FI116030B

FI116030B - Paperi- ja kartonkikoneiden termofiilisten mikrobien biofilminmuodostuksen esto

Info

Publication number: FI116030B
Application number: FI20021986A
Authority: FI
Inventors: Mirja Salkinoja-Salonen; Pentti Vaeaetaenen; Paeivi Tammela; Pia Vuorela; Marko Kolari; Hanna Laatikainen
Original assignee: Kemira Oyj
Priority date: 2002-11-06
Filing date: 2002-11-06
Publication date: 2005-09-15
Also published as: CN1713821A; EP1558088A1; WO2004040983A1; FI20021986A0; FI20021986A; BR0315197A; US20060120916A1; CA2503648A1; RU2331193C2; RU2005116973A; CN100333645C; AU2003277489A1; ZA200503514B

Description

116030

Paperi- ja kartonkikoneiden termofiilisten mikrobien biofilminmuodos-tuksen esto - Inhibering av biofilmbildning av termofila mikrober i pap-pers- och kartongmaskiner 5 Keksintö koskee menetelmää paperi-ja kartonkikoneiden pinnoilla olevan, termofiilisten bakteerien ja/tai homeiden muodostaman ja prosessia häiritsevän biofilmin torjumiseksi.

Keksinnön alue ja tunnettu tekniikka

Paperikoneympäristö on otollinen erilaisten mikro-organismien kasvulle. Paperiko-10 nevesi tarjoaa mikrobeille niiden tarvitsemia ravinteita, sopivan pH:n (4-9) ja lämpötilan (45-60 °C). Mikrobeita tulee prosessiin raaka-aineiden, kuten kuitujen, kemikaalien ja veden mukana. Vapaana uivat mikro-organismit eivät ole prosessille yhtä haitallisia kuin paperikoneen pinnoille tarttuvat, biofilmejä muodostavat mikrobit. Biofilmien pesu paperikoneen pinnoilta on vaikeaa ja vaatii usein vahvoja 15 kemikaaleja. Biofilmissä elävät mikrobit ovat kestävämpiä biosidejä vastaan kuin vapaana uivat mikrobit. Irrotessaan pinnoilta spontaanisti biofilmikasautumat saattavat tukkia sihtejä, aiheuttaa ratakatkoja sekä heikentää paperin laatua aiheuttaen siihen esim. reikiä tai täpliä. Ilman biofilmikasaumia paperikoneiden ajettavuus ja ;'; siten tuottavuus olisi nykyistä selvästi parempi.

: 20 Uusimpien tutkimusten mukaan (M. Kolari, J. Nuutinen ja M.S. Salkinoja-Salonen, ·:··;' Mechanism of biofilm formation in paper machine by Bacillus species: the role of . . : Deinococcus geothermalis, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology .· ·. (2001) 27, sivut 343-351) biofilminmuodostuksessa eräs keskeinen tekijä on ns.

primäärinen tarttujabakteeri (Deinococcus geothermalis), mikä voi aloittaa biofil-25 minmuodostuksen. Tätä bakteeria esiintyy melko yleisesti paperikoneilla. Estämällä tämän bakteerin tarttuminen teräspintoihin pyritään siis vähentämään paperikoneiden ajettavuudelle haitallista biofilminmuodostusta.

:‘ Patenttijulkaisusta US 6 267 897 B tunnetaan menetelmä biofilminmuodostuksen • ; estämiseksi kaupallisissa ja teollisissa vesijärjestelmissä lisäämällä tähän järjestel- 30 mään eteeristä öljyä. Esimerkkeinä vesijärjestelmistä mainitaan mm. jäähdytysvedet, elintarviketeollisuuden vedet, massa- ja paperitehtaiden järjestelmät, olutpanimoiden pastöroimislaitteet, makeaveden järjestelmät jne. Tässä patenttijulkaisussa ; ‘' kuvataan koetta, jossa tutkittiin paperitehtaissa yleisesti esiintyvän limaa muodosta van mesofiilisen bakteerin Sphaerotilus natans biofilminmuodostusta lasipinnoille.

116030 2

Koetulokset osoittavat, että eukalyptusöljy, kanelipuun öljy ja teepuun öljy estävät tutkitun bakteerin kiinnittymistä lasipinnoille tehokkaammin kuin vertailuyhdistee-nä käytetty etyleenioksidin ja propyleenioksidin kopolymeeri. Tämän patenttijulkaisun mukaan erityisen edullisia eteerisiä öljyjä ovat eukalyptusöljy ja kanelipuun öl-5 jy, jotka ovat kaupallisia rohdosvalmisteita, jotka tunnetusti valmistetaan höyrytis-laamalla. Muut tässä patenttijulkaisussa luetellut eteeriset öljyt valmistetaan höyry-tislaamalla tai puristamalla.

Mainittua mesofiilista bakteeria Sphaerotilus natans ei esiinny nykyaikaisissa, kuumissa paperikoneissa, koska se ei pysty kasvamaan lämpötiloissa 50-60 °C. Sen si-10 jaan todellinen ongelmabakteeri tämän päivän paperikoneissa on korkeissa lämpötiloissa kasvava Deinococcus geothermalis (max. 56-57 °C). Muita termofiilisia on-gelmamikrobeja ovat tarttujabakteerit Meiothermus silvanus, Burkholderia cepacia ja Thermomonas sp. sekä tarttujahome Aspergillus fumigatus.

Esillä olevalla keksinnöllä pyritään nimenomaan estämään sellaista biofilminmuo-15 dostusta, jossa oleellisena osana ovat tämän päivän paperikoneiden korkeissa lämpötiloissa (50-60 °C) kasvavat termofiiliset ongelmamikrobit.

Keksinnön tarkoituksena on näin ollen aikaansaada menetelmä ja siinä käytettävä aine, joilla voidaan tehokkaasti estää termofiilisten mikrobien biofilminmuodosusta paperi- tai kartonkikoneiden pinnoille.

20 Keksinnön selostus ..,.: Nyt on keksitty, että ympäristöystävällinen, luonnonmukainen ja tehokas biofilmin- torjuntamenetelmä on löydettävissä luonnonkasvien sisältämistä yhdisteistä, joista ! useilla on kyky estää mikrobien kasvua. Tällaiset yhdisteet ovat elinehto kasvien selviytymiselle luonnossa. Suoritettiin laboratoriotutkimuksia, joihin valittiin 110 25 alunperin kasveista eristettyä yhdistettä tai niiden synteettistä johdannaista, joilla on muissa tutkimuksissa havaittu biologisia vaikutuksia, sekä 92 suomalaista luonnon-kasviuutetta. Näistä tehokkaimpien aineiden käytön avulla voidaan vähentää termofiilisten bakteerien biofilminmuodostusta, ja tätä kautta on mahdollista lisätä paperi-ja kartonkikoneiden tuotantotehokkuutta. Suoritettujen laboratoriotutkimusten mu-y 30 kaan tehokkaimmat aineet vähentävät biofilmimikrobien tarttumista pintoihin parhaimmillaan yli 90 %.

. . Keksinnön mukaisesti on näin saatu aikaan menetelmä, jonka avulla voidaan estää paperi- ja kartonkikoneiden tunnistettujen termofiilisten (lämpöä suosivien) tarttu-jamikrobien (bakteerien ja/tai homeiden) biofilmien muodostuminen paperi- tai kar- 116030 3 tonkikoneiden pintoihin ja/tai jonka avulla voidaan poistaa jo muodostuneet, haitalliset biofilmit mainituilta pinnoilta. Tälle menetelmälle on tunnusomaista, että paperi- tai kartonkikoneiden kiertovesiin lisätään termo f Hiisiin tarttujamikrobeihin tehoava pitoisuus ainakin yhtä kasvista eristettyä puhdasainetta, joka on fenolinen yh-5 diste, edullisesti fenolisen hapon esteri, tai ainakin yhtä kasviuutetta, joka on peräisin jostakin seuraavista kasveista tai kasvinosista: kurttulehtiruusu, maitohorsma, salvia tai mesiangervo tai mainitun puhdasaineen ja mainitun kasviuutteen seosta.

Tässä yhteydessä puhdasaineella tarkoitetaan kasvista eristettyä luonnonainetta, joka on fenolinen yhdiste ja jolla tulee olla kyky estää termofiilisten mikrobien bio-10 filmien muodostusta pintoihin ja/tai kyky poistaa tällaiset biofilmit pinnoilta. Vastaavasti kasviuutteella tulee olla kyky estää termofiilisten mikrobien biofilmien muodostusta pintoihin ja/tai kyky poistaa tällaiset biofilmit pinnoilta. Biofilmin vähentymän tulee olla vähintään 50 %, edullisesti vähintään 70 % ja edullisimmin vähintään 90 %.

15 Mainittu kasviuute saadaan uuttamalla kasvia tai kasvinosaa liuottimen tai liuotin-seoksen avulla. Edullinen liuotin on metanoli. Muita uuttamiseen sopivia liuottimia ovat asetoni, etanoli, heksaani ja kloroformi.

Mainittu kasvista eristetty puhdasaine on fenolinen yhdiste, kuten fenolisen hapon esteri. Edullinen fenolisen hapon esteri on gallushapon alkyyliesteri, joka edullisesti 20 on oktyyligallaatti tai lauryyligallaatti tai niiden seos.

; Puhdasainetta tai kasviuutetta tai näiden seosta lisätään paperi- tai kartonkikoneen ’· ‘ kiertovesiin tuotepitoisuuteen, mikä voi olla 1-1000 ppm, edullisesti 5-200 ppm ja ’ ' edullisimmin 10-100 ppm laskettuna puhdasaineen tai kasviuutteen kuivapainosta.

• < I

.'". Puhdasainetta tai kasviuutetta tai niiden seosta voidaan annostella paperi- tai karton- 25 kikoneen kiertovesiin joko jaksoittain, edullisesti 2-8 kertaa vuorokaudessa, tai yh-: tenä kerta-annoksena vuorokaudessa. Näitä aineita tai niiden seoksia voidaan annos- telia myös suurina annoksina 500-5000 ppm (laskettuna kuiva-aineena) säiliöön, •; * ’ sen pintojen eri tarttujamikrobien irrottamiseksi ns. shokkiannostelun avulla.

.··[ Keksinnön mukaisesti voidaan käyttää mainituista kasveista valmistettuja raaka- “ ‘ 30 uutteita tai näistä raaka-uutteista erotettuja, tehokkaimpia komponentteja.

. · · ·. Keksintö koskee myös mainitun, kasvista eristetyn puhdasaineen tai mainitun kas viuutteen tai näiden seoksen käyttöä paperi- tai kartonkikoneiden termofiilisten tarttujamikrobien (bakteerien ja/tai homeiden) biofilminmuodostuksen estämiseksi pa- 116030 4 peri- tai kartonkikoneiden pinnoille ja/tai tällaisten biofilmien poistamiseksi mainituilta pinnoilta.

Keksintöä kuvataan seuraavassa tarkemmin laboratoriotutkimusten ja esimerkkien avulla.

5 Suoritetut tutkimukset 1. Puhdasaineiden kyky estää tarttujabakteerien biofilminmuodostusta

Puhdasaineiden vaikutusta paperikoneilta eristettyjen tarttujabakteerien Deinococ-cus geothermalis E50051, Burkholderia cepacia F28L1, Thermomonas sp. 11306 ja Meiothermus silvanus R2A-50-3 biofilmin muodostukseen tutkittiin 96-kuoppale-10 vytestillä (polystyreeninen kuoppalevy, soluviljelylaatu, hydrofiilinen). Bakteerit oli siirrostettu maljoilta 1 vrk aiemmin ravintoliemiputkiin ja kasvatettu ravistelussa 45 °C:ssa. Aluksi kuoppiin pipetoitiin 2,5 μΐ puhdasainelaimennosta (liuotettu di-metyylisulfoksidiin, DMSO) kahtena eri pitoisuutena. Tämän jälkeen lisättiin bak-teerisuspensiota, joka oli laimennettu n. 2 %:ksi R2-ravintoliemellä (pH 7) 15 250 μΐ/kuoppa. R2-liemi on synteettinen kasvualusta, joka soveltuu hyvin paperi- konetarttujien kasvatukseen. Puhdasaineiden loppupitoisuudet kuoppalevyjen kaivoissa olivat 25 pmol Γ1 tai 250 pmol f1. Levyjä inkuboitiin 45 °C:ssa ravistelussa 160 rpm 17-18 h.

: V Kasvatuksen jälkeen kuoppalevyt tyhjennettiin, huuhdeltiin huolellisesti hanaveden ·:·. 20 avulla, ja kuoppiin lisättiin 0,1 % SDS-liuosta (anioninen tensidi) 280 μΐ/kuoppa.

Levyt laitettiin takaisin ravistelijaan 1 tunniksi. Täten tuloksissa näkyvät sekä sellaiset aineet, jotka estivät biofilmin muodostusta, että sellaiset, joiden vaikutuksesta . muodostuva biofilmi oli niin löyhärakenteinen, että se irtosi pesussa, joka ei nor maalisti vaikuta ko. tarttujabakteerien biofilmeihin. SDS-pesun jälkeen levyt huuh-25 deltiin hanaveden avulla. Biofilmit värjättiin kristalliviolettiliuoksella ja huuhdeltiin jälleen. Tulosten lukua varten biofilmiin sitoutunut väri liuotettiin 96 % etanoliin ja kuopissa olevien liuosten absorbanssit mitattiin ELISA-lukijan avulla aallonpituu-:’ della 595 nm. Vertaamalla tuloksia pelkällä DMSO:lla käsiteltyihin kuoppiin voitiin : ’ laskea biofilminestoprosentti kullekin puhdasaineelle.

30 Esimerkki 1

Kaikkiaan puhdasaineita tutkittiin 110 kpl. Taulukkoon 1 on koottu ne yhdeksän puhdasainetta, joilla oli voimakas biofilminestovaikutus useammalle kuin yhdelle 116030 5 tarttujabakteerikannalle (biofilmin vähentymä yli 50 % useammalla kuin yhdellä testatuista kaimoista).

Kolmella puhdasaineella (lauryyligallaatti, oktyyligallaatti ja nordihydroquaiareetti-happo) oli laajakirjoista biofilminestotehokkuutta, sillä ne vähensivät kaikkien nel-5 jän eri tarttujabakteerin biofilmin muodostusta pitoisuudessa 250 pmol Γ1. Gallaatit, erityisesti lauryyligallaatti, olivat tehokkaita myös pitoisuudessa 25 pmol Γ1. Lau-ryyligallaatin molekyylipaino on 338,45 g mol'1 eli aineella oli laajakirjoista biofil-minestotehoa pitoisuudessa 8,5 mg Γ1 (= 8.5 ppm). Oktyyli- ja lauryyligallaatti vähensivät biofilmibakteerien tarttumista pintoihin parhaimmillaan yli 90 % laihassa 10 ravintoliemessä (pitoisuudessa 250 pM Deinococcus geothermalista ja Burkholde-ria cepacia vastaan).

Monella puhdasaineella havaittiin selvä estovaikutus 250 pM pitoisuudessa, mutta pienemmän 25 pM pitoisuuden havaittiin puolestaan lisäävän biofilmin muodostusta (esim. kumariini 102, flavoni ja nordihydroquaiareettihappo taulukossa 1). Tämä 15 on tulkittavissa siten, että näillä aineilla 25 pM pitoisuudessa ei ole vielä riittävän suuri tehoainepitoisuus estämään biofilmin muodostusta, mutta riittää tekemään vapaana uivan kasvumuodon epäsuotuisaksi, ja siten saattaa edistää bakteerien hakeutumista biofilmiin.

116030 6

Taulukko 1. Puhdasaineet, joilla oli tarttujabakteerien biofilmien estovaikutusta.

Puhdasaine Pitoisuus , ». , ·* ...i

Biofllminmuodostuksen vähcntymuproscntti ^ Tarttujabakteeri

Deinococcus Burkholderia Meiothermus Thermomonas _geothermalis cepacia_silvanus_sg._

Kumariini 102 250 97 -19 87 86 25 49 -20 -38 -57

Kumariini 106 250 99 -85 95 91 25 -16 -11 82 14 (-)-Epigallokatekiini gallaatti 250 -11 69 66 -16 25 -93 18 79 -27

Flavoni 250 24 -33 90 84 25 24 -6 -164 -56

Lauryyligallaatti 250 95 96 78 77 25 97 64 82 81 2'-metoksi-alfa-nafito- 250 75 -41 89 32 flavoni 25 11 -38 53 3

Nordihydroquaiarecttihappo 250 85 20 89 44 25 -23 -68 92 7

OktyyligallaaUi 250 94 99 85 71 25 96 -20 63 73

Silybiini (silymariini) 250 89 -121 93 -98 _25_18_-44_80_-9_ 1A595 -arvoista laskettuna, verrattuna pelkällä DMSO:lla käsiteltyihin kuoppiin Esimerkki 2 : : · 5 Esimerkin 1 parhaimmille biofilminestoaineille tehtiin lisätutkimuksia ottamalla tes- •: · tiin mukaan useampia bakteerikantoja sekä suorittamalla testaus myös ilman SDS- pesua. Mukaan otettiin paperikoneelta eristetyt, vielä tunnistamattomat tarttujabak-,· teerikannat E-lvk-R2A-l ja E-jv-CTYE3 sekä Aspergillus fumigatus-home G 3.1.

Vertailuaineena oli yleisesti käytetty biosidi Fennosan M9, jonka tehoaine on mety-10 leenibistiosyanaatti (9 %). Tulokset on esitetty taulukossa 2.

Gallaatit osoittautuivat tehokkaiksi myös uusia tarttujia vastaan. Ne tehosivat myös : ·. ilman SDS-pesua, mistä voidaan päätellä, että aineiden vaikutusmekanismina on biofilminmuodostuksen esto. Sekä lauryyli- että oktyyligallaati 11a oli tehoa vielä pi-' ' toisuudessa 25 μΜ useimpia testimikrobeja vastaan. Ne tehosivat myös vaikeasti 15 torjuttavia B. cepacia- ja Thermomonas-biofilmejä vastaan. Lauryyligallaatin teho oli R2-liemitesteissä yllättäen parempi pienellä kuin suurella pitoisuudella. Tämä • ;' saattaa johtua aineen huonosta liukoisuudesta R2-liemeen. Lauryyligallaatin teho pitoisuudessa 25 μΜ (8,5 ppm) oli miltei vertailuaineena olleen metyleenibistio-syanaatin (10 ppm) tasolla.

7 - 116030 o s

^I—I O

'n 'JO ("· _ -- ON (-5 o <N Ό »n ^ S o τΡ 11 —i

ro _ O

rl-, O 2 O

U ir, »n t"- m o -h C\) (N Ov »O OO VO - O 00

m rZ ON

λ S ^ ® ^ r?

^ ^ CS On On CO O oO

co H <N ON

Λ V

(/} ^ S o 2? rv "P ^ h- o oo ov en O' W m es oo ov ov erv Ov - c/5 ^ _____

ö i—1 _ O

H L —r—Or-H O o

S < ^CNg^OiO

e3 pci 04 ^ 0 O

:2 1 - 2 g ~ρ ώ *3 3 <ra ό — o o § <5 -g ^ i VO oo Ον Ον ^ 1—Ie -71¾ Co Cl -3 CS O 2 ly-, rt" Ό <n 00 VO 'P _ & S g § 8ovovov~«ng©gg« a :rt ^ P jg ! I 's sl s s a .s J^.Pus^'go 3 C- ·— i/-> m t~- rn oo oo 3 o 33 ra <u g ^ (Nimooos ov ov .£ _ o >, > JO o v, N_____o O ,—, o ;ra -C 3 -3 m _

m ^ 1 S’ 3 es vO ' D -Ρ• S O ._- g O ^ Ov Ov 1 1 .3 r~> Ov "S

c^^2.3 ό ~ ov

Sj^iu5q · — ce "3 3 t> o ST C« 33 IP -3 -g S 3 O Τ'.

•Sorag-^ -P 0 ov O

-io Ό _o g ^ S ov c/3 ^ o rt ζ rt o ^ *5 ,,* ees 3 ‘3 ^ "3 ro ^ c«c3-s;j-(sioosvoooev) n S ti ^ O C"- oo o rt _ oo _ en :Y O IS 01-----® <* jS g · c/3 P “ lor+ovme^vo :rt m ·;. ^ oo ra- ra- ^ ^ ® - :¾ o

0,-2-2 Λ U

' cg o e .3 -o e- ^ ov 3 £ , . ·— o o L- _, 4-i ra

' ' e -j io vo m m 2S

,· .5 QQ es^ovov il o rv P 5 ra -----m ov j» £ ra Cr, „ .2 3 § <N Ό rv S: s-* γΪη

^ ti G

e <4> _ _. S <5

O 1« o g'' "P <D

3 O o ^ <* rt % ^ §i) JQ rt ω

• > 3 ra- r- m tr, E

rt rv, rs ov ra- o σν ·— c

* · * _ ^ C

” ^ O β Ό C rt ’rt s -111,,2,1 in £ Ä Cd S — O ·Λ .Λ — O'

M 73 Hä --75¾ ir><D

S .Ϊ tg :|"oi < ^ « ä s 1 ss·!?; a , , · ^iiOCCTrCJ4(NÖ

Esimerkki 3 8 116030

Esimerkin 1 tehokkaimpien puhdasaineiden biofilminestovaikutus tutkittiin myös paperikonevesikasvatuksessa (viiravesi, lisätty tärkkelystä 1 g/1 ja hiivauutetta 300 mg/1, steriloitu, 250 μΐ/kuoppa, pH 7, siirros 2 %, kasvatus 48 h, 45 °C, 5 160 rpm). Tulokset on esitetty taulukossa 3. Oktyyli-ja lauryyligallaatti vähensivät biofilmimikrobien tarttumista pintoihin parhaimmillaan yli 90 % steriloidussa viira-vedessä (pitoisuudessa 25 μΜ Meiothermus silvanusta ja tarttujabakteeria E-jv-CTYE3 vastaan). Vaaditaan pidempi kasvatusaika, jotta tarttujabakteerit muodostaisivat biofilmiä paperikonevedessä. Niin puhdasaineiden kuin M9:n teho jäi vaati-10 mattomammaksi kenties juuri pidemmästä kasvatusajasta johtuen. Paperikoneympä-ristössä tätä ongelmaa ei ole, koska tehoainetta lisätään prosessiin säännöllisin väliajoin.

' I

t t » * s t 116030 9 m <ο (N s ιϊ m

(S) (N ^ ΓΗ n ^ O

o o Γ-Η ^ £ 2 2 °o O o fN , ON I NO NO (Ν'-h O----- o o 2 „ no m n 1/-) o1 f 1 1 2 ^ M ^ on oo ^

S N, —ON

2 £ 2 σ\ ^ [—( 1—l

21 V · 2 ^ ^ ^ OO '/N OO

QT) ^ 00 00 ON ON ON (2)--1 θ ώ o oo V) (N On Ö "7 N- (N 5° - g < jq^oooo

S CN O O

^ 0> Γ-H ON

:55 n> o

c2 >>^oor^oor-HO O ON

<L> '-r4 CN (N ΓΛ */T On ON (NON

'S ® ^

> —, ^ oo (N O , O gJ

2^ § S £ £ ^ ^ * ° ^ — e '> S r 2 o o. :a V) <D 5 c/j 04 ö4 o “ -o o o 2: S4 o 2 s; S m ΓΗ rf O oo o E o oo o ö Q . 2 ^ °0 °0 ^ ΟΝΟΝ O <N j= o > o 5 _ S ^ 2 g; -s λ J2 ur ^ 2J oo o - 'o ω S §< 'g N 7 °° ^ ~ .2 i? G _ö .2 ^ £ o_o« 'S =5 -c § S .¾ o Co -ti 3 > £ S ό g .£ >Γ~! C (U o "S c \>

Ti o ti s? O -S

·- Ώ TS 5 O Ό ,—. (N rt o »V ra cn o ή N_i ^ —h * _ O -g S- VQ -—^ r«-» CN on oo gfN Tl >1 oo o O X>------° C/3 • · "ϊ Ό ä tÄ O oo ^ ; : n o E ^ u-n tinoä :.: S|h — o ; : 5 I 11 2 oo 3 2 * Ä .2 >n γ-h 3

Q g « $ J

§2§o^on S m U ·€

:·, Ό .2 gnmooNO^ooNO ^ ur - CX

; ·δ m o __l_2_ § c : -S CO O 2 2

Λ CT UT 5 S

c/1 _ NO rt 2

-S -* tn 2 n m ON <N fc S

S ^ ^ ^ O ON £ £ 3 a t—i O' ^ * I ai S ^ _,o=s·^ V- S & __®_:_ 0 I 8 £ q , ® 2 rt g* ': ' w ö I C - -¾ £ £ -S ! Π o Ξ J > g cd *2 h Cl *·“ w 53 rrt · ^ h 2 SPm^o-.S·^ A i «j * · · » rt -js _2r >> co :s o 3 m o ’ "3 Oe^-T-S-cS-sC on _g 3 Äb^x-sllg ^ Is

c2 2Ö^Ögl?i S ^ H

; c·* ex — o e K .* <n ö 5 ~ <n

. ! '/N O

ίο 116030 2. Kasviuutteiden kyky estää tarttujabakteerien biofilminmuodostusta

Testimenetelmänä käytettiin edellä kuvattua 96-kuoppalevytestiä (polystyreeninen kuoppalevy, soluviljelylaatu, hydrofiilinen, R2-liemi 250 μΐ/kuoppa, pH 7, ravistelussa 160 rpm, 45 °C, 17-18 h). Tutkittavina paperikoneiden tarttujabakteereina oli-5 vat Deinococcus geothermalis E50051, Burkholderia cepacia F28L1, Thermo-monas sp. 11306 ja Meiothermus silvanus R2A-50-3. Kasviuutteiden (uutettu me-tanolilla) loppupitoisuudet kuopissa olivat 20 tai 200 mg Γ1. Kasvatuksen jälkeen levyt huuhdeltiin ja pestiin 0,1 % SDS:n avulla (anioninen tensidi) ravistelussa 120 rpm 1 h. Levyjen kuopat huuhdeltiin hanavedellä ja värjättiin kristalli violetilla. 10 Tulosten lukua varten biofilmiin sitoutunut väri liuotettiin 96 % etanoliin ja kuoppa-liuosten absorbanssit mitattiin ELISA-lukijalla aallonpituudella 595 nm.

Esimerkki 4

Edellä esitetyllä testimenetelmällä tutkittiin 92 kasviuutteen estovaikutusta tarttujabakteerien biofilminmuodostukseen. Taulukkoon 4 on koottu ainoastaan ne me-15 tanolin avulla valmistetut kasviuutteet (18 kpl), joilla oli estovaikutusta useammalle kuin yhdelle bakteerille. Parhaita kasviuutteita olivat ahosuolaheinän kukka, ranta-alpin kukka, nukkahorsman lehti, nukkahorsman kukka, kirjopillikkeen juuri, kurt-tulehtiruusun lehti, kurttulehtiruusun varsi, kurttulehtiruusun terälehti ja salvian lehti.

. · 20 Mielenkiintoisimpina kasveina nousivat esille kurttulehtiruusu, nukkahorsma ja sal- : ; : via, joilla oli laajakirjoisinta biofilmien estotehoa. Lisäksi kurttulehtiruusun ja nuk- ·:· kahorsman kaikilla tutkituilla maanpäällisillä osilla oli estotehoa. Kurttulehtiruusus- ;: ta tehdyt uutteet olivat ainoita, joilla oli estotehoa myös B. cepacia -biofilmeihin, . · . jotka osoittautuivat kaikkein vaikeimmin torjuttaviksi. Tehokkaiksi todetuista kas- 25 veistä kurttulehtiruusu ja salvia olisivat myös helpoimmin viljeltävissä.

116030 π $ 1 · -τ in <? f? 3 °? ^ 5 - °? <D ' C/3 -.· 3 2

1 I

dtf O ^OO^-OnoliN^-tS^MroNvDjh ‘d So Sin'OO'flNoo'i'tnTjin^^inN'iin00-

C S ° V

<3 2 £ -T f- - - 2 ^ 5 ö S2 g -¾ ^ΟΦ^Ό^ΐΛΐΛίΛΜ/ΚΝΟΟ^-ΟΟ^^ 2 % S N m Μ Ν^ΦϊΝΜΦΝΟίΟΝΝ^Μ-^ν d O §

Γ* £ J

£ =3 '« O I § -Γ ω C -C H ^ g ö 2i <u .¾ J~! ^Sor'OCTNOO^nt^^omr'u-iON'^- on S' f'

<3 -5<U^V r„ S tN OO ΙΛΟΝΟΝΟΝΟ\0)ΟιΟΝ-» —' NO

H ti .s < 3 01 Co £ > is ώ ^ =3 °\ r=l G 3 ^ ai .23 w ‘g 8 H 2 -£ 2 is 3 § a

.I ,§(2.a ISSK^'ifSSg'r-sS^JSsI

«III .S

^ I § f JO ·§ -S ~ ‘21 M »I .2 e ο ο;] 2 S §Ξο ^ τ v ' ......^ r- ^ , ^ ^ .-h S <N cä o °q ^1 =

. . * . ee O

·.:.=.·< oo

••o-l S

: : - £ οηΦ^«π^5·Λ,ο_„-ο._Ν-„ Q

* * · cö s *ca : : ' $ "S —

Yi O :«s O §0 £ 00 05 o ^2 O-,

;·-.· «J

° δ -T δσ'^ΌΓ?Ξοοί>αθΝ"οο«^σ1Ό^^σ' 3

,· -fc* O IQ P ^ Γ~ r70Vr?OOOOrVONONl9^0NVC^ON+J

^ ~ O (.N I W

c -s o ce

0 ^ ΙΛ» H

*j Q ω <3 8 > δ «f .B .„1

§ I Ή 1 S

;'-. -§ .2 -g “ 5^¾¾¾ * ω Λ -¾ „ \£ -η <υ g <υ ^-2 * * * So^5 2ctf *5 3 3 ·Η * * rvCd * Wh v-i «Χ3 ·*« <—i _ö hi ώ 3 n 1 I 1511^ ίj s 5| 11 !.= 1 o 3 So- 2 « § S -£ o'M ο 3 2Λ4:3Ϊλ λ 3 ’> 5 § * * -S il s - jj u ! ‘ * . mm ΕΛ Ο ο ^ ^ *ίί ee B'^S’iSS 9<.h33 ci^3 ^ = Λ .0 3 £ 3 -2,-3 d d £j> d ^ .,’ Η >><&οί^θίοοο-Ζ^Ζ^ώ^ί^εΛ^^- 116030 12

Esimerkki 5

Tutkimusta jatkettiin tekemällä uusintauutot ja -testaukset kurttulehtiruususta, nuk-kahorsmasta ja salviasta (säilytetty 2 vuotta kuivattuina) aktiivisuuden varmistamiseksi. Lisäksi päätettiin uuttaa ja testata näiden sukulaiskasvit maitohorsma (lehdet, 5 kukat ja juuret) sekä mesiangervo (lehdet, kukat ja juuret). Samansukuiset kasvit si sältävät usein samantyyppisiä yhdisteitä ja siksi arveltiin, että myös niiden uutteet saattaisivat olla aktiivisia. Nukkahorsma on kohtalaisen harvinainen kasvi, joten toivottiin, että myös paljon yleisempi maitohorsma olisi aktiivinen. Testit suoritettiin sekä SDS-pesun kanssa että ilman sitä, joten tuloksista on nähtävissä uutteiden 10 vaikutusmekanismi (H=heikentää biofilmiä, ilman SDS-pesua biofilmin estymistä ei havaittavissa, E=estää biofilmin muodostumista, SDS-pesulla ei vaikutusta.)

Tulokset on esitetty Taulukossa 5. Tutkituista kasviuutteista parhaat (kurttulehtiruu-su, maitohorsma, mesiangervo ja salvia) estivät eri tarttujabakteerien kiinnittymistä pintoihin, mutta varsinkin D. geothermaliksen ja M. silvanuksen tarttumista. Tulos-15 ten perusteella myös uudet kurttulehtiruusu-uutteet olivat aktiivisia, joskaan eivät aivan yhtä aktiivisia kuin alkuperäiset uutteet. Tätä voidaan selittää sillä, että kasvimateriaalin keräyksestä oli kulunut jo lähes 2 vuotta ja aktiivisten aineiden pitoisuudet ovat saattaneet laskea säilytyksen aikana. Nukkahorsman osalta tilanne oli samanlainen. Uusina, mielenkiintoisina kasveina nousivat esille edellisen sukulais-.;, 20 kasvit maitohorsma ja mesiangervo. Uusi salviauute oli suunnilleen yhtä tehokas kuin vanha. Uusintatutkimuksissa Thermomonas sp. osoittautui tarttujabakteereista : ‘ · vaikeimmin torjuttavaksi: tutkituista uutteista vain salvia torjui sen kasvua.

13 t '5 116030

S

-Sr* oi <d :o3 d

c/i U

-S to oi ω s 6 s; ? 5 a oooN^^(Nm^-o^foo(Nro 3 S _> rivor-r-r^r-r^r^t^OOOoo 5 2 ΐ 1

S g I

jj ^ .s 3 O Ο^-φίΛ'ί^-'η'ΛΙΛΜΓη'ίΟΝ ΓΞ > ·~ Offi(J0\(J\0N0\0\Ch0\0\0\0\ —i 3 ca ^ ^ .2 01 O X) <υ a - .5 d 2 g -3 _ Oi S S ΐ ci, rv

£7 (s) N O Ό <Λ -ιΐΟΓΜΌ ^Χΐί2 I

.2 g Ö s ν "7 1 1 - 1 1 1 727 2S

-° ” o i 1 Q

ö p 2 o fTT' ^ D $3 O sj W, ö

*^r o *cd ^ ^ S

ϊ> y c*« o 0s p c/j P C e οοοηθΜ^^ΓΗΐηΝπ>ΑθιΛ ^ ö

p > > F ooocNoo^-oaNcoomSo^gcrS

^ N i & (N1— 1

Oi 1 N d s I I I I I I ’d „ 'S d 32 E? S' :C3 d j2 a X c-ί Oh -¾ ·£ rt · — :rt ϊ-η O g ω M > > 8 3 -s 5 d '3 C — -¾ ts d Z m S -¾ d .2 ^ •S >, J2 .S S ^ 2 !U — 3.2 o _.O^O^^CN^ — 0°0<^0\m ‘C :ce 2 o? d ^ ^ (Ν^»η<^ΓΛ(Ν(Ν ' — 1 1—1 m m G ° ti ~ '»Cd <urdT3b^öjr — <d -3

•s d i ·§ * ^ s » S

§ P* § ^ Q @5Γω ω 5Γκ

c "3 S O <D O WWWWW

.2^t+H j»; 2(s)O«mh«rH '13-1— vor^r^&o^oo

S2 . o ^ .2 1 *3 JS

* ? S ^ | G £ 1 lö * -s s § • ^22 Nn^iSing00 00 ^0''^^ ^ S ^ S S --^^^^07^--7.700-,2 o :/. .d Q ^ « '3 1

:. . ! £ I @ω Βω & ω ω g SE § 3 S

oi ci .2 O O - o) 2 'ns riJ —) vo M (N ιλ 7 2 d ·§ δ’Β 11 9 g t> 0(S <D S — 3 d s> > δ w S C3 &0 „ -2 o 3 ci o, +- S ° -g rt — s rt S :rt ^ 2ου “ d M :d g — o o s <*> :d e d ? d » -g 5 §| g S jc ^ §2

:"’ 1 S I § ^ g W

'·. .§ Q .£ :2 £ -2 d «f 5 «j 3 5¾¾ .11 sit.1*: o ^ .2 -d 2 G .g 2 d -2 . 2, G d d £3 1¾ ';,‘ S o S S o" § § o 2 § § § !n £ -a d '5>gg>CC>£CCC'3 Su? , k> k^ ir? ^ ^ ir? *·Ρ t2 Jrt co *P ’P *P 2ί oöOOOPdjgoflOoDl) — — «M-Ci ,> SCCCq’ScC'S'H^i doodd^rto dddrt Λ (SsaSjiliSdihi^

6£££^c££^,iM

"3 03

H

Esimerkki 6 116030 14 R2-liemessä testatuista uutteista tehokkaimmat testattiin myös paperikonevedessä (viiravesi, lisätty tärkkelystä 1 g/1 ja hiivauutetta 300 mg/1, steriloitu). Testiin otettiin mukaan lisää mikrobikantoja (paperikoneelta eristetyt, vielä tunnistamattomat 5 bakteerikannat E-lvk-R2A-l ja E-jv-CTYE3 sekä Aspergillus fumigatus -home G 3.1.) Testimenetelmänä oli sama kuoppalevytesti (polystyreeninen kuoppalevy, so-luviljelylaatu, hydrofiilinen, paperikonevesi 250 μΐ/kuoppa, pH 7, 45 °C, 160 rpm 48 h). Pidempi kasvatusaika on tarpeen, sillä bakteerit eivät muodosta paperikonevedessä biofilmiä yhtä nopeasti kuin R2-liemessä. Tulokset on esitetty Taulu-10 kossa 6, josta ilmenee, että uutteiden tehot jäivät alhaisemmiksi kuin R2-liemessä kenties juuri pidemmästä kasvatusajasta johtuen. Paperikoneympäristössä tämä voidaan korjata lisäämällä tehoainetta tasaisin väliajoin.

Suorittujen tutkimusten mukaan kasviuutteista käyttökelpoisimpia paperi- ja kar-tonkikoneiden haitallisten biofilmien torjuntaan ovat siis kurttulehtiruusu-, mesian-15 gervo-, maitohorsma-ja salviauutteet. Myös nukkahorsmauutteet olivat tehokkaita, mutta harvinaisuutensa vuoksi vaikeasti saatavissa.

116030 15 (Λ </) Ö οο 5 --------- λ Ο Os Os Γ^· Q Ο r—. hv ιλ U ^ ^ (N Π ΙΛ ^ ^ nf un <Ν 6 rö ' 'Τ & η ο ο

_r Ο ο ον ο ^ rnOOootN

+3 'trnri^N

ω ____!___!__I___!_ ϋ <τ> 3 ω

.3 o m τ—' 'si- o r- S

^ f_ ^so*^v~ir-^csrir«-)i

3 O

d j

0 ^Vh '~T‘ -Γ O

6 S pL]^—'OosOscN^t OOOst^TfOs ^ w g ö/CNoOOOOsooOsOsOsOsOs :ci co ’—'3--------- '—' CO H w _ 3 rrtP rsiif-v’-H ^ ^ OO 00 i-^ V -ca Ö3S^(N(NO ΓΛ Tf a

Or* K 2 CN ι i 1 M i iii Cl,

►> S <d i co O

2 £ £ 1> o § :S C o — .¾ -* > ω Λ nj Cl O c -3iM-i<uoro — vot"- on on oo oo oo -3 3 c3 -g <N Ό Ό C- f) 00 00 OO On Ä 1 = ΐ S J--------- £·

'3 ^ £ 3 £ S M

2 2 it | * I

g O 3! fNt^mvnvOTfvOvO^Ov Q

'! Γ3 S c3 K 00 ·. !§ -f f- § s -^- § S^tpjf^OOOi^OON'''1 ^ 3 W K ” (N CN -- <N -7 —' ^ :rt <d o o 1 — ,. T3 ·« R :rt δ ® o :2 ö K <u ,3go a .3 3 S (N ro Γ" OM «Nir> s ‘ > Er* 'imhm ηγηοοτ-,^ g

CO ΓΊ I I I I I I I I O

d g M rt C .6¾ fc •S a £ M-» r·» 1 1 S I «e •i I §

3 1 0 S

: o 5J g ^4 : I j H Q ~ '•o ^ .2

O <u 2 2 o' e o O

3 3 I I £ g £ 3 3 3 S3 3 -g S > s .2 0 δ So o S» -g o -g b -S 0 jj λ

3 >J 1sJs| 1 I=ri=r|rf.i S

: H II pl< un

Claims

116030

1. Menetelmä paperi- ja kartonkikoneiden termofiilisten tarttujamikrobien bio-filmimuodostuksen estämiseksi paperi- tai kartonkikoneiden pinnoille ja/tai tällaisten biofilmien poistamiseksi mainituilta pinnoilta, tunnettu siitä, että paperi- tai 5 kartonkikoneiden kiertovesiin lisätään termofiilisiin tarttujamikrobeihin tehoava pitoisuus ainakin yhtä kasvista eristettyä puhdasainetta, joka on fenolinen yhdiste, edullisesti fenolisen hapon esteri, tai ainakin yhtä kasviuutetta, joka on peräisin jostakin seuraavista kasveista tai kasvinosista: kurttulehtiruusu, maitohorsma, salvia tai mesiangervo tai mainitun puhdasaineen ja mainitun kasviuutteen seosta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasviuute on saatu uuttamalla kasvia tai kasvinosaa metanolilla, etanolilla, asetonilla, heksaanilla, kloroformilla tai niiden seoksella.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fenolisen hapon esteri on oktyyligallaatti tai lauryyligallaatti.

4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, et tä puhdasainetta tai kasviuutetta tai niiden seosta lisätään paperi- tai kartonkikoneen kiertovesiin tuotepitoisuuteen 1-1000 ppm, edullisesti 10-100 ppm laskettuna puhdasaineen tai kasviuutteen kuivapainosta.

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, et-ν', ·’ 20 tä puhdasainetta tai kasviuutetta tai niiden seosta annostellaan paperi- tai kartonki- : Ί': koneen kiertovesiin joko jaksoittain, edullisesti 2-8 kertaa vuorokaudessa, tai yhtenä •; “: kerta-annoksena vuorokaudessa. • I-

· ; / 6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, et- * I ' · · - ’ tä puhdasainetta tai kasviuutetta tai niiden seosta annostellaan kerta-annoksina tart- 25 tujamikrobeja sisältäviin säiliöihin, annoksen ollessa edullisesti 500-5000 ppm las-:.: · kettuna puhdasaineen tai kasviuutteen kuivapainosta.

7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, et-' · : tä termofiilinen biofilmi käsittää ainakin yhden seuraavista tarttujabakteereista: •,,. · Deinococcus geothermalis, Meiothermus silvanus, Burkholderia cepacia tai Ther- . ‘: 30 momonas sp., ja/tai tarttujahomeen Aspergillus fumigatus.

‘ 8. Kasvista eristetyn puhdasaineen, joka on fenolinen yhdiste, edullisesti fenoli sen hapon esteri, tai kasviuutteen, joka on peräisin jostakin seuraavista kasveista tai 116030 kasvinosista: kurttulehtiruusu, maitohorsma, salvia tai mesiangervo tai mainitun puhdasaineen ja mainitun kasviuutteen seoksen käyttö paperi- ja kartonkikoneiden termofiilisten tarttujamikrobien aiheuttaman biofilmimuodostuksen estämiseksi paperi- tai kartonkikoneiden pinnoille ja/tai tällaisten biofilmien poistamiseksi maini-5 tuilta pinnoilta.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että puhdasainetta tai kasviuutetta tai niiden seosta lisätään paperi- tai kartonkikoneen kiertovesiin tuote-pitoisuuteen 1-1000 ppm, edullisesti 10-100 ppm, laskettuna puhdasaineen tai kasviuutteen kuivapainosta.

10 Patentkrav