FI112502B - DNA:n siirtäminen stabiilisti bakteerien perimään - Google Patents

Description

112502 DNA:n siirtäminen stabiilisti bakteerien perimään - Stabi 1 överföring av DNA tili bakteriernas arvanslag 5 Tämä keksintö koskee bakteerisolua, jonka genomiin on integroitu DNA-rakenne, bakteerisolun genomiin integroitavaa DNA-raken-netta, tämän DNA-rakenteen sisältävää plasmidivektoria, sekä menetelmiä, joilla DNA-rakenne integroidaan bakteerien perintöainekseen.

10

Kun jotain tiettyä polypeptidiä on tuotettu yhdistelmä-DNA-me-netelmien avulla ja bakteerisolut on transformoitu yhdistelmä-plasmidivektorilla, johon on insertoitu tätä polypeptidiä koo-daavaa geneettistä tietoa, on usein havaittu, että tällaiset 15 plasmidit eivät olekaan stabiileja, vaikka itse olisivatkin stabiilisti. soluun periytyneitä. Epästabiilisuus ilmenee plas-midin huonona pysyvyytenä soluissa, plasmidi voi esimerkiksi hävitä solupopulaatiosta, tai kyseessä olevaa proteiinia koo-daava DNA saattaa deletoitua plasmidista. Tavallinen käytössä 20 ollut keino tämän ongelman ratkaisemiseksi on ollut kasvattaa .·. : transformoituja soluja valintapaineessa, toisin sanoen yleensä __ jonkin sellaisen antibiootin läsnäollessa, jonka suhteen kyseiset solut on tehty resistenteiksi kun läsnä on ollut geeni, ; joka koodaa tälle antibiootille resistentiksi tekevää tuotetta • '25 soluihin transformoidussa plasmidissa. Tämä lähestymistapa ei kuitenkaan ole kannattava, sillä sen laajamittainen tuottaminen ·.· · on epätaloudellista tällaisten antibioottien kalleuden vuoksi, eikä se myöskään ympäristöä ajatellen ole hyvä ratkaisu. On myös vaikeampi saada tuotteelle valmistuslupa terveysviranomai-30 silta ja vastaavilta, jos viljelyaineessa käytetään antibioot-. . : teja.

Aiemmin on ehdotettu plasmidien stabiloimista insertoimalla niihin DNA-sekvenssi, joka koodaa jakautumisfunktiota, joka ",,,'35 huolehtii plasmidien jakautumisesta tasaisesti jälkeläissolui-:·. hin solujakautumisessa. Vaihtoehtoinen menetelmä kloonattujen 2 112502 DNA-sekvenssien stabiilin periytymisen aikaansaamiseksi on integroida tällaisia DNA-sekvenssejä isäntäbakteerin genomiin (1. perintöainekseen). DNA-sekvenssit voidaan integroida plasmidivektoreihin nk. tekijäinvaihtomenetelmällä 5 ("crossing-over") (esim. A. Campbell, Advances Genet. 11, pp. 101-145, 1962). Tässä menetelmässä plasmidivektoriin pannaan DNA-sekvenssi, joka on homologinen bakteerin genomin jonkin alueen kanssa tai vaihtoehtoisesti kahden alueen kanssa, jotka sijaitsevat integroitavan heterologisen DNA-sekvenssin 10 molemmin puolin. Myöhemmässä rekombinaatiovaiheessa vektorin homologinen sekvenssi sekä sen viereiset sekvenssit integroidaan isäntägenomiin homologialueelle.

Joissain tapauksissa on kuitenkin havaittu, että siirretyt 15 DNA-sekvenssit ilman valintapainetta deletoituvat soluista, esimerkiksi samantyyppisellä homologirekombinaatiolla kuin DNA:n integraatiossa. Erityisesti on aiemmin havaittu, että homologisten DNA-sekvenssien rekombinaatio stimuloituu lähellä replikatiivista DNA:ta, jota on isäntäsolugenomiin integ-20 roidussa DNA:ssa tai lähellä sitä (Ph. Noirot et ai., J. Mol.

: Biol.196, pp. 39-48, 1987 ja M. Young and S.D. Ehrlich, J.

·;· Bacteriol. 171 (5), pp. 2653-2656, May 1989.

; Eräs tämän keksinnön kohteista onkin saada integroitua pysy- ; 25 västi DNA-sekvenssejä genomiseen DNA:han, esimerkiksi isän- täbakteerisolujen kromosomiin. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Keksinnön lyhennelmä: ' 30 Tämä keksintö perustuu havaintoon, että DNA-sekvenssejä saa- , daan integroitua stabiilisti isäntäbakteerin genomiin pitä mällä huolta siitä, ettei integroidussa DNA:ssa ole läsnä funktionaalista plasmidireplikaatiosysteemiä.

35 Eräs keksinnön kohteista onkin bakteerisolu, jonka genomiin on integroitu replikoitumaton DNA-rakenne, joka sisältää 1) halutun DNA-sekvenssin, 2) DNA-sekvenssin, joka on homologinen so- 3 112502 lun genomin (jonkin) alueen kanssa ja 3) replikaatioalun ; mainitussa DNA-rakenteessa ei ole funktionaalista geeniä, joka koodaisi tekijää, jota tarvitaan repiikoitumisen käynnistymiseen tästä replikaatioalkukohdasta.

5

Eräs toinen keksinnön kohteista on DNA-rakenne, joka sisältää 1) halutun DNA-sekvenssin, 2) DNA-sekvenssin, joka on homologinen sellaisen solun genomin jonkin alueen kanssa, johon DNA-rakenne aiotaan siirtää, ja 3) replikaatioalun ; mainitussa 10 DNA-rakenteessa ei ole funktionaalista geeniä, joka koodaisi tekijää, jota tarvitaan replikoitumisen käynnistymiseen tästä replikaatioalusta.

Tässä yhteydessä termillä "replikoitumaton DNA-rakenne" tarkoi-15 tetaan DNA-sekvenssiä, joka ei pysty kahdentumaan itsenäisesti, ja joka sen vuoksi kahdentuu yhdessä isäntäsolun genomin myötä. Genomiin kuuluvat kromosomit ja pysyvästi periytyneet kromoso-minulkoiset elementit. Termiä "haluttu DNA-rakenne" käytetään sekvenssistä, joka voi koodata haluttua RNA:ta tai proteiini-20 tuotetta (isäntäsolun kanssa heterologista tai natiivia) tai : joka itse tuo isäntäsoluun halutun ominaisuuden, esimerkiksi .myöhemmin selostettavan mutanttifenotyypin.

; , Homologinen DNA-sekvenssi voi olla tavalliseen tapaan sellai-; 25 nen, joka on johdettu isäntäsolun genomista, ja se voi olla '· " homologinen genomin sellaisen alueen kanssa, joka ei ole olen-·.· · naisen tärkeä isäntäsolun elossa pysymisen tai oikeanlaisen toimimisen kannalta. Toisaalta homologinen DNA-sekvenssi voidaan valita myös siten, että integroitaessa keksinnön mukaista 30 DNA-rakennetta homologirekombinaation avulla tuloksena on solu, : joka ilmentää mutanttifenotyyppiä (joka voi sitten toimia mark- . kerinä valikoitaessa soluja, joihin DNA-rakenne on integroitu- • * nut), esimerkiksi jos DNA-rakenne on integroitu transkriptioyk-sikköön, joka keskeyttää tämän, niin että yksi tai useampi ',..•35 transkriptioyksikön geeni ei sen seurauksena ekspressoidu.

Homologinen DNA-sekvenssi voi vaihtoehtoisesti olla sellainen, 4 112502 joka ei ole ominainen isäntägenomille, vaan joka on kloonattu toisesta organismista tai joka on syntetoitu ja sen jälkeen viety isäntägenomiin mitä tahansa sopivaa menetelmää käyttäen, esimerkiksi tekijäinvaihtomenetelmällä, ennen kuin keksinnön 5 mukainen DNA-rakenne on integroitu. Homologinen DNA-sekvenssi voi olla myös sellainen, joka muodostuu olennaisesti juuri kyseessä olevasta DNA-sekvenssistä, olipa se luonteenomainen tai vieras kyseiselle isäntäsolulle (esimerkiksi luonteenomainen solulle silloin, kun kun halutaan monistaa kyseessä olevan DNA-10 sekvenssin kopioiden lukumäärä solussa (ks. edempänä). Huomattakoon, että tässä yhteydessä termillä "homologinen" tarkoitetaan vähintään 9 peräkkäisen emäsparin sekvenssin eli järjestyksen samanlaisuutta.

15 Keksintö yksityiskohtaisemmin:

Vaikka keksinnön mukaan DNA:n stabiili integrointi bakteeri-genomiin on osoitettu sellaisten plasmidien kohdalta, joilla on tietynlainen kahdentumistapa (nk. rengasreplikaatio, "rolling circle replication", ks. edempänä), tällä hetkellä oletetaan, 20 että mitä tahansa plasmideja, jotka kahdentuvat tavalla, jossa .·. : tarvitaan yhtä tai useampaa trans-vaikuttavaa tekijää (esim.

,RNA- tai proteiinitekijät) aloittamaan replikoituminen plasmi-din cis-vaikuttavista DNA-sekvensseistä (tällaisia cis-vaikut-; tavia sekvenssejä nimitetään yhteisesti replikaatioaluksi), 25 voidaan käyttää tähän tarkoitukseen. Tekijöitä, joita plasmi-'· ’* din replikoitumiseen eli kahdentumiseen tarvitaan, nimitetään ’,· · tästä eteenpäin replikaatiotekijoiksi. Kun DNA-rakenteessa ei ole funktionaalista geeniä, joka koodaisi replikaatiotekijää, jota tämän DNA-rakenteen sisältämä replikaatioalku tarvitsee, 30 yhtään aktiivista replikaatiotekijää ei synny, eikä kahdentumi-; nen sen vuoksi ala tästä alusta.

Kun halutaan saada keksinnön mukainen DNA-rakenne, jossa ei ole funktionaalista geeniä, joka koodaa vaadittavaa replikaatiote-,35 kijää, voidaan joko deletoida koko geeni tai muunnella sitä niin, että se koodaa inaktiivista replikaatiotekijää. Tällai- 112502 h nen geenin muuntelu voidaan toteuttaa sinänsä tunnettuun tapaan deletoimalla, insertoimalia tai substituoimalla yksi tai useampi geenin DNA-sekvenssin nukleotidi tai sitten suorittamalla samanlaisia muutoksia transkripitionaalisille tai translaatio-5 naalisille lähtö- tai lopetusssignaaleille.

Yllä esiin tuotuja kahdentumistapoja voidaan käyttää kokoamaan keksinnön mukainen bakteerisolu. Keksinnön eräässä toteutus-muodossa kootaan ensimmäiseksi plasmidivektori, jota nimitetään 10 emovektoriksi (parental vector). Emovektori sisältää i) ensimmäisen replikaatioalun, ii) yhden tai useamman funktionaalisen geenin, joka koodaa replikaatiotekijää (tai -tekijöitä) jota tarvitaan kahdentumiseen joka alkaa tästä ensimmäisestä repli-kaatioalusta, iii) toisen replikaatioalun, joka on samoin 15 orientoitunut kuin ensimmäinen replikaatioalku, iv) halutun DNA-sekvenssin ja v) DNA-sekvenssin, joka on homologinen sellaisen solun genomin alueen kanssa, johon (soluun) vektori aiotaan viedä, ja emovektorissa ei ole funktionaalista geeniä, joka koodaisi replikaatiotekijää, joka tarvitaan replikointiin 20 toisesta replikointialusta lähtien toisen ja ensimmäisen repli-: kaatioalun välisellä alueella (mainitussa järjestyksessä).

Huomattakoon, että tässä yhteydessä termillä "plasmidi" tarkoi-. tetaan myös bakteriofagia tai muuta DNA-raolekyyliä, joka voi ! toimia itsenäisesti replikoitavana kromosominulkoisena ele-'25 menttinä.

’ Keksinnön mukaan tämä emovektori voidaan sitten transformoida bakteerisoluihin, ja transformoituja soluja viljellään olosuhteissa, joissa vektori kahdentuu.

30 j Emovektorin replikoituessa transformoidussa solussa alkaa muo-dostua kahta erilaista jälkeläisvektoria (progeny vector).

I ! »

Ensimmäinen jälkeläisvektori sisältää i) ensimmäisen replikaa-’ ,35 tioalun, ii) yhden tai useamman geenin, joka tarvitaan repli- koitumiseen tästä alusta. Toisessa jälkeläisvektorissa on iii) 6 112502 toinen replikaatioalku, iv) haluttu DNA-sekvenssi ja DNA-sek-venssi, joka on homologinen sellaisen solun genomin alueen kanssa, johon (soluun) plasmidivektori aiotaan viedä, eikä pa-rentaalivektorissa ole funktionaalista geeniä, joka koodaisi 5 replikaatiotekijää, joka tarvitaan replikointiin alkaen toisesta replikointialusta, joka on tässä toisessa jäikeläisvektoris-sa. Kahden jälkeläisvektorin muodostuminen emovektorista voi toteutua erilaisin mekanismein: joko tuloksena plasmidin kah-dentumistavasta, esimerkiksi yksisäikeisen DNA-plasmidien ren- 10 gasreplikaatiosta (ks. edempänä), tai sitten tuloksena sellaisten DNA-alueiden homologirekombinaatiosta, joihin kuuluvat plasmidivektorissa läsnä olevat kaksi replikaatioaluetta ja/tai jotka sijaitsevat niiden vieressä.

15 Kun toinen alku on orientoitunut emoplasmidissa samoin kuin ensimmäinen alku, erilaiset bakteerigenomiin integroitavat DNA-sekvenssit, jotka sijaitsevat toiseen alkuun nähden alavirtaan, mutta ensimmäiseen alkuun nähden ylävirtaan (eli haluttu DNA-sekvenssi ja DNA-sekvenssi, joka on homologinen solun genomin 20 (jonkin) alueen kanssa), ovat läsnä plasmidin kahdentumisen myötä muodostuvassa toisessa jälkeläisvektorissa. Transformoi-tujen solujen jatkuvassa viljelyssä toinen jäikeläisvektori voi spontaanisti integroitua bakteerigenomiin homologirekombinaa- f * i tiossa ja ensimmäinen jäikeläisvektori hävitä soluista jossain * t · 25 määrin.

» * t * » * i · *.* ’ Kun halutaan helpottaa sellaisten solujen valikoitumisessa, joissa toinen jäikeläisvektori on integroitunut genomiin, tähän vektoriin kannattaa liittää nk. valikointimarkkeri. Siinä ta- 30 pauksessa soluja voidaan viljellä selektiivisissä olosuhteissa, jolloin vain sellaiset solut, joissa valikointimarkkeri pysyy, . : jäävät eloon. Valikointimarkkeri voi olla geeni, joka koodaa tuotetta, joka tekee solusta antibioottiresistentin tai sellainen, joka tekee auksotrofisesta kannasta prototrofisen (esim.

35 dal-geenit, jotka viedään dal-kantaan, vrt. B. Diderichsen,

Bacillus: Molecular Genetics and Biotechnology Applications, A.

» 7 112502 T. Ganesan and J. A. Hoch, Eds., Academic Press, 1986, pp. 35-46). Solut, jotka näissä olosuhteissa pysyvät elossa, ovat joko soluja, jotka sisältävät emoplasmidivektorin tai solussa emovektorin kahdentumisessa muodostuvat molemmat jälkeläisvek-5 torit, tai sitten soluja, joihin on integroitu keksinnön mukaisen DNÄ-rakenteen sisältävä toinen jälkeläisvektori. Yllättäen on havaittu, että emovektori ja ensimmäinen jälkeläisvektori saattavat kadota, kun taas keksinnön mukaisen DNÄ-rakenteen sisältävä toinen jälkeläisvektori integroituu spontaanisti 10 isäntägenomiin runsain määrin.

Jos halutaan parantaa DNA-rakenteen integroitumistehokkuutta, emovektorina voidaan käyttää plasmidia, joka tietyissä (permis-siivisissä) olosuhteissa pystyy kahdentumaan ja toisenlaisissa 15 (ei-permissiivisissä) ei pysty kahdentumaan. Plasmidi voi olla esimerkiksi sellainen, joka on lämpötilaherkkä replikoinnissa. Eräässä keksinnön toteutusmuodossa emovektori on sellainen, joka ei pysty replikoituinaan korkeammissa lämpötiloissa, joissa isäntäsolu kuitenkin vielä pystyy kasvamaan. Bakteerisoluja 20 viljellään aluksi lämpötilassa, jossa plasmidi replikoituu ja : mainitut kaksi jäikeläisvektoria muodostuvat, ja sen jälkeen, ____. kun toinen jälkeläisvektori, joka sisältää keksinnön mukaisen . . DNA-rakenteen on integroitu bakteerigenomiin, jatketaan vilje-; , lyä lämpötilassa, jossa plasmidi ei enää pysty replikoitumaan, • '25 niin että sekä ensimmäinen jälkeläisvektori että emovektori '· ': häviävät solusta. Viljely ei-permissiivisessä lämpötilassa • .· ; toteutetaan selektiivisellä tavalla siten, että vain solut, jotka sisältävät integroidun DNA-rakenteen, sopiva valikointi-markkeri mukaanlukien, jäävät eloon.

30 • . ; Toinen tapa lisätä integroitumistehokkuutta ja siitä seuraavaa ensimmäisen jälkeiäisvektorin poistumista on käsitellä emovek-torilla transformoituja soluja plasmidia parantavalla aineella, esimerkiksi novobiosiiniila (Gadö, I. et ai., Zbl. Bakt. Hyg.

’ ,35 A. 265, 136-145, 1987), sen jälkeen kun isäntäsoluja on viljel-:·. ty kuvatun kaltaisissa selektiivisissä olosuhteissa.

8 112502 ϋη mahdollista käyttää replikaatioalkuja saman emovektorin kahdesta eri plasmidista, kunhan ne ovat niin samanlaiset, että sama replikaatiotekijä (tai tekijät) saa (saavat) ne toimimaan, niin että replikoituminen alkaa sekä ensimmäisestä että toises-5 ta replikaatioalusta. Vaihtoehtoisesti plasmidivektorin tulee sisältää homologisia alueita, jotta se pystyisi kuvatun kaltaiseen homologirekombinaatioon. On kuitenkin suotavaa, että ensimmäinen replikaatioalku (sekä geeni, joka koodaa siihen liittyvää replikaatiotekijää) johdetaan samasta plasmidista kuin 10 toinen replikaatioalku, jotta voitaisiin varmistua siitä, että replikaatiomekanismi, johon tämä keksintö perustuu, toimisi optimaalisella tavalla.

Käytännön syistä saattaa olla edullista luoda plasmidivektorin 15 lähtörakenne organismiin, jossa replikoituminen ensimmäisestä ja toisesta replikaatioalusta ei ole mahdollinen tai jossa replikoituminen näistä aluista lähtien on hyvin vähäistä. Plasmi-divektori voi siis olla sukkulavektori, jossa on ylimääräinen replikaatioalku, jonka ansiosta vektori pystyy replikoitumaan 20 kahdessa eri organismissa. Ylimääräinen replikaatioalku voi : olla esimerkiksi sellainen, joka toimii Escherichia colissa, .joka on paljon kuvattu ja jo kauan yhdistelmä-DNA-kokeissa käy-. . tetty organismi ja joka sen vuoksi soveltuu plasmidien muodos-;tamiseen yhdistelmä-DNA-tekniikoin. Sukkulavektorissa voi li- • 25 säksi olla ylimääräinen valikointimarkkeri, esimerkiksi antibi-'· oottiresistenssigeeni, vektorin selektoitumiseen E. colissa.

·.· · Ylimääräinen replikaatioalku ja valikointimarkkeri saisivat mieluiten seurata ensimmäistä alkua ja/tai replikaatiotekijää (t. -tekijöitä), mutta sijaita ennen toista alkua, niin että 30 vektorireplikoitumisessa ensimmäisestä ja toisesta alusta nämä ;·. : ylimääriset sekvenssit siirtyvät ensimmäiseen jälkeläisvekto- riin ja lopuksi häviävät emovektorilla transformoidusta baktee- • · risolusta.

•,..35 Vaihtoehtoinen menetelmä tuottaa keksinnön mukaisia baktee-:\ risoluja on transformoida isäntäsoluja enimmäisellä DNA-vekto- 9 112502 rilla, joka sisältää ensimmäisen replikaatioalun, joka liittyy funktionaaliseen geeniin, joka tarvitaan plasmidireplikaation alkamiseen tästä ensimmäisestä replikaatioalusta ja suorittaa sen jälkeen tai samanaikaisesti kotransformointi toisella DNA-5 vektorilla, joka sisältää toisen replikaatioalun, johon ei liity funktionaalista geeniä, joka koodaisi tekijää, jota tarvitaan plasmidireplikaatioon toisesta replikaatioalusta lähtien, sekä halutun DNA-sekvenssin samoin kuin DNA-sekvenssin, joka on homologinen solun genomin jonkin alueen kanssa. Myös toisessa 10 DNA-vektorissa saisi mielellään olla valikointimarkkeri. Sekä ensimmäisen että toisen DNA-vektorin sisältäviä soluja viljellään sitten, edullisesti kuvatun kaltaisissa selektiivisissä olosuhteissa, jolloin mainittu toinen DNA-vektori integroituu bakteerigenomiin homologirekombinaation avulla ja ensimmäinen 15 DNA-vektori, johon valinta ei kohdistu, häviää. Kuten edellä kuvattiin menetelmässä, jossa käytettiin yhtä ainoaa plasmidi-vektoria, ensimmäinen DNA-vektori voi olla sellainen, jonka replikoituminen riippuu vektorilla transformoitujen solujen permissiivisistä tai ei-permissiivisistä viljelyolosuhteista.

20 Keksinnön mukaisessa menetelmässä ensimmäinen DNA-vektori voi • . siis olla sellainen, joka ei replikoidu korkeammissa lämpöti-; loissa, joissa isäntäsolu kuitenkin kasvaa, ja bakteerisoluja viljellään aluksi lämpötilassa, jossa plasmidi replikoituu ja sen jälkeen, kun toinen DNA-vektori on integroitu bakteeri-·.‘25 genomiin, jatketaan viljelyä lämpötilassa, jossa plasmidi ei '.'·· enää pysty replikoi tumaan, niin että ensimmäinen vektori häviää : : . solusta, ja viljely toteutetaan selektiivisissä olosuhteissa sellaisella tavalla, että vain solut, joihin toinen DNA-vektori on integroitu, jäävät eloon. Transformoituja soluja voidaan 30 sitten käsitellä plasmidinparannusaineilla kuten jo kuvattiin.

Välimuoto molemmissa mainituissa intergroidun replikoitumatto-man DNA-rakenteen sisältävän solun kokoamismenetelmissä on bakteerisolu, jossa on ensimmäinen DNA-vektori, jossa puolestaan 35 on ensimmäinen replikaatioalku liittyneenä plasmidin replikoi-tumiseen sanotusta enimmäisestä replikaatioalusta tarvittavaa 112502

.1 O

tekijää (tekijöitä) koodaavaan yhteen tai useampaan funktionaaliseen geeniin, toisen replikaatioalun sisältävä toinen DNA-vektori, haluttu DNA-sekvenssi sekä DNA-sekvenssi, joka on homologinen solun genomin jonkin alueen kanssa, eikä toisessa 5 vektorissa ole funktionaalista geeniä, joka koodaisi replikaa-tiotekijää, joka tarvitaan replikointiin mainitussa toisessa vektorissa olevasta replikaatioalusta.

Kun halutaan valmistaa replikaatioalku toiseen DNA-vektoriin, 10 joka ei sisällä funktionaalista geeniä, joka koodaisi replikaatioteki jää, joka tarvitaan replikointiin tästä alusta lähtien, on mahdollista deletoida tämä geeni vektorista tai muunnella sitä kuvatuilla tavoilla. Erityisesti silloin, kun käytetään kanta erilaista replikaatioalkua, ensimmäisessä DNA-vektorissa 15 voi olla lisäksi geeni, joka koodaa replikaatiotekijää, joka tarvitaan replikoinnin alkamiseen tästä toisesta replikaatioalusta. Näin toisen DNA-vektorin replikointi riippuu ensimmäisestä DNA-vektorista tuotetusta replikaatiotekijästä, ja toisesta vektorista tulee replikoitumaton kun ensimmäinen vektori 20 häviää solusta. Ensimmäinen ja toinen replikaatioalku voivat : kuitenkin olla peräisin samasta plasmidista, jolloin tarvitaan vain ensimmäiseen vektoriin yksi geeni, joka koodaa koskematon-- ta replikaatioteki jää.

; 25 Vaikka tässä keksinnössä bakteerisolu, johon plasmidivektori '· : tai ensimmäinen ja toinen DNA-vektori transformoidaan, voi olla ' sekä gram-negatiivinen että gram-positiivinen, on suotavampaa käyttää gram-positiivista, sillä yleensä on helpompi saada aikaan polypeptidien ekstrasellulaarinen ekspressio gram-positii-30 visista organismeista gram-negatiivisiin verrattuna. Bakteeri voi siis kuulua Bacillus- tai Streptomyces-sukuihin, joista erityisesti voidaan mainita kannat Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus ',,,35 coagulans, Bacillus subtilis ja Streptomyces lividans.

11 112502 Tämän keksinnön uskotaan olevan tällä hetkellä ainoa tehokas menetelmä haluttujen DNA-sekvenssien stabiiliin homologiseen integrointiin sellaisten bakteerien genomiin, joita ei voida transformoida tekemällä sitä kompetentiksi (tai joissa luonnon 5 kompetenssimekanismeja ei vielä ole osoitettu), mutta jotka voidaan transformoida muun muassa protoplastinmuodostus- tai elektroporaatiotekniikoin esimerkiksi tietyillä Bacillus liche-niformis- tai Bacillus lentus -kannoilla. Tämä menetelmä on erityisen kiintoisa sellaisten organismien kannalta, joiden 10 transformoitumistiheys on vähäinen, tyypillisesti 10-50 trans-formanttia per /xg DNA: ta (kun esimerkiksi vastaanottavaisten E. coli- tai B. subtilis -solujen transformoinnissa tavallinen transformanttien määrä on luokkaa 106 - 108 per μg DNArta), jonka vuoksi onnistunut transformointi ja DNA:n stabiili integ-15 rointi näihin organismeihin on erityisen tärkeää.

Keksinnön mukaisessa bakteerisolussa haluttu DNA-sekvenssi saisi edullisesti olla sellainen, joka koodaa haluttua polypepti-diä, ja tämän keksinnön kohteena onkin myös menetelmä, jonka 20 avulla saadaan tuotettua haluttua polypeptidiä viljelemällä \: keksinnön mukaista bakteerisolua, johon on integroitu DNA-sek- • j venssi, joka koodaa tätä polypeptidiä olosuhteissa, joissa saadaan tuotettua tätä polypeptidiä, ja kokoamalla muodostunut , , ; polypeptidi sitten talteen viljelmästä. Tällä menetelmällä _ ! 25 tuotettava polypeptidi voi olla mikä tahansa edullisesti bakteereissa tuotettava polypeptidi, esimerkiksi proteaasin, amy-laasin tai lipaasin kaltainen entsyymi.

Keksinnön suositeltavimpien toteutusmuotojen kuvaus: ·' 30 Suuri joukko gram-negatiivisten bakteerien plasmideja kahdentuu ; nk. rengasreplikoitumismekanismin avulla, jossa replikoitumisen välivaiheessa syntyy yksisäikeinen DNA. Replikoituminen alkaa kun plasmidin koodaama proteiini, Rep, tunnistaa replikaatio-: : sekvenssin alun (plus-alun) ja tekee nick-kohdan toiseen DNA- ,,· 35 säikeeseen (plus-säikeeseen) . Plus-säie irtoaa ja nick-kohdasta polymeroituu uusi plus-säie 3'-OH-ulokkeena. Kun Rep-proteiini 1 2 112502 sitten tunnistaa lopetussekvenssin (joka tulee osittain plus-alun päälle) se saa aikaan toisen nick-kohdan samaan kohtaan kuin ensimmäinen ja syntyy täydellisesti repiikoitunut säie ja yksisäikeinen DNA-monomeeri irtautuneesta säikeestä, jonka päät 5 ligatoituvat rengasmaiseksi molekyyliksi. Isännän tekijät huolehtivat sitten yksisäikeisen DNA-molekyylin konvertoimisesta kaksisäikeiseksi DNA:ksi. (lähemmin tämän kaltaisia plasmideja kuvaavat A. Gruss ja S.D. Ehrlich , Microbiological Reviews 53(2), pp. 231-241, June 1989). Tässä yhteydessä tällaisen 10 replikaatiosysteemin plasmideja kutsutaan yksisäikeisiksi DNA-plasmideiksi.

Yllättäen on tullut esiin, että rengasreplikaatiomekanismia voidaan käyttää keksinnön mukaan tuottamaan keksinnön mukainen 15 bakteerisolu, jonka sisällä on paitsi haluttu DNA-sekvenssi ja DNA-sekvenssi, joka on homologinen solun genomin jonkin alueen kanssa, myös plus-replikaatioalku yksisäikeisestä DNA-plasmi-dista, jossa ei ole funktionaalista Rep-geenikognaattia plus-replikaatioalulle.

20 Tällainen bakteerisolu voidaan koota keksinnön mukaisen mene-

* I

. : telmän avulla käyttämällä emoplasmidivektoria, jossa on i) en- ,simmäinen plus-alku yksisäikeisestä DNA-plasmidista, ii) funk-tionaalinen Rep-geenikognaattia ensimmäiselle plus-alulle, iii) ^5 toinen plus-alku yksisäikeisestä DNA-plasmidista, joka on ; s: orientoitunut samoin kuin ensimmäinen plus-alku, iv) haluttu t > · '·’ ’ DNA-sekvenssi ja v) DNA-sekvenssi, joka on homologinen sellaisen solun genomin jonkin alueen kanssa, joka (solu) aiotaan viedä plasmidivektoriin, eikä emovektorissa ole toisen ja en-30 simmäisen plus-alun välisellä alueella samassa suunnassa kuin :'· ; edellä funktionaalista rep-geenikognaattia toiselle plus-alul-: le.

. i ' ; Emovektorin replikoitumisessa ensimmäinen ja toinen jälkeläis-'•35 DNA-vektori muodostuvat oletettavasti seuraavaan tapaan: 13 112502

Rep-proteiini saa kahdentumisen alkamaan leikatessaan nick-koh-dan ensimmäiseen plus-alkuun, ja sen jälkeen se leikkaa nick-kohdan toiseen plus-alkuun. Irronnut säie ligatoidaan uudestaan ja muodostetaan ensimmäinen jälkeläisvektori, jossa on 5 ensimmäinen plus-replikaatioalku yksisäikeisestä DNA-plasmidis-ta ja funktionaalinen Rep-geenikognaatti ensimmäiselle plus-alulle. Rep-geeni jatkaa samaan tapaan toisesta plus-alusta ja leikkaa nick-kohdan ensimmäiseen plus-alkuun jolloin muodostuu irronneen säikeen kiinnittyessä uudestaan ja yksisäikeisen 10 DNA:n konvertoituessa kaksisäikeiseksi DNArksi toinen jälkeläisvektori, joka sisältää toisen plus-replikaatioalun yksisäikeisestä DNA-plasmidista, jolla ei ole funktionaalista Rep-geenikognaattia toiselle plus-replikaatioalulle, samoin kuin halutun DNA-sekvenssin sekä DNA-sekvenssin, joka on homo-15 loginen sanotun solun genomin jonkin alueen kanssa. Koska toisessa jäikeläisvektorissa ei ole funktionaalista Rep-geeniä, tämän molekyylin kahdentuminen riippuu täysin Rep-proteiinista, joka tulee in trans joko ensimmäisestä jälkeläisvektorista tai emovektorista.

20

Vaihtoehtoisesti molemmat jälkeläisvektorit voitaisiin muodos-: taa myös suorittamalla tekijäinvaihto homologisten DNA-alueiden välillä emovektorissa läsnä olevat ja/tai niitä sivuavat kaksi alkua mukaan lukien.

,'. 25 • · Toinen jälkeläisvektori, jossa funktionaalista replikaatioalkua λ,' ei ole, voidaan muodostaa, jos kuvattu ensimmäinen plus-alku emoplasmidissa korvataan pienellä DNA-fragmentilla, joka on johdettu alkualueelta, joka on riittävän suuri, jotta plasmidin 30 replikoituminen päättyy varmasti, mutta liian pieni muodostamaan funktionaalisen alun. Tällaisia fragmentteja on tunnis-: ·; tettu pUBllQrssä (Boe et ai., J. Bacteriol., 171, 3366-3372, ; : 1989) ja pC194:ssä (Gros et ai., EMBO J., 6, 3863-3869, 1987).

,::35 Bakteerisolu voidaan vaihtoehtoisesti muodostaa keksinnön mukaisella menetelmällä, jossa isäntäsolu transformoidaan ensim- 14 112502 maisella DNA-vektorilia, jossa on ensimmäinen plus-replikaatio-alku yksi säikei sestä DNA-plasmidista, joka liittyy funktionaaliseen Rep-geeniin, ja sen jälkeen tai samanaikaisesti kotrans-formoinnin avulla transformoidaan isäntäsolu toisella DNA-vek-5 torilla, jossa on toinen plus-replikaatioaiku yksisäikeisestä DNA-plasmidista, jolla ei ole funktionaalista Rep-geenikognaat-tia toiselle plus-replikaatioalulle, mutta jossa on haluttu DNA-sekvenssi sekä DNA-sekvenssi, joka on homologinen sanotun solun genomin jonkin alueen kanssa. Toinen DNA-vektori pysyy 10 solussa, koska läsnä on Rep-proteiinia ensimmäisestä DNA-vekto-rista.

Silloin kun emovektori tai toinen DNA-vektori sisältää modifioidun Rep-geenin, toinen plus-al.ku voi sijaita ennen modifioi-15 tua Rep-geeniä tai sijaita siinä. Kuten jo tuli esiin, toinen plus-alku voidaan johtaa samasta tai eri plasmidista kuin ensimmäinen plus-alku. Kun ensimmäinen ja toinen plus-alku johdetaan eri plasmideista, niin ettei kahdentuminen ala molemmista aluista saman Rep-proteiinin avulla, ensimmäinen vektori voi 20 lisäksi sisältää Rep-geenin, joka koodaa aktiivista Rep-proteiinia, joka pystyy initioimaan replikoitumisen toisesta plus-·. ·: alusta. Emovektori tai toinen DNA-vektori voivat jo kuvattuun ':· tapaan sisältää myös valikointimarkkerin.

:.25 Suositeltavassa toteutusmuodossa integroitumisvaiheen edistämi-· . : seksi voidaan käyttää vektoria , jonka replikoituminen riippuu permissiivisitä olosuhteista, mukaan lukien lämpötila, jossa isäntäsoluja viljellään. Tällöin kun ensimmäisen ja toisen DNA-vektorin sisältävää isäntäbakteeria viljellään plasmidire-30 plikoitumisen sallivassa lämpötilassa, ensimmäisestä DNA-vekto-rista valmistettua Rep-proteiinia voidaan käyttää pitämään · toista DNA-vektoria solussa. Ei-permissiivisissä olosuhteissa . : taasen, joissa ensimmäinen DNA-vektori ei pysty kahdentumaan, ensimmäinen vektori ja tämän seurauksena sen valmistama Rep-35 proteiini häviävät solusta, niin että myöskään toinen DNA-vek-• tori ei pysty enää replikoitumaan. Jatkuvassa viljelyssä va- 15 112502 1intapaineen alaisena, esimerkiksi antibiootin läsnäollessa, vain sellaiset solut jäävät eloon, joiden genoxniin on insertoi-tu keksinnön mukainen DNA-rakenne, mukaanlukien geeni, joka koodaa valikointimarkkeria.

5

Huomattakoon, että kun DNA-rakenne on integroitu isäntäsolun genomiin, sitä voidaan viljellä ilman valintapainetta ilman, että DNA-rakenne tai sen osia sen vuoksi häviäisi solusta.

Tämän uskotaan johtuvan siitä, ettei integroitu DNA pysty rep-10 likoitumaan itsenäisesti, vaan kahdentuu isänäsolun genomin kanssa. Se, ettei integroitu DNA pysty kahdentumaan itsenäisesti on osoitus siitä, ettei muodostu yksisäikeistä intermedi-aatti-DNA:ta, jonka uskotaan vastaavan rekombinaatioprosessis-ta, jolloin intergroitu DNA ekski sortuu isäntägenomista (vrt.

15 Ph. Noiret et ai., J. Mol. Biol. 196, pp.39-48, 1987 ja M.

Young and S. D. Ehrlich, J. Bacteriol. 171(5), pp. 2653-2656, 1989).

On havaittu olevan mahdollista monistaa integroitua DNA-raken-20 netta viljelemällä transformoituja soluja lisätyssä valintapaineessa, esim. suuremmissa antibioottipitoisuuksissa. Aikaisem-• ·: min (ks. edellä) on havaittu, että valintapaineen puuttuessa tällaiset monistetut kopiot usein häviävät soluista. Kuitenkin tämän keksinnön mukaan pystytään tuottamaan bakteerisolu, jossa . 25 monistetut kopiot integroiduista DNA-sekvensseistä pysyvät sta- .· ; biilisti isäntäsoluissa, koska, kuten edellä tuotiin esiin, integroitu DNA ei pysty kahdentumaan. Vaikka keksintöä on kuvattu pääasiallisesti sopivana heterologisten DNA-sekvenssien integroimiseen, huomattakoon, että sitä voidaan käyttää myös 30 valmistamaan monistettu kopiomäärä geeniä, joka on homologinen isäntäsolun kanssa, niin että saadaan lisättyä sen tietyn gee-:: nituotteen tuotantoa.

Lyhyt kuvoiden kuvaus: 3,35 Keksintöä selventävät oheen liitetyt kuviot, joissa 16 112502 kuviossa 1 on pi a sr, i d 1 n pDNlOQO restriktiokartta , kuviossa 2 on plasmidin pE194 restriktiokartta, kuviossa 3 on plasmidin pPL1975 restriktiokartta, kuviossa 4 on plasmidin pSXD120 restriktiokartta, 5 kuviossa 5 on plasmidin pPL2002 restriktiokartta, kuviossa 6 on plasmidin pDN3060 restriktiokartta, kuviossa 7 on plasmidin pSJ1085 restriktiokartta, kuviossa 8 on plasmidin pl)C19 restriktiokartta, kuviossa 9 on plasmidin pSJ1103 restriktiokartta, 10 kuviossa 10 on plasmidin pSJ1130 restriktiokartta, kuviossa 11 on plasmidin pSJ1136 restriktiokartta, kuviossa 12 on plasmidin pSJ'1137 restriktiokartta, kuviossa 13 on plasmidin pPL1484 restriktiokartta, kuviossa 14 on plasmidin pSJllSb restriktiokartta, 15 kuviossa 15 on plasmidin pSJ1157 restriktiokartta, kuviossa 16 on plasmidin pSJ1259 restriktiokartta, kuviossa 17 on plasmidin pDN2904 restriktiokartta, kuviossa 18 on plasmidin pSJH39 restriktiokartta, kuviossa 19 on plasmidin pSJ1139a restriktiokartta, 20 kuviossa 20 on plasmidin pSJ1139b restriktiokartta, kuviossa 21 on plasmidin pdn3020 restriktiokartta, *: kuviossa 22 on plasmidin pPL1878 restriktiokartta, kuviossa 23 on plasmidin pPL1896 restriktiokartta, : ; : kuviossa 24 on plasmidin pSJ993 restriktiokartta, .£5 kuviossa 25 on plasmidin pSJ1163 restriktiokartta, : kuviossa 26 on plasmidin pSJH36a restriktiokartta, . kuviossa 27 on plasmidin pSJ1136b restriktiokartta, kuviossa 28 on plasmidin pSJ1259a restriktiokartta, kuviossa 29 on plasmidin pSJ1555 restriktiokartta, 30 kuviossa 30 on plasmidin pSJ1555a restriktiokartta ja kuviossa 31 on plasmidin pSJ1555b restriktiokartta.

.· ’ Kaikissa kuvioissa nuolet osoittavat transkriptiosuuntaa.

,35 Replikaatioalkujen lukemisen helpottamiseksi (+ ori pUBHQ, + ori pE194, ori pUC19) ne on merkityy todellisiin replikoituimi- ! 7 112502 sen alkamiskohtaan, vaikka funktiona a. 1 inen alku muodostuukin suuremmasta DNA:n alueesta.

Keksintöä selventävät edelleen seruaavat esimerkit,, jotka eivät 5 millään tavoin rajoita patenttivaatimusten mukaista keksinnön ajatusta ja suojapiiriä.

Materiaalit ja menetelmät:

PLASMTDIT

10 pBE)64; kuvanneet Gryzcan et ai,, 1980.

pDN3060: kloonausvektori, joka on johdettu Bacillus-plamisdista PDN1050 (Diderichsen, B., 3986) insertoimalla synteet-15 tisiä oiigonukelotidejä, jotka sisältävät joukon käyt tökelpoisia restriktiokohtia. Restriktiokartta näkyy kuviossa 6.

pDN2904: johdettu Baoi 1 lus-plasmidista plJBllO (Gryczan et ai., 20 1987), joka sisältää sekä kloramfenikoliresistenssi- geenin sekä kanamysiiniresistenssigeenin. Restriktio-*. ·; kartta näkyy kuviossa 17, : : ' pPL1484: pUC19 (Yanisch-Perron et ai. , 1985) -johdannainen, joka sisältää modifioidun polylinkk.erialueen, johon : insertoitiin 1,4 kb: n BamH i - fragmentti pDN2904 :stä, joka sisälsi kanamysiiniresistenssigeenin, Restrikti okartta näkyy kuviossa 13.

30 pPL'1878: pDN1380 (kuvanneet Di.derichsen and Christiansen,

1988), joka sisältää 2,4 kb:n HaeII-SphI-fragmentin, joka koodaa sykiodekstriiniglykosyylitranseferaasia ' (CGTase), jonka lähde on Thermoanaerobacter sp. ATCC

, *. 53627. Aluiksi geeni kloonattiin E. coli -plasmidiin ••.35 pBR322 12,8 kb:n EcoRI-fragmentissa (Starnes et ai., :'· 1989). Restriktiokartta näkyy kuviossa 22, 18 112502 (BAKTEERI)KANNAT: E. coli SJ6: restriktiovajaa MC1000 (Diderichsen et ai., 5 1990) -johdannainen

Bacillus subtilis DN1885: B. subtilis 168:n amyE-, amyR2, spo+,

Pro-johdannainen.

10 Bacillus subtilis DN1686: DN'1280:n spo-johdannainen, jossa on kromosomaalinen deleetio dal-geenis-sä (Diderichsen, 1986).

Bacillus licheniformis ATCC 9789 15

Bacillus lentus NCIB 10309 ELATUSAINEET: 20 TY:

Tryptikaasi 20 g/1

Hiivauute 5 g/1

FeCl2.4H20 6 mg/1

MnCl2.4H20 1 mg/1 :/.:25 MgS04.7H20 15 mg/1 : /. i PH: 7,3 TY9: Kuten TY, mutta pH säädettiin 8,5:een lisämällä NaHC03 (0,1 M) 30 TY9 agar: * '· Tryptikaasi 20 g/1

Hiivauute 5 g/1

FeCl2.4H20 6 mg/1 35 MnCl2.4H20 1 mg/1

MgS0„.7H20 15 mg/1 19 112502

Bacto agar 5 g/χ pH säädetty 8,5 reen lisämällä NaHCO-, (0,1 M) BPX: 5 Perunatärkkelys 100 g/1

Ohrajauho 50 g/1 BAN 5000 SKB 0,1 g/1

Natriumkaseinaatti 10 g/1

Soijajauho 20 g/'l 10 Na2HP04, 12 H,0 9 g/1

Pluronic 0,1 g/1 LB agar:

Bacto-tryptoni 10 g/1 15 Bacto-hiivauute 5 g/1

NaCl 10 g/1

Bacto agar 15 g/1 Säädetty pH 7,5:een NaOH:11a

20 YLEISET MENETELMÄT

Kokeissa käytetyt tekniikat, joiden avulla plasmidit koottiin, ' · "· olivat yhdistelmä-DNA-tekniikoissa tavallisia (ks. T. Maniatis et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring : / / Harbor, New York, 1982).

:/.25 /·.· Restriktioendonukleaasit hankittiin New England Biolabs- ja // Boehringer Mannheim -yhtiöiltä ja niitä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. T4 DNA -ligaasi hankittiin New England Biolabs -yhtiöltä ja sitä käytettiin valmistajan ohjeiden mu-30 kaisesti.

Kaikista kannoista plasmidi-DNA valmistettiin tavalla, jota on kuvannut Kieser, 1984.

/35 E. colin transformointi: 2u 112502 E. coli -solut tehtiin vastaanottavaisiksi ja transformoitiin tavalla, jota on kuvattu (Mandel and Higa, 1970), tai ne transformoitiin elektroporaation avulla (kuvaus BIO-RAD Gene Pulser elektroporaatiolaitteen käyttöoppaassa).

5 B. subtiliksen transformointi:

Valmistettiin vastaanottavaiset solut ja transformoitiin ne tavalla, jota ovat kuvanneet Yasbin et ai., 1975.

10 B. licheniformiksen transformointi:

Plasmidit vietiin B. licheniformikseen polyetyleeniglykolivä-litteisellä protoplastitransformaatiolla, jota on kuvannut Äka-matzu, 1984.

15 B. lentuksen transformointi:

Plasmidit vietiin Akamatzun menetelmästä (1984) hieman eroavalla protoplastitransformaatiolla. Muutokset olivat korkeampi pH regenerointielatusaineessa, esimerkiksi HPC 1,5 -elatusaine puskuroitiin pH-arvoon 8,5 lisäämällä elatusaineeseen 0,1 M 20 NaHC03:a.

' · ' Esimerkki 1 ’ ' Replikoitumattoman DNÄ-molekyylin integroiminen stabiilisti :,v Bacillus lentus -kromosomiin 25 :*·.· Subtilisin 309 -geenin kloonaus:

Geeni, joka koodaa proteaasia "subtilisin 309", kloonattiin isolaatista, joka oli saatu B. lentus -kannasta NCIB 10309 tavalla, jota kuvaa WO 89/06279. Seuraavassa subkloonauksessa 30 syntyi plasmidi pSX120, joka sisältää replikaatioalun pUB110:s-tä, kloramfenikoliresistenssigeenin (cat) pC194:stä, kaksi pro-’· moottoria, pÄnyM ja PAmyQ, ja geenin, joka koodaa subtilisin 309 -proteaasia (ks. kuvio 4 patenttihakemuksessa PCT/DK90/00i64).

35 Integraatioplasmidin pPL20Q2 kokoaminen: 11 9!“ n 9 S I \_ V.·

Plasmidi pDNJOOO koottiin restriktoimalla pUC19 (Yanisch-Perron et ai.) EcoRI:n avulla ja insertoimalla seuraavanlainen oligo-nukleotidisekvenssi (valmistettu fosfoamidiittimenetelmällä, jota ovat kuvanneet Beaucage ja Caruthers (Tetrahedron Letters 5 22, pp. 1859-1869, 1981) käyttäen automaattista DNA-synteti-saattoria

AATTGATCAAGCTTTAAATGCATGCTAGCAACGCGGCCGCCAACCTCGAGATCTCATG

CTAGTTCGAAATTTÄCGTÄCGÄTCGTTGCGCCGGCGGTTGGAGCTCTÄGÄGTÄCTTÄA

10 linearisoituun pUC19:ään ja suorittamalla sen jälkeen ligaatio. Ligaatioseosta käytettiin sitten transformoimaan vastaanottavaisia E. coli SJ6 -soluja ja transformantit valikoitiin LB-alustoille, joissa oli 100 ug/ml ampisilliinia. pDN3000:een 15 insertoitu linkkeri on orientoitunut tavalla, joka näkyy rest-riktiokohdissa kuviossa 1.

Plasmidi pPLl975 koottiin restriktoimalla pDN3000 BglII:lla ja ligatoimalla sitten tämä linearisoitu plasmidi Mbol-fragment-20 tiin, joka sisälsi DN“A:n kohdasta 1 kohtaan 1585, joka puoles-, , taan oli saatu restriktoimalla pE194 (kuvio 2, Horinouchi and • · Weisblum) MboI:llä. Sitten ligaatioseosta käytettiin transformoimaan vastaanottavaisia E. coli SJ6 -soluja ja transformantit valikoitiin LB-alustoille, joissa oli 100 μg/ml ampisilliinia.

25 Näiden kahden fragmentin liittymisorientoituminen näkyy rest-: riktiokohdissa kuviossa 3. pPL1975 sisältää siis funktionaali- :sen E. coli -replikaatioalun ja pE194-DNA-fragmentin, jossa on koskematon plus-alku (+ ori pE194) ja katkaistu repF-geeni (repF') (Villafane et ai., 1987).

30

Plasmidi pPL2002 (kuvio 5) koottiin restriktoimalla pPL1975 (kuvio 3) EcoRI:11a ja BamHIrllä ja ligatoimalla linearisoitu ’ ’ _ plasmidi sitten pSX120:n 3,3 kb:n EcoRI (partiaalinen), Bglll-: : fragmenttiin (kuvio 4), joka sisälsi subtilisin 309 -geenin ja ; ‘ 35 cat-resistenssigeenin. Ligaatioseoksella transformoitiin sit- 2,2 112 5 C 2 ten vastaanottavaisia E. coli SJ6 -soluja ja transformantit valikoitiin LB-alustoille, joissa oli 100 μq/ml ampisilliinia.

Plasmidin pPL2002 integroiminen stabiilisti B. lentuksen kro-5 mosomiin: B. lentus -kannan NCIB 10309 isolaatti transformoitiin protoplast itransformaation avulla lämpötilaherkällä plasmidilla pE194 (ks. kuvio 1) erytromysiiniresistenssiä valikoiden (5μg/ml) 30 °C:ssa (permissiivinen lämpötila). Saatu kanta 10 nimitettiin PL2156:ksi.

PL2156 protoplastitransformoitiin sitten plasmidilla pPL2002 kloramfenikoliresistenssiä (8μg/ml) ja erytromysiiniresistenssiä (5μg/ml) valikoiden 30 °C:ssa ja saatiin kanta PL2157, joka 15 sisälsi plasmidit pE194 ja pPL2002. Näissä soluissa plasmidin pPL2002 replikoituminen riippuu täysin plasmidin pE194 läsnäolosta, sillä se koodaa pPL2202:n replikoitumista, joka on ehdottoman tärkeä proteiinin repF kahdentumiselle.

20 Kantaa PL2157 kasvatettiin yli yön T¥9-elatusaineessa ja lai-. . mennokset pantiin TY9-alustoille 45 °C:een (ei-permissiivinen • '· lämpötila) kloramfenikoliresistenssiä valikoiden (10μg/ml).

Yksi tällainen kloramfenikoliresistetti pesäke sai nimityksen •, *25 PL2158 .

:V. Southern-hybridisaatio osoitti, että kannassa PL2158 plasmidi pPL2002 oli integroitunut kromosomiin homologirekombinaatiolla plasmidialkuisen ja kromosomaalisen subtilisin 309 -geenien 30 välillä, ja sitten valmistettiin noin 4 kopiota. Täydellisiä pE194-plasmid.isekvenssejä ei ollut havaittavissa.

< Kromosomaalisesti integroitujen kannan PL2158 pPL20Q2-kopioiden : ; stabiiliutta testattiin suurfermentoinnilla (1500 1) ilman anis tibiootteja.

2 3 112502

Fermentoinnin jälkeen koe-erät laimennettiin ja pantiin TY9-alustoille, ja 100 pesäkettä replikoitiin TY9-alustoille, joilla oli 10 μg/ml kloramfenikolia. 98 näistä testatuista pesäk keistä oli yhä kloramfenikolirestenttejä, mikä osoitti, että 5 plasmidi pPL2002 oli yhä integroituneena kromosomissa. Seuraa-vaksi testattiin 20 näistä pesäkkeistä southern-hybridisaatiol-la, ja havaittiin, että plasmidi pPL2002 oli yhä integroituneena, ilmeisesti samana kopiomääränä (noin 4) kaikissa testatuissa pesäkkeissä.

10

Esimerkki 2

Kaksi pUBHO-replikaatioalkua sisältävien plasmidivektorien kokoaminen:

Plasmidi pSJ1085 koottiin restriktoimalla pDN3060 (joka sisälsi 15 replikaatioalun (+ ori pUBllO), rep-geenin (rep) pUB110:stä ja kloramfenikoliresistenssigeenin (cat) pC194:stä) BamHI:tä ja EcoRI:a käyttäen ja insertoimalla seuraavanlainen oligonukle-otidisekvenssi (valmistettu fosfoamidiittimenetelmällä, jota ovat kuvanneet Beaucage ja Caruthers (Tetrahedron Letters 22, 20 pp. 1859-1869, 1981) automaattisella DNA-syntetisaattori11a ' · ’ *: aattctgcägätatcäägätaagäaägäacäagttccg ‘; ’ GACGTCTATÄGTTCTATTCTTTCTTGTTCÄÄGGCCTÄG • · :/.25 linearisoituun pDN3060:aan ja suorittamalla sen jälkeen liga-/*/ tointi ja B. subtilis DN1885:n transformointi

Plasmidi pSJ1103 (kuvio 9) muodostettiin restriktoimalla pSJ1085 (kuvio 7) EcoRI:11a ja insertoimalla koko linearisoitu 30 plasmidi samalla tavalla restriktoituun plasmidiin pUC19 (kuvio 8), ja suorittamalla sen jälkeen ligatointi ja E. coli SJ6:n -' transformointi. Saatu plasmidi pSJ1103 sisältää plus-alun ja pUBllO:n rep-geenin, pC194:n cat-geenin, pUC19:n replikaatio-: ' alun (ori pUC19) ja B-laktamaasi- (ampisilliiniresistenssi-) .35 geenin (bla).

2 4 112502

Plasmidi pSJ1130 (kuvio 10) johdettiin pSJ1103:sta (kuvio 9) deletoimalla 1,6 kb:n Nsi-Pstl-fragmentti, olennaisesti tuloksena pUC19-plasmidi, joka sisälsi pUBllO-plus-alun ja katkaistun rep-geenin (rep7). Plasmidi transformoitiin sitten E. coli 5 SJ6:een.

1,4 kb:n fragmentti pDN3060:sta (kuvio 6), joka sisälsi plus-alun ja sen jälkeen koskemattoman rep-geenin, insertoitiin sitten pSJ1130:n ainoaan HindiII-kohtaan (kuvio 10), ja ligatoitu 10 plasmidi transformoitiin sitten E. coli SJ6:een ja saatiin pSJ1136 (kuvio 11). Tässä kokeessa fragmentti sattui insertoi-tumaan pSJ1136:een kahtena tandemkopiona. Toinen näistä kopioista deletoitiin sitten hajottamalla pSJH36 Nsilillä, uudel-leenliittämällä 5,1 kb:n fragmentti ja transformoimalla E. coli 15 SJ6, tuloksena pSJ1137 (kuvio 12), joka sisältää yhden pUBHO-alun katkaistun rep-geenin vieressä ja yhden pUB110-alun koskemattoman rep-geenin vieressä.

Kanamysiiniresistenssiä koodaava geeni (kan) irrotettiin plas-20 midista pPL1484 (kuvio 33) 1,4 kb:n Sphl-fragmentissa ja inser-, . toitiin kumpaakin mahdollisista orientaatioista pSJ1137:n Sphl- * kohtaan (kuvio 12), transformoitiin sitten E. coli SJ6 ja saatiin sekä pSJ1155 (kuvio 14) että pSJ1157 (kuvio 15). pSJ1157 '.\ sisälsi kan-geenin kahtena tandemkopiona. Toinen kopio leikat-*.*••25 tiin BamHI:llä ja 6,5 kb:n fragmentti ligatoitiin uudelleen, :/·· transformoitiin E. coli SJ6:een ja saatiin pSJ1259 (kuvio 16).

Plasmidi pSJ1139 (kuvio 18) muodostettiin seuraavaan tapaan: Bacillus-plasmidi pDN2904 (kuvio 17), joka sisälsi kloram-30 fenikoliresistenssigeenin (cat), kanamysiiniresistenssigeenin . (kan) ja pUBHQ plus-alun vastaavina rep-geeneineen, hajotet-tiin Sphl:llä ja ligatoitiin pSJ1130:aan (kuvio 10), joka myös ' , oli hajotettu Sphl:llä. Saatava plasmidi pSJH39 sisältää kat- kaistuun rep-geeniin liittyvän pUB110-alun ja koskemattomaan : 35 rep-geeniin liittyvän pUB110-alun.

2b 112502

Esimerkki 3 Jäikeläisvektoreiden muodostaminen plasmideista, jotka sisältävät kaksi pUBilO-replikaatioalkua Bacillus subtiliksessa: 5 Plasmidi pSJH39 (kuvio 18) (valmistettuna E. coli SJ1139:stä sinänsä tunnetulla tavalla) transfomoitiin B. subtilis DN1885:een kanamysiiniresistenssiä valikoiden (10 μg/πil), ja plasmidi DNA valmistettiin useasta transformantista. Kun näille plasmideille suoritettiin agaroosigeenielektroforeesi, olipa 10 ne hajotettu tai ei erilaisilla restriktioentsyymeillä, ilmeni, että läsnä oli kaksi pienempää DNA-molekyyliä, 5,1 kb ja 2,4 kb, sekä myös pieni määrä täysimittaista 7,5 kb:n plasmidia pSJ1139. Saatavat restriktiomallit olivat sellaiset, joita odottiinkin kahden jälkeläisvektorin, pSJ1139a (kuvio 19) ja 15 pSJll39b (kuvio 20) muodostumiselta, joko kahden pSJ1139:n rep-sekvenssin homologivaihdon myötä tai Rep-proteiinin vaikutuksesta, joka tekee nick-kohdan pUBHO plus-alkuun plus-DNA-säi-keeseen, joka sitten irrotetaan ja kierrätetään uudestan tavalla, jota ovat kuvanneet A. Gruss ja S. D. Ehrlich (op. cit.) 20 (molemmilla mekanismeilla päästään samoihin kahteen jälkeläis-. . vektoriin).

• > I t · I

I · I < t i ’ ’ Näitä kahta vektoria analysoitiin edelleen ja transformoitiin • t · ne uudestaan B. subtiliksen kantaan DN1885 ja levitettiin LB-\ *25 alustoille, jotka sisälsivät joko 10 μg/ml kanamysiiniä tai 6 ·'/·) μg/ml kloramfenikolia, ja sen jälkeen kaikki replikat maljat-: tiin levittämällä uudelle alustalle, joka sisälsi toisenlaista antibioottia. Sitten kaikista transformanttityypeistä eristettiin vektorit ja analysoitiin agaroosigeelielektroforeesin 30 avulla seuraavin tuloksin:

Transformantit, jotka ovat resistenttejä sekä kloramfenikolin * 1 että kanamysiinin suhteen, sisältävtä kaikki kolme vektorilajia ; (7,5 kb:n pSJ1139, 2,4 kb:n pSJ1139a ja 5,1 kb:n pSJ1139b.

35 Kloramfenikoniresistentit ja kanamysiiniherkät transformantit ‘ sisältävät vain pSJ1139b:tä. Kanamysiiniresistenttejä, mutta

I S

112502 26 kloramfenikoliherkkiä transformantteja ei saatu lainkaan. Pieni 2,4 kb:n jälkeläisvektori pSJ1139a ei siis pysty replikoitu-maan itsenäisesti B. subtiliksessa.

5

Esimerkki 4

Relikoitumattoman DNA-molekyylin integroiminen stabiilisti B. subtiliksen kromosomiin: 10

Yhden syklodekstriiniglykosyy1itransferaasigeenin kromosomaali-sen kopion sisältävän B. subtilis -kannan kokoaminen CGTase-geeni (CGT) ekskisoitiin plasmidista pPL1878 (kuvio 22) 15 2,5 kb:n BamHI-SphI-fragmentissa ja ligatoitiin BamHI-Sphl-ha-jotettuun plasmidiin pDN3020 (kuvio 21) muodostamaan plasmidi pPL1896 (kuvio 23). pDN3020 on pDN131:n johdannainen (Diderich-sen, 1986), joka on muodostettu insertoimalla synteettinen Sphl:n sisältävä oligonukleotidilinkkeri (valmistettuna esimer-20 kin 1 tapaan) plasmidin pDNi380 (Diderichsen and Christiansen, .·. : 1988) EcoRI-kohtaan, jolloin syntyy plasmidi pDN1620.

____· pDN1620:ssä läsnä olevan B. stearothermophiluksen maltogeeni- . . amylaasin promoottorialue (PamyM) (B. Diderichsen and L. Chris-; \ tiansen. op. cit.) siirrettiin sitten SphI-BamHl-hajotettuun • 25 pUC19:ään noin 200 emäsparin BamHI-SphI-fragmentissa, ja saa-'· ·; tiin plasmidi pDN2977. Promottorialue ekskisoitiin sitten ·,·’· pDN2977:stä noin 200 emäsparin BglII-SacI-fragmentissa, joka oli insertoitu pDN1313:n polylinkkerialueelle, jolloin saatiin plasmidi pDN3020. pPL1896:n CGTase-geenin molemmin puolin tu- 30 lee kaksi B. subtiliksen kromosomaalisen DNA:n fragmenttia, • jotka on merkitty dal ja dfs kuviossa 23. dal on geeni, joka . : koodaa B. subtiliksen D,L-alaniinirasemaasia (Diderichsen 1986).

'3 5 Plasmidi pPL1896 transformoitiin B. subtiliksen kantaan DN1686. Kun valinnan kohteena olivat vain Dal+-transformantit, saatiin 112502 27 useampi kanta, jotka olivat kloramfenikoliherkkiä, CGTase'. Ne muodostettiin kahdenkertaisella homologitekijäinvaihdolla pPL1896:n ja DN1686:n kromosomin kesken, kuten on kuvannut Di-derichsen 1986. Eräs tällainen kanta on PL1897, joka sisältää 5 kromosomaalisesti intergroidun kopion CGTase-geenistä.

CGTase-geenin sisältävän integraatiovektorin muodostaminen: CGTase-geeni ekskisoitiin pPL1878:sta (kuvio 22) 2,5 kb:n Bam-HI-Notl-fragmentissa. Koottiin ekspressiovektori insertoimalla 10 tavanomaisin mutageneesimenetelmin saadusta B. licheniformis ATCC9789:n amylaasia liikaa tuottavasta johdannaisesta kloonatun alfa-amylaasigeenin promottorialueen sisältävä 0,6 kb:n SphI-Pstl-fragmentti pUBHOrstä johdettuun vektoriin, joka sisälsi pUB110-alun ja kanamysiiniresistenssiä koodaavan geenin. 15 CGTase-geeni (cgt) insertoitiin alavirtaan tästä promottorista BamHI- ja Notl-kohtien väliin, ja saatiin pSJ993 (kuvio 24).

4 kb:n BglII-fragmentti pSJ993:sta insertoitiin pSJil55:n Bglll-kohtaan (esimerkki 1, kuvio 14), saatava plasmidi trans-20 formoitiin E. coli-kantaan SJ6, ja ampisilliiniresistenttejä, : CGTase:a tuottavia E. coli SJ6:n transformantteja eristettiin levittämällä transformantit LB-alustoille, joissa oli 100 μg/l amplisilliinia j a0,5 % liukoista tärkkiä, ja kun alustat oli käsitelty jodihöyryilä, tutkittiin pesäkkeiden ympärille muo-25 dostuvaa kirkasta kehää. Plasmidin pSJ1163 sisältävä transfor-mäntti (kuvio 25), johon kanamysiiniresistenssigeeni oli regeneroitunut, säilytettiin jatkokeita varten.

Jälkeläisvektorien muodostaminen pSJ1163:sta B. subtilis -kan-30 noista DN1885 ja PL1897: pSJ1163 (kuvio 25) transformoitiin DN1885 :een, vektori-DNA valmistettiin kanamysiiniresistenteistä transformanteista ja tutkittiin agaroosigeelielektroforeesin avulla. Löytyi pieniä ' määriä 10,5 kb:n plasmidimolekyylejä, jotka vastasivat 35 pSJ1163:a ja kahta jälkeläisvektorimolekyyliä, 4,1 kb:n pSJ1163b (kuvio 27) ja 6,4 kb:n pSJ1163a (kuvio 26), toista

2 S

112202 suurin piirtein yhtä suurena määränä, toista huomattavasti suurempana määränä, jälkeläisvektoreina, jotka olivat muodostuneet joko homologirekombinaatiossa pSJil63:n kahden rep-sekvenssin välillä tai sitten Rep-proteiinin vaikutuksesta rengasreplikaa-5 tion avulla kummassakin plus-alussa kuten edellä kuvattiin. Kuvatun kaltainen jälkeläisvektorien muodostuminen oli havaittavissa myös silloin, kun pSJil63 transformoitiin PLl897:ään, ja kaksi tällaista transformanttia säilytettiin jatkokokeisiin kantoina SJ1168 ja SJ117Q.

10

Replikoitumattomia DNA-molekyylejä sisältävien integranttien eristäminen: SJ1168- ja SJ1170-kantoja siirrostettiin 10 ml:aan TY-ela-tusainetta, joka sisälsi 5 Mg/ml kanamysiiniä, ja inkuboitiin 15 yli yön 37 °C:ssa. Kumpaakin viljelmää sirrostettiin sitten 100 μΐ tuoreeseen TY-elatusaineeseen ja inkubointikäsittely toistettiin. Neljän tällaisen yön yli jatkuvien inkubointisyklin jälkeen näistä kahdesta viljelmästä valmistettiin plasmidi-DNA ja analysoitiin agaroosigeelielektroforeesin avulla.

20 Plasmidimolekyylejä ei ollut havaittavissa. Kun plasmidin val-.·.: mistuksessa käytettiin ampisilliiniresistenssiä valikoivan E.

____· coli:n transformoimiseen, transformantteja ei ollut havaitta- . . vissa, eli läsnä ei ollut alkuperäistä 10,5 kb:n pSJ1163:a eikä pSJii63b:n 4,1 kb:n jälkeäisvektorimolekyyliä. Kanamysiini-; 25 resistentit plasmidittomat kannat säilytettiin jatkokokeisiin '· "· SJ1223:na ja SJ1237:nä.

Integroidun DNA:n monistaminen:

Kasvua valikoiden TY-väliaineessa, joka sisälsi asteittain li-30 sääntyviä määriä kanamysiiniä, eristettiin kannat, jotka pys-tyivät kasvamaan 20, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200 ja .·:·, 1400 ug/ml:n kanamysiinimäärässä. Kun kromosomaalinen DNA kan noista, jotka sietivät yli 400 Mg/ml kanamysiiniä hajotettiin Nhel:llä tai NotI:llä, löytyi odotetun kokoinen DNA-vyöhyke 35 hajotettaessa 6,4 kb:n jälkeläisvektori pSJ1163a näillä entsyy-meillä. Vyöhykettä ei löytynyt hajotettaessa DNA:ta kannoista, 29 1 Ί ΟΓΠΠ I ι z b u z joiden kanamysiiniresistenssi oli vähäisempi. Varovaisesti arvioiden tässä vyöhykkeessä oli läsnä vähintään 5-10 kopiota integroidusta DNA:sta.

5

Integroidun DNA:n stabiilisuus:

Kantoja, jotka sietivät 400 μg/ml kanamysiiniä, kasvatettiin viikon ajan 37 °C:ssa ravisteltavissa pulloissa, jotka sisälsi-10 vät BPX-elatusainetta ilman lisättyä kanamysiiniä. Ne levitettiin sitten LB-alustoille ja myöhemmiin replikat maljättiin alustoille, jotka sisälsivät 10 μg/ml kanamysiiniä. Noin sadasta pesäkkeestä kaikki olivat kanamysiiniresistenttejä, eli integroidussa DNA:ssa läsnä ollut kanamysiiniresistenssigeeni 15 oli ilman valintapainetta periytynyt stabiilista.

Plasmidisyntyisen CGTase-geenin stabiilisuus B. subtiliksessa: Plasmidi pP11892 on olennaisesti samanlainen kuin pSJ993 (kuvio 24), ainoa ero on erilainen polylinkkerialue alavirtaan CGTase-20 geenistä. Tämä plasmidi vietiin DN1885:een ja saatua kantaa SJ984 kasvatettiin viikon ajan 37°C:ssa ravisteltavissa pul-loissa, jota sisälsivät BPX-elatusainetta ilman lisättyä kana-mysiiniä.

; 25 Levitys kanamysiiniä sisältäville alustoille (10 μg/ml) tuotti : 10-kertaa vähäisemmän solumäärän kuin kanamysiiniä sisältämät- '· ' tömät alustat, eli 90 % soluista oli menettävnyt plasmidinsa.

Tämä heijastui myös havainnosta, että alle 10 % kanamysiiniä sisltämättömien alustojen pesäkkeistä tuotti CGTase:a.

30 :' \; Esimerkki 5 Jälkeläisvektorien muodostaminen pSJ1156:sta B. licheniformis ATCC 9789:ssä:

Plasmidi pSJ1156 on samanlainen kuin pSJ1157 kuviossa 15.

35 pSJ1156 vietiin B. licheniformis ATCC 9789:ään protoplasti-transformaation avulla, kanamysiiniresistenssiä valikoiden, ja

3 U

112502 saatiin kanta SJ1199. Tutkittaessa SJ1199:n plasmidisisältöä restriktioentsyyraihajotuksen ja agaroosigeelielektroforeesin avulla osoitti läsnä olevan kahta plasmidimolekyyliä. Toinen oli identtinen pSJi259:n kanssa (kuvio 16), ja todennäköisimmin 5 muodostunut kan-geenin kopion deletoitumisesta homologirekom-binaatiossa. Toinen vastasi pSJ1259a:ta (kuvio 28), toista jälkeläismolekyylistä, jotka pystyivät muodostumaan joko homo-logirekombinaatiolla pSJ1259:n kahden rep-sekvenssin välillä tai Rep-proteiinin vaikutuksesta rengasreplikaatiossa kummassa-10 kin plus-alussa kuten edellä kuvattiin.

Esimerkki 6

Replikoitumattoman DNA-molekyylin integroiminen stabiilisti B. licheniformis ATCC 9789:n kromosomiin: 15

Integrointivektorin kokoaminen:

Plasmidi pSJ1260 on identtinen pSJ1259:n kanssa (kuviossa 16). Kromosomaalista DNArta B. licheniformis ATCC 9789:stä hajotet-20 tiin PstI + BamHI:llä ja 2-4 kb:n fragmentteja eristettiin aga-roosigeelistä. Fragmentit ligatoitiin pSJ1260:een, joka oli • :··: hajotettu PstI + BamHI :IIä , ja transformoitiin E.coli SJ6:een, . joka valikoi ampisilliiniresistessiä. Yksi saatu transformant- f· · ti sisälsi 2,1 kb:n insertin, ja plasmidille annettiin nimitys 25 pSJ1555 (kuvio 29). pSJ1555:n sisältävä E. coli SJ6 on talle- ;tettu: National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd, 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2, 1RY, Scotland, UK, 12.12.1990 Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Proce-30 dure -sopimuksen mukaisesti talletusnumerolla NCIMB 40346.

Tämä plasmidi kykenee muodostamaan jäikeläismolekyylit pSJ1555a (kuvio 30) ja pSJ1555b (kuvio 31).

Replikoitumattoman DNA-molekyylin sisältävän B. licheniformis-35 integrantin eristäminen: 112502 31 pSJ1555 vietiin B. licheniformis ATCC 9789:ään protoplasti-transformaation avulla kanamysiiniresitenssiä valikoiden. Yksi regeneroitunut kanamysiiniresistentti transformantti (SJ1613) on plasmiditon, kuten voidaan havaita tästä transformantista 5 valmistetun plasmidipreparaatin geelielektroforeesilla, eikä plasmidipreparaatti pysty transformoimaan B. subtilikseen kana-mysiiniresistenssiä. Tulos osoittaa, että on muodostunut rep-likoitumaton jälkeläismolekyyli pSJ1555a ja integroitunut ATCC 9789:n kromosomiin.

10

Integroidun DNA:n monistaminen ja stabiilisuus:

Kantaa SJ1613 kasvatettiin perättäissä 10 ml:n TY-viljelmissä, jotka sisälsivät kanamysiiniä 10, 20, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000 ja 5000 Mg/ml, ja näis-15 sä eri pitoisuuksissa kasvavia kantoja säilytettiin myöhempä tutkimusta varten. 20, 200 ja 1500 Mg/ml kanamysiiniä sisältäviä kantoja tutkittiin edelleen. Kahden viimeksi mainitun kannan kromosomaalisesta DNA:sta löytyi BamHI-hajotuksessa selvä 4,5 kb:n vyöhyke, jota ei löytynyt ensimmäisen kannan DNA:ta 20 kuten oli odotettukin kannoilta, jotka sisälsivät moninkertai-: ·.: siä kopioita kromosomiin integroidusta pSJ1555a:sta.

Kaikkia kantoja kasvatettiin BPX-ravistelupulloissa 37 °C:ssa 7 ; päivän ajan ilman kanamysiiniä ja siveltiin sitten LB-alustoil-25 le. Replikamaljaus LB-alustoilta kanamysiinialustoille f 10 ‘,,’ μg/ml) ei paljastanut yhtään kanamysiiniherkkää pesäkettä.

Pesäkelaskut kanamysiiniä sisältämättömiltä ja sitä sisältäviltä (10 μg/ml) alustoilta otettiin kolmesta pesäkkeestä, jotka sietivät 20, 200 tai 1500 μg/ml kanamysiiniä, ja kaikissa ta-30 pauksissa tulos oli 1010 ml'1, mikä osoitti integroidun kan-gee-nin stabiilisuuden.

32 1 12502

InUnutlonil Appllc«tlon No: PCT/ /

MICROORGANISMS

Λ A I

Optio**! Sheet In COAft*ct>Ofl with Iho mlcreorpohUm referred to mi pope—---- lrv« iL— of the deecrtpbMi 1 A. lOCMTIPlCAHON ΟΨ DIPOSIT ·

Fvrthf d*fto*fts Ire Identffled on an oddltloheJ *hee< { ] *

Nam* ·ί debeoftory InotttutJOfl *

NATIONAL COLLECTIONS OF INDUSTRIAL & MARINE BACTERIA

AMmi ·< «·ρο·κMTf ln*tnvtl»n (Including po.tto cod· *nd covntrr) *

23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Scotland, UK

Oil* of dope·* · AccaaalOA Number · 12 December 1990 NCIMB 40346

S. ADDITIONAL INDICATIONS 1 (leove blank It not applicable). Thi· Information la continued on a aaparala attached «hoot Q

In respect of those designations in which a European patent is sought, a sample of the deposited microorganism will be made available only by the issue of such a sample to an expert nominated by the person requesting the sample (Rule 28 (4) EPC) until the publication of the mention of the grant of the European patent or until the date on which the application has been refused or is deemed to be withdrawn.

C. DfSISNATID »TATI· ION WHICH INDICATIONS AM NADI > (H th« todtc·»·»· w· n« tor U «M*ndtod StotM) 0. SCPARATI FUNNISHINS 01 INDICATIONS · (ton· Mank ll net iMcitol , « . The «ndicetl·*· Ncled b«*ow win bo «ubmffled to the IhternttlehoJ Swrpau lot·* 1 (Sp »city the pomoni mature of the lAdtcoftoM d>p- “ AccdtWon Number «f Dope oft ”) 1. 2 ·* receded with the MttornatloAoJ eppNcetlen when Mod (to bo chocked by the mchiMf Office) {y5rfäc<j>________ (Author*,·· ΟΛμΟ |J|p GöltSen

Head Clerk I I Tto d«l· d ncd|( <lr»m ui· ι,ΗιιΜ) fcj IM IntMi^Utwl Bur··· >·

(Authdri,·· OffltuO

_____________________ fntm PCT/SO/1H U.ou.rj IW1) 32b 112502 5 Starnes, R. L. , Trackman, P. C., Katkocin, D. M. (1989). Thermostable cyclodextrin glycosyl transferase, its production and use. International Patent Application, Publication No. WO 89/03421.

Yasbin, R. E. , Williams, G. A., Young, F. E. (1975). J. 10 Bacteriol. 121, 296-304.

R. Villafane, D.H.Beckhofer, C.S. Narayanan and D.Dubnau.: Replication control genes of plasmid pE194. J.Bact.(1987) , 169, p4822-4829.

S. Horinouchi and B.Weisblum.: Nucleotide sequence and 15 functional map of pE194 a plasmid that.-, specifies inducible resistance to macrolide lincosamide and Streptogramin type B antibiotics.: J.Bact.,(1982), p804-814.

Kieser, T. (1984). Factors affecting the isolation of CCC DNA , , from Streptomvces lividans and Escherichia coli. Plasmid 12, ‘‘ ; 20 19-36.

• * ♦ « t i * » t 33 112502 LIITEJULKAISUT: , 10 Akaroatzu, T-, Sekiguchi, J. (1984). An improved method of protoplast regeneration for Bacillus species and its application to protoplast fusion and transformation. Agric. Biol. Chem. 48, 651-655.

Yanisch-Perron, C., Vieira, J., Messing, J. (1985). Improved 15 M13 phage cloning vectors and host strains: Nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, 33, 103- 119.

Diderichsen, B. (1986). A genetic system for stabilization of cloned genes in Bacillus subtilis. In Bacillus Molecular 20 Genetics and Biotechnology Applications. Ganesan, A. T. and Hoch, J. A., Eds., pp. 35-46, Academic Press.

Diderichsen, B., Christiansen, L. (1988). Cloning of a maltogenic alpha-amylase from a Bacillus stearothermophilus.: : ; ·.; FEMS Microbiology Letters, 56, 53-60.

25 Diderichsen, B. , Wedsted, U., Hedegaard, L. , Jensen, B. R. , : Sjoholm, C. (1990). Cloning of aldB. which encodes a- ’ · ’ . acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus: j : brevis. J. Bacteriol., 172, 4315-4321.

Gryczan et al. (1980). J. Bacteriol. 141, 246-253. .

Gryczan et al. (1978). Characterization of Staphylococcus ; aureus plasmids introduced by transformation into Bacillus : subtil is. J. Bacteriol. 134 , pp. 318-329.

Mandel, A., Higa, A. (1970). J. Mol. Biol. 53, 159-162.

Claims (40)

1. Menetelmä sellaisen bakteerisolun tuottamiseksi, jolla on genomissaan integroitu replikoitumaton DNA-rakenne, jossa on 5 1) haluttu DNA-sekvenssi, 2) DNA-sekvenssi, joka on homologi nen solun genomin jonkin alueen kanssa ja 3) replikaation aloituskohta, DNA-rakenteessa ei ole funktionaalista geeniä, joka koodaisi tekijää, joka tarvitaan replikoitumisen alkamiseen tästä replikaation aloituskohdasta, tunnettu siitä, että 10 a) transformoidaan bakteerisoluja emoplasmidivektorilla, joka sisältää ensimmäisen replikaation aloituskohdan ja toisen replikaation aloituskohdan, joka on samoin orientoitunut kuin ensimmäinen replikaation aloituskohta, jotka ensimmäinen ja 15 toinen replikaation aloituskohta ovat riittävän samanlaisia ollakseen toimivia samalla replikaatiotekijällä (-tekijöillä) , jolloin ensimmäinen ja toinen replikaation aloituskohta jaka-20 vat vektorin kahteen osaan (i) ensimmäisen osan käsittäessä : ensimmäisen replikaation aloituskohdan ja yhden tai useamman funktionaalisen geenin, joka koodaa replikaatiotekijää (tai -tekijöitä), jota tarvitaan plasmidireplikaatioon, joka alkaa ,·, ; mainituista ensimmäisestä ja toisesta replikaation aloitus- j 25 kohdasta, ja (ii) toisen osan käsittäessä toisen replikaation aloituskohdan, halutun DNA-sekvenssin, DNA-sekvenssin, joka I t * on homologinen sellaisen solun genomin jonkin alueen kanssa, johon soluun vektori aiotaan viedä, ja 30 b) viljellään transformoituja soluja selektiivisissä olosuh-! teissä, replikoidaan emoplasmidivektori, jolloin muodostuu ensimmäinen jälkeläisvektori käsittäen ensimmäisen replikaa-' tion aloituskohdan ja yhden tai useamman funktionaalisen . geenin, joka koodaa tekijää (tekijöitä) jota tarvitaan plas- "· 35 midin replikoitumiseen mainituista ensimmäisestä ja toisesta replikaation aloituskohdasta, sekä toinen jälkeläisvektori käsittäen toisen replikaation aloituskohdan, muttei funktio- 112502 35 naalista geeniä, joka koodaisi replikaatiotekijää, ja käsittäen myös halutun DNA-sekvenssin, sekä DNA-sekvenssin, joka on homologinen solun genomin jonkin alueen kanssa, jolloin jatkettu transformoitujen solujen viljely selektiivisissä 5 olosuhteissa johtaa toisen jälkeläisvektorin integroitumiseen bakteerin genomiin homologirekombinaation avulla ja ensimmäinen jälkeläisvektorin samoin kuin emoplasmidin häviämiseen soluista.

2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att den andra replikationsstarten har härletts frän samma plasmid som : den första replikationsstarten. 44 Λ Λ Τ Ο Ο ! ί ι ΰ υ

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen replikaation aloituskohta on johdettu samasta plasmidista kuin ensimmäinen replikaation aloituskohta.

3. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att en gen som kodar för den replikationsfaktor som anknyter sig tili den andra replikationsstarten har deleterats.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 15 että geeni, joka koodaa replikaatiotekijää, joka liittyy toiseen replikaation aloituskohtaan, on deletoitu.

4. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att en 5 gen som kodar för den replikationsfaktor som anknyter sig tili den andra replikationsstarten har modifierats.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geeni, joka koodaa replikaatiotekijää, joka liittyy toi- 20 seen replikaation aloituskohtaan, on muunneltu. • 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • että geeni on muunneltu deletoimalla, insertoimalla tai subs- . . : tatuoimalla yksi tai useampi geenin DNA-sekvenssin nukleotidi ; 2 5 tai deletoimalla transkriptio- tai translaatioaloitus- tai -lopetussignaalit.

5. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att genen har modifierats genom deletering, insertering eller substitution av en eller flera nukleotider av genens DNA-sekvens, 10 eller genom deletering av transkriptionella signaler eller translationella start- eller stoppsignaler.

6. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att mo-derplasmidvektorn är sadan att den inte kan replikeras vid förhöjda temperaturer som ännu tilläter att värdcellen växer, 15 och att bakteriecellerna tili en början odlas i en temperatur som tilläter plasmidreplikation och därefter, efter att den andra avkommevektorn har integrerats i bakteriens genom, fortsättes odlingen i en temperatur som inte tilläter plas-midreplikation pä sä sätt att den första avkommevektorn säväl ;20 som modervektorn försvinner frän cellen.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että emoplasmidivektori on sellainen, ettei se pysty repli-. ,· 30 koitumaan korkeammissa lämpötiloissa, joissa isäntäsolu kui- tenkin kasvaa, ja että bakteerisoluja viljellään aluksi läm-pötilassa, jossa plasmidi replikoituu, ja sen jälkeen, kun * toinen jälkeläisvektori on integroitunut bakteerigenomiin, : jatketaan viljelyä lämpötilassa, jossa plasmidi ei pysty 35 replikoitumaan, niin että sekä ensimmäinen jälkeläisvektori että emovektori häviävät solusta. 36 I \l υ u z

7. Förfarande enligt vilket som heist av patentkraven 1-6, ; ; kännetecknat av att modervektorn uppvisar en första plus-rep-: likationsstart frän en enkelsträngad DNA-plasmid och en andra plus-replikationsstart frän en enkelsträngad DNA-plasmid, med 25 samma orientation som den första plus-replikationsstarten, : varvid den första och den andra plus-replikationsstarten de- ; lar vektorn i tvä delar, (i) varvid den första delen omfattar den första plus-replikationsstarten och en funktionell rep gen som kodar för en faktor som krävs för replikering frän ’30 den första och den andra plus-replikationsstarten, och (ii) ; varvid den andra delen omfattar den andra plus-repiikations-> starten, en DNA-sekvens av intresse och en DNA-sekvens som är homolog med ett omräde av genomet i en cell, till vilken plasmidvektorn skall införas. 112502 45

7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että emovektorissa on ensimmäinen plus-repli-kaation aloituskohta yksisäikeisestä DNA-plasmidista ja toinen plus-replikaation aloituskohta yksisäikeisestä DNA- 5 plasmidista, joka on orientoitunut samoin kuin ensimmäinen plus-aloituskohta, ensimmäisen ja toisen plus-replikaation aloituskohdan jakaessa vektorin kahteen osaan, (i) ensimmäisen osan käsittäessä ensimmäisen plus-replikaation aloitus-kohdan ja funktionaalisen rep-geenin, joka koodaa tekijää, 10 joka vaaditaan replikaatiolle ensimmäisestä ja toisesta plus-replikaation aloituskohdasta, ja (ii) toisen osan käsittäessä toisen plus-replikaation aloituskohdan, halutun DNA-sekvens-sin ja DNA-sekvenssin, joka on homologinen sellaisen solun genomin jonkin alueen kanssa, johon soluun plasmidivektori 15 aiotaan viedä.

8. Förfarande enligt patentkrav 7, kännetecknat av att den andra plus-replikationsstarten har härletts fran samma enkel-strängade DNA-plasmid som den första plus-replikationsstarten . 5

9. Förfarande enligt vilket som heist av patentkraven 1-8, kännetecknat av att bakteriecellen är en gram-positiv bakte-rie.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen plus-replikaation aloituskohta on johdettu samasta yksisäikeisestä DNA-plasmidista kuin ensimmäinen plus- 20 replikaation aloituskohta. ·;· ; 9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, ... tunnettu siitä, että bakteerisolu on gram-positiivinen bak- . · : teeri. . ’, ; 25 !,.* 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että gram-positiivinen bakteeri on kanta, joka kuuluu Bacillus- tai Streptomyces-sukuun. ·,,,· 30 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteerikanta on Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis tai Streptomyces lividans. : 3 5

10. Förfarande enligt patentkrav 9, kännetecknat av att den gram-positiva bakterien är en stam som hör tili Bacillus- 10 eller Streptomyces-släkten.

11. Förfarande enligt patentkrav 10, kännetecknat av att bakteriestammen är Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alka-lophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans,

12. Förfarande för att producera en sadan bakteriecell som i sitt genom bär en integrerad icke-replikerande DNA-konstruk- : tion innehällande 1) en DNA-sekvens av intresse, 2) en DNA- sekvens som är homolog med ett omräde av cellens genom ooh 3) , 20 en replikationsstart, varvid DNA-konstruktionen inte innehäl-ler en funktionell gen som kodar för en faktor som behövs för : att päbörja replikationen fran denna replikationsstart, kän- : netecknat av att i förfarandet 25 a) transformeras bakteriecellerna med (i) en första DNA-vek-; tor som uppvisar en första replikationsstart och en eller : flera funktionella gener som kodar för den (eller de) repli- kationsfaktor(er) som behövs för plasmidreplikation fran denna första replikationsstart, och (ii) en andra DNA-vektor '30 som uppvisar en andra replikationsstart men ingen funktionell i gen som skulle koda för den replikationsfaktor som behövs för j plasmidreplikation fran denna första replikationsstart och som även uppvisar en DNA-sekvens av intresse, och en DNA-sekvens som är homolog med ett omräde i genomet i en cell, 112502 46 varvid den första replikationsstarten och den andra replika-tionsstarten är tillräckligt likadana för att fungera med samma replikationsfaktor (-faktorer) pä sä sätt att den andra 5 DNA-vektorns replikation frän den andra replikationsstarten startar medelst en replikationsfaktor (eller -faktorer) som kodas av en (eller flera) gen(er) som är närvarande i den första DNA-vektorn, och 10 b) odlas de transformerade cellerna under selektiva förhäl-landen, i vilka den andra DNA-vektorn integreras medelst homologirekombination av bakteriens genom, och den första DNA-vektorn försvinner.

12. Menetelmä sellaisen bakteerisolun tuottamiseksi, jolla on genomissaan integroitu replikoitumaton DNA-rakenne käsit- 1Ί 2502 37 täen (1) halutun DNA-sekvenssin, (2) DNA-sekvenssin, joka on homologinen solun genomin jonkin alueen kanssa, ja (3) repii-kaation aloituskohdan, jolloin DNA-rakenteessa ei ole funktionaalista geeniä, joka koodaisi tekijää, jota tarvitaan 5 replikoitumisen alkamiseen mainitusta replikaation aloitus-kohdasta, tunnettu siitä, että menetelmässä a) transformoidaan bakteerisolut (i) ensimmäisellä DNA-vekto-rilla, jossa on ensimmäinen replikaation aloituskohta ja yksi 10 tai useampia funktionaalisia geenejä, jotka koodaavat tekijää (tai -tekijöitä), jota tarvitaan plasmidireplikaatioon, joka alkaa tästä ensimmäisestä replikaation aloituskohdasta, ja (ii) toisella DNA-vektorilla, jossa on toinen replikaation aloituskohta muttei funktionaalista geeniä, joka koodaisi 15 tekijää, jota tarvitaan plasmidireplikaatioon tästä toisesta replikaation aloituskohdasta lähtien ja jossa on myös haluttu DNA-sekvenssi sekä DNA-sekvenssi, joka on homologinen solun genomin jonkin alueen kanssa, 20 jolloin ensimmäinen ja toinen replikaation aloituskohta ovat riittävän samanlaisia ollakseen toimivia samalla replikaatio-'* tekijällä (-tekijöillä), siten että toisen DNA-vektorin : replikaatio toisesta replikaation aloituskohdasta käynnistyy ,·, : ensimmäisessä DNA-vektorissa läsnäolevan geenin (geenien) ; 25 koodaaman replikaatiotekijän (tekijöiden) avulla, ja * t · b) viljellään saatuja soluja selektiivisissä olosuhteissa, joissa toinen DNA-vektori integroituu bakteerin genomiin : ·' homologirekombinaation avulla, ja ensimmäinen DNA-vektori '...· 30 häviää. , , 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen replikaation aloituskohta on johdettu : samasta plasmidista kuin ensimmäinen replikaation aloitus- • 35 kohta.

13. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat av att den 15 andra replikationsstarten har härletts frän samma plasmid som den första replikationsstarten.

14. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat av att frän den andra DNA-vektorn har deleterats en gen som kodar för den replikationsfaktor som anknyter sig till den andra replika- :20 tionsstarten.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu sii- 38 1 1 Ο Γ π ^ I I L J U /. tä, että toisesta DNA-vektorista on deletoitu geeni, joka koodaa replikaatiotekijää, joka liittyy toiseen replikaation aloituskohtaan.

15. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat av att en : gen som kodar för den replikationsfaktor som anknyter sig ,\ ; till den andra replikationsstarten har modifierats. ‘. ‘ 16. Förfarande enligt patentkrav 15, kännetecknat av att 25 genen har modifierats genom deletering, insertering eller substitution av en eller flera nukleotider av genens DNA-sek-: vens, eller genom deletering av transkriptionella signaler eller translationella start- eller stoppsignaler. : 17. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat av att den , 30 första DNA-vektorn dessutom omfattar en funktionell gen som . kodar för en replikationsfaktor som anknyter sig till den andra replikationsstarten. 112502 47

15 Bacillus subtilis eller Streptomyces lividans.

15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että geeni, joka koodaa replikaatiotekijää, joka liittyy toiseen replikaation aloituskohtaan, on muunneltu.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu sii-10 tä, että geeni on muunneltu deletoimalla, insertoimalla tai substituoimalla yksi tai useampi geenin DNA-sekvenssin nukleotidi tai deletoimalla transkriptio- tai translaatioaloitus-tai -lopetussignaalit.

17. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen DNA-vektori lisäksi käsittää funktionaalisen geenin, joka koodaa replikaatiotekijää, joka liittyy toiseen replikaation aloituskohtaan.

18. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat av att den andra DNA-vektorn dessutom omfattar en selekterbar marker.

18. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu : siitä, että toinen DNA-vektori lisäksi käsittää selektoitavan markkerin. : 19. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 12-18 mukainen mene- * ; 25 telmä, tunnettu siitä, että ensimmäisessä DNA-vektorissa on ensimmäinen plus-replikaation aloituskohta yksisäikeisestä DNA-plasmidista ja funktionaalinen rep-aeeni ja että toisessa DNA-vektorissa on toinen plus-replikaation aloituskohta yksi-• ·' säikeisestä DNA-plasmidista, muttei funktionaalista rep-qee- 30 nikognaattia toiselle plus-replikaation aloituskohdalle, sekä “ haluttu DNA-sekvenssi samoin kuin DNA-sekvenssi, joka on homologinen solun genomin jonkin alueen kanssa.

19. Förfarande enligt vilket som heist av patentkraven 12-18, kännetecknat av att den första DNA-vektorn uppvisar en första 5 plus-replikationsstart frän en enkelsträngad DNA-plasmid och funktionell rep gen och att den andra DNA-vektorn uppvisar en andra plus-replikationsstart frän en enkelkedjad DNA-plasmid men inget funktionellt rep genkognation för den andra pluss-replikationsstart, samt en DNA-sekvens av intresse och en 10 DNA-sekvens som är homolog med ett omräde av genomet i en cell.

20. Förfarande enligt patentkrav 19, kännetecknat av att den andra plus-replikationsstarten har härletts frän samma enkelsträngade DNA-plasmid som den första plus-replikations- 15 starten.

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu • 35 siitä, että toinen plus-replikaation aloituskohta on johdettu samasta yksisäikeisestä DNA-plasmidista kuin ensimmäinen plus-replikaation aloituskohta. 39 112202

21. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat av att den första DNA-vektorn är sädan att den inte kan replikeras i högre temperaturer i vilka värdcellen dock växer, och att bakteriecellerna odlas tili en början i en temperatur i '*20 vilken plasmiden kan replikeras, och därefter, dä den andra DNA-vektorn har integrerats i bakteriens genom, fortsättes . ; odlingen i en temperatur i vilken plasmiden inte kan replike- ; ras sä att den första DNA-vektorn försvinner frän cellerna.

21. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen DNA-vektori on sellainen, ettei se pysty replikoituinaan korkeammissa lämpötiloissa, joissa isän- 5 täsolu kuitenkin kasvaa, ja että bakteerisoluja viljellään aluksi lämpötilassa, jossa plasmidi voi replikoitua, ja sen jälkeen, kun toinen DNA-vektori on integroitunut bakteeri-genomiin, jatketaan viljelyä lämpötilassa, jossa plasmidi ei pysty replikoituinaan, niin että ensimmäinen DNA-vektori 10 häviää soluista.

22. Förfarande enligt vilket som heist av patentkraven 12-21, 25 kännetecknat av att cellen är en gram-positiv bakterie.

22. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 12-21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solu on gram-positiivinen bakteeri . 15

23. Förfarande enligt patentkrav 22, kännetecknat av att den gram-positiva bakterien är en stam som hör tili Bacillus- • eller Streptomyces-släkten.

23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että gram-positiivinen bakteeri on kanta, joka kuuluu Bacillus- tai Streptomyces-sukuun.

24. Förfarande enligt patentkrav 23, kännetecknat av att bak-‘30 teriestammen är Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, • Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alka-lophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis eller Streptomyces lividans. 48 1Ί')Γ! π ? • * ί-, V. »W# ^

24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu • ‘.j siitä, että bakteerikanta on Bacillus licheniformis, Bacillus ·:·: lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus : coagulans, Bacillus subtilis tai Streptomyces lividans. • : 25 ·’ 25. Emoplasmidivektori, joka sisältää ensimmäisen replikaa- tion aloituskohdan ja toisen replikaation aloituskohdan, joka on samoin orientoitunut kuin ensimmäinen replikaation aloi-: ·' tuskohta, jotka ensimmäinen ja toinen replikaation aloitus- 30 kohta ovat riittävän samanlaisia ollakseen toimivia samalla replikaatioteki jällä (-tekijöillä), 1 _ jolloin ensimmäinen ja toinen replikaation aloituskohta jaka- : vat vektorin kahteen osaan, (i) ensimmäisen osan käsittäessä * 35 ensimmäisen replikaation aloituskohdan ja yhden tai useamman funktionaalisen geenin, joka koodaa replikaatiotekijää (tai -tekijöitä), jota tarvitaan plasmidireplikaatioon, joka alkaa 40 1 1 9 R Π 9 I I t_ v^·' mainituista ensimmäisestä ja toisesta replikaation aloitus-kohdasta, ja (ii) toisen osan käsittäessä toisen replikaation aloituskohdan, halutun DNA-sekvenssin, DNA-sekvenssin, joka on homologinen sellaisen solun genomin jonkin alueen kanssa, 5 johon soluun vektori aiotaan viedä.

25. Moderplasmidvektor som innehäller en första replikations-start och en andra replikationsstart med samma orientation som den första replikationsstarten, vilka första replikationsstart och andra replikationsstart är tillräckligt likadana för att 5 fungera med samma replikationsfaktor (-faktorer), varvid den första och den andra replikationsstarten delar vektorn i tvä delar (i) varvid den första delen omfattar den första replikationsstarten och en eller flera funktionella 10 gener som kodar för den (eller de) replikationsfaktor(er) som behövs för plasmidreplikation frän nämnda första och andra replikationsstart, och (ii) den andra delen omfattar den andra replikationsstarten, en DNA-sekvens av intresse, och en DNA-sekvens som är homolog med ett omräde i genomet i en cell till 15 vilken vektorn skall föras.

26. Plasmidvektor enligt patentkrav 25, kännetecknad av att den andra replikationsstarten har härletts frän samma plasmid som den första replikationsstarten. :20 27. Plasmidvektor enligt patentkrav 25, kännetecknad av att en gen som kodar för den replikationsfaktor som anknyter sig tili den andra replikationsstarten har deleterats.

26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen plasmidivektori, tunnettu siitä, että toinen replikaation aloituskohta on johdettu samasta plasmidista kuin ensimmäinen replikaation aloitus- 10 kohta.

27. Patenttivaatimuksen 25 mukainen plasmidivektori, tunnettu siitä, että geeni, joka koodaa replikaatiotekijää, joka liittyy toiseen replikaation aloituskohtaan, on deletoitu. 15

28. Plasmidvektor enligt patentkrav 25, kännetecknad av att : en gen som kodar för den replikationsfaktor som anknyter sig ; 25 tili den andra replikationsstarten har modifierats.

28. Patenttivaatimuksen 25 mukainen plasmidivektori, tunnettu siitä, että geeni, joka koodaa replikaatiotekijää, joka liittyy toiseen replikaation aloituskohtaan, on muunneltu.

29. Plasmidvektor enligt patentkrav 28, kännetecknad av att genen har modifierats genom deletering, insertering eller substitution av en eller flera nukleotider av genens DNA- : sekvens, eller genom deletering av transkriptionella signaler ,30 eller translationella start- eller stoppsignaler.

29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen plasmidivektori, tunnet- 1. tu siitä, että geeni on muunneltu deletoimalla, insertoimalla : Ί tai substituoimalla yksi tai useampi geenin DNA-sekvenssin nukleotidi, tai deletoimalla transkriptio- tai translaatio-,: aloitus- tai -lopetussignaalit. • ; 2 5

30. Plasmidvektor enligt vilket som heist av patentkraven 25- ; 29, kännetecknad av att den uppvisar en första plus-replika- tionsstart frän en enkelsträngad DNA-plasmid och en andra plus-replikationsstart frän en enkelsträngad DNA-plasmid, med 112502 49 samma orientation som den första plus-replikationsstarten, varvid den första och den andra plus-replikationsstarten delar vektorn i tvä delar, varvid den första delen omfattar den första plus-replikationsstarten och en funktionell rep 5 gen som kodar för en faktor som krävs för replikering fran den första och den andra plus-replikationsstarten, och varvid den andra delen omfattar den andra plus-replikationsstarten, en DNA-sekvens av intresse och en DNA-sekvens som är homolog med ett omräde av genomet i en cell, till vilken plasmidvek-10 torn skall föras.

30. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 25-29 mukainen plasmi-di- vektori, tunnettu siitä, että siinä on ensimmäinen plus-replikaation aloituskohta yksisäikeisestä DNA-plasmidista ja toinen plus-replikaation aloituskohta yksisäikeisestä DNA-* 30 plasmidista, joka on orientoitunut samoin kuin ensimmäinen plus-aloituskohta, ensimmäisen ja toisen plus-replikaation aloituskohdan jakaessa vektorin kahteen osaan, ensimmäisen osan käsittäessä ensimmäisen plus-replikaation aloituskohdan - !· ja funktionaalisen rep-geenin, joka koodaa tekijää, joka vaa- 35 ditaan replikaatiolle ensimmäisestä ja toisesta plus-replikaation aloituskohdasta, ja toisen osan käsittäessä toisen plus-replikaation aloituskohdan, halutun DNA-sekvenssin, ja 41 1 1 9 r~ f] Ο ' I L Ο U 1.. DNA-sekvenssin, joka on homologinen sellaisen solun genomin jonkin alueen kanssa, johon soluun plasmidivektori aiotaan viedä.

31. Plasmidvektor enligt patentkrav 30, kännetecknad av att den andra plus-replikationsstarten har härletts frän samma enkelsträngade DNA-plasmid som den första plus-replikationsstarten .

31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen plasmidivektori, tunnet tu siitä, että toinen plus-replikaation aloituskohta on johdettu samasta yksisäikeisestä DNA-plasmidista kuin ensimmäinen plus-replikaation aloituskohta.

32. Plasmidvektor enligt nägot av patentkraven 25-31, känne tecknad av att den dessutom omfattar en selekterbar marker.

32. Jonkin patenttivaatimuksen 25-31 mukainen plasmidivek tori, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää selektoitavan markkerin.

33. Bakteriecell, vilken hör till Bacillus-släkten och som inte kan transformeras genom att göra den kompetent och som i ,: sitt genom uppvisar en integrerad icke-replikerande DNA- ;20 konstruktion omfattande 1) en DNA-sekvens av intresse, 2) en DNA-sekvens som är homolog med ett omräde av cellens genom : och 3) en replikationsstart, varvid fran DNA-konstruktionen * har deleterats en gen som kodar för en faktor som behövs för att päbörja replikationen fran denna replikationsstart, eller 25 varvid den gen som kodar för replikationsfaktorn har modifie-rats pä sä sätt att den kodar för en inaktiv replikationsfak-tor.

33. Bakteerisolu, joka kuuluu Bacillus-sukuun jota ei voida 15 transformoida tekemällä sitä kompetentiksi ja jolla on geno-missaan integroitu replikoitumaton DNA-rakenne käsittäen (1) halutun DNA-sekvenssin, (2) DNA-sekvenssin, joka on homologinen solun genomin jonkin alueen kanssa ja (3) replikaation aloituskohdan, jolloin DNA-rakenteesta on deletoitu geeni, 20 joka koodaa tekijää, joka tarvitaan replikoitumisen alkami-\ seen mainitusta replikaation aloituskohdasta, tai jolloin replikaatiotekijää koodaava geeni on muunneltu, niin että se koodaa inaktiivista replikaatiotekijää. 1 : 25 34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen bakteerisolu, tunnettu siitä, että geeni on muunneltu deletoimalla, insertoimalla tai substituoimalla yksi tai useampi geenin DNA-sekvenssin nukleotidi, tai deletoimalla transkriptio- tai translaatio-aloitus- tai -lopetussignaaleja. 30 '; 35. Patenttivaatimuksen 3 3 tai 34 mukainen solu, tunnettu siitä, että DNA-rakenteessa on haluttu DNA-sekvenssi, DNA-sekvenssi, joka on homologinen solun genomin jonkin alueen kanssa, sekä plus-replikaation aloituskohta yksisäikeisestä 35 DNA-plasmidista, jolloin vektorissa ei ole plus-replikaation aloituskohtaan liittyvää funktionaalista rep-geenikognaattia. 112502 42

34. Bakteriecell enligt patentkrav 33, kännetecknad av att genen har modifierats genom deletering, insertering, eller 30 substituering av en eller flera nukleotider i genens DNA-sekvens, eller genom deletering av transkriptionella signaler - eller translationellastart- eller stoppsignalerna. 50 1 1 9 9 n o • 1 ^ '•J /..

34 112502 Pat ent t ivaat imukset

35. Cell enligt patentkrav 33 eller 34, kännetecknad av att DNA-konstruktionen uppvisar en önskad DNA-sekvens, en DNA-sekvens som är homolog med ett omräde av cellens genom samt en plus-replikationsstart frän en enkelsträngad DNA-plasmid 5 varvid vektorn inte uppvisar ett funktionellt rep genkognat som anknyter sig till en plus-replikationsstart.

36. Cell enligt nagot av patentkraven 33-35, kännetecknad av att DNA-konstruktionen dessutom omfattar en selekterbar marker .

36. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 33-35 mukainen solu, tunnettu siitä, että DNA-rakenne käsittää lisäksi selektoi-tavan markkerin.

37. Cell enligt nagot av patentkraven 33-36, kännetecknad av att bakteriestammen är Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagu-lans eller Bacillus subtilis. 15 38. Förfarande för produktion av en önskad polypeptid, känne- tecknat av att man odlar en bakteriecell enligt vilket som heist av patentkraven 33-37, vilken cell innehäller en integ-rerad DNA-sekvens vilken kodar för nämnda polypeptid i för-i hällanden i vilka man kan producera polypeptiden, och den 20 erhällna polypeptiden tages tili vara frän odlingen. ’ 39. Förfarande enligt patentkrav 38, kännetecknat av att : polypeptiden är ett enzym.

37. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 33-36 mukainen solu, tunnettu siitä, että bakteerikanta on Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophi-lus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans tai Bacillus subtilis. 10

38. Menetelmä halutun polypeptidin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään minkä tahansa patenttivaatimuksen 33-37 mukaista bakteerisolua, joka sisältää integroidun DNA-sek-venssin, joka koodaa sanottua polypeptidiä olosuhteissa, 15 joissa polypeptidiä voidaan tuottaa, ja otetaan saatava poly-peptidi talteen viljelmästä.

39. Patenttivaatimuksen 38 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on entsyymi. 20

40. Patenttivaatimuksen 39 mukainen menetelmä, tunnettu ···· siitä, että entsyymi on proteaasi, amylaasi tai lipaasi. J 25 1. Förfarande för att producera en sädan bakteriecell som i ; ; sitt genom bär en integrerad icke-replikerande DNA-konstruk-tion innehällande 1) en DNA-sekvens av intresse, 2) en DNA-sekvens som är homolog med ett omräde av cellens genom och 3) en replikationsstart, varvid DNA-konstruktionen inte innehäl-30 ler en funktionell gen som kodar för en faktor som behövs för att päbörja replikationen frän denna replikationsstart, kän-netecknat av att ; a) bakterieceller transformeras med en moderplasmidvektor som 35 innehäller en första replikationsstart och en andra replikationsstart med samma orientation som den första replikations- 43 119. n 9 starten, vilka första replikationsstart och andra replika-tionsstart är tillräckligt likadana för att fungera med samma replikationsfaktor (-faktorer), 5 varvid den första och den andra replikationsstarten delar vektorn i tvä delar (i) varvid den första delen omfattar den första replikationsstarten och en eller flera funktionella gener sora kodar för den (eller de) replikationsfaktor(er) som behövs för plasmidreplikation frän näranda första och andra 10 replikationsstart, och (ii) den andra delen omfattar den andra replikationsstarten, en DNA-sekvens av intresse, och en DNA-sekvens som är homolog med ett omräde i genomet i en cell till vilken vektorn skall föras, och 15 b) de transformerade cellerna odlas under selektiva förhäl-landen, moderplasmidvektorn replikeras, varvid en första avkommevektor bildas omfattande den första replikationsstarten och en eller flera funktionella gener som kodar för den/de replikationsfaktor/-faktorer som behövs för att plas-20 miden replikeras frän nämnda första och andra replikations-* \ starter, samt en andra avkommevektor omfattande den andra ·; replikationsstarten men inte en funktionell gen som skulle koda en replikationsfaktor, och även omfattande en DNA-sek-, : vens av intresse och en DNA-sekvens som är homolog med ett - ; 25 omräde av genomet i cellen, varvid odlingen av de transforme-rade cellerna fortsättes under selektiva förhällanden och resulterar i en integrering av den andra avkommevektorn i bakteriens genom genom homogen rekombination och i att den första avkommevektorn säväl som moderplasmiden försvinner ,'30 frän cellerna.

40. Förfarande enligt patentkrav 39, kännetecknat av att enzymet är proteas, amylas eller lipas. : 25