FI109811B - Menetelmä GDP-L-fukoosin valmistamiseksi ja menetelmässä käytettäviä välineitä - Google Patents

Description

, 109811

Menetelmä GDP-L-fukoosin valmistamiseksi ja menetelmässä käytettäviä välineitä

Keksinnön ala 5 Nykyinen keksintö liittyy yhdistelmäentsyymien käyttöön GDP-L- fukoosin ja fukosyloitujen glykaanien valmistamiseksi. Fukosyloidut glykaanit ovat biologisesti aktiivisia ja niillä on terapeuttinen käyttö ja GDP-L-fukoosi toimii fukoosin luovuttajana fukosyloituihin glykaaneihin johtavalla biosynteetti-sellä reitillä.

10 Tarkemmin nykyinen keksintö kohdistuu menetelmään GDP-L- fukoosin valmistamiseksi GDP-D-mannoosista ja sitä kautta mahdollisesti myös fukosyloitujen glykaanien valmistamiseksi ja mainitussa menetelmässä käyttökelpoisiin välineisiin. Niin ollen keksintö kohdistuu myös kimeerisiin entsyymeihin, jotka sisältävät useita entsyymejä biosynteettiseltä polulta. Lisäksi 15 keksintö liittyy vektoreihin, jotka sisältävät kimeerisiä entsyymejä koodittavia DNA-sekvenssejä, ja vektoreita sisältäviin hiiva- tai homesoluihin. Lopuksi tässä kuvataan menetelmässä käyttökelpoinen analyysi GDP-L-fukoosin ja fukosyloitujen glykaanien määrittämiseksi ja testipakkaus siihen tarkoitukseen. Mainittu analyysi voi myös olla käyttökelpoinen infektioiden ja tulehdusten 20 diagnoosissa.

t · * · • · • · *i Keksinnön taustaa • ♦ · *·.·* Fukosyloidut glykaanit ovat käyttökelpoisia tulehduksellisten vastei- » · '···’ den hoidossa. Niitä voidaan käyttää estämään leukosyyttien liike tulehduskoh- 25 tiin ja siten vähentämään tai muuten parantamaan ei-toivottua tulehdusvastetta • · ♦ ja muita tautitiloja, joille leukosyyttien infiltraatio on tunnusomaista. Ne ovat *:·’ myös käyttökelpoisia bakteerien tarttumisen endoteeliin estämisessä ja siten : *·· estävät ja/tai hoitavat bakteeri-infektioita. Fukosyloitujen glykaanien lisäkäyttö

IM

on syövän hoidon alalla, jossa tuumorisolumetastaasia voidaan inhiboida näillä : 30 glykaaneilla (US 5 965 544).

·:··: Valkoisten verisolujen kulkeutumista verestä patogeenialtistus- alueille kehossa kutsutaan tulehduskaskadiksi. Soluadheesiotapahtumat otta- 109811 2 vat huomioon leukosyyttien spesifisen sitoutumisen tulehdusinsultin vieressä olevan suonen endoteeliin; sellaiset adheesiotapahtumat ehkäisevät suuria vaskulaarisia leikkausvoimia ja suuria verenvirtausnopeuksia, joilla on taipumus pitää leukosyytit kierrossa ja auttaa ohjaamaan leukosyytit vaadittuun 5 kohtaan.

Nykyinen käsitys leukosyyttiekstravasaatiosta perustuu useiden en-doteelin ja leukosyyttien pinnalle sijoittuneiden adheesiomolekyylien johdonmukaiseen toimintaan. Selektiiniperheen jäsenten ja niiden oligo-sakkaridia sisältävien vastareseptorien vuorovaikutus aloittaa lymfosyytti-ekstravasaation.

10 Selektiinit, tunnetut myös "lektiinisoluadheesiomolekyyleinä" (LEC- CAM:t), luokitellaan kolmeen ryhmään: L-selektiiniä ilmennetään erilaisilla leukosyyteillä ja konstitutiivisesti lymfosyyteillä, monosyyteillä, neutrofiileillä ja eo-sinofiileillä. E-selektiiniä ilmennetään tulehduksensäätelijöiden aktivoimalla en-doteelilla. P-selektiiniä varastoidaan verihiutaleiden alfa-granuloissa ja endo-15 teelisolujen Weibel-Palade -bodeissa ja ilmennetään myös tulehduksellisen stimulaation aktivoimalla endoteelillä. Kaikki selektiiniperheen jäsenet näyttävät säätelevän soluadheesiota hiilihydraattien tunnistuksen kautta.

Kaikki selektiinit sitoutuvat sialyyli Lewis x:ään (NeuNAca2-3Gaipi-4(Fuca1-3)GlcNAc) (sLex tai sLex) ja sialyyli Lewis a:han (NeuNAca2-3Galp1-

tl < I

' ] 20 3(Fuca1-3)GlcNAc) (sLea tai sLea) yhtä lailla kuin sukua oleviin hiilihydraat- I · · · * tisekvensseihin. L-selektiini-riippuvainen tunnistus edeltää normaa-lia lymfo- • · # syyttien ekstravasaatiota perifeerisiin imusolmukkeisiin ja tulehduskohtiin, jotka I”’ molemmat ovet heikentyneet L-selektiini-vajavaisissa hiirissä.

I · * · *” Useiden glykoproteiinien on osoitettu toimivan L-selektiinin vasta- . . 25 reseptoreina. Yleinen nimittäjä kloonatuille GlyCAM-1-, DC34-, MAdCAM-1-ja PSGL-1-ligandeille on musiinityyppinen proteiiniydin, jossa on paljon O-liittynieitä glykaanikuoria, jotka ovat ratkaisevia selektiinin tunnistuksessa.

: GlyCAM-1:n ja PSLG-1:n glykosylaatiota on luonnehdittu tarkemmin yksityis- ·;·' kohdin, muiden sakkaridien tavoin näiden proteiinien on vastaavasti osoitettu :, ·,: 30 kantavan sulfatoituja sLex- ja sLexLexLex-epitooppeja.

Useat endoteelisolut perifeerisissä imusolmukkeissa ilmentävät sialyyli Lewis a- ja sialyyli Lewis x- (sLea- ja sLex-) epitooppeja, jotka ovat L- 3 109811 selektiini-vastareseptorin osia. Endoteelisolut useissa muissa paikoissa ovat sLea- ja sLex-negatiivisia, mutta tulehduksellinen stimulaatio voi indusoida aikaisemmin negatiivisen endoteelin ilmentämään näitä oligosakkaridi-rakenteita de novo. On osoitettu, että viljellyillä endoteelisoluilla on koneisto ainakin 5 sLex:n tuottamiseksi, koska niillä on useita toiminnallisia a-2,3-sialyyli- ja a- 2,3-fukosyylitransferaaseja, jotka ovat sLex:n tuottamiseen (poly)laktoo-siamineista osallistuvia entsyymejä.

Useissa tutkimuksissa on ehdotettu selektiinien oleva osallisina laajassa akuuttien ja kroonisten tulehdustilojen joukossa monissa kudoksissa. 10 Mono- ja multivalenttien sLex-glykaanien on osoitettu inhiboivan L-selektiinien säätelemää lymfosyyttien sitoutumista in vitro ja ne myös inhiboivat granulo-syyttien ekstravasaatiota in vivo akuuteissa tulehduksen eläinmalleissa ja re-perfuusiovaurioissa. E-ja P-selektiinit, joilla on suurempi affiniteetti kuin analogisilla yksittäistä sLex-yksikköä kantavilla oligosakkarideilla, näyttävät tunnista-15 van yhtä sLexLex- ja sLexLexLex-tyypin epitooppia kantavat polylaktoosiami-nit. WO 97/12892 paljastaa synteettisen multivalentin sLex:n, joka sisältää po-lylaktoosiamineja, ja niiden käytön lymfosyyttien sitoutumisen estämiseksi vastaavaan oligosakkaridiin endoteelisella pinnalla.

Fukosyloitujen glykaanien, kuten sLex.n ja/tai Lex:n, on osoitettu 20 olevan ratkaisevia leukosyyttien ja tuumorisolujen selektiiniriippuvaisessa ekst- * ravasaatiossa yhtä lailla kuin bakteeri- ja parasiitti-infektioissa [Vestweber D, • » and Blanks JE: Mechanisms that regulate the function of the selectins and their • · · ’···* ligands. Physiol. Rev. 1999, 79: 181 - 213], Glykaanien fukosylaatio glykopro- *»· I · '···* telineillä ja -lipideillä vaatii asiaankuuluvien fukosyylitransferaasien aktiivisuutta 25 ja GDP-L-fukoosin aktiivisuutta luovuttajana. Fukosyloitujen glykaanien biolo-; / gisesta tärkeydestä johtuen vaadittaisiin helposti saavutettava GDP-L-fukoosin ;·* lähde. Nykyisin GDP-L-fukoosi on edelleen suhteellisen kallis nukleotidisokeri : ’·· ja siksi fukosylaation alalla työskentelevät laboratoriot hyötyisivät sen parem- t * · :: min saavutettavista lähteistä.

: 30 GDP-L-fukoosin synteesiin on kaksi päästrategiaa, kemialliset ja entsymaattiset polut. Suhteellisen kompleksisessa kemiallisessa synteesiissä, joka alkaa L-fukoosista lopputuotteen ollessa GDP-L-fukoosi, on käytetty eri- 4 109811 laisia lähestymistapoja. Sellaiset synteesit ovat kuitenkin hyvin työläitä, kalliita ja sopimattomia L-fukoosin valmistamiseen suuressa mittakaavassa.

Eukaryoottisoluissa GDP-L-fukoosia voidaan syntetisoida kahden erilaisen polun kautta, joko tärkeämpää de novo -polkua tai vähäistä salvage-5 polkua. Prokaryooteilla on ainoastaan de novo -polku. Voitolla oleva de novo -polku alkaa GDP-D-mannoosista ja vähäinen salvage-polku käyttää lähtömateriaalina L-fukoosia [Becker DJ ja Lowe JB: Leukocyte adhesion deficiency type Il [Katsaus]. Biochim. Biophys. Acta - Molecular Basis of Disease. 1999, 1455: 193-204] 10 GDP-D-mannoosista alkavan de novo -polun ensimmäinen vaihe on spesifisen nukleotidisokeridehydrataasin, GDP-mannoosi-4,6-dehydrataasin (GMD) katalysoima dehydraatioreaktio. Tämä johtaa epästabiilin GDP-4-keto- 6-deoksi-D-mannoosin muodostumiseen, joka joutuu seuraavaksi 3,5-epimerisaatioon ja GDP-4-keto-6-deoksi-D-galaktoosin muotoon, joka sitten 15 joutuu NADPH-riippuvaiseen pelkistykseen, jonka tuloksena on GDP-L-fukoosin (kuvio 1) muodostuminen. Näitä kahta viimeistä vaihetta katalysoi yksi kaksitoiminen entsyymi, GDP-4-keto-6-deoksi-D-mannoosi-3,5-epimeraasi/4-reduktaasi (GFS), jota kutsutaan myös GDP-L-fukoosisyntetaasiksi. GMD- ja GFS-aktiivisuuksia de novo -polulle koodittavat geenit on kloonattu useista "" 20 bakteereista, kasveista ja nisäkkäistä [Tonetti M, Sturla L, Bisso A, Benatti U ja

De Flora A: Synthesis of GDP-L-fucose by the human FX protein. J. Biol. :M Chem. 1996, 271:2727-9],

Salvage-polut käyttävät L-Fuc:ia ja muuntavat sen GDP-Fuc:ksi * * * kahden entsymaattisen reaktion kautta (Kuvio 1). Fuko-1-kinaasi (FK) ja GDP-25 fukoosipyrofosforylaasi (PP) katalysoivat näitä kahta entsymaattista vaihetta.

« · » · FK muuntaa L-fukoosin L-fukoosi-1-P:ksi ja PP muuntaa L-fukoosi-1-P:n GDP- • · ;·* L-fukoosiksi. Salvage-polku on onnistuneesti toteutettu puhdistetuilla entsyy- : '·· meillä yhdessä astiassa tehtävällä kierrättävällä lähestymistavalla, mutta ei vie- lä yhdistelmäentsyymeillä [Ichikawa Y, Look GC ja Wong CH: Enzyme-: 30 catalyzed oligosaccharide synthesis. Analytical Biochemistry 1992, 202: 215 - :··: 38], 5 109811 L-fukoosi on useissa biologisesti tärkeissä glykaaneissa läsnä oleva ratkaiseva monosakkaridi [Feizi T ja Galustian C: Novel oligosaccharide ligands and ligand-processing pathways for the selectins. TIBS 1999, 24: 369 -372]. Prokaryooteissa L-fukoosia on läsnä pääasiassa soluseinän polysakkari-5 deissa ja eläimissä L-fukoosi on glykokonjugaattien, sellaisisten kuten ABH- ja Lewis-antigeenit, osa, joko solukalvoon sitoutuneena tai biologisiin nesteisiin eritettynä. Fukosylaatio edellyttää fukosyylitransferaasin toimintaa, joka katalysoi L-fukoosin siirtoa nukleotidisokerista, GDP-L-fukoosista, glykaanivastaanot-tajaan.

10 Fukosylaatiolle nukleotidisokerin luovuttajana toimivan GDP-L- fukoosin biosynteesi on saavuttanut kasvavaa kiinnostusta sen jälkeen kun useita oc-1,2, cc-1,3- ja oc-l,6-fukosyylitransferaasigeenejä on kloonattu, sek-vensoitu ja ilmennetty. Fukosyylitransferaasit katalysoivat fukoosin siirtoa nuk-leotidisokerilta, GDP-L-fukoosilta (GDP-Fuc), sakkaridivastaanottajalle.

15 Joitakin fukosyylitransferaaseja on kloonattu erilaisista lähteistä ja ne ovat siten tulleet synteettisiin tarkoituksiin saavutettaville. GDP-Fuc on kuitenkin yhä suhteellisen kallis nukleotidisokeri, ja sen takia sen paremmin saavutettava lähde olisi toivottava. Oligosakkaridien suuren mittakaavan synteesiä rajoittavat saatavuus ja suuret kulut voitaisiin voittaa GDP-Fuc:n entsymaatti- 20 sella synteesillä halvemmista hiilihydraattivaroista.

Yksi nykyisen keksinnön tavoitteista on lisätä GDP-L-Fuc:n syntee- ϊ * sin tehokkuutta. Toinen nykyinen tavoite on helpottaa fukosyloitujen glykaani-en tuottoa GDP-L-Fuc:sta. Fukosyloiduilla glykaaneilla on biologisesti käyttö- I · · kelpoisia ominaisuuksia, joita voidaan käyttää glykobiologiatutki-muksessa ja 25 lääketieteellisissä sovelluksissa. Sitten nykyinen keksintö tarjoaa menetelmiä ^ · · '; * ja välineitä GDP-L-fukoosin yhdistelmägeeniteknologiseen valmistamiseen.

·;·’ Keksintöön liittyen tässä esitetään myös analyysi infektion tai tuleh- : *·· duksen diagnosoimiseen.

»· · 30 Keksinnön yhteenveto *:··: Eräs nykyisen keksinnön kohde on menetelmä GDP-L-fukoosin valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaati- 6 109811 muksessa 1 esitetään. Menetelmällä saadusta GDP-L-fukoosista voidaan edelleen muodostaa fukosyloituja glykaaneja.

Keksintöön liittyen tässä kuvataan lisäksi menetelmässä käyttökelpoisia Helicobacter pylorin GDP-mannoosi-4,6-dehyrataasia (GMD) ja Helico-5 bacter pylorin GDP-4-keto-6-deoksi-D-mannoosi-3,5-epimeraasi/4-reduktaasia (GFS) ja Helicobacter felisin tai rotan oc-1,3-fukosyylitransferaasia koodittavat DNA-sekvenssit.

Lisäksi keksintö tarjoaa kimeerisen entsyymin, joka on GDP-mannoosi-4,6-dehydrataasin (GMD) ja GDP-4-keto-6-deoksi-D-mannoosi-3,5-10 epimeraasi/4-reduktaasin (GFS) kimeerinen molekyyli.

Keksinnön lisäkohteita ovat vektorit, jotka sisältävät ensimmäisen GDP-mannoosi-4,6-dehydrataasia (GMD) koodittavan DNA-sekvenssin ja toisen GDP-4-keto-6-deoksi-D-mannoosi-3,5-epimeraasi/4-reduktaasia (GFS) koodittavan DNA-sekvenssin. Tarjotaan myös isäntäsoluja, jotka ovat hiiva- tai 15 homesoluja, jotka sisältävät vektorit.

Lopuksi kuvataan analyysi GDP-fukoosin määrittämiseksi, mainitun analyysin käsittäessä biotinyloitujen hiilihydraattipolyakryylikonju-gaattien käytön, streptavidiinin ja aikaeotteisen fluorometrisen havaitsemisen ja testipakka-,.· * ukset, jotka sisältävät analyysien suorittamiseksi tarvittavat reagenssit.

20 Keksinnön edullisia suoritusmuotoja kuvataan epäitsenäisissä pa- tenttivaatimuksissa.

* * · '. ·.: Piirrustusten lyhyt kuvaus *···* Kuvio 1 esittää GDP-L-fukoosin kaksi biosynteettistä reittiä 25 Kuvio 2 on pESC-leu/gmd/wcaG-vektori i · · • · · • · *;·’ Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus * · : *·· Käytetyt lyhenteet: AAL, Aleuria aurantia lektiini; FucT, oc-1,3- > · · fukosyylitransferaasi; GDP-Fuc tai GDP-L-Fuc, GDP-L-fukoosi; GDP-Man tai : 30 GDP-D-Man, GDP-D-mannoosi; GFS, GDP-4-keto-6-deoksi-D-mannoosi-3,5- :*·: epimeraasi/4-reduktaasi (GFS) tai GDP-L-fukoosisyntetaasi; GMD, GDP-D- mannoosidehydrataasi; Lex, Lewis x [Gaipi-4(Fucoc1-3)GlcNAc]; sLex, sialyyli 7 109811 i Lewis x [Neu5Ac°c2-3Gaipi-4(Fuc°c1-3)GlcNAc]; sLN, sialyylilaktoosiamiini (Neu5Acoc2-3Gaipi-4GlcNAc).

GDP-L-fukoosia voidaan valmistaa käyttäen yhdistelmäentsyymejä sen biosynteettiseltä reitiltä. Keksinnön mukaisesti GDP-L-fukoosi valmistetaan 5 luontaisesta GDP-D-mannoosista viljelemällä hiiva- tai homesoluja, jotka on transformoitu DNA-sekvenssillä, joka koodaa GDP-mannoosi-4,6-dehydra-taasia (GMD) ja DNA-sekvenssillä, joka koodaa GDP-4-keto-6-deoksi-D-mannoosi-3,5-epimeraasi/4-reduktaasia (GFS) toiminnallisesti ilmentämään mainitut entsyymit, ja ottamalla talteen mainituissa soluissa luonnostaan ole-10 vasta GDP-D-mannoosista muodostunut GDP-L-fukoosi. Hiiva- ja homesolut sisältävät luontaista GDP-D-Man:ia, joka voi toimia GDP-L-Fuc:n biosynteesin substraattina de novo -polun kautta. Isäntäsoluna on edullisesti Saccharomy-ces cerevisiae.

Hyvin sopiva tapa GDP-L-Fuc:n rekombinanttiin tuottamiseen on 15 konstruoida kaksoisvektori, s.o. vektori, joka käsittää de novo -polulla tarvittavat kaksi geeniä. Sellaisella kaksoisvektorilla transformoitu isäntäsolu voi tuottaa kimeeristä entsyymiä, jolla on molempien entsyymien aktiivisuudet. Hiiva-tai homesolu, joka käsittää sekä gmd- että gfs-geenit, voi tuottaa GDP-L-Fuc:ia ilman ulkoista GDP-D-Man:in lisäystä.

l": 20 GDP-L-fukoosi toimii fukoosin luovuttajana glykaanien fukosylaati- : : ossa fukosyylitrasferaaseilla. Nykyisen keksinnön mukaisesti fukosyloituja gly- I · · '· “· kaaneja voidaan valmistaa saattamalla muodostunut GDP-L-Fuc reagoimaan rekombinantisti tuotetun oc-1,3-fukosyylitransferaasin kanssa, joka on edulli-sesti saatu rotasta tai bakteerista. Isäntäsolu voi olla mikä tahansa prokaryoot- , . 25 ti- tai eukaryoottisolu, eläinsolut mukaan lukien.

Fukosyloitavat glykaanit ovat edullisesti polylaktoosiamineja, jotka muunnetaan sialyyli Lewis x- (sLex-) sokereiksi. oc-1,3-fukosyylitransferaasi siirtää fukoosin oc-1,3-asemassa GlcNAc-sokeriin. GlcNAc voi olla osa polylak-toosiamiinirunkoa, esim. Gaipi,4GlcNAcpb1,3-Gaipi,4GlcNAc, joka voi vuo- ’·:·* 30 rastaan olla osa glykoproteiinia tai glykolipidiä. Toisin sanoen nykyisen keksin- * i i i i i nön mukaista prosessia voidaan käyttää sokereiden fukosyloimiseksi sellaise- i 109811

O

naan, mukaan lukien luonnossa esiintyvät ja synteettisesti tuotetut sokerit, tai glykoproteiinien ja glykolipidien fukosyloimiseksi. Näillä kaikilla fukosyloiduilla yhdisteillä on potentiaalinen käyttö selektiini-inhibiittoreina. Ne voidaan edelleen formuloida farmaseuttisiksi koostumuksiksi.

5 Tässä esitetään edelleen useita uusia geenejä, jotka ovat käyttökel poisia kuvatuissa prosesseissa. Mainitut geenit sisältävät tietyn organismin tiettyä entsyymiä koodittavan DNA-sekvenssin. Sekvensoidut DNA-sekvenssit annetaan sekvensseinä tunnusnumerot 1 - 4 (SEQ ID No. 1 - 4). Tässä fokusoidaan erityisesti näiden sekvenssien entsyymiä koodataviin osiin (alkaen 10 ATG:sta).

DNA-sekvenssit liitetään vektoreihin yhdessä tarkoituksen mukaisten promoottorien ja selektiomerkkien kanssa. Sopivia promoottoreita ovat esim. GAL-promoottorit. Selektiomerkkeinä voidaan käyttää antibioottiresistenssiä tai välttämättömiä aminohappoja. Vektorit transformoidaan tai transfek-15 toidaan isäntäsoluihin ja sitten yhdistelmäisäntäsoluja viljellään olosuhteissa, jotka mahdollistavat kooditettavan entsyymin ilmentämisen. Sitten entsyymit otetaan talteen soluista, tai käytetään suoraan solulysaattia katalysoimaan haluttua entsymaattista reaktiota. Sitten entsyymi tai entsyymiä sisältävä solu-;:· lysaatti saatetaan kosketuksiin substraattinsa kanssa halutun tuotteen muo- '“·* 20 dostamiseksi. Keksinnön mukaisesti GDP-L-Fuc tuotetaan yhdistelmä- : * isäntäsolulla, joka tuottaa suoraan haluttua reaktiotuotetta.

* »

Analyysit GDP-Fuc:n tai fukosyylitransferaasin määrittämiseksi hei- t « · pottavat keksinnön mukaisen menetelmän tarkkailua. Analyysit ovat erityisen sopivia GDP-L-Fuc:n määrittämiseen, mutta samaa periaatetta voidaan myös 25 soveltaa muiden sokerinukleotidien määrittämiseen. Vastaavasti fukosyyli- » » transferaasien määritys on erityisen sopiva cc-1,3-fukosyy-litransferaasin mää-

’ I

rittämiseen, mutta samaa periaatetta voidaan myös soveltaa oc-1,2- tai <x-1,6- '· fukosyylitransferaasien määrittämiseen. Koska fukosylaatio lisääntyy infektion ·« • ja tulehduksen aikana, nykyisen keksinnön mukaisia analyyseja voidaan käyt- . ; 30 tää myös diagnoosiin. Lisääntynyt määrä GDP-Fuc:ia ja/tai fukosyylitransfe- raaseja elimistössä osoittaa infektio- tai tulehdussairauksia. GDP-Fuc- ja fu-kosyylitransferaasiaktiivisuus voidaan määrittää missä tahansa kudosnäyt- „ 109811 teessä. Koska fukosyylitransferaasia myös eritetään, sen aktiivisuus voidaan edelleen määrittää missä tahansa kehon nestenäytteessä, kuten veren seerumissa, plasmassa, selkäydinnesteessä, nivelnesteessä, kyyneleissä, syljessä jne. Analyysejä voidaan myös käyttää gmd-, gfs-, fk- tai pp-geeenien tai niiden 5 mRNA:iden tai vastaavien entsyymien läsnäolon määrittämiseen.

Erään suoritusmuodon mukaisesti analyysi käsittää näytteen, jossa epäillään olevan GDP-fukoosia, inkuboimisen fukosyy-litransferaasin ja sLN-polyakryyliamidibiotiinikonjugaatin kanssa biotinyloidun fukosyloidun glykokon-jugaatin (sLex-konjugaatti) muodostamiseksi; edellisen vaiheen reaktioseok-10 sen saattamisen kosketukseen immobilisoidun streptavidiinin kanssa biotinyloidun sLex-konjugaatin immobilisoimiseksi; biotinyloidun sLex-konjugaatin saattamisen reagoimaan primaarisen anti-sLex-vasta-aineen kanssa ja sitten sekundaarisen europium-leimatun vasta-aineen kanssa, joka tunnistaa primaarisen vasta-aineen; ja aikaerotteisen fluoresenssin havaitsemisen näytteessä 15 olevan GDP-fukoosin mittana.

Vaihtoehtoisesti analyysi käsittää näytteen, jossa epäillään olevan fukosylaasitransferaasia, inkuboimisen GDP-L-fukoosin ja sLN-polyakryyliamidibiotiinikonjugaatin kanssa biotinyloidun fukosyloidun glykokon-jugaatin (sLex-konjugaatti) muodostamiseksi; edellisen vaiheen reaktioseok-20 sen saattamisen kosketukseen immobilisoidun streptavidiinin kanssa bio-tinyloidun sLex-konjugaatin immobilisoimiseksi; biotinyloidun sLex-konjugaatin • · saattamisen reagoimaan primaarisen anti-sLex-vasta-aineen kanssa ja sitten •« · sekundaarisen europium-lematun vasta-aineen kanssa, joka tunnistaa primaa- • * * risen vasta-aineen; ja aikaerotteisen fluoresenssin havaitsemisen näytteessä 25 olevan GDP-fukoosin mittana.

• · • ♦ *

Yllä kuvatussa analyysissä käyttökelpinen testipakkaus voi sisältää ·;·’ esim. fukosyylitransferaasia tai GDP-Fuc:ia, sLN-polyakryyliamidibiotiini- • φ : *·· konjugaatin, valinnaisesti immobilisoidun streptavidiinin, primaarisen anti-sLex-

* M

vasta-aineen, leimatun sekundaarisen vasta-aineen ja valinnaisesti reaktio-ja : 30 pesuliuoksia.

·:·*: Toisen suoritusmuodon mukaisesti analyysi käsittää biotinyloidun

Lex-polyakryyliamidikonjugaatin immobilisoimisen streptavidiinilla päällystetylle 10 109811 kantajalle; näytteen, jonka epäillään käsittävän GDP-fukoosia ja europium-leimatun fukoosispesifisen lektiini-AAL:n lisäämisen, inkuboimisen ja pesun; ja aikaerotteisen fluoresenssin havaitsemisen, jolloin fluoresenssin väheneminen osoittaa näytteessä läsnä olevan GDP-Fuc:n määrää.

5 Tässä analyysissä käyttökelpoinen testipakkaus voi sisältää bio-

tinyloidun Lex-polyakryyliamidikonjugaatin, valinnaisesti immobilisoidun strep-tavidiinin ja leimatun fukoosispesifisen lektiini-AAL:n. Se voi myös käsittää tarkoituksenmukaisia reaktio- ja pesuliuoksia GMD ja GFS

10 Kuvaamme tässä molekulaarisen identifioimisen, kloonauksen ja il- mennysstrategiat tätä polkua koodittavien uusien geenien identifioimiseksi ja niiden kerailmentämisen hiivasoluissa kuten S. cerevisiae. Uusia gmd- ja gms-(myös termit kuten gmers tai fx) geenejä H. pylorista tunnistettiin, kloonattiin, sekvensoitiin ja ilmennettiin toiminnallisesti yhdessä kaksoisvektorissa S. cere-15 visiaessa. Vastaavia E. colin geenejä voidaan myös onnistuneesti ilmentää tässä hiivasysteemissä. Tämän hiivasolulähestymistavan suuri etu on se tosiasia, että ilmennysisännän sytosolissa on spontaanisti hyvin suuri pitoisuus GDP-D-mannoosia, GDP-L-Fuc -synteesin prekursoria ja lisäksi siitä puuttuvat ..!: ‘ ensijaisesti fukoosimetaboliaan vaadittavat geenit ja entsyymit.

20 Myös kaksi kimeeristä molekyyliä, nimittäin GMD-GFS ja GFS-GMD

« tuotettiin PCR:llä ja enstymaattinen aktiivisuus voitiin osoittaa jopa tällä lähes- • · *· 'i tymistavalla. Tämän lähestymistavan suuri etu on, että tällä tavalla muuten epästabiili GMD säilyy paremmin ja lisäksi tarvitaan ainoastaan yksivaiheinen *···* entsyymi(e)n puhdistus ennen kun se voidaan kiinnittää matriisiin jne.

25 Olemme myös tutkineet koettimilla S. cerevisiaen, jossa on transfek- • · · / toituna joko toinen tai molemmat gmd- ja gfe-geeneistä, koko genomin sisältä-·;* viä geenilastuja. Tällä lähestymistavalla voimme tunnistaa geenien koko ge-i '·· nomin laajuisia ilmentymiskuvioita ja tunnistaa polut, jotka ovat katkenneet I t · transfektioista johtuen. Pystymme myös toteuttamaan metabolista rakentamis-: 30 ta uusilla geeneillä transfektoiduille hiivakannoille ja edelleen edistämään ·:··: GDP-L-Fuc:n tuottavuutta.

! 11 109811

Edellinen tutkimus on osoittanut, että gmd:tä ja gfs:ää voidaan yli-ilmentää H. pylorissa ja että kun reaktioon on tarjolla eksogeenista GDP-D-mannoosia, syntetisoituu GDP-L-fukoosia. Meidän työmme tarjoaa kuitenkin suuren parannuksen tähän lähestymistapaan, koska GMD- ja GFS- (GFS) ent-5 syymejä ilmentäviin hiivasolulysaatteihin ei tarvitse lisätä kallista eksogeenista GDP-D-mannoosia.

GDP-D-mannoosin osoitettiin olevan rajoittava tekijä niin gmd- kuin gfe-geenejäkin ilmentäville hiivatransformanteillemme. Hiivasoluissa GDP-D-mannoosia syntetisoidaan sytoplasmassa ja edelleen kuljetetaan Golgin lait-10 teen lumeniin spesifisellä antiportteri-systeemillä, joka vaatii vaihtoa guanosii-ni-5'-monofosaatin (GMP) kanssa. Siten, koska yhdistelmäentsyymejä ilmennetään hiivasolun sytosolisessa osastossa, saattaisi olla edullista käyttää mu-tanttihiivasoluja, joille on tunnusomaista, että niillä on vaje GMP-antiportterin toiminassa, joka vaje johtaa suurempiin sytosolisiin GDP-L-mannoositasoihin.

15 Yhteenvetona olemme osoittaneet tässä, että bakteeriperäisiä gmd- ja gfs-geenejä voidaan ilmentää toiminnallisina entsyymeinä S. cerevisiaessa ja ne voivat syntetisoida GDP-L-fukoosia luontaisesta GDP-D-mannoo-sisynteesistä hiivasoluissa johtuen. Tämän lähestymistavan on osoitettu ole-van suhteellisen tehokas, koska >0,2 mg/l GDP-L-fukoosia tuotettiin 20 spesifisesti transfektoiduilla hiivasoluilla. Tulisi myös huomata, ettei hiivan :'· viljelysysteemejä ole vielä toistaiseksi optimoitu saannon lisäämiseksi. Tällä *·: nopealla reitillä tuotettua GDP-L-fukoosia voidaan edelleen muuntaa bioaktiivisiksi fukosyloiduiksi glykaaneiksi sopivilla yhdistelmäfukosyyli-"·*·' transferaaseilla.

25 Transferaasit ‘oc-1,3-fukosyylitransferaasientsyymit ·” Fukosyylitransferaasi siirtää GDP-L-Fuc:n (luovuttaja) kasvavaan : ’·* glykaaniketjuun. Olemme kloonanneet, sekvensoineet ja ilmentäneet bakteerin oc-i,3-fukosyylitransferaasientsyymiä H. felisistä. Lisäksi olemme kloonanneet, 30 sekvensoineet ja ilmentäneet uutta rotan oc-l,3-fukosyylitransferaasientsyymiä (FucT-VII), joka on ratkaiseva sialyloitujen glykaanien synteesissä. Nämä mo- 12 10981 1 i lemmat geenit koodittavat entsyymejä, joita voidaan käyttää oc-1,3- fukosyloimaan glykaaneja ja glykoproteiineja GDP-L-fukoosin avulla.

Analyysit Tätä varten olemme kehittäneet suuren suorituskyvyn analyysit 5 GDP-L-Fuc:n tunnistamiseksi solu-uutteista. Meillä on kaksi analyysia; ensimmäinen analyysi havaitsee pienempiä näytteessä läsnä olevia GDP-L-Fuc määriä ja on riippuvainen spesifisen fukosyylitransferaasientsyymin aktiivisuudesta, ja vasta syntetisoidut glykaanit havaitaan asiaankuuluvilla monoklonaa-lisilla vasta-aineilla aikaerotteisessa immunofluorometrisessa analyysissa ja 10 toinen analyysi on riippuvainen GDP-L-Fuc:n spesifisestä AAL-lektiinin fu-koosinsitomisaktiivisuudella havaitsemisesta.

Olemme viime aikoina kehittäneet nopeita ja herkkiä suuren suorituskyvyn analyysejä glykosyylitransferaaseille ja glykosidaaseille, joissa analyyseissä käytetään mikrolevyanalyysiteknologiaa ja aikaerotteista 15 fluorometrista havaitsemista. GDP-Fuc:n havaitsemiseen käytimme oc-1,3-fukosyylitransferaasianalyysia, jossa rajoittava tekijä oli GDP-Fuc:n läsnäolo tai puuttuminen näytteessä. <x-1,3-fukosyylitransferaasireaktio, joka muuntaa sia-lyylilaktoosiaminia (sLN) sialyyli Lewis x (sLex) -tetrasakkaridiksi, suoritettiin liuosfaasissa, minkä jälkeen biotinyloitu glykokonjugaatti immobilisoitiin strep-[ 20 tavidiinipäällysteiselle mikrolevylle. Sitten havaittiin fukosyloitu reaktiotuote ’ [ sLex aikaerotteisella immunofluorometrilla. Tämä analyysi yhdistää liuosfaasin entsymaattisen reaktion ja kiinteäfaasihavaitsemis-teknologian edut olleen monipuolinen ja useiden näytteiden samanaikaiseen prosessoimiseen kykene-**’ vä.

. . 25 GDP-L-Fuc-pitoisuuden mittaamiseen kehitettiin myös nopeampi vähäkuluinen metodi, joka perustuu europium-leimatun fukoosispesifisen '·* Aleuria aurantian lektiinin (AAL) inhibitioon. Lektiiniin perustuva analyysi on : vähemmän herkkä kuin entsymaattinen analyysi, mutta on halpana ja nopeana *·:** metodina hyvin sopiva GDP-L-Fuc:n tuoton optimointiin hiivassa. Koska useita •\i.: 30 erilaisia lektiinejä, glykosyylitransferaaseja ja glykokonjugaatteja on kaupalli-sesti saatavilla, vasta kehitetyt metodit ovat sovellettavissa monien erilaisten nukleotidisokerien ja yhtä lailla glykosyylitransferaasien analyyseihin.

I 13 109811

Tavanomaisen kromatografisten ja radiokemiallisten metodien käyttö GDP-L-Fuc:n kvantitoimiseen on pulmallista sen tosiasian takia, että erilaiset nukleotidisokerit ovat rakenteeltaan samanlaisia ja solun GDP-Man-pitoisuus on suuri hiivassa. Lisäksi optimoitaessa olosuhteita GDP-Fuc:n tuot-5 tamiseksi täytyy tarkkailla suurta määrää näytteitä. Siten otimme edun fukoosin stereospesifisestä tunnistuksesta joko oc-1,3-fukosyylitransferaa-sientsyymillä tai fukoosispesifisellä lektiinillä, toiminnoista, jotka on helppo havaita mikrole-vyanalyyseissä. Uusien analyysien etuihin kuuluvat menettelytavan helppous ja kyky prosessoida useita näytteitä samanaikaisesti.

10 Entsyymianalyysissä suoritettiin liuosfaasientsymaattinen reaktio ja kiinteäfaasihavaitseminen. Aiemmin julkaistussa FucT-analyysissä käytimme immobilisoitua vastaanottajaa, mutta myöhemmin olemme huomanneet, että tälle entsyymille liukoinen vastaanottaja on selvästi parempi. Syy tähän on tuntematon, mutta todennäköisesti on kineettisesti edullista, että kaikki entsymaat-15 tisen reaktion komponentit ovat liuosfaasissa.

Päätepisteanalyysinä FucT-analyysi on herkempi ja täsmällisempi GDP-Fuc-pitoisuuden määrittämisessä kuin lektiini-inhibitioanalyysi, jossa lek-tiinin affiniteetti fukoosia kohtaan määrää herkkyyden. Siten aikaerotteisen fluorometrisen havaitsemisen edut nähdään paremmin FucT-analyysissa. Ai-20 kaerotteinen fluorometria perustuu joidenkin lantanidikelaattien ainut-kertaisiin : : fluoresenssiominaisuuksiin ja on osoittanut huomattavan suurta herkkyyttä ja *· " laajaa mittausaluetta ei-kompetetiivisissa analyysissä. Entsymaattiseen ana-·...* lyysiin verrattuna lektiini-inhibitioanalyysi toimii suuremmilla GDP-Fuc- *’·' pitoisuuksilla ja tässä tutkimuksessa käytimme näytteissä GDP-Fuc- 25 pitoisuuksia, jotka olivat vain hieman yli havaisemisrajan. GDP-Fuc:n tuottoa optimoitaessa saadaan kuitenkin todennäköisesti parempia saantoja ja tämä metodi on lupaava työkalu, koska analyysin komponentit ovat halpoja ja inku-i " baatiot vievät alle yhden tunnin.

'·.·* Kaksi analyysia täydentävät toisiaan; entsymaattinen analyysi on : : : 30 sopiva hyvin pienten GDP-Fuc:n määrien havaitsemiseen kun taas vankka ja halpa lektiinianalyysi vaatii mikromolaarisia GDP-Fuc-pitoisuuksia ennen kun sitä voidaan käyttää. Molemmat analyysit toimivat hyvin käsittelemättömissä 14 109811 solulysaateissa, mutta tarvittaessa GDP-Fuc voidaan puhdistaa Aleuria auran-tia -lektiiniaffiniteettikromatografialla. Entsyymiin perustuvaa metodia voidaan käyttää mittaamaan sekä de novo- että salvage-reaktiopolkua, mutta lektiiniin perustuva metodi on käyttökelpoinen vain de novo -polulla, koska vapaa fu-5 koosi häiritsisi analyysia.

Lopuksi, kehittämiemme metodien pitäisi osoittautua hyvin käyttökelpoisiksi tarkkailtaessa GDP-Fuc:n tuottoa sekä fukoosimetabolia-analyysissa soluissa. Nämä analyysit ovat houkuttelevia vaihtoehtoja nykyisin käytettäville metodeille erityisesti seulottaessa suuria määriä käsittelemättömiä 10 biologisia näytteitä. Tässä tutkimuksessa käytetyt metodit voidaan myös sopeuttaa helposti muiden entsyymien analyysiin glykobiologiassa.

Seuraavat esimerkit valaisevat nykyistä keksintöä.

Esimerkki 1

Escherichia colin luontaisesta GDP-D-mannoosista GDP-L-15 fukoosia syntetisoivien entsyymien toiminnallinen ilmentäminen Saccha-romyces cerevisiaessa

Geenikonstruktien valmistaminen E. coli K-12 wca-geeniklusterista (tunnus U38473) amplifioitiin gmd\tä ja wcaG:tä koodittavat alueet. Käytettiin Advantage-polymeraasia 20 (Clontech, Palo Alto, CA, USA) alukesetin 5'AAGAACTCGAGTCAAAAGTCGCTCTCAT3' (Xhol-kohdan luominen) ja 0-i 5TTATAAGCTTTTATGACTCCAGCGCGA3' (Hind lll-kohdan luominen) kans-• · · sa amplifioiman gmd (nukleotidit 8662 - 9780) ja yhtälailla alukesetin

III

5'CAAGAAAGATCTCAAGTAAACAACGAGTTTTT3' (Bgl ll-kohdan luominen) 25 ja 5TTATGAGCTCTTACCCCCGAAAGCGGTC3' (Sac l-kohdan luominen) • ·

• I I

kanssa amplifioimaan vvcaG (nukleotidit 9786 - 10748). Molemmat PCR-·;·* tuotteet kloonattiin PCR-blunt II TOPO:oon (Zero-blunt-TOPO; PCR-kloning kit, : ’· Invitrogen, Groningen, Alankomaat). Molemmat insertit digestoitiin irti PCR-blunt II TOPOista ja siirrettiin pECS-leu-vektoriin (Stratagene, La Jolla, CA, : 30 USA), gmd-geen\ alakloonattiin Pgal1 -promoottorin alaisuuteen samaan luku- ·:··: kehykseen c-myc-epitoopin kanssa ja vvcaG-geeni PGAi.10-promoottorin alai suuteen samaan lukukehykseen FLAG-epitoopin kanssa. Tämän vektorin kon- is 109811 strukti esitetään kuviossa 2. Valmistettiin myös vektorit, jotka sisälsivät ainoastaan toisen inserteistä. Konstruktit vahvistettiin sekvensoimalla (ABI 310, PE Biosystems, Fostercity CA, USA).

Transformaatio S. cerevisiaeen 5 YPH 499 ja YPH 501 hiivaisäntäkantoihin transformoitiin litiumase- taattimetodilla valmistajan ohjeita seuraten (Stratagene) pESC-leu-vektoreita, jotka eivät sisältäneet mitään geenejä, sisälsivät joko gmd:n tai wcaG:n tai molemmat geenit. Transformantit valittiin käyttäen maljoja, joilta puuttui leusiini.

Hiivatransformanttien valinta 10 Useita alustoilla, joilta puuttui leusiini, kasvavia transformantteja poimittiin talteen ja kasvatettiin yli yön 25 ml:ssa selektiivistä dekstroosia sisältävää synteettistä (SD)-väliainetta, josta puuttui ravintotekijä. GAL1-ja GAL10-promoottorit repressoituivat kun transformoituja hiivasoluja kasvatettiin dekstroosia sisältävässä SD-väliaineessa ja indusoituivat, kun solut vaihdettiin kas- 15 vamaan galaktoosia sisältävään SG-väliaineeseen. Tyypillisessä kokeessa hii-vasolumassa lisääntyi kasvattamalla soluja yli yön SD-väliaineessa ja transformoitujen geenien ilmentyminen indusoitui seuraavina 24 h:na vaihtamalla väliaineen hiililähde dekstroosista galaktoosiksi. Sentrifugoinnin jälkeen hii-vasoluja kasvatettiin toiset 24 h samassa tilavuudessa synteettisessä galak-:20 toosia sisältävässä (SG-) väliaineessa, josta puuttui ravintotekijä ja mitattiin OD600- 1x109 solua spinnattiin pohjaan, suspensoitiin 0,5 ml.aan hajotuspusku-\ ·: ria, joka sisälsi 1 % TX-100:a ja 10 % glyserolia ja solut lyysattiin mekaanisesti vorteksoimalla lasihelmien kanssa (1/3 tilavuutta). Sentrifugoinnin jälkeen solu-lysaateille tehtiin proteiinianalyysi ja entsymaattisen aktiivisuuden analyysit.

25 Kokonaisproteiinia käytettiin Western blottauksessa 25 pg ja aktiivisuusanalyy- • » · sissä 0,3 - 0,4 mg/ml.

* · ·;·* E. colin gmd\n ja wcaG:n ilmentäminen hiivassa » · i ’·· Yhdistelmäproteiinien ilmentyminen havaittiin RNA-ja proteiinitasol- * t · la. Kaksoistransformanttihiivasoluista ja yhtä lailla negatiivisista kontrolleista : 30 uutettiin kokonais-RNA (15 mg) ja hajotettiin mekaanisesti lasihelmien kanssa "·: ja tehtiin Northern-blot -analyysi, kuten aiemmin on kuvattu [Mattila P, Jouts- järvi V, Kaitera E, Majuri M, Niittymäki J, Maaheimo H, Renkonen R ja Maka- ie 10981Ί row Μ: Targetting of active rat a2,3-sialyltransferase to the yeast cell wall by the aid of the hsp150Dcarrier. Towards the synthesis of sLex decorated L-selectin ligands. Glycobiology 1996, 6: 851 - 859], Blotit tutkittiin koettimina E. coli K-12:n wca-geeniklusterista amplifioituja PCR-tuotteita. GMD:n ja GFS:n ! 5 (GFS) ilmentyminen tutkittiin Western blotissa käyttäen vastaavasti c-myc- ja FLAG-epitooppien vastaisia vasta-aineita. Havaitsemismetodina käytettiin ke-miluminesenssia (ECL, Amersham) valmistajan ohjeen mukaisesti.

GDP-L-fukoosin synteesin määrittäminen GDP-L-fukoosin läsnäolo analysoitiin käyttäen hiivasolulysaattia 10 GDP-L-fukoosin lähteenä fukosyylitransferaasireaktiossa, joka muuntaa sialyy- li-N-asetyylilaktoosiamiinia (sLN) sLex:ksi. Reaktioseokseen kuului fukosyyli- transferaasi IV (FucTVI 25 μΙ), Calbiochem; San Diego, CA), fukoosin luovuttajana 1:20 laimennettu hiivasolulysaatti, fukoosin vastaanottajana sLN-

polyakryyliamidibiotiinikonjugaatti (Syntesome; Moskova, Venäjä), 50 mM

15 MOPS-NaOH (pH 7,5), 6 mM MnCI2, 0,5 % Triton X-100, 0,1 % BSA ja 1 mM

ATP. Yhden tunnin inkubaation +37 °C:ssä jälkeen 50 μΙ alikvootti reak- tioseoksista siirrettiin streptavidiinilla (Wallac, Turku, Suomi) päällystetyille mik- rotiitteriliuskoille biotinyloidun glykokonjugaatin immobilisoimiseksi. Sitten fu- ··' kosyloitu reaktiotuote sLex havaittiin ja kvantitoitiin aikaerotteisella fluorometril-* · · · 20 lä (Wallac) käyttäen anti-sLex-primääri-vasta-ainetta KM-93 (Calbiochem) ja • · · · ’ * europium-leimattua (DELFIA Eu-labelling kit: Wallac) anti-hiiri-IgM-sekundääri-vasta-ainetta (Sanbio; Uden, Alankomaat) kuten aiemmin on kuvattu [Räbinä • · ;;;* J, Smithers N, Britten CJ ja Renkonen R: A Time-Resolved Immunofluoromet-• * *" ric Method For the Measurement Of Sialyl Lewis X-Synthesizing Alpha-1,3-. . 25 Fucosyltransferase Activity. Analytical Biochemistry 1997, 246: 71 - 78],

* · I

* · · !./ GDP-L-fukoosin puhdistaminen

Suuren mittakaavan GDP-L-fukoosisynteesiä varten kasvatettiin

» I

: transformanttia, joka sisälsi molemmat, sekä gmd- että wcaG-geenit, 24 h 750 *;·' ml:ssa selektiivistä SD-väliainetta ja toiset 24 h selektiivisessä SG- 30 väliaineessa. Solut kerättiin, kun OD6oo oli 3,7 ja pelletti suspensoitiin pitoisuu-teen 2x109 solua/ml (kokonaistilavuus 45 ml) 1 % TX-100 ja 10 % glyserolia sisältävää hajotuspuskuria lasihelmien kanssa. Voimakkaan 30 min vorteksoin- 17 109811 nin jälkeen lasihelmet ja solujätteet sentrifugoitiin ja kirkas lysaatti suodatettiin YM-10 centricon pylvään läpi (Millipore Corporation; Bedford, MA, USA) yli yön +4 °C:ssa valmistajan ohjeen mukaan.

Sen jälkeen hiivassa syntetisoitu GDP-L-fukoosi puhdistettiin kah-5 della kromatografisella vaiheella. Lektiiniaffiniteettikromatografia suoritettiin pienellä pylväällä (halkaisija 0,5 cm) agaroosiin sidottua Aleuria aurantia lek-tiiniä (2 ml; Vector Laboratories, Burlingame, CA). Pylväs tasapainotettiin 10 mM:sella HEPES-puskurilla, pH 7,5, joka sisälsi 0,15 M NaCI ja 0,02 % NaN3. Hiivasolulysaatin (4 ml) aplikoinnin pylvääseen jälkeen suoritettiin eluutio 4 10 ml:lla tasapainotuspuskuria, jota seurasi 4 ml 25 mM L-fukoosia sisältävää puskuria. Kerättiin 1 ml:n jakeita ja niistä analysoitiin GDP-L-fukoosin läsnäolo.

Suolan poistamiseksi GDP-L-fukoosista ja hapteenisokereiden poistamiseksi käytettiin kokoekskluusio HPLC:tä Superdex Peptide HR 10/30 pylvästä (Pharmacia, Ruotsi). Eluutio suoritettiin 1 ml/min:ssa käyttäen 50 mM 15 NH4HC03:a ja eluenttia tarkkailtiin UV-detektorilla 254 nm:ssä. GDP-L-fukoosin määrä laskettiin piikkien pinta-aloista vertaamalla ulkoisiin standardeihin (GDP-L-fukoosi, Calbiochem).

Matriisiavusteinen laserdesorptio/ionisaatiolentoaikamassaspektro- metriä ' ; 20 Maldi-TOF-massaspektrometria suoritettiin Biflex-massaspektro- • · · · ' ’ metrillä (Bruker Daltonics, Saksa). Analyysi suoritettiin negatiivi-ioni- ’· '' lineaarisessa viivästys-uuttomoodissa käyttäen matriisina 2,4,6-• · · ’···' trihydroksiasetofenonia (THAP, Fluka Chemica) kuten kuvattu. Ulkoinen kalib-raatio suoritettiin THAP-matriisidimeerillä ja sialyyli Lewis x beeta-25 metyyliglykosidillä (Toronto Research Chemicals, Canada).

I » * ;, ’: Tulokset *:* gmd- ja wcaG-geenikonstruktien valmistaminen ja S. cerevisiae % * i ‘ * -transformanttien seulonta ’·.· E. colin GDP-L-mannoosi-4,6-dehydrataasi- (GMD-) aktiivisuutta : 30 koodittava gmd ja GDP-4-keto-6-deoksi-D-mannoosiepimeraasi/reduktaasi- : s.o. GFS- (GFS-) aktiivisuutta koodittava ivcaG insertoitiin pESC-leu-vektoriin, vastaavasti GAL1- ja GAL10-promoottorien alaisuuteen (kuvio 2) GDP-L- is 109811 fukoosin synteesin indusoimiseksi S. cerevisiaessa. gmd oli samassa lukukehyksessä c-myc-epitoopin kanssa ja wcaG FLAG-epitoopin kanssa kuten DNA-sekvensoinnilla paljastui.

Vektorikontrollit, joissa ei ollut yhtään geeniä, yksittäiskonstruktit, 5 jotka sisälsivät vain joko gmd:n tai vvcaG.n tai kaksoiskonstruktit, jotka sisälsivät molemmat geenit, transformoitiin kahteen hiivaisäntäkantaan, YPH 499:ään ja YPH 501:een. Molemmista isäntäkannoista seulottiin gmd- ja wcaG-geenien ilmentymisen RNA-tasolla ja yhtälailla vastaavien entsyymien, GMD ja GFS, proteiinitasolla suhteen useita transformantteja, jotka kykenivät 10 selviämään ja lisääntymään selektiivisillä leusiinin suhteen vajailla maljoilla, joilta puuttui ravintotekijä.

gmd:n ja wcaG:n ilmentäminen S. cerevisiaessa Northern blot -analyysissä havaittiin 1,3 ke:n gmd-transkripti molemmissa hiivakannoissa YPH 499 ja YPH 501, jotka oli transformoitu joko ai-15 noastaan E. colin gmd\Mä tai sekä gmd.Uä että wcaG:llä. Kun analysoitiin vastaavan entsyymin, GMD:n läsnäolo c-myc-vasta-aineella Western blotissa, havaittiin 48 kD:n proteiininauha ainoastaan gmd-geenin sisältävissä yksittäis-transformanteissa tai molemmat, sekä gmd- että wcaG-geenit sisältävissä ..." kaksoistransformanteissa. Vastaavasti valetransformantit eivät antaneet min-20 käänlaista signaalia Northern tai Western blotissa.

Vastaavasti Northern blot -analyysissä havaittiin 1,1 kb:n wcaG-\ nauha molemmissa hiivakannoissa YPH 499 ja YPH 501, jotka oli transformoi- tu joko ainoastaan E. colin wcaG.Wa tai sekä gmd- että ivcaG-geeneillä. Vas- • · ·.· taava wcaG:n koodittama entsyymin ilmentyi 40 kD:n nauhana anti-FLAG-25 vasta-aineella havaittuna. Jälleen valekontrolleissa tai kontrolli-vasta-aineilla ei > ·

« I I

havaittu asiaankuuluvia nauhoja.

t I

•; *' E. colin GMD:n ja GFS:n entsymaattinen aktiivisuus hiivassa I » • ’· De novo -polun välituotteiden GDP-D-mannoosista GDP-L- fukoosiksi (GDP-4-keto-6-deoksi-D-mannoosi ja GDP-4-keto-6-deoksi-L-: 30 galaktoosi) tiedetään olevan labiileja eikä toteuttamiskelpoisia tarkkailtavaksi •:": suuren suorituskyvyn lähestymistavalla. Siten käytimme laboratoriossamme oc- 1,3-fukosylaation mittaamiseen kehitettyä mikrokuoppalevyanalyysiä. Tässä is 109811 analyysissa biotinyloitua polyakryyliamidikonjugoitua sLN:a ja yhdistelmä-oc- 1,3-fukosyylitransferaasi IV:ää lisättiin hiivasolulysaatteihin, jotka joko eivät sisältäneet (vale- tai pelkät yksittäistransformantit, joissa joko gmd tai wcaG) tai sisälsivät GDP-L-fukoosin s.o. kaksoistransformantit, joissa oli molemmat, se-5 kä gmd- että ivcaG-geenit. Tämän analyysin tuloksena oli sialyylilaktoosiaminin vaihtuminen sLexrksi spesifisillä vasta-aineilla ja aikaerotteisella immunofluo-rometrialla havaittuna. Koska tässä analyysissa asiaankuuluva vastaanottaja ja entsyymi olivat läsnä koko ajan, ainoa rajoittava tekijä sLex:n tuottamiselle sLN:stä oli GDP-L-fukoosin läsnäolo tai puuttuminen.

10 Molemmat, niin valetransformantit kuin yhtälailla ainoastaan erik seen gmd:llä tai wcaG:llä transformoidut hiivasolut olivat kykenemättömiä syntetisoimaan GDP-L-fukoosia, jolloin tulokseksi saatiin entsymaattisen analyysin tausta-arvot. Kun gmd:tä ja wcaG:tä ilmentävien hiivakloonien solulysaatit sekoitettiin yhteen, sLex:n synteesi nousi 0 %:sta (taustataso) 10,7 %:iin (YPH 15 499) tai 16,6 %:iin (YPH 501) yhden tunnin analyysissä. Sen todistamiseksi, että nämä geenit voitaisiin transformoida samaan hiivasoluisäntään, gmcfitä ilmennettiin GAL1-promoottorin alaisuudessa ja wcaG:\ä GAL10-promoottorin alaisuudessa samassa pESC-leu-vektorissa joko YPH 499:ssä tai YPH 501:ssä. Nämä kaksoistransformantit kykenivät tuottamaan GDP-L-fukoosia 20 riittävästi mahdollistaakseen 3,4 %:n (YPH 499) ja 5,2 %:n (YPH 501) sLN- : * vastaanottajista muuntumisen sLexiksi yhden tunnin analyysissa.

• · *· '· Sen analysoimiseksi, että onko luontaisen hiivan tuottaman GDP- • · » mannoosin määrä GDP-L-fukoosin synteesin rajoittava tekijä kaksois-'···’ transformoiduissa hiivakannoissa, hiivasolulysaatteihin lisättiin ulkoista GDP-25 D-mannoosia (0 - 500 μΜ) ennen inkubaatiota asiaankuuluvan sLN- * · ·

vastaanottajan ja yhdistelmä-oc-1,3-fukosyylitransferaasin kanssa. Ulkoisen ‘‘‘ GDP-D-mannoosin lisäys lisäsi GDP-L-fukoosin synteesin määrän 3-·’t‘* kertaiseksi, s.o. 3,4 %:sta 12,5 %:iin (YPH 499) tai 5,1 %:sta 12,5 %:iin (YPH

» t 501). Osoitimme myös, ettei eksogeenisen NAPDH:n lisäys enää kiihdyttänyt 30 lisää GDP-L-fukoosin synteesiä, mistä voisi päätellä, ettei tämän kofaktorin pi-*: : toisuus hiivasolulysaateissa ole rajoittava vaihe tässä kokeessa.

20 109811 GDP-L-fukoosin puhdistus ja MALDI-TOF MS gmd:\ä ja wcaG:tä ilmentävissä hiivasoluissa tuotetun GDP-L-fukoosin synteesin vahvistamiseksi edelleen ja tuotetun määrän kvantitoimi-seksi käytettiin tuotteen puhdistamiseksi Aleuria aurantia 5 lektiiniaffiniteettikromatografiaa. Kuten entsymaattisessa oc-1,3-fukosyylitransferaasianalyysissa huomattiin, suurin osa lektiinipylvääseen sitoutuneesta GDP-L-fukoosista eluoitui eksogeenisellä L-fukoosin lisällä. Piikki-jae puhdistettiin edelleen kokoekskluusio-HPLC:llä, jossa sekä puhdistetun tuotteen että kaupallisen GDP-L-fukoosin retentioaika oli 16,2 min. Ulkoiseen 10 standardiin (GDP-L-fukoosi) verrattuna GDP-L-fukoosin määrä puhdistuksen jälkeen oli 3 mg:a 1 ml:aa alkuperäistä hiivasolulysaattia kohden vastaten 0,2 mg/l:ssa GDP-L-fukoosia alkuperäisessä hiivasoluviljelmässä.

Tälle HPLC-puhdistetulle tuoteelle tehtiin sitten MALDI-TOF MS analyysi. Kaupallisen GDP-L-fukoosin kanssa keramigroituva kaksois-15 transformoiduista hiivasoluista puhdistettu tuote antoi yksittäisen piikin m/z 588,04:ssä (laskennallinen m/z GDP-L-fukoosin [M-H]':lle on 588,08). Yksittäinen sopivalla alueella MALDI-TOF MS:ssa nähty piikki ei ainoastaan osoita, että tuote on GDP-L-fukoosi, vaan osoittaa myös, että tuote on vapaa muista nukleotidisokereista.

: : 20 Esimerkki 2

Uusien Helicobacter pylorin gmd- ja vvcaG-geenien tunnistami- 3 i nen, kloonaus ja toiminnallinen ilmentäminen • · *···’ Pystyimme tunnistamaan putatiiviset gmd- ja ivcaG-geenit julkiste- • · tusta H. pylori J99:n kokonaisesta genomista (Genbank, tunnusnumero 25 AE001443) in s/7/co-kloonausta käyttäen. Sekvenssien kohdistuksella putatiivi-

I t I

nen gmd-geeni tunnistettiin J99:ssä jph0038:ksi ja 26695:ssä hp0044:ksi (sek- * · '!* venssitunnustumero 1; SEQ ID No. 1), tunnettu myös rfbO.nä. Samoin gfs- i '‘· geenin ehdotettiin olevan J99:ssä jhp0039, 26695:ssä hp0045 (sekvenssitun-* »» * · '···* nusnumero 2; SEQ ID No. 2) s.o. noK, joka on nimetty wöcJ:ksi (McGowan).

: 30 GDP-L-fukoosin synteesin indusoimiseksi S. cerevisiaessa H. pylo- '· " rin GDP-D-mannoosi-4,6-dehydataasi- (GMD) aktiivisuutta koodittava gmd ja GDP-4-keto-6-deoksi-D-mannoosiepimeraasi/reduktaasi- s.o. GFS-aktiivi- 21 ί 109811 suutta koodittava gfs insertoitiin pESC-leu-vektoriin, vastaavasti GAL1- ja GAL10-promoottorien alaisuuteen, gmd oli samassa lukukehyksessä c-myc-epitoopin ja gfs FLAG-epitoopin kanssa kuten DNA-sekvensoinnissa paljastui. Vektorikonstrukti oli ekvivalentti kuviossa 2 esitetyn kanssa.

5 Geenikonstruktien valmistaminen gmd- ja gfs-koodittavat alueet amplifioitiin H. pylorin geeniklusterista (tunnus U38473). Käytettiin Advantage polymeraasia (Clontech, Palo Alto, CA, USA) alukesetin 5’AAGAACTCGAGTCAAAAGTCGCTCTCAT3’ (Xhol kohdan luomi-10 nen) ja 5'TTATAAGCi i I IATGACTCCAGCGCGA3' (Hind lll-kohdan luominen) kanssa amplifioimaan gmd (nukleotidit 8662 - 9780) ja yhtälailla alukesetin 5'CAAGAAAGATCTCAAGTAAACAACGAGTTTTT3' (Bgl ll-kohdan luominen) ja 5TTATGAGCTCTTACCCCCGAAAGCGGTC3’ (Sao l-kohdan luominen) kanssa amplifioimaan gfs (nukleotidit 9786 - 10748). Molemmat 15 PCR-tuotteet kloonattiin PCR-blunt II TOPO:oon (Zero-blunt-TOPO; PCR-kloning kit, Invitrogen, Groningen, Alankomaat). Molemmat insertit digestoitiin irti PCR-blunt II TOPOista ja siirrettiin pECS-leu -vektoriin (Stratagene, La Jolla, CA, USA), gmd-geeni alakloonattiin Pgal1 -promoottorin alaisuuteen sa-.,;" maan lukukehykseen c-myc-epitoopin kanssa ja gfs-geeni Pgal1 0-promoottorin 20 alaisuuteen samaan lukukehykseen FLAG-epitoopin kanssa. Valmistettiin myös vektorit, jotka käsittivät ainoastaan toisen insertin. Konstruktit vahvistet- • · tiin sekvensoimalla (ABI 310, PE Biosystems, Fostercity CA, USA).

# · ·

Vektorikontrollit, joissa ei ollut yhtään geeniä, yksittäiskonstruktit, • * ·

jotka sisälsivät ainoastaan joko gmd:n tai gfs:n tai kaksoiskonstruktit, jotka si-25 sälsivät molemmat geenit, transformoitiin kahteen hiivaisäntäkantaan, YPH

» » V · · 499:ään ja YPH 501:een. Molemmista isäntäkannoista seulottiin gmd- ja ·;·' u/caG-geenien ilmentymisen RNA-tasolla ja yhtälailla vastaavien entsyymien, • *· GMD ja GFS, proteiinitasolla suhteen useita transformantteja, jotka kykenivät • »* selviämään ja lisääntymään selektiivisillä leusiinin suhteen vajailla maljoilla, : 30 joilta puuttui ravintotekijä.

22 109811 gmd.n ja gfs:n ilmentäminen S. cerevisiaessa Northern blot -analyysissä havaittiin 1,3 ke:n gmd-transkripti molemmissa hiivakannoissa YPH 499 ja YPH 501, jotka oli transformoitu joko ainoastaan E. colin gmd:\\ä tai sekä gmd:llä että gfe:llä. Kun analysoitiin vastaa-j 5 van entsyymin, GMD:n läsnäolo c-myc-vasta-aineella Western bloteissa, ha vaittiin 48 kD:n proteiininauha vain gmd-geenin sisältävissä yksittäistransfor-manteissa tai molemmat, sekä gmd- että gfs-geenit sisältävissä kaksoistrans-formanteissa. Vastaavsti valetransformantit eivät antaneet minkäänlaista signaalia Northern tai Western bloteissa.

10 Vastaavasti Northern blot -analyysissä havaittiin 1,1 ke:n gfe-nauha molemmissa hiivakannoissa YPH 499 ja YPH 501, jotka oli transformoitu joko ainoastaan E. colin g/s:llä tai sekä gmd:\lä että g/s:llä. Vastaava gfs:n koodit-tama entsyymi ilmentyi 40 kD:n nauhana anti-FLAG-vasta-aineella havaittuna. Jälleen valekontrolleissa tai kontrollivasta-aineilla ei havaittu asiaankuuluvia 15 nauhoja.

H. pylorin GMD:n ja GFS:n entsymaattinen aktiivisuus hiivassa De novo -polun välituotteiden GDP-D-mannoosista GDP-L-fukoosiksi (GDP-4-keto-6-deoksi-D-mannoosi ja GDP-4-keto-6-deoksi-L-galaktoosi) tiedetään olevan labiileja eikä toteuttamiskelpoisia tarkkailtavaksi * 20 suuren suorituskyvyn lähestymistavalla. Siten käytimme laboratoriossamme oc-' * 1,3-fukosylaation mittaamiseen kehitettyä mikrokuoppalevyanalyysiä. Tässä • t ’·”· analyysissa biotinyloitua polyakryyliamidikonjugoitua sLN:a ja yhdistelmä-oc-* · 1,3-fukosyylitransferaasi IV:ää lisättiin hiivasolulysaattiin, joka joko ei sisältänyt • · *···’ (vale- tai vain yksittäistransformantit, joissa joko gmd tai gfs) tai sisälsi GDP-L- , , 25 fukoosia s.o. kaksoistransformantit, joissa molemmat, sekä gmd- että gfs- I > I » · · geenit. Tämän analyysin tuloksena oli sialyylilaktoosiaminin vaihtuminen » *!' sLex:ksi spesifisillä vasta-aineilla ja aikaerotteisella immunofluorometrialla ha-: ” vaittuna. Koska tässä analyysissa asiaankuuluva vastaanottaja ja entsyymi oli- I » vat läsnä koko ajan, ainoa rajoittava tekijä sLex:n tuottamiselle sLN:stä oli 30 GDP-L-fukoosin läsnäolo tai puuttuminen.

Molemmat, niin valetransformantit kuin yhtälailla ainoastaan erikseen gmd:llä tai gfs.llä transformoidut hiivasolut olivat kykenemättömiä synte- 23 109811 tisoimaan GDP-l_-fukoosia, jolloin tulokseksi saatiin entsymaattisen analyysin tausta-arvot. Kun gmd.tä ja gfs:ää ilmentävien hiivakloonien solulysaatit sekoitettiin yhteen, sLex.n synteesi nousi 0 %:sta (taustataso) 15 %:iin (YPH 499) yhden tunnin analyysissä. Sen todistamiseksi, että nämä geenit voitaisiin 5 transformoida samaan hiivasoluisäntään, gmd:tä ilmennettiin GAL1-promoottorin alaisuudessa ja gfs.ää GAL10-promoottorin alaisuudessa samassa pESC-leu-vektorissa joko YPH 499:ssä tai YPH 501:ssä. Nämä kaksois-transformantit kykenivät tuottamaan GDP-L-fukoosia riittävästi mahdollistaakseen sLN-vastaanottajan muuntumisen sLex:ksi.

10 Esimerkki 3

Uusien H. felisin ja rotan oc-1,3-fukosyylitransferaasigeenien kloonaus

Fukosyylitransferaasi siirtää GDP-L-Fuc:n (luovuttaja) kasvavaan glykaaniketjuun. Olemme matalan stringensin kloonauksella löytäneet baktee-15 rin oc-1,3-fukosyylitransferaasientsyymin H. felisistä, kloonanneet, sekvensoi-neet ja ilmentäneet sitä E. colissa, S. cerevisiaessa ja Nawalma-soluissa. Yleinen sekvenssihomologia ja konservoituneet motiivit osoittivat sen <x-1,3-fukosyylitransferaasiksi. H. felisin 1,3-fukosyylitransferaasigeenillä on sek-··* venssitunnusnumero 8 (SEQ ID No 4). Lisäksi olemme löytäneet myös uuden lit· 20 rotan a>1,3-fukosyylitransferaasi- (FucT-VII-) entsyymin, joka on ratkaiseva III· [ sialyloitujen glykaanien synteesissä, ja kloonanneet, sekvensoineet ja ilmentä- ;,,: neet sitä Nawalma-soluissa.

• » • »

Rotan oc-1,3-fukosyylitransferaasi Vll-geeni kloonattiin käyttäen cDNA.ta rotan endoteelisoluista, ja ihmisen ja hiiren geenien homologiaan pe-,·, ; 25 rustuen suunniteltuja alukkeita. Kloonattu geeni on 1910 ep pitkä (sekvennsi-

t I I

,·>’, tunnusnumero 7; SEQ ID No. 3) ja ORF on nukleotidien 194 - 1341 välissä j koodittaen 367 pitkää aminohappoa. Tämä geeni transfektoitiin pcDNA3- I i ilmennysvektoriin (neomysiinresistenssigeenin kanssa) ja transfektoitiin Na- I · ",’ malwa-soluihin elektroporaatiolla stabiilin transfek-tanttisolulinjan neomysii- l : 30 niselektiolla perustamiseksi.

> > i I i » • · 24 109811

Esimerkki 4

Kaksi aikaerotteisen fluorometrisen suuren suorituskyvyn analyysia GDP-L-fukoosin kvantitoimiseen solulysaateista, kudosuut-teista ja kehon nesteistä 5 Materiaalit ja menetelmät

Biotinyloidut Lex- ja sLN-polyakryyliamidikonjugaatit olivat Syn-tesomilta (Moskova, Venäjä). Anti-sLex-vasta-aine KM-93 (hiiren IgM), oc-1,3-fukosyylitransferaasi VI (FucTVI) ja GDP-Fuc olivat Calbiochemiltä (San Diego, CA) ja fukoosille spesifinen lektiini-AAL olivat Vector Laboratoriesilta (Burlin-10 game, CA). Anti-hiiri-IgM-vasta-aine (rotan) (Sanbio, Uden, Alankomaat) ja AAL leimattiin europiumilla DELFIA EU-labelling kit:in (Wallac, Turku, Suomi) käyttöohjeen mukaisesti. Streptavidiinimikrotiitteriliuskat, vahvennusliuos, ana-lyysipuskuri ja pesutiiviste oli hankittu Wallacilta.

Hiivasolu-uutteiden valmistus 15 GMD-, GFS- tai molemmilla näillä geeneillä transformoituja yhdis- telmähiivakantoja kasvatettiin ensin yön yli glukoosia sisältävässä SD- väliaineessa ja sitten stimuloitiin vieraiden geenien ilmentyminen kasvattamalla yhdistelmäkantoja galaktoosia sisältävässä SG-väliaineessa 24 h ajan. 1x109 ·:· solua spinnattiin pohjaan, suspensoitiin 0,5 ml:aan lyysipuskuria, joka sisälsi :··: 20 50 mM MOPS-NaOH:ia (pH 7,0), 1 % Triton X-100:a ja 10 % glyserolia, ja so- :*·: lut lyysattiin mekaanisesti vorteksoimalla lasihelmien kanssa. Lysaatteja ja yk- sittäistransformanttien lysattien seosta inkuboitiin 2 h ajan +30 °C:ssa.

:: oc-1,3-fukosyylitransferaasianalyysi • · * ’···* Reaktioseokseen kuului fukosyylitransferaasi (FucTVI 25 pU), fu- 25 koosin luovuttaja (kaupallinen GDP-L-Fuc tai hiivasolulysaatti), sLN- • · ·

*;,/ polyakryyliamidibiotiinikonjugaatti (1 pg/ml) fukoosin vastaanottajana, 50 mM

·

MOPS-NaOH (pH 7,5), 6 mM MnCI2, 0,25 % Triton X-100, 0,1 % BSA ja 1 mM

* · • · : ” ATP. Reaktioseoksia inkuboitiin tunnin ajan +37 °C:ssa eritäin matalan sitou- ’·;·* tumisen 96-kuoppalevyillä (Costar, Cambridge, MA). Entsymaattisen reaktion 30 jälkeen 50 μΙ alikvotteja reaktioseoksista siirrettiin streptavidiinilla päällystetyille : mikrotiitteriliuskoille biotinyloitujen glykokonjugaattien immobilisoimiseksi. Im- 25 10981 1 mobilisoinnin (30 min) jälkeen fukosyloitu reaktiotuote sLex havaittiin ja kvanti-toitiin aikaerotteisella fluoromerilla (Wallac) ja monoklonaalisilla vasta-aineilla. Anti-sLex primaarinen vasta-aine KM-93 (0,5 μς^Ι) ja europium-leimattu anti-hiiri-lgM sekundaarinen vasta-aine (0,6 pg/ml) laimennettiin molemmat DEL-j 5 FIA-analyysipuskurilla ja inkuboitiin 1 h ajan huoneen lämmössä voimakkaassa | ravistelussa. Inkubaatioiden välillä ja niiden jälkeen liuskat pestiin kuuteen ker taan DELFIA-pesuliuoksella. Lopuksi lisättiin (150 μΙ/kaivo) DELFIA-vahvennusliuosta ja inkuboitiin huoneen lämmössä 5 min hitaassa ravistelussa. Sitten mitattiin fluoresenssi aikaerotteisella fluorometrillä (Wallac).

1 o GDP~Fuc:n mittaus a 1,3-fukosyylitransferaasi analyysillä Käytettiin hiivasolulysaattia fukoosin luovuttajana fukosyylitrans-feraasireaktiossa, joka muuntaa sLN:ää sLex:ksi (edellä). Näytteet laimennettiin (1:50) 50 mM MOPS-NaOH-puskurilla (pH 7,5), joka sisälsi 0,5 % Triton X-100:a ja sekoitettiin muiden entsymaattisen reaktion komponenttien kanssa. 15 GDP-Fuc:n kvantitoimiseksi näytteissä tarkkaan määrättyjä pitoisuuksia kaupallista GDP-Fuc:ia näytepuskurilla laimennettuina käytettiin standardeina. GDP-Fuc:n mittaaminen lektiini-inhibitioanalyysillä Lex-polyakryyliamidibiotiini (0,1 pg/ml DELFIA analyysipuskurissa) immobilisoitiin streptavidiinilla päällystetyille mikrotiitteriliuskoille. 30 min inku-20 baation ja pesun jälkeen joko standaria (lyysipuskurilla laimennettu GDP-Fuc)

' * tai hiivasolulysaattia (10 μΙ) pipetoitiin kuoppiin. Sitten lisättiin Eu-leimattu AAL

• · · ';//· (40 μΙ, 0,2 μg/ml, DELFIA-analyysipuskurissa). 15 minuutin inkubaation • · ravistelijalla huoneen lämmössä jälkeen liuskat pestiin kuuteen kertaan • · DELFIA-pesuliuoksella. Lisättiin vahvennusliuos (150 μΙ/kaivo) ja liuskoja . . 25 inkuboitiin 5 min huoneen lämmössä hitaalla ravistelulla. Sitten mitattiin • · ( • 4 · fluoresenssi aikaerotteisella fluorometrillä (Wallac).

Tulokset GDP-Fuc:n kvantitoimiseksi kehitettiin kaksi suuren suorituskyvyn • » ’f* analyysiä. Molemmat analyysit käyttävät biotinyloituja hiilihydraattipolyakryyli-30 amidikonjugaatteja ja aikaerotteista fluorometrista havaitsemista. Ensimmäi-: sessä analyysissa (kuvio 2A) käytetään GDP-Fuc:ia fukoosin luovuttajana 26 109811

FucT-entsyymille, joka siirtää fukoosin sLN:ään tuottaen sLex:n. Entsymaatti-nen fukosylaatioreaktio tapahtuu liuoksessa, minkä jälkeen biotinyloidut glyko-konjugaatit vangitaan spesifisesti streptavidiinilla päällystetylle mikrotiitterilevyl-le. Koska tässä analyysissa entsyymiä ja vastaanottajaa on läsnä aina vakio 5 pitoisuus, näytteessä olevan GDP-Fuc:n pitoisuus on rajoittava tekijä sLex:n syntymiselle sLN:stä. Immobilisoitu reaktiotuote sLex havaitaan tuotespesifisel-lä primaarisella vasta-aineella ja europuim-leimatulla sekundaarisella vasta-aineella. Toinen analyysi (kuvio 2B) perustuu europium-leimatun fukoosis-pesifisen lektiini-AAL:n sitoutumiseen mikrotiitterilevyjen kuoppiin immobilisoi-10 tuun Lex-glykokonjugaattiin. Näytteessä oleva GDP-Fuc sitoutuu lektiiniin ja siten inhiboi lektiinin siotutumista immobilisoituun ligandiin aikaansaaden laskun fluoresenssilukemissa.

Standardikuvaajat GDP-Fuc:lle

Tarkkaan määrättyjä pitoisuuksia kaupallista GDP-Fuc:ia käytettiin 15 standardeina analyysissä. Ensimmäisessä FucT:n entsymaattista aktiivisuutta käyttävässä analyysissa fluoresenssilukemat olivat verrannollisia GDP-Fuc:n pitoisuuteen alueella 10 - 10 000 nM. Analyysi kykeni havaitsemaan 10 nM GDP-Fuc:ia käyttäen 1 h:n entsyymin inkubaatioaikaa. Taustalukemat olivat ··· tasolla 10 000 cps ja vähennettiin tuloksista. Toisessa analyysissa, joka on :··: 20 riippuvainen lektiinin sitoutumisesta joko matriisiin sitoutuneeseen ligandiin tai :··: GDP-Fuc:iin liuoksessa, GDP-Fuc inhiboi AAL:n sitoutumisen kuoppiin annok- sesta riippuvalla tavalla. Kun sitoutumistiedot muunnettiin prosenteiksi, 50 %:n inhibiitiopitoisuus (IC50) oli välillä 50 - 100 μΜ. Dynaaminen mittausalue on ka- • · · peampi kuin entsyymianalyysissa ollen noin 10 - 500 μΜ. Standardikuvaajan 25 matalan ja korkean pitoisuuden päissä annosvastekuvaaja on matala, mikä ra- • · · '· " joittaa analyysin herkkyyttä näillä pitoisuusalueilla.

• » ···* Analyysit käsittelemättömille hiivalysaateille ; ·.· GDP-Man.in muuntamiseen GDP-Fuc:ksi tarvittavia E. colin geenejä * · · GMD:lle ja GFS:lle ilmentävä stabiili yhdistelmä-S. cerevisiae -kanta testattiin ; 30 yhdessä yksittäistransformanttien ja kontrollien kanssa. Kuten ensimmäisellä ·:··· ensyymiin perustuvalla analyysillä on määritetty, valetransformanttikanta (501-) oli kykenemätön syntetisoimaan GDP-Fuc:ia, jolloin tulokseksi saatiin entsy- 27 109811 maattisen analyysin tausta-arvot. Sitä vastoin kaksoistransformanttikanta (501+) kykeni tuottamaan GDP-Fuc:ia omasta GDP-Man-poolistaan. Yksin testattuina joko GMD:tä tai GFS:ää ilmentävät kannat (yksittäistransformantit) eivät pystyneet tuottamaan GDP-Fuc:ia. Kun näiden kantojen lysaatit sekoitettiin 5 yhteen, havaittiin GDP-Fuc:n läsnäolo. Näytteet mitattiin myös toisella, lek-tiininsitomisanalyysillä. Tämä analyysi on vähemmän herkkä, mutta kuten entsyymiin perustuvan analyysin standardikuvaajista ja tuloksista voitiin ennustaa, GDP-Fuc:n läsnäolo voitiin havaita myös lektiininsitomisanalyysillä. GDP-Fuc:n pitoisuudet solulysaateissa laskettiin standardikuvaajaa käyttäen. Kaksois-10 transformanttihiivan solulysaatissa entsymaattisen analyysin ja lektiinianalyysin antamat tulokset olivat vastaavasti 11 μΜ ja 12 μΜ GDP-Fuc:ia. Vastaavasti yksittäistransformanttihiivalysaattien seoksessa havaittiin joko 17 μΜ tai 25 μΜ GDP-Fuc:ia.

Vaikka edellä oleva viittaa erityisen edullisiin suoritusmuotoihin, tu-15 lee ymmärtää ettei nykyinen keksintö ole sillä tavoin rajoitettu. Tavalliseille alan ammattimiehille on ilmeistä, että kuvattuihin suoritusmuotoihin voidaan tehdä erilaisia muunnoksia ja että sellaiset muunnokset on tarkoittetu kuuluviksi nykyisen keksinnön piiriin.

. §;:' Kaikki tässä mainitut viitteet otataan selitykseen viitteiksi.

20 «· · · • · t t • «1 • · · • · « · · * ·» · • · • · ♦ • · · • 1 · • · • ♦ • 1 ♦ · · 28 SEQUENCE LISTING _ Λ 109811 <110> Glycim Oy <120> Use of Recombinant Enzymes for Preparing GDP-L-fucose ί and fucosylated glycans <130> sequences 1 — 4 <14 0> <141> <160> 4 <170> Patentin Ver. 2.1

<210 > 1 <211> 1146 <212> DNA

<213> Helicobacter pylori < 4 0 0 > 1 atgaaagaaa aaatcgcttt aatcaccggg gttaccgggc aagacgggag ctatctggct 60 gaatacttgc tgaatttggg ctatgaagtg catgggttaa aaaggcgctc ttctagcatc 120 aacacttcta ggatcgatca tttgtatgaa gatttgcaca gcgaacacaa aaggcgtttt 180 ttcttgcact atggggatat gaccgatagc tctaacctca tccatttgat cgctaccact 240 aagcccacag agatttataa tttagccgcg caaagccatg tgaaagtctc ttttgaaacc 300 ccagaataca ccgctaacgc tgatggtatt ggcacgctaa ggattttaga ggccatgcgg 360 attttgggct tagaaaagaa aacgcgcttt tatcaagcta gcacgagcga attgtatggc 420 ..." gaagtcttag aaaccccaca aaatgaaaac acccccttta acccacgaag cccctatgcg 480 :*·; gtcgctaaaa tgtatgcctt ttacatcact aaaaattaca gagaggctta taatttgttt 540 ,..: gcggttaatg gcatcctttt taaccatgag agcagggtaa ggggcgaaac ttttgtaacc 600 cgtaaaatca cacgagccgc tagcgcgata gcgtataact taacggattg cttgtattta 660 *. *; gggaatttgg acgctaaaag agactggggg catgccaaag attatgtgaa aatgatgcat 720 ttgatgctcc aagcacccac cccacaagat tatgtaatcg ctacagggaa gaccacgagc 780 l|| ,···' gtgcgcgatt ttgtgaaaat gagctttgaa tttatcggca ttgatctaga atttcaaaat 840 ··· acagggatta aagaaatcgg t-ttgattaaa agcgttgatg aaaaaagagc gaacgcttta 900 caattaaact taagccattt aaaaacgggc aaaatcgtgg tgcgtataga cgagcactat 960 ;*·t· ttcaggccta ctgaagtgga tttgctctta ggcgatccca ctggggctga gaaagagctg 1020 • · ggctgggtta gggaatacga tttaaaagag ttggttaagg acatgttaga atacgattta 1080 ···* aaagaatgcc agaaaaacct ttacttgcaa gatgggggct atactttaag gaatttttat 1140 gaatga 1146

. !·. <210> 2 <211> 933 * " <212> DNA

<213> Helicobacter pylori 109811 29 <400> 2.

atgaatgaga tcattttaat caccggcgct tatggcatgg tggggcagaa cacggcgttg 60 tattttaaaa aaaacaagcc tgatgttacc ttactcaccc ctaaaaagag cgaattgtat 120 ttgttggata aagacaacgt tcaagcctat ttgaaagaat acaagcctac aggcattatc 180 cattgtgccg ggagagtggg gggcattgtg gcaaacatga acgatctttc aacttacatg 240 gttgagaatt tactcatggg tttgtatctt ttttctagcg ctttagattt gggcgtgaaa 300 aaagccatta atctagcgag ctcttgcgct tatcctaaat acgcccctaa ccctttaaaa 360 gagagcgatt tattgaacgg ctctttagaa ccaacgaatg aaggctacgc tttagccaaa 420 ctctctgtga tgaagtattg cgaatacgtg agcgctgaaa aaggcgtttt ttataaaact 480 ctagtgcctt gtaaccttta tggcgagttt gacaagtttg aagaaaagat agcgcacatg 540 ataccagggc ttattgctag gatgcacacc gctaaattaa aaaatgaaaa aaattttgcg 600 atgtggggcg atggcacggc cagaagagag tatctaaacg ctaaagattt agccagattc 660 atcgctctcg cttatgagaa tatcgctcaa atgcctagcg tgatgaatgt cggctctgga 720 gtggattaca gcattgaaga gtattacgaa aaagtcgctc aggttttaga ctataagggc 780 gtgtttgtga aagattcatc caaaccagtg ggcatgcaac aaaagcttat ggatatttcc 840 aaacaaaagg ctttaaaatg ggaattagaa atccctttag agcagggcat caaagaagct 900 tatgagtatt atttgaagct tttagaggtt tga 933 <210> 3 <211> 1910 <212> DNA <213> Rat <4 00> 3 ggttgatgcc aaagattgaa ggggtagggt ggggcagaag tgggaaggtc cctggcttcc 60 tcaccttggt agatgaaaca aaagcatcag gctgagttga gcagtagctg tgatttcagg 120 gtgcctctgt tggagaggct gctgtgattt gaaaacctcc tttccctggg tgactaattc 180 ...· cagaaagctc tggatgaatt gtattggtga gtgcctggcc ttgagaagtc ccagctgggg 240 ;··· acgatgggga ttttggggtg tccccgaacc taaggtgaca gggcctctcc tttttcattc 300 .,t; tgcttcaggg tgcaaccccg tctggaagct gcgggcctgg gggtgtctgg ctggaggtac 360 • · . aacactcatg gtaatctggc tcttctggct gctgcgatca gttcctgggg gtgccccagc 420 • · · ·. *; gccccagccc acactcacca tccttatctg gcactggcct ttcaccaacc ggtcgccaga 480 gctgtctagc gacacctgca ctcgctatgg catggccagc tgccacctga gtgctaaccg 540 * t · gagtctgcta gccagtgctg atgctgtggt cttccaccat cgtgagctgc agacccggca 600 ··· ctctcgcctg cccctggacc agaggccgca cggacagcct tgggtctggg ccaccatgga 660 atcacccagt aatacccatg gtctccgtca cttccggggc atcttcaact gggtgctgag 720 ;*·. · ctatcggcgt gattcagata tctttgtacc ctatggtcgc ttagagccct tctctgggcc 780 ... tacgccccca ctaccagcca aaagcaggat ggctgcctgg gtggtcagca atttccagga 840 ”·'gcggcagcag cgggcaaagc tgtaccggca gctggcccct catctgaagg tggatgtgtt 900 I', cggtcgcgcc agtggacggc ccctgtgccc taactgtctg ctgcccactg tggcccggta 960 ccgcttctac ctgtcctttg agaactcaca gcaccgggac tacatcaccg agaagttctg 1020 ’·.·*gcgcaatgca ctggccgctg gcgctgtgcc tgtggtgctg ggacctcctc ggactaccta 1080 . .·.cgaggctttc gtgccaccag atgcctttat acacgtagat gacttcagct ctgcccgtga 1140 actagctgtc ttccttgtca gcatgaatga gagtcgctat cgtggcttct ttgcttggcg 1200 ' ‘agaccggctc cgtgtgcggc tcctgaatga ctggagggag cgcttctgca ccatctgcgc 1260 ccgctaccct tacttgcccc gcagccaggt ctatgaagac ctggaaagct ggttccaagc 1320 ttgaactcct gctgctggga gaggctgtgt gcgtggaaga ctgatgatga aatggaaggg 1380 cttttgggtc accatgggac taaccctagg cttaggtcag tgaataggaa gtcaggatat 1440 30 109811 I gaggagaagg ctgggctgag aagccatatg gatgaggact ctggtgggct ttagagt-agg 1500 gacccaggga aggagacaat taatgaggag cgtgtgggaa aagctagtca aacggggaaa 1560 I gtggctgagg gtcctggact taccttgagt atgctcatgg ctcaaggctc aggtgaaaaa 1620 I gggaggcagt gtctctggag ctgggaacat ccaaagctgg gatttgtggg gacaaacatg 1680 gtgcctgaac ctccacaatc aaagtgctta gcctcaggga tacaagtgtg tgttccagaa 1740 ctccacatgc aaaatgtatg ctgagcccag ggtttgtggg agaaggatgg tgtggatgat 1800 tctgggcttt tgacaccaca gttccctgag ggaaagaggc accactaata ataaaattgt .1860 tcacttgtaa tagagacgcc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagt 1910

<210> 4 <211> 1190 <212> DNA

<213> Helicobacter felis <400> 4 atgcctttgt tgagagcacc aagctacccc cccccccccc ccacaaaaag cctttaaatt 60 tagacttaca atggtatcgc gatttaaatg attttaaggg gtggtttttt tatgacattt 120 tccagcacca atacaatgtt tcgtttgata aaaaggcgga ttgtgattgc ctccttggag 180 tgcaccatag aacactagaa gagttgtacc aagccttgac taatcccaaa aagcgtcttg 240 tgtttatggg agaaaatgag cgcattgatt ttaatgtcta cgactttgcc atgagttttg 300 atcatttgga gtttggagat cgctatttgc gcgtgcctct ttattaccag tctctccatt 360 ggttcttgca catcattact catgcgtcta atcctccttt tagactggat ggagcgcacg 420 agatgctaca ctctcctttg acactccatc taccccttaa ctccacatgc actaaaattt 480 cttttgctga caaataccct catttagatg ccctagctag agaacagaaa aatcctcttg 540 aacgagagtt tgctagtttt gtggcttcca actggggagc ccccatgcgc aataattttt 600 • · · .«ccagcaact caacgagtat cgccctgtgg ctgggggtgg gagagtgttt aacactatag 660 ijofeaacccgt .atctaataaa catgactttt tagcccaata taagttcaat ttgtgctttg 720 .aa^actcttg tggcatgggt tataccactg agaaaattgt ggatgcttat tttgcccaca 780 .ctattcctat ttattggggt aatccgttag tgcatttgga ttttaaccct aaaagttttg 840 '.tijkatgtcca tgattttgcc aacctagatg aggcgatcga ttttgtgcac tatttggaca 900 :cctatgacaa tgcctattta gaaatgctcc atgctcaccc gcttagcatt gtggaaggca 960 * · « .•aapcgaaatt ttgccatgat ttgagtttta agaaaatctt agactttttg gtcaatgcga 1020 • · ‘tSgaaagtcc gcataactat cacgagcagg tccgtgtact tagtaacagt gtgtacaaat 1080 atcggcatcc aagccgcgac accgtgctag aagcatgctc tggaagagaa catctgcaac 1140 ;tgptcctcaa aaagctccat aaaaaattat ggaagcgcaa gagaccctaa 1190 • · • · · * · • · I » » • » t t · «

Claims (15)

31 109811

1. Menetelmä GDP-L-fukoosin valmistamiseksi GDP-D- mannoosista, tunnettu siitä, että GDP-L-fukoosi valmistetaan luontaisesta 5 GDP-D-mannoosista viljelemällä hiiva- tai homesoluja, jotka on transformoitu DNA-sekvenssillä, joka koodaa GDP-mannoosi-4,6-dehydrataasia (GMD) ja DNA-sekvenssillä, joka koodaa GDP-4-keto-6-deoksi-D-mannoosi-3,5-epime-raasi/4-reduktaasia (GFS) toiminnallisesti ilmentämään mainitut entsyymit, ja otetaan talteen mainituissa soluissa luonnostaan olevasta GDP-D-mannoosis- 10 ta muodostunut GDP-L-fukoosi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ilmennetyt GMD- ja GFS-entsyymit ovat Escherichia coli- tai Helicobacter py/on-bakteerin entsyymejä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 15 että hiivasoluja transformoidaan vektorilla, joka sisältää mainitut DNA- sekvenssit sisällytettyinä yhteen vektoriin.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut transformoidaan vektorilla, joka koodaa GMD:n ja GFS:n kimeeristä molekyyliä.

5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 -4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiivasolut ovat Saccharomyces cerevisiae.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muodostuneesta GDP-L-fukoosista muodostetaan edelleen fukosyloituja »tl glykaaneja.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, %·: että fukosyloidut glykaanit valmistetaan GDP-L-fukoosista rekombinanttifu- kosyylitransferaasin avulla.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, :...: että fukosyylitransferaasi on a-1,3-fukosyylitransferaasi.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, : että a-1,3-fukosyylitransferaasi on rotan tai bakteerin a-1,3-fukosyylitransfe- raasi. 109811

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että a-1,3-fukosyylitransferaasi on Helicobacter fe//s-bakteerin a-1,3-fukosyylitransferaasi.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii-5 tä, että solut transformoidaan DNA-sekvenssillä, joka koodaa Helicobacter py- /o/7-bakteerin GDP-mannoosi-4,6-dehydrataasia (GMD).

12. Patenttivaatimuksen 1 tai 11 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että solut transformoidaan DNA-sekvenssillä, joka koodaa Helicobacter py/on-bakteerin GDP-4-keto-6-deoksi-D-mannoosi-3,5-epimeraasi/4-reduk- 10 taasia (GFS).

13. Kimeerinen entsyymi, tunnettu siitä, että se on GDP-mannoosi-4,6-dehydrataasin (GMD) ja GDP-4-keto-6-deoksi-D-mannoosi-3,5-epimeraasi/4-reduktaasin (GFS) kimeerinen molekyyli.

14. Vektori, tunnettu siitä, että se sisältää DNA-sekvenssin, 15 joka koodaa GDP-mannoosi-4,6-dehydrataasin (GMD) ja GDP-4-keto-6- deoksi-D-mannoosi-3,5-epimeraasi/4-reduktaasin (GFS) kimeeristä molekyyliä.

15. Hiiva- tai homesolu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 14 mukaisen vektorin. 4 « · «M» • ♦ · 4 ♦ 4 · • ♦ · » · 4 · 114 « 4 > 4 4 4 4 4 * 4 4 4 4 4 4 4 * • 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 I 33 109811