FI56830C - Foerfarande foer framstaellning av asparaginylgrupper innehaollande biologiskt aktiva polypeptider - Google Patents

Description

GSr^l ΓβΊ ««kuulutusjulkaisu p CQ_n LBJ ' UTLÄGG NI N GSSKRI FT 56830 C (45) Patentti myönnetty 10 04 1030 Patent meddelat ^ ^ (51) Kv.lk.'/Int.CI.* C 07 C 103/52 SUOMI-FINLAND (H) P»t«nttlhtk«mu» — Patcntanseknlng 1^3^/73 (22) H»k*mi»pllvi — Anaöknlngsdag 0U. 05.73 ^ ^ (23) Alkuplivi — Glltlghecidag 0^.05.7^ (41) Tullut Julkiseksi — Bllvlt offentlig l6.11.7 3

Patentti· ja rekisterihallitut ,,,. .... ......... , ' (44) Nlhtkvlkiipanon ja kuul.julkaliun pvm. —

Patent-och registerstyrelsen Anaekan utiagd och uti.skrift*n pubiicerad 31.12.79 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begird prioritet 15.05.72

Unkari-Ungern(HU) RI-L65 (Tl) Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar R.T., Gyömröi ut 21, Budapest X,

Unkari-Ungern(HU) (72) Lajos Kisfaludy, Budapest, Miklos Low, Budapest, Istvan Schön, Budapest,

Tamäs Szirtes, Budapest, Maria Sz.Sarközi, Budapest, Sandor Bajusz, Budapest, Andräs Turän, Budapest, Rozsa Beke, Budapest, Attila Juhäsz, Buda-pest, Laszlo Gräf, Budapest, Kalman Medzihradszky, Budapest, Laszlö Szporny, Budapest, Unkari-Ungern(HU) (7^) Oy Kolster Ab (5^) Menetelmä asparaginyyliryhmiä sisältävien biologisesti aktiivisten pciypepti-dien valmistamiseksi - Förfarande för framställning av asparaginylgrupper innehällanae biologiskt aktiva polypeptider

Keksintö koskee menetelmää asparaginyyliryhmiä, erityisesti asparaginyyii-glysiiniosan sisältävien, biologisesti aktiivisten polypeptidien valmistamiseksi liittämällä vastaavat, suojatut peptidikomponentit aktiiviesterimenetelmän mukaan ja lopuksi lohkaisemalla suojaryhmät.

Kirjallisuudesta on tunnettua, että asparagiini-peptidien synteesissä muuttuu toisaalta /3-karboksiamidiryhmä veden lohjetessa helposti /3-syanoalaniini-johdannaiseksi, /M. Bodanszky, V. du Vigneaud: J. Am. Chem. Soc. 8l, 5088 (1959); E. Schröder, K. Lubke: Peptides I, S. HQ/, toisaalta, että peptidit, jotka sisältävät /3-karboksyylissä esteröidyn asparaginyyliryhmär», muuttuvat helposti rengasmaisiksi sukkinimidijohdannaisiksi, ^E. Schröder, K. Liibke: Peptides I, S. 203; M. A. Ondetti u. a. : Biochemistry 7, kö69 (1968)^. Jälkimäinen reaktio tapahtuu erittäin helposti, jos peptidiketjussa seuraa asparagiiniosaa glysiini. Niinpä esimerkiksi desaminoidaan synteettinen tetrapeptidi Pro-Asn-Gly-Pro ja G,l-m ammoniakkipitoisessa liuoksessa kvantitatiivisesti. ^L. Graf. u.a. Polypeptide Hormones s. 255, Akademiai Kiado, Budapest, (1971 )J· Näiden vaikeuksien välttämiseksi työskennellään viime aikoina asparaginyyliryhmän sisältävien peptidien 2 56830 synteesissä suuremmassa määrin karboksiamidi-suojaryhmillä /vrt. esim. W. König, R. Geiger: Ber. 103, 20Ul (1970)/, ja on ymmärrettävää, että asyloinnista jaksolla asparaginyyli-glysiini ei ole kirjallisuudessa löydettävissä mitään esimerkkejä.

Asparaginyyli-glysiini-osan karboksiamidiryhmän helpolla desaminoituvuudel-la on selitettävissä, että uudempien tutkimusten mukaan adrenokortikotrooppisten hormonien aikaisemmin oletettu rakenne tarvitsee ainoastaan vähäisen modifikaation. Niin johti systemaattinen luonnollisten ja synteettisten valmisteiden vertailu siihen havaintoon, että aikaisemmin asemassa 30 oletettu karboksiamidiryhmä onkin asemassa 25 ja asemissa 26 ja 27 on sekä ihmiselimistön kortikotropiinissa että myös sian kortikotropiinissa jakso Gly-Ala /l. Graf. et ai. Acta Biochim. Biophys. Hung. 6, Ul5 (1971) sekä B. Riniker et ai. Nature New Biology 235, 11^ (1972)/.

Sen mukaisesti on ihmiselimistön adrenokortikotrooppisen hormonin pääasiallinen rakenne seuraavanlainen: H-Ser-iyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-1 2 3 k 5 6 7 8 9 10 11 12 13 lU 15 16 17 18 -Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro- 19 20 21 22 23 2k 25 26 27 28 29 30 31 32 33 3** 35 36 -Leu-Glu-Phe-OH.

37 38 39

On tunnettua, että ihmiselimistön adrenokortikrotrooppisen hormonin synteesiä, jolla on T.H.Lee'n et ai. /J. Biol. Chem. 236, 2970 (1961 )J kuvaama rakenne sekä tämän hormonin fragmenttien synteesiä kuvattiin ensimmäisen kerran unkarilaisessa patenttijulkaisussa n:o 155 25^ ja sitä vastaavissa Ulkolaisissa r- ~ patenttijulkaisuissa /esim. itävaltalaisessa patenttijulkaisussa n:o 295 051/.

Keksintö pohjautuu havaintoon, että biologisesti aktiivisten polypepti-dien synteesissä tähän mennessä käyttämätön pentafluorifenolimenetelmä /L.Kisfalud'y et ai.: Proc. 8th Europ. Peptide Symp. 1966 p 25 (1967); L. Kisfaludy et ai.: J. Org. Chem. 35, 3563 /1970/; J. Kovacs et ai.: J. Am. Chem. Soc. 89, 183 (1967)/ soveltuu erinomaisesti vastaavissa olosuhteissa edellä mainitun rakenteen omaavien asparaginyyliryhmän sisältävien polypeptidien synteesiin.

Yllättävää kyllä todettiin, että Z-Asn-0H:sta voidaan valmistaa ilman karboksiamidiryhmän suojaa vastaava pentafluorifenyyli esteri, saannon ollessa yli 90 %f jos työskennellään noin 0°C:een lämpötilassa, koska täten voidaan ehkäistä käytännöllisesti katsoen täydellisesti rengasmaisen sukkinimidi-johdannaisen muodostuminen ja /3-syanoalaniini-johdannaisen muodostuminen. Tällä tavoin valmistetulla Z-Asn-0PFP:llä voidaan asyloida aminohappo- tai peptidijohdannaisia ilman sivureaktiota. Näin on valmistettavissa esimerkiksi suojattu dipeptidi-Z-Asn-Gly-0tBu samoin 90-% saannolla ja tästä käsittelemällä trifluorietikkahapol-.la Z-Asn-Gly-0H. Tästä dipeptidistä saatiin samoin erinomaisella saannolla vastaava 56030 pentafluorifenyyliesteri, jolla esimerkeissä kuvatut C-terminaaliset peptidit ^ACTH2^_31j ACTH2^_32; ACTH2^_3^7 voidaan asyloida erinomaisella saannolla ja ilman sivureaktioita.

Pitempien, asparaginyyliryhmän sisältävien peptidien synteesissä oli erittäin hyvin osoitettavissa pentafluorifenoli-menetelmän etu, ja vielä havaittiin, että asyloitaessa pentafluorifenyyliestereillä muodostunut pentafluori-fenoli ei aiheuta niitä vaikeuksia, joita yleensä esiintyy pentakloorifenoli-menetelmässä /i.P. 295 051/. Jälkimmäisen haittapuolena on, että liittämisen yhteydessä syntyy tasapaino, jota voidaan siirtää tapauskohtaisesti ylimäärän käytettyjä amiinikomponentteja tai tertiäärisiä emäksiä läsnäollessa haluttuun suuntaan. Käytettäessä pentafluorifenolimenetelmää ei ylimäärä emästä ole välttämätön. Tämä havainto näyttää olevan ristiriidassa sen tosiasian kanssa, että molempien mainittujen fenolijohdannaisten pK-arvot ovat kirjallisuuden tietojen mukaan identtisiä ,/pK; 5,37. Yllättävää kyllä todettiin, että molempien fenoli-johdannaisten dimetyyliformamidissa mitatut pK-arvot poikkeavat oleellisesti toisistaan: pentakloorifenolin pK-arvo on 5,05, ja pentafluorifenolin pK-arvo on 6,35. Toisin ilmaistuna tämä merkitsee, että viimeksimainittu on dimetyyliformamidissa vähemmän dissoeioituneessa muodossa, jolloin on ymmärrettävää, että emäksisten komponenttien jatkuva protonointi ja tästä johtuva liittymisreaktion hidastuminen jäävät pois. Pentafluorifenolimenetedmän toisena etuna on, että reaktiossa vapautuva pentafluorifenoli voidaan helposti poistaa reaktiotuotteesta. Sensijaan Pentakloorifenolia tai sen orgaanisten emästen kanssa muodostuneita suoloja ei voida helposti poistaa,nimikä aiheuttaa sen haittapuolen, että näistä yhdisteistä - myös kun niitä jää jäljelle häviävän pieni määrä reaktioseokseen -kehittyy liittämistä seuraavassa katalyyttisessä hydrauksessa suolahappoa, mikä vahingoittaa hapolle herkkiä suojaryhmiä. On havaittu, että pentafluorifenoli voidaan poistaa kvantitatiivisesti yksinkertaisella tavalla - nimittäin kaatamalla reaktioseos eetteriin, jolloin mainittu vahingollinen vaikutus on vältettävissä. Käytännön näkökannalta katsottuna merkitsee pentafluorifenyyliesterin oleellisesti suurempi liukoisuus orgaanisiin liuottimiin toista etua. Esimerkkinä mainittakoon Z-Asn-Gly-OPPP:n valmistus, jossa tarvitaan pentafluorifenyyliesterin muodostumiseen 1/10 siitä dimetyyliformamidimäärästä liuottimena, joka olisi välttämätön pentakloorifenyyli esterin muodostukseen. Edelleen todettiin, että pentafluorifenoli-menetelmä soveltuu erinomaisesti myös pitkien peptidien synteesiin. Tässä tapauksessa työskennellään uusimpien kirjallisuuden ilmoitusten mukaan päämääränä suurempi saanto ja puhtaamman lopputuotteen saavuttaminen kohotetussa lämpötilassa ja/tai käytetään asylointiainetta ylimääränä, jjs.s. esimerkiksi R. Schuyzer, P.W. Schiller; Helv. Chim. Acta 5**, 897 [V¥\\} ja E. Wunwch; Ber. 101*, 2kk5 (1971 ]J· On havaittu, ettei pentafluorifenolimenetelmän käytössä edellämainittujen päämäärien saavuttamiseksi ole välttämätöntä käyttää 11 56830 kohotettua lämpötilaa eikä ylimäärää asylointiainetta. Niinpä tapahtuu esimerkiksi ohutlevykranatografian avulla suoritettujen kontrollitutkimusten tulosten mukaan suojatun dekapeptidin Z-Lys/B0C/-Lys/B0C/-Arg/N02/-Arg/N02/-Pro-Val-Iys/ BOC/-Val~Tyr/tBu/Pro-OH ja heptapeptidin H-Asn-Gly-Ala-Glu-/OtBu/-Asp/OTBu/-Glu/ OtBu/-Ser/tBu/-OtBu/ tai oktapeptidin H-Asn-Gly-Ala-Glu/OtBu/-Asp/OtBu/-Glu/-OtBu/-Ser-Ala-OtBu reaktio dimetyyliformamidiliuoksessa, jossa on pentafluori-fenolia ja disykloheksyylikarbodi-imidin kompleksia huoneenlämpötilassa käytännöllisesti katsoen 5-6 tunnin sisällä, ja suojattu heptadekapeptidi /15-32'] voidaan eristää yksinkertaisella edelleenkäsittelyllä saannon ollessa yli 80 %. Vastaavanlainen, erinomainen tulos saadaan antamalla itävaltalaisessa patenttijulkaisussa n; o 295 051 kuvatun tetradekapeptidin ACTH 1-Um reagoida hepta-dekapeptidin /15-31J kanssa, oktadekapeptidin /Ϊ5-32/ kanssa ja pentacosapeptidin /15~397 kanssa mainituissa reaktio-olosuhteissa»

Vaihtoehtoisen menetelmän mukaan halutun välituotteen syntetisoimiseksi voidaan myös menetellä siten, että asyloidaan Z-Arg/N02/-Arg/N02/-Pro-0H:sta valmistetulla pentafluorifenyyliesterillä pentapeptidi H-Val-Iys/BOC/-Val-Tyr/ tBu/-Pro-0H, ja saadulle oktapeptidille suoritetaan katalyyttinen hydraus, jolloin poistetaan myös arginiinin guanidinoryhmän suojaamiseen käytetyt nitro-ryhmät ja rakennetaan vaiheittain suojattu dekapeptidi /l5~2kjt joka eroaa edel-läkuvatusta dekapeptidista /I5~2k7 siten, että arginiinin guanidinoryhmät ovat protonoidussa muodossa. Tämän menetelmän etu on siinä, että C-terminaalisille peptideille, jotka sisältävät hapolle herkkiä suojaryhmiä, ei täydy suorittaa samaa katalyyttistä hydrausta, jota käytetään sitäpaitsi nitroryhmien poistamiseksi ja - kuten tunnettua - on suoritettavissa ainoastaan etikkahappoisessa väliaineessa pitkillä, monissa tapauksissa päiväkausia kestävillä reaktioajoilla.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että asylointikompo-nentin karboksyyliryhmä aktivoidaan huoneenlämpötilassa tai sen alapuolella olevassa lämpötilassa, tarkoituksenmukaisesti noin 0°C:ssa, saattamalla se reagoimaan pentafluorifenyyliesteriksi, ja että asylointireaktio suoritetaan samoin huoneenlämpötilassa tai sen alapuolella olevassa lämpötilassa, tarkoituksenmukaisesti käyttämällä ekvimolaarisia määriä, jonka jälkeen suojaryhmät poistetaan ja saadut vapaat peptidit muutetaan haluttaessa happoadditiosuoloiksi tai farmaseuttisesti hyväksyttäviksi komplekseiksi tai kondensaateiksi,

Edelläolevien suoritusten mukaan soveltuu siis uusi menetelmä ihmiselimistön adrenokortikotrooppihormonia ja sen lajille ominaisia fragmentteja edustavien yleisen kaavan H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Ply-Iys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Pro-

Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Q

mukaisten peptidien valmistukseen, jossa kaavassa Q merkitsee 56830

a/ Ser-OH

b/ Ser-AIa-OH

c / Ser-Ala-Glu-OH

d/ Ser-Ala-Glu-Ala-OH

e/ Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-OH

f/ Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-OH

g/ Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-OH

h/ Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-OH

i/ Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-OH, sekä näiden peptidien suojattujen johdannaisten valmistukseen.

Lähtöaineita ja välituotteita valmistetaan tunnettujen peptidikemiallis-ten menetelmien avulla. Sen mukaisesti käytetään aminoryhmien suojaamiseen ensi sijassa bentsyylioksikarbonyyli-, tert.-butyylioksikarbonyyli-, p-klooribentsyy-lioksikarbonyyliryhmiä, karboksyyliryhmien suojaamiseen ensi sijassa esteröinnin menetelmää, ennen kaikkea metanolilla, etanolilla ja tert-butanolilla. Sivuketjujen hydroksyyliryhmät suojataan tapauskohtaisesti eetteröimällä, jolloin käytetään tert-butanolia tai bentsyylialkoholia. Arginiinin guanidinoryhmän suojaamiseksi soveltuu ennen kaikkea nitroryhmä, mutta guanidinoryhmää voidaan myös käyttää protanoidussa muodossa. Suojaryhmien vastaavalla kombinaatiolla voidaan saavuttaa, että nämä voidaan poistaa hydrogenolyysillä tai asidolyysillä selektiivisesti tai myös samanaikaisesti.

Pienimolekyylisiä peptidejä voidaan valmistaa asteittaisen menetelmän mukaan tai kondensoimalla fragmentit, jolloin voidaan työskennellä sekoitetun anhydridi-, atsidi-, aktiiviesteri- tai disykioheksyylikarbodi-imidi-menetelmän mukaan.

Keksinnön olemus on siinä, että liitettäessä asparaginyyliryhmiä sisältäviä peptidejä aktivoidaan asylointikomponentin karboksyyliryhmä muuttamalla se pentafluorifenyyliesteriksi, Pentafluorifenyyliesteriä voidaan valmistaa ennen asylointia, mutta on myös mahdollista tuottaa se välittömästi reaktioseok-sessa. Aktiivista esteriä voidaan valmistaa siten, että lisätään reaktioseokseen pentafluorifenolla ja disykloheksyylikarbodi-imidiä. Eräs erittäin edullinen aktiivisen esterin valmistusmenetelmän mukaan valmistetaan ensin pentafluori-fenyyli-disykloheksyylikarbodi-imidi-kompleksi ja lisätään se reaktioseokseen moolisuhteessa 1,2-1,5. Paitsi helpompaa käsiteltävyyttä on tällä menetelmällä etuna se, että mahdollisesti disykloheksyylikarbodi-imidin sisältävät rikkipitoiset epäpuhtaudet voidaan poistaa. Näillä epäpuhtauksilla voi olla vahingollinen vaikutus hydrauksessa, joka useimmiten seuraa liittämistä. Tämän liittämismenetelmän, joka tapahtuu ilman sivureaktioita ja saannon ollessa erinomainen, toisena etuna on, että ei ole välttämätöntä suorittaa suojatuille välituotteille erityistä, esimerkiksi pylväskromatograafista puhdistamista, vaan suojaryhmistä 6 50830 vapautetun lopputuotteen puhdistaminen on riittävä. Tämä puhdistaminen voidaan suorittaa vastavirtajakautumisen periaatteen pohjalla, mutta myös pylväskromatograa-fisen menetelmän mukaan. Jälkimäisessä tapauksessa käytetään esimerkiksi erilaisia karboksimetyyliselluloosa-lajeja.

Keksinnön piiriin kuuluu myös keksinnönmukaisen menetelmän mukaan valmistettujen peptidien muuttaminen happoadditiosuoloiksi tai farmaseuttisesti käytettäviksi komplekseiksi. Happoadditiosuolojen muodostamiseen voidaan käyttää farmaseuttisesti sopivia happoja, esim. etikkahappoa, suolahappoa ja korkeampia rasvahappoja, jopa rikkihappoa tai fosforihappoa. Farmaseuttisesti käytettävillä komplekseilla ymmärretään keksinnönnukaisen menetelmän mukaan valmistettujen peptidien yhdisteitä, jotka muodostuvat lisäämällä tiettyjä orgaanisia tai epäorgaanisia aineita ja jotka saavat aikaan peptidien hidastavan vaikutuksen. Tällaisia orgaanisia yhdisteitä voivat esimerkiksi olla määrätyt gelatiinilajit, karboksimetyyli-selluloosa, algiinihappoesteri, aminohappopolymeerit ja muut polymeerit ja kopoly-meerit. Epäorgaanisina yhdisteinä tulevat kysymykseen vaikealiukoiset suolat, siten määrättyjen metallien fosfaatit tai pyrofosfaatit, ennen kaikkea sinkin fosfaatit tai pyrofosfaatit. Mainitun vaikutuksen saavuttamiseen soveltuvat myös tietyt silikaatit, jotka muodostavat peptidien kanssa samoin liukenemattomia komplekseja tai kondensaatteja.

Keksinnönmukaisen menetelmän mukaan valmistettuja peptidejä voidaan käyttää farmaseuttisesti tavanomaisten lääkeainevalmisteiden muodossa. Tällaiset lää-keainevalmisteet voivat olla kiinteitä lyofilisaatteja, joissa käytetään vaikutuksettomana lisäaineena ei-peptidien kanssa reagoivia aineita, esim. manniittia, maitosokeria, tärkkelystä yms. Edelleen voidaan peptidit valmistaa suspensioina tai emulsioina, jotka voivat sisältää apuaineina erilaisia neutraaleja säilöntä-ja stabilisointiaineita. Erittäin edullinen valmistustapa ovat edellämainitut kompleksit ja kondensaatit, jotka saavat aikaan valmisteen hidastetun vaikutuksen.

Adrenokortikotrooppisen hormonin normaali annostus on 0,1-3,0 mg 1-7 kertaa viikossa annettuna subkutaanisti, parenteraalisesti tai intramuskuläärisesti.

Esimerkeissä kuvatut välituotteet ovat uusia.

Esimerkeissä käytetyt lyhennykset ovat tunnettuja IUPAC-IOB:stä /ks. J.

Biol. Chem., 2U7, 977 (1972^7* Muina lyhennyksinä käytetään otsikon jälkeen symbolia, josta ilmenee jakso-osa lukumäärinen ja joka kuvaa edelleen N-terminaali-siä ja C-terminaalisia pääteryhmiä. Sivuketjujen suojaryhmät ovat sisältyneenä kulloiseenkin otsikkoon. Lisäksi käytetään seuraavia lyhennyksiä: DCC = disykloheksyylikarbodi-imidi, PFPOH * pentafluorifenoli, PCPOH = penta-kloorifenoli.ja DOHA = disykloheksyyliemiini. Sulamispisteiden määritys tapahtui T &ι>83ΰ tri Tottolin /Biichi, Schweiz/ kehittämällä, laitteella. Ohutlevykromatograafiset tutkimukset suoritettiin silikageelillä Stahl*in menetelmän mukaan, jolloin käytettiin seuraavia liuotinseoksia: 1. Etyyliasetaatti-/pyridiini-etikkahappo-vesi = 20:6:ll7 = 95^5 2. Etyyliasetaatti-/pyridiini-etikkahappo-vesi = 20:6:ll7 = 9:1 3. Etyyliasetaatti-/pyridiini-etikkahappo-vesi = 20:6:li/ = ^:1 U, Etyyliasetaatti-/pyridiini-etikkahappo-vesi = 20:6:11] = 3:2 5. Etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi = 2k0:20:6:ll 6. Etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi = 120:20:6:11 7. Etyyliasetaatti^pyridiini-etikkahappo-vesi = 60:20:6:11 8. Etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi = 30:20:6:11 9. Etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi = U80:20:6:ll 10. Kloroformi-heksaani-etikkahappo = 8:1:1 11. Kloroformi-metanoli =98:2 12. Kloroformi-metanoli = 95:5 13. Kloroformi-metanoli = 9:1 lU. Kloroformi-metanoli =85:5 15. n-butanoli-pyridiini-etikkahappo-vesi = 30:20:6:2^ 16. Kloroformi-metanoli-etikkahappo = 8:1:1

Kehittämiseen käytetään ninhydriiniä ja/tai klooria ja tolidiiniä.

Esimerkki 1

Ihmiselimistön ACTH^_^:n synteesi

Vaihe 1: Z-Glu/ÖtBu7-Ser/tBu7~OtBu./Z-30~31-OtBu7 10,85 g /25 mmoolia7 Z-Glu/fttBu7_0NSu:ta liuotetaan 100 ml:aan etyyliasetaattia ja lisätään 7,0 g /27,5 mmoolia7 H-Ser/tBu7-0tBu.HCl:ää liuokseen.

Saatu suspensio jäähdytetään 0°C:een ja lisätään sekoittaen 3,85 ml /27,5 mmooliq/ trietyyliamiinia. Reaktioseosta sekoitetaan edelleen puolen tunnin ajan 0°C:ssa, sitten yön ajan huoneenlämpötilassa, sitten ravistellaan peräjälkeen 2 x 20 ml:11a 1-n suolahappoa. 3 x 20 ml:11a 1-n NaHCO^-liuosta ja lopuksi vedellä. Etyyli-asetaattifaasi kuivataan ja sen jälkeen haihdutetaan. Saatua öljyistä jäännöstä trituroidaan petrolieetterin kanssa. Tällä tavalla saadaan 10,1*5 g /77,8 %J Z-30-31~OtBu: a.

Analyysi C^H^OgNg /536,687 Laskettu: C 62,7 H 8,3 Todettu: C 62,k H 8,2 Sulamispiste: 92-95°C^ R^: 0,8.

θ 56830

Vaihe 2: H-GIu[OtBu]-Ser[tBu]-OtBu.[H-30-31-OtBu] 17,2 g [32 mmoolia] Z-30-31-0tBu:a liuotetaan 350 altaan metanolia ja johdetaan 2,5 g:n palladium-aktiivihiiltä läsnäollessa tunnin ajan vetyä liuoksen lävitse. Katalysaattorin suodattamisen jälkeen haihdutetaan suodos alennetussa paineessa kuiviin ja saatetaan kiinteä jäännös petrolieetterin avulla suodattimelle. Saalist 10,97 g [83,4 H-Glu[OtBu]-Ser[tBu]-OtBu:a. Sulamispiste: 78 - 82°C; R^1: 0,4.

Analyysi c2oH38°6N2 C402»54]

Laskettu: C 59,7 H 9,5 N 6,9

Todettu: C 59,8 H 9,4 N 6,6

Vaihe 3: Z-Aep[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser[tBu]-0tBu.[Z-29-Jl-OtBu] 9,45 8 [22,5 mmoolia] Z-Asp[0tBu]-0NSu:a ja 10,1 g [25 mmoolia] H-3O- 31-0tBu:a liuotetaan 200 mitään etyyliasetaattia ja annetaan seistä yli yön. Toisena päivänä ravistellaan liuosta peräjälkeen 2 x 50 ml:11a n suolahappoa, 3 x 50 ml:11a n NaHCO^-liuosta ja lopuksi vedellä. Etyyliasetaatin tislauksen jälkeen saatu öljy saatetaan vedellä jähmettymään, sitten suodatetaan vesi pois. Saalis: 15,2 g [95,0 #] Z-29-31-OtBu:n. Sulamispiste: 84 - 87°C, Hf: 0,70.

Analyysi [707,88]

Laskettu: C 61,1 H 6,1

Todettu: C 61,3 H 8,3

Vaihe 4: Z-Glu[0tBu]-As[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser[tBu]-0tBu.[Z-28-31-0tBu] 14,18 g [20 mmoolia] Z-29-31-OtBu:a liuotetaan 280 ml:aan metanolia ja 2,1 g:n palladium-aktiivihiiltä läsnäollessa johdetaan puolen tunnin ajan vety liuoksen lävitse. Liuos haihdutetaan alennetussa paineessa katalysaattorin suodattamisen jälkeen ja öljyinen jäännös [11,65 g{ R*1: 0,2] saatetaan liuoksen kanssa, joesa on 8,25 g [19 mmoolia] Z-Glu[0tBu]-01fSu:a 200 ml:ssa etyyliasetaattia reaktioon. Liuoksen annetaan seistä yön yli ja sitten ravistellaan peräjälkeen 2 x 50 ml:11a n suolahappoa, 3 x 50 ml:11a n NaHCO^-liuosta ja lopuksi vedellä. Liuos kuivataan, etyyliasetaatti tislataan, kiinteätä jäännöstä hierretään n-heksaanin kanssa ja suodatetaan. Raaka tuote liuotetaan 45 ml:aan kuumaa etyyliasetaattia ja liuokseen lisätään 7 ai n-heksaania. Erottuneet kiteet suodatetaan seuraa vana päivänä ja kuivataan. Saalis: 13,0 g [78,5 Z-28-31-OtBu:a. Sulamispiste: 184 - 185°Cj R*: 0,80.

Analyysi C^H^O^N^ [893,1]

Laskettu: C 60,5 H 8,1 Todettu: C 60,8 H 8,0

Vaihe 5* H-Glu[0tBu]-Asp[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser[tBu]-0tBu[H-28-31-0tBu] 12,5 g [l4 mmoolia] Z-28-31-0tBu:a liuotetaan 250 ml:aan metanolia ja hydrataan 1,8 gtn palladium-aktiivihiiltä läsnäollessa puolen tunnin ajan. Katalysaattori suodatetaan ja suodos haihdutetaan kuiviin. Kiinteätä jään-

[>u83U

nöstä hierretään n-heksaanin kaneea ja suodatetaan. Saalisi 10,09 8 [95 £] H-28-31-0tBu. Sulamispiste! 139 ~ 140°C? R^: 0,3? 0,25.

Analyysi C27H66°12If4 [758,97]

Laskettu: N 7*4

Todettu: N 7»6

Vaihe 6: Z-Ala-Glu[0tBu]-Aep[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser[tBu]-0tBu.[Z-27-31-0tBu] 6,62 g [8,7 amoolia] H-28-31-0tBu:a liuotetaan 65 mliaan etyyliasetaattia ja lisätään 2,72 g [8,5 amoolia] Z-Ala-0NSu:a, joka 5-minuuttia kestäneen sekoittamisen jälkeen liukenee samoin. Tunnin kestäneen sekoittamisen jälkeen alkaa tuote erottua liuoksesta. Beaktioseoksen annetaan seistä yli yön, tuote suodatetaan seuraavana päivänä ja pestään etyyliasetaatilla. Raa-katuote kiteytetään uudelleen 65 alista etyyliasetaattia. Saalis: 6,61 g [80,7 #] Z-27-31-0tBu. Sulamispiste: 195 - 195°C; R^1: 0,35? R^* 0,75·

Analyysi C^H^O^N^ [:64,1β]

Laskettu: C 59,9 H 8,1

Todettu: C 59,6 H 8,1

Vaihe 7: H-Ala-Glu[OtBu]-Asp[OtBu]-Glu[OtBu]-Ser[tBu]-0tBu.[H-27-31-0tBu] 6,61 g [6,85 amoolia] Z-27-31-0tBu:a liuotetaan lievästi lämmittäen 150 mliaan metanolia, liuos jäähdytetään huoneenlämpötilaan ja palladium-aktiivihiilen läsnäollessa johdetaan puolen tunnin ajan vetyä. Katalysaattorin suodattamisen jälkeen haihdutetaan liuos kuiviin, kiinteätä jäännöstä käsitellään n-heksaanilla ja suodatetaan. Saalis: 5,55 8 [97,6 ?6] H-27-31” OtBu. Sulamispiste: 13Θ - 142°C; R^: 0,15*

Analyysi C^H^O^N^ [830,05]

Laskettu: C 57,9 H 8,6 N 8,4

Todettu: C 57,7 H 8,3 N 8,1

Vaihe 8: Z-Asn-OPFP

1,35 8 [5 mmoolia] Z-Aen-0H:ta ja 3,4 g pentafluorifenolla liuotetaan 3,5 mliaan dimetyyliformamidia ja liuokseen lisätään 10,5 ml dioksaania.

Liuos jäähdytetään 0°C:een ja sekoittaen lisätään 1,13 8 [5,5 mmoolia] DCCitä. Reaktioseosta sekoitetaan 2 tunnin ajan 0°C:ssa, sitten suodatetaan DCU ja suodos haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa. Jäännöstä hierretään 8 ml:n eetteriä kuissa, kiteinen valkoinen aine suodatetaan ja pestään pienellä määrällä kylmää eetteriä. Saalis: 2,02 g [93,5 $] Ζ-Αβη-OPFP. Sulamispiste 149 - 150°C? R*°: 0,35

Analyysi 018H13°5"2F5 U32.31]

Laskettu: C 50,0 H 3,0 K 6,5 Todettu: C 50,2 H 3,1 N 6,4 10 S 683 ϋ

Valhe 9« Z-A βη-Gly-O tBu L Z-25-26-0tBu] 0,43 g [l aaooliaJ Z-Aen-0P7Pitä liuotetaan lievästi läänittäen 10 altaan diokeaanla, lluoe jäähdytetään 10°Cxeen ja lisätään 0,185 8 C1,1 aaoolia] H-Gly-OtBuxHCl:ää. Saatuun suspensioon lisätään sekoittaen 0,154 ai [l,l aaoolia] trietyyllaaiinia, reaktioseosta sekoitetaan puolen tunnin ajan huo-neenläapötilassa, sitten suodatetaan ja suodos haihdutetaan. Saatua geeli-aäistä jäännöstä hierretään eetterin kanssa ja suodatetaan. Tällä tavalla saadaan 0,34 8 [89,8 f>] Z-Asn-Gly-OtBuia. Sulamispiste! 150 - 151°C; R*x 0,6.

Analyysi C^H^OgNj [379,42]

Laskettu! N 11,1

Todettux N 11,2

Vaihe 10x Z-Asn-Gly-OH [Z-25-26-0H] 9,13 8 [26 aaoolia] Z-Asn-Gly-OtBuxa liuotetaan 90 mlxaan trifluori-etikkahappoa ja annetaan seistä puoli tuntia, sen jälkeen lisätään 430 ai kuivaa eetteriä. Erottunut valkoinen sakka suodatetaan ja pestään eetterillä. Raakatuote kiteytetään uudelleen 35 alista vettä, jolloin saadaan 6,56 g [78 £] Z-Asn-Gly-OHxta. Sulaaispiste 170 - 172°C; R^x 0,43*

Vaihe lii Z-Asn-Gly-Ala-fllu[0tBu]-Asp[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser[tBu]-0tBu.[Z-25-3I-OtBu].

2,39 8 [θ aaoolia] Z-Asn-Gly-OHxta, 6,65 g [8 aaoolia] H-Ala-Glu[OtBu]-Asp[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser[tBu]-0tBuia ja 4,86 g pentafluorifenolia liuotetaan 28 aixaan diaetyyliforaaaidia, liuos jäähdytetään 0°Cxeen ja lisätään 11,81 g [8,8 aaoolia] DCCxtä. Reaktioseosta sekoitetaan puolen tunnin ajan 0°Cxssa, sitten huoneenläapötilassa 2,3 tuntia. DCUxn suodattaaisen jälkeen haihdutetaan liuos kuiviin, jäännöstä käsitellään etyyliasetaatilla ja suodatetaan. Saalisi 7,3 8 [80,3 #] Z-25-31-OtBu. Sulaaiepistex 194°0 [hajoten]; R^x 0,6.

Vaihe 12; H-A sn-Gly-Ala-Glu[0tBu]-A sp[0 tBu]-Glu[0tBu]-Ser[tBu]-0 tBu [H-25-31-0tBu] 6,47 8 [3,7 aaoolia] H-25-31-0tBuxa liuotetaan seokseen, joesa on 220 ai etanolia ja 20 ai diaetyyliforaaaidia ja johdetaan 1 gxn palladiuaaktii-vihiiltä läsnäollessa tunnin ajan vetyä liuoksen lävitse. Katalysaattori suodatetaan ja suodos haihdutetaan kuiviin. Geelimäistä jäännöstä käsitellään eetterillä, suodatetaan ja kuivataan. Saalisi 4,9 8 [86,2 ^] H-25-31-OtBu. Sulamispiste! 174 - 176°C [hajoten].R^x 0,2.

Vaihe 13t Z-Lys[BOC]-Lye[BOC]-Arg[K02]-Arg[N02]-Pro-Val-Lys[BOC]-Val-Tyr[tBu]-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu[OtBu]-Asp[OtBu]-Glu[OtBu]-Ser[tBu]-OtBu.[Z-15- 31-0tBu] 7,4 g [4 aaoolia] Z-Lys[B0C]-Lys[B0C]-Arg[N02]-Arg[K02]-Pro-Val-Lys [B0C]-Val-Tyr[tBu]-Pro-0R [itävaltalainen patentti-ilaoitus nr. 293 05l] ja 4,2 g [4,2 aaoolia] H-25-31-OtBuxa liuotetaan 25 allaan diaetyyliforaaaidia, liuos jäähdytetään 0°Cxeen ja lisätään liuokseen 3,64 8 [4,8 aaoolia] DCC-PFPOH-koapleksia, joka sisältää reaktiokoaponentteja suhteessa 1x3* Reaktio- 11

&6 83 O

seosta sekoitetaan 20 min* ajan 00Cssea, sitten 5 tuntia huoneenlämpötilassa· Lopuksi reaktioseos suodatetaan 300 altssa vedetöntä eetteriä* erottuva sakka eristetään. Saadaan 11,0 g [97 #] raakaa tuotetta. Sulamispiste* 180°C. Raakatuote liuotetaan 33 ml»aan aetanolia ja seostetaan lisääeällä 430 el etyyliasetaattia. Saalis» 8,73 g [77 Z-15-31-OtBu. Sulamispiste [hajoten]» 185°Cj R^t 0,5.

Vaihe 14* H-Lys[B0C]-Lys[B0C]-Arg-Arg-Pro-Val-Lys[B0C]-Val-Tyr[tBu]-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu[0TBu]-Asp-[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser[tBu]-0tBu.3HCl[H-15-31-0tBu.3 HC1] 6,5 g [2,3 anoolia] Z-15-31-OtBu*a liuotetaan 85 altaan etikkahappoa ja johdetaan 2 g»n palladium-aktiivihiiltä läsnäollessa vetyä liuoksen lävitse. Reaktion edistyalstä kontrolloidaan ohutlevykroaatografian avulla. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori ja suodos haihdutetaan kuiviin. Saatu tuote [6,72 g] liuotetaan 70 altaan vettä ja liuoksen pH-arvo saatetaan jäähdyttäaällä laimennetulla suolahapolla 4*ksi. Sen jälkeen lisätään liuokseen 20 ml 30 $*eta keittosuolaliuosta, erottunut sakka suodatetaan ja kuivataan. Suolanpoistaais-tarkoitusta varten suspensoidaan tuote etanoliin ja kloroforaiin, suola suodatetaan ja suodos haihdutetaan kuiviin. Jäännöstä käsitellään eetterillä ja suodatetaan. Saalis* 5*35 g [85,6 ji] H-15-3l-0tBu. 3HC1. r£* 0,45.

Vaihe 15* BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu[OtBu]-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys[BOC]-Pio-Val-Gly-Lys[BOC]-Lys[B0C]-Arg-Arg-Pro-Val-Lys[BOC]-Val-Tyr[tBuj-Pro-Asn-Gly-

Ala-Glu[0tBu]-Asp[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser[tBu]-0tBu.3 HC1 [BOC-l-31-OtBu.3HCl] 2,96 g [l,5 aaoolia] BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu[OtBu]-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys[BOC]-Pro-Val-Gly-OH [itävaltalainen patentti-ilaoitus nr. 295 051] ja 4,08 g [1,5 aaoolia] H-15-3l-OtBu.3HCl*ää liuotetaan 20 altaan diaettyyli-foraanidia, liuos jäähdytetään 0°C:een ja lisätään ensiksi 0,21 ai trietyyli-aaiinia, sen jälkeen 1,36 g [l,8 aaoolia] BCC-PFPOH-koapleksia. Reaktioseosta pidetään 10 minuutin ajan 0°Cseen lämpötilassa, sitten 24 tuntia huoneenlämpötilassa ja lopuksi suodatetaan 250 aliesa kuivaa eetteriä. Erottunut sakka suodatetaan, pestään eetterillä ja sitten kuivataan. Saalis* 6,84 g [98,4 $>] BOC-l-31-OtBu.3HCL»ää) r£* 0,45.

Vaihe 16* H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Arg—Pro—Vai—Lys—Vai—Tyr—Pro—Asn—Gly—Ala—Glu-Asp—Glu—Ser—OH.3CH^C00H [H—1—31— OHOCHjCOOH] 3,0 g [0,647 aaoolia] B0C-l-31-0tBu«3HCl*ää liuotetaan seokseen, jossa on trifluorietikkahappoa, vettä ja anisolia suhteesea 8*1*1 ja liuosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa tunnin ajan. Sen jälkeen lisätään liuokseen 300 ai eetteriä. Erottunut sakka suodatetaan ja pestään eetterillä. Saatu trifluoriaeetaatti [2,89 g] liuotetaan veteen ja liuos suodatetaan Dovex-pylväällä 1x8 [asetaattiauoto]. Ioninvaihdon jälkeen saatetaan liuos 500 ai*11a CN 23ta täytettyyn pylvääseen. Puhdistus tapahtuu gradientilla 12 06830 eluoinnilla. Fraktiot, jotka sisältävät halattua ainetta, yhdistetään ja pa-kastekuivataan. Saalis 1,64 g [70 kromatograafieesti yhtenäistä, biologisesti täysin aktiivista H-l-31-OHtta.

Aainohappoanalyysi1 Lys 4*08 [4]I His 1,0 [l];

Arg 2,94 [3]; Asp 2,01 [2]; Met 0,78 [l]j Ser 2,78 [3]»

Glu 3,07 [3l* Pro 2,86 [3]; Gly 2,97 [3]l Ala 1,09 [l]|

Vai 2,96 [3]; Tyr 2,1 [2]; Phe 1,09 [lj.

Esimerkki 2

Vaihtoehtoaenetelaä ihaiseliaistön ACTH^^511 synteesiin Vaihe 1» Z-Arg[N0g J-Arg[HOg J-Pro-OPFP [Z-17-19-OPFPJ 3»26 g [5 aaooliaj Z-Arg[N02J-Arg[N02]-Pro-OH*ta [itävaltalainen pa-tentti-ilaoitus nr. 295 051] liuotetaan 30 altaan dimetyyliformamidia ja liuokseen lisätään 5,31 g [7 anoo1ia] DCC-PFPOH-konpleksia. Reaktioseosta sekoitetaan huoneeniänpötilaeaa 5 tunnin ajan, sen jälkeen erottunut DCTT suodatetaan ja euodos haihdutetaan kuiviin, öljyinen jäännös saatetaan jähmettymään eetterissä. Täaä sakka suodatetaan ja pestään eetterillä [3,8 g - 92,9 # raakatuotetta]. Raakatuote liuotetaan 11 altaan tetrahydrofuraania ja säestetään 60 aitila eetteriä.

Analyysi ^^36^(^11^5 C817*93 Laskettu: C 45*5 H 4,4 N 18,8 F 11,6 Todettu} C 46,0 H 4*7 N 18,7 F 11,8

Vaihe 2: Z-Arg[N02]-Arg[N02]-Pro-Val-Lys[B0C]-Val-Tyr-[tBu]-Pro-0H.[Z-17-24-OH] 2,22 g [2,92 mmoolia] H-Val-Lye[BOC]-Val-Tyr[tBu]-Pro-0Htta [itävaltalainen patentti-ilmoitus no. 295 05l] suspensoidaan 25 altaan dimetyyliform-amidia ja lisätään sekoittaen 2,64 g [3*22 maoolia] Z-17-19-OPFPttä. Sekoittamalla 2 1/2 tunnin ajan saadaan kirkas liuos, jota sekoitetaan vielä 21/2 tuntia ja sitten haihdutetaan kuiviin. Jäännös saatetaan tetrahydrofuraanin avulla suodattimelle ja pestään tetrahydrofuraanilla. Raakatuote [3*8 g -93*3 $] liuotetaan 15 mitään metanolia ja saostetaan 100 mltila etyyliasetaattia. Sakka suodatetaan ja kuivataan. Saalis 3,55 g [87*2 ^] Z-17-24-0H. R^t 0,7· Analyysi C^H^O^ [1394,61]

Laskettut C 55*1 H 7,2 N 17,1 Todettut C 55,0 H 7,0 N 17,2

Vaihe 3t H-Arg-Arg-Pro-Val-Lys[B0C]-Val-Tyr[tBu]-Pro-0H.3HCl [H-17-24-0H.3HC1] 0,4 g [0,29 mmoolia] Z-17-24-0Htta liuotetaan 8 altaan etikkahappoa ja hydrataan 0,1 gtn palladium-aktiivihiilen läsnäollessa. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori ja suodos haihdutetaan kuiviin, öljyinen jäännös liuotetaan 3 altaan metanolia ja liuoksen pH-arvo saatetaan jäähdyttämällä laimennetulla suolahapolla 4>ksi. Sen jälkeen haihdutetaan liuos kuiviin 15 56830 ja haihdutuejäännös saatetaan etyyliasetaatin avulla suodattimelle. Saadaan 0,26 g [70,2 H-17-24-Oh.3HCliää. ΐφ 0,1.

Vaihe 4: Z-Lys[B0C]-Arg-Arg-Pro-Val-Lys[B0C]-Val-Tyr[tBu]-Pro-0H.2HCl [Z-l6-24-0h.2HCL] 0,63 [0,49 mmoolia] H-17-24-OH.3HCl:ää suspensoidaan 7 ml:aan dimetyy-liformamidia ja lisätään 0,07 ml trietyyliamlinla sekä 0,3 g [0,6 mmoolia] Z-Lye[B0C]-0NP:tä. Reaktioseosta sekoitetaan 24 tuntia huoneenlämpötilassa ja sitten haihdutetaan kuiviin. Jäännös saatetaan etyyliasetaatin avulla suodattimelle ja pestään pienellä määrällä vettä. Saalis: 0,6 g [76,3 i>] Z-I6-24-0H.2RC1. R^: 0,45«.

Vaihe 5* Z-Lys[BOC]-Lys[BOC]-Arg-Arg-Pro-Val-Lye[BOC]-Val-Tyr[tBu]-Pro-0H.2HCl. [Z-15-24-0H.2HC1] 0,5 g [0,3 mMol] Z-l6-24-0H.2HCl:ää liuotetaan 20 ml:aan aetanolia ja hydrataan palladium-aktiivihiilen läsnäollessa. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori ja suodos haihdutetaan kuiviin. Jäännös saatetaan etyyliasetaatin avulla suodattimelle. Saalis: 0,42 g [97*5 H-l6-24-0H.2HCl:ää [R^: 0,15].0,33 g [0,23 mmoolia] tätä tuotetta suspensoidaan 3 ml:aan dime-tyyliformamidia ja lisätään 0,14 g [0,25 mmoolia] Z-Lys[B0C]-0PPP:tä. Kun on sekoitettu 10 min. ajan saadaan kirkas liuos, jota sekoitetaan vielä 3 tuntia ja sitten haihdutetaan kuiviin. Jäännöstä hierretään etyyliasetaatin kanssa. Saalis: 0,36 g [85,4 £] Z-15-24-0H.2HCl:ää. R*: 0,45·

Vaihe 6: Z-Lys[B0C]-Lys[B0C]-Arg-Arg-Pro-Val-Lys[BOC]-Val-Tyr[tBu]-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu[0tBu]-Asp[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser[tBu]-0tBu.2HCl [Z-15-31-0tBu.2HCl] 0,18 g [0,1 mmoolia] Z-15-24-0H.2HCl:ää ja 0,10 g [0,1 mmoolia] H-25-31-0tBu:a liuotetaan 1 ml:aan dimetyyliformamidia ja liuokseen lisätään 0,091 g [0,12 mmoolia] DCC-PFPOH-komp1eksia. Reaktioseosta sekoitetaan 5 tuntia ja sitten laimennetaan etyyliasetaatilla. Erottunut DCU suodatetaan ja suodos haihdutetaan kuiviin. Jäännöstä hierretään eetterin kanssa. Saadaan 0,25 g [88,8 £] Z-15-31-OtBu:2HCl:ää. R*: 0,5· Tuotetta käsitellään edelleen esimerkissä 1.kuvatulla tavalla.

Esimerkki 3

Ihmiselimistön ACTH^^^n 8Vn^ees^

Vaihe 1: Z-Glu[0tlu]-Ser-Ala-0tBu.[Z-30-32-0tBu] 23,9 g [100 mmoolia] Z-Ser-0H:ta ja 14,5 g [lOO mmoolia] H-Ala-0tBu:a liuotetaan 150 ml:aan metyleenikloridia ja liuos jäähdytetään -10°C:een. Sen jälkeen lisätään tipoittain liuos, joka on valmistettu 20,6 g:sta [lOO mmoolia] DCC:tä ja 100 ml:sta metyleenikloridia. Reaktioseosta sekoitetaan 2 tuntia 0°C:ssa ja annetaan seistä yli yön. Seuraavana päivänä suodatetaan erottunut DCU ja suodos pestään peräjälkeen 3 x 70 ml:11a n suolahappoa, 3 x 70 ml:lla 5 #:sta NaHCO^-liuosta ja lopuksi vedellä. Sen jälkeen kun linos on kuivattu tislataan metyleenikloridi ja öljyinen jäännös saatetaan n-heksaanissa jäh- 14 56830 mettymään. Saadaan 30,0 g [82 #] raakaa Z-Ser-Ala-OtBu * a, joka liuotetaan 600 altaan metanolia ja hydrataan 2 gtn palladiumaktiivihiiltä läsnäollessa· Reaktiota kontrolloidaan ohutlevykromatografian avulla. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori, euodos haihdutetaan kuiviin ja öljyinen jäännös liuotetaan 220 altaan etyyliasetaattia. Tähän liuokseen lisätään 33*0 g [76 mmoolia] Z-Glu[0tBu]-0RSuta. Toisena päivänä ravistellaan liuosta 3 x 30 altn n suolahappoa kanssa, sitten 3 x 50 mltn 5 £*eta VaHCO^-liuosta kanssa ja lopuksi veden kanssa. Liuos kuivataan, sen jälkeen tislataan etyyliasetaatti ja öljyinen jäännös kiteytetään seoksesta, jossa on etyyliasetaattia ja petrolieetteriä. Saadaan 31*5 g [75 ^] Z-30-32-0tBu:a. Sulanis-pistet 72 - 74°Cj Rj1* 0,6} [a]D - -28,9°

Analyysi Ο^Η^Η^Ο^ [551*84]

Laekettui C 58,8 H 7,5 R 7,7

Todettu: C 58,8 H 7,7 N 7,8

Vaihe 2: H-Glu[OtBu]-Ser-Ala-OtBu [H-30-32-0tBu] 16,0 g [29 mmoolia] Z-30-32-OtBu:a liuotetaan 350 altaan aetanolia ja hydrataan 1,6 gtn palladiua-aktiivihiiltä läsnäollessa. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori ja euodos haihdutetaan kultiin. Jäännös kiteytetään aetanoli- ja eetteriseoksesta. Saadaan 9,06 g [75 H-30-32-0tBu:a.

Sulamispiste* 135 - 136°Cj R**: 0,15; [«]D - -25,9° [c 1; etanoli].

Analyysi [417,80]

Laskettut C 54,6 H 8,5 K 10,1

Todettu: 054,5 H 8,4 N 9,8

Vaihe 3: Z-Asp[OtBu]-Glu[OtBu]-Ser-Ala-OtBu[Z-29-32-OtBu] 8,2 g [19,6 aaoolia] H-30-32-0tBu:a ja 8,0 g [19,0 aaooliaj Z-Asp[0tBu] -ORSuta saatetaan reagoimaan 80 altaan etyyliasetaattia. Liuosta ravistellaan seuraavana päivänä peräjälkeen 3 x 20 mltn n suolahappoa kanssa, 3 x 20 mltn 5 s ta NaHCOj-liuosta kanssa ja lopuksi veden kanssa. Liuos kuivataan, etyy liasetaatti tislataan ja jäännös saatetaan petrolieetterin avulla suodatti-melle. Saadaan 12,08 g [85,5 ^] Z-29-32-0tButa. Sulamispistet 85 - 87°C; rJ1: 0,55; [«]D - -3,28° [c - 1; etanoli].

Analyysit C^H^O^R^ [722,81]

Laskettu: C 58,2 H 7,5 R 7,8

Todettut C 58,3 H 7,6 R 7,3

Vaihe 4t H-Asp[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser-Ala-0tBu [H-29-32-OtBu] 10,5 g[14,5 mmoolia] Z-29-32-OtBu:a liuotetaan 130 mitään metanolia ja hydrataan 1 gtn palladium-aktiivihiiltä läsnäollessa. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori ja euodos haihdutetaan kuiviin. Jäännöstä hierretään petrolieetterin kanssa. Saadaan 8,35 8 [97,5 #] H-29-32-OtButa.

15 &6830

Sulamispiste* 81 - 82°C; R^1* 0,1j [e]D - -24,3° [c - 1» etanoli].

Vaihe 5* Z-Glu[OtBu]-As[OtBu]-Glu[OtBu]-Ser-Ala-OtBu.[Z-28-32-0tBu] 3tO g [li,5 mmoolia] Z-Glu{0tBu]-0HSu*a ja 6,6 g [li,2 amoolia] H-29- 32-0tBu*a saatetaan reaktioon 100 mlissa kloroformia. Seuraavana päivänä ravistellaan reaktioseosta peräjälkeen 3 x JO ml*n n suolahappoa kanssa, 3 x 30 ml:n NaHCO^-liuosta kanssa ja lopuksi veden kanssa. Liuos kuivataan ja kloroformi tislataan. Jäännös puhdistetaan säestämällä kloroforai-petro-lieetteristä. Saalis* 8,45 g [83 Ί»\ Z-28-32-0tBu. Sulamispiste* 166 - 169°C| R*1* 0,5* [a]D - -29° [c - 1} etanoli].

Analyysi C^Hg^Oj^ [908,07]

Laskettu* C 38,2 H 7,7 N 7,7 Todettu* C 58,4 H 7,7 N 7,5

Vaihe 6* H-Glu[0tBu]-Asp[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser-Ala-0tBu.[H-28-32-0tBu] 8.0 g [8,8 mmoolia] Z-28-32-0tBu*a liuotetaan 160 mitään metanolia ja hydrataan 1 g*n palladium-aktiivihiiltä läsnäollessa. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori ja suodos haihdutetaan kuiviin. Jäännöstä hierretään eetteri- ja petrolieetteriseoksen kanssa. Saadaan 6,4 g [94 $] H-28-32-0tBu*a. Sulamispiste* 138 - 139°C* hJ2* 0,lj [e]D - -29,7° [c - 1* etanoli].

Vaihe 7* Z-Ala-Glu[0tBu]-Asp[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser-Ala-0tBu. [Z-27-32-

OtBu].

5,2 g [6,7 mmoolia] H-28-32-0tBu*a saatetaan 50 mltssa kloroformia reaktioon 2,15 g*n [6,7 mmoolia] Z-Ala-OnSuta kanssa. Seuraavana päivänä ravistellaan reaktioseosta peräjälkeen 3 1 10 ml*n n suolahappoa kanssa, 3 x 10 ml*n 5 ^tsta NaHCO^-liuosta kanssa ja veden kanssa. Liuos kuivataan ja kloroformi tislataan. Jäännös saatetaan petrolieetterin avulla suodatti-melle. Saalis* 6,1 g [93,1 #] Z-27-32-0tBu. Sulamispiste* 194 - 195°Cj rJ2* 0,5l [a]D - 30,9° [c - 1; etanoli].

Vaihe 8* H-Ala-Glu[0tBu]-Aep[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser-Ala-0tBu.[H-27-32-

OtBu]· 6.1 g [6,2 mmoolia] Z-27-32-OtBu*a liuotetaan 120 mitään metanolia ja hydrataan 1 g*n palladium—aktiivihiiltä läsnäollessa. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori ja suodos haihdutetaan kuiviin. Jäännös kiteytetään etanolin ja eetterin seoksesta. Saalis* 4,32 g [83 #] H-27-32-0tBu. Sulamispiste* 192 - 194°C| R^t 0,1.

Analyysi C39H68W6014 [®45»0]

Laskettu* C 55,4 H 8,1 H 9,9 Todettu* C 55,2 H 7,8 N 9,6

Vaihe 9* Z-Aen-Gly-Ala-Glu[0tBu]-Asp[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser-Ala-0tBu. [Z-25-32-OtBu] 2,45 g [13,3 mmoolia] pentafluorifenolia, 1,31 g [4,02 mmoolia] Z-Asn-Gly-OH*ta [esimerkki l] ja 3,4 g [4,02 mmoolia] H-27-32-OtBu*a liuotetaan 24 ml taan kuivaa dimetyyliformamidia, liuos jäähdytetään 0°C*een ja lisätään 16 56830 0,915 g [4*45 mnoolia] DCCitä. Reaktioeeoeta sekoitetaan puoli tuntia 0°C:ssa, sitten 2,9 tuntia huoneenlämpötilassa. Erottunut DCU suodatetaan ja suodoe haihdutetaan kuiviin. Kiinteätä jäännöstä käsitellään etyyliasetaatilla, suodatetaan ja pestään kuumalla etyyliasetaatilla. Saalisi 4»12 g [89 #] 2-25-52-OtBu. Sulamispiste: 200 - 201°C; R^: 0,6* [ct]D - -13,9° [e - 1» BMP].

Vaihe 10: H-Asn-Gly-Ala-Glu[OtBu]-Asp[OtBu]-Glu[OtBu]-Ser-Ala-OtBu. [H-25-32-0tBu] 4.0 g [9,48 mmoolla] Z-25-32-OtBu:a liuotetaan 140 ml:aan metanolia ja hydrataan 0,3 g:n palladium-aktiivihiiltä läsnäollessa. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori ja suodos haihdutetaan kuiviin. Jäännöstä käsitellään eetterillä ja suodatetaan. Saalis: 3*4 g [96 #] H-25-32-OtBu. Sulamispiste: 188 - 190°Cj R*: 0,5* [a]D - -6,6° [c - 0,89* DKF].

Vaihe 111 Z-Lys[B0C]-Lys[B0C]-Arg[K02]-Arg[K02]-Pro-Val-Lys[BOC]-Val-Tyr[tBu]-Pro-A sn-Gly-Ala-Glu[0tBu]-Asp[0tBu]-Glu[0tBu]-S er-Ala-0tBu. [Z-15- 32-0tBu] 3.0 g [2,95 mmoolia] H-25-32-OtBuia ja 5,46 g [2,95 »moolia] Z-Lys-[BOC]-Lys[B0C]-Arg[N02]-Arg[KO2]-Pro-Vai-Lys[B8C]-Vai-Tyr[tBu]-Pro-OH1 ta [itävaltalainen patentti-ilmoitus nr. 295 051] liuotetaan 33 mliaan diaetyy-liforaamidia, liuos jäähdytetään 0°C:een ja lisätään 3,35 g [4,42 mmoolia] DCC-PFPOH-kompleksia. Reaktioeeoeta pidetään 15 »in. ajan 0oC:esa, sitten 6 tuntia huoneenlämpötilassa. Erottunut DCU suodatetaan pois, jolloin auo-dos suodatetaan 450 ml:ssa kuivaa eetteriä. Erottunut raakatuote puhdistetaan saostamalla uudelleen metanoli-eetteri-seoksesta. Saalis: 7,18 g [85,1 fl] Z-15-32-OtBu. np 0,55* [a]jj - -26,4° [o - 0,42* DMF].

Vaihe 12: H-Lys[B0C]-Lys[B0C]-Arg[K0g]-Arg[K02]-Pro-Val-Lys[BOC]-Val-Tyr[tBu]-Pro-A sn-Gly-Ala-Glu-[0 tBu]-A sp[0tBu]-Glu[0tBu]-S er-Ala-0tBu.3HC1· [H-15-32-0tBu.3HCl] 6,5 g [2,28 mmoolia] Z-15-32-OtBu:a liuotetaan 85 ml:aan etikkahappoa ja hydrataan 2 g:n palladium-aktiivihiiltä läsnäollessa. Reaktiota seurataan ohutlevykromatografian avulla. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori, suodos haihdutetaan kuiviin ja öljyinen jäännös saatetaan kuivan eetterin avulla jähmettymään. Suodattamisen jälkeen liuotetaan tuote 70 ml:aan vettä ja liuoksen pH-arvo saatetaan laimennetulla suolahapolla 4<ksi. Sen jälkeen tuote seostetaan lisäämällä 30 #:sta keittosuolaliuosta liuoksesta. Suodattamisen ja kuivaamisen jälkeen poistetaan tuotteesta suola saostamalla »e-tanoli-kloroformiseoksesta. Liuotin tislataan ja jäännöstä käsitellään eetterillä ja suodatetaan. Saalis: 5,6 g [89,6 H-15-32-OtBu*3HCl:ää| ϊφ 0,35* [a]j> - -26,1° [c - 1| BMP]

Aainohappoanalyyei: Lys 3,0[3]j Arg 1,8[2];

Asp 1,98 [3]» Ser l,0[l]* Glu 2,2[2]| Pro 2,l[2]| Gly l,05[l]| Ala 2,0[2]|

Vai 1,96[2]| Tyr 0,96[l].

17 [>6830

Vaihe 13s BOC-Ser-Tyr-Ser-met-Glu[OtBu]-HiB-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys[BOC]-Pro-Val-Gly-Ly e [ BOC ]»*Ly β [ BOC ]-Arg-Arg-Pro-Val-Ly B [ BOC ]-Val-Tyr [ tBu ]-Pro-Αβη-

Gly-Ala-Glu[OtBu]-Asp[OtBu]-Glu[OtBu]-Ser-Ala-OtBu.3HC1 [BOC-l-31”OtBu. 3HCl] 3,11 g [l,57 mmoolia] BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu[OtBu]-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys[BOC]-Pro-Val-Gly-OH. HC11 ää [itävaltalainen patentti-ilmoitus nr.

295 051] ja 4,30 g [1,57 mmoolia] H-15-32-0tButa liuotetaan 25 mlsaan dime-tyyliformamidia ja liuokseen lisätään 0,22 ml trietyyliamiinia sekä 1,79 g [2,36 mmoolia] DCC-PFPOH-kompleksia. Reaktioseosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa 24 tuntia ja sitten suodatetaan 300 mlsssa kuivaa eetteriä. Erottunut tuote suodatetaan ja pestään. Saalisi 1,2 g [98,5 BOC-l-32-OtBu.3HC1. R*t 0,5» [«]D - -27^6° [o - 1; BMP].

Vaihe 14s H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Aen-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala.3CHjC00H.

[H-I-32-OH.3CH5COOH].

3,0 g [0,64 mmoolia] BOC-l-32-OtBu.OtBu.3HClsää liuotetaan sekoittaen seokseen, joka koostuu 3,0 mlssta anisonia, 3*0 mlssta vettä ja 24 mlssta trifluorietikkahappoa. Tunnin kestäneen sekoittamisen jälkeen lisätään reaktioseokseen 300 ml eetteriä. Erottunut sakka suodatetaan ja pestään eetterillä. Saatu trifluoriasetaatti [2,86 g] liuotetaan veteen ja liuos suodatetaan Dowex-pylväällä 1x8 [asetaattimuoto]. Sen jälkeen saatetaan liuos 500 mltila CM 23:a täytettyyn pylvääseen. Pylväskromatograafinen puhdistus tapahtuu asteittaisella eluoinnilla. Päätuotetta sisältävät fraktiot kootaan ja pakastekuivataan. Tällä tavoin saadaan 1,7 g [70 ?6] kromatograafi-sesti yhtenäistä ja biologisesti täysin aktiivista H-I-32-OH:ta.

Aminohappoanalyysi: Lys 3»94[4]i His l,0[l]; ARg 2,81[3]? Asp 2,07[2]} Met 0,72[l]j Ser 2,72[3]*

Glu 2,94[3]; Pro 2,96[3]i Gly 2,89[3l; Ala 2,2[2];

Vai 2,97[3]* Tyr l,98[2]j Phe 0,99[l].

Esimerkki 4

Ihmiselimistön ACTHtn synteesi

Vaihe lt Z-Ser-Ala-Glu£0tBu]-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu[0tBu]-Phe-0tBu.[Z-3I-39-0tBu].

51,6 g [48,3 mmoolia] Z-Leu-Glu[OtBu]-Phe-OtButa [s.S. Bajusz, T.

Lazart Acta Chim. Hung. 48, 111 [1966] liuotetaan 310 mitään dimetyyliform-amidia ja hydrataan palladium-aktiivihiilen läsnäollessa. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori ja suodos haihdutetaan 100 mitään, jäähdytetään -20°Cteen ja kaadetaan liuokseen, jonka koostumus on seuraavanlainen! 38,33 g [47,7 mmoolia] Z-Ser-Ala-Glu[0tBu]-Ala-Phe-Pro-0H] itävaltalainen patentti-ilmoitus nr. 295 051 [liuotetaan 100 mitään dimetyyliformamidia, lisätään 5,27 ml] 47,4 mmoolia [N-metyyli-morfoliinia, jäähdytetään -10°Cteen ja lisätään sekoittaen 6,26 ml [47,4 mmoolia] kloorihiilihappobutyyliesteriä.

18 56830

Reaktioseosta sekoitetaan -10°Ctssa 8 min. ajan, sitten Jäähdytetään -20°Cieen ja kaadetaan edelläkuvattu aminokomponentin esijäähdytetty liuos. Reaktio-seosta sekoitetaan 15 min. ajan -10°Cissa, tunnin ajan 0°C*ssa ja lopuksi tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten reaktioseos kaadetaan 2 litraan jäävättä, joka sisältää 45 ml N-metyylimorfoliinia. Sakka suodatetaan, pestään laimennetulla sitruunahapolla, sitten vedellä ja lopuksi eetterillä. Saalisi 55»85 g [89,9 Z-31-39-OtBu. Sulamispiste [hajoten]* 180°C; R^: 0,7·

Vaihe 2* H-Ser-Ala-Glu[OtBu]-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu[OtBu]-Phe-OtBu.[H-3I-39-OtBu], 78,95 g [60,15 mmoolia] Z-31-39-OtBu*a liuotetaan 15ΟΟ mliaan 80 joista etikkahappoa Ja hydrataan palladium-aktiivihiilen läsnäollessa. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori ja suodos haihdutetaan kuiviin. Jäännöstä käsitellään eetterillä ja suodatetaan. Saalisi 74,39 g [99 £] H-3I-39-OtBu. Sulamispiste [hajoten]} 105°C; R^i 0,5·

Vaihe 31 Z-Glu[OtBu]-Ssr-Ala-Glu[OtBu]-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu[OtBu]-Phe-OtBu. [Z-30-39-OtBu].

44.3 8 [85,8 mmoolia] Z-Glu[0tBu]-0Htn DCEA-suolaa suspensoidaan 430 mliaan kuivaa eetteriä ja lisätään 9,6 ml [83,8 mmoolia] N-metyylimorfo-liinia. -10°Cteen lämpötilassa lisätään tipoittain sekoittamalla 11,3 ml [85,8 mmoolia] kloorihiilihappoisobutyyliesteriä liuokseen ja sitten jäähdytetään -20°C:een. Tässä lämpötilassa lisätään edeltäkäsin -20°C;een jäähdytetty liuos, jossa on 88,5 8 [71«5 mmoolia] H-31-39-0tButa 300 mltssa kuivaa dime-tyyliformamidia ja sitten reaktioeeosta sekoitetaan 15 min. ajan -10°CtBsa, tunnin ajan 0°CiBsa ja lopuksi 1 tunti huoneenlämpötilassa. Lopuksi kaadetaan reaktioseos 8 litraan n sitruunahappoa. Erottunut sakka suodatetaan, pestään vedellä ja sitten eetterillä. Saadaan 104,1 8 [97,2 $>] Z-30-39-OtBu*a. Sulamispiste: 136 - 138°C [hajoten]! R^i 0,8.

Vaihe 41 H-Glu[OtBu]-Ser-Ala-Glu[OtBu]-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu[OtBu]-Phe-OtBu. [H-3O-39-0tBu].

103,1 8 [68,8 mmoolia] Z-30-39-OtBuia liuotetaan 1500 mliaan 80 ^tsta etikkahappoa ja hydrataan palladium-aktiivihiilen läsnäollessa. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori ja suodos haihdutetaan kuiviin. Jäännöstä käsitellään eetterillä, suodatetaan ja pestään eetterillä. Saadaan 90,75 8 [92,7 96] H-30-39-OtBu:a. Sulamispiste 118°C, [hajoten]; R^i 0,5*

Vaihe 5* Z-Asp[OtBu]-Glu[OtBu]-Ser-Ala-Glu[OtBu]-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu [0tBu]-Phe-OtBu. [Z-29-39-0tBu].

38.3 8 [75,9 mmoolia] Z-Asp[0tBu]-0Hin DOHA-suolaa suspensoidaan 400 mliaan kuivaa dimetyyliformamidia ja lisätään 8,5 ml [76,6 mmoolia] N-metyylimorfoliinia. Seoe Jäähdytetään -10°Cteen ja sekoittaen lisätään 10 ml [75,9 mmoolia] kloorihiilihappoisobutyyliesteriä. Reaktioseos jäähdytetään -20°Cieen ja lisätään -20°Ciesn esijäähdytetty liuos, jossa on 90 g [63,25 W S 6 83 ύ mmoolia] H-30-39-0tBu:a 230 ml:sea dimetyyliformamidia. Reaktioseosta sekoitetaan -10°C:sBa 13 minuuttia, 0°C:esa 1 tunti ja huoneenlämpötilassa edelleen 1 tunti. Erottunut suola suodatetaan ja suodos haihdutetaan kuiviin. Jäännöstä käsitellään n sitruunahapolla, suodatetaan ja pestään kunnes se on neutraali. Saalis: 98,3 g [93 i°\ Z-29-39-OtBu. Sulamispiste [hajoten] 185°C| R*: 0,8.

Vaihe 6: H-Asp[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser-Ala-Glu[0tBu]-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu [0tBu]-Phe-0tBu. [H-29-39-OtBu].

67,25 g [42,15 mmoolia] Z-29-39*"0tBu:a liuotetaan 1300 ml:aan 80 j6:sta etikkahappoa ja hydrataan palladium-aktiivihiilen läsnäollessa. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori ja suodos haihdutetaan kuiviin. Jäännöstä käsitellään eetterillä, suodatetaan ja kuivataan. Saalis: 63,8 g [95 $>] Z-29-39-0tBu]. Sulamispiste [hajoten]: 128 - 1320Cj R^: 0,3*

Vaihe 7* Z-Glu[0tBu]-Asp[0tBu;]-Glu[0tBu]-Ser-Ala-Glu[0tBu]-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu[0tBu]-Phe-0tBu. [Z-28-39-0tBu].

27,3 S Z-Glu[0tBu]-0H:n DCHA-suolaa suspensoidaan 270 ml:aan kuivaa dimetyyliformamidia, lisätään 5,6 ml [33,2 mmoolia] N-metyylimorfoliinia, reaktioseos jäähdytetään -10°C:een ja tässä lämpötilassa lisätään tipoittain ja sekoittaen 6,95 ml [52,55 mmoolia] kloorihiilihappoisobutyyliesterlä.

8 minuutin kuluttua jäähdytetään -20°C:een. Tässä lämpötilassa lisätään *20°C:een esi jäähdytetty liuos, jossa on 69,9 g [43,8 mmoolia] H-29-39-OtBu:a 27Ο ml:eaa dimetyyliformamidia. Lämpötila pidetään 15 min. ajan -10°C:s8a, 1 tunnin ajan 0°C:ssa ja 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen suodatetaan erottunut suola, suodos haihdutetaan kuiviin, jäännös saatetaan n-sitruunahapon avulla suodattimelle ja pestään neutralisaatioom saakka. Saalis: 70,15 g [86,2 #] Z-28-39-0tBu. Sulamispiste [hajoten]: 205°C; R^t 0,9.

Vaihe 8: Z-Ala-Glu[0tBu]-Asp[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser-Ala-Glu[0tBu]-Ala-Phe-Pro-1eu-Glu[0tBu]-Phe-OtBu. [Z-27-39**OtBu].

89,0 g [37,2 mmoolia] Z-29-39-OtBu:a liuotetaan 1800 ml:aan kuivaa dimetyyliformamidia ja hydrataan palladium-aktiivihiilen läsnäollessa. Reaktion päätyttyä katalysaattori suodatetaan ja suodos tiivistetään 300 ml:aan. Sekoittaen lisätään 20,2 g [42,85 mmoolia] Z-Ala-OPCP:tä, sen jälkeen annoksittain 4,76 ml [42,85 mmoolia] N-metyylimorfoliinia. Seuraavana päivänä kaadetaan sitkeä hartsimainen seos sekoittaen ja jäähdyttäen 4 litraan 5 $>1 sta NaHCO,-liuosta. Erottunut aine suodatetaan ja pestään kunnes se on 3 neutraalia. Raaka tuote liuotetaan kuumana 1900 ml:aan metanolia ja seostetaan 1100 ml:11a vettä. Seuraavana päivänä suodatetaan, tuote pestään ja kuivataan. Saalis: 59,2 g [82,6 ^] Z-27-39-OtBu. Sulamispiste: 210°Cj R^: 0,7· £6830 20

Vaihe 9» H-Ala-Glu[OtBu]-Aep[OtBu]-Glu[OtBu]-Ser-Ala-Glu[OtBu]-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu[OtBu]-Phe-OtBu. [H-27-39-0tBu.

8,5 g [4,41 mmoolia] Z-27-39-OtBu»a liuotetaan 850 mitään kuivaa dime-tyyliformamidia ja hydrataan palladium-aktiivihiilen läsnäollessa. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori, liuos haihdutetaan, käsitellään eetterillä ja lopuksi suodatetaan. Saalis» 7,65 8 [96,9 #] H-27-39-OtBu. Sulamispiste [hajoten]» 197°C; R^t 0,3·

Vaihe 10* Z-Asn-Gly-Ala-Glu[0tBu]-Asp[OtBu]-Glu[OtBu]-Ser-Ala-Glu[OtBu] -Ala-Phe-Pro-Leu-Glu[OtBu]-Phe-OtBu. [Z-25-39-OtBu].

3,58 g [2,10 mmoolia] H-27-39-°tBufra ja 0,65 g [2,0 mmoolia] Z-Asn-Gly-OHita [esimerkki l] liuotetaan 30 mitään kuivaa dimetyyliformamidia. Liuos jäähdytetään 0°Cseen ja lisätään 1,8 g [2,4 mmoolia] BCC-PPPOH-kompleksia.

Sen jälkeen kun on sekoitettu 4 tuntia suodatetaan reaktioseos 300 mltssa eetteriä, erottunut sakka suodatetaan pois ja pestään eetterillä. Saalis» 3*7 8 [88 #] Z-25-39-OtBu. Sulamispiste [hajoten]» 194°C| R^?» 0,3.

Vaihe 11» H-Asn-Gly-Ala-Glu[OtBu]-Asp[OtBu]-Glu[OtBu]-Ser-Ala-Glu[OtBu]-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu[OtBu]-Phe-OtBu.HCl [H-25-39-OtBu.HCl].

3,92 g [1,87 mmoolia] Z-25-39-OtBu»a liuotetaan 400 mitään 80 ^»sta etikkahappoa ja hydrataan palladium-aktiivihiilen läsnäollessa. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori ja suodos haihdutetaan kuiviin. Jäännös liuotetaan kuivaan dimetyyliformamidiin ja liuokseen lisätään pyridiiniä, joka sisältää 6-8 ekvivalenttia suolahappoa. Liuottimen tislaamisen jälkeen saatu öljy saatetaan veden avulla suodattimelle, sen jälkeen pestään vedellä ja lopuksi etyyliasetaatilla. Saalis» 3*22 g [86,1 $] H-25-39-OtBu.HCl. Sulamispiste [hajoten]» 187°C; R^» 0,31·

Vaihe 12» Z-Lye[B0C]-Lys[B0C]-Arg[N02]-Arg[N02]-Pro-Val-Lye[B0C]-Val-Tyr[tBu]-Pro-A sn-Gly-A1a-Glu[0 tBu]-Asp[0tBu]-Glu[0tBu]-Ser-Ala-Glu[0 tBu]-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu[0 tBu]-Phe-0tBu.[Z-l5-39-0 tBu].

3,0 g [l,5 mmoolia] H-25-39~OtBu.HCl*ää ja 3*1 8 [1*65 mmoolia] Z-Lys [B0C]-Lye[B0C]-Arg[N02]-Arg[N02]-Pro-Val-Lys[B0C]-Val-Tyr[tBu]-Pro-0H, [kts. itävaltalainen patentti-ilmoitus nr. 295 051] liuotetaan 20 ml»aan kuivaa dimetyyliformamidia, liuos jäähdytetään 0°C»een ja lisätään 0,166 ml [l,5 mmoolia] N-metyylimorfoliinia, sitten 1,4 8 BCC-PPPOH-kompleksia. Reaktioseos-ta sekoitetaan 24 tuntia huoneenlämpötilassa, sen jälkeen suodatetaan 400 ml» ssa eetteriä. Erottunut sakka suodatetaan pois, suspensoidaan asetoniin, sekoitetaan ja saatetaan suodattimelle. Saalis» 5,15 8 [90 ^] Z-15-39-OtBu. Sulamispiste [hajoten]» 220°C; R^t 0,2; R^» 0,65.

21 £*ύ θ 3 O

Vaihe 13* H-Lys[B0C]-Lys[B0C]-Arg-Arg-Pro-Val-Lys[BOC]-Val-Tyr[tBu]-Pro-A sn-Gly-Ala-Glu[O tBu]-A ep[OtBu]-Glu[O tBu]-S er-Ala-Glu[O tBu]-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu[OtBu]-Phe-OtBu.3HC1 [H-15-39-OTBu.3HC1].

5,0 g [1*31 mmoolia] Z-15-39-OtBu:a liuotetaan 100 ml:aan 80 ^:sta etikkahappoa* lisätään 3 8 aktivoitua sinkkipölyä ja reaktioseosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa. Pelkistämistä kontrolloidaan ohutlevykromatografian avulla. Pelkistämisen päätyttyä suodatetaan suspensio, suodos haihdutetaan ja jäännöstä käsitellään vedellä, sen jälkeen suodatetaan. Tuote liuotetaan 300 mlJaan 80 sta etikkahappoa ja hydrataan palladium-aktiivihiilen läsnäollessa. Reaktion päätyttyä suodatetaan katalysaattori pois, liuos haihdutetaan kuiviin, jäännöstä käsitellään eetterillä ja suodatetaan. Tuote liuotetaan 40 mlJaan pyridiiniä ja jäähdyttäen lisätään 10 ml pyridiiniä* joka sisältää 1,5 ml konsentroitua suolahappoa. Liuoksen haihduttamisella saatua jäännöstä käsitellään vedellä* suodatetaan ja pestään vedellä. Saalis: 4*0 g [85 #] H-15-39-OtBu.3HCl. Sulamispiste [hajoten]: 208°C} rJ: 0,35.

Vaihe 14: H-Ser-Tyr-Ser-Het-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lye-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala—Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-OH. [H-1-39-OH].

3,6 g [1,0 mmoolia] H-15-39-OtBu.3HCl:ää Ja 2,0 g [l mmoolia] BOC-Ser-Tyr—Ser—Met—Glu[OtBu]—His—Phe—Arg—Trp—Gly-Lys[BOC]—Pro—Vai—Gly—0H.HC1:ää [kate. itävaltalainen patentti-ilmoitus nr. 295 05l] liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia, liuos jäähdytetään 0°C:een ja lisätään 0,11 ml [l mmoolia] N-metyylimorfoliinia sekä 0,95 g DCC-PFPOH-komplekeia. Reaktioseosta sekoitetaan 24 tuntia huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen suodatetaan 200 ml:sea eetteriä. Erottunut tuote [5,6 g; rJ: 0,55] suodatetaan ja pestään ensiksi eetterillä, sitten vedellä. Yksi gramma näin saatua tuotetta liuotetaan seokseen, joka koostuu 20 ml:sta trifluorietikkahappoa ja 1 ml:sta merkaptoeta-nolia. Liuoksen annetaan seistä 1 tumiin ajan huoneenlämpötilassa ja sitten haihdutetaan vakuumissa. Jäännös liuotetaan 20 ml:aan vettä ja haihdutetaan jälleen vakuumissa. Haihdutusjäännös liuotetaan 10 ml:aan vettä ja vaihdetaan asetaattisyklisen ioninvaihtohartsin Amberlite IRA 410:n avulla trifluo— riaeetaatti-ionituasetaatti-ioneihin. Liuos pakastekuivataan ja tuote puhdistetaan ioninvaihtaja CM-32:lla täytetyllä pylväällä puskuriainegradienttien ollessa 0,13 moolia [pH 6,6] - 0,25 moolia [pH 7]. Fraktiot, jotka sisältävät haluttua ainetta, yhdistetään ja pakastekuivataam Saadaan 0,6 g [60 #] H-I-39-OH:ta. R*4: 0,25.

Aminohappoanalyyei:

Asp l,9[2]i Ser 2,7[3]f Glu 4t7[5]i Pro 3,8[4]i Gly 3»0[3]l Ala 3»0[3]| I*eu l,0[l]? Vai 2,9[3]i Met 0,95[l]f l,9[2]l Phe 3»0[3]? His 0,95[l]f Lys 5,8[4]{ Arg 2,8[3]·