FI109604B - Diagnostinen reagenssi, joka käsittää CMV:a neutraloivan vasta-aineen kanssa reaktiokykyisen polypeptidin, sekä immunologinen määritysmenetelmä - Google Patents
Diagnostinen reagenssi, joka käsittää CMV:a neutraloivan vasta-aineen kanssa reaktiokykyisen polypeptidin, sekä immunologinen määritysmenetelmä Download PDFInfo
- Publication number
- FI109604B FI109604B FI903724A FI903724A FI109604B FI 109604 B FI109604 B FI 109604B FI 903724 A FI903724 A FI 903724A FI 903724 A FI903724 A FI 903724A FI 109604 B FI109604 B FI 109604B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- cmv
- polypeptide
- diagnostic reagent
- att
- omfattar
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 77
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 72
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 69
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 51
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 101710170453 Glycoprotein 55 Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 50
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 44
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 34
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 26
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 21
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 7
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000003241 endoproteolytic effect Effects 0.000 claims description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims description 5
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 241000220313 Geum Species 0.000 claims 1
- 235000014823 Geum X aurantiacum Nutrition 0.000 claims 1
- 235000014842 Geum X macranthum Nutrition 0.000 claims 1
- 235000014843 Geum X pulchrum Nutrition 0.000 claims 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 1
- 108010029389 Simplexvirus glycoprotein B Proteins 0.000 claims 1
- 230000001773 anti-convulsant effect Effects 0.000 claims 1
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 claims 1
- 229960003965 antiepileptics Drugs 0.000 claims 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 claims 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 abstract description 21
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 abstract description 21
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 abstract description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 abstract 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 64
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 41
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 24
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 101150029683 gB gene Proteins 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 description 4
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 3
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 3
- 101710085664 Gene 55 protein Proteins 0.000 description 3
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- HIYAVKIYRIFSCZ-UHFFFAOYSA-N calcium ionophore A23187 Natural products N=1C2=C(C(O)=O)C(NC)=CC=C2OC=1CC(C(CC1)C)OC1(C(CC1C)C)OC1C(C)C(=O)C1=CC=CN1 HIYAVKIYRIFSCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- QMXCRMQIVATQMR-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-pyridin-2-ylsulfanylpropanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSC1=CC=CC=N1 QMXCRMQIVATQMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PQMRRAQXKWFYQN-UHFFFAOYSA-N 1-phenyl-2-sulfanylideneimidazolidin-4-one Chemical group S=C1NC(=O)CN1C1=CC=CC=C1 PQMRRAQXKWFYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- HIYAVKIYRIFSCZ-CVXKHCKVSA-N Calcimycin Chemical compound CC([C@H]1OC2([C@@H](C[C@H]1C)C)O[C@H]([C@H](CC2)C)CC=1OC2=CC=C(C(=C2N=1)C(O)=O)NC)C(=O)C1=CC=CN1 HIYAVKIYRIFSCZ-CVXKHCKVSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 succinimidyl Chemical group 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- LQILVUYCDHSGEU-UHFFFAOYSA-N 4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexane-1-carboxylic acid Chemical compound C1CC(C(=O)O)CCC1CN1C(=O)C=CC1=O LQILVUYCDHSGEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 101100163849 Arabidopsis thaliana ARS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 101100022187 Caenorhabditis elegans mab-10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100065885 Caenorhabditis elegans sec-15 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001631457 Cannula Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102100037633 Centrin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 206010010430 Congenital cytomegalovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde Chemical compound OC[C@@H](O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710088235 Envelope glycoprotein C homolog Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000027355 Ferocactus setispinus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 102400001302 Gasdermin-B, N-terminal Human genes 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 101000880522 Homo sapiens Centrin-3 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710189818 Non-structural protein 2a Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 101710151911 Phosphoprotein p30 Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710120319 Photosystem I reaction center subunit IV Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101100097319 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ala1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- QFBNNYNWKYKVJO-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N QFBNNYNWKYKVJO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N ammonium thiocyanate Chemical compound [NH4+].[S-]C#N SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N bromoacetic acid Chemical compound OC(=O)CBr KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000000442 hair follicle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 description 1
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 description 1
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 201000003723 learning disability Diseases 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N methyl alpha-D-mannoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002853 ongoing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010322 reactivation of latent virus Effects 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229940102127 rubidium chloride Drugs 0.000 description 1
- 101150116497 sacm1l gene Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
- C07K16/089—Cytomegalovirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
- C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
109604
Diagnostinen reagenssi, joka käsittää CMV:a neutraloivan vasta-aineen kanssa reaktiokykyisen polypeptidin, sekä immunologinen määritysmenetelmä 5 Keksintö liittyy ihmisen yhdistelmäsytomegalovirusproteiinei-hin (CMV) ja gB-proteiinien neutraloivien muotojen, niiden typistettyjen muotojen ja niiden diagnostisten DNA-fragment-tien tuottamiseen.
10 Ihmisen sytomegalovirus (CMV) on kaikkialla läsnä oleva aine ihmispopulaatioissa. Infektiot ovat yleensä oireettomia, mutta immunologisesti vaarannetuissa yksilöissä (siirrännäisten vastaanottajat ja AIDS-potilaat) ja synnynnäisesti tartunnan saaneissa vastasyntyneissä voi olla vakavia lääketieteellisiä 15 taudin oireita. Immuunipuutosihmisissä liittyy primääriseen CMV-infektioon ja latentin viruksen uudelleenaktivoitumiseen vakava sairaus, joka sisältää verkkokalvon tulehduksen ja keuhkokuumeen. CMV-infektio myös herkistää potilaan sieni- ja bakteeri-infektioille. Sikiön synnynnäinen CMV-infektio ta-20 pahtuu noin 1 %:ssa (36000) USA:ssa vuosittain syntyvässä ··..* lapsessa. Näistä lapsista 10-20 %:lle tulee oireellinen in- * · • *: fektio syntyessä tai kahden vuoden kuluessa syntymästä kuol- • · leisuusasteen ollessa 10-15 %. Henkiin jääneiden joukossa mo- ♦ · * • ·’ nilla on lievistä vakaviin neurologisiin lisätauteihin, si- 25 sältäen kuulon menetyksen, oppimisvaikeudet ja henkisen jäl- * ' keenjäämisen.
Kuten muutkin herpesvirukset, CMV määrittää monia glykopro-: 30 teiineja (Stinski, M. (1976), J. Virol. 19:594-609; Pereira, L., et ai., (1982) Infect. Immun. 36: 933-942). Näiden karakul j terisointiin on liittynyt tutkimuksia CMV infektoiduista so- luista ja puhdistetuista virioneista käyttäen polyklonaalisia ja monoklonaalisia vasta-aineita (Pereira, L., et ai., (1984) 2 109604
Virology 139: 73-86; Britt,W.J. (1984) Virology 135: 369-378; Novak, B. et al., (1984)Virology 132: 325-338; Law, R.M., et al., (1985) J. Med. Virol. 17: 255-266; Rasmussen, L. et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 876-880; ja Britt and 5 Auger (1986) J.Virol. 58: 185-191).
US-patentti 4,689,225, joka on myönnetty 25.08.1987 ja perustuu työhön, jota on kuvannut Pereira et al., viite yllä, kuvaa menetelmää ja rokotetta CMV-infektioita vastaan käyttäen 10 polypeptidiä, jota on merkitty siinä sytomegaloviruksen gly-koproteiini A:na (gAi-A7). Kaksi glykoproteiinia, jotka on merkitty pl30 (gpl30) ja p55 (gp55) (perustuen molekyylipai-noihin annettuna kilodaltoneissa) on osittain puhdistettu ja niiden on osoitettu herättävän neutraloivan vasteen marsuissa 15 (Rasmussen, L., et al., (1985) J. Virology 55: 274-280). Gly- koproteiini gpl30 näyttää olevan gp55 glykoproteiinin esiaste .
CMV-kannan AD169 (joka näyttää olevan samanlainen kuin CMV:n 20 pl30-proteiini, jota on kuvannut Rasmussen et al., yllä) gB-geeni on identifioitu nukleotidisekventoinnilla (Cranage, M.P., et al., (1986) EMBO J. 5 (11):3057-3063) 906 aminohapon • ’·· proteiinin ollessa johdettu siitä. gB-geenin tuote ilmennet- ; *.·* tiin yhdistelmärokoteviruksessa ja kaniinit, jotka immunisoi- ’...· 25 tiin tällä geenituotteella, tuottivat vasta-aineita, jotka * immunosaostavat gB:n CMV-infektoiduista soluista ja neutra loivat CMV:n infektiokykyä in vitro (ks. myös WO 87/05326).
• · ·
Vaikka onkin paljon jatkuvaa aktiivisuutta pääasiallisten : 30 glykoproteiinien identifioimista kohtaan, jotka ovat virus-neutraloinnin kohteita ja alayksikkö-CMV-rokotteen kehittä-• mistä kohtaan nykyään, ei gp55-CMV-glykoproteiinin alkuperää ·;·· ole selvitetty, eikä gp55:tä ole identifioitu nukleotidi- tai aminohapposekvenssien suhteen. Olisikin selvästi, sen valos- · 109604 3 sa, että CMV:n biologian täydellinen tunteminen puuttuu, toivottavaa aikaansaada diagnostisia reagensseja, jotka kykenevät havaitsemaan sen erityisen immunogeenisen ärsykkeen, mikä seuraa CMV-infektioista.
5 Tämä keksintö aikaansaa yhdistelmäpolypeptidejä, jotka ovat peräisin 55000 daltonin proteiinista, joka on peräisin gB:stä ja sen typistettyjä fragmentteja, jotka sisältävät epitoopin, joka voidaan immunologisesti identifioida CMV genomin koodit-10 tamalla epitoopilla. Yhdistelmäpolypeptidi, joka on peräisin gp55-CMV-glykoproteiinin gBrstä, on aikaansaatu tässä kuvatulla tavalla.
Gp55-proteiinin, joka on peräisin gB:stä, täydellinen karak-15 terisointi sallii sellaisten polypeptidien tuottamisen, jotka ovat hyödyllisiä standardeina tai reagensseina diagnostisissa testeissä. Koska haluttu polypeptidi voidaan tehdä synteettisesti suhteellisen puhtaassa muodossa tai yhdistelmä-DNA-teknologialla, vältetään muiden immunogeenivalmistuksen mene-20 telmien ongelmat, mukaanlukien kilpailevien antigeenien ja ...: epäpuhtauksien rinnakkaistuotanto.
I ·
Keksinnön parhaana pidetyssä suoritusmuodossa typistetty ♦ · · • ’ gp55:n gB-fragmentti sisältää epitoopin, joka on immunolo-;;·* 25 gisesti reaktiokykyinen CMV:n neutraloivan vasta-aineen kans-’ ’ sa. Neutraloiva vasta-aine voidaan luoda tekniikoilla, jotka , , ovat alalla tunnettuja, kuten sillä, jota on kuvattu monoklo-naalisia vasta-aineita varten, joka on esitetty Rasmussen et * » ai, yllämainitussa viitteessä ja US-patentissa 4,689,225.
: 30
• » I
*·.. Keksinnön toisessa parhaana pidetyssä suoritusmuodossa on il : myös aikaansaatu yhdistelmäpolypeptidi, joka on koodattu CMV-glykoproteiinin gB:ssä, jossa on muunnettu endoproteo-lyyttinen lohkeamispaikka niin, että gB-proteiinin lohkaisu 4 109604 4 estetään tehokkaasti. Lohkeamispaikan muuntaminen suoritetaan käyttäen paikkaspesifistä mutagenointia DNA:han, joka koodit-taa polypeptidiä proteolyyttisen lohkeamisen paikassa tai lähellä sitä. Tähän keksinnön puoleen liittyvät polynukleoti-5 dit, jotka koodittavat yhdistelmäpolypeptidejä.
Keksinnön toinen näkökulma on yhdistelmä-gp55-polynukleotidi, joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka on peräisin CMV:n gB-geenistä. Keksinnön tähän puoleen liittyy typistetyt yh-10 distelmäpolynukleotidit, jotka sisältävät alueita, joissa on gp55fn nukleotidit 1381-2040 ja gp55:n nukleotidit 1381-1938, jotka alueet sisältävät epitoopin, joka on immunologisesti reaktiokykyinen CMV:a neutraloivan vastaaineen kanssa.
15 Vielä eräs keksinnön seikka aikaansaa ekspressiojärjestelmän, joka käsittää isäntäsoluja, jotka on transformoitu vektorilla, joka sisältää keksinnön yhdistelmäpolynukleotidit.
Keksinnön muu seikka aikaansaa DNA:n hybridisaatioanalyysin 20 CMV-homologisten sekvenssien havaitsemiseksi biologisessa näytteessä, käsittäen sen että a) inkuboidaan biologista näy-tettä DNA-koettimen kanssa, joka koetin voi olla mahdol- • · ' " lisesti leimattu entsyymillä, radioaktiivisella leimalla tai * t « : ·* fluoresoivalla leimalla, olosuhteissa, jotka edistävät ’···’ 25 DNA-dupleksien muodostumista, jossa mainittu DNA-koetin on ’·’ ' peräisin gp55-nukleotidisekvensseistä; ja b) mitataan muodostuneet DNA-dupleksit, jotka sisältävät DNA-koettimen.
Keksinnön lisäseikka aikaansaa immunologisen analyysin vas-: 30 ta-aineiden, jotka ovat suunnatut CMV-antigeeniä vastaan, ha-’...· vaitsemiseksi biologisessa näytteessä, käsittäen sen, että: : a) inkuboidaan biologista näytettä koetinpolypeptidin kanssa :··· olosuhteissa, jotka sallivat vasta-aine-antigeenikompleksin muodostumisen, jolloin mainittu koetinpolypeptidi muodostuu 5 109604 gp55-CMV-yhdistelmäproteiinista tai sen typistetystä fragmentista ja mainittu proteiini tai typistetty fragmentti sisältää epitoopin, joka on immunologisesti reaktiokykyinen CMV:ta neutraloivan vasta-aineen kanssa; ja b) todetaan vasta-aine-5 antigeenikompleksi, joka sisältää koetinantigeenin.
Tämän keksinnön muut ja lisäseikat ovat ilmeisiä seuraavasta selityksestä ja patenttivaatimuksista ja keksinnön muita suoritusmuotoja, jotka käyttävät samoja tai ekvivalentteja peri-10 aatteita, voivat alan ammattilaiset käyttää poikkeamatta tästä keksinnöstä ja oheisten patenttivaatimusten suojapiiristä.
Kuvio 1 on CMV:n (Towne) genomin Hindlll-restriktiokartta, joka on esitetty parentaalisuunnassa. Ainutkertaiset sek-15 venssit on merkitty ohuella viivalla ja pitkien (L) ja lyhyiden (S) komponenttien invertoidut toistot on merkitty laatikoilla, ab-b'a', ja a'c'-ca. Sekvenssi a, joka on erotettu valkeana laatikkona, on pään suora toisto invertoidun käännetyn kopion (a') kanssa L/S-liitoksessa.
20
Alempi restriktiokartta kuvaa -4,96 kb BamHI E/R -> Hindlll ’.*·: D/A-fragmenttia, joka koodittaa gB-geeniä. Towne-DNA- • ’*· fragmentti, joka on kloonattu pXgBi:een, esitetään viivan : .· yläpuolella ja-suurelta osin rinnakkaislineaarinen AD169- *··.* 25 fragmentti on esitetty viivan alla. Restriktioentsyymien ly- '·' ' henteet ovat B, BamHI; Bg, Bglll; C Clal, E, EcoRI; Eg, EagI; H, Hindin; He, Hindi; K, Kpnl; p, PstI; S, SacII; Sa, Sali; X, XhoI.
;,j · 30 Kuvio 2 kuvaa CMV-kantojen Towne ja AD169 nukleotidi- ja johdettuja aminohapposekvenssejä gB-kuoriproteiinille.
* Gp55:n lohkeamispaikkaa aminohappojen 460 ja 461 välissä on i 6 109604 merkitty nuolella. Gp55:n N-terminaalin sekvenssianalyysi, joka paljasti tämän lohkeamispaikan, on esitetty taulukossa 2.
5 Kuvio 4 on kuvaus keksinnön imettäväissolu-ekspressiovekto-reista. Plasmidit pXgB7 (4,5 kb) ja pXgB8 (6,5 kb) koodit-tavat sen gB:n typistettyä versiota, joka on kloonattu osittaisena SacIl/XhoI-fragmenttina pSV7d:hen, SV40:stä saatuun ekspressiovektoriin tai vastaavasti pON260:een, CMV:sta saa-10 tuun ekspressiovektoriin. Plasmidit pXgB12 (6,4 kb) ja pXgB13 (5,5 kb) koodittavat sen gB-geenin täyttä pituutta, joka on kloonattu EagI-fragmenttina plasmidiin pMIE, CMV:sta saatuun ekspressiovektoriin ja vastaavasti pSV7d:hen. Kopioinnin aloitus- ja lopetuselementit ovat erilaisia kussakin raken-15 teessä.
Kuvio 4 on kaaviomainen esitys topografisesta epitooppikar tästä CMV:n gB:llä. Epäjatkuvat neutralointialueet (alue 1 = aminohapot 461-619; alue 2a ja 2b = aminohapot 620-680) 20 on merkitty soikioilla.
109604
Saadun sekvenssin vastaavuus tai vastaamattomuus toisen -sekvenssin kanssa voidaan määrittää hybridisaatiolla sopivan tiukoissa olosuhteissa käyttäen standardeja DNA:n hybridisaa-tioteknologioita nestefaasissa tai- kiinteillä kantajilla.
5 Hybridisaatiotekniikat nukleiinihapposekvenssien komplemen-taarisuuden määrittämiseksi ovat alalla tunnettuja (ks. esim. Maniatis et ai., (1982)) ja kuten keskustellaan alla. Lisäksi voidaan dupleksipolynukleotidien, jotka ovat muodostuneet hybridisaatiossa, eroavuudet määrittää tunnetuilla teknii-10 koilla, sisältäen pätkimisen nukleaasilla, kuten Siiliä, joka pätkii spesifisesti yksisäikeisiä alueita dupleksipolynukle-otideissa. Alueet, joilta tyypilliset DNA-sekvenssit voivat olla peräisin, sisältävät, mutteivät ole niihin rajoitettuja, alueet, jotka koodittavat erityisiä epitooppeja.
15
Jostakin saatu polynukleotidi ei välttämättä ole fyysisesti saatu esitetystä nukleotidisekvenssistä, vaan se voidaan kehittää millä tahansa tavalla, sisältäen esimerkiksi kemiallisen synteesin tai DNA:n replikaation tai käänteistranskripti-20 on, jotka menetelmät perustuvat siihen tietoon, jonka antaa ...: emästen sekvenssi alueilla, joista polynukleotidi on saatu.
I I
Samoin polynukleotidi, joka "on peräisin" merkitystä sekvens-·' sistä, esimerkiksi typistetty CMV:n gB-glykoproteiini, viit- 25 taa polypeptidiin, jonka aminohapposekvenssi on identtinen I · ·’‘ sen polypeptidin kanssa, joka on kooditettu sekvenssiin tai sen proteiiniin, jossa osa käsittää ainakin 5-10 aminohappoa
» * I
ja mieluummin ainakin 10-15 aminohappoa tai joka on immunolo-gisesti identifioitavissa polypeptidillä, joka on sekvenssiin <: : 30 kooditettu.
: : Termi "yhdistelmäpolynukleotidi" tässä käytettynä kuvaamaan polynukleotidia, joka on hyödyllinen CMV:n diagnostiikan tuottamiseen, merkitsee polynukleotidia, jonka alkuperä on 8 109604 ί genomi, cDNA, puolisynteettinen tai synteettinen, joka alkuperänsä tai käsittelyn nojalla: (1) ei liity kaikkeen tai osaan polynukleotidistä, johon se on liittynyt luonnossa tai kirjaston muodossa; ja/tai (2) on liitetty polynukleotidiin, 5 joka on muu kuin se, johon se on liittynyt luonnossa.
"Yhdistelmäisäntäsolut", "isäntäsolut", "solut", "solulin-jat", "soluviljelmät" ja muita sellaisia termejä, jotka merkitsevät prokaryootti-mikro-organismeja tai eukaryoottisolu-10 linjoja, joita viljellään yksisoluisina kokonaisuuksina, käytetään keskenään vaihdellen ja ne viittaavat soluihin, joita voidaan käyttää tai on käytetty vastaanottajina yhdistelmä-vektorille tai muulle siirto-DNA:lie ja sisältävät alkuperäisen solun, joka on transfektoitu, perimän. Ymmärretään, että 15 yhden emosolun perimä ei ole välttämättä täysin identtinen morfologiassa tai genomin tai kokonais-DNA-komplementissa alkuperäisen emosolun kanssa johtuen vahingossa tai harkiten tapahtuneesta mutaatiosta. Emosolun perimä, joka on riittävän samanlainen emonsa kanssa tullakseen kuvatuksi asiaankuulu-20 valla ominaisuudella, kuten haluttua peptidiä koodittaavan ··..' nukleotidisekvenssin läsnäololla, sisältyvät perimään, jota '· tarkoitetaan tällä määritelmällä ja ne ovat ylläolevien ter mien alla.
25 "Replikoni" on mikä tahansa geneettinen elementti, esim.
* * · ·’ * plasmidi, kromosomi, virus, joka käyttäytyy polynukleotidin replikaation itsenäisenä yksikkönä solun sisällä; s.o. se ky- * * * kenee kopioitumaan oman ohjauksensa alaisena.
: 30 "Vektori" on replikoni, johon on kiinnitetty toinen polynuk- ·.' leotidisegmentti aiheuttaakseen kiinnittyneen segmentin kopi- ; : oitumisen ja/tai ilmentymän.
• 9 109604 "Ohjaussekvenssi" viittaa polynukleotidisekvensseihin, jotka ovat tarpeen koodaussekvenssien, joihin ne ovat kiinnitettyjä, ekspression aikaansaamiseksi. Sellaisten ohjaussekvenssi-en luonne on erilainen riippuen isäntäorganismista; proka-5 ryooteissa sellaiset ohjaussekvenssit yleensä sisältävät promoottorin, ribosomin sitoutumispaikan ja terminaattoreita; eukaryooteissa sellaiset ohjaussekvenssit sisältävät yleensä promoottoreita, terminaattoreita ja joissakin tapauksissa vahvistajia. Termin "ohjaussekvenssi" on tarkoitus sisältää 10 vähintään kaikki komponentit, joiden läsnäolo on tarpeen ilmentymää varten ja ne voivat sisältää myös lisäkomponentteja, joiden läsnäolo on edullista, esimerkiksi johtosekvenssejä.
"Toimivasti liitetty" viittaa sellaiseen rinnakkainasette-15 luun, jossa niin kuvatut komponentit ovat sellaisessa suhteessa, että ne voivat toimia aiotulla tavallaan. Ohjaus-sekvenssi, joka on "toimivasti liitetty" koodaussekvenssiin, on sidottu sellaisella tavalla, että koodaussekvenssin ilmentymä aikaansaadaan olosuhteissa, jotka sopivat ohjaussekvens-20 sille.
• · · • · [· "Immunologisesti identifioitavissa oleva jonkin kanssa tai jonakin" viittaa epitooppien läsnäoloon ei-luonnon, s.o. kei-
» · I
\ notekoisesti syntetisoidussa tai yhdistelmäproteiinissa, jot- ;;; 25 ka ovat läsnä myös merkityssä CMV-polypeptidissä/peptideissä ' ja ovat niille ainutkertaisia. Immunologinen identtisyys voi- , , daan määrittää vasta-aineen sitoutumisen ja/tai sitoutumises- !..* sa kilpailun kautta; nämä tekniikat ovat tunnettuja alan kes- kimääräiselle ammattilaiselle ja niitä kuvataan myös alla.
* » <'· · 30 Epitoopin ainutkertaisuus voidaan määrittää myös tietokone- ’;·* haulla tunnetuista tietopankeista, esimerkiksi Genbank1 ista, ; j polynukleotidisekvensseille, jotka koodittavat epitooppia ja aminohappovertailuilla muiden tunnettujen proteiinien kanssa.
i 1 109604 10 Tässä käytettynä "epitooppi" viittaa polypeptidin anti-geenideterminanttiin; epitooppi voisi käsittää 3 aminohappoa avaruuskonformaatiossa, joka on ainutkertainen epitoopille, yleensä epitooppi muodostuu ainakin viidestä sellaisesta ami-5 nohaposta ja tavallisemmin se muodostuu ainakin 8-10 sellaisesta aminohaposta.
Polypeptidi on "immunologisesti reaktiokykyinen" vasta-aineen kanssa, kun se sitoutuu vasta-aineeseen erityisen polypepti-10 din sisältämän epitoopin vasta-aineen tunnistuksen takia. Immunologinen reaktiokyky voidaan määrittää vastaaineen sitoutumisena ja/tai kilpailuna sitoutumisessa käyttäen kilpaili-jana/oina tunnettuja polypeptidejä, jotka sisältävät epitoopin, jota vastaan vasta-aine on suunnattu. Tekniikat sen mää-15 rittämiseksi, onko polypeptidi immunologisesti reaktiokykyi nen vasta-aineen kanssa, ovat alalla tunnettuja.
Termi "polypeptidi" viittaa genomiin kooditetun sekvenssin aminohappotuotetta, eikä viittaa tuotteen erityiseen pituu-20 teen, täten peptidit, oligopeptidit ja proteiinit ovat sisäl-···.' lytettyjä polypeptidin määritelmään. Tämä termi ei myöskään '· ’· viittaa polypeptidin ilmentymän jälkeisiin muunnoksiin, esimerkiksi glykosylaatioihin, asetylaatioihin, fosforylaatioi-•ti;‘ hin ja sen kaltaisiin.
25 * » t * "Transformaatio" tässä käytettynä viittaa eksogeenisen poly- , t nukleotidin viemiseen isäntäsoluun riippumatta viemiseen käy- tetystä menetelmästä, esimerkiksi suorasta otosta, transduk-tiosta tai f-liitosta. Eksogeenistä polynukleotidia voidaan Mi 30 pitää yhdistämättömänä vektorina, esimerkiksi plasmidi tai M·' vaihtoehtoisesti se voidaan yhdistää isäntägenomiin.
M Haluttua polypeptidiä koodittava DNA, joko fuusioidussa tai täysin kehittyneessä muodossa ja joko sisältäen signaalise- 11 109604 kvenssin erittymisen sallimiseksi tai ei, voidaan kiinnittää ekspressiovektoreihin, jotka ovat sopivia mitä tahansa tarkoituksenmukaista isäntää varten. Nykyään käytetään sekä eu-karyootti- että prokaryootti-isäntäjärjestelmiä yhdistelmäpo-5 lypeptidien muodostamiseen ja yhteenveto joistakin yleisemmistä ohjausjärjestelmistä ja isäntäsolulinjöistä on annettu osassa III.A. alla. Polypeptidi eristetään sitten hajotetuista soluista tai viljelyvällaineesta ja puhdistetaan siihen laajuuteen, joka on tarpeen sen aiottua käyttöä varten. Puh-10 distus voidaan tehdä alalla tunnetuilla tekniikoilla, esimerkiksi suolafraktioimisella, ioninvaihtohartseilla suoritetulla kromatografiällä, affiniteettikromatografiällä, linkoamalla ja sen kaltaisilla. Katso esimerkiksi kirjaa Methods of Enzymology eri menetelmiä varten proteiinien puhdistamiseksi. 15 Sellaisia polypeptidejä voidaan käyttää diagnostisina välineinä tai sellaisia, jotka aiheuttavat vasta-aineiden neutraloimista, voidaan formuloida rokotteiksi. Näitä polypeptidejä vastaan kasvaneita vasta-aineita voidaan käyttää myös diagnostiikassa tai passiivisessa immunoterapiassa.
20 II. Keksinnön kuvaus • · • '·· 55000 daltonin glykoproteiinin, jota glykoproteiinin B geeni
* » I
; koodittaa, on osoitettu aikaansaavan neutraloivia vas- * · * 25 ta-aineita CMV:tä vastaan (Rasmussen, et ai., 1985, yllä).
« I · * Erityisesti tämän keksinnön polypeptidit vastaavat virus- genomin proteiineja, jotka ovat homologisia tietyille osille » · *· *.* CMV:n gB-kuoriproteiinia gpl30 ja siitä saatua gp55:tä.
: 30 Nyt viitataan kuvioon 2, mikä esittää nukleotidi- ja ennus-
I * I
tetut aminohapposekvenssit CMV-kantojen Towne ja AD169 gB- » kuoriproteiinille, tämän keksinnön gp55-yhdistelmäproteiini < * * (..j on 447 aminohapon proteiini alkaen aminopäästään seriinillä tähteessä 461 (Ser46i) ja päättyen valiinitähteeseen 907 ,2 109604 (Valg07). Erityisen kiinnostavat tämän proteiinin typistetyt muodot sisältävät olennaisen aminohapposekvenssihomologian gp55:n alueelle, joka sisältää epitoopit, jotka ovat immuno-logisesti reaktiokykyisiä CMV:a neutraloivien vasta-aineiden 5 kanssa. Yleisesti tämä CMV-kuoriproteiinin alue on tähteen 461 ja tähteen 680 välisellä alueella. Erityisemmin epäjatkuvia neutraloivia alueita on paikallistettu: alue 1 käsittää aminohapot 461-619-ja alueet 2a ja 2b käsittävät aminohapot 620-680.
10 GB:n sen alueen määrittämiseksi, joka sisältää nämä neutraloivat epitoopit, määritettiin ensin Towne-gB-geenin nukleo-tidisekvenssi. Towne-kanta valittiin sen rokotteena todetun turvallisuuden takia. Johdettiin analogisen CMV:n (Towne) 15 Hindlll D-fragmentin restriktiokartta. 4,96 kb Hindlll -> BamHI-fragmentti Hindlll D:n oikeasta päästä, joka todennäköisesti kooditti gB:a (ks.kuvio 1), alikloonattiin. Kuviossa 1 Towne-kannan restriktiokarttaa verrataan AD169-kannan samaan alueeseen. GB-alueen nukleotidisekvenssi määritettiin 20 5 1-pään kaikkein kauimmasta Pstl-paikasta Hindi :n paikkaan ...'Γ 3 1-päähän gB:a koodittavaan sekvenssiin (kuvio 1). Kuviossa 2 ·*.*.: esitetään gB- (Towne) -sekvenssi päällimmäisellä viivalla ja • *·· vertailua varten esitetään pohjaviivalla CMV:n (AD169) ; ,· gB-alueen DNA-sekvenssi .
25 v · Towne gB-geeniä koodittaa 2721 emäsparin avoin luentakehys.
Kaksi muuta pitkää avointa kehystä (ORF = open reading frame) on myös läsnä Towne-sekvenssissa, joka on esitetty kuviossa *« · ♦ · 2. Toinen ORF, joka on gB-geenin suhteen kehyksen ulkopuolel-I : 30 la, ulottuu Hindlll D/A-paikasta (ei esitetty) gB-geenin _ 5 1-lukemattoman alueen läpi ja päättyy nukleotidissa +36.
Kolmas ORF, joka on myös gB-geenin suhteen kehyksen ulkopuoli lella, alkaa nukleotidista +2864 ja ulottuu kuviossa 2 esite tyn sekvenssin pään läpi.
109604 GB-proteiinin, joka ennustetaan 2721 emäsparin ORFrstä, koko on 907 aminohappoa pitkä ja sillä on ominaisuuksia, jotka ovat ominaisia membraaniproteiinille. Mahdollinen 24 aminoha-5 pon signaalisekvenssi on esitetty kuviossa 2 (Meti, -> Ser24) · Signaalialue sisältää hydrofobisen ytimen (lies -> Val23, poikkeuksella Asni3) , mitä edeltää varauksellinen tähde (Arg4) .
10 GB-geenin täysi pituus ja typistetty versio kloonattiin plas-mideihin, jotka olivat sopivia ilmentymistä varten imettä-väissoluissa. Näiden plasmidien rakenne on kuvattu yksityiskohtaisesti seuraavissa esimerkeissä. GB-geenin typistetyt muodot rakennettiin poistamalla aminohapot 681-15 907 ja 647-907 C-terminaalista, poistaen transmembraani- ja C-terminaalin alueet.
Täyden pituuden ja typistetyn rakenteen koodittämän gBgeenin ekspressio analysoitiin lyhytaikaisella ekspressiolla 20 COS-7-soluissa käyttäen virusta neutraloivaa hiiren monoklo-····' naalista vasta-ainetta 15D8 (jonka on kuvannut Rasmussen et ai., 1985, yllä) koettimena ekspressiota varten. Tämä vasta-aine on tähdätty 55 kd:n virioniglykoproteiinia (gp55) ja siihen liittyvää 130 kd:n (gpl30) solunsisäistä esiastetta ' · 25 vastaan. Vasta-aine 15D8 voi neutraloida lukuisia kliinisiä ’ » · ’ ja laboratoriokantoja komplementin läsnäollessa samalla vah- . . vistaen tämän gB-epitoopin tärkeänä kohteena virusta neutra- 1 « * · loivalle vastaaineelle.
: ‘ 30 GB-proteiinin typistettyjen muotojen ekspressio analysoitiin *;*' myös käyttäen US-patentissa 4,689,225 kuvattuja monoklonaa- * · listen vasta-aineiden levyjä. Näistä vasta-aineista kymmenen, joilla oli komplementista riippuvaa tai riippumatonta neutra-lointiaktiivisuutta, reagoi typistetyn gB-johdannaisen kanssa 14 109604 (gBt), joka sisälsi 619 aminoterminaalin tähdettä, mutta jossa ei ollut transmembraani- ja solunsisäistä molekyylin aluetta. Kaksitoista vasta-ainetta reagoi CHO-solulinjan kanssa ilmentäen gB-johdannaista (CHO-solulinja 67), josta 680 ami-5 no-C-terminaalia oli poistettu.
Lisäksi tässä aikaansaadaan gB-polypeptidi, jossa on muta-genoitu endoproteolyyttinen lohkeamispaikka. Tulokset, jotka saatiin käyttäen kalsiumspesifistä ionoforia A23187 estämään 10 gB-molekyylin lohkeaminen, joka on ilmennetty stabiilissa CHO-solulinjassa (67.77), merkitsee 110 kilodaltonin lohkea-mattoman gB-proteiinin ilmentymisen toteutettavuutta, s.o. jossa ei ole transmembraani- ja oletettuja sytoplasmisia alueita. Kyky ilmentää gB-molekyyliä ilman -sitä seuraavaa kä-15 sittelyä sallii halutun proteiinin tuotannon vapaana muista epäpuhtautena olevista tai sellaisista gB-tuotteista, joita ei haluta.
Mutagenoivia oligonukleotideja, jotka ovat suunniteltuja 20 muuttamaan aminohapposekvenssiä proteolyyttisessä loh- ··<·' keamispaikassa tai sen lähellä säilyttävällä tavalla, käyte- • · · • '·' tään korvaamaan esimerkiksi treoniini- tai glutamiinitähteet arginiinilla tai lysiinillä asemissa -1, -2 ja -4 aminohapon » * · ' ·' Arg460 jälkeisen lohkeamispaikan suhteen.
'· 25 l * · I · « ‘ * Nämä endoproteolyyttiset lohkeamispaikkamutantit testataan . . ilmennettäessä imettäväissoluekspressiovektoreissa vastus- * * tuskykyisyyden suhteen proteolyysiä ja radioleimattuja solu- « » ‘1’ lysaatteja vastaan ja solujen kuntoon saatetut väliaineet, * · ' 30 jotka vastaanottavat nämä rakenteet, radioimmunosaostetaan ! i · ·;·* neutraloivilla monoklonaalisilla vasta-aineilla gB-ilmentymän ,· f analysoimiseksi.
109604 II.B. Antigeenipolypeptidien valmistus ja sitominen kantajaan
Polypeptidin antigeenialue on yleensä suhteellisen pieni -5 tyypillisesti pituudeltaan 8-10 aminohappoa tai vähemmän. Fragmentit, joissa on,niinkin harvoja aminohappoja kuin 5 aminohappoa, voivat kuvata antigeenialueen. DNA:t, jotka koodit tavat CMV:n gB-polypeptidien lyhyitä segmenttejä, voidaan ilmentää yhdistelmänä joko fuusioproteiineina tai eristettyi-10 nä polypeptideinä. Lisäksi lyhyitä aminohapposekvenssejä voidaan saada mukavasti kemiallisella synteesillä. Tapauksissa, joissa syntetisoitu polypeptidi on oikein rakennettu antaakseen oikean epitoopin, mutta on liian pieni ollakseen immuno-geenien, polypeptidi voidaan liittää sopivaan kantajaan.
15
Lukuisat tekniikat sellaisen sidoksen saamiseksi ovat alalla tunnettuja, sisältäen disulfidiliitosten muodostamisen käyttäen N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyylitio)propionaat tia (SPDP) ja sukkinimidyyli-4-(N-maleimidometyyli)syklo-20 heksaani-l-karboksylaattia (SMCC), joita saadaan Pierce Corn- * » · ··*' pany'lta Rockford, IL, USA. (Jos peptidissä ei ole sulfhyd- I · * * * / '* ryyliryhmää, tämä voidaan varustaa lisäämällä kysteiinitäh-de). Nämä reagenssit luovat disulfidiliitoksen itsensä ja ’ * · peptidikysteiinitähteen välille yhdessä proteiinissa ja ami- * · 25 diliitoksen lysiinissä olevan epsilonaminon kautta tai muun I · · ' * · ' vapaan aminoryhmän kautta toisessa proteiinissa. Katso esi- , . merkiksi Immun. Rev. (1982) 62:185. Muut bifunktionaaliset kytkentäaineet muodostavat mieluummin tioeetteri- kuin disul- 1 fidisidoksen. Monet näistä tioeettereitä muodostavista ai- ► · ··’ ·’ 30 neista ovat kaupallisesti saatavia ja sisältävät ;·’ 6-maleimidokaproliinihapon, 2-bromietikkahapon, ,j j 2-jodietikkahapon, 4-(N-maleimidometyyli)sykloheksaani-1- » karboksyylihapon ja sen kaltaisten esterit. Karboksyyliryhmät voidaan aktivoida yhdistämällä ne sukkinimidin tai 1- 109604 hydroksyyli-2-nitro-4-sulfonihapon natriumsuolan kanssa. Edelläolevan luettelon ei ole tarkoitettu olevan tyhjentävä ja nimettyjen yhdisteiden muunnoksia voidaan ilmiselvästi käyttää.
5
Voidaan käyttää mitä tahansa kantajaa, joka ei itse aiheuta isännälle haitallisten vasta-aineiden tuotantoa. Sopivat kantajat on tyypillisesti suuria, hitaasti metaboloituvia makromolekyylejä, kuten proteiineja; polysakkarideja, kuten latek-10 silla funktionalisoitua sefaroosia,-agaroosia, selluloosaa, selluloosatankoja ja sen kaltaisia; polymeerisiä aminohappoja, kuten polyglutamiinihappo, polylysiini ja sen kaltaiset; aminohappokopolymeerejä; ja inaktiivisia viruspartikkeleita. Erityisen käyttökelpoisia proteiinisubstraatteja ovat seerumi 15 albumiini, avaimenreikäiilimadon hemosyaniini, immunoglobu-liinimolekyylit, tyroglobuliini, munan albumiini, jäykkä-kouristustoksoidi ja muut proteiinit, jotka ovat hyvin tunnettuja alan ammattilaiselle.
20 II.C. CMV-epitooppeja sisältävien hybridipartikkeli- ·· immunogeenien valmistaminen CMV:n epitooppien immunogeenisyyttä voidaan myös vahvistaa valmistamalla ne imettäväis- tai hiivajärjestelmissä, jotka : : 25 on fuusioitu partikkeleita muodostavien proteiinien, kuten : : : sen kanssa, joka liittyy hepatitis-B:n pinta-antigeeniin. Ra kenteet, joissa CMV-epitooppi on liitetty suoraan partik- • · keleita muodostavaa proteiinia koodittaviin sekvensseihin, tuottaa hybridejä, jotka ovat immunogeenisiä CMV-epitoopin • 30 suhteen. Lisäksi kaikki valmistetut vektorit sisältävät epi- ( » ä · tooppeja, jotka ovat spesifisiä HBV:lle, niillä on eri astei-. siä immunogeenisyyksiä, kuten esimerkiksi pre-S-peptidi. Tä- ten partikkelit, jotka on rakennettu partikkeleita muodosta- i 17 109604 vasta proteiinista jotka sisältävät CMV-sekvenssejä, ovat im-munogeenisiä CMV:n ja HBV:n suhteen.
Hepatitiksen pinta-antigeenien (HBSAg) on osoitettu muodos-5 tuvan ja kokoontuvan partikkeleiksi S. cerevisiae1ssa (Valenzuela, et ai., (1982 Nature 298: 344) ja myös esimerkiksi imettäväissoluissa (Valenzuela, P., et ai., (1984) julkaisussa Hepatit's B (Millman, I., toim., Plenum Press) ss.
225-236). Sellaisten partikkeleiden muodostumisen on osoitet-10 tu vahvistavan monomeerisen alayksikön immunogeenisyyttä. Rakenteet voivat sisältää myös HBSAg:n immunodominantin epitoo-pin, joka käsittää esipinta-alueen (pre-S) 55 aminohappoa. Neurath, et ai. (1984). Pre-SHBSAg-partikkelirakenteet, jotka voidaan ilmentää hiivassa, on esitetty EP-patenttijulkaisussa 15 174,444; hybridit sisältäen heterologiset virussekvenssit hiivassa ilmentämistä varten on esitetty EP-patenttijulkaisussa 175,261. Molemmat hakemukset ovat tämän hakemuksen tekijän nimissä ja ne liitetään tähän viitteeksi. Näitä rakenteita voidaan ilmentää myös imettäväissoluissa, kuten marsun 20 munasarjasoluissa (CHO) käyttäen SV40-dihydrofolaatti- reduktaasivektoria (Michelle, et ai. (1984) Int. Symposium on .·. : Viral Hepatitis) .
« * ii.d.
f I
25 II.E.
F. Vasta-aineiden valmistus CMV-epitooppeja vastaan • · · * ·
Immunogeenisiä polypeptidejä, jotka on valmistettu kuten : 30 yllä, voidaan käyttää vasta-aineiden, sekä polyklonaalisten i · · I « I · että monoklonaalisten, tuottamiseen. Jos halutaan polyklonaa- • · . *. lisiä vasta-aineita, immunoidaan valittu imettäväinen (esim.
hiiri, kani, vuohi, marsu, hevonen jne.) immunogeenisellä po-lypeptidillä, jossa on CMV-epitooppeja. Seerumia immunoidusta t 109604 18 eläimestä kerätään ja sitä käsitellään tunnettujen menetelmä-tapojen mukaan. Jos seerumi, joka sisältää polyklonaalisia vasta-aineita CMV-epitooppia vastaan, sisältää vasta-aineita muita antigeenejä vastaan, voidaan polyklonaaliset vas-5 ta-aineet puhdistaa imraunoaffiniteettikromatografiällä. Tekniikat polyklonaalisen antiseerumin tuottamiseksi ja käsittelemiseksi ovat alalla tunnettuja, ks. esimerkiksi Mayer and Walker, toim. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London.
10 CMV-epitooppeja vastaan suunnattuja monoklonaalisia vasta-aineita voi alan ammattilainen tuottaa helposti. Yleinen me-netelmätieto monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi hybridomien kautta on hyvin tunnettu. Kuolemattomia solulin-15 joja, jotka tuottavat vasta-aineita, voidaan luoda solufuusi-olla ja myös muilla tekniikoilla, kuten suoralla B-lymfosyyttien transformaatiolla onkogeenisellä DNA:11a tai transfektiolla Epstein-Barr-viruksella. Ks. esim. Rasmussen et ai., (1985) yllä; M. Schreier, et ai., (1980) Hybridoma 20 Techniques; Hammerling, et ai., (1981) Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas; Kennett, et ai. (1980) Monoclonal An-: tibodies; ks. myös US-patentit 4.341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,452,570; 4,466,917; 4,4472,500; 4,491,632; ja 4,493,890. CMV-epitooppeja vastaan tuotettujen 25 monoklonaalisten vasta-aineiden levyjä voidaan seuloa eri ominaisuuksien suhteen; s.o. isotyypin, epitoopin affiniteetin jne. suhteen.
19 109604
Anti-idiotyypin vasta-aineet ovat immunoglobuliineja, joissa on infektoivan aineen, jota vastaan suojaa halutaan, antigeenin "sisäinen kuva". Tekniikat anti-idiotyypin vasta-aineiden 5 kasvattamiseksi ovat alalla tunnettuja. Katso esimerkiksi Crzych et ai., (1985) Nature 316:74 ja Macnamara et ai., (1984) Science 226:1325. Yleisesti tässä kuvattuja typistettyjä CMV-yhdistelmäpeptidejä, jotka sisältävät CMV:tä neutraloivia epitooppeja, voitaisiin käyttää kehittämään monoklo-10 naalisia vasta-aineita, joista voitaisiin kehittää anti- idiotyypin vasta-aineita. Nämä anti-idiotyypin vasta-aineet voivat olla hyödyllisiä myös CMV:n hoidossa ja myös CMV-antigeenien immunogeenisten alueiden selventämiseen.
15 II.G. Diaanostiset oligonukleotidikoettimet ja kitit Käyttäen esitettyä CMV:n DNA:ta pohjana voidaan valmistaa oligomeerejä, joissa on suunnilleen 8 nukleotidia tai enem-20 män, joko poisleikkaamalla tai synteettisesti, jotka hybridi-·:* soituvat CMV:n gB-geenin kanssa ja ovat hyödyllisiä ainutker-: täisten virus sekvenssien havaitsemisessa hybridisaatiolla.
• ’·· Vaikka 6-8 nukleotidia saattaakin olla työstettävä pituus, • 10-12 nukleotidin sekvenssejä pidetään parempana ja noin 20 25 nukleotidia näyttää optimaaliselta. Nämä sekvenssit saadaan · mieluummin alueilta, joissa ei ole heterogeenisyyttä. Nämä koettimet voidaan valmistaa käyttäen rutiinimenetelmiä, si-·.*·: sältäen automaattiset oligonukleotidin synteettiset menetel- mät. Koettimena käyttämistä varten on täydellinen komplemen-: 30 taarisuus toivottavaa, vaikka saattaakin olla tarpeetonta, : kun fragmentin pituutta lisätään.
....: Sellaisten koettimien käyttämiseksi diagnostisina välineinä analysoitava biologinen näyte, kuten veri tai seerumi, kä- 20 109604 siitellään haluttaessa sen sisältämien nukleiinihappojen uuttamiseksi. Tuloksena näytteestä saaduille nukleiinihapoille voidaan tehdä elektroforeesi tai muu koon mukaan erottava tekniikka; vaihtoehtoisesti nukleiinihapponäyte 5 voidaan paperikromatografoida ilman koon mukaista erottelua. Koettimet leimataan sitten. Sopivat leimat ja menetelmät ko-ettimien leimaamiseksi ovat alalla tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi radioaktiiviset leimat, jotka liittyvät nick-translaatioon tai kinasointiin, biotiinin, fluoresoivat koet-10 timet ja kemiluminesoivat koettimet. Näytteestä uutettuja nukleiinihappoja käsitellään sitten leimatulla koettimella sopivan ankarissa hybridisaatioolosuhteissa.
Koettimet voidaan tehdä täysin komplementaarisiksi CMV:n 15 gB-geenin kanssa. Siksi ovat tavallisesti hyvin tarkat olosuhteet toivottavia väärien positiivisten estämiseksi. Suuren tarkkuuden olosuhteita tulisi kuitenkin käyttää vain, jos koettimet ovat komplementaarisia virusgeenin alueelle, jossa ei ole heterogeenisyyttä. Hybridisaation tarkkuus määritetään 20 lukuisilla tekijöillä hybridisaation aikana ja pesutapahtuman ··· aikana, sisältäen lämpötilan, ionivahvuuden, ajan pituuden ja formamidin pitoisuuden. Näitä tekijöitä on hahmotellut esi-merkiksi Maniatis, T. (1982) .
f · · » · · ► · t » t · « 25 Yleensä odotetaan, että CMV:n genomisekvenssit ovat läsnä in- * « a v · fektion saaneiden yksilöiden seerumissa suhteellisen alhaisilla tasoilla, s.o. suunnilleen 102-103 sekvenssiä/ml. Tämä » · taso voi vaatia, että käytetään amplifikaatiotekniikoita hyb-ridisaatioanalyyseissä. Sellaiset tekniikat ovat alalla tun-: 30 nettuja. Esimerkiksi Enzo Biochemical Corporation-firman "Bio-Bridge"-järjestelmä käyttää terminaalideoksinukleotidi-; ’·, transferaasia modifioimattornien 3'-poly-dT-häntien lisäämi- seksi DNA-koettimeen. Poly-dT-häntäinen koetin hybridisoidaan » » kohteena olevaan nukleotidisekvenssiin ja sitten biotiinimo- 21 109604 difioituun poly-A:han. PCT-hakemus 84/03520 ja EP-julkaisu 124221 kuvaavat DNA-hybridisaatioanalyysiä, jossa: (1) ana- lyytti liitetään yksisäikeiseen DNA-koettimeen, joka on komplementaarinen entsyymileimatulle oligonukleotidille; ja (2) 5 tulokseksi saatu hännällinen dupleksi hybridisoidaan entsyy-mileimattuun oligonukleotidiin. EP-julkaisu 204510 kuvaa DNA:n hybridisaatioanalyysiä, jossa analyytti-DNA saatetaan kosketuksiin koettimen kanssa, jossa on häntä, kuten po-lydT-häntä, monistussäie, jossa on sekvenssi, joka hybridi-10 soituu koettimen häntään, kuten poly-A-sekvenssi ja joka kykenee sitomaan lukuisia leimattuja säikeitä. Erityisen haluttava tekniikka voi sisältää ensin kohteena olevan seerumin CMV-sekvenssin monistamisen suunnilleen 10000-kertaiseksi, s.o. suunnilleen 106 sekvenssiin/ml. Tämä voidaan tehdä esi-15 merkiksi Saiki et ai., (1986) Nature 324:163 tekniikalla. Monistetut sekvenssit voidaan sitten osoittaa käyttäen hybridisaatioanalyysiä, jota on kuvattu rinnaishakemuksessa US S/N 109,282, joka on jätetty 15.10.1987, joka on siirretty tämän hakemuksen hakijalle ja joka liitetään tähän mukaan viitteek-20 si. Tämä hybridisaatioanalyysi, jonka tulisi osoittaa sek-··· venssit tasolla 106/ml, käyttää nukleiinihappomultimeerejä, jotka sitoutuvat yksisäikeiseen analyytin nukleiinihappoon ja !·.. jotka sitoutuvat myös moniin yksisäikeisiin leimattuihin oli- i · * : gonukleotideihin. Sopiva liuosfaasin sandwich-analyysi, jota • · · 25 voidaan käyttää leimattujen polynukleotidikoettimien kanssa v : ja menetelmiä koettimien valmistamiseksi on kuvattu rinnak kaisessa EP-julkaisussa 225,807, joka on julkaistu 16.06.1987, joka on siirretty tämän hakemuksen hakijalle ja i * * joka liitetään tähän viitteeksi.
; 30 > * * · ► ♦ 22 109604 II.H. Immunologinen analyysi ja diagnostisia kittejä
Sekä yhdistelmäpolypeptidit, jotka reagoivat immunologisesti 5 seerumin kanssa, joka sisältää CMV-vasta-aineita että vasta-aineet, jotka ovat syntyneet näitä yhdistelmäpolypeptidejä vastaan, ovat hyödyllisiä immunologisissa analyyseissä CMV-vasta-aineiden läsnäolon tai viruksen läsnäolon osoittamiseksi biologisissa näytteissä, sisältäen esimerkiksi veri-10 tai seeruminäytteet. Immunologisten analyysien suunnittelu on suuren vaihtelun kohteena ja lukuisia tällaisia tunnetaan alalla. Esimerkiksi immunologinen analyysi voi käyttää yhtä virusantigeeniä, esimerkiksi yhdistelmäpolypeptidiä, joka on peräisin gp55:n aminohapoista 461-680; vaihtoehtoisesti immu-15 noanalyysi voi käyttää CMV-genomista peräisin olevien virus antigeenien yhdistelmää. Se voi käyttää esimerkiksi mono-klonaalista vasta-ainetta, joka on suunnattu virusantigeeniä vastaan, monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmää, joka on suunnattu yhtä virusantigeeniä vastaan, monoklonaalisia vas-20 ta-aineita, jotka ovat suunnattuja erilaisia virusantigeenejä *·· vastaan, polyklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat suunnat- I * · · .**·,; tuja samaa virusantigeeniä vastaan tai polyklonaalisia vas-• · !'·.. ta-aineita, jotka ovat suunnattuja erilaisia virusantigeenejä : ·*: vastaan. Menettelytavat voivat perustua esimerkiksi kilpai- :: 25 luun tai suoraan reaktioon tai ne voivat olla sand- v ·* wich-tyyppisiä analyysejä. Menettelytavat voivat myös käyttää esimerkiksi kiinteitä kantajia tai ne voivat olla immunosaos- tumisen kautta tapahtuvia. Useimmat analyysit käsittävät lei- matun vasta-aineen tai polypeptidin käytön; leimat voivat ol- : 30 la esimerkiksi fluoresoivia, kerniluminesoivia, radioaktiivi- 11» · siä tai värimolekyylejä. Analyysit, jotka vahvistavat signaa-: lit koettimesta, ovat myös tunnettuja; joista esimerkit ovat analyysejä, jotka käyttävät biotiinia ja avidiinia ja entsyy- 23 109604 mileimattuja ja välitettyjä immunoanalyysejä, kuten ELI-SA-analyysejä.
Immunologisia diagnooseja varten sopivat välinesarjat, jotka 5 sisältävät sopivia leimattuja reagensseja, rakennetaan pakkaamalla sopivat materiaalit, sisältäen keksinnön yhdistelmä-polypeptidit, jotka sisältävät CMV-epitoopit tai epitooppeja vastaan suunnatut vasta-aineet sopivissa säiliöissä yhdessä loppujen reagenssien ja analyysin suorittamiseen vaadittavien 10 materiaalien kanssa ja myös sopivan analyysin ohjeiden kokoelman.
Polynukleotidikoettimet voidaan myös pakata diagnostisiksi välinesarjoiksi. Diagnostiset välinesarjat sisältävät koe-15 tin-DNA:n, joka voi olla leimattu; vaihtoehtoisesti koe- tin-DNA voi olla leimaamaton ja ainekset leimaamista varten voidaan sisällyttää välinesarjaan. Välinesarja voi myös sisältää muita sopivasti pakattuja reagensseja ja materiaaleja, joita tarvitaan erityistä hybridisaatiomenettelyä varten, 20 esimerkiksi standardeja ja myös ohjeet kokeen tekemiseksi.
« » · » 4 » · · • · t * • · III. Yleisiä menetelmiä • * i « · · 25 Yleiset tekniikat, joita käytetään genomin uuttamiseksi vi-'·.! *· ruksesta, cDNA-kirjaston valmistamiseksi ja tutkimiseksi koettimilla, kloonien sekventoimiseksi, ekspressiovektoreiden >,'·· rakentamiseksi, solujen transformoimiseksi ja sen kaltaisik- si, ovat tunnettuja alalla ja saatavilla on laboratoriokäsi-' f; 30 kirjoja, jotka kuvaavat näitä tekniikoita. Kuitenkin yleisenä ohjeena seuraava julkaisee joitakin sellaisia menettelytapoja ; X ja niiden suorittamiseksi hyödyllisiä materiaaleja varten ny-kyään saatavilla olevia lähteitä.
109604 III.A. Isäntiä ja ilmentymän ohjaussekvenssejä
Voidaan käyttää sekä prokaryootti- että eukaryootti-isän- 5 täsoluja haluttujen kooditussekvenssien ilmentymiseen, kun käytetään sopivia ohjaussekvenssejä, jotka ovat yhteensopivia näiden merkittyjen isäntien kanssa. Prokaryootti-isännistä on useimmiten käytetty E. Coli. Ilmentymän-ohjaussekvenssit pro- karyootteja varten sisältävät promoottoreita, mahdollisesti 10 sisältäen operaattoriosia ja ribosomin sitomispaikkoja. Siir- tovektorit, jotka ovat yhteensopivia prokaryootti-isäntien kanssa, ovat yleensä peräisin esimerkiksi pBR322:sta, plasmi- dista, joka sisältää operoneja, jotka antavat ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssiä ja eri pUC-vektoreista, jotka 15 sisältävät myös sekvenssejä, jotka antavat antibioottiresis- tenssimarkkereita. Näitä markkereita voidaan käyttää saamaan menestyksellisiä transformantteja valinnan kautta. Yleisesti käytetyt prokaryoottiohjausekvenssit sisältävät betalaktamaa- si- (penisillinaasi) ja laktoosipromootterijärjestelmät 20 (Chang, et ai., (1977) Nature 198:1056), tryptofaanipromoot- .'j* torijärjestelmän (trp) (Goeddel, et ai., (1980) Nuo. Acids * * *.’· Res. 8:4057) ja lambdaperäisen PL-promoottorin (Shimatake, et 1 · • '·· ai., (1981) Nature 292:128) ja N-geenin ribosomin sitoutumis- i * · • paikan ja hybridin tae-promoottorin (De Boer, et ai., (1983) • · · 25 PrQg:. Natl. Acad. Sei. USA 69:2110), jotka ovat peräisin trg V * ja lac UV5-promoottoreiden sekvensseistä. Edellä olevat järjestelmät ovat erityisen yhteensopivia E. Colin kanssa; ha- '· *: luttaessa voidaan käyttää muita prokaryootti-isäntiä, kuten » · *··' Bacillus- ja Pseudomonas-kantoja, joissa on vastaavat ohjaus-'| 30 sekvenssit.
: Eukaryootti-isännät sisältävät hiiva- ja imettäväissolut vil- » » · · jelyjärjestelmissä. Saccharomyces cerevisae ja Saccharomvces carlsbergensis ovat yleisimmin käytetyt hiivaisännät ja ne 25 109604 ovat mukavia sieni-isäntiä. Hiivaan sopivissa vektoreissa on markkereita, jotka sallivat menestyksellisten transformantti-en valinnan antamalla prototrofiaa auksotroofisille mutan-teille tai raskasmetallien kestävyyttä villityyppisille kan-5 noille. Hiivan kanssa yhteensopivat vektorit voivat käyttää replikaation 2 mikrometrin alkua (Broach, et ai., (1983)
Meth. Enz. 101:307), CEN3:n ja ARSl:n yhdistelmää tai muita tapoja replikaation varmistamiseksi, kuten sekvenssejä, joista on tuloksena sopivan fragmentin liittäminen isäntäsolun 10 genomiin. Alalla tunnetaan ohjaussekvenssejä hiivavektoreita varten ja ne sisältävät promoottorit glykolyyttisten entsyymien synteesiä varten (Hess, et ai., (1968) J. Acv. Enz. Rea. 7:149; Holland, et ai., (1978) Biotechnology 17:4900), sisältäen promoottorin 3-fosfoglyseraattikinaasia varten (Hitzeman 15 (1980) J. Biochem. 255:1385). Erityisen hyödyllisiä ohjaus järjestelmiä ovat ne, jotka käsittävät glyseraldehy-di-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH)-promoottorin tai alkoho-lidehydrogenaasin (ADH) säädettävän promoottorin, terminaat-torit, jotka on myös saatu GAPDH:sta, ja jos halutaan eritys-20 tä, johtosekvenssin hiivan alfatekijästä. Lisäksi transkrip-!· tiota säätävä alue ja transkription aloittava alue, jotka * ovat toiminnallisesti liitettyjä, voivat olla sellaisia, että .ne eivät luonnostaan liity villityyppiseen organismiin. Näitä i * » ! ‘.1 järjestelmiä kuvataan yksityiskohtaisesti US-patenttihake- 25 muksissa S/N 468,589, 522,909, 760,197 ja 868,639, jotka on > i · *,·· vastaavasti jätetty 22.05.1983, 12.08.1983, 29.07.1985 ja 29.05.1986, joista kaikki on siirretty tämän hakijalle ja * · jotka liitetään tähän viitteeksi.
t % * ; 30 Imettäväissolulinjat, jotka ovat saatavilla isäntinä ilmenty- * i * · : mistä varten, ovat tunnettuja alalla ja sisältävät monia kuo- » ; lemattomaksi tehtyjä solulinjoja, jotka ovat saatavilla Ame- rican Type Culture Collectionista (ATCC) , sisältäen He-La-solut, marsun munasarjasolut (CHO), hamsterin poikasen mu- 109604 nuaissolut (BHR) ja lukumäärän muita solulinjoja, sisältäen myelomalinjat. Sopivia promoottoreita imettäväissoluja varten tunnetaan myös alalla ja ne sisältävät viruspromoottorit, kuten ihmisapinaviruksen 40 (SV40) (Fiers (1978)), Ro-5 us-sarkoomaviruksen (RSV), adenoviruksen (ADV), ihmisen, ih-misapinan ja hiiren CMV:n ja härän papilloomaviruksen (BPV). Imettäväissolut voivat myös vaatia lopetussekvenssejä. Vektorit, jotka ovat sopivia replikointia varten imettäväissoluis-sa, voivat sisältää virusrepiikoneja tai sekvenssejä, jotka 10 takaavat sopivien sekvenssien, jotka koodittavat CMV-epitooppeja, siirtymisen isäntägenomiin.
Ekspressiota-voidaan myös suorittaa sopivilla vektoreilla, esimerkiksi baculovirusvektoreilla, transformoiduissa, vil-15 jellyissä hyönteisoluissa. Menetelmät hyönteissoluviljelmiä varten käyttäen esimerkiksi Spodoptera frugiperdaa ovat alalla hyvin tunnettuja ja yksityiskohtaisia menettelytapoja niiden viljelemiseksi ja käyttämiseksi-voidaan löytää julkaisuista A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect 20 Cell Culture Procedures, tekijät M.D. mmers ja G.E. Smith, Texas Agricultural Experimental tion Bulletin No. 1555, <f]·* 2.painos, helmikuu 1988 ja EP839, julkaistu 12.12.1984, • ’··’ Smith, G.E. et ai.
• · · ί 25
Ill B. Transformaatiot < I t • · · • · ·
Transformaatio voi tapahtua millä tahansa tunnetulla menetel- * * · mällä polynukleotidien viemiseksi isäntäsoluun, sisältäen ···* 30 esimerkiksi polynukleotidin pakkaamisen virukseen ja isän-I täsolun transdusoimisen viruksella ja suoralla polynukleoti-din ottamisella. Käytetty transformaatiomenettely riippuu : transformoitavasta isännästä. Esimerkiksi E. Co- li-isäntäsolujen transformaatiosta lambda-gtll: llä, joka si- 109604 j sältää CMV-sekvenssit, keskustellaan alla esimerkkiosassa. Bakteerien transformaatio suoralla otolla käyttää yleensä käsittelyä kalsium- tai rubidiumkloridilla (Cohen (1972) Prog. Natl. Acad. Sei. USA 69:2110; Maniatis et ai., (1982) Molecu-5 lar cloning;. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Hiivan transformaatiot suoralla otolla voidaan suorittaa käyttäen Hinnen, et ai., (1978)
Proc. Natl. Acad. Sei USA 75:1929 menetelmää. Imettäväis-transformaatiot suoralla otolla voidaan suorittaa käyttäen 10 kalsiumfosfaatilla saostamisen menetelmää, jonka ovat kuvanneet Graham ja Van der Eb (1978) Virology 52:546 tai sen eri tunnetuilla muunnoksilla.
15 III.C. Vektorin rakentaminen
Vektorin rakentaminen käyttää tekniikoita, jotka ovat alalla tunnettuja. Suoritetaan paikkaspesifinen DNA-lohkaisu käsittelemällä sopivilla restriktioentsyymeillä olosuhteissa, jot-20 ka yleensä määrittää näiden kaupallisesti saatavien entsyymien valmistaja. Yleensä lohkaistaan noin 1 pg plasmidia tai *!*’. DNA-sekvenssiä yhdellä entsyymiyksiköllä noin 20 pl:ssa pus- ‘ kuriliuosta inkuboimalla 1-2 tuntia 37°C:ssa. Restriktioent- .. . syymillä inkuboinnin jälkeen poistetaan proteiini feno- 25 li/kloroformiuutolla ja DNA otetaan talteen saostamalla eta-nolilla. Lohkaistut fragmentit voidaan erottaa käyttäen poly-akryyliamidi- tai agaroosigeelielektroforeesitekniikoita nii-,·# : den yleisten menettelytapojen mukaan, jotka löytyvät julkai- .···, susta Methods in Enzymology (1980) 65:499-560.
. \ 30
Tarttuvapäiset lohkaisufragmentit voidaan tehdä päistään tylpiksi käyttäen E. Colin DNA-polymeraasi I:tä (Klenow) sopiviin : en deoksinukleotiditrifosfaattien (dNTP) läsnäollessa seok- ’ ' sessa. Sl-nukleaasilla käsittelyä voidaan myös käyttää, mistä 109604 on tuloksena minkä tahansa yksisäikeisten DNA-osien hydrolyy- si.
Liittämiset suoritetaan käyttäen standardia puskuria ja läm-5 pötilaolosuhteita käyttäen T4-DNA-ligaasia ja ATP:tä; tarttu-vapäiset liittämiset vaativat vähemmän ATP:tä ja vähemmän li-gaasia kuin tylppäpäiset liittämiset. Kun käytetään vektori-fragmentteja osana liittämisseosta, käsitellään vektorifrag-menttia usein bakteerin alkaalisella fosfataasilla (BAP) tai 10 vasikan suolen alkaalisella fosfataasilla 5'-fosfaatin poistamiseksi ja täten estämään vektorin religoiminen; vaihtoehtoisesti niiden fragmenttien, joita ei haluta, restriktioent-syymeillä pilkkomista voidaan käyttää liittämisen estämiseen.
15 Liittämisseokset transformoidaan sopiviin kloonausisäntiin, kuten E. Coliin ja onnistuneet transformantit valitaan esimerkiksi antibioottiresistenssin mukaan ja ne seulotaan oikean rakenteen selvillesaamiseksi.
20 III.D. Haluttujen DNA-sekvenssien rakentaminen ·.’·: Synteettisiä oligonukleotideja voidaan valmistaa käyttäen au- • ·' tomaattista oligonukleotidisyntetisaattoria, kuten on kuvan- • ’ 25 nut Warner (1984). Haluttaessa voidaan synteettiset säikeet leimata 32P:lla käsittelemällä polynukleotidikinaasilla '·' ' 32P-ATP:n läsnäollessa käyttäen standardiolosuhteita reaktioon.
• » · ;*' 30 DNA-sekvenssejä, mukaanlukien ne, jotka on eristetty cDNA-: kirjastoista, voidaan muuntaa tunnetuilla tekniikoilla, si- sältäen esimerkiksi paikkasuunnatun mutagenoinnin, kuten on : kuvannut Zoller (1982)-Nuc. Acids Res. 10:6487. Lyhyesti pa- ·:··· kataan muunnettava DNA faagiin yksisäikeisenä sekvenssinä 109604 ja se muutetaan kaksisäikeiseksi DNA:ksi DNA-polymeraasilla käyttäen alukkeena synteettistä oligonukleotidia, joka on komplementaarinen muunnettavan DNA:n osalle ja jolla on haluttu muunnos sisältyvänä omaan sekvenssiinsä. Tulokseksi 5 saatu kaksisäikeinen DNA transformoidaan faagiin, joka kantaa isäntäbakteeria. Transformoidun bakteerin viljelmät, joka bakteeri sisältää faagin kunkin säikeen replikaatioita, asetetaan levylle agariin plakkien saamiseksi. Teoreettisesti 50 % uusista plakeista sisältää faagin, jossa on mutanttise-10 kvenssi ja lopuilla 50 %:lla on alkuperäinen sekvenssi. Plakkien kopiot hybridisoidaan leimattuihin synteettisiin koetti-miin lämpötiloissa ja olosuhteissa, jotka sallivat hybridi-saat ion oikean säikeen kanssa, mutta ei muuntamattoman sekvenssin kanssa. Sekvenssit, jotka on tunnistettu hybridisaa-15 tiolla, otetaan talteen ja kloonataan.
III.E. Hybridisaatio koettimella 20 DNA-kirjastoja voidaan käsitellä koettimella käyttäen menettelytapaa, jonka ovat esittäneet Grunstein ja Hogness (1975) ...: Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73:3961. Lyhyesti tässä menette- • * " lyssä koettimella käsiteltävä DNA immobilisoidaan nitrosellu- loosasuodattimiin, denaturoidaan ja esihybridisoidaan pusku- ·' ·’ 25 rilla, joka sisältää 0-50 % formamidia, 0,75 M NaCl, 75 mM • · natriumsitraattia, 0,02 % (w/v) kutakin seuraavista, härän • · ♦
‘ seerumin albumiini, polyvinyylipyrrolidiini ja Ficoll, 50 mM
natriumfosfaattia (pH 6,5), 0,1 % SDS ja 100 pg/ml kantajalle ;>t* denaturoitua DNA:ta. Formamidin prosenttiosuus puskurissa ja *;* 30 myös esihybridisaation ja sen jälkeisen hybridi saat iovaiheen i aika ja lämpötilaolosuhteet riippuvat vaadittavasta ankaruu-desta. Oligomeerikoettimia, jotka vaativat alemman ankaruuden : : : olosuhteita, käytetään yleensä alemmilla formamidiprosent- tiosuuksilla, alemmissa lämpötiloissa ja pidemmillä hybridi- j 109604 saatioajoilla. Koettimet, jotka sisältävät enemmän kuin 30 tai 40 nukleotidia, kuten ne jotka ovat peräisin cDNA:sta tai genomisekvensseistä, käyttävät yleensä korkeampia lämpötiloja, esimerkiksi noin 40-42°C ja korkeaa, esimerkiksi 50 % 5 formamidimäärää. Seuraten esihybridisaatiota lisätään 5 i _32p_ieimattua oligonukleotidikoetinta puskuriin ja suodattimia inkuboidaan tässä seoksessa hybridisaatio-olosuhteissa. Pesun jälkeen suoritetaan käsitellyille suodattimille autora-diografia hybridisoidun koettimen paikan soittamiseksi; käy-10 tetään DNA:ta vastaavissa paikoissa alkuperäisillä agaarile-vyillä halutun DNA:n lähteenä.
III. F. Rakenteen ja sekventoimisen todentaminen 15
Rutiineilla vektorirakenteilla transformoidaan liittoseokset E. Colin kantaan HB101 tai muuhun sopivaan isäntään ja onnistuneet transformantit valitaan antibioottiresistenssin tai muiden merkkien mukaan. Sitten valmistetaan transformanteista 20 plasmideja Clewell, et ai., (1969) Proc. Natl. Acad Sei USA 62:1159 mukaan, mitä tavallisesti seuraa klooriamfenikoli-'*·*, monistus (Clewell (1972) J. Bacteriol. 1-10:667) . DNA eriste-* tään ja analysoidaan, tavallisesti restriktioentsyymianalyy-.. . sillä ja/tai sekventoimalla. Sekventoiminen voidaan tehdä 25 Sanger, et ai., (1977) Proc. Natl. Acad. Sei USA 74:5463 di-... deoksimenetelmällä, mitä on edelleen kuvannut Messing, et ai., (1981) Nuc. Acids Res. 9:309 tai menetelmällä Maxam, et .·. : ai., (1980) Meth. Enz. 65:499. Ongelmat vyöhykkeiden kokoon- • · · .···. puristumisesta, joita joskus huomataan GC-rikkailla alueilla, •t 30 vältettiin käyttämällä T-deatsaguanosiinia artikkelin Barr, et ai., (1986) Biotechniques:428 mukaan.
• » 31 109604 III. G. CHO-solulinjoilla tuotetun gB:n puhdistaminen
Saatavilla on lukuisia tavanomaisia proteiininpuhdistustek-niikoita käytettäväksi gB:n puhdistamisessa. Nämä menettelyt 5 sisältävät esimerkiksi kromatograafiset menetelmät, kuten ioninvaihdon, hydrofobisen vuorovaikutuksen, virvilä-lektiinikromatografiän ja geeliläpäisykromatografiän.
IV. Esimerkit 10
Alla on kuvattu tämän keksinnön esimerkkejä, jotka on annettu vain kuvaamistarkoituksessa, eikä rajoittamaan tämän keksinnön suojapiiriä.
15 Solut, virus ja plasmidit. Ihmisen CMV (Towne) saatiin E.S. Mocarskilta (Stanfordin yliopisto). Virusta viljeltiin ihmisen esinahkafibroblastisoluissa (HF) Dulbecco's modified Eagle Medium-väliaineessa (DME) (Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y.) Spaete ja Mocarski (1985a) J.Virol. 56:135-143 20 menetelmän mukaan, mutta sitä täydennettiin 10 %:lla vasikan sikiöseerumilla (FCS) (Hyclone, Logan, UT).
.·’_ * Plasmidirakenteet. Kuviossa 1 kuvattu CMV:n (Towne) Hindlll D-fragmentti kloonattiin plasmidiin pBR322 ja nimettiin • · ,···. 25 pRL104a:ksi, mikä oli lahja R.L. LaFeninalta ja G.S.
Haywardilta (Johns Hopkins Yliopisto) . Plasmidi pXgBl, mikä koodittaa koko gB-geeniä, saatiin pyöristämällä pRL104a:n .·. : 8,95 kb:n BamHI-fragmentti . Täten pXgBl sisältää 4,96 kb:n
Hindlll D/A ->BamHI E/R-fragmentin Hindlll D- plus pBR322 .30 sekvenssien oikeasta päästä. Plasmidi pXgB7 sisältää typis • » » tetyn gB-geenin, joka on kloonattu ekspressiovektoriin pSV7d (Truett, M.A., et ai., (1985) DN :333-349), mikä ; sisältää SV40:n varhaisen promoottorin, alku- ja poly adenylaatiosekvenssit ja myös pML:stä saadut sekvenssit.
32 109604
Plasmidi pXgB7 rakennettiin kloonaamalla gB 2,12 kb:n osittaisena SacII/Xhol-fragmenttina pGEM-l:n polylinkkerin Sali-paikkaan (Promega Biotec, Madison, WI) käyttäen K1enow-fragmenttia (Boehringer Mannheim Biochemicals) 5 SacII-paikan pyöristämiseksi ja liittämättömän Sali-paikan täyttämiseksi. Tätä välirakennetta merkittiin pXgB6:lla. GB-sekvenssi pätkittiin ympäröivistä pXgB6:n polylinkke risekvensseistä 2,13 kb:n Xbal/Hindlll-fragmenttina ja se liitetiin pSV7d:n Xbal-paikkaan. HindiII-paikka täytettiin 10 ja liitettiin pSV7d-.n täytettyyn Xbal-paikkaan Xbal-paikan säilyttämiseksi gB:n 3'-päässä. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pXgb7:ksi ja se esitetään kuviossa 3.
Plasmidi pXgB8 sisältää samat typistetyt gB-sekvenssit, jotka 15 on kloonattu pON260-.een, CMV-.n pääasialliseen välittömään varhaispromoottoriin (MIE), joka käyttää betagalaktosidaasin (IacZ) ekspressiovektoria. Plasmidi pON260 on saatu pON249:stä (Geballe, A.P., et ai., (1986) Cell 4 C:865-872) poistamalla Ball -> Sali-fragmentti CMV:n vahvistajasta ylä-20 virtaan. 2,13 kb:n Xbal-fragmentti, joka koodittaa gB:a, pätkittiin pXgB7:stä ja siirrettiin pON260:een, mikä oli leikat- • # · ····* tu Xbal:llä ja PvuII:lla kaikkien muiden paitsi 15 • * ’· ” C-terminaalin IacZ:a~koodittavien sekvenssien aminohappojen ’* poistamiseksi. Näitä IacZ-sekvenssejä ei ilmennetä pXgB8:ssa • · '25 johtuen ylävirran puolen pysäytyskodonista. Rakennettiin toi- ;;; nen CMV:n MIE-promoottoriin perustuva ekspressioplasmidi * pON260:ssa olevien IacZ:a koodittavien sekvenssien poistami- . . seksi. CMV:n MIE-promoottorin sekvenssit ensimmäisestä Ba- » » · !..* ll-paikasta ylävirtaan vahvistajasta Sacl-paikkaan 8 emäspa- 30 ria alavirtaan TATA-laatikosta poistettiin pON260:sta 0,67 * * ♦ ·'·:·* kb:n Sall/Xbal-fragmenttina ja kloonattiin plasmidiin pSV7b,
» I
*·;·' mikä on pSV7d:tä muistuttava rakenne, mikä oli pätkitty Sa- ·,· · ll:llä ja BglII:lla SV40-vahvistajan, alun ja promoottorin 109604 j poistamiseksi jättäen SV40-polyadenylaatiosignaalit koskematta .
Täyspitkä gB-geeni kloonattiin pMTll/Eagl:in (pBR322:sta saa-5 tu plasmidivektori, jonka on kuvannut Spaete et ai., 1985a) 3,12 kb:n EagI-fragmenttina molemmissa orientaatioissa ja plasmidit nimettiin pXgB9:ksi ja pXgBlliksi. gB-sekvenssit pätkittiin plasmidista pXgBll käyttäen EcoRI- ja Bam-HI-paikkoja polylinkkerissä ja kloonattiin pMIE-poly-10 linkkerisekvensseihin ECoRI:ssa ja Xbalrssa. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pXgB12:ksi ja se on kuvattu kuviossa 3.
EcoRI/BamHI-fragmentti, jota käytettiin pXgB12:n luomiseen, kloonattiin myös pSV7d:n, joka oli leikattu EcoRI:11a ja Bam-15 HI:11a, polylinkkerisekvensseihin. Tämä SV40-ekspres- sioplasmidi nimettiin pXgB13:ksi ja se on myös kuvattu kuviossa 3 .
PXgB6:een kloonattu gB-geeni poistettiin poistamalla 1106 20 emäsparia N-terminaalin gB:a koodittavista sekvensseistä Aa- tll-paikan ja Ndel-paikan välissä. Päät pyöristettiin käyttä- en Klenow-fragmenttia ja religoitiin SnaBl-paikan luomiseksi ja lukukehyksen säilyttämiseksi. Tämä plasmidi nimettiin •’·· pXgB19:ksi. 1036 emäsparin Xbal/Hindlll-fragmentti, joka koo- i V 25 dittaa poistettua gB-geeniä, leikattiin pXgB19:stä ja kloo-* · * nättiin pMCMVAdhfr-.n ainutkertaiseen Sali-paikkaan käyttäen > » t v ; Klenowia paikkojen täyttämiseksi ennen liittämistä pyöristet tyihin päihin. Ekspressiovektori pMCMVAdhfr on rinnakkais- t · · '· '·' lineaarinen pCMVAdhfr:n, jota kuvataan alla, kanssa, paitsi "·’ 30 että ihmisen CMV-promoottori on korvattu hiiren CMV:n (MCMV) ''{ | välittömällä varhaispromoottorilla, joka on kloonattu * * »
Hpal/PstI-fragmenttina.
* 109604 j
Sellaisten plasmidien kehittämiseksi, jotka ilmentävät loh-keamatonta gB:a, gB:n endoproteolyyttinen lohkeamispaikka mu-tagenoidaan in vitro käyttäen M13-kloonattuja templaatteja ja neljää alla kuvattua mutageenioligonukleotidia: 5 +1 *-l -2 -3 -4
Ser Arg Lys Thr Arg
Parent 5' GCC ATC TGT ACT TCT TTT GGT TCT ATT ATG AGT AAG
10 Thr
1. 5' GCC ATC TGT ACT TGT TTT GGT TCT ATT ATG AGT AAG
Gin 2. 5' GCC ATC TGT ACT TCT TTG GGT TCT ATT ATG AGT AAG 15
Thr
3 . 5' GCC ATC TGT ACT TCT TTT GGT TGT ATT ATG AGT AAG
Thr Gin Thr
20 4. 5' GCC ATC TGT ACT TGT TTG GGT TGT ATT ATG AGT AAG
t I I « • · • · ;.f.# GB- ja M13-sekvenssien tutkiminen ei ole paljastanut näille ,···, 25 36-meereille mitään muita mahdollisia sitoutumispaikkoja kuin l · lohkeamispaikka. Sekventoiva primeri, 51 CGC CCG GTT GAT GTA ACC GCG 3’ : joka on 93 emäsparin päässä lohkeamispaikasta, luodaan myös.
t » .··*. Templaattisäie varustetaan alukkeella kullakin muta- t * · , 30 geneesioligonukleotidillä, mitä seuraa pidennys.
* * · I » I « * * · e « » · ” Tuloksena olevaa dsDNA:ta käytetään sopivan M13-isäntäsäi= : keen transformointiin ja mutagenoidut DNA:t eristetään sek- >
ventoimalla replikoivan muodon DNA:n (RF) luomiseksi. RF-DNA
35 109604 pätkitään EcoRI:lla ja ApaLI:lla ja nämä fragmentit vaihdetaan villityypin segmentteihin gB-ekspressioplasmidissa pXgB23 (ks. alla) tai samanlaisessa gB-rakenteessa, jossa transkriptiota edistetään hiiren CMV:n välittömällä varhais-5 promoottorilla.
Käytettiin ekspressiovektoria, pCMVAdhfr, joka käyttää ihmisen CMV:n pääasiallista varhaispromoottoria (MIE) ja joka sisältää myös hiiren dhfr-cDNA;n, mikä on liitetty adenoviruk-10 sen pääasialliseen myöhäisprornoottoriin (Stuve, et ai., (1987) J. Virol. 61:326-335), kloonaamaan 2196 emäsparin Ea-gl/XhoI gB-fragmentin BamHI/XhoI-fragmenttina, joka on otettu pXgB9:stä. Tällä gB-rakenteella, pXgB23, on insertti, joka on identtinen 51-päässä pXgB12:n ja pXgB13:n gB-insertin kanssa 15 siinä, että se sisältää 153 emäsparia 51 -lukematonta gB-johtosekvenssiä. Rakenne on identtinen 3'-päässä pXgB8:n gB-insertin kanssa siinä, että se on typistetty C-päässä poistamalla aminohapot 681-907, poistamalla transmembraani-alue ja C-terminaalin alueet.
20
Kaikki bakteerikloonaukset tehtiin Eschericia coli:n < » ♦ HB-101:ssä tai-DH5alfassa Spaete et ai., (1985b) J. Virol.
♦ · · " « « ’ 54:817-824 menettelyn mukaan. Menettelytavat plasmidi-DNA:n ja restriktioentsyymianalyysien valmistamiseksi on myös ku- 25 vattu ylläolevassa julkaisussa Spaete et ai., (1985b). Kaikki t’].\ transfektioissa käytetyt plasmidit jaettiin vyöhykkeisiin • · kahdesti kesiumkloridigradientteina. Restriktioentsyymit ja ,·, : T4-DNA-ligaasi ostettiin New England Biolabs'ista tai Bethes- » « » .···, da Research Laboratories1 lta (BRL) ja niitä käytettiin vai- , ·. 30 mistä jän ohjeiden mukaisesti.
( t T Nukleotidisekvenssin määrittäminen ja analyysi. DNA-frag- : mentit alikloonattiin M13-faagivektoreihin mpl8 ja mpl9
> I
109604 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) ja myös näiden vektoreiden po-lylinkkerijohdannaisiin, plasmideihin rtl ja rt2. Plasmi-di rtl sisältää polylinkkerin, jossa on seuraavat restriktio-entsyymipaikat annetussa järjestyksessä: HindiII, Xbal, 5 EcoRV, Sali, Sphl, BamHI, Ncol, PstI, Rpnl, SstI, EcoRI.
Plasmidissa rt2 on polylinkkerin paikkajärjestys käänteinen. Luotiin yksisäikeistä virus-DNA:ta templaattina sekventoimis-ta varten dideoksinukleotidin ketjunpäätösmenetelmällä, Sanger, F., et ai., (1977) Proc. Natl. Acad. Sei USA 10 74:5463-5467. Käytettiin dGTP-emäsanalogia, 7-deatsa-dGTP:tä (American Bionetics, Hayward, CA; Boehringer Mannheim Bio-chemicals) kokoonpuristuneiden alueiden purkamiseen (alueet, joissa oli korkea G/C-pitoisuus). DNA sekventoitiin kokonaisuudessaan molemmissa säikeissä ja kaikki liitokset silloi-15 tettiin käyttäen oligonukleotidialukkeita, jotka oli syntetisoitu Applied Biosystems 380A-syntetisoijassa.
DNA-transfektiot. Transfektoitiin COS-7-soluja (Gluzman, Y.
20 (1981) Cell 23:172-182), kuten on kuvannut Spaete et ai., 1985. Lyhyesti 10-35 yg plasmidi-DNA:ta sekoitettiin 1,4 ml:n ·;*·. kanssa DME - 50 mM Tris-hydrokloridia (pH 7,4), mikä sisälsi « i · ' 400-600 yg DEAE-dekstraania millilitraa kohti ja se lisättiin • · · ... 6 cm:n laseille, jotka sisälsivät soluja 50-80 % konfluens- » · * • · 25 sissa. Solut pestiin DME-50 mM Tris-hydrokloridilla (pH 7,4) 4-6 tuntia transfektion jälkeen ja niitä inkuboitiin DME-10% FCS:ssä 37°C:ssa. 24 tunnin jälkeen osa transfektoiduista so-. . luista aliviljeltiin 4-kammioiseen muoviseen liuskakuoppiin (Lab-Tek) immunofluoresenssitutkimuksia varten. Muiden solu-p 30 astioiden annettiin kasvaa yhteen ja ilmastetusta väliainees-ta kerättiin pesäkkeet 72 tuntia transfektion jälkeen.
!.: : CHO-solulinja, jossa ei ollut DHFR:ää (Urlaub and Chasin * ‘ (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220) transfektoi- j 109604 tiin samalla, kuten on kuvannut Stueve, et ai. yllä käyttäen plasmideja pXgB8 ja Ad-dhfr. Selektiivistä väli-ainetta, mikä käsitti DME:tä yhdessä 10 % dialysoidun vasikan sikiöseerumin kanssa ja mitä oli täydennetty, kuten esittää Pachl, et ai., 5 (1987) J. Virol. 61:315-325), käytettiin transfektoituihin soluihin 2 päivää infektion jälkeen. Analysoitiin useita dhfr-positiivisia klooneja gB:n ekspression suhteen ilmastetun väliaineen immunofluoresenssin ja ELISAn avulla. Tutkittiin stabiileja solulinjoja, jotka erittivät gB:ä ja eniten 10 tuottava klooni ilmensi gB:a tasolla, mikä oli samanlainen kuin COS-solujen suhteen havaittiin.
On myös mahdollista lisätä gB:n ilmtymää näihin stabiileihin solulinjoihin käyttäen metotreksaattimonistusta (MTX), kuten 15 esitetään alalla.
Immunofluoresenssi. Identifioitiin COS-7-soluja, jotka tuottavat gB:a, epäsuoralla immunofluoresenssilla käyttäen hiiren monoklonaalisesta 15D8:sta (Rasmussen et ai., 1985) ensisi-20 jäisenä vasta-aineena ja FITC-konjugoitua vuohen an-. ti-hiiri-IgG:tä (Tago, Inc., Burlingame, CA; Chemicon, El Se- Τ'. gundo, CA) toissijaisena vasta-aineena. FITC-konjugaatteja • ♦ ♦ ··, * käytettiin laimennoksina 1:50 (Tago) ja 1:80 (Chemicon).
Liuskoja tarkkailtiin käyttäen Leitz Dialux 20 .···. 25 EB-fluoresenssimikroskooppia.
• · * • ♦ ♦ GB:n ilmentymä havaittiin 15D8:lla COS-soluissa, jotka oli : transfektoitu kaikilla neljällä gB:tä ilmentävillä plasmi- deilla, merkiten sitä, että gB-geeni koodittaa pl30- ja .30 p55-glykoproteiineja. Transfektoiduilla soluilla, jotka sai-\‘T vat gB:n typistetyn version, oli diffuusi sytoplasman immuno-fluoresenssi-värjäyskuvio. Tälle vastakohtana soluilla, jotka ···; oli transfektoitu täyspitkällä gB-geenillä, oli täplämäinen
I · » M
sytoplasman värjäyskuvio, mikä ehdottaa yhteyttä membraaniin 109604 johtuen transmembraanialueiden läsnäolosta näissä rakenteissa.
GB;n ELISA-analyysi. Mikrotiitterilevyt (Immulon 1, Dynatech 5 Laboratories, Inc.) päällystettiin hiiren monoklonaalisella 15D8-gammaglobuliinilla (0,1 pg/kuoppa) laimennettuna 50 mM natrrumboraattiin (pH 9,1) ja niitä inkuboitiin 2 tuntia 37' C:ssa. Levyt pestiin, niitä inkuboitiin 1 tunti fosfaattipus-kuroidun suolaliuoksen kanssa (PBS; 0,15 M MaCl, 2,7 mM KC1, 10 15,3 mM Na2HP04, 1,5 mM KH2P04) plus 2,0 % BSA ja sitten niitä inkuboitiin yli yön 37'C:ssa transfektoiduista COS-soluista tai CMV-glykoproteiinien seoksesta saadun ilmastoidun väliaineen kanssa (kuvataan alla), mikä sisälsi gB:n. Pestyjä levyjä inkuboitiin sitten 1 tunti 37°C:ssa ihmisen an-15 ti-CMV-seerumin kanssa (Whitaker M.A. Bioproducts, Inc.), mi tä seurasi 1 tunnin inkubointi 37°C:ssa 1:500-laimennoksen kanssa peroksidaasikonjugoitua vuohen anti-ihmis IgGrtä (Cooper Biomedical, Inc.). Levyt kehitettiin 0,83 mg/ml 0-fenyleenidiamiinilla 0,1 M sitraattifosfaattipuskurissa (pH 20 5, 0) plus 0,015 $ H202, reaktio pysäytettiin 4 M H2S04:lla ja ,;> absorbanssi luettiin 490 nm:n aallonpituudella. Kunkin anti-.·. : geenin tai vasta-aineiden kanssa tapahtuneen inkuboinnin jäl keen levyt pestiin 5 kertaa PBS:llä plus 0,05 % Tween 20 ja 0,1 % BSA ja viisi kertaa pelkällä PBS:llä loppupesuna. Kaik-.·*·. 25 ki antigeenien ja vasta-aineiden laimennokset tehtiin PBS:ään .·)·. plus 0,05 % Tween 20 ja 0,5 % BSA.
;'.tj ELISAa varten standardina käytetty CMV-glykoproteiiniseos valmistettiin infektoimalla suunnilleen 4 x 108 HF-solua ; ]· 30 CMV:llä (Towne) MOI:n arvolla 0,2. Seitsemän päivää infek-.···[ toinnin jälkeen solut hajotettiin 40 ml:ssa hajotuspuskuria (LB), mikä sisälsi 150 mM NaCl, 20 mM Tris - pH 7,5, 1 % ·· ; NP40, 0,5 % DOC, 1 mM PMSF, 1 pg/ml pepstatiinia ja 17 pg/ml aprotiniinia. Lysaatti vietiin virvilälektiini- 109604
Sepharose-4B-pylvääseen (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), mikä oli tasapainotettu LB:hen. Pylväs pestiin LBrssä plus 0,5 M NaCl ja sitoutuneet glykoproteiinit eluoitiin LB:hen plus 0,5 M NaCl ja 1,0 M alfametyylimannosidiin.
5
Ilmastettu väliaine kerättiin transfektoiduista soluista, jotka sisälsivät typistetyn gB-geenin ja se analysoitiin erittyneen gB-proteiinin läsnäolon suhteen epäsuoralla CMV:n gBrlle spesifisellä ELISA:11a. Kuten odotettiin, 10 havaittiin gB-proteiinia väliaineessa, joka oli otettu soluista, jotka ilmensivät proteiinin typistettyä versiota (pXgB7 ja pXgB8), kuten annetaan allaolevan taulukon 1 tiedoissa .
Taulukko 1 15 Typistetyn qB:n ekspressio COS-7-soluissaa
Suhteelliset absorbanssi- Vahvistus-
Plasmidi arvot kerroin pSV7d 0,03 pXgB7 0,17 5,7 20 pXgB8 1,04 34,7 ♦ _ _ ^_ _ _ __ — — _ __ __ * · * .! * a COS-7-solut transfektoitiin CMV:n gB-ekspressioplasmideilla .. . ja 72 tuntia transfektion jälkeen kerättiin ilmastettu väli- 25 aine ja gB:n läsnäolo määritettiin ELISA: 11a käyttäen hiiren -y monoklonaalista 15D8:aa. Absorbanssiarvot otettiin samanlais ten laimennosten kahden määrityksen keskiarvona, jotka määri-.·, ; tykset olivat standardikäyrän lineaarisella osalla. Standar- .···. dikäyrä johdettiin käyttäen virvilälektiinipuhdistettujen *. 30 CMV-glykoproteiinien seosta, mikä sisälsi gB:n, eristettynä infektoiduista soluista.
M : Proteolyyttisen lohkeamisen ehkäisytutkimukset. Plasmidilla * ‘ pXgB8 transformoitu CHO-solulinja (linja 67.77) erittää sekä „ 109604 lohkaistua (93 kDa ja 31 kDa) että lohkaisematonta (110 kDa) gB:n muotoa. Solulinja 67.77, joka ilmentää typistettyä eritettyä gB:n muotoa ja negatiivinen solulinja 5-5 radioleimat-tiin 35S-metioniinilla 2 tuntia DME-väliaineessa tai REM:ssa 5 (reinforced Eagle's medium), jossa ei ollut kalsiumia sekä ilman kalsiumspesifisen ionoforin A23187 lisäystä tai lisäämällä sitä lisääntyvissä pitoisuuksissa (0,062 uM - 0,25 μΜ). Soluja ajettiin leimaamattoman väliaineen kanssa 4 tuntia, lysaatit ja väliaine saostettiin immunologisesti MAb:n 10 15d8:11a, sille tehtiin käsittely 12 %:lla SDS-PAGE:lla ja autoradiografia. A23187:n annos, mikä täydellisimmällä mahdollisella tavalla estää gB:n lohkeamisen, on 0,25 μΜ. Tulokset merkitsevät selvästi, että 93 kDa:n ja 31 kDa:n gB:n loh-keamisfragmentit pyydystettiin 110 kDa:n esivaiheeseen li-15 sääntyvän lääkepitoisuuden myötä, esivaiheen lohkeamista ei kuitenkaan estetty täysin.
Nämä tulokset merkitsevät, että (i) radioimmunologisella saostuksella ja Western-blottauksella havaittu 110 kDa:n esi-20 vaihe edustaa tehottomasti lohkaistua esivaihetta eikä loh-keamistuotteiden pienentymätöntä kompleksia; (ii) lohkeamaton .·. ; esivaihe tunnistetaan konformaatiosta riippuvalla viruksen • · · ··, neutraloivalla MAb 15D8:lla, mikä havainnollistaa, että tämän tärkeän epitoopin alkuperäinen rakenne pysyy 110 kDa:n mole-25 kyylinä; ja (iii) kyky pyydystää 93 kDa:n ja 31 kDa:n loh-keamistuotteet 110 kDa-.n esivaiheeseen lääkkeen lisääntyvän pitoisuuden myötä paljastaa näiden fragmenttien esivai-he/tuote-suhteen ja havainnollistaa, että 93 kDa:n fragmentti edustaa gB:n N-päätä. 31 kDa:n molekyylien identiteetti ; 30 C-terminaalin fragmenttina paljastetaan aminohapposekvenssi- .···. analyysillä ja se kuvataan alla. Koska lohkeamaton gB-molekyyli on yksinkertaisempi puhdistaa CHO:n ilmastetusta ; väliaineesta verrattuna osittain lohkaistuun kompleksiin, jo ta nykyään puhdistetaan CHOcsolulinjasta 67.77, proteolyytti-
• · I
1 109604 41 sen lohkeamisen paikan gB-mutantti helpottaa tämän tärkeän molekyylin eristystä ja puhdistusta.
qp55:n N-terminaalin aminohapposekvenssi ja gp55:n loh 5 keamispaikan määrittäminen aB:ssä. Glykoproteiini B puhdistettiin viemällä selkeytynyt solulysaatti CMV-infektoiduista ihmisen esinahkafibroblasteista immunoaffiniteettipylvääseen, joka oli valmistettu monoklonaalisen vasta-aineen 15D8 kanssa. Pylvääseen sitoutuneet proteiinit eluoitiin 10 ammoniumtiosyanaatilla ja konsentroitiin saostamalla tri kloorietikkahapolla. Proteiinit erotettiin sitten 10 % preparatiivisella SDS-polyakryyliamidigeelillä, mitä seura si proteiinien elektroforeettinen siirtäminen Immobilon membraanille (Millipore). Membraani värjättiin Coomassie 15 sinisellä siirrettyjen proteiinien paikallistamiseksi.
Gp55-vyöhyke leikattiin ja sitä käytettiin sekvenssimääri tykseen Edmanin hajoamisella käyttäen kaasufaasin prote-iinisekvensseriä (Applied Biosystems, Foster City, CA). Fe-nyylitiohydantoiinitähteet (PTH) tunnistettiin C18-20 käänteisfaasin korkeapaineisella nestekromatografiällä. Tulokseksi saatu gp55:n N-pään aminohappojen sekvenssianalyysi on esitetty taulukossa 2 ja se paikallistaa lohkeamispaikan ’ peptidisidokseen, joka seuraa kaksiemäksisiä tähteitä Lys459 ja Arg46o· Lohkeamispaikka on esitetty kuviossa 2 tummennettu-25 na nuolena, mikä on kohdistettu Arg46o:n ja Ser461:n väliin.
* » ·
* I I
| 109604
Taulukko 2 gp55:n N-pään aminohappojen sekvenssianalyysi
Ennustettu Havaittu Saanto 5 Sykli tähdea tähde (pmol)b IS S 68 2 T T 54 3D D 63 4 G G 75 10 5 N N 50 6 N N 20c 7 A A 68 8 T T 29 9 H H 11 15 10 L L 85 a Aminohapposekvenssit perustuvat nukleotidisekvensseihin CMV:n Towne-kannasta (ks. kuvio 2).
b Pikomooleja fenyylitiohydantoiinin (PTH) aminohappoa, mitä 20 ei ole korjattu taustan tai viiveen suhteen.
c PTH-aspargiinin alhainen saanto voi merkitä glykosylaation ‘ t « läsnäoloa tässä paikassa.
• · ♦ .. . Monoklonaalisella 15D8:lla tunnistetun QB:n neutraloivan epi- ..! 25 toopin deleetiokartoitus. pXgB7:n koodittaman gB-geenin ty- k » !!! pistettyä versiota käytettiin luomaan lisää C-terminaalin de- leetioita gB:n gp55-alueella. Deleetioplasmidi pXgB16, joka . poisti 34 aminohappoa, luotiin poistamalla 102 emäsparin Sa-.···, 11/XhoI-fragmentti, joka sisälsi aminohapot 647-680.
30 Tämä DNA-fragmentti oli 5':n lähin XhoI-paikalle, mitä käy- » » tettiin pXgB7:n rakentamiseen. Toinen deleetioplasmidi pXgB17 :,! : poisti 186 emäsparin BglII/XhoI-fragmentin, joka kooditti 62 » ‘ ’ aminohappoa, jotka sisälsivät aminohapot 619-680. Täten 109604 ! pXgB16 ja pXgB17 ilmensivät 186 aminohapon (tähteet Ser46i-Asp646) ja vastaavasti 158 aminohapon (tähteet Ser46i-Ile6i8) käsiteltyjä/typistettyjä proteiineja.
5 Kolmas deleetioplasmidi pXgB18 poisti 369 aminohappoa ja se luotiin poistamalla 1106 emäsparin fragmentti pXgB8:sta sisältäen aminohapot 43-411. GB-insertti on identtinen sen kanssa, mikä kuvattiin pXgB22 varten.
10 Kyky havaita näiden typistettyjen rakenteiden ilmentymä analysoitiin tilapäisen ilmentymän jälkeen COS-7-soluissa ELISA: 11a käyttäen monoklonaalista 15D8:aa koettimena kuten kuvattiin yllä. Kuten esitetään taulukossa 3, havaittiin ilmentymä väliaineessa, joka oli pantu kuntoon soluilla, jotka oli 15 transfektoitu pXgB7:llä, kuten odotettiinkin aikaisemmista tuloksista. Ilmentymä havaittiin myös väliaineessa, joka oli pantu kuntoon näillä soluilla, jotka oli transfektoitu pXgB16:lla, joka ilmensi 186 aminohapon typistettyä gp55-fragmenttia ja pXgB18:lla, mikä ilmensi 287 aminohapon 20 gB-fragmenttia, mukaan laskematta lohkaistua signaalipepti-diä. Ilmentymistä ei havaittu väliaineessa soluista, jotka • · * · .·. : olivat saaneet ohjausplasmidin pSV7d tai soluista, joka oli saanut pXgB17:n, jonka olisi tullut ilmentää 158 aminohapon gp55-fragmenttia. Kuitenkin havaittiin ekspressio pXgB18:sta » · 25 transfektoitujen COS-solujen immunofluoresenssilla, mikä mer-kitsee, että 15D8 voi tunnistaa tämän N-terminaalin typistetyn rakenteen. Nämä tulokset merkitsevät, että 15D8-epitooppi kartoittaa 186 aminohapon gp55-fragmentissa, jota koodittavat • pXgB16 ja pXgB18 ja edelleen, että 28 aminohapon lisäpoista- : ,·. 30 misen tämän fragmentin C-päästä täytyy poistaa se epitoopin • * > osa, mikä on olennainen 15D8:n kanssa reagoimista varten.
* * » 1*1* » · 44 109604
Taulukko 3 gB:n neutraloivan epitoopin kartoitus3
Plasmidi Suhteellinen alsorbanssiarvo Ilmentymä pSV7d 0,00 5 pXgB7 0,24 + pXgB16 0,08 + pXgB17 0,00 pXgB18 0,00 +b 10 a Ks. taulukko 1, alaviite a.
b Mitattu immunofluoresenssilla.
Lisäkokeita suoritettiin käyttäen typistettyjä gB-tuotteita sen määrittämiseksi, reagoiko monoklonaalisten vasta-ainei-15 den, jotka on tuotettu CMV-glykoproteiineja vastaan, aikaisemmin merkitty gAl-gA6 (US-patentti 4,689,225) levy proteiinien kanssa, joita ylläkuvatut plasmidit ilmentävät.
Tilapäiset ilmentymiskokeet COS-soluilla, jotka oli trans-20 fektoitu plasmideilla, jotka koodittivat sekvenssejä, kuten kuvattiin pXgB17:n suhteen, joista puuttuu gB:n 289 kar- • * · boksyyliterminaalin aminohappoa, osoittivat tämän gB:n typis- » · · • tetyn johdannaisen immunofluoresenssireaktiivisuutta 10 itse- ’* näisesti saadun monoklonaalisen vasta-aineen kanssa (ks. ku-• · * *<t|* 25 vio 4 ja Banks et ai., (1989) J. Gen. Virol, (painossa). Kah-* · ;;;* deksan reaktiivisista vasta-aineista neutraloi viruksen komp- * » · * · · ' lementin läsnäollessa, kun taas yksi ei vaatinut komplement- . . tia neutralointiin.
* » · i i · • · » « « 30 Määritettiin myös, että 12 lisävasta-ainetta reagoi stabiilin * · · · solulinjan kanssa tuottaen gB-johdannaisen (pXgB8) , josta » · ’·;·* puuttui gB:n 227 karboksyyliterminaalin aminohappoa.
i » · · >11»· 45 109604 Nämä tulokset todistavat sekä gB-molekyylin identiteetin että neutraloivien alueiden sijainnin ja vahvistavat tässä kuvattujen gB:n typistettyjen proteiinien virusta neutraloivat ominaisuudet.
5
Keksinnön ylläkuvattujen suoritusmuotojen muunnokset, jotka ovat ilmeisiä niille, joilla on taitoja keksintöön liittyvillä tekniikan alueilla, ovat tarkoitetut olemaan seuraavien patenttivaatimuksien suojapiirissä.
• · * # · • * · • · * »
> I I
I i t * · » I > • * * I * l « * i t I I * • ♦ · » I I * I i » * «
I I I
I * * I > f ♦ « I * «
< * I
t I | § I * · I >
* I
I t · t » » i • t I » f · t » I » i I * • >
Claims (15)
- 46 109604
- 1. Diagnostinen reagenssi, tunnettu siitä, että se käsittää C-päästä typistetyn sytomegalo-viruksen (CMV) glykoproteiini B(gB) polypeptidin joka sisältää gp55:n neutraloivan alu- 5 een ja joka on immunologisesti reaktiokykyinen CMV:a neutraloivan vasta-aineen kanssa, jolloin typistys käsittää CMV-gB:n transmembraani-ja sytoplasma-alueiden poiston.
- 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen diagnostinen reagenssi, tunnettu siitä, että polypeptidi käsittää kuvion 2 aminohappotähteet 1 - 680. 10
- 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen diagnostinen reagenssi, tunnettu siitä, että polypeptidi käsittää kuvion 2 aminohappotähteet 461 - 680.
- 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen diagnostinen reagenssi, tunnettu siitä, että polypeptidi is käsittää kuvion 2 aminohappotähteet 461 - 646.
- 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen diagnostinen reagenssi, tunnettu siitä, että polypeptidi käsittää kuvion 2 aminohappotähteet 461 - 618.
- 6. Diagnostinen reagenssi, tunnettu siitä, että se käsittää sytomegaloviruksen (CMV) gly- ’: *'. koproteiini B(gB) polypeptidin, joka käsittää muunnetun endoproteolyyttisen lohkeamis- I · t , ; ’ paikan, niin että gB-proteiinin lohkeaminen aminohappojen 460 ja 461 välistä on estetty, ja ... että muunnos käsittää yhden tai useamman aminohapon korvauksen proteolyyttisessä loh- • # ’.. keamispaikassa tai sen läheisyydessä. 25 • I ·
- 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen gB-polypeptidi, tunnettu siitä, että yksi tai useammista . · · ·. aminohapoista arginiini, lysiini ja arginiini, jotka esiintyvät paikoissa -1, -2 ja -4 loh- • · §» · . ·". keamispaikan suhteen, on korvattu treoniinilla, glutamiinilla tai treoniinilla. « · * ‘..! 30 8. Diagnostinen reagenssi, tunnettu siitä, että se käsittää C-päästä typistetyn, CMV:n gly koproteiini B(gB) polypeptidin j oka sisältää gp5 5 :n neutraloivan alueen j a j oka on immu- | | t • · · · nologisesti reaktiokykyinen CMV:a neutraloivan vasta-aineen kanssa, jolloin typistys kä sittää CMV-gB:n transmembraani- ja sytoplasma-alueiden poiston, jolloin mainittu typis- 47 109604 tetty polypeptidi käsittää muunnetun endoproteolyyttisen lohkeamispaikan niin, että poly-peptidin lohkeaminen aminohappojen 460 ja 461 välistä on estetty, ja että muunnos käsittää yhden tai useamman aminohapon korvauksen proteolyyttisessä lohkeamispaikassa tai sen läheisyydessä.
- 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen diagnostinen reagenssi, tunnettu siitä, että fragmentti käsittää kuvion 2 aminohappotähteet 1 - 680.
- 10. Immunologinen menetelmä CMV-antigeeniä vastaan suunnattujen vasta-aineiden ίο osoittamiseksi biologisessa näytteessä, tunnettu siitä, että a) inkuboidaan biologista näytettä koetinpolypeptidin kanssa olosuhteissa, jotka sallivat vasta-aine-antigeenikompleksin muodostumisen, jolloin mainittu koetinpolypeptidi muodostuu jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukaisesta CMV-gB-polypeptidistä; ja • · · • · b) osoitetaan vasta-aine-antigeenikompleksi, joka sisältää koetinpolypeptidin. • * • is ” Patentkrav ;; 1. Ett diagnostiskt reagens, kännetecknat därav, att det omfattar en frän C-änden stympad *»* glykoprotein B(gB) polypeptid av cytomegalo viru set (CMV), vilken innehäller ett neutralist? serande omräde av gp55 och vilken är immunologiskt reaktionsduglig med en CMV-, .. * neutraliserande antikropp, varvid stympningen omfattar avlägsnande av CMV-gBs trans- membran- och cytoplasmaomräden. * · ; · 2. Diagnostiskt reagens enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att polypeptiden omfat- . * 25 tar aminosyrarestema 1 - 680 enligt figur 2.
- 3. Diagnostiskt reagens enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att polypeptiden omfattar aminosyrarestema 461 - 680 enligt figur 2.
- 4. Diagnostiskt reagens enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att polypeptiden omfat tar aminosyrarestema 461 -646 enligt figur 2. «· 109604
- 5. Diagnostist reagens enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att polypeptiden omfat-tar aminosyrarestema 461-618 enligt figur 2.
- 6. Diagnostista reagens, kännetecknat därav, att det omfattar en glykoprotein B(gB) poly-s peptid av cytomegaloviruset (CMV), vilken omfattar ett ändrat endoproteolytiskt spjälk- ningsställe sä att gB-proteinets spjälkning mellan aminosyrorna 460 och 461 är förhindrad och att ändringen omfattar ersättning av en eller flera aminosyror i det proteolytiska sp-jälkningsstället eller i dess närhet. jo 7. gB-polypeptid enligt patentkravet 6, kännetecknad därav, att en eller flera av aminosy-roma arginin, Iysin och arginin, vilka förekommer i ställena -1,-2 och -4 i förhällande tili spjälkningsstället, har ersatts med treonin, glutamin eller treonin. i * 8. Ett diagnostista reagens, kännetecknat därav, att det omfattar en fran C-änden stympad i is glykoprotein B(gB) polypeptid av CMV, vilken innehäller ett neutraliserande omrade av ‘ * gp55 och vilken är immunologista reaktionsduglig med en CMV-neutraliserande anti- 1 · kropp, varvid stympningen omfattar avlägsnande av CMV-gBs transmembran- och cyto-;;' plasmaomräden, varvid nämnda stympade polypeptid omfattar ett ändrat endoproteolytiskt spjälkningsställe sä, att polypeptidens spjälkning mellan aminosyrorna 460 och 461 är för-20 hindrad och att ändringen omfattar ersättning av en eller flera aminosyror i det proteolytiska spjälkningsstället eller i dess närhet. : ·’ 9. Diagnostista reagens enligt patentkravet 8, kännetecknat därav, att fragmenten omfattar ; ·' aminosyrarestema 1 - 680 enligt figur 2. “: 10. Immunologista förfarande för detektering av antikroppar mot CMV-antigen i ett biolo gista prov, kännetecknat därav, att man a) inkuberar det biologiska provet med en probpolypeptid under förhällanden, som tilläter bildning av ett antikropp-antigenkomplex, varvid nämnda probpolypeptid bestär av en
- 30 CMV-gB-polypeptid enligt nägot av patentkraven 1-9; och b) pävisar antikropp-antigenkomplexet, som innehäller probpolypeptiden.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14971588A | 1988-01-29 | 1988-01-29 | |
| US14971588 | 1988-01-29 | ||
| PCT/US1989/000323 WO1989007143A1 (en) | 1988-01-29 | 1989-01-26 | Recombinant cmv neutralizing proteins |
| US8900323 | 1989-01-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI903724A0 FI903724A0 (fi) | 1990-07-25 |
| FI109604B true FI109604B (fi) | 2002-09-13 |
Family
ID=22531490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI903724A FI109604B (fi) | 1988-01-29 | 1990-07-25 | Diagnostinen reagenssi, joka käsittää CMV:a neutraloivan vasta-aineen kanssa reaktiokykyisen polypeptidin, sekä immunologinen määritysmenetelmä |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6190860B1 (fi) |
| EP (2) | EP0609580B1 (fi) |
| JP (2) | JP2607712B2 (fi) |
| AT (1) | ATE246244T1 (fi) |
| AU (1) | AU641121B2 (fi) |
| CA (1) | CA1340832C (fi) |
| DE (1) | DE68929478T2 (fi) |
| DK (1) | DK176055B1 (fi) |
| FI (1) | FI109604B (fi) |
| WO (1) | WO1989007143A1 (fi) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6100064A (en) * | 1984-04-06 | 2000-08-08 | Chiron Corporation | Secreted viral proteins useful for vaccines and diagnostics |
| US6162620A (en) * | 1986-03-07 | 2000-12-19 | Cogent Limited | Processes for the production of HCMV glycoproteins, antibodies thereto and HCMV vaccines, and recombinant vectors therefor |
| US5124440A (en) * | 1986-11-24 | 1992-06-23 | The Childrens Hospital, Inc. | Antibody and T cell recognition sites on glycoproteins comprising the GCI complex of human cytomegalovirus |
| US5591439A (en) * | 1989-03-24 | 1997-01-07 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Recombinant cytomegalovirus vaccine |
| US5552143A (en) * | 1989-03-24 | 1996-09-03 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Recombinant cytomegalovirus vaccine |
| GB9008223D0 (en) * | 1990-04-11 | 1990-06-13 | Royal Free Hosp School Med | Improvements relating to the detection of viruses |
| US5997878A (en) * | 1991-03-07 | 1999-12-07 | Connaught Laboratories | Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses |
| WO1993013227A1 (en) * | 1991-12-23 | 1993-07-08 | Chiron Corporation | Cmv probes for use in solution phase sandwich hybridization assays |
| GB9409962D0 (en) * | 1994-05-18 | 1994-07-06 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| EP0852624A2 (en) * | 1995-09-26 | 1998-07-15 | University Of Washington | Glycoprotein b of the rfhv/kshv subfamily of herpes viruses |
| US6448389B1 (en) | 1996-04-23 | 2002-09-10 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Human cytomegalovirus DNA constructs and uses therefor |
| AU2172800A (en) * | 1998-12-10 | 2000-06-26 | Washington University | Protein transduction system and methods of use thereof |
| US8206749B1 (en) | 1999-02-26 | 2012-06-26 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Microemulsions with adsorbed macromolecules and microparticles |
| ES2615362T3 (es) | 2001-07-27 | 2017-06-06 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Adhesinas de meningococos |
| AU2003301148A1 (en) | 2002-12-23 | 2004-07-22 | Vical Incorporated | Codon-optimized polynucleotide-based vaccines against human cytomegalovirus infection |
| AR054822A1 (es) | 2005-07-07 | 2007-07-18 | Sanofi Pasteur | Emulsion inmuno adyuvante |
| EP2451475A2 (en) | 2009-07-06 | 2012-05-16 | Novartis AG | Self replicating rna molecules and uses thereof |
| WO2011053798A2 (en) | 2009-10-30 | 2011-05-05 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Peptide compositions and methods for inhibiting herpesvirus infection |
| MX2012007489A (es) | 2009-12-23 | 2012-11-29 | 4Antibody Ag | Miembros enlazadores para citomegalovirus. |
| EP3449910A1 (en) | 2010-07-06 | 2019-03-06 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Cationic oil-in-water emulsions |
| EP2502631A1 (en) * | 2011-03-22 | 2012-09-26 | Medizinische Hochschule Hannover | Immune suppressor and its use |
| RU2606846C2 (ru) | 2011-07-06 | 2017-01-10 | Новартис Аг | Эмульсии типа "масло в воде", которые содержат нуклеиновые кислоты |
| US9636410B2 (en) | 2011-07-06 | 2017-05-02 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Cationic oil-in-water emulsions |
| AU2012322704B2 (en) | 2011-10-11 | 2017-09-07 | Novartis Ag | Recombinant self-replicating polycistronic RNA molecules |
| ES2874233T3 (es) | 2011-11-11 | 2021-11-04 | Variation Biotechnologies Inc | Composiciones y métodos para el tratamiento de citomegalovirus |
| CN115058452A (zh) * | 2013-12-03 | 2022-09-16 | 霍欧奇帕生物科技有限公司 | Cmv疫苗 |
| US10611800B2 (en) | 2016-03-11 | 2020-04-07 | Pfizer Inc. | Human cytomegalovirus gB polypeptide |
| JP7018941B2 (ja) | 2016-06-17 | 2022-02-14 | ベーリンガー インゲルハイム アニマル ヘルス ユーエスエイ インコーポレイテッド | 直鎖または分枝ポリアクリル酸ポリマーアジュバントを含む新規な免疫原性処方物 |
| WO2020085457A1 (ja) * | 2018-10-25 | 2020-04-30 | Ｋｍバイオロジクス株式会社 | 改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質及びこれを含むＣＭＶワクチン |
| US11629172B2 (en) | 2018-12-21 | 2023-04-18 | Pfizer Inc. | Human cytomegalovirus gB polypeptide |
| US11857622B2 (en) | 2020-06-21 | 2024-01-02 | Pfizer Inc. | Human cytomegalovirus GB polypeptide |
| CN112662694A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-04-16 | 康九生物科技(长春)有限公司 | 一种麦芽糖结合蛋白、麦芽糖结合蛋白表达载体、重组工程菌及其应用 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4313927A (en) * | 1979-10-19 | 1982-02-02 | Ames-Yissum Ltd. | Immunoassay method for detecting viral antibodies in whole blood samples |
| US4554101A (en) * | 1981-01-09 | 1985-11-19 | New York Blood Center, Inc. | Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity |
| US4460689A (en) * | 1982-04-15 | 1984-07-17 | Merck & Co., Inc. | DNA Cloning vector TG1, derivatives, and processes of making |
| US4762780A (en) * | 1984-04-17 | 1988-08-09 | The Regents Of The University Of California | Method and composition for screening and diagnosing "HCMV" |
| US5173402A (en) * | 1982-11-02 | 1992-12-22 | The Regents Of The University Of California | Method and compositions for screening and diagnosing human cytomegalovirus ("hCMV") |
| US4783399A (en) * | 1984-05-04 | 1988-11-08 | Scripps Clinic And Research Foundation | Diagnostic system for the detection of cytomegalovirus |
| ATE73349T1 (de) * | 1984-06-18 | 1992-03-15 | Chiron Corp | Hepatitisoberflaechenantigenpartikelvakzin. |
| US5075213A (en) * | 1984-07-27 | 1991-12-24 | City Of Hope | Method for detection and prevention of human cytomegalovirus infection |
| US4689225A (en) * | 1984-11-02 | 1987-08-25 | Institut Merieux | Vaccine for cytomegalovirus |
| WO1987003602A1 (en) * | 1985-12-06 | 1987-06-18 | Teijin Limited | Anticytomegaloviral human monoclonal antibody and process for its preparation |
| CA1335429C (en) * | 1986-03-07 | 1995-05-02 | Geoffrey L. Smith | Processes for the production of hcmv glycoproteins, antibodies thereto and hcmv vaccines, and recombinant vectors therefor |
| DE3619720A1 (de) * | 1986-06-12 | 1987-12-17 | Behringwerke Ag | Hauptglykoprotein des menschlichen cytomegalovirus, seine herstellung und verwendung |
| US5124440A (en) * | 1986-11-24 | 1992-06-23 | The Childrens Hospital, Inc. | Antibody and T cell recognition sites on glycoproteins comprising the GCI complex of human cytomegalovirus |
| US5126130A (en) * | 1986-11-24 | 1992-06-30 | The Childrens Hospital Incorporated | Monoclonal antibodies reactive with specific antigenic sites on human cytomegalovirus glycoprotein a |
| US5403711A (en) * | 1987-11-30 | 1995-04-04 | University Of Iowa Research Foundation | Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved |
| JPH03504197A (ja) * | 1988-05-09 | 1991-09-19 | ザ・チルドレンズ・ホスピタル，インコーポレイテッド | Ｈｃｍｖ糖タンパク質をコードしているベクターおよび発現産物 |
| US5262297A (en) * | 1990-06-18 | 1993-11-16 | Eastman Kodak Company | Specific binding analytical and separation methods using carboxy containing polymers |
| WO1993013227A1 (en) * | 1991-12-23 | 1993-07-08 | Chiron Corporation | Cmv probes for use in solution phase sandwich hybridization assays |
-
1989
- 1989-01-26 AT AT93203533T patent/ATE246244T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-01-26 AU AU30413/89A patent/AU641121B2/en not_active Ceased
- 1989-01-26 EP EP93203533A patent/EP0609580B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-26 EP EP19890902156 patent/EP0436537A4/en not_active Withdrawn
- 1989-01-26 WO PCT/US1989/000323 patent/WO1989007143A1/en active IP Right Grant
- 1989-01-26 JP JP1502008A patent/JP2607712B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-26 DE DE68929478T patent/DE68929478T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-27 CA CA000589457A patent/CA1340832C/en not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-07-25 FI FI903724A patent/FI109604B/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-07-27 DK DK199001792A patent/DK176055B1/da not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-05-24 US US08/448,780 patent/US6190860B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-24 US US08/449,671 patent/US5834307A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-07-25 JP JP8196805A patent/JPH09176190A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6190860B1 (en) | 2001-02-20 |
| AU3041389A (en) | 1989-08-25 |
| JPH09176190A (ja) | 1997-07-08 |
| FI903724A0 (fi) | 1990-07-25 |
| DK179290A (da) | 1990-09-28 |
| EP0436537A1 (en) | 1991-07-17 |
| US5834307A (en) | 1998-11-10 |
| DE68929478D1 (de) | 2003-09-04 |
| DE68929478T2 (de) | 2004-04-29 |
| EP0609580B1 (en) | 2003-07-30 |
| DK176055B1 (da) | 2006-02-27 |
| DK179290D0 (da) | 1990-07-27 |
| AU641121B2 (en) | 1993-09-16 |
| CA1340832C (en) | 1999-11-30 |
| JP2607712B2 (ja) | 1997-05-07 |
| EP0609580A1 (en) | 1994-08-10 |
| EP0436537A4 (en) | 1992-04-08 |
| ATE246244T1 (de) | 2003-08-15 |
| JPH03503478A (ja) | 1991-08-08 |
| WO1989007143A1 (en) | 1989-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI109604B (fi) | Diagnostinen reagenssi, joka käsittää CMV:a neutraloivan vasta-aineen kanssa reaktiokykyisen polypeptidin, sekä immunologinen määritysmenetelmä | |
| Holland et al. | Herpes simplex virus type 1 glycoprotein C-negative mutants exhibit multiple phenotypes, including secretion of truncated glycoproteins | |
| Urban et al. | The dominant linear neutralizing antibody-binding site of glycoprotein gp86 of human cytomegalovirus is strain specific | |
| CA1335429C (en) | Processes for the production of hcmv glycoproteins, antibodies thereto and hcmv vaccines, and recombinant vectors therefor | |
| Rasmussen et al. | Antibody response to human cytomegalovirus glycoproteins gB and gH after natural infection in humans | |
| JP4365440B2 (ja) | エプスタイン−バールウイルスに関連するペプチド及び核酸配列 | |
| US4810492A (en) | Flavivirus antigen | |
| US5124440A (en) | Antibody and T cell recognition sites on glycoproteins comprising the GCI complex of human cytomegalovirus | |
| Ohlin et al. | Characterization of human monoclonal antibodies directed against the pp65-kD matrix antigen of human cytomegalovirus | |
| US5547834A (en) | Recombinant CMV neutralizing proteins | |
| US6162620A (en) | Processes for the production of HCMV glycoproteins, antibodies thereto and HCMV vaccines, and recombinant vectors therefor | |
| Wada et al. | Cytomegalovirus glycoprotein B sequence variation among Japanese bone marrow transplant recipients | |
| AU623375B2 (en) | Molecularly cloned diagnostic product and method of use | |
| US5807557A (en) | Soluble herpesvirus glycoprotein complex | |
| US20020102562A1 (en) | Recombinant CMV neutralizing proteins | |
| US6008327A (en) | Peptides and nucleic acid sequences related to the Epstein Barr virus | |
| Ayata et al. | Different antibody response to a neutralizing epitope of human cytomegalovirus glycoprotein B among seropositive individuals | |
| US6177080B1 (en) | Polypeptides encoded by Kaposi sarcoma-associated herpes virus the use thereof in diagnosis and therapy | |
| CA1338441C (en) | Expression of immunologically active proteins of human .beta.-lympho tropic virus | |
| Gretch et al. | Expression of a human cytomegalovirus glycoprotein multigene family |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: AVENTIS PASTEUR |
|
| MA | Patent expired |