FI104902B - Menetelmä sennosidien A, B ja A1 talteenottamiseksi - Google Patents

Description

104902

Menetelmä sennosidien A, B ja A1 talteenottamiseksi. - Förfarande för tillvara-tagande av sennosider A, B och A1.

Keksintö koskee tapaa uuttaa sennisideja A, B ja A1, jotka ovat oleellisen 5 vapaita sennosideista C, D ja D1 ja aloe-emodiinikomponenteista.

Sennosidit ovat laksatiivisesti vaikuttavia aineita, joita esiintyy sukujen Cassia ja Rheum kuivatuissa rohdoissa. Sennarohto koostuu sennakasvin, esimerkiksi intialaisen sennan (Cassia acutifolia) kuivatuista lehdistä ja liduista (Schoten).

10

Laksatiivisesti aktiiviset sennosidit ovat reiinistä ja aloe-emodiinista johdettuja diantroniglukosideja. Tärkeimpiä ovat sennosidit A, B, A1, C, D ja D1. Ne vastaavat kaavaa:

°·Η„06-0 O OH

15 ι<ϊιΓ"ιΓί ΟφίΤ

20 ο,η,,ο,- O o ÖH

Sennosideissa A, B ja A1 ryhmä R on COOH ja sennosideissa C, D ja D1 ryhmä R on CH2OH. Sennosidit A, B ja A1 tai C, D ja D1 ovat stereoisomeerejä ja eroavat toisistaan konfiguraation suhteen C-atomeissa 10 ja 10’.

25

Raakarohto sisältää sennosidien ohella myös aglykoneja (sennidiinejä), puoli-glykosyloituja sennidiinejä, polymeerejä, sennosidien hajoamistuotteita, aloe-emodiinia ja sen johdannaisia ja vastaavia, jotka voivat aiheuttaa ei-toivottuja sivuvaikutuksia, kuten pahoinvointia, oksentelua, ilmaa suolessa ja koliikkia.

30

Menetelmiä sennosidien uuttamiseksi sennarohdosta kuvataan esimerkiksi DE-patenttijulkaisussa B1617667, FR-patenttijulkaisussa M6611, GB-patentti-julkaisussa A832017 ja DE-patenttijulkaisussa A3200131. Näillä menetelmillä uutetut sennosidit sisältävät kulloisenkin rohdon mukaan sennosidiseosta, 2 104902 jossa on 1,5 - 5 % sennosideja C, D ja D1. Kuten edellä jo esitettiin, nämä sisältävät molekyylissään seuraavan kaavan mukaisesta aloe-emodiinista:

HO o OH

5 υόόι

Y CHjOH

O

johdetun osan. Olisi toivottavaa voida saada talteen sennosideja, jotka ovat oleellisen vapaita sennosideista C, D ja D1.

10

Sennosidien C, D ja D1 oleellisen täydellinen erottaminen sennosidiseoksesta ei ole nykyisen tekniikan tasolla tunnettua.

Tämän vuoksi keksinnön tehtävänä on antaa käyttöön tapa uuttaa sennosideja 15 A, B ja A1, jotka ovat oleellisen vapaita ei-toivotuista mukana seuraavista aineista, erityisesti sennosideista C, D ja D1.

Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisella menetelmällä, jolle on tunnusomaista, että 20 A) sennosidiseos alistetaan pelkistykselle reiini-9-antroni-8-glukosidiksi, B) suoritetaan saatujen yhdisteiden neste/neste-jako veden kanssa vain osaksi sekoittuvan, polaarisen orgaanisen liuottimen ja vesifaasin välillä, ja 25 C) jaon jälkeen vesifaasin sisältämä reiini-9-antroni-8-glukosidi hapetetaan sennosideiksi A, B ja A1, ja nämä otetaan talteen.

: Vaihe A

30

Keksinnön mukaisen menetelmän lähtöaineena käytetään yleensä sennosidi-seosta, jollaisena se esiintyy uutettaessa sennarohtoa edellä mainittujen menetelmien mukaisesti. Lähtöaineena käyttökelpoista on esimerkiksi sennosidiseos, joka saadaan DE-patenttijulkaisussa A3200131 kuvatulla tavalla. Tämän 3 104902 mukaisesti sennarohto uutetaan ensin vesipitoisella metanolilla. Metanolin täydellisen poistamisen jälkeen jäljelle jäävä konsentraatti sisältää sennosidit kaliumsuolan muodossa. Tätä konsentraattia voidaan käyttää keksinnön mukaisen menetelmän lähtöaineena.

5

Konsentraatti voidaan vielä puhdistaa neste/neste-uutolla veden kanssa osaksi liukoisilla alkoholeilla tai ketoneilla (esimerkiksi 2-butanoli, 2-butanoni, asetoni) (raffinaatti). Raffinaatti säädetään happamaksi pH-arvoon noin 1,5- 2,0, ja sennosidit saatetaan kiteytämään siemenkiteillä. Saatu raakasennosidiseos on 10 samoin keksinnön mukaisen menetelmän lähtöaineena käyttökelpoinen. Haluttaessa raakasennosidiseos voidaan vielä uudelleenkiteyttää.

Vaihtoehtoisesti voidaan lähtöaineena käyttää konsentraattia, johon on lisätty veden kanssa osaksi liukoista alkoholia tai ketonia, erityisesti 2-butanolia.

15

Sennarohdon uutossa rohdon suhde uuttoliuottimeen on edullisesti 1:4 - 1:15, erikoisesti 1:4-1:10.

Uutto suoritetaan edullisesti puskurin, esimerkiksi trinatriumsitraatin, glysiinin, 20 natriumkarbonaatin tai sakkaroosin läsnä ollessa.

Keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti nämä lähtöaineet alistetaan täy-• delliselle pelkistykselle vastaavaksi reiini-9-antroni-8-glukosidiksi (R = COOH) ja vastaavaksi aloe-emodiini-9-antroni-8-glukosidiksi (R = CH2OH), joilla on 25 kaava: c6Hii°* ~

Pelkistysreagensseja, joilla on sopiva pelkistyspotentiaali, ovat tina(ll)kloridi, rikkidioksidi, alkalimetalliboorivety ja edullisesti alkalimetalliditioniitit, erityisesti natriumditioniitti.

30 . 104902 Lähtöaine voi olla pelkistyksen suorittamista varten vesipohjaisessa liuoksessa tai suspensiossa, ja pelkistysreagenssi lisätään kiinteässä muodossa tai veteen liuotettuna. Voidaan myös, erityisesti käytettäessä sennahedelmäprimää-riuutetta, toimia DE-patenttijulkaisun A3200131 (= vesipohjainen konsentraatti) 5 mukaisesti 2-faasiseoksessa, jolloin lisätään veden kanssa osaksi sekoittuvaa, polaarista orgaanista liuotinta, erityisesti 2-butanolia tai asetonia.

Voidaan pelkistää ympäristön lämpötilassa tai korkeammassa lämpötilassa. Pelkistys suoritetaan tarkoituksenmukaisesti 40 - 60°C:ssa, erityisesti 10 50 - 55°C:ssa. Toimitaan lähtöainesennosidiliuoksen tai -suspension lievästi happamassa - lievästi alkalisessa pH-arvossa, edullisesti pH-arvossa 5 -10,5. Haluttaessa pelkistys voidaan suorittaa useita kertoja, erityisesti 2-10 kertaa.

Muodostuneet d-antroni-8-glukosidit saostetaan säätämällä happoa, esimerkik-15 si rikkihappoa lisäämällä happamaan pH-arvoon noin 2 - 4,5. Lämpötila ei tällöin tarkoituksenmukaisesti saisi olla yli 40°C. Tarkoituksenmukaisesti antroniglukosidien saostuksessa ja niiden eristyksessä (esimerkiksi suodattamalla) toimitaan typen alla, jotta vältettäisiin näiden yhdisteiden kontrolloimaton hapettuminen.

20

On oleellista, että pelkistys etenee täysin loppuun. Tämän vuoksi pelkistysrea-genssia käytetään tarkoituksenmukaisesti suuri ylimäärä. Ditioniitteja, erityisesti natriumditioniittia, käytetään yleensä 1 - 4-kertainen painomäärä lähtöainema-teriaalin sennosidien pitoisuuden perusteella. Lisäksi pelkistysreagenssin an-25 netaan vaikuttaa vähintään 2 tuntia, edullisesti vähintään 3 tuntia. Yleensä pelkistys ei kestä pitempää aikaa kuin 10 tuntia. Edullisesti suoritetaan jälkipel-kistys mainituissa olosuhteissa.

! Edullisesti saatu tuote saostetaan ennen sen käyttöä vaiheessa B, jolloin se 30 saatetaan liukenemaan vesipohjaisessa liuoksessa lisäämällä emästä (NaOH, KOH) suunnilleen pH-arvoon 6 - 7, vesipohjainen liuos uutetaan 2-butanolilla, 2-butanonilla tai asetonilla, ja tuote saostetaan jälleen säätämällä happoa lisäämällä happamaan pH-arvoon noin 2 - 4.

5 104902

Vaihe B

Tässä vaiheessa poistetaan aloe-emodiinikomponentit, erityisesti aloe-emodiini-9-antroni-8-glukosidi. Tätä varten suoritetaan saadun tuotteen 5 neste/neste-jako veden kanssa vain osaksi sekoittuvan polaarisen orgaanisen liuottimen ja vesifaasin välillä. Sopivia polaarisia orgaanisia liuottimia ovat C^-alkanolit ja di-C^-alkyyliketonit, kuten 1-butanoli, 2-butanoli, 2-butanoni ja asetoni.

10 Vesifaasiin lisätään edullisesti pelkistysreagenssia, jotta vesifaasille annettaisiin koko neste/neste-jaon ajaksi hapetus/pelkistys-potentiaali -210 mV tai negatiivisempi. Tarkoituksenmukaisesti käytetään samaa pelkistysreagenssia kuin vaiheessa A. Käytettäessä pelkistysreagenssina alkalimetalliditioniittia on mainittujen potentiaaliolosuhteiden ylläpitämiseksi yleensä riittävä 15 2 - 4-paino-%:nen liuos pH-arvossa 7 - 10,5.

Vesifaasin (painava faasi) tilavuussuhde orgaaniseen faasiin (keveä faasi) on yleensä alueella 1:5 -1:40.

20 Neste/neste-uutto tapahtuu edullisesti vastavirtaan. Antroniyhdisteiden seos lisätään tällöin pelkistyksen jälkeen saadun liuoksen muodossa, tai jos antroni-yhdisteet eristettiin, 3 -15-paino-%:isen liuoksen muodossa.

•

Jaon jälkeen haluttu reiini-9-antroni-8-glukosidi on vesifaasissa. Se saostetaan 25 säätämällä happoa lisäämällä pH-arvoon noin 2 - 4, ja otetaan talteen tavallisella tavalla.

Vaihe C

t 30 Tässä vaiheessa reiini-9-antroni-8-glukosidi hapetetaan jälleen vastaaviksi sennosidiyhdisteiksi. Sopivia hapetusreagensseja tätä varten ovat vetyperoksidi, mangaanidioksidi, permanganaatti, mangaani(ll!)asetonyyliasetonaatti.

6 104902

Edullisesti hapetus suoritetaan kuitenkin hapella. Happilähteenä voi toimia esimerkiksi ilma.

Koska reiini-9-antroni-8-glukosidi on veteen liukenematonta, se muutetaan 5 hapetusta varten liukoiseen muotoon. Tämä tapahtuu esimerkiksi siten, että se muutetaan säätämällä sopivaa emästä lisäämällä pH-arvoon noin 6-7 alkali-metallisuolaksi tai kalsiumsuolaksi. Haluttaessa voidaan liuokseen lisätä vähäinen määrä (määrään noin 30 tilavuus-%) veden kanssa vain osaksi sekoittuvaa liuotinta, erityisesti 2-butanolia.

10

Hapetus suoritetaan mahdollisimman konsentroidussa liuoksessa, koska tällä tavalla suositaan toivottujen sennosidien muodostusta. Tarkoituksenmukaisesti hapetus suoritetaan liuoksella, joka sisältää noin 250 - 300 g reiini-9-antroni-8-glukosidia/l liuotinta. Käytettäessä happea hapetusreagenssina sitä johdetaan 15 tarkoituksenmukaisesti liuoksen läpi.

Hapetusta hapella voidaan helpottaa katalysaattorilla. Sopivia katalysaattoreita ovat esimerkiksi palladiummusta tai rauta(lll)suolat, erityisesti rauta(lll)kloridi. Katalysaattorin määrä on yleensä alueella 0,2 - 2 paino-% reiini-9-antroni-8-20 glukosidin määrän perusteella, ja erityisesti alueella 0,5 -1 paino-%.

Vaihtoehtoisesti hapetus voidaan suorittaa rauta(lll)suoloilla, esimerkiksi : Fe2(S04)3:lla tai FeCI3:lla pH-arvossa 8 - 8,5. Tällöin toimitaan tarkoituksenmu kaisesti 30 - 50 °C:ssa ja trinatriumsitraatin läsnä ollessa.

25

Hapetusta suoritetaan niin pitkään ettei reiini-9-antroni-8-glukosidia enää voida osoittaa. (Antroniyhdisteiden UV-fluoresenssin puuttuminen).

Sennosidit otetaan talteen säätämällä liuoksen happamaan pH-arvoon tavalli-30 sella tavalla. Tarkoituksenmukaisesti liuos laimennetaan ennen ennen hapon lisäämistä käytettynä liuottimena (esimerkiksi vesi/2-butanoli) 2 - 3-kertaiseen tilavuuteen nykyiseen verrattuna). Tällä tavalla saavutetaan se, että sivutuotteena muodostunut reiini-8-giukosidi jää sennosidien saostuksessa suureksi osaksi liuokseen.

7 104902

Reiini-8-glukosin erotus voi myös tapahtua kalsiumsuolan kautta, koska reiini- 8-glukosidin kalsiumsuola on ei-liukoinen ja saostuu, kun taas sennosidien kalsiumsuola jää liuokseen.

5 Sennosidit seostetaan säätämällä happoa lisäämällä happamaan pH-arvoon noin 2 - 4, ja otetaan sitten tavallisella tavalla talteen.

Saatujen sennosidien kohdalla ovat yleensä kyseessä sennosidit A, B ja A1.

Ne ovat olleellisen vapaita sennosideista C, D ja D1 ja muista aloe-emodiini-10 epäpuhtauksista. Sennosidien C, D ja D1 pitoisuus keksinnön mukaisesti saatavassa tuotteessa on alle 100 ppm (määritettynä esimerkeissä mainituilla analyysimenetelmillä).

Käyttöalue, annettava annos ja sopivat annostusmuodot tunnetaan jo maini-15 tuista julkaisuista.

Seuraavat esimerkit selittävät keksintöä.

Esimerkki 1 20 Lähtöaineena käytettävän sennosidiseoksen talteenotto: : : Lisätään kulloinkin 40 kg sennarohtoa kahteen rinnan kytkettyyn perkolaatto- riin, joiden tilavuus on 250 I, ja ne peitetään revitetyllä teräslevyllä.

25

Uuton liuottimena käytetään 70-%:sta metanolia, joka johdetaan rohdolle ensimmäisessä perkolaattorissa. Ensimmäisessä perkolaattorissa muodostunut liuos johdetaan rohdolle, joka on toisessa perkolaattorissa. Tällöin liuottimen annetaan virrata vapaasti ensimmäisen perkolaattorin läpi.

30 40 sennarohto-kg:n uuttoon käytetään yhteensä 160 I liuotinta. Sen jälkeen kun tämä tilavuus 70-%:sta metanolia on johdettu molempien perkolaattorien läpi ja on koottu vastaava määrä perkolaattia, perkolaattorin tyhjennysletku yhdistetään jälkiperkolaattiastiaan, ja perkolaattorien läpi johdetaan vielä 60 170-%:sta 8 104902 metanolia. Tämän jälkeen loppu vapaa liuotin ensimmäisestä perkolaattorista johdetaan toisen perkolaattorin yläosaan ja kerätään jälkiperkolaattia, kunnes sitä on yhteensä 120 I. Tämän jälkeen ensimmäinen perkolaattori tyhjennetään, se täytetään uudelleen 40 kg:lla sennarohtoa ja pumpataan jälkiperko-5 laatii rohdon päälle, jolloin 120 I jälkiperkolaattia riittää perkolaattorissa olevan rohdon peittämiseen. Seuraavaksi liuoksen lämpötila säädetään 30°C:seen. Tämän jälkeen annetaan seistä yön yli.

Tämä perkolaatti yhdistetään aikaisemmin uutetun kanssa, ja suoritetaan uutto 10 edellä kuvatulla tavalla.

Kutakin 40 rohto-kg:tä kohden kerätään 160 I perkolaattia, josta metanoli poistetaan tyhjökiertohaihduttimella, joka on varustettu täytekappalekolonnilla. Saadaan noin 30 I pohjatuotetta.

15 Tämä konsentraatti uutetaan yhtä suurella tilavuudella 2-butanolia, joka on kyllästetty vedellä. Faasit erotetaan, ja vesifaasia käsitellään edelleen.

Vaihe A: 20 Sennosidien pelkistys reiini-9-antroni-8-alukosideiksi 1,0 I uutettua konsentraattia säädetään 48-%:lla natronlipeällä pH-arvoon 7,5.

:·. Kuumennetaan 60°C:seen, ja liuokseen lisätään sekoittaen puolen tunnin aikana 90 g natriumditioniittia kiinteässä muodossa. Lisäyksen loppuun saatta-25 misen jälkeen sekoitetaan vielä tunti. Seuraavaksi lisätään sekoittaen konsentroitua rikkihappoa pH-arvoon 2. Jäähdytetään kahden tunnin aikana huoneenlämpötilaan, suodatetaan saostunut kiteinen sakka, ja se pestään rikkidioksidi-pitoisella vedellä.

30 Haluttaessa raaka reiini-9-antroni-8-glukosidi seostetaan uudelleen. Vielä märkä suodatinkakku liuotetaan niin seokseen, jossa on 15 tilavuusosaa 2-butanolia ja 85 tilavuusosaa vettä, joka sisältää 0,5 paino-% natriumpyrosul-faattia, että lisäämällä 48-%:sta natriumhydroksidiliuosta pH-arvoon 7, saadaan : 10-%.nen liuos (paino/tilavuus). Liuos säädetään konsentroidulla suolahapolla 9 104902 happamaan pH-arvoon 2,8 tai alle, ja annetaan seistä 2 tuntia. Saostunut sakka suodatetaan pois ja pestään rikkidioksidi- tai natriumpyrosulfaattipitoisel-la vedellä ja kuivataan.

5 Saanto: 90 %.

Tällä tavalla saadulla tuotteella suoritetaan uusi pelkistus (jälkipelkistys) seu-raavalla tavalla: 10 3,0 g raakaa kuivattua reiini-9-antroni-8-glukosidia tai vastaava määrä kosteaa tuotetta liuotetaan yhdessä 1,4 g:n kanssa natriumditioniittia ja 2,3 ml:n kanssa 5N NaOH:ta 15 ml:aan vettä. Seuraavaksi täytetään vedellä 24 ml:aan, ja liuosta lämmitetään 24 tuntia 55°C:ssa. Tämän jälkeen lisätään edelleen 1,5 g natriumditioniittia, ja lämmitetään 20 min 55°C:ssa. Seuraavaksi lisätään 0,9 ml 15 5N NaOH:ta ja 1,5 g natriumditioniittia. 20-min 55°C:seen lämmityksen jälkeen lisätään vielä kerran 0,9 ml 5N NaOH:ta. Saatu liuos johdetaan suoraan seu-raavaan neste/neste-uuttoon.

Vaihe B: 20 Aloe-emodiinikomoonenttien erottaminen

Aloe-emodiinikomponenttien erottaminen tapahtuu 9-antroni-8-glukosidien ·. neste/neste-jaolla vastavirrassa laitteen avulla, jossa on 60 sekoitin/erotin- yksikköä ("Mixer-Settler"-laite). Vesipohjaisena, raskaana faasina käytetään 25 liuosta, jossa on 3,0 g natriumditioniittia 3,5 ml:ssa 5N NaOH:ta ja 96 ml:ssa vettä. Orgaanisena, keveänä faasina käytetään (vedellä kyllästettyä) 2-buta-nolia tai asetonia. Molemmat faasit lähetetään laitteen läpi niin, että raskaan faasin tilavuussuhde keveään faasiin on 1:10.

30 Erotettava seos johdetaan laitteeseen tuoreen pelkistetyn liuoksen muodossa tai vastaavan pH-arvon ja vastaavan konsentraation omaavan liuoksen muodossa, jotka sisältävät vaiheesta A saatua 9-antroni-8-glukosidia, ja siten, että erotettavan seoksen tilavuusosaa kohden käytetään 30 tilavuusosaa orgaanis-: ta faasia.

10 104902

Seoksen sisältävän liuoksen pH-arvo pidetään glysiinipuskurin avulla 9 - 9,5:ssä. Puskuria, jossa on 3 tilavuusosaa 7,5-%:sta glysiiniliuosta ja 1 tila-vuusosa 1N NaOH:ta, lisätään määrä 240 ml puskuriliuosta/150 g raakaa reiini- 9-antroni-8-glukosidia. Ei-toivotut aloe-emodiiniyhdisteet rikastuvat orgaani-5 seen faasiin, kun taas reiini-9-antroni-8-glukosidi jää vesifaasiin. Vesifaasi säädetään rikkihapolla happamaksi pH-arvoon 2,8, muodostunut sakka suodatetaan ja pestään vedellä ja asetonilla, ja kuivataan ilmassa ympäristön lämpötilassa. Tällä tavalla saadaan reiini-9-antroni-8-glukosidia, jonka aloe-emodiini-komponenttien pitoisuus on 49 ppm (määritettynä aloe-emodiinina).

10 Saanto 97 %, reiini-9-antroni-8-glukosidin perusteella.

Vaihe C:

Reiini-9-antroni-8-qlukosidien hapetus 15 18,8 g saatua reiini-9-antroni-8-glukosidia liuotetaan 56 ml:aan vettä ja 11 ml:aan 2-butanolia, jolloin lisätään 17 N NaOH:ta pH-arvoon 6,5. Tämän liuoksen läpi puhalletaan sylinterinmuotoisessa astiassa lasisulatteen (Glasfritte) avulla 5 tunnin ajan sekoittaen ilmaa. Ilman virtausnopeus on 40 ml/min. Hapetuksen kulkua seurataan HPLC:n avulla.

20

Kun enää ei voida osoittaa reiini-9-antroni-8-glukosidia, liuos laimennetaan noin 200 ml:ksi vesi/butanoli 56/11 :llä. Säädetään konsentroidulla suolahapolla happamaan pH-arvoon 1,5 - 2,0, sekoitetaan 2 tuntia ympäristön lämpötilassa, suodatetaan saostuneet kiteet pois, ja ne pestään vedellä ja asetonilla ja kuiva-25 taan. Saadaan 14,4 g (76 %) puhdasta sennosidiseosta, jossa on pitoisuus 41 ppm aloe-emodiinikomponentteja (määritettynä aloe-emodiinina) vaiheessa C, esimerkki 2, esitetyn analyysimenetelmän mukaisesti.

Esimerkki 2 30

Toistetaan esimerkissä 1 kuvattu menetelmä, jolloin hapetus vaiheessa C suoritetaan kuitenkin seuraavalla tavalla: 150 g puhtaita reiini-9-antroni-8-glukosideja ja 75 g rauta(lll)kloridiheksahyd-raattia liuotetaan 480 ml.aan vettä ja 120 ml:aan 2-butanolia. Lisätään H 104902 48-%:sta natriumhydroksidiliuosta pH-arvoon 6,5 ja kunnes reiini-9-antroni-8-glukosidi on liuennut. Liuos lisätään astiaan, jossa on sintteripohjalevy. Seuraa-vaksi liuoksen läpi johdetaan voimakas ilmavirta. Hapetus on edennyt loppuun noin 30 min kuluttua. Seuraavaksi liuos laimennetaan seoksella, jossa on 5 120 ml 2-butanolia ja 480 ml vettä, lisätään 7,5 g natriumditioniittia ja sääde tään liuoksen pH konsentroitua suolahappoa lisäämällä happamaan pH-arvoon 2,0. Liuosta sekoitetaan 18 tuntia. Seuraavaksi suodatetaan pois saostunut sakka, pestään 600 ml:lla vettä ja 800 ml:lla asetonia, ja kuivataan. Tuotteen antranoidiyhdisteiden pitoisuus on välillä 94 ja 95 %.

10

Tuote otetaan 200 ml:aan 2-butanolia ja seostetaan 800 ml:lla vettä ja lisäten 5,5 g natriumpyrosulfiittia. Saostuneen sakan pois suodattamisen ja kuivaamisen jälkeen saadaan 95,4 g antranoidiyhdisteiden tuotetta, jolla on seuraava koostumus (HPLC:n mukaan, tyypillisen kokeen analyysi): 15

Reiini-8-glukosid 1,5 %

Sennosidi B 49,7 %

SennosidiAl 13,3%

Sennosidi A 33,6 % 20 Sennidiinimonoglukosidi 1,1 %

Reiini 0.02 % 99,22 % • 25 HPLC:n avulla ei voitu osoittaa sennosideja C ja D eikä aloe-emodiiniglukosi-dia. Aloe-emodiinin ja sen johdannaisten kokonaispitoisuus määritettiin seuraa-vien menetelmien mukaisesti 30 ppmiksi.

Sennosideja C, D ja aloe-emodiini-8-glukosidia ei voida enää ppm-alueella 30 määrittää HPLC:n avulla luotettavasti sennosideiksi. Tämän vuoksi vaaditaan tutkittavan aineen muuttamista rauta(lll)kloridilla hapettamalla ja samanaikaisella hydrolyysillä suolahapolla vesipohjaisen liuoksen ja hiilitetrakloridin 2-faasiseoksessa reiiniksi tai aloe-emodiiniksi. Reiini muuttuu tällöin suolaksi niin, että se voidaan uuttaa vesifaasiin, ja aloe-emodiini voidaan määrittää orgaani- 12 104902 sessa faasissa HPLC:n avulla. Tällä lailla voidaan ilmoittaa sennosidien C, D, aloe-emodiini-8-glukosidien ja muiden aloe-emodiinikomponenttien kokonaispitoisuus aloe-emodiinina ilmoitettuna.

5 Esimerkki 3

Toistetaan esimerkissä 1 kuvattu sennarohdon uutto ja sennosidien pelkistys. Sitten suoritetaan jälkipelkistys seuraavalla tavalla: 10 14,0 g sakkaroosia, 4,5 g natriumditioniittia (85-%) ja 13,3 g kaliumasetaattia liuotetaan 133 ml:aan vettä ja lisätään 1,3 ml 48-%:sta natriumhydroksidiliuosta ja 17,3 g kaliumkarbonaattia. Seuraavaksi sekoitetaan 293 ml.n kanssa asetonia ja 50 ml:n kanssa vettä. Seosta ravistellaan erotussuppilossa ja erotetaan faasit, jolloin saadaan 373 ml yläfaasia (asetonifaasi) ja 130 ml alafaasia.

15 98 ml:aan alafaasia liuotetaan 1,4 ml 48-%:sta natriumhydroksidiliuosta ja 10 g raakaa reiini-9-antroni-8-glukosidia. Lämmitetään 45 - 50°C:seen ja pidetään tässä lämpötilassa 20 - 30 min ajan. Seuraavaksi lisätään 1,0 ml 48-%:sta natriumhydroksidiliuosta ja 3,4 g natriumditioniittia ja lämmitetään edelleen 20 20 - 30 min 45 - 50°C:seen. Seuraavaksi lisätään uudelleen 1,0 ml 48-%:sta natriumhydroksidiliuosta ja 3,4 g natriumditioniittia ja lämmitetään 20 - 30 min ajan 45 - 50°C:seen.

Aloe-emodiinikomponentin erotus tapahtuu pelkistetyn liuoksen neste/neste-25 jaolla vastavirtaan edellä mainittua yläfaasia (asetonifaasia) vastaan. Pois juokseva, reiini-9-antroni-8-glukosidin sisältävä raffinaattifaasi haihdutetaan 400 ml:aan ja sekoitetaan 20 ml.n kanssa 2-butanolia tai asetonia. Säädetään suolahapolla tai rikkihapolla happamaksi pH-arvoon 4,0 - 4,2. Muodostunut sakka suodatetaan, pestään 40 ml:lla vettä ja 30 ml:lla asetonia, ja kuivataan 30 seuraavaksi. Seuraava hapetus tapahtuu esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.

13 104902

Esimerkki 4

Sennarohdon uuton jälkeen saatu konsentraatti sekoitetaan noin 2 I n kanssa 2-butanolia. Sennahedelmäkonsentraatti/2-butanoli-seoksen pelkistys suorite-5 taan sitten 7 vaiheessa suojakaasuna olevan typpikaasun alla. Pelkistysvai-heen I jälkeen tapahtuu raa'an reiini-9-antroni-8-glukosidin saostus.

Pelkistvsvaihe I

10 1001 sennahedelmäkonsentraatti/2-butanoli-seosta, joka sisältää noin 4 kg sennosidia, lisätään sekoitusastiaan ja sen päälle johdetaan typpeä. Lisätään sekoittaen 6 120-%:sta (paino) natronlipeää, sen jälkeen 350 I vedellä kyllästettyä 2-butanolia (esimerkiksi vaiheesta II) peräjälkeen, ja sekoitetaan 15 min.

Erä kuumennetaan 42 - 50°C:seen ja sekoitetaan 7 kg:n kanssa natriumditio-15 niittiä. Sekoitetaan vielä 45 min. pH-arvo pidetään 20-%:lla (paino) natronlipeäl-lä pH-arvossa 7,5 - 8. Pelkistyspotentiaali (Ag/AgCI-elektrodia vastaan) pidetään vaadittaessa natriumditioniittilisäyksellä alle -630 mV.ssa. 30 - 33°C:seen jäähdyttämisen jälkeen saostetaan 1,5 tunnin sisällä 10-%:lla (paino) rikkihapolla pH-arvoon < 4. Muodostunutta suspensiota sekoitetaan pienellä sekoitus-20 nopeudella < 25°C:ssa 10 tunnin ajan. Muodostunut sakka suodatetaan pois. Sakka suspendoidaan 60 liaan 15-%:sta (paino) 2-butanolia, sekoitetaan 30 min 50 - 60°C:ssa ja suodatetaan seuraavaksi. Jäännös pestään 100 Lila >. demineralisoitua vettä. Reiini-9-antroni-8-glukosidin raakasaanto käytettyjen sennosidien perusteella on yli 82 %.

25

Pelkistvsvaihe II

3,3 kg raakaa reiini-9-antroni-8-glukosidia vaiheesta I suspendoidaan seokseen, jossa on 42 I demineralisoitua vettä ja 7,412-butanolia. Suspensio liuote-30 taan 2 lilla 20-%:sta (paino) natronlipeää ja 9,9 kgiliä trinatriumsitraattia ja sekoitetaan tämän jälkeen 3,3 kgin kanssa natriumditioniittia ja 350 Iin kanssa vedellä kyllästettyä 2-butanolia (esimerkiksi vaiheesta III). Erä kuumennetaan 42 - 45°C:seen. pH pidetään 20-%isella (paino) natronlipeällä pH-arvossa » 14 104902 8,5 - 9. Pelkistyspotentiaali (Ag/AgCI-elektrodia vastaan) pidetään tarpeen mukaan natriumditioniittilisäyksellä alle -750 mV:ssa.

Noin 30 min seisomisen jälkeen yläfaasi poistetaan, ja alafaasi käsitellään 5 edelleen vaiheessa III.

Pelkistvsvaihe III

Alafaasilla vaiheesta II toistetaan vaiheessa II kuvattu pelkistys/uutto-menetel-10 mä seuraavat kemikaalit lisäten: 1,65 kg natriumditioniittia 0,8 I 20-%:sta (paino) natronlipeää 350 I vedellä kyllästettyä 2-butanolia 15 (esimerkiksi vaiheesta IV)

Pelkistvsvaiheet IV - VII

Alafaasilla kulloinkin edeltävästä vaiheesta toistetaan vaiheessa II kuvattu 20 pelkistys/uutto-menetelmä seuraavat kemikaalit lisäten: 0,825 kg natriumditioniittia ·. 0,4 I 20-%:sta (paino) natronlipeää 350 I vedellä kyllästettyä 2-butanolia 25 (esimerkiksi kulloinkin seuraavasta vaiheesta - vastavirtaperiaate)

Vaiheessa VII erotettu alafaasi jäähdytetään 30 - 35°C:seen, ja reiini-9-antroni-8-glukosidi saostetaan - kuten vaiheessa I kuvataan. Muodostunut sakka suodatetaan ja pestään 100 lilla demineralisoitua vettä. Seuraavaksi peitetään 30 10 lilla rauta(lll)sulfaattiliuosta (28 kg Fe2(S04)3 100 l:ssa demineralisoitua H20:ta).

Sitten reiini-9-antroni-8-glukosidi muutetaan sennosidiksi esimerkissä 1 tai 2 : kuvatulla tavalla sennosideiksi.

is 104902

Esimerkki 5

Reiini-9-antroni-8-glukosidin hapetus voi tapahtua myös seuraavalla tavalla: 5 6,0 kg suodatinkosteaa reiini-9-antroni-8-glukosidia sekoitetaan 12,6 kg:n kanssa trinatriumsitraattia. Tämä seos liuotetaan voimakkaasti sekoittaen 7.0 haan 1N NaOH.ta ja sekoitetaan 0,7 l:n kanssa 2-butanolia. Seuraavaksi sekoitetaan 8,8 l:n kanssa rauta(lll)sulfaattiliuosta (28 kg Fe2(S04)3100 hssa demineralisoitua H20:ta) samoin kuin 20-%:isen NaOH:n kanssa niin, että 10 pH-arvo on noin 8,3. Annetaan reagoida 3-4 tuntia noin 40°C:ssa, säädetään 52-%:isella H2S04:llä happamaan pH-arvoon 1,8 - 2,0, ja jatkokäsitellään kuten esimerkissä 1.

Esimerkki 6 15

Vaihtoehtoisesti reiini-9-antroni-8-glukosidi 50 mhssa vettä saatetaan liuokseen lisäämällä kalsiumhydroksidi/sakkaroosi-liuosta (valmistettu suspendoimalla 7.0 g kalsiumhydroksidia liuokseen, jossa on 30,0 g sakkaroosia 100 mhssa H20:ta ja poistamalla liukenemattoman kalsiumhydroksidin). Siihen lisätään 20 20 ml 2-butanolia, ja liuoksen läpi johdetaan 90 min aikana voimakas ilmavirta.

Lisätään 5,0 g CaCI2-2H20:ta, ja säädetään pH kalsiumhydroksidi/sakkaroosi-liuoksella emäksiseen pH-arvoon 8,5. Muodostunut sakka suodatetaan, ja suodos laimennetaan H,0:lla 340 mhksi, sekoitetaan 60 mhn kanssa 2-butano-lia ja säädetään konsentroidulla suolahapolla happamaan pH-arvoon 2,0.

25 Edelleenkäsittely tapahtuu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Farmaloaiset tutkimukset *

Laksatiivinen vaikutus 30

Keksinnön mukaisen sennosidiseoksen laksatiivinen vaikutus määritettiin hiirillä. Käytettiin koiraspuolisia NMRI i-hiiriä, joita pidettiin kokeiden aikana pleksi-lasihäkeissä ja jotka saivat tahnamaisen konsistenssin omaavaa vakiorehu- 16 104902 seosta vesijohtoveden kanssa (1:1). Kokeiden aikana ei tapahtunut erillistä juomaveden lisäystä.

Eläimet saivat 100, 200 ja 400 mg/kg sennosidiseosta 10 ml:ssa 0,5-%:sta 5 NaHC03:a/kg mahaletkulla.

Testattavien yhdisteiden annon jälkeen kerättiin eläinten uloste ja virtsa 24 tunnin aikana ja määritettiin. Saadut tulokset esitetään yhteenvetona seuraavassa taulukossa perustuen kg:hen kilonpainoa.

10

On selvää, että sennosideilla on hyvä laksatiivinen vaikutus, joka alkaa suhteellisen nopeasti. Aika ensimmäisen pehmeän ulosteen ilmenemiseen (2 tuntia) voidaan kuitenkin vielä yhdistää aikaisempaan kuljetukseen ohutsuoleen ja sennosidien avautumiseen ohutsuolen flooran kautta. Esiintyy annoa/vaikutus-15 suhde.

Akuutti toksisuus:

Kulloinkin 10 koiras-ja naaraspuoliselle Wistar-rotalle annettiin ruokintaletkulla 20 kerralla sennosideja annoksena 2 000 - 25 000 mg/kg.

Rotilla ei voitu havaita aineesta riippuvia makroskooppisia elinvaurioita. Saadut ·. LD50-arvot ovat: + 840) 25 koiraspuoliset rotat: 5 200 - 720 ) mg/kg + 380) naaraspuoliset rotat: 3 530 - 340 ) mg/kg.

30 Koiras- ja naaraspuolisilla hiirillä (n = 8, kanta NMRI) suurin annettavissa oleva annos 5 000 mg/kg ei johtanut yhteenkään kuolemantapaukseen. Kaikilla hiirillä ilmeni ripulia, vaikkakin vähäisemmässä määrin kuin rotilla. LDS0-arvot olivat molemmilla sukupuolilla > 5 000 mg/kg.

17 104902

Taulukko

Keksinnön mukaisen sennosidiseoksen laksaatiivinen vaikutus hiirillä 5 Pehmeä uloste

Normaalien Pehmeiden yksikössä %

Annos Eläinten ulostepellettien ulostepellettien kokonaisulos- (mg/kg) lukumäärä lukumäärä lukumäärä teenerityksestä 0 30 1265 0 0 10 100 40 587 144 28,0 200 30 223 239 56,0 400__30__236__282__60,0 • · · • ·

Claims (10)

1. Menetelmä sennosidien A, B ja A1 talteenottamiseksi, joilla sennosideilla on kaava: 5 ο,η,,ο,-Ρ 9 ,OH

10 QyO C6HiiOs- O O OH ja jotka ovat oleellisen vapaita sennosideista C, D ja D1 ja aloe-emodiinikom-ponenteista, tunnettu siitä, että 15 A) sennosidiseos alistetaan pelkistykselle reiini-9-antroni-8-glukosidiksi ja aloe-emodiini-9-antroni-8-glukosidiksi, B) suoritetaan saatujen yhdisteiden neste/neste-jako veden kanssa vain osaksi 20 sekoittuvan polaarisen orgaanisen liuottimen ja vesifaasin välillä, ja C) jaon jälkeen vesifaasin sisältämä reiini-9-antroni-8-glukosidi hapetetaan jälleen vastaaviksi sennosideiksi, ja nämä otetaan talteen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sennosi diseos on saatavissa uuttamalla sennarohtoa vesipitoisessa metanolissa, edullisesti puskurin läsnä ollessa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vai-30 heessa A käytetään pelkistysreagenssina alkalimetalliditioniittia.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toimitaan pH-arvossa 5 -10,5. • · 104902

5. Yhden edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa 6 käytetään polaarisena orgaanisena liuottimena 2-buta-nolia.

6. Patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vai heessa B käytetään polaarisena orgaanisena liuottimena asetonia.

7. Yhden edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa B käytetään vesifaasia, jonka hapetus/pelkistys-potentiaali 10 on -210 mV tai negatiivisempi.

8. Yhden edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että neste/neste-jako vaiheessa B suoritetaan vastavirtaan.

9. Yhden edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapetus vaiheessa C suoritetaan hapella tai rauta(lll)suolalla.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapetus hapella suoritetaan heikosti happamassa pH-arvossa tai katalysaattorin, erityi-20 sesti rauta(lll)suolan läsnä ollessa. • · • · 20 104902