FI119373B - Luun proteiineja - Google Patents

Description

119373

Luun proteiineja Keksinnön alue 5 Tämä keksintö liittyy luun muodostusta indusoiviin proteiineihin, joita kutsutaan luun morfogeneettisiksi proteiineiksi (BMP), varsinkin BMP-4-proteiiniin; nukleiinihappomolekyyleihin, jotka koodaavat mainittuja proteiineja, vektoreihin, jotka sisältävät mainittuja nukleiinihappomolekyylejä sekä isäntäsoluihin, jotka ekspressoivat mainittua proteiinia. Tämä keksintö liittyy myös näiden luun 10 morfogeneettisten proteiinien käyttöön hoidettaessa häiriöitä, kuten häiriöitä, jotka liittyvät luun ja ruston muodostukseen. Tämä keksintö lisäksi liittyy osteogeenisiin välineisiin ja farmaseuttisiin koostumuksiin, jotka sisältävät kyseisiä proteiineja.

Keksinnön tausta 15

Lancroix havaitsi vuonna 1945 luun muodostukseen liittyvän ilmiön, kun hän osoitti, että hapan alkoholi-luuekstrakti indusoi heterotrooppisen luun muodostuksen ektooppisissa paikoissa. Kaksikymmentä vuotta myöhemmin Urist työtovereineen dekalsifioi luumatriksin ja kun tätä implantoitiin lihakseen, hän 20 huomasi implantointikohtaan muodostuvan uutta rustoa ja luuta. Nämä havainnot johtivat luuta indusoivan aineen, joka nimettiin BMP:ksi, eristämiseen ja : V: puhdistamiseen eri eläinlajien luumatriksista ja vuosia myöhemmin näiden uusien • · : .*. proteiinien cDNA:n kloonaukseen ja karakterisointiin. BMP:n biologista aktiivisuutta · on määritetty bioanalyysillä, joissa BMP implantoidaan rotan tai hiiren • · · 25 lihastaskuun, tai nisäkässoluviljelmissä, joissa mitataan alkaalista fosfataasia :*Y (ALP).

• · * • · · · • · · • · *···* Aikaisemmat tutkimukset vuodesta 1965 alkaen ovat osoittaneet, että BMP:t kuuluvat TGF-p-superperheeseen, ja kuten muillakin tämän geeniperheen :.:Y 30 jäsenillä, niillä on moninaisia vaikutuksia solun liikkuvuuteen, kasvuun ja erilaistumiseen, varsinkin luun muodostuksen ja kudosten korjausprosessien : !·. aikana, mutta myös embryogeneesiin ja syöpiin. Ne ovat molekyylikooltaan pieniä, • · · "·/ hydrofobisia glykoproteiineja, jotka liukenevat kaotrooppisiin aineisiin, kuten • · ureaan ja guanidiinihydrokloridiin mutta ovat resistantteja useiden proteaasien, • · : '·· 35 kuten kollagenaasien, vaikutukselle.

• · BMP:t tuotetaan suurina prekursorimolekyyleinä, jotka prosessoidaan proteolyyttisesti kypsiksi peptideiksi translaation jälkeen. Kuten muutkin TGF-β- 2 119373 superperheen jäsenet, BMP:t sisältävät seitsemän kysteiinitähteen jonon kypsässä C-terminaalisessa osassa. Kypsissä BMP-monomeereissä näiden kysteiinien välissä on kolme disulfidisidosta ja yksi disulfidisidos, joka yhdistää kaksi monomeeriä, jolloin syntyy biologisesti aktiivinen dimeeri.

5 BMP:n vaikutus välittyy kohdesolujen solukalvolla sijaitsevien spesifisten reseptoreiden kautta. BMP-reseptorit ovat seriini-treoniini-kinaaseja, jotka ovat samankaltaisia TGF-p-reseptoreiden kanssa ja ne jaetaan kahteen alaryhmään: tyypin I ja tyypin II reseptoreihin. BMP:t kykenevät sitoutumaan tiukasti ainoastaan 10 sellaiseen reseptoriin, joka muodostaa heterotetrameerisen kompleksin. Tällaisen kompleksin muodostuminen on edellytys sille, että tapahtuu BMP:n signaalin siirtyminen (signal transduction). Kohdesolun sisällä BMP-signaalit siirretään tumaan käyttäen spesifisiä signaalin siirtoon erikoistuneita molekyylejä nimeltään Smadit, jotka kykenevät myös vaimentamaan BMP-signaaleja.

15 Tähän mennessä on karakterisoitu 16 erilaista BMP-molekyyliä, joista seitsemän (BMP:t 2-7 ja 9) on osoitettu kykenevän indusoimaan luun muodostuksen kun ne on implantoitu ektooppisiin kohtiin. Kypsän osan aminohapposekvenssin perusteella BMP:t jaetaan kahteen alaryhmään. BMP:t 2 ja 4 ovat 86 % identtisiä 20 keskenään ja BMP:t 5, 6 ja 7 ovat 78 % identtisiä. Näiden kahden alaryhmän välinen identtisyys on vain noin 56 %. BMP-3:n aminohapposekvenssi on noin 45 % samankaltainen kuin BMP-2:n ja BMP-4:n sekvenssi ja BMP-9 on 50-55 % : :*· identtinen BMP:iden 2, 4, 5, 6 ja 7:n kanssa. Johtuen suuresta homologiasta ja • · · · vähäisestä eroavuudesta molekyylien koossa, BMP:iden erottaminen toisistaan, : ,·.* 25 puhdistaminen ja identifioiminen proteiinitasolla on melko vaikeaa, aikaa vievää ja • tl "V kallista. Tästä syystä nykyään useimmat BMP:t tuotetaan käyttäen hyväksi * · · \\V molekyylibiologian menetelmiä. Erilaisia rekombinanttiproteiinitekniikoita on '*··’ kokeiltu ja sekä eukaryootti- että prokaryoottisysteemejä on käytetty.

30 Suurin osa tutkimuksesta on kohdistunut ihmisen rekombinantti-BMP:hen, mutta ·*· mielenkiintoisen tutkimusalueen muodostaa myös Cervidae-heimo, koska niissä : tapahtuu tehokas luun induktio sarvissa. Sarvet ovat luuta sisältäviä kallon .···.' rakennelmia, jotka ovat tyypillisiä Ce/v/dae-heimolle, ja jotka eroavat Bovidaen • · sarvista kasvutapansa vuoksi. Sarvet kasvavat sarven kärjestä ja urokset : *·· 35 pudottavat ne kerran vuodessa. On väitetty, että sarvet ovat nisäkkäiden keskuudessa nopeimmin kasvavat rakennelmat ja näiden rakenteiden tiedetään olevan ainoita, jotka uusiutuvat täydellisesti joka vuosi. Sarvien muodostuessa tapahtuu tietynlainen endokondraalinen ossifikaatio, jossa prosessi etenee 3 119373 runsaan verisuoniston omaavan ruston kautta, joka kalsifioituessaan muodostuu lopulta luuksi. Sarvet muodostavat mielenkiintoisen mallin mineralisoituvan kudoksen regeneraatiosta täysikasvuisessa eläimessä ja luun uusiutuminen jatkuu siihen saakka kunnes sarvet pudotetaan. Vaikka sarvien hämmästyttävän 5 kasvunopeuden perimmäistä syytä ei ole selvitetty, sarvissa tiedetään olevan useita BMP-proteiineja. Hirvieläimen sarvien on osoitettu tuottavan BMP-2:ta ja BMP-4:ää (Feng et ai. 1997 Biochim Biophys Acta 1350:47-52; Feng et ai. 1995 Biochim Biophys Acta 1263:163-168). Lisäksi poron sarvissa ekspressoidaan BMP-3b-proteiinia (Kapanen et ai. 2002 J Biomed Mat Res 59:78-83). Kuitenkin, 10 on myös mahdollista, että sarvissa on yksi tai useampi tuntematon tekijä/tekijöitä, joka saa aikaan sarven nopean kasvun.

Osteoinduktiivisen ominaisuutensa vuoksi sekä BMP:t, jotka on uutettu demineralisoidusta luumatriksista että BMP:t, jotka on tuotettu käyttäen 15 rekombinanttitekniikkaa, ovat hyvin mielenkiintoisia ja erittäin potentiaalisia vaihtoehtoja luusiirrännäisille. Erilaisia BMP-proteiineja on käytetty useissa kokeellisissa ja kliinisissä tutkimuksissa.

Luun morfogeneettinen proteiini 4 on eristetty eri lähteistä käsittäen eräät 20 nisäkäslajit, kuten ihminen, hiiri, rotta, kaniini ja koira. Kuten BMP-2, se on myös eristetty Cerv/dae-perheeseen kuuluvasta Teksasin kuusipeuran sarvesta (Feng et ai. 1997; Feng et ai. 1995). Kuitenkaan hirvieläimen BMP-4:n toimintaa ja • · l vaikutuksia ei ole osoitettu, koska sitä ei ole tuotettu millään ekspressiosysteemillä.

·♦· · • · # · · • ♦· 25 Tähän mennessä BMP-3b on ainoa BMP, joka on karakterisoitu poron j*V sarvikudoksesta (Kapanen et ai. 2002).

• · · ·♦· • · *···* Useat in vitro -tutkimukset ovat osoittaneet, että BMP-4:n signalointi on tarpeen kondrogeneesissä muutettaessa rustosolujen esiasteet rustosoluiksi. Sen 30 ekspressio kohoaa murtuman vaikutuksesta ja kuten BMP-3, -7, ja -8, sitä ekspressoidaan rajoitettuna aikana päivästä 14 alkaen päivään 21 saakka. Sitä : !·. ekspressoidaan kadusta muodostavassa kudoksessa ennen kalluksen • · · V/ muodostumista. Se toimii myös kemiallisena houkutinproteiinina ihmisen V primääreille mesenkymaalisille kantasoluille. Lisäksi BMP-4:llä on osoitettu olevan : *·· 35 tärkeä rooli luun muodostuksen indusoinnissa sekä in vivo että in vitro ja, kuten "**: BMP-2, sen vaikutusta embryogeneesiin ei voi korvata millään muulla BMP:llä.

Vaikka BMP-4 tehtävät ja aktiivisuus ovat olleet tasaisen tutkimuksen kohteena jo yli kymmenen vuotta ja vaikka ihmisen BMP-4 on tuotettu rekombinanttiproteiinina, 119373 4 ei kukaan, ainakaan vielä tähän mennessä, ole esittänyt tietoja sarvi kudoksesta kloonatun BMP-4:n biologisesta aktiivisuudesta, joka on peräisin Ce/v/afae-perheen jäsenestä.

5 US 6245889 esittää puhdistetut BMP-2- ja BMP-4-proteiinit ja niiden tuottomenetelmät. On myös esitetty farmaseuttinen koostumus, joka sisältää BMP-4:ää. Kuten yleisesti alalla tunnetaan, näitä proteiineja ja koostumuksia voidaan käyttää luu- ja rustodefektien hoidossa sekä haavojen parantamisessa ja samankaltaisten muiden kudosvaurioiden korjauksessa. Lisäksi, edellä esitetty 10 farmaseuttinen koostumus voi sisältää matriksin, joka kykenee luovuttamaan mainitun BMP-proteiinin luun ja/tai ruston vauriokohdassa ja tarjoamaan rakenteen kehittyvälle luulle ja rustolle ja joka myös kyetään optimaalisesti resorboimaan kehoon. Tällaiset matriksit voidaan muodostaa materiaaleista, jotka ovat tällä hetkellä jo käytössä muissa lääketieteellisissä implanttisovelluksissa.

15 US 5399677 esittää DNA molekyylejä, jotka koodaavat luun morfogeneettisten proteiinien mutanttimuotoja. BMP:n mutanttimuotoja voidaan tuottaa bakteereissa ja laskostaa biologisesti aktiiviseen muotoon joko BMP:n homodimeeriksi tai heterodimeeriksi. Menetelmä, jolla kyseinen mutantti BMP tehdään, on myös 20 esitetty. Kyseiset mutanttimuodot ovat hyödyllisiä, koska bakteeri-isännässä tuotettuna ne ovat laskostuneet virheettömästi.

• · • · · • · · φ · ; WO 98/51354 esittää osteogeenisiä välineitä ja niiden käyttömenetelmiä luu- ja • · · · : rustovikojen korjaamiseksi. Menetelmä uuden luun kasvattamiseksi 25 vaurioituneeseen luun kohtaan nisäkkäällä sisältää vaiheen, jossa • · · |‘V kalsiumfosfaattimatriksi, joka sisältää ainakin yhtä osteogeenistä proteiinia, implantoidaan vauriokohtaan. Kyseiset osteogeeniset proteiinit käsittävät useita · *·*·* morfogeenejä, kuten luun morfogeneettisiä proteiineja.

30 EP 1131087 esittää morfogeneettisten proteiinien, kuten BMP:n, lisäkäytön. On * · · ·*„.·* osoitettu, että syöpäsolujen joutuminen kosketuksiin morfogeenien kanssa inhiboi : .·. syöpäsolujen kasvua ja saa aikaan niiden erilaistumisen pois syöpäsolun .’••V fenotyypistä. Morfogeenien käyttö voi vaikuttaa syöpäsolujen solukohtaloon ja • · osaltaan lieventää syövän oireita. BMP-4 kuuluu esitettyihin edullisiin • · : *·· 35 morfogeeneihin.

• ·

Vaikka joidenkin BMP-proteiinien käyttösovelluksia luun ja ruston muodostuksen indusoijina, samoin kuin syövän oireiden lievittämisessä, tunnetaan, tarvetta on 119373 5 kuitenkin saada vieläkin parempia menetelmiä näiden proteiinien eristämiseksi ja varsinkin parempien morfogeneettisten proteiinien saamiseksi, esimerkiksi sellaisten, jotka toimivat tehokkaammin luun indusoijina tai ovat liukoisempia kuin aikaisemmin. Sellaisilla proteiineilla olisi käyttöä paremmissa terapeuttisissa 5 menetelmissä ja sovelluksissa.

Keksinnön yhteenveto

Yllättäen tämän keksinnön uudella BMP-4-proteiinilla, joka on eristetty porosta, ja 10 jolla on suuri homologia sekvenssin suhteen verrattuna muihin jo tunnettuihin luun morfogeneettisiin proteiineihin, on erittäin hyödyllisiä ominaisuuksia, jotka liittyvät luun ja ruston muodostukseen. Kyseiset ominaisuudet ovat huomattavasti parempia kuin jo tunnetuilla BMP-proteiineilla. Kyseiset, tämän keksinnön mukaiset luun morfogeneettiset proteiinit ja niiden homologit ovat hyödyllisiä luun ja ruston 15 indusoijina useanlaisissa sovelluksissa, kuten terapeuttisissa sovelluksissa.

Tämän keksinnön yksi näkökulma liittyy eristettyyn morfogeneettiseen proteiiniin tai sen homologiin, analogiin, johdannaiseen tai fragmentteihin, jotka sisältävät aminohapposekvenssin SEQ ID NO: 1:n oleelliset aminohapot.

20

Toinen tämän keksinnön näkökulma liittyy eristettyyn DNA-molekyyliin, joka koodaa mainittua morfogeneettistä proteiinia.

• · • · • · · ··* * ;\j Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökulma liittyy nukleiinihappovektoriin, joka :*.·! 25 sisältää mainitun eristetyn DNA-molekyylin.

• · · ··# · • · • * * “Y Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökulma liittyy rekombinantti-isäntäsoluun, • · *···* joka sisältää mainitun DNA-molekyylin tai edellä mainitun nukleiinihappovektorin.

:.:V 30 Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökulma liittyy luun morfogeneettiseen proteiiniin, jota on tuotettu kasvattamalla kyseistä isäntäsolua siten, että se : .**. ekspressoi mainittua luun morfogeneettistä proteiinia ja mainittu luun • · · morfogeneettinen proteiini on otettu talteen mainitusta isäntäsolusta.

• · * · · ·· : '·· 35 Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy rekombinantti-isäntäsoluun, *·**: joka ekspressoi mainittua luun morfogeneettistä proteiinia.

119373 6

Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy farmaseuttiseen koostumukseen, joka sisältää mainitun luun morfogeneettisen proteiinin.

Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy mainittuun, eristettyyn luun 5 morfogeneettiseen proteiiniin käytettäväksi lääkeaineena.

Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy mainitun, eristetyn luun morfogeneettisen proteiinin käyttöön valmistettaessa lääkeainetta, jota voidaan käyttää luuhun ja rustoon liittyviin häiriöihin, joissa regeneraatio, vaurion 10 korjaaminen tai kasvu on toivottavaa, tai muihin tauteihin, kuten syöpiin.

Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy osteogeeniseen välineeseen, jolla hoidetaan mainittuja häiriöitä, joka väline sisältää kyseisen luun morfogeneettisen proteiinin.

15

Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy menetelmään, jolla ruston ja/tai luun muodostusta indusoidaan käsittelemällä mainittua rustoa ja/tai luuta mainitulla eristetyllä luun morfogeneettisellä proteiinilla.

20 Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy menetelmään, jolla hoidetaan kyseisiä luuhun ja rustoon liittyviä häiriöitä, joissa regeneraatio, vaurion korjaaminen tai kasvu on toivottavaa, tai muita sairauksia, kuten syöpiä, antamalla • · : mainittua eristettyä luun morfogeneettistä proteiinia potilaalle, joka kärsii mainitusta .·,* · häiriöstä.

• · · 25 • · * " \ * Kuvien lyhyt yhteenveto • · · • · · *** · ·***# *·*·* Kuva 1 esittää plasmideja, jotka sisältävät rdBMP-4-insertit PCR-vektorissa pGEM-T® (Promega).

30 s.y Kuva 2 esittää plasmideja, jotka sisältävät rdBMP-4-insertit ekspressiovektorissa : pTrcHis2A (Invitrogen).

• · ·

Ml I

• l* • ® *:*’ Kuva 3 esittää plasmideja, jotka sisältävät rdBMP-4-insertit ekspressiovektorissa :”··· 35 pET-22b(+) (Novagen).

♦ • ·

Kuva 4 esittää plasmideja, jotka sisältävät rdBMP-4-insertin ekspressiovektorissa plVEX2.4c (Roche).

119373 7

Kuva 5 esittää pTrcrd4/116-ekspressioplasmidissa tuotetun poron BMP-4-proteiinin kypsän osan aminohappo- ja nukleotidisekvenssit. Kypsä osa poron BMP-4-proteiinista on reunustettu. Kysteiinit, jotka ovat tyypillisiä TGF-β-superperheelle, on merkitty lihavoituina.

5

Kuva 6 esittää pETrd4/116-ekspressioplasmidissa tuotetun poron BMP-4-proteiinin kypsän osan aminohappo- ja nukleotidisekvenssit. Kypsä osa poron BMP-4-proteiinista on reunustettu. Kysteiinit, jotka ovat tyypillisiä TGF-p-superperheelle, on merkitty lihavoituina.

10

Kuva 7 esittää plVEXrd4/116-ekspressioplasmidissa tuotetun poron BMP-4-rekombinanttiproteiinin kypsän osan aminohappo ja nukleotidisekvenssit. Kypsä osa poron BMP-4-proteiinista on reunustettu. Kysteiinit, jotka ovat tyypillisiä TGF-β-superperheelle, on merkitty lihavoituina.

15

Kuva 8 esittää Coomassie-värjättyä SDS-PAGE:a, jossa on HiTrap-pylväästä eluoidut fraktiot (esimerkki 3C). Vyöhykkeet edustavat 1) lähtömateriaali; 2) pylvään läpi kulkenut materiaali; 3) ensimmäinen pesu; 4) toinen pesu; 5) standardi; 6) pH-gradienttieluutio, pH 6,2; 7) pH-gradienttieluutio pH 5,3; 8) pH-20 gradienttieluutio, pH 4,0.

:Vi Kuva 9 esittää röntgenkuvat hiiren takajalan lihaksista. A) jalkaan istutettu • implantti, joka sisältää ihmisen BMP-4-proteiinia ja B) jalkaan istutettu implantti,

*·· I

;*.j joka sisältää tämän keksinnön BMP-4-proteiinia.

·* ·* 25 « * · • « · "V Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus • · · ··· ·»·

• I

***** Nisäkkäiden aikaisemmin tunnettujen BMP-4-proteiinien kypsien osien keskinäinen homologia on erittäin korkea ollen 100 % hiiren ja rotan välillä. Kun näitä kahta 30 kypsää osaa verrataan Teksasin kuusipeuran ja ihmisen vastaavien kypsien osien ··· kanssa, homologia on 99 % (taulukko 1). Poron BMP-4:n kypsän osan kloonaus ja : .*. karakterisointi osoittivat, että aminohappotasolla korkein homologia on Teksasin .···] kuusipeuran kanssa, 99 %, ja homologia on 98 % verrattuna hiiren, rotan ihmisen • ♦ I” ja koiran BMP-4:n kanssa. Aminohappotasolla matalin homologia poron BMP-4:llä : *** 35 on kaniinin vastaavan proteiinin kanssa (96 %). Nukleiinihappotasolla homologia poron ja Teksasin kuusipeuran BMP-4:n välillä tavoittaa 99 % ja poron ja ihmisen välillä 93 %. Matalin homologia nukleiinihappotasolla, 88 %, saatiin verrattaessa 119373 8 poron BMP-4 rotan vastaavaan. Yleisesti ottaen BMP-4:llä on homologiaa myös muiden BMP-tyyppien kanssa, kuten esimerkiksi BMP-2:n kanssa.

Alkuperä Poro Peura Ihminen Hiiri Rotta Kaniini Koira _ nt ah nt ah nt ah nt ah nt ah nt ah nt ah

Poro 100 100 99 99 93 98 89 98 88 98 93 96 94 98

Peura 99 99 100 100 93 99 89 99 89 99 94 97 95 99

Ihminen 93 98 93 99 100 100 91 99 89 99 94 94 95 99

Hiiri__89 98 89 99 91 99 100 100 95 100 89 96 89 98

Rotta 88 98 89 99 89 99 95 100 100 100 88 96 89 98

Kaniini 93 96 94 97 94 94 89 96 88 96 100 100 94 96

Koira__94 98 95 99 95 99 89 98 89 98 94 96 100 100 5 Taulukko 1 Eri nisäkkäiden BMP-4:n kypsien osien homologia nukleotidi- ja aminohappotasolla esitettynä prosentteina (%) (nt = nukleotidit; ah = aminohapot).

Alla oleva linjaus esittää ihmisen ja poron BMP-4 proteiinien kypsän osan aminohapposekvenssit (vertailu tehty käyttäen ClustalX 1.8 -ohjelmaa (Thompson, 10 J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) Nucleic Acids Research, 22: 4673- 4680), rdBMP-4 = poron BMP-4, hBMP-4 = ihmisen BMP-4, tähti osoittaa identtiset aminohapot). Nämä aminohapposekvenssit eroavat vain kahden aminohapon • · · ·1..1. suhteen: aminohappo 6 on ihmisellä seriini ja porolla proliini (Ser6->Pro6), ja T ! aminohappo 21 on ihmisellä leusiini ja porolla proliini (Leu21->Pro21). Yllättäen / / 15 vain kahden aminohapon ero johtaa suuriin muutoksiin näiden kahden BMP-4- • · · proteiinien toiminnassa ja tehokkuudessa. Koska proliini on erityinen aminohappo J·: : sen suhteen, että sillä on yleensä suuri vaikutus proteiinien rakenteeseen ja ·«· laskostumiseen, voidaan helposti nähdä, että tämän keksinnön hyödylliset vaikutukset liittyvät näihin kahteen aminohappoon. Varsinkin proliini 21, joka 20 korvaa erittäin konservoituneen leusiinin, saattaa näytellä tärkeää osaa tässä :1'1· keksinnössä. Poron BMP-4:n lähin vastine on ihmisen BMP-4, jonka aktiivisuus on ··· .määritetty.

• · · ··· · »·· • · • · ··· * ·· • » • · · · 119373 9

rdBMP-4 S PKHHPQRARKKNKNCRRHS PYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAFYCHGDC PFPLADHLNST

hBMP-4 SPKHHSQRARKKNKNCRRHSLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAFYCHGDCPFPLADHLNST

***** ^ ************** ***************************************

5 rdBMP-4 NHAIVQTLVNSVNS SIPKACCVPTELSAISMLYLDEYDKWLKNYQEMWEGCGCR

hBMP - 4 NHAIVQTLVNSVNS SI PKACCVPTELSAI SMLYLDEYDKWLKNYQEMWEGCGCR

******* + *****,*********νΙί************^******^**********·**·*· 10 "Keksinnön BMP-4-proteiini” tai "keksinnön luun morfogeneettinen proteiini” viittaavat proteiiniin, jolla on luun morfogeneettistä aktiivisuutta (tai morfogeenistä, joita molempia sanoja voidaan käyttää synonyymeinä), kuten porosta eristetyllä BMP-4-proteiinilla, joka on kuvattu tässä asiakirjassa (SEQ ID NO:1 oheisessa sekvenssilistauksessa tai rdBMP-4 yllä olevassa linjauksessa), ja sisältää sen 15 homologit, analogit, johdannaiset ja fragmentit. Sellaiset homologit tai johdannaiset sisältävät kyseessä olevan proteiinin toiminnalliset johdannaiset, kuten proteiinit, jotka ovat peräisin alkuperäisestä BMP-4-proteiinista tai minkä tahansa muun lajin mistä tahansa BMP:stä. Johdannaiset voivat erota pituutensa suhteen ja ne voivat sisältää aminohappolisäyksiä, poistoja ja substituutioita, kuten alan ammattilaiset 20 hyvin tietävät. Tämän keksinnön luun morfogeneettisen proteiinin tunnusomainen piirre on proteiinin kypsän osan kaksi keskeistä aminohappoa, aminohapot 6 ja/tai 21, jotka porolla ovat molemmat proliineja, kuten on esitetty edellä olevassa : .·. linjauksissa. Edullisesti alueet, joissa nämä aminohapot sijaitsevat, ovat .'·] | konservoituneita tämän keksinnön BMP-proteiinissa.

• ·* 25 • · ·

Toisaalta, lisäykset, poistot ja substituutiot, jotka sijaitsevat kaukana mainitusta • · « ·*;;/ tunnusomaisesta alueesta, eivät todennäköisesti aiheuta oleellista muutosta • · *···* keksinnön BMP-proteiinin toimintaan, tehoon tai laskostumiseen. Esimerkiksi homologit, joissa on poistoja, kuten muutaman aminohapon poisto, edullisesti 1-10 :..v 30 aminohappoa, edullisemmin 1-5 aminohappoa, edullisimmin 1-3 aminohappoa, joko karboksyyli- tai aminoterminaalisessa päässä, jolloin polypeptidi on kooltaan : I*. lyhyempi, ovat tämän keksinnön suojapiirissä kunhan kyseiset poistot eivät vaikuta • · · keksinnön BMP-proteiinin tunnusomaisiin aminohappoihin. On edullista, että 7 kyseessä olevilla homologeilla on alkuperäisen poron BMP-4-proteiinin hyödyllisiä ·· : *·· 35 ominaisuuksia, jotka liittyvät mainittuihin tunnusomaisiin aminohappoihin Pro6 ja/tai *:**: Pro21 ja/tai niiden ympärillä olevaan alueeseen. Mainituissa homologeissa voi olla aminohapposubstituutioita, joilla ei ole olennaisesti vaikutusta mainitun proteiinin toimintaan ja tehoon. Esimerkiksi aminohappo, joka ei sijaitse aktiivisessa 119373 10 kohdassa tai sen läheisyydessä, voidaan korvata toisella, jolla on samankaltainen rakenne ja/tai kemialliset ominaisuudet (esimerkiksi hydrofobisuus tai hydrofiilisyys), tämä tarkoittaa konservatiivista aminohapon vaihtoa, niin kauan kuin kyseessä oleva substituutio ei olennaisesti muuta kypsän proteiinin toimintaa 5 tai laskostumista. Tällaisia substituutioita tunnetaan ja ymmärretään hyvin alalla. Esimerkkinä näistä aminohappojen ominaisuuksista eri ryhmiin jaettuina ovat hydrofobiset (Met, Ala, Vai, Leu, Ile), neutraalit hydrofiiliset (Cys, Ser, Thr), happamat (Asp, Glu), emäksiset (Asn, Gin, His, Lys, Arg), aminohapot, jotka vaikuttavat ketjun orientaatioon (Gly, Pro) ja aromaattiset (Trp, Tyr, Phe) 10 aminohapot. Substituutiot kyseessä olevien ryhmien sisällä eivät todennäköisesti saa aikaan merkittäviä muutoksia polypeptidiketjun tukirangan rakenteeseen (esimerkiksi laskos tai helikaalinen konformaatio), varaukseen tai molekyylin hydrofobisuuteen tai sivuketjujen kokoon.

15 Tämän keksinnön BMP-homologit (esimerkiksi BMP-4) käsittävät esimerkiksi minkä tahansa luun morfogeneettisen proteiinin, joka sisältää tai se on modifioitu siten, että se sisältää ainakin toisen kyseisistä keskeisistä aminohapoista, Pro6 tai Pro21 tai vastaavat aminohapot homologisessa BMP-proteiinissa, jossa numerointi on erilainen. Myös mikä tahansa tällä hetkellä tuntematon BMP-4-proteiini, mistä 20 tahansa lajista, joka on modifioitu, kuten edellä on esitetty, on tämän keksinnön suojapiirissä.

• ·

* * I

• · · • · • ·*. Koska Pro21 korvaa erittäin konservoituneen leusiinin, niin eräässä tämän ·*· · .\j keksinnön toteutusmuodossa kyseinen BMP-proteiini tai sen homologi, 25 johdannainen tai fragmentti sisältää aminohappo proliinin, joka vastaa Pro21 :tä, tai • · ♦ j*Y eräässä toisessa toteutusmuodossa, proliinit, jotka vastaavat molempia proliineja \*Y Pro6 ja Pro21, määriteltynä SEQ ID NO: 1 :n vastaavista paikoista. Kyseiset paikat • · *···' on laskettu SEQ ID NO: 1 :n aminoterminaalisesta päästä, vastaten käytännöllisesti katsoen mitä tahansa kypsää BMP-4-proteiinia. Aminoterminaalisen pään :.:Y 30 sekvenssi voi olla SPKHH (kuten SEQ ID NO: 1:ssä) tai sen homologi, kuten :...· esimerkiksi ihmisellä, porolla tai muulla nisäkkäällä. Kyseiset paikat voidaan ; !·. määrittää linjaamalla kyseisten homologien, johdannaisten tai fragmenttien "Y samankaltaiset sekvenssit SEQ ID NO: 1 :ssa esitetyn sekvenssin kanssa.

* ·

Ml ·· * ’·· 35 Jos kyseisen homologin, johdannaisen tai fragmentin aminohapposekvenssissä on *:*·: yhdenkään aminohapon lisäys tai poisto, joka vaikuttaa numerointiin, tämä pitää ottaa huomioon kun määritellään mainittujen olennaisten proliinien paikkoja, esimerkiksi linjaamalla sekvenssit, kuten on edellä kerrottu, ja sen jälkeen 119373 11 määrittämällä kyseisten oleellisten aminohappojen paikat. Kuitenkin minkä tahansa kyseessä olevista BMP-4-proteiinin homologeista, johdannaisista tai fragmenteista pitäisi olennaisilta osiltaan pitää sisällään sellaisen toiminnan ja tehokkuuden, joka on tuotu esille tässä. Koska kaikki tunnetut BMP-4-proteiinit ovat hyvin 5 konservoituneita (taulukko 1, ainakin 96 % homologia aminohappotasolla nisäkkäillä, tai linjaus edellä), kyseisten olennaisten proliinien paikkamääritys on yksiselitteinen, kuten ihmisen BMP-4:n tapauksessa. Kyseiset paikat voidaan myös helposti määrittää muista BMP-proteiineista (katso edellä olevaa linjausta). Yleensä näiden homologia-aste aminohappotasolla voi olla ainakin 70 %, 10 edullisesti 80 %, edullisemmin 90 % ja edullisimmin 96 %.

Keksinnön eräässä toteutusmuodossa BMP on mikä tahansa BMP tai sen homologi, johdannainen tai fragmentti, joka sisältää BMP-4-perheen kahden proliinin välissä olevin konsensussekvenssin: P-Q-R-A/S-R-K-K/R-N/K-K/R-N/H-C-15 R-R-H-S/A-P. Vielä eräässä toteutusmuodossa keksinnön BMP on mikä tahansa BMP tai sen homologi, johdannainen tai fragmentti, joka sisältää BMP-4:n ja BMP-2:n yhteenlinjatun vastaavan konsensussekvenssin: P-Q-R-A/S-R/K-K/R-K/N/R/L· N/K-K/R/S-N/H/S-C-R/K-R-H-S/A-P. Tämä konsensussekvenssi on määritetty useiden eri lajien BMP-4- ja/tai BMP-2-proteiinien sekvenssien linjauksien 20 perusteella, kuten on esitetty jäljempänä olevassa ClustalX-linjauksessa. Mainittu konsensussekvenssi vastaa aminohappoja 6-21 SEQ ID NO: 1:ssä. Myös muita :Y: konsensussekvenssejä voidaan määritellä, esimerkiksi sellainen, jossa • määritellään alue, joka on toisen proliinin ympärillä (Pro21 SEQ ID N:0 1:ssä), • · · · : kuten eräässä toteutusmuodossa: C-R/K-R-H-S/A-P-Y-V-D-F-S-D tai • · · 25 samankaltaiset sekvenssit, jotka eroavat pituuden suhteen, esimerkiksi 1-5 • · |*Y aminohapolla. Vastaavia konsensussekvenssejä voidaan määrittää alla olevasta • · · linjauksesta tai vastaavista linjauksista, jotka on tehty linjaamalla erilaisia, sukua • · ***** olevia BMP-proteiineja. Linjatut BMP-sekvenssit ovat porosta, ihmisestä, kaniinista, naudasta, koirasta, Teksasin kuusipeurasta (Cervus dama, DAMDA), :.:*.: 30 rotasta, hiirestä, aasialaisesta päästäisestä (suncus murinus), kanasta, • · · afrikkalaisesta kynsisammakosta (Xenopus laevis) ja seeprakalasta (danio rerio).

· • · · * · · ,·'··[ Eräässä toteutusmuodossa BMP on mikä tahansa BMP-2, kuten poron BMP-2, • · *.*’ jota on modifioitu siten, että se sisältää tämän keksinnön tekstissä kuvatut • · : *** 35 aminohapot tai sekvenssin, kuten konsensussekvenssin.

• * 1 1 9373 12

BMP4_REINDEER SPKHHPQRARKKNKNCRRHSPYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAFYCHGDCPFPLADHLN BMP4_HUMAN SPKHHSQRARKKNKNCRRHSLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAFYCHGDCPFPLADHLN

BMP4_RABBIT SLKHHPQRARKKNKNCRRHALYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAFYCHGDCPFPLADHFN

BMP4_B0VINE SPKHHPQRARKKNKNCRRHSLYVDFSDVGWNDWXVAPPGYQAFYCHGDCPFPLADHLN

5 BMP4_D0G SPKHHAQRARKKNKNCRRHSLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAFYCHGDCPFPLADHLN

BMP4_DAMDA SPKHHPQRARKKNKNCRRHSLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAFYCHGDCPFPLADHLN

BMP4_RAT SPKHHPQRSRKKNKNCRRHSLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAFYCHGDCPFPLiADHLN

BMP4_M0USE SPKHHPQRSRKKNKNCRRHSLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAFYCHGDCPFPLADHLN

BMP4_SUNCUS SPKHHPQRARKKNKNCRRHSLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAFYCHGDCPFPLADHLN

10 BMP4_CHICKEN SPKHHG—SRKNKKNCRRHALYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAFYCHGDCPFPLADHLN

BMP 4 _X ENO PUS SPKQQR—PRKKNKHCRRHSLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAFYCHGDCPFPLADHLN

BMP4_ZEBRAFXSH SPKQRG---RKRNRNCRRHALYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAYYCHGECPFPLADHLN

BMP2_HUMAN QAKHKQ—RKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLN

BMP2_DAMDA QAKHKQ—RKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLN

15 BMP2 _MOUSE QAKHKQ--RKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLN

BMP2_XENOFUS QARHKQ--RKRLKSSCRRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLN

... -. . ★.**' ft******************.*.****.********-1

BMP4_RE INDEER STNHAIVQTLVNSVNS SIPKACCVPTELSAISMLYLDEYDKWLKNYQEMWEGCGCR

20 BMF4_HUMAN STNHAIVQTLVNSVNSSI PKACCVPTELSAI SMLYLDEYDKWLKNYQEMWEGCGCR

BMP4_RABBIT STNHAIVQTLVNSVNSSI PKACCVPTELSAI SMLYLDEYDKWLKNYQEMWEGCGCR

:V: BMP4_BOVINE STNHAIVQTLVNSVNSSI PKACCVPTELSAI SMLYLDEYDKWLKNYQEMWEGCGCR

• ·

• ·1; BMP4_DOG STNHAIVQTLVNSVNSSI PKACCVPTELSAI SMLYLDEYDKWLKNYQEMWEGCGCR

• · · ·

.1. I BMP4_DAMDA STNHAIVQTLVNSVNSSI PKACCVPTELSAI SMLYLDEYDKWLKNYQEMWEGCGCR

• · ·

: 25 BMP4_RAT STNHAIVQTLVNSVNS SI PKACCVPTELSAI SMLYLDEYDKWLKNYQEMWEGCGCR

• · 1

!**.' BMP4_MOUSE STNHAIVQTLVNSVNSSI PKACCVPTELSAI SMLYLDEYDKWLKNYQEMWEGCGCR

* · · • · ·

BMP4_SUNCUS STNHAIVQTLVNSVNSSI PKACCVPTELSAI SMLYLDEYDKWLKNYQEMWEGCGCR

• ·

·** BMP4_CHICKEN STNHAIVQTLVNSVNSSI PKACCVPTELSAI SMLYLDEYDKWLKNYQEMWEGCGCR

BMP4„XENOPUS STNHAIVQTLVNSVNSSI PKACCVPTELSAI SMLYLDEYDKWLKNYQEMWEGCGCR

• · · _ _

30 BMP 4_Z EBRAFISH STNHAIVQTLVNSVNTNIFKACCVPTELSAISMLYLDETDRWLKNYQEMWEGCGCR

*·1

*, t, · BMP2_HUMAN STNHAIVQTLVNSVNSKI PKACCVPTELSAI SMLYLDENEKWLKNYQDMWEGCGCR

I . . BMP2_DAMDA STNHAIVQTLVNSVNSKI PKACCVPTELSAI SMLYLDENEKWLKNYQDMWEGCGCR

• · · • · 1 ·

β 1 1 1 φ BMP2_MOUSE STNHAIVQTLVNSVNSKI PKACCVPTELSAI SMLYLDENEKWLKNYQDMWEGCGCR

• ·

BMP2_XENOPUS STNHAIVQTLVNSVNTNIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKWLKNYQDMWEGCGCR

• · * 1 «- j · · **★★***★1★**·1·**. ********************* ··*******«********* « 119373 13

Eräässä toteutusmuodossa BMP on mikä tahansa BMP tai sen homologi, johdannainen tai fragmentti, joka sisältää SEQ ID NO: 1:n aminohapot 6-21. Vielä eräässä toteutusmuodossa tämän keksinnön BMP on mikä tahansa BMP tai sen homologi, johdannainen tai fragmentti, joka sisältää SEQ ID NO: 1:n aminohapot 5 1-16. Vielä eräässä toteutusmuodossa tämän keksinnön BMP on mikä tahansa BMP tai sen homologi, johdannainen tai fragmentti, joka sisältää SEQ ID NO: 1:n aminohapot 16-23. Vielä eräässä toteutusmuodossa tämän keksinnön BMP on mikä tahansa BMP tai sen homologi, johdannainen tai fragmentti, joka sisältää SEQ ID NO: 1:n aminohapot 1-23. Vielä eräässä toteutusmuodossa tämän 10 keksinnön BMP on BMP-4-proteiini tai sen homologi, johdannainen tai fragmentti, kuten sellainen, joka sisältää SEQ ID NO: 1:n aminohapposekvenssin. Homologien, johdannaisten tai fragmenttien, jotka on mainittu näissä toteutusmuodoissa pitää sisältää ainakin aminohappo Pro6 (esimerkkinä mutaatio L—»P, kuten edellä olevasta linjauksesta nähdään) tai molemmat aminohapot Pro6 15 ja Pro21 kuten on kuvattu edellä. Mainittuihin homologeihin, johdannaisiin, tai fragmentteihin eivät sisälly tunnetut BMP-4-proteiinit sellaisenaan, kuten ihmisen BMP-4, koska ne eivät sisällä kyseisiä, tämän keksinnön BMP-4-proteiinille luonteenomaisia aminohappoja. Kuitenkin, jos tunnettu BMP-4 modifioidaan siten, että se sisältää ainakin yhden kyseisistä, tunnusomaisista aminohapoista, voidaan 20 sitä pitää sellaisena homologina, johdannaisena tai fragmenttina.

Eräs tämän keksinnön toteutusmuoto tarjoaa nukleiinihappomolekyylin, kuten : .·. DNA- tai RNA-molekyylin, joka koodaa mainittua tämän keksinnön BMP:tä.

• · · [·[ j Johtuen geneettisen koodin degeneratiivisuudesta on olemassa useita erilaisia • · · .*/ 25 nukleiinihapposekvenssejä, jotka koodaavat keksinnön BMP:tä. Kaikki sellaiset :*V nukleiinihappovariantit ovat tämän keksinnön suojapiirissä. Edullisesti mainittu • » · nukleiinihappomolekyyli on DNA-molekyyli. Esimerkkejä mainituista DNA-sekvensseistä on esitetty kuvissa 5-7.

:.:V 30 Eräs tämän keksinnön toteutusmuoto tarjoaa replikoituvan vektorin, joka sisältää :**[: edellä kuvatun nukleiinihappomolekyylin, yhdistettynä toiminnallisesti sellaiseen : ]·. sekvenssiin, joka kontrolloi sen ekspressiota. Tällaisia vektoreita voidaan käyttää • · · tuottamaan keksinnön mukaisia BMP-rekombinanttiproteiineja sopivassa **.**’ isäntäsysteemissä.

35 ·:**: Nukleiinihappo, joka koodaa tämän keksinnön BMP:tä, voidaan liittää kyseiseen replikoituvaan vektoriin kloonausta tai ekspressiota varten. Useita vektoreita on yleisesti saatavilla. Vektori voi olla esimerkiksi plasmidin, kosmidin, viruspartikkelin 119373 14 tai faagin muodossa. Tarkoituksenmukainen nukleiinihapposekvenssi voidaan liittää vektoriin käyttäen useaa eri menettelytapaa. Yleensä, DNA liitetään sopivaan restriktioendonukleaasin katkaisukohtaan käyttäen alalla hyvin tunnettuja menetelmiä. Vektorin rakenneosana voi olla esimerkiksi yksi tai useampi 5 signaalisekvenssi, replikaation alkamiskohta, yksi tai useampi markkerigeeni, enhancer-elementti, promoottori ja transkription lopettamissekvenssi. Rakennettaessa tällaisia sopivia vektoreita, jotka sisältävät yhden tai useamman näistä komponenteista, käytetään hyväksi normaaleja ligaatiotekniikoita, jotka alan ammattilainen tuntee hyvin.

10

Yleensä kyseinen BMP voidaan tuottaa geeniteknologisesti ekspressoimalla sitä missä tahansa sopivassa isäntäsolussa, kuten bakteerisolussa. Tällaiset menetelmät ovat alalla hyvin tunnettuja ja niistä löytyy tietoa kirjallisuudesta. Oleellista on, että proteiini laskostuu oikeanlaiseen muotoon ekspression aikana ja 15 että se sisältää kaikki tarpeelliset post-translationaaliset modifikaatiot.

Ei ole aina mahdollista tuottaa ja puhdistaa tiettyjä proteiineja asianmukaisesti, esimerkiksi liukoisuuteen ja uudelleenlaskostumiseen liittyvistä ongelmista johtuen. Yleensä E. coli ei voi tehdä post-translationaalisia modifikaatioita, jotka ovat 20 tyypillisiä nisäkässolusysteemeille. Kuitenkin tämän keksinnön tekijät ovat tuottaneet poron BMP-4-proteiinin kypsän osan rekombinanttiproteiinina E. colissa ja puhdistamisen ja uudelleenlaskostumisen jälkeen osoittaneet sen olevan • · : biologisesti aktiivisessa muodossa.

*·· · • · • · t • *· ·’,/ 25 Eräs tämän keksinnön toteutusmuoto tarjoaa isäntäsolun, joka sisältää • t · 5*V nukleotidimolekyylin tai nukleotidivektorin, joka on kuvattu edellä. Käyttökelpoisia ::i.: soluja ovat kaikki prokaryoottiset ja eukaryoottiset solut, jotka kykenevät • · *···' ekspressoimaan tämän keksinnön proteiinia. Tällaiset isäntäsolut ovat hyvin tunnettuja alalla ja alan ammattilainen voi helposti valita sopivan isäntäsolun. Eräs 30 toteutusmuoto tarjoaa BMP:n joka on tuotettu kasvattamalla mainittuja soluja siten, että ne ekspressoivat kyseistä proteiinia, ja ottamalla talteen mainittu tuotettu : J*. proteiini kyseisestä isäntäsolusta. Mitä tahansa käyttökelpoista menetelmää ]···[ voidaan käyttää proteiinin talteenottamiseen ja puhdistamiseen ja sellaiset • · *" menetelmät ovat alalla hyvin tunnettuja.

• · • · _ _ : ·· 35 Tämän keksinnön BMP:tä voidaan käyttää hoidettaessa häiriöitä, jotka kohdistuvat luun, ruston, jänteen tai hampaiden vikoihin tai sairauksiin tai muuhun vastaavaan, jossa niiden uudistuminen, korjaaminen tai kasvu on toivottavaa, tai myös muihin 119373 15 sairauksiin. Tämän keksinnön proteiinia voidaan käyttää myös haavojen parantamiseen, kuten palovammoihin, leikkaushaavoihin ja mahahaavoihin ja vastaaviin kudosten korjauksiin ja myös syövän hoitoon, kuten on esitetty julkaisussa EP1131087. Koska BMP-proteiinilta yleisesti puuttuu lajispesifisyys, 5 potilas, joka kärsii kyseisestä viasta, voi olla tahansa soveltuva eläin, edullisesti nisäkäs, kuten ihminen, ja hoidossa käytettävä BMP-proteiini voi olla alkuperältään mistä tahansa sopivasta lähteestä peräisin. Samankaltaisten BMP-proteiinien käyttö monissa terapeuttisissa sovelluksissa tunnetaan alalla hyvin (katso esimerkiksi US 6245889 ja WO 98/51354).

10 ’’Häiriöt, jotka liittyvät luun, ruston, jänteen tai hampaiden vikoihin” tässä käytettynä viittaa yleisesti mihin tahansa vaivaan, jossa luun, ruston, jänteen tai hampaiden paraneminen tai uudelleen rakentaminen, ts. regeneraatio, on toivottavaa. Ei- rajoittavia esimerkkejä hoitotoimenpiteistä, jotka kohdistuvat luun, ruston, jänteen 15 tai hampaiden häiriöihin tai sairauksiin tai vastaaviin, ovat luun ja hammaskudoksen regeneraatio, korjaaminen ja kasvu; luun regeneraatio, korjaaminen ja kasvu nisäkkäillä, kuten ihmisellä; hoitotoimenpiteet luun muodostuksessa tai regeneraatiossa tapahtuneiden poikkeavuuksien korjaamiseksi; haavan paraneminen, ektooppinen luun indusointi ja 20 segmentaalisten luuvaurioiden parantaminen selkärankaisilla; hoitotoimenpiteet luurangan häiriöiden ja epämuodostumien korjaamiseksi; suurten luuvaurioiden korjaaminen, jotka johtuvat traumasta, kasvainten poistamisesta tai synnynnäisistä : .·. epämuodostumista, implantoidun sisäisen proteesin vuoksi vähentyneiden • · · ! luuvarastojen rekonstruointi korjausoperaatioissa tai luunmurtumien hidastunut • * · .* / 25 paraneminen tai yhteen liittymättömät luunmurtumat; luun ja ruston vikojen i*V korjaaminen, kuten ’’critical size defectif, ”non-critical size defectit”, yhteen • · · liittymättömät murtumat, segmentaaliset yhteen liittymättömät murtumat; akuutit murtumat, rustoviat, luu-rusto defektit, rustonalaisen luun viat, paikallinen luun ja ruston muodostus; viat, jotka johtuvat rappeuttavista sairauksista; hampaisiin 30 liittyvät sovellukset, joissa korjataan hammaskudosta, alveolaarista luuta, hammassementtiä, hampaanjuuren membraania, täytetään hampaan juurikanavan .sisältöä, hammasimplantin kiinnityksen kehittäminen ja parantaminen. Lisää esimerkkejä näistä häiriöistä löytyy julkaisusta Ann Rheum Dis, Volume 62, 2003, **:·' 73-78: Reddy AH: Cartilage morphogenic proteins: role in joint development, 35 homeostasis and regeneration.

• ·

Muita sairauksia, joissa tämän keksinnön BMP on hyödyllinen, ovat esimerkiksi syöpä, fibromyalgia, psoriasis ja muut dermatologiset häiriöt, ja reumaattiset häiriöt 119373 16 ja vastaavat. Esimerkkejä tällaisista syövistä ja menetelmistä ja koostumuksista, joilla niitä hoidetaan, on esitetty julkaisussa EP1131087.

Eräs keksinnön toteutusmuoto tarjoaa BMP:n, kuten BMP-4, käytettäväksi missä 5 tahansa tässä kuvatussa sovelluksessa yhdessä yhden tai useamman muun morfogeneettisen proteiinin kanssa, kuten toisen BMP-tyypin tai vastaavan kanssa. Yleensä tällä saavutetaan synergiaetuja, kuten alalla tiedetään. Esimerkkeinä muista sopivista BMP-proteiineista ovat, mutta eivät ole rajoittuneet vain näihin, BMP-1, BMP-2, BMP-3, jokin muu BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 ja BMP-8. Myös 10 muita terapeuttisesti hyödyllisiä aineita voidaan käyttää, kuten epidermaalista kasvutekijää, fibroblastista kasvutekijää ja tranformoivaa kasvutekijää (US 6 245 889). Eräässä keksinnön toteutusmuodossa kyseessä oleva täydentävä morfogeneettinen proteiini on peräisin porosta, kuten jokin muu poron BMP-proteiini. Eräässä keksinnön toteutusmuodossa BMP-4 tarjotaan käytettäväksi 15 dimeerinä, homodimeerinä tai heterodimeerinä yhdessä toisen BMP-proteiinin kanssa, kuten on kuvattu edellä. Vielä eräässä toteutusmuodossa BMP-4 tarjotaan käytettäväksi dimeerimuodossa tai yhdessä jonkin muun tekijän tai proteiinin kanssa, kuten on kuvattu edellä, lääkeaineen valmistukseen, jolla lääkitään häiriöitä, joita on kuvattu selitysosassa.

20

Eräs keksinnön toteutusmuoto tarjoaa käyttöön osteogeenisen välineen, kuten implantin, joka sisältää tämän keksinnön BMP:tä. Osteogeeninen väline voi sisältää bioyhteensopivan matriksin, kuten kalsiumfosfaatti-, • · * T : karboksimetyyliselluloosa-, kollageenimatriksin tai näiden yhdistelmiä. Eräässä .* / 25 toteutusmuodossa kyseinen kalsiumfosfaattimatriksi on hydroksiapatiittimatriksi.

• · · [*·/ Kyseinen matriksi voi mahdollistaa BMP-proteiinin hitaan vapautumisen ja/tai : sopivan ympäristön BMP-proteiinin luovuttamiselle. Osteogeeninen väline saattaa myös sisältää metallisen implantin, jota mainittu bioyhteensopiva matriksi ympäröi. Eräs esimerkki kyseisestä metallista on titaani. Joitakin esimerkkejä tällaisista 30 osteogeenisistä välineistä on esitetty julkaisussa WO 98/51354.

* * · • · • * • · · . \4 Ei-rajoittavia esimerkkejä erilaisista tukimateriaaleista, kantajista tai tuista, joiden avulla muodostetaan esimerkiksi erilaisia osteogeenisiä välineitä tai vastaavia, • * '"** joissa on tämän keksinnön proteiinia, ovat ilmiasultaan seuraavissa erilaisissa 35 muodoissa: pulveri, pesusienimäinen, liuska, kalvo, geeli, verkko tai liuos tai ·:··· suspensio; puolikiinteä liuosmainen kantaja, jota voidaan käyttää lihaksensisäisiin, suonensisäisiin, luuytimensisäisiin tai nivelensisäisiin injektioihin; eristetyt mesenkymaaliset kantasolut, mikä tahansa farmaseuttisesti hyväksyttävä kuljetin; 119373 17 jauhetut auto- ja allograftit, mikä tahansa farmaseuttisesti hyväksyttävä matriksi, materiaali, joka on valittu ryhmästä, joka käsittää hydroksiapatiitin, kollageenin, polymeerejä (esimerkiksi polymaitohappo- ja polyglykolihappo-polymeerit), synteettiset polymeerit, hyaluronihappo, α-BSM, kalsiumfosfaatti, 5 trikalsiumfosfaatti, ei-huokoinen keraaminen biopolymeeri, ei-huokoinen resorboituva biopolymeeri, koralli, demineralisoitunut luu, biolasi, mikä tahansa biohajoava materiaali ja näiden yhdistelmät; sitoutumiseen käytetyt aineet, jotka on valittu seuraavasta ryhmästä: mannitoli, dekstraanit, valkovaseliini, alkyyli- ja metyyliselluloosat, kostuttavat aineet kuten natriumsuolat, fobriiniliima, 10 nisäkäsperäinen fibrinogeeni ja trombiini ja näiden yhdistelmät ja sekoitukset. Osteogeeninen väline voi olla esimerkiksi rakenteellisesti stabiili, kolmiulotteinen implantti, joka on muodoltaan kuutio, sylinteri tai blokki tai anatomisesti muotoiltu tai injektoitavassa muodossa. Esimerkkejä osteogeenisistä välineistä, hyödyllisistä materiaaleista ja tekniikoista on tuotu esiin kirjassa Skeletal reconstruction and 15 bioimplantation (T. Sam Lindholm, 1997, Springer-Verlag, Heidelberg, Germany).

Eräs keksinnön toteutusmuoto tarjoaa farmaseuttisen koostumuksen, joka sisältää terapeuttisesti tehokkaan määrän tämän keksinnön BMPrtä farmaseuttisesti sopivassa kuljettimessa tai kantajassa. Kyseisiä farmaseuttisia koostumuksia 20 voidaan käyttää sellaisten häiriöiden hoitamiseen, jotka liittyvät luun, ruston, jänteen tai hampaiden vaurioihin tai muihin sairauksiin, haavoihin ja muihin kudosvaurioihin tai mihin tahansa häiriöihin, joita on kuvattu tässä tekstissä.

· • · • · · • · · · Eräs keksinnön toteutusmuoto tarjoaa menetelmän, jolla voidaan indusoida luun, • · · .* / 25 ruston, jänteen, hampaiden tai vastaavien muodostuminen, jossa kyseistä luuta, j*Y rustoa, jännettä, hammasta tai vastaavaa käsitellään tämän keksinnön BMP:llä tai * · φ ·*;;/ sen yhdistelmillä kuten on kuvattu edellä, in vitro tai in vivo. Vielä eräs keksinnön *··.: toteutusmuoto tarjoaa menetelmän, jolla hoidetaan niitä häiriöitä, joita on kuvattu selityksessä, käsittäen eristetyn keksinnönmukaisen BMP:n antamisen potilaalle, 30 joka kärsii kyseisistä häiriöistä. Kyseistä BMP:tä voidaan antaa farmaseuttisena :[[[: koostumuksena tai osteogeenisenä välineenä, kuten on kuvattu edellä.

: )·, Täydentäviä morfogeneettisiä proteiineja tai muita hyödyllisiä aineita voidaan antaa • · · yhdessä kyseessä olevan tämän keksinnön BMP:n kanssa, kuten on kuvattu '*;** edellä, lisäämään terapeuttista vaikutusta.

35 ·:·*: Seuraavassa selvityksessä ja esimerkeissä kuvataan sitä, miten keksinnön erään toteutusmuodon mukainen poron rekombinantti-BMP-4:n kypsä osa tuotettiin E colissa. Puhdistamisen ja uudelleenlaskostamisen jälkeen osteoinduktiivinen 119373 18 aktiivisuus varmistettiin bioanalyysillä hiiren takajalan lihastaskussa. Tämä in vivo -bioanalyysi on ollut BMP:n aktiivisuuden määrityksen standardimenetelmä jo proteiinin keksimisestä lähtien. Se käsittää BMP:n implantoimisen hiiren takajalan lihakseen ja heterotrooppisen uuden luun indusoitumisen arvioinnin radiologisesti 5 ja histologisesti 10-21 päivän kuluttua implantaatiosta.

BMP:n aktiivisuuden määrityksessä kuva-analyysi tehdään lähettämällä röntgensäde luun lävitse, jolloin se nähdään filmillä röntgenpositiivisena tummentumana verrattaessa sitä pehmytkudokseen. Tämä mahdollistaa 10 vastamuodostuneen luun radiografisen havaitsemisen ja radiomorfometrisen kvantitaation, joka luu on saatu aikaan implantoimalla BMP:tä tai muuta luuta indusoivaa ainetta heterotooppiseen tai ortotooppiseen paikkaan.

Osteoinduktiivisuus havaittiin kaikissa kolmessa tutkitussa ryhmässä (1 mg, 3 mg, 15 ja 5 mg rekombinanttia poron BMP-4-proteiinia) ja vaste kohosi annosta lisättäessä (taulukko 2). Verrattaessa poron rekombinantti-BMP-4-proteiinia ihmisen vastaavaan, poron BMP-4 oli noin viisi kertaa tehokkaampi luunmuodostuksen indusoija kuin samalla tavalla tuotettu ihmisen rekombinantti BMP-4-proteHm (jopa 7,5 mg:n annoksella), joten se on tehokas osteoinduktiivinen aine kliinisiin 20 sovelluksiin.

• φ • · · • » · • · : 1 ma 3 ma 5mq • · · - • M · • · • *· :*,·* Poro (+) ++ + (+) (+) +++ +++ + ++ +++ +++ _i±L_i±)__:__:__±__±__ω__:__=__:__ω__i_ ·*::/ __:__:__:__:__:__-__:__++ (+) + +++ • · ···* __^__-__++ - +++ +++ +++ +++ +++ _____(+)__"__+++ +++ +++ +++ +++__~ • · * • · · ··· . _ - - -.....

• · · • ·

··· . I I | I I----- I

• ,·. Ihminen (+)-(+)- - + • · · • · · · • · · • · — ...... ..II.. I .........* ........... · • · ··» • *·· Taulukko 2. Havaittu osteoinduktiivisuus • « 25 In vivo -bioanalyysin tulokset on esitetty kuvassa 9. Kuva 9A on verrokki ja 9B on näyte, joka on implantoitu tämän keksinnön BMP-4 proteiinilla. Bioanalyysi 119373 19 toteutettiin kuten on esitetty julkaisussa Marshall R. Urist, J.J. Chang, A. Lietze, Y.K. Huo, A.G. Brownell and J.DeLange (1987): Preparation and Bioassay of Bone Morphogenetic Protein and Polypeptide Fragments, Methods Enzymol 146: 294-312.

5

Esimerkit

Esimerkki 1: Poron BMP-4 mature osan cDNA:n kloonaaminen ja sekvensointi 10 A. RNA:n eristäminen

Kolmivuotiaan urosporon sarvet leikattiin irti ja jäädytettiin nestetypessä välittömästi teurastuksen jälkeen. Jäätyneet sarvet leikattiin 0,5 cm:n palasiksi ja 15 säilytettiin -70 °C. Poron sarven mRNA eristettiin käyttäen QuickPrep® Micro mRNA Purification Kit -pakkausta (Pharmacia Biotech). Osa poron sarven kappaleesta pilkottiin pieniksi palasiksi (noin 1 mm3) ja 0,1 g tätä kudosta lisättiin 0,6 ml:iin Extraction-puskuria, joka sisälsi guanidinitiosyanaattia ja N-lauroyylisarkosiinia. Kudosta homogenisoitiin jäissä Ultra Turraksilla kolme kertaa 20 10 sekuntia ja jäähdytettiin homogenisointikertojen välillä. 1,2 ml Elution-puskuria lisättiin ja suspensiota homogenisoitiin vielä yhden kerran 10 sekunnin ajan. Lopputuloksena oli tasainen suspensio.

• · • · · * T | Poron sarven homogenaatti ja Oligo(dT)-selluloosa sentrifugoitiin täydellä / / 25 nopeudella [14,000 rpm, huoneenlämmössä, Centrifuge 5415 C (Eppendorf)] • ti j··*/ yhden minuutin ajan. Oligo(dT)-selluloosapelletin päällä oleva puskuri poistettiin ja ··· : kirkas kudoshomogenaatti pipetoitiin sen tilalle. Putkea käännettiin ylösalaisin, jotta I··

Oligo(dT)-selluloosapelletti saataisiin suspensioksi. Suspensiota sekoitettiin varovasti viiden minuutin ajan ja sentrifugoitiin täydellä nopeudella [14,000 rpm, 30 huoneenlämmössä, Centrifuge 5415 C (Eppendorf)] kymmenen sekunnin ajan. Supernatantti heitettiin pois.

IM

• ♦ * · ·

Oligo(dT)-selluloosa suspensoitiin uudelleen High-Salt Buffer -puskuriin [10 mM

• ♦ '·;·* Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCI] ja suspensio sentrifugoitiin täydellä 35 nopeudella [14,000 rpm, huoneenlämmössä, Centrifuge 5415 C (Eppendorf)] ·:··· kymmenen sekunnin ajan. Pesut High-Salt Buffer -puskurilla toistettiin viisi kertaa ja lisäksi kaksi kertaa Low Salt Buffer -puskurilla [10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 M NaCI]. Kolme ml Low Salt Buffer -puskuria lisättiin ja suspensio 20 1 1 9373 siirrettiin MicroSpin-pylvääseen. MicroSpin-pylväs laitettiin Eppendorf-putkeen ja sentrifugoitiin täydellä nopeudella viiden sekunnin ajan. Pylvään Oligo(dT)-selluloosa huuhdeltiin kolme kertaa Low Salt Buffer -puskurilla.

5 Poron sarven mRNA eluoitiin MicroSpin-pylväästä puhtaaseen Eppendorf-putkeen lisäämällä pylvääseen 0,2 ml 65 °C Elution Buffer -puskuria (QuickPrep® Micro mRNA Purification Kit, Pharmacia Biotech) ja sentrifugoimalla täydellä nopeudella [14,000 rpm, huoneenlämmössä, Centrifuge 5415 C (Eppendorf)] viiden sekunnin ajan. Eluutiovaihe toistettiin kaksi kertaa. Eristetty mRNA saostettiin lisäämällä 10 jokaiseen eluanttiin 5 pl glykogeeniliuosta (5-10 mg/ml DEPC-käsitellyssä H20:ssä), 1/10 tilavuutta K-asetaattiliuosta (2,5 M kaliumasetaatti, pH 5,0) ja 0,5 ml absoluuttista etanolia (jäähdytettynä -20 °C;seen). Saostumisen annettiin tapahtua -20 °C:ssa ainakin 30 minuuttia ja mRNA sentrifugoitiin täydellä nopeudella [14,000 rpm, 4 °C:ssa, Centrifuge 5415 C (Eppendorf)] viiden minuutin ajan. 15 Saostettu mRNA säilytettiin -70 °C:ssa niin kauan kunnes cDNA.n synteesi suoritettiin.

B. cDNA:n synteesi 20 Poron sarven mRNA:n käänteinen transkriptio suoritettiin modifioiden Time Saver™ cDNA Synthesis Kit -pakkauksen (Pharmacia Biotech) ohjeita. 3 pg :\\ mRNA:ta lämpödenaturoitiin 65 °C:ssa kymmenen minuutin ajan ja jäähdytettiin jäissä. 0,2 pmol DTT, 0,5 pg Oligo(dT)12-ie aluketta ja lämpödenaturoitu mRNA j lisättiin First Strand -reaktioseokseen, joka sisälsi seuraavia: FPLCpure™ Cloned // 25 Murine Reverse Transcriptase, RNAguard™, RNaasi/DNaasivapaa BSA, dNTPs

i*:t: (dATP, dCTP, dGTP ja dTTP) vesipohjaisessa puskurissa (Time Saver™ cDNA

ϊ·ί i Synthesis Kit, Pharmacia Biotech). Sekoitettua liuosta inkuboitiin 37 °C:ssa yhden !...! tunnin ajan. Inkubaation jälkeen First Strand -reaktioseos lisättiin Second Strand - reaktioseokseen, joka sisälsi E. colin RNaasi H:ta ja E. coli DNA-polymerasi l:tä ja 30 dNTP:t vesipohjaisessa puskurissa (Time Saver™ cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech). Liuosta sekoitettiin varovasti ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 . \ minuuttia. Syntetisoitu cDNA säilytettiin +4 °C asteen lämpötilassa.

• · · ··· · • · *···* C. Poron sarven cDNA:n kartoittaminen 9 : ·.. 35 e ·:··· Poron BMP-4:n kypsän osan cDNA monistettiin PCR-tekniikalla (Polymerase chain reaction) käyttäen alukkeita (5’- GGATCCGAGCCCCAAGCATCACCCACAGAGG -3’) 21 119373 ja (3’- AAGCTTGCGGCACCCACATCCCTCCACTAC - 5’) (taulukko 3), jotka oli suunniteltu jo tunnetun Teksasin kuusipeuran BMP-4-geenin homologiaan perustuen. PCR-reaktioseos (50 pl) sisälsi 100 ng poron sarvesta valmistettua cDNA:ta, 40 pmol kutakin aluketta, 0,4 mM dNTP (PCR Core Kit, Roche) ja 0,7 5 U/μΙ Expand High Fidelity -entsyymiseosta (lämpöstabiili Taq-polymeraasi + oikolukeva polymeraasi, Roche) Expand High Fidelity -puskurissa, joka sisälsi MgCI2 (Expand High Fidelity PCR System, Roche). Reaktio suoritettiin käyttäen Mastercycler personal apparatus -laitetta (Eppendorf) seuraavan ohjelman mukaisesti: alkudenaturaatio 94 °C 4 minuuttia, ja seuraavat 25 sykliä: 10 denaturaatio 94 °C, 1 minuutti, alukkeiden liittäminen 55 °C 1 minuutti, DNA-ketjujen pidentäminen 72 °C 2 minuuttia. Loppuekstensio suoritettiin 72 °C:ssa 10 minuuttia.

Kloonauksessa käytetyt alukkeet_

Poron BMP-4 cDNA:n kypsä osa_ pTrcHis2A 51-> 3’ GGATCCGAGCCCCAAGCATCACCCACAGAGG_ __3’—» 5’ AAGCTTGCGGCACCCACATCCCTCCACTAC_ PIVEX2.4 5’-+ 3’ CCGCGGTAGCCCCAAGCATCACCCACAGAGG_

3’—» 5’ GGATCCTAGCGGCACCCACATCCCTCCACTAC

15 • · v Taulukko 3. Poron BMP-4 kypsän osan kloonaamisessa käytetyt alukkeet • · • 1 · • · · ··· · D. Kloonaaminen pGEM-T®-vektoriin • m m 1 • · · • « · : 20 PCR-tuote puhdistettiin käyttäen Wizard® PCR Preps DNA Purification System “1·! -pakkausta (Promega) ja ligatoitiin pGEM-T®-vektoriin (kuva 1) käyttäen T4 DNA- ligaasia (pGEM-T® Vector System I; Promega). 0,3 pg puhdistettua PCR-tuotetta , ja 2,3 pg/ml pGEM-T® vektoria lisättiin ligaatiopuskuriin, joka sisälsi 18 mM Tris- HCI (pH 7,8), 6 mM MgCfe, 6 mM DTT, 0,3 mM ATP, 3 % polyetyleeniglykolia ja *···1 25 0,14 U/μΙ T4 DNA-ligaasia kokonaistilavuuden ollessa 66 μΙ. Reaktion annettiin : tapahtua +16 °C vesihauteessa, joka viileni yön aikana +4 °C:ksi. Syntynyttä, uutta ··· · :1··. plasmidia kutsuttiin nimellä: pGEMrd4/116 (kuva 1).

• · · • ♦ · • · • · · <· 119373 22 E. Kompetenttien Escherichia coli TOP 10 F’ -solujen valmistaminen

Kompetentit Escherichia coli TOP 10 F -solut valmistettiin kalsiumkloridi/magnesiumkloridimenetelmällä. 2 ml LB-kasvatuslientä inokuloitiin 5 E. Coli TOP 10 F -soluilla ja kasvatettiin yön yli 37 °C:ssa ravistellen (225 rpm). Seuraavana aamuna 100 ml:aan tuoretta LB kasvatuslientä lisättiin 1 ml yli yön kasvatettua kasvustoa ja sitä kasvatettiin ravistellen (225 rpm) 37 °C:ssa niin kauan kunnes OD6oo = 0,5 - 0,6. Kasvatetut solut kerättiin sentrifugoimalla (2,500 x g, 5 minuuttia), suspendoitiin 10 ml:aan 0,1 M MgCI2-liuosta ja kerättiin uudelleen 10 sentrifugoimalla (2,500 x g, 5 minuuttia). MgCI2-käsittelyn jälkeen solut suspendoitiin 10 inhaan 0,1 M CaCI2-liuosta, inkuboitiin jäähauteessa 30 minuuttia ja kerättiin taas sentrifugoimalla (2,500 x g, 5 minuuttia). CaCI2-käsittely toistettiin, muuttaen sitä kuitenkin niin, että toisella kerralla käytettiin 3,5 ml CaCI2-liuosta ja inkuboimalla soluja yhden tunnin ajan. Suspensioon lisättiin glyserolia (lopullinen 15 konsentraatio 14 % (v/v)) ja suspensio jaettiin 200 μΙ:η eriin. Kompetentit E. Coli TOP 10 F’ -solut pakastettiin nestetypessä ja säilytettiin -70 °C:ssa.

F. Kompetenttien Escherichia coli TOP 10 F' -solujen transformointi ja sellaisten kloonien valitseminen, jotka sisältävät poron BMP-4:n.

20

Kompetentit Escherichia coli TOP 10 F -solut sulatettiin jäähauteessa 15 minuutin

:Y: ajan. 10 μΙ ligaatioseosta (kuvattu edellä) lisättiin 100 phaan TCM-liuosta (10 mM

• · ; Tris-HCI, 10 mM CaCI2, 10 mM MgCI2, pH 7,0) ja sekoitettiin 200 μΙ:η kanssa .·. : kompetentteja E. coli soluja. Seosta inkuboitiin jäissä 30 minuuttia ennen • · ·

25 lämpöshokkia (43 °C, 3 minuuttia). Lämpökäsittelyn jälkeen lisättiin 800 μΙ LB

• · · ΓΥ kasvatuslientä ja solujen annettiin elpyä 37 °C:ssa 45 minuuttia. Transformoidut ;:i.: solut kerättiin sentrifugoimalla täydellä nopeudella 2 minuutin ajan ja suspendoitiin • · ’···1 30 phaan kasvatuslientä. Solususpensio maljattiin kahdelle LB-maljalle, jotka sisälsivät 25 pg/ml ampisilliinia, 1 mmol IPTG (isopropyyli-p-D- 30 tiogalaktopyranosidiä) ja 2,4 nmol X-gal (5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-p-D- :...·1 galaktosidi) ja soluja kasvatettiin maljoilla yön yli 37 °C:ssa. Positiiviset kloonit : !·. havaittiin siitä, että ne olivat väriltään valkoisia IacZ-geenin a-komplementaation • · [···[ vuoksi. Menetelmä on kuvattu yksityiskohtaisesti kirjassa Sambrook ja Russel (2001) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

· * · • ·· 119373 23 G. pGEMrd4/116-plasmidien eristäminen ja cDNA~inserttien sekvensointi

Plasmidit eristettiin käyttäen Wizard® Plus Minipreps DNA Purification System -pakkausta (Promega) ja puhdistettiin lisäksi saostamalla etanolilla. cDNA:n 5 identiteetti varmistettiin sekvensoimalla ABI Prism -laitteella (Perkin-Elmer

Corporation). Sekvensointireaktio suoritettiin käyttäen DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit -pakkausta (Amersham Pharmacia Biotech) ja Mastercycler Personel PCR-laitetta (Eppendorf). Sekvensoinnissa käytettävät PCR-alukkeet olivat (5’-T AATACGACTCACT AT AGGGCGA-3’) ja (3’- 10 ATTTAGGTAACACTATAGAATAC-5’) (taulukko 4) ja käytetty ohjelma: 25 sykliä denaturaatio 94 °C 30 sekuntia, alukkeiden liittäminen 50 °C 15 sekuntia, ketjun pidentäminen 60 °C. Monistetut PCR-tuotteet seostettiin etanolilla. 10 pl:aan reaktioseosta lisättiin 1 pl 1,5 M Na-asetaatti - 250 mM EDTA-puskuria ja 95-100 % etanolia niin paljon, että etanolin lopullinen konsentraatio oli 75 %. Saostumisen 15 annettiin tapahtua jäähauteessa 10 minuutin ajan ja sen jälkeen seosta sentrifugoitiin 20 minuuttia. Supernatantti heitettiin pois ja sakka pestiin huoneenlämmössä 125 piillä 70 % etanolia. Seos sentrifugoitiin pikaisesti ja pesussa käytetty etanoli poistettiin niin tehokkaasti kuin mahdollista. Sakka kuivattiin 37 °C:ssa muutaman minuutin ajan, kunnes kaikki etanoli oli haihtunut. 20 ABI Prism -laitteisto oli lääketieteellisen biokemian ja molekyylibiologian laitoksessa Oulun yliopistossa ja varsinainen sekvensointi suoritettiin siellä.

• · • · · • · t • · 0 9 0 0 9 0 0 9 - · · : Sekvensoinnissa käytetyt alukkeet_

pGEM-T® plasmidit 5’-> 3’ TAATACGACTCACTATAGGGCGA

3’^ 5’ ATTTAGGTGACACTATAGAATAC

• · · 0 09 9 099

*···: pTrcHis2A 5’-> 3’ AGAGGTATATATTAATGTATCG

plasmidit 3’^ 5’ ATGGTCGACGGCGCTATTCAG

* * · • · · • · ·

0 5’—► 3’ TAATACGACTCACTATAGGGCGA

: .*·. plVEX2.4 plasmidit 3’^ 5’ GCTAGTTATTGCTCAGCGG

1·« · • · · • · • · *·· A(.

25 • 1 Taulukko 4. Poron BMP-4:n kypsän osan sekvensoinnissa käytetyt alukkeet 9 9 9 119373 24

Esimerkki 2. Poron BMP-4:n kypsän osan rekombinanttiproteiinin ekspressio Escherichia coli TOP 10 F’, Origami B (DE3) ja Rosetta (DE3) -soluissa A. Poron BMP-4:n kypsän osan subkloonaaminen pGEM-T®-vektorista 5 ekspressoivaan vektoriin pTrcHis 2A (invitrogen) ja transformointi kompetentteihin Escherichia coli TOP 10 F -soluihin.

Poron BMP-4:n kypsän osan subkloonaminen pGEM®-T vektorista ekspressoivaan vektoriin pTrcHis 2A (kuva 2) toteutettiin irrottamalla kypsä osa 10 pGEMrd4/116-vektorista Bam Hl ja Hind III -restriktioentsyymeillä ja ligatoimalla insertti pTrcHis 2A -vektoriin, joka oli digestoitu samoilla entsyymeillä. pGEM®-T ja pTrcHis 2A -vektorien (1 pg) digestio Bam Hl (Roche) ja Hind III (Roche) -entsyymeillä suoritettiin 10 pl:ssa 10 mM Tris-HCI, 10 mM NaCI, 5 mM MgCI2, 1 mM 2-merkaptoetanoli, pH 8,0 (SuRE/Cut B, Roche) käyttäen 1 U/μΙ kutakin 15 restriktioentsyymiä. Reaktion annettiin tapahtua 1,5 tuntia 37 °C:ssa, jonka jälkeen restriktioentsyymit inaktivoitiin 65 °C:ssa 20 minuutin ajan ja pakastettiin -20 °C:seen. Ligaatio (ligaasin pitoisuus 0,1 U/μΙ) suoritettiin 2X Rapid Ligation Buffer-puskurissa (tullut pGEM-T® -vektorin (Promega) mukana) +16 °C vesihauteessa, jonka annettiin hitaasti jäähtyä + 4 °C:seen yön aikana.

20

Uusi konstrukti tarkistettiin sekvensoimalla (menetelmä on kuvattu esimerkissä 1, osassa G) käyttäen alukkeita: (5’-AGAGGTATATATTAATGTATCG -3’) ja : (3’-ATGGTCGACGGCGCTATTCAG -5’). Ekspressiovektoria, joka sisälsi pTrcHis !\ : 2A:n ja poron BMP-4:n kypsän osan cDNA:n, kutsuttiin nimellä: pTrcrd4/116 (kuva • ·· .*,·] 25 2). Kompetentit Escherichia Coli TOP 10 F’ -solut transformoitiin kuten on kuvattu i « · ΓΥ esimerkissä 1 osassa F.

• · ·

• « I

f f · · ··· *···* B. Poron BMP-4:n kypsän osan liittäminen pET22b(+) (Novagen) ekspressiovektoriin ja transformoiminen kompetentteihin Escherichia Coli Origami \:V 30 B (DE3) ja Rosetta (DE3) -soluihin • · · « · • · t·· : !·. Poron BMP-4:n kypsän osan subkloonaaminen ekspressoivaan vektoriin • * [·*·[ pET22b(+) (Novagen) (kuva 3) suoritettiin, kuten on kuvattu edellä (katso esimerkki 2 osa A). Syntynyttä uutta plasmidia, joka sisälsi pET22b(+)vektorin ja ·· : *·· 35 siihen ligatoidun poron BMP-4:n kypsän osan cDNA-molekyylistä, kutsuttiin ”’*i nimellä: pETrd4/116 (kuva 3). Kompetentit Origami B (DE3) ja Rosetta (DE3) -solut transformoitiin noudattaen valmistajan (Novagen) antamia ohjeita.

119373 25 C. Poron BMP-4:n kypsän osan rekombinanttiproteiinin ekspressio Escherichia coli -kasvustoissa ja solujen kerääminen £ coli -solut [TOP 10, Origami B (DE3) tai Rosetta (DE3)], jotka sisälsivät joko 5 pTrcrd4/116- tai pETrd4/116-plasmidin, kasvatettiin yön yli 50 mhssa SOB kasvatuslientä, joka sisälsi ampisilliinia (50 pg/ml) ja Rosetta (DE3) -solukasvusto myös kloramfenikolia (35 pg/ml), +37 °C:ssa ravistellen (225 rpm). Seuraavana aamuna 1200 ml:aan SOB kasvatusmediumia, joka sisälsi edellä mainitut antibiootit, lisättiin 24 ml yön yli kasvanutta kasvustoa ja kasvatusta jatkettiin + 37 10 °C:ssa ravistellen (225 rpm) kunnes Οϋβοο oli 0,6, jolloin solut ovat logaritmisen kasvuvaiheen puolivälin paikkeilla. Tässä vaiheessa rekombinattiproteiinin indusointi suoritettiin lisäämällä IPTG siten, että lopullinen konsentraatio oli 1 mM. Induktion jälkeen soluja kasvatettiin neljästä viiteen tuntiin, jonka jälkeen ne kerättiin sentrifugoimalla. Nukleotidisekvensseistä johdetut rekombinanttiproteiinien 15 aminohapposekvenssit on esitetty kuvassa 5 (pTrcrd4/116) ja kuvassa 6 (pETrd4/116).

Esimerkki 3: Poron BMP-4:n kypsän osan rekombinanttiproteiinin puhdistaminen ja laskostaminen 20 A. Inkluusiokappaleiden peseminen • » • ♦ · • · · : .·, Kerätyt solut suspendoitiin ravistellen 50 mM Na-fosfaattipuskuriin (pH 7,0, 220 g [·[ | soluja/1 litra puskuria). Suspensio sentrifugoitiin 5500 x g 45 minuuttia +4 °C:ssa.

• · · 25 Pesu Na-fosfaattiliuoksella toistettiin kerran. Solusakka punnittiin ja säilytettiin -70 Γ\: °C:ssa yön yli. Pakastettu sakka, jossa oli osittain särkyneitä soluja, sulatettiin ja • ·

**;;/ suspendoitiin (25 mg/ml) 20 mM Tris-HCI-puskuriin, pH 8,5, joka sisälsi 0,5 mM

*···: EDTA, ravistellen 2 minuuttia. Suspensio sentrifugoitiin 26 000 x g 30 minuutin ajan +4 °C:ssa ja Tris-HCI-EDTA pesu toistettiin kerran. Saatu solusakka 30 punnittiin. Viimeisen pesun jälkeen solusakka suspendoitiin (35 mg/ml) ravistellen

(200 rpm/minuutti, yön yli, huoneenlämmössä) lyysipuskuriin (6 M GuHCI-20 mM

: ,*·. Na-fosfaatti-0,5 M NaCI, pH 8,0), jolloin kaikki loput kokonaiset £. coli solut • * · *.‘V särkyvät ja inkluusiokappaleet saadaan liukoisiksi. Suspensio sentrifugoitiin *"** (26,000 x g, 45 minuuttia, huoneenlämmössä), sakka heitetään pois, jolloin ·· : *.. 35 rekombinanttiproteiini jää liukoisena supernatanttiin. Lopuksi supernatantti ·:··: suodatetaan 45 pm suodattimen läpi, jotta päästään varmasti eroon kaikista solurippeistä.

119373 26 B. Saostus isoelektrisessä pisteessä (pl)

Poron BMP-4-rekombinanttiproteiini, jota ekspressoitiin pETrd4/116-plasmidista Escherichia coli Origami B (DE3) tai Rosetta (DE3) -soluissa, seostettiin 5 isoelektrisessä pisteessään pH 8,12. Isoelektrinen piste määritettiin tietokonelaskennan avulla poron rekombinantin BMP-4:n aminohapposekvenssistä (kuva 6). Sakka kerättiin sentrifugoimalla (12 000 x g, 30 min, huoneenlämmössä) ja suspensoitiin lyysipuskuriin (6 M GuHCI - 20 mM Na-fosfaatti - 0,5 M NaCI; pH 8,0).

10 C. immobilisoitu metalliaffiniteettikromatografia (IMAC)

Escherichia coli -solut lyysattiin heiluttelemalla 6 M GuHCI - 20 mM Na-fosfaatti -0,5 M NaCI; (pH 8,0) liuoksessa kahden tunnin ajan ja suodatettiin 45 pm 15 suodattimen läpi. IMAC-menetelmässä käytettiin valmiiksi pakattuja HiTrap

Chelating HP -affiniteettipylväitä (Amersham Pharmacia Biotech). Pylväät varattiin Co2+-, Cu2+- tai Ni2+-ioneilla valmistajan ohjeen mukaan. rdBMP-4-proteiinin päässä olevaa His-Tag-epitooppia käytetettiin hyväksi siten, että His-tag-epitooppi sitoutui metalli-ioneilla varattuun pylvääseen ja E. colista peräisin olevat solujätteet 20 virtasivat pylvään läpi. Suodatettu, pesujen jälkeinen supernatantti saatettiin pylvään pintaan pylväsmatriksin varaamisen jälkeen. Suurin osa epäpuhtauksista : V: poistettiin pesemällä pylvästä lyysipuskurilla (6 M GuHCI - 20 mM Na-fosfaatti - 0,5 • M NaCI, pH 8,0) 5-10-kertaisella pylvään tilavuudella. Toinen pesukerta, ·*· ·

määrältään 5-10-kertainen pylvään tilavuus, suoritettiin lyysipuskurilla, jossa 6 M

: .·] 25 GuHCI:n tilalla oli 6 M urea. Rekombinantti poron BMP-4 eluoitiin HiTrap pylväästä • · · "V käyttäen pH-gradienttia pH.sta 7,0 pH:hon 4,0 (6 M urea - 20 mM Na-fosfaatti - 0,5 M NaCI). Fraktiot analysoitiin SDS-PAGE:lla ja puhtaimmat rdBMP-4 sisältävät ψ · ***** fraktiot yhdistettiin rekombinanttiproteiinin laskostamista varten (kuva 8).

30 D. Rekombinantin rdBMP-4:n kypsän osan laskostaminen ··· • · • · ··· : !·. BMP-4-fraktiot, jotka oli analysoitu SDS-PAGE:lla, yhdistettiin ja dialysoitiin vettä *···! vastaan. Dialyysissä saostunut proteiini kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin • · '1* inkuboiden kaksi tuntia 25 °C:ssa 8 M urea - 0,1 M Tris/HCI, pH 8 -liuoksessa, joka I *·· 35 lisäksi sisälsi 100 mM DTT, 1 mM EDTA. pH laskettiin pH:hon 3-4 lisäämällä tipoittain 1 M HCI-liuosta. DTT poistettiin täysin dialysoimalla kaksi tuntia 25 °C:ssa 6 M urea-10 mM HCI -liuosta vastaan. Dialyysiä jatkettiin +4 °C:ssa yön yli 6 M ureaa vastaan. Rekombinantin rdBMP-4:n laskostuminen suoritettiin 119373 27 kaksivaiheisessa dialyysissä. Ensimmäinen dialyysiliuos oli 20 mM Tris-HCI - 150 mM NaCI - 3 M urea (pH 7,5). Dialyysipuskuri vaihdettiin neljä kertaa kahden tai kolmen päivän aikana. Toisessa vaiheessa kaikki suolat poistettiin perinpohjaisella vesidialyysillä. Dialyysivesi vaihdettiin ainakin kuusi kertaa kahden, kolmen päivän 5 aikana. Näyte, josta suolat oli poistettu, sentrifugoitiin ja pelletti kuivattiin lyofilisoimalla. Tässä vaiheessa BMP-4:n puhtausaste oli 75 % ja se laskostui 50-prosenttisesti määritettynä ei-pelkistävällä SDS-PAGE:lla. Poron rekombinantin BMP-4:n laskostuneen dimeerin määrä mitattiin densitometrillä Coomassie Brilliant Blue -värjätyistä geeleistä.

10

Esimerkki 4. Poron rekombinantin BMP-4:n kypsän osan biologisen aktiivisuuden testaaminen

Lyofilisoidun, poron BMP-4-rekombinanttiproteiinin biologinen aktiivisuus testattiin 15 implantoimalla hiiren reisilihaksen taskuun vähemmän kuin 1 mg rekombinattiproteiinia absorboituna Lyostrypt® kollageenihuopaan tai gelatiinikapseliin. Kontrollina toimi BSA. Takajalat röntgenkuvattiin ja implantaatiokohdat leikeltiin ja fiksattiin 10 % neutraalissa formaliiniiiuoksessa. Fiksatut implantit leikattiin 4 pm:n leikkeiksi ja värjättiin hematoksyliini-20 eosiiniliuoksella. Leikkeitä tarkasteltiin valomikroskoopilla. Uuden luun muodostus evaluoitiin röntgenkuvauksen avulla määrittämällä pinta-ala ja optinen tiheys. Röntgenkuvat siirrettiin tietokoneelle käyttäen optista skanneria (HP Scan Jet, • · « ·*.*. Hewett-Packard, USA). Ektooppisen ja ortotooppisen uuden luun muodostuminen T i arvioitiin röntgenkuvissa nähtävän kalsifioidun kudoksen pinta-alan suhteen (mm2) / / 25 käyttäen Scion Image Beta 4.02 (Scion Corp., USA) -ohjelmaa. Tietyn alueen • * · ;·: ·* keskimääräinen optinen tiheys (mmAl) mitattiin samalla laitteella. Optisen tiheyden : kalibrointi suoritettiin käyttäen alumiinista valmistettua levyä (AI), jossa oli 0,25 • · · mmAl askelmat, ja jonka kalibroitu tiheys antoi vaihtelualueen 4 mmAl asti.

: 30 Esimerkki 5: Poron BMP-4-rekombinanttiproteiinin kypsän osan ekspressio

Rapid Translation System RTS 500:ssa *♦· • · • · * A. RTS 500 ekspressiovektorin pIVEX2,4c (Roche) rakentaminen φ · • · * · · 35 Poron BMP-4:n normaalin kypsän osan monistaminen, PCR-tuotteen ·:··· puhdistaminen, ligaatio pGEM-T®-vektoriin (kuva 1), transformaatio kompetentteihin Escherichia coli TOP10 F -soluihin (Invitrogen), plasmidin puhdistaminen ja inserttien sekvensointi tehtiin muutoin samoin kuin on kuvattu 119373 28 esimerkissä 1, paitsi poron BMP-4 kypsän osan monistamiseen käytettiin seuraavia alukkeita: (5’-CCGCGGTAGCCCCAAGCATCACCCACAGAGG-3’) ja (3’-GGATCCTAGCGGCACCCACATCCCTCCACTAC-5’) (taulukko 2) ja konstruktia kutsuttiin nimellä pGEMrd4/116/2 (pMU5/2) (kuva 1). Konstruktin sekvensoinnissa käytetyt alukkeet olivat: (5’-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3’) ja (3’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-5’) (taulukko 4). Monistamiseen käytetyissä alukkeissa oli Ksp I (Sac II) -restriktioentsyymin katkaisukohta 5’-päässä ja Bam Hl -katkaisukohta alukkeen 3’-päässä, ja näitä kohtia käytettiin hyväksi poron BMP-4 kypsän osan subkloonauksessa. Plasmidit pGEMrd4/116/2 ja pIVEX 2,4c (0,5 pg) digestoitiin käyttäen 10 mM Tris*HCI, 10 mM MgCI2 1 mM ditioerytritolia, pH 7 (SuRE Cut Buffer L, Roche) -puskuria ja kutakin entsyymiä 1 U/μΙ, kokonaistilavuuden ollessa 10 pl. Restriktioentsyymit inaktivoitiin ennen ligaatiota ja ligaatioreaktio suoritettiin kuten on esitetty esimerkissä 2, osassa A. Uutta konstruktia kutsutaan nimellä plVEXrd4 (pMU500) (kuva 4).

B. Rekombinantti-BMP-4:n kypsän osan tuottaminen RTS 500 -systeemissä RTS 500 reaktio suoritettiin noudattaen Rapid Translation System RTS 500 E. coli Template Kitin ohjeita. Rekombinanttiproteiinin aminohapposekvenssi ja vastaava nukleotidisekvenssi on esitetty kuvassa 7.

Tulokset • · · • · • · • · · • * · ! Poron BMP-4:n osittaisen cDNA:n kloonaus • · * • · · • · • · • · ·

Nukleotidisekvenssi, joka saatiin ABI Prism -reaktioista, analysoitiin tietokoneen

:·ί ; avulla ja sitä verrattiin jo tunnettuihin BMP-sekvensseihin. Uusi kloonattu cDNA

··· osoittautui homologiavertailujen perusteella kaikkein homologisimmaksi peuran BMP-4:n (nukleotidihomologia 99 % ja aminohappohomologia 99 %) ja hiiren, rotan ihmisen ja koiran BMP-4:n kanssa (aminohappohomologia 98 %). BMP-4-proteiinien nukleotidi- ja aminohappohomologit eri nisäkkäiden välillä on esitetty • · · . *. taulukossa 1.

• · « • · · ··· · • · · • * *j·* Poron BMP-4:n kypsän osan ekspressointi • · • * • · * ····: Ensiksikin, poron BMP-4 kypsä osa kloonattiin pTrcHis2A-vektoriin, transformoitiin E. coli TOP 10 -soluihin, jolloin saatiin pTrcrd4/116-vektori. Rekombinanttiproteiinin ekspressio indusoitiin IPTG:llä. Rekobinanttiproteiinin tuotto varmistettiin SDS- 119373 29 PAGEilla, mutta induktiota ei havaittu. Tämän arveltiin johtuvan monista sellaisista rdBMP-4:n kodoneista, jotka ovat harvoin käytössä E. colissa. On myös mahdollista, että indusoitumattomuus johtunee korkeasta GC-pitoisuudesta rdBMP-4:n proteiinia koodaavan alueen alussa (ensimmäisten 10 kodonin GC-5 pitoisuus on 70 %).

Näiden syiden vuoksi päätettiin kokeilla toisenlaista vektorisysteemiä ja erilaista E. coli -kantaa. pET22b(+) (Novagen), jossa on His6-tag ja pelB-johtoalue, valittiin uudeksi ekspressiovektoriksi ja Rosetta (DE3) (Novagen) ja Origami B (DE3) 10 (Novagen) uusiksi E. coli -kannoiksi. Poron BMP-4:n kypsä osa kloonattiin pET22b(+)-vektoriin ja uutta plasmidia kutsuttiin nimellä pETrd4 ja sekä Rosetta (DE3) että Origami B (DE3) -solut transformoitiin tällä vektorilla. Analyysit SDS-PAGE:lla osoittivat, että rdBMP-4 proteiini yliekspressoitui. Ekspressiokokeiden perusteella pääasiassa Rosetta (DE3) -soluja, jotka sisälsivät pETrd4-vektorin, 15 käytettiin tuottamaan rdBMP-4 proteiinia.

rdBMP-4-proteiinin puhdistaminen

Poron rdBMP-4-rekombinanttiproteiinia yliekspressoitiin E. colissa. Pesujen, 20 isoelektriseen pisteeseen perustuvan saostuksen ja inkluusiokappaleiden solubilisaation jälkeen rekombinantin poron rdBMP-4:n pitoisuus oli 85 %.

• · • · · • · ·

Seuraava puhdistusvaihe oli immobilisoitu metalliaffiniteettikromatografia (IMAC). T | Näyte eluoitiin pylväästä käyttäen pH-gradienttia ja rdBMP-4-proteiinin puhtaus oli / / 25 vähintään 75 % määritettynä SDS-PAGE:lla (kuva 8). Eristetyn rdBMP-4 proteiinin • t · j··· kypsän osan molekyylipaino oli 17 800 Da määritettynä elektroforeettisen ί·: : liikkuvuuden perusteella SDS-PAGE:lla pelkistävissä olosuhteissa.

• · · • · • · • · · rdBMP-4-proteiinin laskostaminen ja aktiivisuuden testaaminen : :*: 30 • ·

Denaturoituneen rdBMP-4-proteiinin in vitro -laskostuminen kvantitoitiin tn . *. mittaamalla laskostunut dimeeri Coomassie Brilliant Blue -värjätyiltä geeleiltä • · « densitometrisesti. Ei-pelkistävistä SDS-PAGE geeleistä määritetty proteiinin • · *···’ laskostuminen oli 50 %.

* • * _ _ 35 ·:··; rdBMP-4-proteiinin osteoinduktiivinen aktiivisuus lisääntyi annoskokoa suurennettaessa (taulukko 2). Poron rdBMP-4-rekombinanttiproteiini osoittautui kaikilla testatuilla konsentraatioilla huomattavasti tehokkaammaksi luun muodostuksen indusoijaksi kuin ihmisen vastaavaa.

30 1 1 9373 Tämä keksintö on kuvattu korostaen joitakin edullisia toteutusmuotoja ja 5 sovelluksia. Kuitenkin alan ammattilaisille on ilmeistä, että variaatioita esiintuoduista toteutusmuodoista voidaan tehdä ja käyttää ja, että keksintöä voidaan käyttää seuraavien vaatimusten puitteissa muullakin tavalla kuin mitä on tässä täsmällisesti esitetty.

• » • · 1 • · · • · • · • · · • · · ··· · • · • · · * ti • · • ·

• · I

• · · • M · • · • · · • · · ··· · • · · • · • · • · · • · · • · · • · · *·1 • · • · • · · • · • · · • · · «·· 1 * · · • · • · • 1 · • · • · • ·· t 3, 1 1 9373

SEQUENCE LISTING

<110> BBS-Bioactive Bone Substitutes Oy 5 <120> Bone morphogenetic proteins <130> OP10087 6 <160> 1 10 <170> Patentin version 3.1 <210> 1 <211> 116

15 <212> PRT

<213> Rangifer tarandus tarandus <400> 1 20 Ser Pro Lys His His Pro Gin Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys 15 10 15

Arg Arg His Ser Pro Tyr Vai Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp 20 25 30 25

Trp lie Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gin Ala Phe Tyr Cys His Gly Asp 35 40 45

Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala lie 30 50 55 60

Val Gin Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser lie Pro Lys Ala Cys 65 70 75 80 I i : 35 Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala lie Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu .1 I 85 90 95 • ♦ · ♦ · ♦ ·♦· · .·, : Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gin Glu Met Val Val Glu Gly ·. 1: 100 105 110 :40 *·1 1 Cys Gly Cys Arg :115 »«· · • · · • ♦ • · ··· • · · • · ♦ ··♦ ··· • » • · ··· • ♦ • · ♦ • · · *·« · ««· • · • · ··· • · · • · • ♦♦

Claims (19)

119373

1. Eristetty luun morfogeneettinen proteiini 4 (BMP-4), tunnettu siitä, että se sisältää konsensussekvenssin P-Q-R-A/S-R/K-K/R-K/N/R/L-N/K-K/R/S-N/H/S-C-

2. Morfogenetiskt protein 4 av ben enligt patentkrav 1, kännetecknat av att det innehäller konsensussekvensen P-Q-R-A/S-R-K-K/R-N/K-K/R-N/H-C-R-R-H-S/A-P.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen luun morfogeneettinen proteiini 4, tunnettu siitä, että se sisältää konsensussekvenssin P-Q-R-A/S-R-K-K/R-N/K-K/R-N/H-C-R-R-H-S/A-P. 10

3. Morfogenetiskt protein 4 av ben enligt patentkrav 1, kännetecknat av att det 5 innehäller aminosyrorna 6-21 av SEQ ID NO: 1.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen luun morfogeneettinen proteiini 4, tunnettu siitä, että se sisältää SEQ ID NO: 1 :n aminohapot 6-21.

4. Morfogenetiskt protein 4 av ben enligt patentkrav 1, kännetecknat av att det innehäller aminosyrorna 1-23 av SEQ ID NO: 1.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen luun morfogeneettinen proteiini 4, tunnet-15 tu siitä, että se sisältää SEQ ID NO: 1 :n aminohapot 1-23.

5. Morfogenetiskt protein 4 av ben enligt patentkrav 1, kännetecknat av att det innehäller en aminosyrasekvens av SEQ ID NO: 1.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen luun morfogeneettinen proteiini 4, tunnettu siitä, että se sisältää SEQ ID NO: 1:n aminohapposekvenssin.

5 R/K-R-H-S/A-P tai C-R/K-R-H-S/A-P-Y-V-D-F-S-D.

6. Isolerad DNA-molekyl, kännetecknad av att den kodar ett morfogenetiskt protein av ben enligt nägot av patentkraven 1-5.

6. Eristetty DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa jonkin patenttivaati muksen 1-5 mukaista luun morfogeneettistä proteiinia. • · • · * • · · • ·

7. Nukleotidvektor, kännetecknad av att den innehäller en isolerad DNA-molekyl enligt patentkrav 6.

7. Nukleotidivektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 6 mu-kaisen eristetyn DNA-molekyylin. 25 • · i *:**.·. 8. Rekombinantti-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuk- * * * sen 7 mukaisen nukleotidivektorin. • · • f· . . 9. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patentti- · · *·*·* 30 vaatimuksen 1-5 mukaisen luun morfogeneettisen proteiinin. • • · • · · • ·*; 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, ··· · .··*. että se sisältää kyseistä luun morfogeneettistä proteiinia homodimeerinä, tai hete- ,· . rodimeerinä jonkin toisen luun morfogeneettisen proteiinin kanssa. • · · *·" 35

8. Rekombinant värdcell, kännetecknad av att den innehäller en nukleotidvek- 15 tor enligt patentkrav 7.

9. Farmaceutisk sammansättning, kännetecknad av att den innehäller ett mor- . . fogenetiskt protein enligt nägot av patentkraven 1-5. • « · • · · * ·

10. Farmaceutisk sammansättning enligt patentkrav 9, kännetecknad av att den innehäller berörda morfogenetiska protein av ben som homodimer, eller som hete- 20 rodimer tillsammans med ett annat morfogenetiskt protein av ben. • ·· · • • · ·

11. Farmaceutisk sammansättning enligt patentkrav 9 eller 10, kännetecknad av • · *···1 att den dessutom innehäller ett annat morfogenetiskt protein av ben, en epidermal tillväxtfaktor, en fibroblastisk tillväxtfaktor eller en transformerande tillväxtfaktor. · • · « • · · • · ·***. 12. Användning av ett morfogenetiskt protein av ben enligt nägot av patentkra- • · · .·. 25 ven 1-5 vid framställning av ett läkemedel, med vilket man värdar störningar i ben, • · · 'll·' brosk, leder eller tänder, varvid regeneration, reparation eller tillväxt av dessa är • · *···1 önskvärd. ·· · • 1 · • ·

11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi jonkin toisen luun morfogeneettisen proteiinin, epider-maalisen kasvutekijän, fibroblastisen kasvutekijän tai transformoivan kasvutekijän. 'N 119373

12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisen luun morfogeneettisen proteiinin käyttö valmistettaessa lääkeainetta, jolla hoidetaan luuhun, rustoon, jänteisiin tai hampaisiin liittyviä häiriöitä, joissa niiden regeneraatio, korjaus tai kasvu on toivot- 5 tavaa.

13. Användning av ett morfogenetiskt protein av ben enligt nägot av patentkra- • · ven 1-5 vid framställning av ett läkemedel, med vilket man värdar cancer, fibromy-30 algi, psoriasis och andra dermatologiska störningar, och reumatiska besvär. 119373

13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisen luun morfogeneettisen proteiinin käyttö valmistettaessa lääkeainetta, jolla hoidetaan syöpää, fibromyalgiaa, psoriasista ja muita dermatologisia häiriöitä, ja reumaattisia vaivoja. 10

14. Osteogent medel, kännetecknat av att det innehäller ett morfogenetiskt protein av ben enligt nägot av patentkraven 1-5.

14. Osteogeeninen väline, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisen luun morfogeneettisen proteiinin.

15. Osteogent medel enligt patentkrav 14, kännetecknat av att det innehäller berörda morfogenetiska protein av ben som homodimer, eller som heterodimer till- 5 sammans med ett annat morfogenetiskt protein av ben.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen osteogeeninen väline, tunnettu siitä, että 15 se sisältää kyseistä luun morfogeneettistä proteiinia homodimeerinä, tai heterodi- meerinä jonkin toisen luun morfogeneettisen proteiinin kanssa.

16. Osteogent medel enligt patentkrav 14 eller 15, kännetecknat av att det dessutom innehäller ett annat morfogenetiskt protein av ben, en epidermal tillväxt-faktor, en fibroblastisk tillväxtfaktor eller en transformerande tillväxtfaktor.

16. Patenttivaatimuksen 14 tai 15 mukainen osteogeeninen väline, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää jonkin toisen luun morfogeneettisen proteiinin, epider- 20 maalisen kasvutekijän, fibroblastisen kasvutekijän tai transformoivan kasvutekijän.

17. Osteogent medel enligt vilket som heist av patentkraven 14-16, känneteck-10 nat av att det innehäller en biologiskt kompatibel matris.

17. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 14-16 mukainen osteogeeninen väline, • * : .·. tunnettu siitä, että se sisältää biologisesti yhteensopivan matriksin. ··· · • · • · · • ♦ · :*.·] 25 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen osteogeeninen väline, tunnettu siitä, että • · ΓΥ kyseinen biologisesti yhteensopiva matriksi sisältää kalsiumfosfaattia, karboksime- Y.: tyyliselluloosaa tai kollageenia tai näiden yhdistelmiä. • · · • · ·

19. Menetelmä luun, ruston, jänteen tai hampaan muodostuksen indusoimiseksi :.v 30 in vitro, tunnettu siitä, että jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisella luun morfo- ··· geneettisellä proteiinilla käsitellään kyseistä luuta, rustoa, jännettä tai hammasta. « · • · · • · · • · .*··. Patentkrav • · • · · V\: 1. Isolerat morfogenetiskt protein 4 (BMP-4) av ben, kännetecknat av att det ·:··· 35 innehäller konsensussekvensen P-Q-R-A/S-R/K-K/R-K/N/R/L-N/K-K/R/S-N/H/S-C- R/K-R-H-S/A-P eller C-R/K-R-H-S/A-P-Y-V-D-F-S-D. 119373

18. Osteogent medel enligt patentkrav 17, kännetecknat av att den berörda kompatibla matrisen innehäller kalciumfosfat, karboximetylcellulosa eller kollagen eller kombinationer av dessa.

19. Förfarande för att inducera in vitro ben-, brosk-, led- eller tandbildning, kän-15 netecknat av att berörda ben, brosk, led eller tand behandlas med morfogenetiskt protein av ben enligt nägot av patentkraven 1-5. • · • ♦ « • · · • · • · • · · • ♦ · ··· · • · • · · • ·· • · • · • · · • · · *·· · • • · · * · · ··· · «·· • · • · ··· • · • · · • « « • ♦ ·»· • · • · ··· • · • · · • « · • · ··· • · • · ··· ........ ·· · a · · • · • · 1