkua sisällä mikro-organismien kasvulle välttämättömiä ravinteita, vaan nämä lisätään tutkittavan mikro-organismin siirrostamisen jälkeen lokeroihin tablettien muodossa, jotka sisältävät mahdollisia farmakologisesti hyväksyttäviä, tavanomaisia täyte- ja sidosaineita sekä kulloinkin mikro-organismin identifioimiseen soveltuvia sinänsä tunnettuja hiilihydraatteja ja typenlähteitä sekä kulloinkin viimeksi mainittuja aineita sopivasti täydentäviä mikro-organismien kasvulle välttämättömiä ravinteita.