FI104898B - Menetelmä terapeuttisesti aktiivisen metallikompleksiyhdisteen valmistamiseksi - Google Patents

Description

, 104898

Menetelmä terapeuttisesti aktiivisen metallikompleksiyh-disteen valmistamiseksi

Jakamalla erotettu hakemuksesta 906368 5 Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti aktiivi sen metalli- kompleksiyhdisteen valmistamiseksi, jonka muodostaa kaavan (IA)

Q

/"3 10 ,-ζ V \ / R2-// \\-CCH2)-c-N K-a >=/ ";

Q

15 mukainen yhdiste, jossa kaavassa kukin Q on itsenäisesti vety tai (CHR5)pC02R, Q1 on vety tai C02R, kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, 20 sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q ja Q1 on muita kuin vetyjä ja että kun Q1 on vety niin R3 on muu kuin vety, kukin R5 on itsenäisesti vety tai C1.4-alkyyli, n on kokonaisluku nollasta viiteen, : 25 p on 1 tai 2, R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikar-batsido-, tiosemikarbatsido-, maleimido-, bromiasetamido-tai karboksyyliryhmä, R3 on C^-alkoksi, -0CH2C02H, hydroksi tai vety, 30 R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikar-*!' batsido-, tiosemikarbatsido-, maleimido-, bromiasetamido- tai karboksyyliryhmä, sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety, 2 104898 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola kompleksoi-tuneena metalli-ionin kanssa, joka on La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y tai Se.

Funktionaalisia ryhmiä sisältävien kelaatinmuodos-5 tajien, tai bifunktionaalisten koordinoivien yhdisteiden, tiedetään kykenevän sitoutumaan kovalenttisesti vasta-aineeseen, joka on spesifinen syöpä- tai kasvainsolujen epi-tooppien tai antigeenien suhteen. Sellaisten vasta-aine-kelaatinmuodostajakonjugaattien radionuklidikompleksit 10 ovat käyttökelpoisia diagnostisissa ja/tai terapeuttisissa sovellutuksissa keinona kuljettaa radionuklidi syöpä- tai kasvainsoluun. Tutustukaa esimerkiksi artikkeleihin Meares et ai., Anal. Biochem. 142 (1984) 68 - 78 ja Krejcarek et ai., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 77 (1977) 581 -15 585.

Kelaatteja muodostavia aminokarboksyylihappoja on tunnettu ja tutkittu monta vuotta. Tyypillisiä aminokarboksyylihappoja ovat nitriilietikkahappo (NTA), etyleeni-diamiinitetraetikkahappo (EDTA), hydroksietyylietyleenidi-20 amiinitrietikkahappo (HEDTA), dietyleenitriamiinipenta- etikkahappo (DTPA), trans-1,2-diaminosykloheksaanitetra-etikkahappo (CDTA) ja 1,4,7,10 -tetra-atsasyklododekaani-tetraetikkahappo (DOTA). Lukuisia aminokarboksyylihappo-pohjaisia bifunktionaalisia kelaatinmuodostajia on esitet-; ' ' 25 ty ja valmistettu. On esimerkiksi raportoitu DTPA:n sykli sestä dianhydridistä [Hnatowich et ai., Science 220 (1983) 613 - 615; US-patenttijulkaisu 4 479 930] ja DTPA:n kar-boksihiilihapposeka-anhydrideistä [Gansow, US-patenttijulkaisut 4 454 106 ja 4 472 509; Krejcarek et ai., Biochem. 30 and Biophys. Res. Comm. 77 (1977) 581 - 585]. Liitettäessä \* anhydridejä proteiineihin liittyminen tapahtuu amidisidok- sen muodostumisen kautta, jolloin jäljelle jää siis neljä dietyleenitriamiinirungon (DETA-rungon) alkuperäisistä viidestä karboksimetyyliryhmästä [Hnatowich et ai., Int. 35 J. Appi. Isot. 33 (1982) 327 - 332]. US-patenttijulkai- 3 104898 suissa 4 432 907 ja 4 352 751 on lisäksi esitetty bifunk-tionaalisia kelaatinmuodostajia, jotka soveltuvat metalli-ionien sitomiseen "orgaanisiin spesieksiin, kuten esimerkiksi orgaanisiin kohdemolekyyleihin tai vasta-aineisiin".

5 Samoin kuin edellä liittäminen tapahtuu amidiryhmän kautta diaminotetraetikkahappojen dianhydridejä hyväksi käyttäen. Esimerkkejä anhydrideistä ovat EDTA:n, CDTA:n, propyleeni-diamiinitetraetikkahapon ja fenyleeni-1,2-diamiinitetra-etikkahapon dianhydridit. Tuoreessa US-patenttijulkaisussa 10 4 647 447 on esitetty useita kompleksisuoloja, jotka on muodostettu komplekseja muodostavan hapon anionista, erilaisissa diagnosointitekniikoissa käyttäviksi. Konjugaation mainitaan tapahtuvan kompleksin muodostavan hapon karboksyyliryhmän kautta, mikä johtaa sitoutumiseen amidi-15 sidoksen välityksellä.

Paik et ai. ovat julkaisussa J. of Radioanalytical Chemistry 57 (1980), nro 12, 553 - 564 tuoneet esiin p-nitrobentsyylibromidin käytön reaktiossa "suojatun" di-etyleenitriamiinin kanssa, so. bis (2-ftaiimidoetyyli) amii-20 nin kanssa, jota reaktiota seuraavat suojauksenpoistotoi- menpiteet ja karboksimetylointi kloorietikkahappoa käyttäen, jolloin saadaan N'-p-nitrobentsyylidietyleenitriamii-ni-Ν,Ν,Ν'',N'1-tetraetikkahappoa. Koska sitoutuminen tapahtuu typen kautta, saadaan tässäkin tapauksessa tetra-; 25 etikkahappojohdannainen. Julkaisussa käsitellään bifunk- tionaalisen kelaatinmuodostajan konjugoitumista ja kela-toitumista indiumin kanssa. Typpiatomiin tapahtuvaa substituutiota kuvaavat myös Eckelman et ai. julkaisussa J. of Pharm. Sei. 64 (1975), nro 4, 704 - 706, joka substituutio « 30 tapahtuu antamalla amiinien, kuten esimerkiksi "etyleeni-diamiinin tai dietyleenitriamiinin reagoida asianmukaisen alkyylibromidin kanssa ennen karboksimetylointia". Yhdisteitä on ehdotettu potentiaalisiksi radiofarmaseuttisessa kuvauksessa käytettäviksi aineiksi.

4 104898

Myös eräs toinen aminokarboksyylihappofunktionaali-suuteen perustuva bifunktionaalisten kelaatinmuodostajien ryhmä on kirjallisuudessa hyvin dokumentoitu. Sundberg, Meares et ai. ovat julkaisussa J. of Med. Chem. 17 (1974), 5 nro 12, 1304 esittäneet EDTA:n bifunktionaalisia analogeja. Tyypillisiä esimerkkejä näistä yhdisteistä ovat 1-(p-aminofenyyli)etyleenidiamiinitetraetikkahappo ja 1-(p-bentseenidiatsonium)etyleenidiamiinitetraetikkahappo. Julkaisussa käsitellään liittymistä proteiineihin para-10 substituentin kautta ja radioaktiivisten metallien sitoutumista kelaatin muodostavaan ryhmään. Yhdisteitä on esitetty myös julkaisussa Biochemical and Biophysical Research Communications 75 (1977), nro 1, 149 sekä US-pa-tenttijulkaisuissa 3 994 966 ja 4 043 998. On tärkeätä 15 huomata, että aromaattisen ryhmän sitoutuminen EDTA-raken-teeseen tapahtuu etyleenidiamiinirungon hiiliatomin kautta. Optisesti aktiivisia bifunktionaalisia kelaatinmuodostaj ia, joiden perustana on EDTA, HEDTA tai DTPA, on esitetty US-patenttijulkaisussa 4 622 420. Näissä yhdisteissä 20 alkyleeniryhmä yhdistää aromaattisen ryhmän (joka sisältää proteiiniin liittymiseksi tarpeellisen funktionaalisen ryhmän) funktionaalisen kelaatinmuodostusryhmän sisältävän polyamiinin hiileen. Muita lähteitä, joissa sellaisia yhdisteitä käsitellään, ovat Brechbiel et ai., Inorg. Chem.

: 25 25 (1986) 2772 - 2781, US-patenttijulkaisu 4 647 447 ja kansainvälinen patenttijulkaisu WO 86/06384.

Vielä vähemmän aikaa sitten on US-patenttijulkaisussa 4 678 667 ja julkaisussa Moi et ai., Inorg. Chem. 26 (1987) 3458 - 3463 tuotu esiin eräitä makrosyklisiä bi- 30 funktionaalisia kelaatinmuodostajia sekä niiden kuparike-'/ laattikonjugaattien käyttö diagnostisissa tai terapeutti sissa sovellutuksissa. Funktionaalisen aminokarboksyyli-happo-osan liittyminen bifunktionaalisen kelaatinmuodosta-jamolekyylin muuhun osaan tapahtuu syklisen polyamiinirun-35 gon rengashiiliatomin kautta. Yhdistävä ryhmä, joka on 5 1G4898 - toisesta päästään sitoutunut syklisen polyamiinin rengas-hiileen, on myös siten sitoutunut toisesta päästään funktionaaliseen ryhmään, joka kykenee reagoimaan proteiinin kanssa.

5 Erään toisen, myös huomionarvoisen, bifunktionaa listen kelaatinmuodostajien ryhmän muodostavat yhdisteet, joissa molekyylin kelaatin muodostava osa, so. aminokar-boksyylihappo, on liittynyt typen kautta sellaisen molekyylin funktionaaliseen ryhmään, joka sisältää proteiinin 10 kanssa reaktiokykyisen osan. Esimerkiksi Mikola et ai. ovat esittäneet patenttihakemuksessaan (kansainvälinen julkaisunumero W0 84/03698, julkaistu 27. 9. 1984) bifunk-tionaalisen kelaatinmuodostajan, joka valmistetaan antamalla p-nitrobentsyylibromidin reagoida DETA:n kanssa, 15 jota reaktiota seuraa reaktio bromietikkahapon kanssa ami-nokarboksyylihapon aikaansaamiseksi. Nitroryhmä pelkistetään vastaavaksi amiiniryhmäksi ja muunnetaan sitten reaktiolla tiofosgeenin kanssa isotiosyanaattiryhmäksi. Nämä yhdisteet ovat bifunktionaalisia kelaatinmuodostajia, jot-20 ka kykenevät muodostamaan lantanidien kanssa kelaatteja, jotka voidaan konjugoida bio-orgaanisiin molekyyleihin diagnostisina aineina käyttöä varten. Koska molekyylin kytkentäosan sitoutuminen tapahtuu jonkin aminokarboksyy-lihapon typen kautta, menetetään yksi potentiaalinen kela-; 25 toituva aminokarboksyyliryhmä. Saadaan siis valmistetuksi DETA-pohjäinen bifunktionaalinen kelaatinmuodostaja, joka sisältää neljä (eikä viisi) happoryhmää. Tässä suhteessa tähän ryhmään kuuluva kelaatinmuodostaja on samanlainen kuin ne, joiden liittyminen proteiiniin tapahtuu amidiryh- t 30 män välityksellä, mistä on seurauksena kelaatin muodosta-T van karboksyyliryhmän menetys.

Carney, Rogers ja Johnson esittivät hiljattain (3rd International Conference on Monoclonal Antibodies for Cancer, San Diego, Kalifornia, 4. - 6. 2. 1988) tiivistel-35 mät, joiden otsikot olivat "Absence of Intrinsically « 104898

Higher Tissue Uptake from Indium-111 Labeled Antibodies: Co-administration of Indium-111 and Iodine-125 Labeled B72.3 in a Nude Mouse Model" ja "Influence of Chelator Denticity on the Biodistribution of Indium-ill Labeled 5 B72.3 Immunoconjugates in Nude Mice". Ne paljastavat bi- funktionaalisen EDTA- ja DTPA-kelaatinmuodostajan kanssa kompleksoituneen indium-111:n biologisen jakautumisen. Aromaattisen renkaan sitoutuminen EDTA- tai DTPA-osaan tapahtuu asetaattimetyleenin kautta. Eräässä hiljattaises-10 sa kokouksessa (Florida Conf. on Chem. in Biotechnology, 26. - 29. huhtikuuta 1988} myös D. K. Johnson et ai. esittivät EDTA:n ja DTPA:n bifunktionaalisia johdannaisia, joissa p-isotiosyanaattibentsyyliryhmä on sitoutunut jonkin karboksimetyyliryhmän metyleenihiileen. Aikaisemmin 15 Hunt et ai. ovat esittäneet US-patenttijulkaisuissa 4 088 747 ja 4 091 088 (1978) etyleenidiamiinidietikkahap-poon (EDDA) pohjautuvia kelaatinmuodostajia, joissa aromaattisen renkaan liittyminen EDDA-osaan tapahtuu alkylee-nin tai asetaattimetyleenin kautta. Yhdisteiden mainitaan 20 olevan käyttökelpoisia kelaatteina haiman ja sapen toimintaa tutkittaessa. Edullinen metalli on teknetium-99m. Myös indium-111 ja indium-113m mainitaan kuvaukseen soveltuvina radionuklideina.

Olisi siis edullista saada aikaan kompleksi, joka 25 ei hajoa helposti, poistuu nopeasti koko elimistöstä haluttua kudosta lukuunottamatta ja konjugoituu vasta-aineen kanssa, niin että saavutetaan toivotut tulokset.

Oheisissa piirroksissa esitettyjä kuvia voidaan kuvata seuraavasti: 3 0 Kuvat 1 - 7 ja 15 - 21 esittävät tämän keksinnön !* mukaisesti saadusta metallikompleksiyhdisteestä valmistet tuna, 153Sm:a sisältävänä konjugaattina annetun 153Sm:n biologista jakautumista. Kyseisessä konjugaatissa käytettiin vasta-ainetta CC49-IgG. Biologinen jakautuminen määritet-35 tiin karvattomilla hiirillä, joilla oli LS 174-T -kasvain.

104898

Kuvat 8 - 14 ja 22 - 28 esittävät tämän keksinnön mukaisesti saadusta metallikompleksiyhdisteestä valmistettuna, 153Sm:a sisältävänä konjugaattina annetun 153Sm:n biologista jakautumista. Kyseisessä konjugaatissa käytettiin 5 vasta-ainefragmenttina CC49-F(ab')2:ta. Biologinen jakautuminen määritettiin karvattomilla hiirillä, joilla oli LS 174-T -kasvain.

Kuvat 29 - 34 esittävät 177Lu (PA-DOTMA) : ta tai 177Lu-(PA-DOTA) :ta sisältävänä konjugaattina annetun 177Lu:n bio-10 logista jakautumista. Konjugaatissa käytettiin vasta-aineena CC49-IgG:tä. Biologinen jakautuminen määritettiin balb/C-hiirillä, joilla oli LS 174-T -kasvain.

Yllättävää kyllä, tämän keksinnön mukaisesti saatavat kompleksit ovat suhteellisen stabiileja (ts. eivät ha-15 joa helposti) ja jotkut niistä poistuvat nopeasti koko kehosta ja eräistä kohteena olemattomista elimistä, kuten maksasta, munuaisesta ja luusta.

Keksintö liittyy uudenlaisten bifunktionaalisten kelaatinmuodostajien suunnittelun ja valmistuksen, jotka 20 kelatoivat aineet sisältävät kukin kelaatin muodostavan funktionaalisen ryhmän sekä kemiallisesti reaktiivisen ryhmän biomolekyyleihin tapahtuvaa kovalenttista sitoutumista varten. Tähän liittyvät myös menetelmät erilaisten bifunktionaalisten koordinoivien yhdisteiden (BFC) ja me-:’* 25 tallien kompleksien valmistamiseksi sekä konjugaattien valmistamiseksi, joissa kompleksi on liitetty vasta-aineisiin diagnostisiin ja/tai terapeuttisiin käyttötarkoituksiin soveltuvien, radionuklidilla (kuten esimerkiksi sama-rium-153:11a, lutetium-177:llä tai yttrium-90:llä) leimat-30 tujen vasta-aineiden ja/tai fragmenttien aikaansaamiseksi.

Tässä keksinnössä uudet kaavan IA mukaiset, bifunk-tionaalisia kelaatteja muodostavat yhdisteet muodostavat komplekseja metalli-ionien kanssa, erityisesti sellaisten "radioaktiivisten" metalli-ionien kanssa, jotka ovat ke-35 mialtaan harvinaisten maametallien tyyppiä. Tällaisia har- β 104898 vinaisten maametallien ioneja ovat La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y ja Se ja edullisia niistä ovat Sm, Ho, Y ja Lu. Edullisia radioaktiivisia harvinaisten maametallien ioneja ovat 153Sm, 166Ho, 90Y, 149Pm, 5 159Gd, 140La, 177Lu, 175Yb, 47Sc ja 142Pr ja erityisen edullisia 153Sm, 166Ho, 90Y ja 142Pr. Muita radioaktiivisia metalli-ioneja, jotka saattavat olla kiinnostavia, ovat 47Sc, 99mTc, 186Re, 188Re. 97Ru, 10SRh, 109Pd, 197Pt, 67Cu, 198Au, 199Au, 67Ga, 68Ga, lxlIn, 113mIn, 115mIn, 117Sn ja 212Pb/212Bi. Siten muodoste-10 tut kompleksit voidaan liittää (kovalenttisella sidoksella) vasta-aineeseen tai sen fragmenttiin ja käyttää terapeuttisiin ja/tai diagnostisiin tarkoituksiin. Kompleksit ja/tai konjugaatit voidaan formuloida in vivo tai in vitro käyttöä varten. Formuloituja konjugaatteja käytetään edul-15 lisesti eläinten, erityisesti ihmisten, syövän hoidossa.

Tämän keksinnön mukaisesti saatuja komplekseja, jotka sisältävät jotakin ei-radioaktiivista metallia, on myös mahdollista käyttää tautitilojen, kuten esimerkiksi syövän, diagnosointiin ja/tai hoitamiseen. Sellainen käyt-20 tö on tunnettua ei-radioaktiivisten metallien tapauksessa käytettäessä radiotaajuutta hypertermian indusointiin (JP-patenttijulkaisu Kokai Tokkyo Koho 61/158 931) ja fluoresenssi -immuuniohjatussa hoidossa (FIGS) [K. Pettersson et ai., Clinical Chemistry 29 (1983), nro 1, 60 - 64 ja C.

" " 25 Meares et ai., Acc. Chem. Res. 17 (1984) 202 - 209] .

Ilmaisu "nisäkäs" tarkoittaa tässä käytettynä eläimiä, jotka ruokkivat poikasiaan maitorauhasten erittämällä maidolla, edullisesti tasalämpöisiä nisäkkäitä, vielä edullisemmin ihmisiä. "Vasta-aineella" tarkoitetaan mitä 30 tahansa polyklonaalista, monoklonaalista tai kimeeristä '/ vasta-ainetta tai heterovasta-ainetta, edullisesti mono klonaalista vasta-ainetta; "vasta-ainefragmentilla" tarkoitetaan Fab-fragmentteja ja (F (ab' )2-fragmentteja sekä mitä tahansa vasta-aineen osaa, joka on spesifinen halutun 35 epitoopin tai epitooppien suhteen. Käytettäessä ilmaisua 9 104898 "metallikelaatti-vasta-ainekonjugaatti" tai "konjugaatti" osalla "vasta-aine" tarkoitetaan kokonaisia vasta-aineita ja/tai vasta-ainefragmentteja niiden puolisynteettiset tai geeniteknisesti käsitellyt muunnokset mukaan luettuina.

5 "Kompleksilla" tarkoitetaan tässä käytettynä kek sinnön mukaista, kaavan IA mukaista yhdistettä kompleksoi-tuneena metalli-ionin kanssa, joka on tyypiltään harvinainen maametalli, erityisesti radioaktiivisen harvinaisen maametallin ionin kanssa, jolloin ainakin yksi metalliato-10 mi on kelatoitunut tai kompleksoitunut; "radioaktiivisella metalli-ionikelaatti-vasta-ainekonjugaatilla" tai "radioaktiivisella metalli-ionikonjugaatilla" tarkoitetaan radioaktiivisen metalli-ionin konjugaattia, jossa metalli-ioni on sitoutunut kovalenttisesti vasta-aineeseen tai 15 vasta-ainefragmenttiin; "radioaktiivisella" tarkoitetaan sanan "metalli-ioni" yhteydessä käytettynä tyypiltään harvinaisia maametalleja olevien alkuaineiden yhtä tai useampaa sellaista isotooppia, joka emittoi hiukkasia ja/tai fotoneja, kuten esimerkiksi isotooppeja 153Sm, 166Ho, 90Y, 20 149Pm, 159Gd, 140La, 177Lu, 175Yb, 47Sc ja 142Pr; ilmaisuja "bi- funktionaalinen koordinoiva yhdiste", "bifunktionaalinen kelaatinmuodostaja" ja "funktionaalisia ryhmiä sisältävä kelaatinmuodostaja" käytetään toistensa vaihtoehtoina ja niillä tarkoitetaan yhdisteitä, jotka sisältävän kelaatin ' ' 25 muodostavan osan, joka kykenee muodostamaan metalli-ionin kanssa kelaatin, ja kelaatin muodostavaan osaan kovalenttisesti sitoutuneen kytkentäryhmän/väliryhmän, joka pystyy toimimaan vasta-aineeseen tai vasta-ainefragmenttiin tapahtuvan kovalenttisen sitoutumisen välineenä.

30 "Farmaseuttisesti hyväksyttävä suola" tarkoittaa Γ* tässä käytettynä mitä tahansa kaavan IA mukaisen yhdisteen suolaa, joka on riittävän myrkytön, jotta se on käyttökelpoinen nisäkkäiden diagnosoinnissa ja hoidossa. Suoloja voidaan siis käyttää tämän keksinnön mukaisesti. Tyypilli-35 siä sellaisia suoloja, joita muodostetaan tavanomaisilla 104898 reaktioilla sekä orgaanisista että epäorgaanisista lähteistä, ovat esimerkiksi rikki-, suola-, fosfori-, etikka-, meripihka-, sitruuna-, maito-, maleiini-, fumaari-, palmitiini-, sappi-, pamoni-, lima-, glutamiini-, D-kamfe-5 ri-, glutaari-, glykoli-, ftaali-, viini-, muurahais-, lauriini-, steariini-, salisyyli-, metaanisulfoni-, bent-seenisulfoni-, sorbiini-, pikriini-, bentsoe- ja kaneliha-pon sekä muiden sopivien happojen suolat. Suoloihin kuuluvat myös sellaiset suolat, joita muodostetaan tavanomai-10 silla reaktioilla sekä orgaanisista että epäorgaanisista lähteistä, kuten esimerkiksi ammoniumioneista, alkalime-talli-ioneista, maa-alkalimetalli-ioneista ja muista samankaltaisista ioneista. Erityisen edullisia ovat kaavan IA mukaisten yhdisteiden kalium-, natrium- ja ammoniumsuo- 15 lat sekä niiden seokset.

Luonnollisesti voidaan käyttää kaava IA mukaisten yhdisteiden vapaata happomuotoa samoin kuin yhdisteiden protonoitua muotoa, jollainen syntyy esimerkiksi protonoi-taessa karboksylaatti ja/tai typpiatomit, ts. muodostetta-20 essa HCl-suola.

Edullisia kaavan IA mukaisia yhdisteitä ovat yhdisteet, joissa Q1 on vety A ja joita kuvaa seuraava kaava: ' 25 r~C « ^*"^7 "2-// Λ-(ch2)-c-N N-°

(II) Q

• · jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja kukin R on itsenäisesti vety tai C1.4-alkyyli, il 104898 ' sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q on muita kuin vetyjä, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto- semikarbat-5 sido-, tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, bromiasetamido- tai maleimidoryhmä, R3 on C^-alkoksi, -0CH2C02H, hydroksi tai vety, R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikar-batsido-, tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, bromiasetami-10 do- tai maleimidoryhmä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

15 Kun R3 ja R4 ovat molemmat kaavassa II vetyjä, yh disteet vastaavat seuraavaa kaavaa:

Q

V

R2——<CHz>—'c-^

(III) Q

25 jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, 30 sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista ” Q on muita kuin vetyjä, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R2 on nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikarbatsido-, tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, bromiasetamido- tai ma-35 leimidoryhmä ja 12 104898 kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli; tai ovat vastaavia farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.

R2:n ollessa kaavassa II vety yhdisteet vastaavat kaavaa 5 3 '

(/ -cch2)-c-H *>-Q

\—/ " * / \ io — H

(IV) Q

jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja 15 kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q on muita kuin vetyjä, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R3 on C-^-alkoksi, -0CH2C02H tai hydroksi, 20 R4 on nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikarbatsido-, tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, bromiasetamido- tai ma-leimidoryhmä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli; tai ovat vastaavia farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja. 25 Muita edullisia kaavan IA mukaisia yhdisteitä ovat yhdisteet, joissa ainakin yksi Q on vety ja jotka vastaavat kaavaa

Q

r-S Q1 . .. r2-(/ y-(CH2)-c-n n-q

H*/ / H

35 Q

(V) 13 104898 jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R, Q1 on vety tai C02R ja kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, 5 sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q ja Q1 on muita kuin vetyjä ja yksi Q on vety, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikar-batsido-, tiosemikarbatsido-, karboksyy1i-, maleimido- tai 10 bromiasetamidoryhmä, R3 on Cj^-alkoksi, -0CH2C02H, hydroksi tai vety, R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikar-batsido-, tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, maleimido- tai bromiasetamidoryhmä ja 15 kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

Muita edullisia kaavan IA mukaisia yhdisteitä ovat 20 yhdisteet, joissa Q1 on C02R ja jotka vastaavat kaavaa /> /-\ C°2R \ /

: 25 r2-(/ V-<ch2>-c-9 N-Q

Q

(VI) jossa v»x/ * 30 kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja « * > kukin R on itsenäisesti vety tai Cj.^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että ainakin yksi Q on muu kuin vety, m on kokonaisluku nollasta viiteen, 14 104898 R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikar-batsido-, tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, maleimido- tai bromiasetamidoryhmä, R3 on C^-alkoksi, -0CH2C02H, hydroksi tai vety, 5 R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikar-batsido-, tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, maleimido- tai bromiasetamidoryhmä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla 10 vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

Eräitä edullisia kaavan VI mukaisia yhdisteitä ovat yhdisteet, joissa R3 ja R4 ovat molemmat vetyjä ja jotka vastaavat kaavaa

Q

15 i rN— /

K--r M— (CH2)-C-N N-Q

20 H

Q

(VII) jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja : 25 kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että ainakin yksi Q on muu kuin vety, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R2 on nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikarbatsido-, 30 tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, bromiasetamido- tai male imidoryhmä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

Muita edullisia kaavan VI mukaisia yhdisteitä ovat 35 yhdisteet, joissa R2 on vety ja jotka vastaavat kaavaa 104898 jossa q R3 _ ' .

f, C02R r 7

5 ( y-(CH2)-c-N N-Q

Q

(VIII) 10 kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että ainakin yksi Q on muu kuin vety, m on kokonaisluku nollasta viiteen, 15 R3 on C^-alkoksi, -0CH2C02H tai hydroksi, R4 on nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikarbatsido-, tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, maleimido- tai bromiase-tamidoryhmä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli; 20 ja vastaavat farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

Tässä kuvattuja bifunktionaalisia kelaatinmuodosta-jia (jotka vastaavat jotakin kaavoista IA - VIII) voidaan käyttää kelatoimaan tai kompleksoimaan tyypiltään harvinaisia maametalleja olevia metalli-ioneja, erityisesti ; 25 radioaktiivisia harvinaisia maametalli-ioneja, metalli- ionikelaattien (joita kutsutaan tässä myös "komplekseiksi") muodostamiseksi. Koska kompleksit sisältävän funktionaalisen osan (jota edustaa substituoitu fenyyli kaavassa IA) , ne voidaan kiinnittää funktionalisoituihin kantajiin, 30 kuten esimerkiksi funktionaalisia ryhmiä sisältäviin polymeerisiin kantajiin, tai edullisesti, kun kysymyksessä on kaavan IA mukainen kompleksi, jossa R2 ja R4 ovat pakosta muita kuin nitroryhmiä, se voidaan liittää proteiineihin tai vielä tarkemmin vasta-aineisiin tai vasta-ainefrag-35 mentteihin. Tässä kuvatut kompleksit (joita edustaa har- 16 104898 vinaisten maametalli-ionien kanssa, erityisesti radioaktiivisten harvinaisten maametalli-ionien kanssa, kompleksin muodostanut yhdiste, joka vastaa jotakin kaavoista IA - VIII) voidaan liittää kovalenttisesti vasta-aineeseen 5 tai vasta-ainefragmenttiin, ja niitä kutsutaan tässä "kon-jugaateiksi".

Tässä kuvatuissa konjugaateissa käyttökelpoisia vasta-aineita tai vasta-ainefragmentteja voidaan valmistaa alalla tunnetuilla tekniikoilla. Erittäin spesifisiä mo-10 noklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa hybridisaa-tiotekniikoilla, jotka ovat tällä alalla tunnettuja; tutustukaa esimerkiksi Kohlerin ja Milsteinin julkaisuihin [Nature 256 (1975) 495 - 497 ja Eur. J. Immunol. 6 (1976) 511 - 519] . Sellaisilla vasta-aineilla on tavallisesti 15 hyvin spesifinen reaktiokyky. Radioaktiivisissa metalli-ionikonjugaateissa voidaan käyttää minkä tahansa halutun antigeenin tai hapteenin vasta-aineita. Edullisesti radioaktiivisissa metalli-ionikonjugaateissa käytettävät vasta-aineet ovat monoklonaalisia vasta-aineita tai niiden frag-20 mentteja, joilla on suuri spesifisyys halutun epitoopin tai epitooppien suhteen. Tässä yhteydessä käytettävät vasta-aineet voivat olla esimerkiksi kasvainten, bakteerien, sienien, virusten, loisten, mykoplasmojen, erilaistumis-ja muiden solukalvoantigeenien, patogeenien pinta-antigee-: 25 nien, toksiinien, entsyymien, allergeenien, lääkkeiden ja minkä tahansa biologisesti aktiivisten molekyylien vasta-aineita. Eräitä esimerkkejä vasta-aineista tai vasta-aine-fragmenteista ovat C-ll, CC-46, CC-49, CC-49:n F(ab')2, CC-83, CC-83:n F(ab')2 ja B72.3. [Mitä vasta-aineisiin CC-49, 30 CC-83 ja B72.3 tulee, tutustukaa julkaisuun D. Colcher et ai., Cancer Res. 48 (15. elokuuta 1988) 4597 - 4603. Hyb-ridoomasolulinja B72.3 on talletettu kokoelmaan American Type Culture Collection (ATCC) numerolla HB 8108. Erilaiset CC-vasta-aineet on esitetty US-patenttihakemuksessa 7-35 073685, joka on jätetty 15. heinäkuuta 1987 ja on saata- 17 104898 vissa NTIS:n kautta. Muut hiiren monoklonaaliset vasta-aineet sitoutuvat kasvaimiin yhteydessä olevan antigeenin TAG-72:n epitooppeihin.] Täydellisempi luettelo antigeeneistä löytyy US-patenttijulkaisusta 4 193 983. Tässä ku-5 vatut radioaktiiviset metalli-ionikonjugaatit ovat erikoisen edullisia erilaisten syöpien diagnosointiin ja hoitoon .

Edullisia tyypiltään harvinaisia maametalleja (lan-tanideja tai pseudolantanideja) olevien metallien komplek-10 seja, jotka ovat tämän keksinnön mukaisia, kuvaa kaava C [Ln (BFC) ] (IX) 15 jossa Ln on harvinaisen maametallin ioni, lantanidi-ioni, kuten esimerkiksi Ce3+, Pr3*, Nd3*, Pm3*, Sm3+, Eu3*, Gd3*, Tb3*, Dy3*, Ho3*, Er3*, Tm3*, Yb3* tai Lu3+, tai pseudolantanidi- ioni, kuten esimerkiksi Sc3+, Y3* tai La3+, ja erityisen edullisia metalli-ioneja ovat Y3*, Ho3+, Lu3* ja Sm3*, BFC 20 tarkoittaa kaavan IA mukaista bifunktionaalista kelaatin-muodostajaa ja C tarkoittaa farmaseuttisesti hyväksyttävää ionia tai ioniryhmää, jolla on riittävä varaus tekemään koko kompleksi sähköisesti neutraaliksi. Mikäli BFC sisältää vähintään 4 negatiivisesti varautunutta ryhmää, C on : 25 kationi tai ryhmä kationeja, kuten esimerkiksi H*, Li+, Na*, K\ Rb*, Cs\ Mg2*, Ca2*, Sr2*, Ba2*, NH4*, N(CH3)4*, N(C2H5)4*, N(C3H7)4*, N (C4H9) 4*, As (C6H5) 4*, [ (C6H5)3P=]2N* tai muu pro- tonoitu amiini. Jos BFC sisältää 3 negatiivisesti varautunutta ryhmää, C:tä ei tarvita. Mikäli BFC sisältää 2 % 30 negatiivisesti varautunutta ryhmää, C on anioni, kuten '1 esimerkiksi F', Cl', Br', I', C104', BF4', H2P04~, HC03', HC02", CH3S03·, H3C-C6H4-S03-, PF6·, CH3C02- tai N(C6H5)4'.

Tämän keksinnön mukaisesti saatavia komplekseja voidaan käyttää formulaatioiden muodossa. Formulaatiot si-35 sältävät yhdistettä, jolla on kaava IA, yhdistettynä me- ie 104898 talli-ioniin ja mahdollisesti vasta-aineeseen sekä sopivaa fysiologisesti hyväksyttävää kantaja-, täyte- tai väliainetta. Formulaatio voi siis koostua fysiologisesti hyväksyttävästä kantaja-aineesta ja kompleksista (metalli-5 ioni + ligandi) tai konjugaatista (metalli-ioni + ligan-di + vasta-aine). Menetelmät sellaisten formulaatioiden valmistamiseksi ovat tunnettuja. Formulaatioita voidaan käyttää suspension, injektoitavaksi soveltuvan liuoksen tai muun sopivan formulaation muodossa. Voidaan käyttää 10 fysiologisesti hyväksyttäviä suspendointiaineita mahdollisesti yhdessä apuaineiden kanssa.

Hoitoon käytetään "vaikuttava määrä" formulaatiota. Annos vaihtelee hoidettavan taudin mukaan. Vaikka kyseisiä formulaatioita voidaan käyttää in vitro suoritettavassa 15 diagnosoinnissa, myös in vivo diagnosointi on mahdollista niiden avulla. Lisäksi kyseisiä formulaatioita voidaan käyttää myös radioimmuuniohjatussa kirurgiassa (RIGS); muita metalleja, joita voitaisiin käyttää tähän tarkoitukseen, ovat kuitenkin myös 99mTc, 311In, 113mIn, 67Ga ja 68Ga.

20 Muihin eräiden tämän keksinnön mukaisesti saatavien kompleksien käyttöihin kuuluvat magneettiseen resonanssiin perustuva kuvaus, esimerkiksi kaavan IA mukaisten yhdisteiden, erityisesti kaavan VI mukaisten yhdisteiden ja Gd3*:n kompleksien, kiinnittäminen polymeerisiin kantajiin 25 erilaisia tarkoituksia varten, esimerkiksi diagnostisina aineina käyttöä varten, ja lantanidimetalli- tai pseudolantanidimetalli-ionin poistaminen selektiivisellä uutolla.

Tämän keksinnön avulla saadaan, komplekseja, joista 30 eräät ovat stabiilimpia ja/tai biologiselta jakautumisel-' taan parempia ja/tai poistuvat nopeammin elimistöstä kuin alalla jo tunnetut.

19 104898

Keksinnön mukaiselle menetelmälle terapeuttisesti aktiivisen metallikompleksiyhdisteen valmistamiseksi kaavan IA mukaisesti yhdisteestä tai sen suolasta ja metalli-ionista on tunnusomaista, että 5 (A) yhdiste, jolla on kaava

H

/ (VA)

10 o2fc -(' -(CH2)-C-N M"H

n H

H

15 j ossa Q1 on C02R, R on C^-alkyyli ja n on kokonaisluku nollasta viiteen, 20 satetaan reagoimaan a-halogeenikarboksyylihappoesterin kanssa, jolla on kaava

BrCH2C02R

• ’’ 25 jossa R on C^-alkyyli, orgaanisen liuottimen ja emäksen läsnäollessa 0 °C:n ja refluksointilämpötilan välillä olevassa lämpötilassa, kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa Q1 ja n ovat edellä määritellyt, 3 0 R3, R4 ja R5 ovat vetyjä, " R on C1.4-alkyyli ja R2 on nitro, tai (B) vaiheen (A) tuote saatetaan reagoimaan hydra-usaineen, kuten Pd/C:n ja vedyn, kanssa tavanomaisissa 20 104898 reaktio-olosuhteissa kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa Q1 ja n ovat edellä määritellyt, R3, R4 ja R5 ovat vetyjä, 5 R on C^-alkyyli ja R2 on amino, tai (C) vaiheen (B) tuote saatetaan reagoimaan de-es-teröintiaineen, kuten vahvan hapon, kanssa kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa 10 Q1 ja n ovat edellä määritellyt, R3, R4 ja R5 ovat vetyjä, R on vety ja R2 on amino, tai (D) edellä määritelty kaavan VA mukainen yhdiste 15 saatetaan reagoimaan optisesti aktiivisen a-bentseenisul- fonaatin kanssa, jolla on kaava R5

)COOR

20 0

_ I

o — S= o ά . 25 ^ jossa R ja R5 ovat edellä määritellyt, kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa Q1, R5 ja n ovat edellä määritellyt, R3 ja R4 ovat vetyjä, 30 R on C1.4-alkyyli ja ·; R2 on nitro, tai (E) vaiheen (D) tuote saatetaan reagoimaan hydra-usaineen, kuten Pd/C:n ja vedyn, kanssa tavanomaisissa reaktio-olosuhteissa kaavan IA mukaisen yhdisteen saami-35 seksi, jossa 104898 Q1, R5 ja n ovat edellä määritellyt, R3 ja R4 ovat vetyjä, R on C^-alkyyli ja R2 on amino, tai 5 (F) vaiheen (E) tuote saatetaan reagoimaan de-es- teröintiaineen, kuten vahvan hapon, kanssa kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa Q1, R5 ja n ovat edellä määritellyt, R3, R4 ja R ovat vetyjä ja 10 R2 on amino, tai (G) yhdiste, jolla on kaava ” /ri " /' Λ-(CH2)-C-N N- h (IVA)

11 H

no2

H

20 jossa R3' on C^-alkoksi, -0CH2C02H tai hydroksi ja n on kokonaisluku nollasta viiteen, satetaan reagoimaan α-halogeenikarboksyylihapon kanssa, .. 25 jolla on kaava

BrCH2C02H

orgaanisen liuottimen ja emäksen läsnäollessa 0 °C:n ja 30 refluksointilämpötilan välillä olevassa lämpötilassa, kaa van IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa R3 on sama kuin edellä määritelty R3', n on edellä määritelty, Q1 ja R2 ovat vetyjä ja 35 R4 on nitro, tai 104898 (H) vaiheen (G) tuote saatetaan reagoimaan hydra-usaineen, kuten Pd/C:n ja vedyn, kanssa tavanomaisissa reaktio-olosuhteissa kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa 5 R3 on sama kuin edellä määritelty R3' , n on edellä määritelty, Q1, R, R2 ja R5 ovat vetyjä ja R4 on amino, tai (I) yhdiste, jolla on kaava 10

H

/ OMe N ^ /-\ '1 \ / // v\-(CH2)-C-M N' H (VIHA) 15 \-/ n ' \

Λ-7 H

no2 h jossa 2 0 Q1 on C02R, R on C1.4-alkyyli ja n on kokonaisluku nollasta viiteen, satetaan reagoimaan a-halogeenikarboksyylihappojohdannaisen kanssa, jolla on kaava .. 25

BrCH2C02R

jossa R on edellä määritelty, orgaanisen liuottimen ja emäksen läsnäollessa 0 °C:n ja refluksointilämpötilan vä-30 Iillä olevassa lämpötilassa, kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa Q1, Q ja n ovat edellä määritellyt, R2 on vety ja R4 on nitro, tai 23 104898 (J) vaiheen (I) tuote saatetaan reagoimaan de-es-teröintiaineen, kuten vahvan hapon, kanssa ja sen jälkeen hydrausaineen, kuten Pd/C:n ja vedyn, kanssa tavanomaisissa reaktio-olosuhteissa kaavan IA mukaisen yhdisteen 5 saamiseksi, jossa Q1, Q ja n ovat edellä määritellyt, R, R2 ja R5 ovat vetyjä ja R4 on amino, tai (K) vaiheen (B) , (F) , (H) tai (J) tuote saatetaan 10 reagoimaan tiofosgeenin kanssa vastaavan yhdisteen saamiseksi, jossa R2 tai R4 on isotiosyanaatto; (L) mahdollisesti kaavan IA mukainen yhdiste saatetaan tunnetuilla menetelmillä reagoimaan sopivan reagens-sin kanssa yhdisteen kalium-, natrium-, litium-, am- 15 monium-, kalsium-, magnesium- tai vetykloridiadduktin saa miseksi farmaseuttisesti hyväksyttävänä suolana, ja (M) jollakin menetelmistä (A) - (L) valmistettu yhdiste saatetaan reagoimaan metalli-ionin kanssa, joka metalli-ioni on La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, 20 Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y tai Se.

Eräs järkevä ja yleinen tapa kaavan IA mukaisen 12 rengasatomia sisältävän, makrosyklisen, bifunktionaalisen kelaatinmuodostajan syntetisoimiseksi, on monofunktionali-soida vapaana emäksenä oleva makrosyklinen yhdiste (esim.

.. 25 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani) liittämällä vain yhteen sen typpiatomeista sopiva elektrofiili (esim. jokin asianmukaisella tavalla substituoitu a-halogeenikarboksyylihap-poesteri). Tämän elektrofiilin täytyy sisältää sopiva kyt-kentäryhmä tai sopivalla tavalla suojattu kytkentäryhmä, 30 joka mahdollistaa bifunktionaalisen ligandin liittämisen proteiiniin, vasta-aineeseen tai vasta-ainefragmenttiin.

On alalla tunnettua, että alkylointimenettelytavat mono-N-funktionaalisten makrosyklisten polyatsayhdisteiden valmistamiseksi saattavat johtaa vaikeasti erotettavien 35 tuotteiden seoksiin [T. Käden, Top. Curr. Chem. 121 (1984) 24 104898 157 - 175]. Tästä ongelmasta on päästy käyttämällä, niin kuin on raportoitu, suuria makrosyklisen yhdisteen ylimääriä (5 - 10 ekvivalenttia suhteessa elektrofiiliin), mikä edistää monoadditiotuotteen muodostumista [M. Studer 5 ja T. A. Käden, Helv. Chim. Acta 69 (1986) 2081 - 86; E. Kimura et ad. , J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1986, 1158 -59] .

Muut tiet mono-N-funktionaalisten makrosyklisten polyatsayhdisteiden valmistamiseksi sisältävät pitkähkön 10 suojaus-, funktionalisointi- ja suojauksenpoistosysteemin [P. S. Pallavicini et ai., J. Amer. Chem. Soc. 109 (1987) 5139 - 44; M. F. Tweedle et ai. , EP-hakemusjulkaisu 0 232 751]. Abbott Laboratories on julkaissut hiljaittain tiivistelmänä äskettäisestä kokouksesta raportin substitu-15 oitujen fenyylipalorypälehappojen ja amiinien välisestä pelkistysaminaatiosta [D. K. Johnson et ai., Florida Conf. on Chem. in Biotechnology, April 26-29 (1988), Palm Coast, FL] .

Yleisiä valmistusteitä kaavan IA mukaisten kelaa-20 tinmuodostajien valmistamiseksi on esitetty jäljempänä synteesikaavioissa I - V, ja ne sisältävät sopivan elektrof iilin ja makrosyklisen polyatsayhdisteen reaktion sopivassa orgaanisessa liuottimessa eri reagointisuhteilla, lämpötiloissa ja pitoisuuksilla. Esimerkkejä sopivista .. 25 orgaanisista liuottimista ovat kaikki liukenemista edistä vät hiilivedyt, kuten esimerkiksi asetonitriili, isopropa-noli, metyleenikloridi, tolueeni, kloroformi, n-butanoli, hiilitetrakloridi, tetrahydrofuraani ja 5 % etanolia sisältävä kloroformi, joista edullisimpia ovat kloroformi, 30 metyleenikloridi, n-butanoli, 1,4-dioksaani ja asetonitriili. Makrosyklistä yhdistettä ja elektrofiiliä voidaan käyttää stökiometrisinä tai lähes stökiometrisinä määrinä ja vastaava mono-N-alkylointituote voidaan saada yhdessä vaiheessa. Lämpötila voi vaihdella reaktiossa noin 35 0 °C:sta suunnilleen seoksen kiehumislämpötilaan ja on 104898 edullisesti O - 25 °C. Aika, jossa reaktio menee loppuun, on noin 1-24 tuntia.

Yleismenettely substituoitujen a-halogeenihappoes-tereiden valmistamiseksi on toivottava, jotta synteesikaa-5 viot II ja IV ovat yleisesti käyttökelpoisia. Eräs sopiva tapa on bromata tai kloorata in situ muodostettu happoha-logenidi [esim. D. N. Harpp et ai., J. Org. Chem. 4 0 (1975) 3420 - 27] . Tämä menettelytapa mahdollistaa jopa reaktiivisia bentsyyliryhmiä sisältävien alkaanihappojen 10 yksinomaisen alfa-halogenoinnin. Eräs yleismenetelmä substituoitujen happohalogenidien valmistamiseksi käsittää orgaanisen hapon reaktion tionyylikloridin tai sulfuryyli-kloridin kanssa [esim. E. Schwenk et ai., J. Amer. Chem. Soc. 70 (1944) 3626 - 27]. Molemmissa menetelmissä käyte-15 tään hyväksi vapaata karboksyylihappoa, joka on usein saatavissa kaupallisista lähteistä.

Makrosyklisiä polyatsayhdisteitä, kuten esimerkiksi 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani, voidaan valmistaa menetelmillä, joista on jo raportoitu [esim. T. J. Atkins et 20 ai., J. Amer. Chem. Soc. 96 (1974) 2268 - 70 ja T. J.

Richman et ai., Org. Synthesis 58 (1978) 86 - 98].

Mono-N-funktionaalisen makrosyklisen yhdisteen kar-boksimetylointi voidaan toteuttaa Desreux'n menetelmällä käyttämällä bromietikkahappojohdannaisia ja sopivaa emästä .. 25 [J. F. Desreux, Inorg. Chem. 19 (1980) 1319 - 24].

Kaikki tässä keksinnössä tarvittavat lähtöaineet ovat joko kaupallisista lähteistä saatavissa tai valmistettavissa tunnetuista kirjallisuuslähteistä löytyvien kuvausten perusteella.

30 Seuraavassa kaaviossa I valmistetaan yhdisteitä, joilla on kaava IA, jossa Q1 on vety. Vaikka esitetyt ter- • · mit viittaavat vain yhteen yhdisteeseen, tällä menetelmällä voidaan valmistaa myös muita samankaltaisia kaavan IA piiriin kuuluvia yhdisteitä, joissa Q1 on vety ja n on 35 0-5.

26 1 0 4 8 9 8

Kaavio I

ΙΟΙ + Η"/ Ν'Η CHC1V 25°C Η Η-Η νο2 · ' / ' 10 / BrCH2C02CH3, / K2C03 CH3CN, / 25eC, 'l7 h o2n cooch3 15 00«, >—Ns/

Pd/c, H2, / ^ COOCH3 20 CH3OH, 25°C, / 2,5 h / h2h cooch3 :· 25 ΥλλΙ ^ väk. HC1 COOCH3 80eC, 2,5 h 7 N—' 1 /

V

*^cooch3 / 30 * h7n cooh /_/»» 35 ^nHCl

XCOOH

27 104898

Seuraavassa kaaviossa II valmistetaan yhdisteitä, joilla on kaava IA, jossa Q1 on vety. Vaikka esitetyt termit viittaavat vain yhteen yhdisteeseen, tällä menetelmällä voidaan valmistaa myös muita samankaltaisia kaavan IA 5 piiriin kuuluvia yhdisteitä, joissa Q1 on vety ja n on 0 - 5.

28 104898

Kaavio II

H

N02 R 2 H

1) Pd/C, h2, ch3oh / 2) HCl(g), C2H5OH / 10 / H / joTUJ' 15 H2N h -nHCl

BrCH2C02CH3, /

K2C03r CH3CH

20 ^cooch3 £0OCH3

1°fV

25 H2N ^ / cooch3 Väk. / HC1 / 30 / j/0™ ’· / cooh j@X.. J' - h2n ^

35 COOH

29 104898

Seuraavassa kaaviossa III valmistetaan yhdisteitä, joilla on kaava IA, jossa Q1 on C02R. Vaikka esitetyt termit viittaavat vain yhteen yhdisteeseen, tällä menetelmällä voidaan valmistaa myös muita samankaltaisia kaavan IA 5 piiriin kuuluvia yhdisteitä, joissa Q1 on C02R ja n on 0-5.

30 104898

Kaavio III Br _^~C00H COOCH-, 5 ύ -ä:.z: @

I CH3OH

02n no2

Br H

'V—COOCH, .

Ϋ' "CJ" ^

HO, ' H3COOC

1 H ,

15 H

BrCH2C02CH3, , K2C03f CH3CN, \ 25eC, 17 h \

Y

20 ON COOCH3 M/C, H2 Y/~n1 ^ _yCOOC£3 T H3C00<: :· 25 HpN _ .COOCH, { ΊΘΐ C00CH> H^COOC \

l h2^ ___ \ /C00H

30 C00CH3 t ^ S00C 13HC1 k

COOH

104898

Seuraavassa kaaviossa IV valmistetaan yhdisteitä, joilla on kaava IA, jossa Q1 on C02R. Vaikka esitetyt termit viittaavat vain yhteen yhdisteeseen, tällä menetelmällä voidaan valmistaa myös muita samankaltaisia kaavan IA 5 piiriin kuuluvia yhdisteitä, joissa Q1 on C02R ja n on 0-5.

Kaaviossa IV esitetty A':n sisältävä reagenssi voi olla mikä tahansa a-hapon aikaansaantiin soveltuva poistuva ryhmä, ts. A' on fenyyli tai CF3.

10 Optisesti aktiivisen alkylointiaineen käyttö on minimoinut diastereomeerien muodostumisen ja tekee synteesistä yksinkertaisemman. Yhden ainoan diastereomeerin saaminen eristetyksi, mikä tuottaisi yhden helposti puhdistettavan lantanidikompleksin, olisi toivottavaa sekä ra-15 dioaktiivisen kelaatin muodostuksen kannalta.

· • .

1 · 32 1 0 4 8 9 8

Kaavio IV

H Br ’ COOCH(CH3) 2 5 »'C' + if^l _,.

^ V %\l \QL

H N02 V / N N"H

(H3C)jCHOOC

10 „ __ H

K2c03, CH3CH(50-95%) ^ +

H,C

3 , COOCH-5

X

„ r H

15 h3C^, COOCH, O

o,1 _ V I

2 V^v, H HlY _ 1 ] (H3C)2CHOOC C „ \ \ \C00CH3 20 H I.jL· />ch3 cooch3

Pd/C, H2 I

:· 25 ch3oh I

h3C<4 COOCH3 h3C<4 COOH

Β21νΛν H ,V H2NV^N h 'V

. ^>ΓΊ^· ^>fl> (B3C)2CHOOC 3 \ HOOC ) \

.. COOCH3 COOH

H IIlL H uL

/ ▼CH-j w väk. ECl » / ▼CH3

COOCH-, COOH

35 J

33 104898

Seuraavassa kaaviossa V valmistetaan yhdisteitä, joilla on kaava IA, jossa Q1 on C02R ja R2 on vety. Vaikka esitetyt termit viittaavat vain kahteen yhdisteeseen, tällä menetelmällä voidaan valmistaa myös muita samankaltai-5 siä kaavan IA piiriin kuuluvia yhdisteitä, joissa Q1 on C02R, n on 0 - 5, R3 on edellä esitetyn määritelmän mukainen ja R2:na sekä R4:nä tulevat kysymykseen vety ja amino-, nitro-, isotiosyanaatto-, semikarbatsido-, tiosemikarbat-sido-, maleimido-, bromiasetamido- ja karboksyyliryhmä. 1 · 3« 104898

Kaavio V

H

|R H OR ' _ 1 [_ ΒΓ Xl

(ÄY“ R * CH3' i^YU^'K w.H

+ H"^Ks^"H R * h' dioksaani kD>jJ

°2N h 02N

r’b h» R * CH3, 10 / R’ = C0,CH, R1 « H, COOCH3 Rs H ν' 2 3 ν' BrCH2COOH BrCH2COOCH3

ν' T

CH2COOCH3

15 “jC0" ca3o I

f V~K~^ I t|02l-H3

O) W¥”J

chocooh CH2C00CH3

0,N

20 °2N 2

(1) HC1, 90-10D°C

(2) Pt02/H2

Pt02/H2

▼ T

• · 9 c

: CH2C00H

CH2C00H

0H 1 CH3O I

i 1 /_X / N N-CH^COOH X \2 V '

f/Λγ / \ 2 xXx/-H N-CH-,COOH

(QJ (DJ

30 T c^coob 'h2cooh

E2S HjK

35 104898

Elektrofiilinen osa (kaavassa IA substituoitu fe-nyyliryhmä) voidaan valmistaa alalla tunnetuin menetelmin. Sellaisia menetelmiä on esitetty julkaisussa Acc. Chem. Res. 17 (1984) 202 - 209. Eräs menetelmä, jolla voidaan 5 valmistaa kaavan IA mukaisia yhdisteitä, joissa elektro-fiili voisi olla isotiosyanaattoryhmä (läsnä oleva R2 tai R4 on isosyanaattoryhmä) käsittää aminokelaatin (R2 tai R4 on aminoryhmä) reaktion tiofosgeenin kanssa ja on esitetty M. J. Fazion et ai. US-patenttihakemuksessa 289 712, joka 10 on jätetty 23. joulukuuta 1988.

Radionuklideja voidaan tuottaa monin tavoin. Nukli-dia pommitetaan ydinreaktorissa neutroneilla, jolloin saadaan radionuklidi, esimerkiksi 15 Sm-152 + neutroni - Sm-153 + gamma

Toinen menetelmä saada aikaan radionuklideja on pommittaa nuklideja hiukkasilla lineaarikiihdyttimessä tai syklotronissa. Eräs tapa on vielä eristää radionuklidi 20 fissiotuotteiden seoksesta. Tässä keksinnössä käytettävä menetelmä radionuklidien aikaansaamiseksi ei ole keksinnön kannalta ratkaiseva.

Konjugaatteja voidaan valmistaa muodostamalla ensin keksinnön mukaisesti kompleksi ja liittämällä siihen ;·, 25 sitten vasta-aine tai vasta-ainefragmentti. Menetelmä kä sittää siis ligandin valmistamisen, sen ja metallin kompleksin muodostamisen ja vasta-aineen liittämisen sen jälkeen.

Seuraavissa esimerkeissä käytetään seuraavia terme- 30 jä ja käytettiin seuraavia olosuhteita, ellei toisin ole .. erikseen mainittu.

♦

Massaspektrit saatiin joko Finnigan TSQ -massaspektrometrillä (Q^S-malli) tai hyvän erotuskyvyn omaavalla VG ZAB-MS -massaspektrometrillä (pommitus nopeilla kse- 36 1 0 4 8 9 8 nonatomeilla käyttäen ditiotreitolin ja ditioerytritolin seosta suhteessa 3:1).

1H- ja 13C-NMR-spektrit saatiin käyttämällä Varian VXR-300, Bruker APC 300, IBM/Bruker Nr-80 tai Jeol FX400 5 -spektrometriä. Kaikki spektrit saatiin 30 °C:ssa, ellei toisin ole mainittu. ^-NMR-spektrit ajettiin taajuudella 300 MHz, 80 MHz tai 400 MHz edellä lueteltuja laitteita vastaavasti ja 13C-NMR-spektrit taajuudella 75 MHz, 20 MHz tai 100 MHz edellä lueteltuja laitteita vastaavasti.

10 NMR-arvot ovat delta-arvoja suhteessa TMSrään (tetrametyy-lisilaaniin) tai D20:n ollessa liuottimena suhteessa DSS:ään (2,2-dimetyyli-2-silapentaani-5-sulfonihapon nat-riumsuolaan).

Infrapunaspektrit (IR-spektrit) rekisteröitiin 15 Nicolet 5SX FT/IR -laitteella.

Mitä kromatografisiin menettelytapoihin tulee, useimmat liuottimet olivat Fischer HPLC -laatua olevia aineita. Ammoniumasetaatti ostettiin Aldrichilta. Vesi puhdistettiin Barnstead NANOpure™ -vedensuodatusjärjestel-20 mää käyttäen. Orgaanisten yhdisteiden preparatiivinen kromatografinen käsittely toteutettiin joko normaalilla painovoimaan perustuvalla kromatografiällä tavanomaista tekniikkaa käyttäen tai flash-kromatografiällä, jota kuvaavat C. W. Still et ai., J. Org. Chem. 43 (1978) 2923 - 24.

: ' ' 25 Käytettiin seuraavia liuotinseoksia:

Liuotinseos Aineosat 1 CHCI3SCH3OH: väk. NHjjOH til. suhde 30 2:2:i

V : V : V

• · 2 CHCli :CH-aOK: väk. ΝΗ],0Η til. suhde

12:11:1 J

V : V : V

37 104898 H CHCl-a sCH^OH: väk. NHhOH ti 1. suhde 4:2:1 0

V: V * V

5 CHClc:CH-aOH: väk. NHnOH til. suhde 5 3:2:1 0

V:V: V

6 CHClöiCHoÖH: väk. NHmOHtil.suhde 7:3:1

V: V: V

γ Fysiologinen suolaliuos (0,85 % 10 NaCl:ä tislatussa vedessä): väk.NH4OH,

til.suhde 4:1 V:V

8 CHClo:CHoOH: väk. NKhOK til.suhde 4:4:1 0

V: V: V

15

Ilmoitetut Rf-arvot on saatu näitä liuotinseoksia ja kaupan olevia, faasiltaan normaaleja silikageeli-TLC-levyjä (GHLF 250 mieron, Analtech Inc. tai Kieselgel 60F254, Merck) käyttäen. Preparatiivinen pylväskromatografiakäsit-20 tely tehtiin Merck grade 60 -silikageeliä (600 nm:n sili-kageeliä) käyttäen.

Kaikki prosenttiluvut perustuvat massaan, ellei toisin ole mainittu.

Eräitä kiinteitä aineita kuivattiin pyöröhaih-: 25 dutinta (Buchi 461) tai vakuumiuunia käyttäen noin 55 - 60 °C:ssa muutaman tunnin ajan. Liuottimien poistoon käytettiin lisäksi automaattista Virtis-kylmäkuivauslaitetta (malli 10-010) tai Speed Vac™ -väkevöintilaitetta.

Samarium-153 ja lutetium-177 tuotettiin Missourin 30 yliopiston (Columbia, MO) tutkimusreaktorilla. Yttrium-90 *·; ostettiin Oak Ridge National Laboratoriesilta.

1- (4 -isotiosyanaattobentsyyli)dietyleenitriamii-nipentaetikkahappo (SCN-Bz-DTPA) valmistettiin muunnelmalla menetelmästä, jonka ovat esittäneet M. W. Brechbiel 35 et ai., Inorg. Chem. 25 (1986) 2772 - 2781, ja 38 1 0 4 8 9 8 puhdistettiin yhden ainoan lajin saamiseksi anioninvaihto-HPLC:llä (Q-Sepharose™). Jotkut käytetyistä kemikaaleista hankittiin alla mainituista lähteistä: N-2-hydroksietyyli-piperatsiini-N'-2-etaanisulfonihappo (HEPES), vapaa happo 5 ja natriumsuola, ostettiin Behring Diagnosticsilta (La

Jolla, CA) ; natriumsitraatti (takuulaatu) oli peräisin Fisher Scientificilta; tiofosgeeni oli peräisin Aldrich Chemicalsilta; ammoniumasetaatti, natriumasetaatti, ety-leenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA) ja fosfaattipuskuroi-10 tu fysiologinen suolaliuos (PBS) olivat peräisin Sigma

Diagnosticsilta.

HPLC-kolonnit, joita käytettiin, olivat seuraavia: Käsin pakattu Q-Sepharose™ (Pharmacia), jonka koko oli joko 1,5 cm x 25 cm tai 2,5 cm x 25 cm; Zorbax™ BIO Series 15 GF-250 (DuPont Instruments; 9,4 mm x 25 cm); Vydac™ pro tein C-4 (Separations Groupin, Hesperia, CA, tavaramerkki; 4,6 mm x 25 cm); sekä Mono-Q™ ja Sp-Sephadex™ (Pharmacia Biotechnology Productsin tavaramerkki). Sep-Pak™ (Waters Associatesin tavaramerkki) C-18 -patruunat ostettiin 20 Waters Associatesilta (Milford, MA) , Sephadex™ G-25 -ker-takäyttökolonnit (2,2 ml) Isolab Inc:Itä (Akron, OH) ja Centricon™-30 (Amicon Divisionin, W. R. Grace & Co., Danvers, MA, tavaramerkki) -pienväkevöintilaitteet Amico-nilta.

; 25 Analyyseissä ja näyte-erotuksissa käytettiin viittä HPLC-systeemiä:

Systeemi I koostui LKB 2150 -pumpusta ja 4152 -säätölaitteesta, UV-detektorista (LKB 2238 UV Cord) Berthold LB 506 A HPLC -radioaktiivisuusseurantalaitteesta 30 (International Berthold Group) ja Gilson 201-202 -frakti-*·; onkeräyslaitteesta (Gilson International, Middleton, WI) .

Systeemi II varustettiin automaattisella näytteen-ottolaitteella (WISP 710 B) , kahdella pumpulla (malli 510) ja automaattisella gradientinsäätölaitteella (Waters Asso-35 ciates), Perkin-Elmer LC-75 -spektrofotomeridetektorilla, 39 104898

Beckman Model 170 -radioisotooppidetektorilla ja fraktion-keräyslaitteella (Pharmacian Frac-100).

Systeemi III koostui kahdesta Waters M-6000A -pumpusta ja Waters 660 -liuotinohjelmointilaiteesta, Waters 5 Model 481 -detektorista, jossa aallonpituus on vaihdeltavissa, ja Waters Data Module -yksiköstä; preparatiivisesti käytettiin myös ISCO-fraktiokeräyslaitetta.

Systeemi IV oli Dionex BioLC™ -systeemi, joka oli varustettu UV-detektorilla, jossa aallonpituus oli vaih-10 deltavissa.

Systeemi V oli Waters Model 590 -pumppu yhdistettynä ISCO Model 2360 -gradientinohjelmointilaitteeseen ja Dionex-detektoriin, jossa aallonpituus on vaihdeltavissa.

Sentrifugointiin ja väkevöitiin käytettiin Sorvali 15 RT 6000B -laitetta (DuPontin jäähdytettävää sentrifugia). Haihtuvien liuottimien poistamiseen käytettiinm Speed Vac -haihdutinta (Savant Instruments Inc., Hicksville, N.Y.). Radioaktiivisuusmittaukset tehtiin Capintec™ Radioisotope Calibrator (Capintec Inc:n tavaramerkki) CRC-12 -laitteel-20 la, Beckman LS 9800 -nestetuikelaskurilla (beckman Instru ments, Inc., Irvine, CA) tai Canberra 35* -monikanava-ana-lysaattorilla, jossa jakopintana oli talliumissa uiva 7,6 cm natriumjodidikolokide.

Kompleksin muodostusta koskevissa esimerkeissä ; 25 kompleksinmuodostumisprosentti määritettiin seuraavalla yleisellä vaihtomenetelmällä, silloin kun se on ilmoitettu.

10 ml:n muovikolonni täytettiin 1 - 2 ml:11a SP-Sephadex™ C-25 -hartsia, joka turvotettiin vedessä. 30 Ylimääräinen vesi poistettiin kolonnin yläpäähän kohdiste-'·; tulla paineella. Hartsin päälle lisättiin tutkittava liuos (15 μΐ), ja sen jälkeen käytettiin eluenttina 2 ml isotonisen suolaliuoksen ja väk. NH4OH:n seosta tilavuussuhteessa 4:1. Eluentti kerättiin laskentaputkiin. Sen jälkeen 35 käytettiin 2 ml lisää eluenttia. Sen jälkeen kun eluentti 40 104898 oli kerätty toiseen laskentaputkeen, hartsin yläosaan puhallettiin paineilmaa sen saamiseksi kuivaksi. Kuivattu hartsi siirrettiin kolmanteen laskentaputkeen. Aktiivisuus kussakin laskentaputkessa mitattiin Canberra-monikanava-5 analysaattoriin kytketyllä Nal-kolokidelaskurilla. Komp leksina esiintyvän metallin määrä on ilmoitettu sinä koko-naisaktiivisuuden osana (prosentteina), joka todettiin eluentista. Vapaassa kompleksoitumattomassa tilassa olevan metallin määrä on ilmoitettu sinä prosenttiosuutena koko-10 naismetallimäärästä, joka jää hartsiin.

Kompleksoitumattoman metallin poisto ioninvaihdolla 10 ml:n muovikolonni täytettiin 0,5 ml :11a SP-Sephadex™ C-25 -hartsia, joka oli turvotettu vedessä. Ylimääräinen vesi poistettiin sentrifugoimalla kolonnia 15 4 minuuttia kierrosnopeudella 3000 min'1. Hartsin päälle laitettiin 200 - 500 μΐ kompleksiliuosta, ja putkea sentrifugoitiin jälleen 4 minuuttia kierrosnopeudella 3000 min"1. Kompleksoitumaton metalli jäi kolonniin ja kompleksoitunut eluoitui liuottimen mukana.

20 Yttriumkompleksin valmistus

Kompleksit valmistettiin valmistamalla yttriumin 3 x 10'4 M vesiliuos [YC13 *6H20, 303,26 g/mol, tai Y(OAc)3, 12,1 % H20:ta]. Halutun radioaktiivisuustason saavuttamiseksi lisättiin radioaktiivista Y3+-liuosta (Oak Ridge : 25 National Laboratories). 990 ul:aan Y3+-liuosta lisättiin • ’ 10 μΐ ligandiliuosta (0,03 M), jolloin ligandin ja metallin moolisuhteeksi tuli 1:1. Ligandi-metallisuhteen 10:1 muodostamiseen käytettiin 10-kertainen määrä ligandiliuosta. pH säädettiin arvoon 7,4 mikrolitraluokkaa olevilla 30 määrillä HCl:a tai NaOH:a. Liuoksesta tutkittiin sitten *·; kompleksoituneen yttriumin määrä edellä esitettyä katio- « ninvaihtomenetelmää käyttäen.

Samariumkompleksin valmistus

Samariumkompleksit muodostettiin edellä yttrium-35 komplekseille esitetyllä tavalla, paitsi että 3 x 10~4 M

104898 samariumliuos valmistettiin liuottamalla Sm203 (348,7 g/mol) 0,1 M HCl:oon. Radioaktiivinen Sm-153 saatiin Missourin yliopiston (Columbia, Missouri) tutkimus-reaktorista noin 3 x 10'4 M liuoksena 0,1 M HC1: ssa.

5 Eräät läpi koko tämän tekstin käytettävät termit määritellään seuraavasti.

Sanasto: Väk. tarkoittaa väkevää; *OAc tarkoittaa asetaattiryhmää, 'OCOCH3; 10 TLC tarkoittaa ohutkerroskromatografiaa; DI H20 tarkoittaa deionisoitua NANOpure™-vettä; NANOpure™-vesi on puhdasta vettä, jota saadaan Barnstead NANOpure™-vedensuodatus j ärj estelmästä; ympäristön lämpötila tarkoittaa huoneen lämpötilaa 15 eli noin 20 - 25 °C:n lämpötilaa; yön yli tarkoittaa noin 9-18 tuntia; LC tarkoittaa nestekromatografiaa; NBS tarkoittaa N-bromisukkinimidiä; MES tarkoittaa 2-(N-morfolino)etaanisulfonihappoa; 2 0 HPLC tarkoittaa suuren erotuskyvyn nestekromatogra- f iaa; PBS tarkoittaa Sigmalta peräisin olevaa fosfaatti-puskuroitua fysiologista suolaliuosta, joka sisältää 120 mmol NaCl:a/l, 2,7 mmol KCl:a/l ja 10 mmol fosfaatti-; 25 puskuria (pH 7,4)/1.

SP-Sephadex™ C-25 -hartsi on kationinvaihtohartsi, joka sisältää funktionaalisia sulfonihapporyhmiä ja jota myy Pharmacia, Inc.; min'1 = kierroksia minuutissa; 30 pD tarkoittaa pH:ta vedyn ollessa korvattu deute riumilla; DOTA = 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkahappo; HEPES = N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N'-2-etaani-35 sulfonihappo; 42 104898 BFC = bifunktionaalinen kelaatinmuodostaja;

Sykleeni = 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani; PA-DOTA = a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappo; 5 PA-DOTMA = a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-l-etikka-4,7,10-tris(metyylietik-ka) happo; BA-DOTA = a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappo; 10 OMe-BA-DOTA = a - ( 5-amino-2-metoksifenyyli) - 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikka-happo; EA-D03A = 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahappo; 15 DTPA = dietyleenitriamiinipentaetikkahappo; SCN-Bz-DTPA = 1-(4-isotiosyanaattobentsyyli)diety-leenitriamiinipentaetikkahappo; EDTA = etyleenidiamiinitetraetikkahappo; kelaatinmuodostaja on ekvivalenttinen ligandin 20 kanssa; kompleksi on ekvivalenttinen kelaatin kanssa, konjugaatti tarkoittaa kovalenttisesti vasta-ainee-seen tai vasta-ainefragmenttiin sitoutunutta kelaatinmuo-dostajaa tai kompleksia; : 25 vasta-aineet tarkoittavat CC-49:ää, CC-83:a ja B72.3:a ja niiden fragmentteja, kuten esimerkiksi Fab:tä ja F(ab')2:ta. Muita mahdollisia vasta-aineita on esitetty edellä. Hybridoomasolulinja B72.3 on talletettu kokoelmaan American Type Culture Collection numerolla ATCC HB 8108, 30 ja muut nimetyt hiiren monoklonaaliset vasta-aineet sitoutuvat TAG-72:n, kasvaimiin yhteydessä olevaan antigeenin, epitooppeihin.

Keksintöä valaistaan yksityiskohtaisemmin seuraa-villa esimerkeillä.

35 43 104898 Lähtöaineiden valmistus

Esimerkki A

DL-2-bromi-4-(4-nitrofenyyli)butaanihapon metyyli-esterin valmistus 5 Liuokseen, joka sisälsi 5 ml hiilitetrakloridia ja 15 ml (0,2 mol) tionyylikloridia, lisättiin 10,46 g (0,05 mol) 4-(4-nitrofenyyli)butaanihappoa typpikaasukehän alla. Liuosta refluksoitiin 1 tunti, jolloin aluksi vapautui vetykloridikaasua ja rikkidioksidikaasua. Lämpimään 10 liuokseen lisättiin 11,0 g (0,06 mol) N-bromisukkinimidiä 25 ml:ssa hiilitetrakloridia ja katalysaattoriksi kolme pisaraa 48-%:ista vetybromidin vesiliuosta. Bromikaasua havaittiin vapautuvan. Tummanpunaista liuosta refluksoitiin 35 minuuttia. Liuos jäähdytettiin ja kaadettiin 15 100 ml taan metanolia samalla sekoittaen. TLC-analyysi (etyyliasetaatti-heksaaniseos tilavuussuhteessa 60:40) osoitti uuden tuotteen (R£ = 0,69, silikageelilevyt) syntyneen. Ylimääräinen liuotin poistettiin pyöröhaihdutta-malla, ja tummanpunainen öljy suodatettiin flash-kromato-20 grafiasilikageelikerroksen (2,5 cm x 12,7 cm) läpi käyttäen eluenttina metyleenikloridia. Haihdutettaessa liuotin saatiin kirkas öljy (saanto 15,43 g), joka oli otsikon mukaisen yhdisteen ja lähtöaineena käytetyn butaa-nihappojohdannaisen metyyliesterin seos suhteessa 85:15.

.. 25 Otsikon mukaisen tuotteen karakterisoitiin seuraavien tie- tojen perusteella: ^-NMR (CDClj) : 8,16 (d) , 7,38 (d) , 4,20 (dd) , 3,79 (s), 2,88 (m), 2,38 (m): 13C-NMR (CDCIj, 75 MHz): 169,6, 147,5, 129,3, 123,7, 53,0, 30 44,4, 35,5, 33,0.

Esimerkki B

• · I

a-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-l-etikkahapon 1-metyyliesterin valmistus

Liuokseen, joka sisälsi 1,72 g (10,0 mmol) 35 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania 17 ml:ssa penteenillä 44 104898 stabiloitua kloroformia ja jota sekoitettiin, lisättiin 5 minuutin aikana 2,07 g (5,82 mmol) DL-2-bromi-4-(4-nit-rofenyyli) butaanihapon metyyliesteriä typpikaasukehän alla ja samalla sekoittaen. Reaktioseosta sekoitettiin noin 5 25 °C:ssa 48 tuntia. TLC (Analtechin silikageelilevyillä käyttäen liuotinseosta 2) osoitti otsikon mukaisen tuotteen (Rf = 0,73) muodostuneen. Keltainen kloroformiliuos laitettiin kooltaan 2,5 cm x 40 cm olevaan flash-kromato-grafiasilikageelipylvääseen (esieluoitu 5 % metanolia si-10 sältävällä kloroformilla), joka eluoitiin 250 ml :11a kloroformia, joka sisälsi 5 % metanolia ja sen jälkeen liuo-tinseoksella 2. Puhdasta otsikon mukaista tuotetta sisältävät jakeet yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 2,15 g (5,46 mmol, 94 %) otsikon mukaista tuotetta 15 vaaleankeltaisena lasimaisena aineena. Tämän lasimaisen aineen kloroformiliuoksen triturointi dietyylieetterin kanssa johti analyysipuhtaan valkean jauheen (sp = 156 -159 °C) saostumiseen, joka jauhe karakterisoitiin seuraa-vien tietojen perusteella: 20 1H-NMR (CDC13) : 8,14 (d) , 7,39 (d) , 3,71 (s), 3,39 (dd) , 2,5 - 3,0 (m), 2,08 (m), 2,01 (m) ; 13C-NMR (CDC13i 75 MHz): 172,7, 149,3, 146,4, 129,2, 123,6, 62,3, 51,2, 48,9, 47,2, 45,8, 45,4, 32,8,30,9.

Esimerkki C

25 2-bromi-2-(4-nitrofenyyli)etaanihapon metyylieste- rin valmistus

Seosta, joka sisälsi p-nitrofenyylietikkahappoa (25,0 g, 0,14 mol) ja tionyylikloridia (15,1 ml, 0,21 mol) kuivassa bentseenissä (100 ml), sekoitettiin ja refluksoi-30 tiin N2-vaipan alla 3 tuntia. Sen jälkeen seos haihdutettiin kuiviin alipaineessa, Jäännös liuotettiin hiilitetra-kloridiin, ja liuosta sekoitettiin ja refluksoitiin typpi-vaipan alla. Palautusjäähdyttimen alla kiehuvaan seokseen lisättiin bromi (7,2 ml, 0,14 mol) pienissä erissä 3 vuo-35 rokauden aikana. Reaktioseoksen annettiin jäähtyä, ja hap- 45 104898 pokloridiin lisättiin hitaasti metanolia (50 ml). Tulokseksi saatu bromiesteri (27 g, 71 %) saatiin talteen keltaisena alennetussa paineessa 6 tuuman lasikierukkakolon-nin läpi tislaamalla (kp = 168 °C 1,1 mm:n paineessa).

5 Otsikon mukaisen tuotteen rakenteen vahvistivat seuraavat spektritiedot: lH-NMR (CDClj) : 8,25 (d) , 7,81 (d) , 5,51 (s), 3,86 (s).

Esimerkki D

a- (4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-10 ni-l-etikkahapon 1-metyyliesterin valmistus 529 mg:aan (2,068 mmol) 2-bromi-2-(4-nitrofenyyli)-etaanihapon metyyliesteriä (valmistettu esimerkin C mukaisella menetelmällä), joka oli liuotettu 20 ml:aan aseto-nitriiliä, lisättiin kerralla liuos, joka sisälsi 354 mg 15 (2,068 mmol) 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania 20 ml:ssa asetonitriiliä, joka sisälsi juuri ja juuri riittävästi metanolia täydellisen liukenemisen aikaansaamiseksi. Tulokseksi saatua vaaleanpunaista liuosta sekoitettiin 1,5 tuntia, jonka jälkeen se väkevöitiin alipaineessa 20 35 °C:ssa pieneen tilavuuteen. Tämä epäpuhdas monoesteri- tetra-amiini puhdistettiin silikageelikromatografiällä käyttäen eluent tina 20 % (m/V) NH4OAc:a sisältävää CH3OH:a. Näin triasetaattisuolana eristetty puhdistettu monoesteri-tetra-amiini muunnettiin sitten vapaaksi amiiniksi.

;· 25 270 mgraan suolaa, joka oli liuotettu 3 mlraan vettä, li sättiin 0 °C:ssa K2C03:n vesiliuosta (10-painoprosenttista) niin, että liuoksen pH:ksi tuli 11. Emäksinen liuos uutettiin sitten 10 ml:lla kloroformia (viidesti), ja klorofor-mikerrokset yhdistettiin, kuivattiin natriumsulfaatilla ja 30 haihdutettiin, jolloin saatiin 160 mg (saanto 42 %) haluttua monoesteritetra-araiinia, joka karakterisoitiin NMR-spektrometrian ja FAB-massaspektrometrian (FAB = nopeilla atomeilla pommitus; [M + H]+ = 366) avulla sekä seuraavien tietojen perusteella: 46 1 0 4 8 9 8 Ή-NMR (CDC13) : 8,12 (d) , 7,44 (d) , 4,75 (s) , 3,76 (s) , 2,67 - 2,44 (m); 13C-NMR (CDCI3) : 171,5, 147,6, 144,0, 130,0, 124,0, 67,0, 49,8, 47,9, 46,9, 46,0.

5 Esimerkki E

N- (2-metoksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaanin valmistus

Kloroformiliuokseen (20 ml), joka sisälsi 2,9 g (16,8 mmol) 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania ja jota 10 sekoitettiin, lisättiin yhdessä eräss kloroformiliuos (20 ml), joka sisälsi 2,1 g (8,5 mmol) 2-metoksi-5-nitro-bentsyylibromidia. Sen jälkeen kun reaktioseosta oli sekoitettu huoneen lämpötilassa 3 tuntia, se suodatettiin ja suodos väkevöitiin (alipaineessa) , jolloin saatiin jään-15 nös, joka käsiteltiin kromatografisesti silikageeli, liuo-tinsseos 3). Monoalkyloitu tuote saatiin eristetyksi 79 %:n saannolla (sp = 154 - 156 °C) ja karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (CDCI3) : 162,47, 140,63, 127,92, 125,49, 124,53, 20 109,91, 55,88, 53,25, 50,90, 47,17, 45,45, 45,29.

Esimerkki F

N-(2-hydroksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaanin valmistus 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaanin (2,3 g, 14 mmol) .. 25 1,4-dioksaaniliuokseen (20 ml) lisättiin yhdessä erässä ja tasaisesti sekoittaen 2-hydroksi-5-nitrobentsyylibromidin (1,2 g, 7 mmol) dioksaaniliuos (15 ml). Muutaman minuutin kuluttua lisättiin K2C03:a (1 g), ja sekoitusta jatkettiin 1 tunti huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen reaktioseos suo-30 datettiin ja suodos haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin keltaista puolikiinteätä ainetta, joka käsiteltiin kromatografisesti (pylväässä) silkageelillä käyttäen elu-enttina liuotinseosta 5. Haluttu monoalkyloitu tuote eristettiin viimeistä kolmasosasta kirkkaankeltaista eluent-35 tia, joka sisälsi myös reagoimatonta amiinia. Haihdutuksen 104898 jälkeen keltaista öljyä trituroitiin CHCl3:n (100 ml) kanssa, ja seos suodatettiin CHCl3-liukoisen amiinilähtöaineen poistamiseksi. Lopputuote eristettiin sitten puhtaana keltaisen kiinteän aineen muodossa (1,2 g, 55 %; sp = 142 -5 145 °C) ja karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20) : 25,04. 25,28, 26,83, 31,80, 36,54, 101,88, 107,22, 110,92, 111,80, 115,26, 159,99.

Esimerkki 6 10 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaanin valmistus

Liuokseen, joka sisälsi 3,50 g (20,3 mmol) 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania 50 ml:ssa penteenillä stabiloitua kloroformia ja jota sekoitettiin, lisättiin 15 pisaroittain 5 minuutin aikana 4,00 g (17,4 mmol) l-(2-bromietyyli)-4-nitrobentseeniä typpikaasukehän alla ja samalla voimakkaasti sekoittaen.

Sekoitusta jatkettiin noin 18 tuntia huoneen lämpötilassa (noin 25 °C:ssa), jolloin liuoksesta saostui amii-20 nihydrobromidikiteitä. Koko reaktioseo siirrettiin flash-kromatografiapylvääseen (2,5 cm x 46 cm) , joka oli esielu-oitu 5 % metanolia sisältävällä kloroformilla; 200 ml tätä liuosta käytettiin eluenttina ja eluointia jatkettiin sen jälkeen liuotinseoksella 3. Halutusta tuotteesta erotet-:· 25 tiin 1,45 g (9,7 mmol) p-nitrostyreeniä (Rf = 0,98, liuo- tinseos 1) . Haluttu monofunktionaalinen otsikon mukainen yhdiste saatiin eristetyksi keltaisena öljynä (2,27 g, 7,06 mmol, 40,6 %), joka jähmettyi seisoessaan (Rf = 0,73, liuotinseos 1).

30 Otsikon mukaisesta yhdisteestä otettu näyte kitey tettiin uudelleen CHCl3-sykloheksaaniseoksesta, ja sen ka-rakterisistiset tiedot olivat seuraavat: sp = 146,5 - 148,5 °C; "H-NMR (CDC13) : 8,135 (d, m), 7,395 (d, m), 2,91 (t) , 2,77 35 (t), 2,72 (t), 2,50 (t), 2,60 (s); 48 1 0 4 8 9 8 13C-NMR (CDC13; 75 MHz) : 148,5, 146,7, 129,6, 123,4, 55,5, 51,4, 46,9, 45,9, 45,1, 33,7.

Esimerkki H

1-(4-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-5 kaanin valmistus 50 ml:aan kloroformia lisättiin lisättiin 3,5 g (20,3 mmol) 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania ja 1,7 g (7,87 mmol) p-nitrobentsyylibromidia, ja seosta sekoitettiin typen alla 25 °C:ssa 24 tuntia. Hydrobromidisuolan 10 kloroformiliete siirrettiin sitten flash-silikageelikroma- tografiapylvääseen (liuotinseos 3) , jonka koko oli 2,5 cm x 43 cm. Saatiin 2,13 g (6,93 mmol) otsikon mukaista tuotetta analyysipuhtaana, vaaleankeltaisena, kiinteänä aineena 88 %:n saannolla (Rf = 0,58, liuotinseos 3), sp = 15 128 - 129 °C, joka aine karakterisoitiin tarkemmin seuraa- vien tietojen perusteella: ^-NMR (CDClj) : 8,19 (d) , 7,49 (d) , 3,69 (s), 2,82 (t) , 2,70 (t), 2,59 (m); 13C-NMR (CDC13, 75 MHz): 147,2, 128,4, 123,8, 58,8, 51,7, 20 47,1, 46,3, 45,1.

(Esimerkkiä I ei ole lainkaan, jotta vältetään sekaantuminen myöhempien biologisten esimerkkien numeroinnin kanssa .)

Esimerkki J

.. 25 1-(4-aminobentsyyli)1,4,7,10-tetra-atsasyklodode- kaanin valmistus 10 ml:aan metanolia liuotettiin 690 mg (2,25 mmol) 1-(4-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania (valmistettu esimerkin H mukaisella menetelmällä). Liuok-30 seen lisättiin 350 mg katalysaattoria, joka sisälsi 10 % palladiumia hiilikantoaineella. Liuoksen läpi johdettiin ylimäärin vetyä 25 °C:n lämpötilassa. TLC osoitti 45 minuutin kuluttua otsikon mukaisen tuotteen syntyneen (Rf = 0,33, liuotinseos 3). Muodostunut otsikon mukainen tuote 35 puhdistettiin kromatografisesti flash-silikageelipylväässä 49 104898 (liuotinseos 3), jonka koko oli 2,5 cm x 41 cm, ja saatiin 480 mg (77 %) otsikon mukaista tuotetta vaaleankeltaisena kirkkaana öljynä.

Vapaan emäksen muodossa oleva otsikon mukainen tuo-5 te (103 mg, 0,37 mmol) muunnettiin hydrokloridisuolaksi puhaltamalla vapaan emäksen etanoliliuosten läpi vedetöntä vetykloridia. Syntyneen otsikon mukaisen yhdisteen tetra-hydrokloridisuolan saanto oli kylmällä etanolilla pesun ja alipainekuivauksen jälkeen 147 mg (0,347 mmol), sp = 255 -10 260 °C (hajoaa), ja se karakterisoitiin tarkemmin seuraa- vien tietojen perusteella: XH-NMR (D20, pD = 1,9): 7,56 (d) , 7,47 (d) , 3,95 (s), 3,28 (t), 3,23 (t), 3,09 (t), 2,96 (t); 13C-NMR (D20, pD = 1,9, 75 MHz): 138,3, 134,2, 132,2, 126,0, 15 58,5, 50,3, 46,7, 44,6, 44,3.

Esimerkki K

2-metoksi- 5-nitrobentsyylinitriilin valmistus Liuokseen, joka sisälsi natriumsyanidia (6 g, 121,9 mmol) vedessä (5,3 ml) jajonka lämpötila oli 70 °C, 20 lisättiin pienissä erissä ja samalla sekoittaen kuuma liuos, joka sisälsi 2-metoksi-5-nitrobentsyylibromidia (25 g, 101,6 mmol) etanolissa (15 ml). Reaktioseosta refluksoi-tiin sitten 1,5 tuntia, ja se jäähdytettiin ja suodatettiin. Suodatuskakku pestiin asetonitriilillä ja suodos ;· 25 haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin 2-metoksi-5- nitrobentsyylinitriiliä (19,5 g, 100 %) kellertävänruskeana kiinteänä aineena. Tuote karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (CDC13) : 161,4, 141,0, 125,7, 124,6, 119,8, 116,5, 30 110,2, 56,3, 18,8.

Esimerkki L

• « 2-metoksi-5-nitrofenyylietikkahapon valmistus Lietettä, joka sisälsi 2-metoksi-5-nitrobentsyyli-nitriiliä (19,5 g) (valmistettu esimerkin K mukaisella 35 menettelytavalla) väk. HCl:ssa (20 ml) refluksoitiin 3 104898 tuntia. Jäähdytyksen jälkeen raakatuote saatiin talteen suodattamalla ja pestiin vedellä. Kiinteä aine sekoitettiin natriumhydroksidin kuumaan vesiliuokseen ja seos suodatettiin kuumana. Oranssi liuos jäähdytettiin ja tehtiin 5 happamaksi HClrlla. Sakka suodatettiin erilleen, pestiin vedellä ja kuivattiin, jolloin saatiin 2-metoksi-5-nitro-fenyylietikkahappoa valkeana kiinteänä aineena (15 g, 70 %) . Tuote karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella : 10 13C-NMR (CDCI3-CD3OD) : 172,8, 162,5, 140,7, 126,2, 124,7, 124,1, 109,7, 55,8, 35,0.

Esimerkki H

α-bromi- (2-metoksi-5-nitrofenyyli)etikkahapon me-tyyliesterin valmistus 15 Lietteeseen, joka sisälsi 2-metoksi-5-nitrofenyyli- etikkahappoa (2,266 g, 10,74 mmol) (valmistettu esimerkin L mukaisella menettelytavalla) kuivassa bentseenissä (50 ml), lisättiin tionyylikloridia (4,0 ml, 54,8 mmol). Pulloon asetettiin kuivausputki ja jäähdytin, ja seosta 20 refluksoitiin 2 tuntia. Tulokseksi saatu keltainen liuos väkevöitiin alipaineessa pieneen tilavuuteen ja sekoitettiin kuivaan hiilitetrakloridiin. Lisättiin bromia (0,6 ml, 11,6 mmol), ja liuosta refluksoitiin 2 vuorokautta ilmakehän kosteudelta suojattuna. Reaktioseos väkevöi-.. 25 tiin pieneen tilavuuteen, ja siihen lisättiin metanolia (50 ml). Sen jälkeen kun ylimääräinen metanoli oli haihdutettu alipaineessa, tulokseksi saatu öljy puhdistettiin kromatografisesti (silikageeli, metyleenikloridi-heksaani-seos suhteessa 4:1). Otsikon mukainen tuote (2,399 g, 30 74 %) saatiin keltaisena öljynä. Tuote karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 1H-NMR (CDC13) : 8,45 (dd) , 8,15 (dd) , 6,95 (d) , 5,75 (s), 3,99 (s), 3,78 (s).

104898

Esimerkki N

a-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-l-etikkahapon metyyliesterin valmistus

Liuokseen, joka sisälsi 1,4,7,10-tetra-atsasyklodo-5 dekaania (2,72 g, 15,79 mmol) kloroformissa (50 ml) ja jota sekoitettiin, lisättiin liuos, joka sisälsi o-bromi-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)etikkahappoa (2,399 g, 7,89 mmol) (valmistettu esimerkin M mukaisella menettelytavalla) kloroformissa (10 ml). Seosta sekoitettiin huo-10 neen lämpötilassa 2 tuntia. Samea seos väkevöitiin sitten pieneen tilavuuteen alipaineessa ja huoneen lämpötilassa. =aakatuote puhdistettiin kromatografisesti (silikageeli, liuotinseos 3) . Otsikon mukainen yhdiste saatiin talteen keltaisena kiinteänä aineena (2,60 g, 83 %) ja karakteri-15 soitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (CDCIj) : 170,7, 161,6, 139,9, 125,0, 124,5, 124,2, 110,2, 59,5, 55,5, 50,5, 48,0, 47,3, 45,6, 44,3, 43,5.

Esimerkki 0 DL-2-bromi-4-(4-nitrofenyyli)butaanihapon isopro-20 pyyliesterin valmistus

Liuokseen, joka sisälsi hiilitetrakloridia (10 ml) ja tionyylikloridia (30 ml, 0,4 mol), lisättiin typpikaa-sukehän alla 4-(4-nitrofenyyli)butaanihappoa (21,0 g, 0,10 mol) Harppin et ai. [J. Org. Chem. 40 (1975) 3420 -;· 25 27] menettelytapaa käyttäen. Liuosta refluksoitiin l tun- ti, jolloin aluksi vapautui nopeasti vetykloridia ja rikkidioksidia. Tässä vaiheessa lämpimään liuokseen lisättiin N-bromisukkinimidiä (22,0 g, 0,12 mol) hiilitetrakloridiin (50 ml) liuotettuna ja katalysaattoriksi 8 pisaraa 30 48-%:ista vetybromidin vesiliuosta, jolloin havaittiin vapautuvan bromia. Tummanpunaista liuosta refluksoitiin 35 minuuttia lisää. Liuos jäähdytettiin ja kaadettiin iso-propanoliin(400 ml) samalla sekoittaen. TLC-analyysi (me-tyleenikloridi, silikageelilevyt) paljasti uuden tuotteen 35 (Rf = 0,73). Ylimääräinen liuotin poistettiin, ja tummanpu- 52 104898 nainen öljy suodatettiin flash-kromatografiasilikageeli-kerroksen läpi (7,6 cm x 15 cm) käyttäen eluenttina mety-leenikloridia. Liuotin poistettiin alipaineessa, ja vaaleankeltainen öljy siirrettiin flash-kromatografiapylvääseen 5 (7,6 cm x 46 cm) ja elueoitiin metyleenikloridilla, jol loin saatiin 25,0 g (0,076 mol) otsikon mukaista bromies-terituotetta 75 %:n saannolla kirkkaana öljynä isopropano-lilla solvatoituneena, joka tuote sisälsi alle 5 % bromau-tumatonta esteriä ja joka karakterisoitiin seuraavien tie-10 tojen perusteella: 1H-NMR (CDC13) : 8,16 (d, 2 H), 7,38 (d, 2 H), 5,05 (sept., 1 H), 4,14 (dd, 1 H), 2,88 (m, 4 H), 2,39 (m, 4 H), 1,29 (d, 6 H) ; 13C-NMR (CDCI3) : 168,7, 147,7, 129,3, 123,8, 69,9, 45,1, 15 35,6, 33,0, 21,5, 21,2.

Esimerkki P

a - [3- (4-nitrofenyyli)propyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-l-etikkahapon 1-metyyliesterin valmistus

Liuokseen, joka sisälsi 3,137 g (18,2 mmol) 20 sykleenistä vapaata emästä 30 mlrssa penteenillä stabiloi tua kloroformia ja jota sekoitettiin, lisättiin 5 minuutin aikana 4,81 g (14,6 mmol) DL-2-bromi-4-(4-nitrofenyyli)bu-taanihapon isopropyyliesteriä typpikaasukehän alla ja samalla sekoittaen. Reaktioliuosta sekoitettiin 24 tuntia ;· 25 huoneen lämpötilassa. TLC-analyysi (liuotinseos 2) paljas- ti muuttumisen otsikon mukaiseksi monoalkyloitumistuot-teeksi (Rf = 0,78, detektointi ninhydriinin, jodin ja UV-valon avulla). Keltainen kloroformiliuos siirrettiin kooltaan 2,5 cm x 43 cm olevaan flash-kromatografiasilikagee-30 lipylvääseen, joka oli esieluoitu 5 % metanolia sisältävällä kloroformilla. Eluointi 300 ml :11a tätä liuotinseos-ta ja sen jälkeen liuotinseoksella 2 antoi tuotteeksi puhdasta otsikon mukaista yhdistettä sisältäviä jakeita, jotka yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 4,85 g 35 (5,46 mmol) vapaan emäksen muodossa olevaa otsikon mukais- 53 104898 ta tuotetta vaaleana öljynä (saanto 79 %), joka karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: 1H-NMR (CDClj) : 8,15 (d, 2 H), 7,40 (d, 2 H), 5,07 (p, 1 H), 3,35 (dd, 1 H), 2,65 - 3,0 (m, 13 H), 2,5 - 2,64 (m, 5 4 H) , 2,14 (m, 1 H), 2,00 (m, 1 H), 1,28 (dd, 6 H) ; 13C-NMR (CDC13) : 171,6, 149,5, 146,5, 129,2, 123,6, 68,1, 62,7, 49,2, 47,5, 45,9, 45,7, 32,9, 31,0, 22,1, 22,0; IR (CDC13, cm'1) : 3231 (N-H) , 2978, 2933, 1721 (esterikar-bonyyli), 1601, 1512, 1458, 1345, 1107; 10 FAB-massaspektri (m/e): 422 ([M + H]*), 408, 392.

Kaavan IA mukaisten yhdisteiden valmistus

Esimerkki 1 a- (4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon monometyylitrietyyliesterin 15 valmistus 46 ml:aan asetonitriiliä, joka sisälsi 4,6 g (33,3 mmol) vastajauhettua vedetöntä kaliumkarbonaat tia, liuotettiin 700 mg (1,91 mmol) a-(4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l-etikkahapon 1-metyyli-20 esteriä (valmistettu esimerkin D mukaisella menettelytavalla) . Tähän suspensioon lisättiin kerralla 1,022 g (6,12 mmol) etyylibromiasetaattia. Sen jälkeen kun suspensiota oli sekoitettu huoneen lämpötilassa 4 tuntia, se suodatettiin alipaineessa, suodatuskakku pestiin 15 ml :11a .. 25 asetonitriiliä (kahdesti) ja suodos haihdutettiin alipai neessa 38 °C:ssa, jolloin saatiin puhdistamatonta otsikon mukaista tetraesteriä purppuranpunaisena kiinteänä aineena. Tetraesteri puhdistettiin sitten silikageelikromato-grafian avulla käyttäen eluenttina 5 % C2H5OH:a sisältävää 30 CHCl3:a ja sen jälkeen liuotinseosta 3, jolloin saatiin 620 mg (0,988 mmol, 52 %) haluttua tuotetta. Tämä tuote •« karakterisoitiin FAB-massaspektrometrian avulla ( [M + H]+ = 624) ja lisäksi seuraavien tietojen perusteella: 1H-NMR (CDC13) : 8,24 (d) , 7,45 (d) , 4,94 (s), 4,35 - 4,10 35 (m), 3,79 (s), 3,75 - 1,84 (m), 1,34 - 1,22 (m); 54 104898 13C-NMR (CDC13) : 174,3, 173,8, 173,6, 171,5, 147,6, 138,9, 131,5, 123,4, 64,8, 61,5, 61,4, 60,2, 55,4, 55,0, 53,1, 52,9, 52,7, 52,4, 51,9, 51,7, 48,8, 48,3, 44,9, 19,1, 14,1.

5 Esimerkki 2 o- (4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon valmistus 30 ml .-aan 6 N HCl.-a liuotettiin 300 mg (0,478 mmol) a -(4-nitrofenyyli-1,4,7,10 -1etra- atsasyklododekaani-10 1,4,7,10-tetraetikkahapon monometyylitrietyyliesteriä (valmistettu esimerkin 1 mukaisella menettelytavalla), ja seosta refluksoitiin yön yli. Tämän refluksointijakson päätyttyä liuos haihdutettiin alipaineessa 70 °C:ssa, jolloin saatiin keltaista kiinteätä ainetta. Tämä kiintoaine 15 liuotettiin 3 ml:aan vettä, liuos suodatettiin ja suodos haihdutettiin, jolloin saatiin 253 mg (0,378 mmol, 79 %) raakatuotetta. Tämä tuote puhdistettiin preparatiivisen TLC:n avulla [silikageeli, kehitys 20 % (m/V) NH4OAc:a sisältävällä CH3OH:lla] ja karakterisoitiin FAB-massaspektro-20 metrian avulla ( [M + H]+ = 526) ja lisäksi seuraavien tietojen perusteella: Ή-NMR (D20) : 8,21 (d) , 7,42 (d) , 483 (s), 3,83 - 2,19 (m), 1,92 (s); 13C-NMR (D20) : 175,0, 173,6, 171,8, 167,0, 166,3, 146,9, 25 138,3, 130,1, 123,0, 62,2, 54,0, 53,0, 52,2, 50,4, 97,3, 46,8, 44,8, 42,8, 20,0.

Esimerkki 3 a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon (BA-DOTA) valmistus 30 Menetelmä A:

Tetrahapon (valmistettu esimerkin 2 mukaisella menettelytavalla) nitroryhmän katalyyttinen hydraus toteutettiin Adams-katalysaattoria (Pt02) ja vetyä käyttäen suurin piirtein kvantitatiivisella saannolla, jolloin saa-35 tiin otsikon mukainen tuote. Tämä tuote karakterisoitiin 55 104898 FAB-massaspektrometrian ([M + H]+ = 496) ja anioninvaihto-HPLC:n (Q-Sepharose™-geelillä) avulla sekä lisäksi seuraa-vien tietojen perusteella: Ή-NMR (D20) : 8,12 (d) , 7,86 (d) , 5,66 (s) , 4,73 - 4,57 5 (m), 4,27 - 3,78 (m), 3,39 - 2,91 (m); 13C-NMR (D20) : 176,54, 176,52, 176,46, 141,1, 128,9, 120,9, 112,5, 65,0, 55,9, 55,7, 53,6, 49,7, 49,5, 49,3, 45,7, 45,4, 44,9, 44,6, 41,4.

Menetelmä B: 10 Toinen menetelmä tämän yhdisteen valmistamiseksi oli esimerkissä D saadun monoesteritetra-amiiniyhdisteen muuntaminen monohappotetra-amiiniyhdisteeksi (6 N HCl, refluksointi yön yli), mitä seurasi alkylointi vesiliuoksessa bromietikkahappoa käyttäen ja sitten nitroryhmän 15 pelkistys amiiniryhmäksi (Pt02-katalysaattori), jolloin saatiin edellä kuvatun tuotteen kanssa identtinen tuote.

Esimerkki 4 a- (4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-l, 4,7-trietikkahapon valmistus 20 60 ml:aan 6 N HCl:a liuotettiin 2,0 g (5,48 mmol) monoesteritetra-amiiniyhdistettä (valmistettu esimerkin D mukaisella menettelytavalla). Seosta kuumennettiin 95 °C:ssa yön yli (noin 10 tuntia) , jonka jälkeen se haihdutettiin alipaineessa 75 °C:ssa, jolloin saatiin 2,53 g 25 (5,11 mmol, 96 %) monohappotetra-amiinitetrahydrokloridia keltaisena kiinteänä aineena.

Edellä saatu monohappotetra-amiinitetrahydrokloridi (0,5 g, 1,0 mmol) liuotettiin 15 ml:aan vettä, ja pH säädettiin NaOH:lla arvoon 9. Valmistettiin erillinen bromi-30 etikkahapon (0,71 g, 5,13 mmol) liuos, ja se lisättiin mo-nohappotetra-amiinin vesiliuokseen. Liuoksen pH säädettiin taas arvoon 9 ja pidettiin reaktion aikana tässä arvossa pienillä 1,0 N NaOH -lisäyksillä. Samalla kun reaktiota sekoitettiin, siitä otettiin eri vaiheissa näyte-eriä ja 35 alkyloitumisen etenemistä seurattiin anioninvaihto-HPLC:n 104898 avulla. Kun dialkyloitumistuotteen (kaikkiaan 3 asetaatti-ryhmää läsnä) määrä oli saavuttanut maksiminsa, koko reak-tioseos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin tummaa kiinteätä ainetta. Tämä alkylointituotteiden raakaseos puhdistettiin 5 sitten silikageelikromatografiällä (eluointi liuotinseok-sellal), jota seurasivat preparatiivinen anioninvaihtokro-matografia (eluointi liuotingradienttia 0 %:sta 100 %:iin 1 M NH4OAc:a käyttäen), sen jälkeen käsittely preparatiivi-silla TLC-levyillä (kehitys liuotinseoksessa 4) ja lopuksi 10 silikageelikromatografia (eluointi liuotinseoksella 4) .

Tällä laajamittaisella puhdistusmenettelyllä saatiin 30 mg (0,06 mmol, 6,0 %) otsikon mukaista tuotetta keltaisena kiinteänä aineena. Tämä tuote karakterisoitiin FAB-massa-spektrometrian ( (M + H]+ = 468) ja anioninvaihto-HPLCm 15 avulla sekä lisäksi seuraavien tietojen perusteella: lH-NMR (D20) : 8,12 (bs) , 7,35 (bs), 4,76 (s), 3,57 - 3,44 (m), 2,97 - 1,83 (m), 1,80 (s); 13C-NMR (D20) : 181,75, 180,68, 179,00, 175,37, 147,70, 141,22, 133,08, 123,53, 68,44, 59,72, 56,00, 52,80, 49,96, 20 49,29, 47,86, 45,36, 44,26, 42,78, 42,25, 23,72.

Esimerkki 5 a- (4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7-trietikkahappopentahydrokloridin ja a-(4-aminofenyyli) -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,10-tetraetik-;· 25 kahappopentahydrokloridin valmistus

Alkuloitumistuotteiden raakaseos valmistettiin esimerkissä 4 kuvatulla menettelytavalla. Tämä raakaseos käsiteltiin kromatografisesti silikageelipylväässä käyttäen eluenttina 20 % (m/V) NH4OAc.-a sisältävää CH3OH:a. Asianmu-30 kaiset tästä pylväästä saadut jakeet yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin. Raakatuote, joka sisälsi huomattavia määriä NH4OAc:a, liuotettiin 80 ml:aan NANOpure™-vettä ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin vaaleanruskeata kiinteätä ainetta. Tämä kiintoaine liuotettiin 20 ml:aan NANOpure™-35 vettä, ja liuosta ravistettiin Pt02-katalysaattorin kanssa 104898 H2-atmosfäärissä, kunnes vedyn kulutus lakkasi. Katalysaattori erotettiin alipainesuodattamalla ja suodos kylmäkuivatuin, jolloin saatiin keltaista kiinteätä ainetta. Kiintoaine liuotettiin 3 mlraan liuotinseosta 4 ja käsi-5 teltiin kromatografisesti silikageelillä liuotinseosta 4 käyttäen. Yhdistetyistä jakeista poistettiin sitten liuotin alipaineessa ja ne kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 779,6 mg vaaleankeltaista kiinteätä ainetta. 13C-NMR- ja protoni-NMR-spektri viittasivat siihen, että tämä tuote on 10 kahden mahdollisen geometrisen isomeerin seos suhteessa 50:50. Isomeeriseos käsiteltiin HCl:lla (ylimäärin) ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 548,4 mg (saanto 61 %) otsikon mukaisia tuotteita, sp. >270 °C. Anionvaihto-kromatografiässä (HPLC-systeemi III) esiintyi vain yksi 15 suuri huippu (puhtaus >94 %); FAB-massaspektri paljasti geometristen isomeerien esiintymisen ([M + H]* = 438).

Esimerkki 6 a-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkahapon 1,4,7,10-tetrame-20 tyyliesterin valmistus

Liuokseen, joka sisälsi 1,43 g (3,63 mol) a-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l-etikkahapon 1-metyyliesteriä (valmistettu esimerkin B mukaisella menettelytavalla) 40 ml:ssa argonilla huuhdottua • 25 asetonitriiliä, lisättiin 1,71 g (12,34 mmol) vedetöntä kaliumkarbonaattia samalla voimakkaasti sekoittaen. Reak-tioseokseen lisättiin 1,78 g (11,61 mmol) metyylibromiase-taattia, ja reaktioseosta sekoitettiin noin 25 °C:ssa 48 tuntia. TLC-analyysi osoitti uuden tuotteen muodostuneen 30 (Rf = 0,62, liuotinseos 2). Lietteeseen lisättiin 6,0 g ·.. flash-kromatografiasilikageeliä ja asetonitriili poistet- tiin pyöröhaihduttimellä. Tulokseksi saatu aine siirrettiin silikageelipylvääseen, jonka koko oli 2,5 cm x 41 cm ja joka oli esieluoitu 5 % metanolia sisältävällä kloro-35 formilla. Noin 400 ml valmistetusta liuoksesta käytettiin 58 104898 useiden poolittomien epäpuhtauksien ja reagoimattoman al-kylointiaineen eluointiin. Sen jälkeen eluoitiin liuotin-seoksella 2, ja tuotetta (R£ = 0,62) sisältävät jakeet kerättiin talteen, yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin 5 saatiin 2,1 g (3,44 mmol, 95 %) otsikon mukaista tuotetta vaaleankeltaisena lasimaisena aineena. ^-NMR osoitti tämän tuotteen olevan konformaatioisomeerien eli geometristen isomeerien seos suhteessa 2:1.

^-NMR (CDClj, 50 °C) : 8,137 (d) , 8,128 (d) , 7,398 (d) , 10 7,385 (d) , 3,82 (s), 3,76 (s), 3,75 (s), 3,74 (s), 3,68 (s), 1,5-3,52 (m); 13C-NMR (CDClj, 50 °C, 75 MHz): 175,8, 174,2, 174,1, 174,0, 149,0, 129,5, 129,3, 123,6, 60,1, 55,1, 52,8, 52,7, 52,6, 52,4, 52,2, 52,1, 52,0, 51,2, 51,1, 51,0, 49,1, 48,8, 15 47,5, 45,2, 34,2, 32,6.

Esimerkki 7 o-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon 1,4,7,10-tetrame-tyyliesterin valmistus 20 25 ml:aan metanolia, joka sisälsi 400 mg kataly saattoria, joka sisälsi 10 % palladiumia hiilikantoaineel-la, liuotettiin typpikaasukehän alla 1,41 g (2,31 mol) a-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-kaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon 1,4,7,10-tetrametyylieste-; 25 riä (valmistettu esimerkin 6 mukaisella menettelytavalla).

Liuoksen läpi johdettiin ylimäärin vetyä 1 baarin paineessa 3 tunnin ajan. TLC osoitti voimakkaasti ninhydriinipo-sivisen aineen (Rf = 0,62, liuotinseos 2) muodostuneen.

Metanolia sisältävä katalysaattoriliete suodatettiin pii-30 maan läpi ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin otsi-·· kon mukainen tuote (1,21 g, 2,08 mmol, 91 %) valkeana la simaisena kiintoaineena (konformaatioisomeerien seoksena suhteessa 2:1). Vähemmistönä oleva konformaatioisomeeri eli geometrinen isomeeri erotettiin pääisomeerista flash-35 kromatografiän avulla käyttäen eluenttina 10 % metanolia 59 104898 sisältävää kloroformia, jolloin saatiin otsikon mukainen tuote likaisenvalkoisena jauheena (sp =89-95 °C), joka karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: ^-NMR (CDC13/ 50 °C) : 6,94 (d) , 6,89 (d) , 6,69 (d) , 6,66 5 (d) , 3,91 (S), 3,80 (s), 3,78 (s), 3,74 (s), 3,73 (s), 3,72 (s), 3,71 (s), 1,5 - 3,5 (m); 13C-NMR (CDC13, 50 °C, 75 MHz): 176,1, 174,0, 173,9, 172,2, 170,4, 169,6, 144,2, 144,1, 130,6, 130,5, 129,5, 129,1, 115,9, 115,8, 62,6, 58,7, 55,1, 54,3, 52,7, 52,5, 52,3, 10 52,2, 52,1, 52,0, 51,9, 51,8, 51,7, 50,2, 50,0, 47,3, 44.7, 32,8, 31,8, 30,0, 25,2; FAB-massaspektri (m/e) : 602 ([M + Na+]+), 618 ([M + K+]+), 624 ( [M + 2Na+ - H+] +) .

Esimerkki 8 15 o-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon (PA-DOTA) valmistus 50 ml:aan väk. suolahappoa liuotettiin 1,5 g (2,59 mmol) a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-20 atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon 1,4,7,10-tet- rametyyliesteriä (esimerkin 7 mukaisella menettelytavalla valmistettuna raakaseoksena suhteessa 2:1). Reaktioseosta refluksoitiin noin 105 °C:ssa 6 tuntia. TLC (liuotinseos 1) osoitti esterin (Rf = 0,88) muuttuneen hydrokloridisuo-; · 25 lan muodossa olevaksi otsikon mukaiseksi tuotteeksi (Rf = 0,43) . Ylimääräinen liuotin poistettiin pyöröhaihduttimellä, ja tulokseksi saatu valkea kiinteä aine kuivattiin. Otsikon mukaista tuotetta saatiin hydrokloridisuolana 1,6 g, ja se karakterisoitiin seuraavien tietojen perus-30 teella: .. "H-NMR (D20, pD = 1,0, 90 °C) : 7,48 (d) , 7,42 (d) , 2,8 - 4,3 (m), 2,23 (m), 2,03 (m); 13C-NMR (D20, pD = 1,0, 90 °C, 75 MHz) : 176,4, 174,9, 171,6, 144.7, 132,9, ,132,8, 130,4, 125,7, 61,7, 56,8, 56,0, 35 53,7, 53,1, 51,6, 47,9, 34,3, 37,6;

6 O

104898 FAB-massaspektri (m/e) : 524 ([M + H]+), 546 ([M + Na+] Ί , 624 ( [M + 2Na+ - H+] +) .

Mahdolliset pienet esteriepäpuhtaudet poistettiin flash-kromatografiaa ja liuotinseosta l käyttäen hydroklo-5 ridisuolan muodossa olevasta otsikon mukaisesta yhdisteestä. 1,0 g otsikon mukaisen yhdisteen hydrokloridisuolaa siirrettiin flash-silikageelikromatografiakolonniin, jonka koko oli 2,5 cm x 58 cm. Jakeet, jotka sisälsivät pelkästään otsikon mukaista tuotetta ammoniumkaliumsekasuolan 10 muodossa, yhdistettiin, jolloin saatiin 580 mg tuotetta.

HPLC-analyysi osoitti aineen pinta-alaan perustuvan puhtauden olevan yli 98 % aallonpituudella 230 ja 254 nm.

FAB-massaspektri (m/e): 562 ([M + K*]*), 584 ([M + K+ + Na* - H+] +) , 624 ([M + 2Na+ - H+] +) .

15 Esimerkki 9 o-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,10 -trietikkahapon ammoniumkaliumsekasuolan eristys

Seka tetra- että trihappoja (2,05 g) sisältävä raa-20 kaliuos (valmistettu esimerkin 8 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin mahdollisimman pieneen määrään liuotinseosta 1 ja siirrettiin flash-silikageelikromatografiapyl-vääseen, jonka koko oli 30 cm x 7,6 cm ja joka oli esi-eluoitu tällä liuottimena. Eluoituneet otsikon mukaista 25 tuotetta (Rf = 0,63 liuotinseoksessa 1) sisältävät jakeet kerättiin ja saatiin 200 mg a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,10-trietikkahapon ammoniumkaliumsekasuolaa. 1H-NMR- ja 13C-NMR-analyysi viit-tasivat siihen, että tämä trihappo oli symmetrinen isomee-30 ri (1,4,10-trihappopaikkaisomeeri): .. 1H-NMR (D20, pD = 0,5 DCl:lla säädettynä, T = 90 °C) : 7,52 (d), 7,46 (d), 3,60 (m), 3,54 (m), 3,19 (m); 13C-NMR (D20, pD = 0,5, T = 90 °C) : 176,1, 170,2, 140,0, 132,7, 131,1, 126,1, 57,6, 57,2, 56,1, 54,9, 53,2, 51,5, 35 51,2, 31,2.

6i 104898 FAB-massaspektri (m/e) : 466 ( [M + H+]+) , 488 ( [M +

Na*]+) , 504 ( [M + K+]+) , 526 ( [M + K+ + Na+ - IT] +) f 542 ( [M + 2K+ - H+] +) .

Esimerkki 10 5 a-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon tetrametyyliesterin valmistus

Seokseen, joka sisälsi a-(2-metoksi-5-nitrofenyy-li)-1,4,7,10-tetra-at sasyklododekaani-1-et ikkahapon 1-melo tyyliesteriä (580 mg, 1,47 mmol) (valmistettu esimerkin N mukaisella menettelytavalla) ja jauhettua kaliumkarbonaattia (1,15 g, 8,32 mmol) asetonitriilissä (20 ml) ja jota sekoitettiin, lisättiin metyylibromiasetaattia (565 μΐ, 5,97 mmol). Reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilas-15 sa 2 tuntia. Sen jälkeen seos suodatettiin ja seos väke-vöitiin öljyksi alipaineessa. Raakatuote puhdistettiin kromatografisesti (silikageeli, 8 % metanolia sisältävä metyleenikloridi). Otsikon mukainen tuote saatiin keltaisena kiinteänä aineena (469 mg, 52 %; TLC Rf = 0,4, silika-20 geeli, 10 % CH3OH:a CHCl3:ssa) ja karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (CDCIj) : 173,2, 172,6, 161,2, 139,1, 125,1, 124,6, 120,5, 110,7, 57,0, 55,6, 53,5, 52,6, 51,3, 50,8, 46,8, 46,0, 44,0.

: 25 Esimerkki 11 a-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon valmistus

Liuosta, joka sisälsi a-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkaha-30 pon metyyliesteriä (valmistettu esimerkin 10 mukaisella menettelytavalla) vökevässä HCl:ssa (5 ml, J. T. Baker ULTREX), refluksoitiin typpikaasukehän alla 5 tuntia. Liuos haihdutettiin sitten kuiviin alipaineessa, jolloin jäi kiinteä jäännös. Tämä jäännös puhdistettiin kromatografi-35 sesti (silikageeli, liuotinseos 6), jolloin saatiin otsi- 62 104898 kon mukaista tuotetta likaisenvalkoisena kiinteänä aineena (209 mg). Tämä aine muunnettiin tetrahydrokloridisuolaksi ja karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20-DClf 80 °C) : 171,0, 166,9, 161,2, 139,0, 125,5, 5 119,3, 110,7, 56,8, 54,5, 52,7, 51,0, 49,2, 49,0, 46,3, 42,9.

Esimerkki 12 a-(2-metoksi-5-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon tetra-ammonium-10 suolan valmistus

Liuokseen, joka sisälsi a-(2-metoksi-5-nitrofenyy-li)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetik-kahappoa (157 mg; valmistettu esimerkin 11 mukaisella menettelytavalla) vedessä (20 ml), lisättiin platinaoksidia 15 (20 mg) . Tätä seosta hydrattiin (vedyn paine 1 bar) huo neen lämpötilassa 1 tunti. Suodatuksen jälkeen aine puhdistettiin edelleen kromatografisesti (silikageeli, liuo-tinseos 5) , jolloin saatiin otsikon mukaista yhdistettä (141 mg) likaisenvalkoisena kiinteänä aineena, joka karak-20 terisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (DjO-DCI) : 175,5, 172,6, 172,3, 159,9, 128,8, 127,5, 124.6, 123,8, 115,5, 61,2, 58,1, 57,3, 55,7, 53,4, 51,6, 49.6, 47,4.

Esimerkki 13 : 25 1-(4-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode- kaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-trimetyyliesterin valmistus 4 ml:aan argonilla huuhdottua asetonitriiliä lisättiin samalla sekoittaen 100 mg (0,236 mmol) 1-(4-amino-30 bentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaanin tetrahydro- kloridisuolaa (valmistettu esimerkin J mukaisella menettelytavalla) , 260 mg (1,88 mmol) kaliumkarbonaattia ja 108 mg (0,708 mmol) metyylibromiasetaattia. Seosta sekoitettiin 25 °C:ssa 48 tuntia. Suolaa sisältävä liuos siir-35 rettiin flash-silikageelikromatografiapylvääseen, jonka 63 104898 koko oli 2,5 cm x 10 cm, ja eluoitiin asetonitriilillä. Haluttua tuotetta sisältävät jakeet yhdistettiin ja liuotin poistettiin pyöröhaihduttamalla, jolloin saatiin 65 mg (0,132 mmol, 56 %) otsikon mukaista tuotetta, joka karak-5 terisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: 1H-NMR (CDC13) : 7,29 (d) , 6,75 (d) , 4,62 (s), 4,20 (leveä s), 3,70 (s), 3,69 (s), 3,64 (s), 3,62 (t), 3,27 (s), 3,06 (t) , 2,82 (leveä t), 2,79 (leveä t); 13C-NMR (CDCI3, 75 MHz): 171,4, 171,0, 148,4, 132,8, 117,5, 10 115,0, 55,9, 55,3, 54,7, 53,1, 51,7, 51,4, 50,6, 50,5, 47,4 .

Esimerkki 14 1-(4-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-kaani-4,7,10-trietikkahapon hydrokloridisuolan valmistus 15 Liuos, joka sisälsi 42 mg (0,085 mmol) 1-(4-amino- bentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-tri-etikkahapon 4,7,10-trimetyyliesteriä (valmistettu esimerkin 13 mukaisella menettelytavalla) 2 ml:ssa 6 N suolahappoa, kuumennettiin 80 °C:seen 2 tunniksi. TLC paljasti 20 useita tuotteita (halutun otsikon mukaisen tuotteen Rf = 0,60, liuotinseos 1). Poistettaessa liuotin saatiin 41 mg puhdistamatonta otsikon mukaista tuotetta.

Esimerkki 15 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa-25 syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-trimetyylies-terin valmistus

Liuokseen, joka sisälsi 2,24 g (6,97 mmol) l-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania (valmistettu esimerkin G mukaisella menettelytavalla) 30 75 ml:ssa argonilla huuhdottua asetonitriiliä, lisättiin samalla voimakaasti sekoittaen 3,17 g vedetöntä kaliumkarbonaattia. Tähän reaktioseokseen lisättiin pisaroittain 5 minuutin aikana 3,20 g (20,9 mmol) metyylibromiasetaattia. Reaktioseosta sekoitettiin 17 tuntia argonkaasukehän alla.

35 TLC-analyysi osoitti lähtöaineen (Rf = 0,73, liuotinseos 1) 64 104898 muuttuneen uudeksi tuotteeksi (Rf = 0,46, liuotinseos 1). Liuokseen lisättiin 70 ml kloroformia, ja suspendoitunutta suolaa sisältävä liuos siirrettiin flash-silikageelikroma-tografiapylvääseen, jonka koko oli 2,5 cm x 18 cm. Tuote 5 eluoitiin 10 % metanolia sisältävällä kloroformilla, jolloin saatiin 2,95 g otsikon mukaista tuotetta meripihkan-värisenä öljynä, josta muodostui haurasta lasimaista ainetta alipaineessa kuivattaessa (78 %). Otsikon mukainen tuote karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 10 1H-NMR (CDC13) : 8,17 (m,m), 7,4 - 7,66 (m), 2,38 - 3,95 (m) ; 13C-NMR (CDCI3, 75 MHz): 171,5, 171,2, 146,7, 144,5, 130,3, 123,9, 56,0, 55,2, 53,5, 53,4, 52,6, 51,9, 51,8, 50,6, 48,1, 29,5.

15 Esimerkki 16 1 -[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-metyyliesterin valmistus 50 ml:aan metanolia liuotettiin 2,8 g (5,18 mmol) 20 puhdistamatonta 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-tri-metyyliesteriä (valmistettu esimerkin 15 mukaisella menettelytavalla) . Liuokseen, jota sekoitettiin ja josta poistettiin ilma typellä, lisättiin katalysaattoria (600 mg), ; ' 25 joka sisälsi 10 % palladiumia hiilikantoaineella. Liuos • „ pidettiin typpikaasukehän alla, ja liuoksen läpi johdettiin sitten sitä samalla sekoittaen vetyä (1 bar, 20 -25 °C) 2,5 tuntia. Liuoksen läpi johdettiin sitten typpeä usean minuutin ajan, ja katalysaattori poistettiin suodat-30 tamalla liuos ohuen piimakerroksen läpi. TLC-analyysi ·· (10 % metanolia kloroformissa) osoitti otsikon mukaisen tuotteen läsnäolon (Rf = 0,14). Otsikon mukainen tuote eluoitiin silikageelistä kloroformilla, jolloin saatiin 2,2 g (4,33 mmol, 83 %) keltaista lasimaista ainetta, joka ka-35 rakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 104898 ^-NMR (CDClj) : 7,03 (d, m) , 6,63 (d) , 3,4 - 3,6 (m) , 2,7 -3,2 (m); 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): 171,4, 171,2, 145,6, 129,7, 125,6, 115,5, 55,9, 54,4, 54,3, 53,0, 52,8, 51,8, 51,6, 50,3, 5 47,8, 28,6; FAB-massaspektri (m/e) : 508 ( [M + H*]+).

Esimerkki 17 1-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon (EA-D03A) hydroklori-10 disuolan valmistus 30 ml:aan väk. HCl:a liuotettiin 850 mg (1,69 mmol) 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-kaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-trimetyyliesteriä (valmistettu esimerkin 16 mukaisella menettelytavalla). Liuos-15 ta sekoitettiin 70 - 80 °C:ssa 2,5 tuntia, sen annettiin jäähtyä 25 °C:seen sitä samalla sekoittaen ja sekoitusta jatkettiin noin 18 tuntia. Liuotin poistettiin pyöröhaih-duttimella alipaineessa (10 mm, 75 °C) . Liuotin ja ylimääräinen vetykloridi poistettiin tulokseksi saadusta kirk- 20 kaasta öljystä alipainekuivauksella (0,1 mm, 45 °C). Otsi kon mukaista tuotetta saatiin 820 mg valkeana kiinteänä aineena (Rf = 0,46, liuotinseos 2), joka karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: 1H-NMR (D20, pD = 1,9, T = 90 °C) : 7,50 (d) , 7,41 (d) , 4,26 : 25 (s), 3,43 - 3,68 (m), 3,0 - 3,3 (m); 13C-NMR D20, pD = 1,9, T = 90 °C) : 176,7, 170,9, 139,8, 133,0, 131,2, 125,9, 57,5, 57,1, 55,4, 54,4, 52,7, 51,0, 50,6, 31,3; FAB-massaspektri (m/e): 466 ([M + H+]+) , 488 ([M + Na*]+), 30 510 (M + 2Na+ - H+] +) .

HPLC-analyysi osoitti pinta-alaan perustuvan puhtauden olevan yli 92 % (254 nm) 10 cm Partisil-5 OD53 RAC II -käänteisfaasikolonnia. Eluenttina oli 10 % asetonit-riiliä sisältävä 0,05 M kaliumfosfaattiliuos, pH 7,0.

35 66 104898

Esimerkki 18 1- [2-(4-isotiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon (SCN-EA-D03A) valmistus 5 1-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon hydrokloridisuola (valmistettu esimerkin 17 mukaisella menettelytavalla; 106 mg, 0,21 mmol) liuotettiin 2 ml:aan vettä typpikaasu-kehän alla ja samalla sekoittaen. Lisättiin hitaasti nat-10 riumvetykarbonaattia (105,6 mg, 1,26 mmol) hiilidioksidin kehittymisestä aiheutuvan vaahtoamisen estämiseksi (tuloksena pH-arvo 8,0). Lisättiin tiofosgeenia (16,8 μΐ, 0,22 mmol), ja 1 tunnin voimakkaan sekoituksen jälkeen TLC-analyysi (20 % vettä asetonitriilissä) osoitti lähtö-15 aineen (Rf = 0,12) muuttuneen otsikon mukaiseksi tuotteeksi (Rf = 0,26). Liuotin poistettiin raakatuotteesta pyöröhaih-duttamalla, jolloin saatiin 130 mg otsikon mukaista tuotetta, joka sisälsi natriumkloridia. Tämän aineen infra-puna-analyysi (KBr-tabletti) vahvisti isotiosyanaattiryh-20 män läsnäolon (SCN = 2150 cm'1) .

Esimerkki 19 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon trietyyliesterin valmistus ; 25 5 ml:aan asetonitriililiuosta, joka sisälsi 395 mg (1,12 mmol) 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania (valmistettu esimerkin G mukaisella menettelytavalla) 1,5 g (11 mmol) K2C03:a ja jota sekoitettiin, lisättiin yhdessä erässä 496 μΐ (4,5 mmol) etyyli-30 bromiasetaattia. Sen jälkeen kun seosta oli kuumennettu 68 °C:ssa N2-kaasukehän alla 1 tunti, tulokseksi saatu suspensio suodatettiin. Suodatuskakku pestiin CH3CN:llä (2 x 10 ml). Sen jälkeen suodos haihdutettiin, jolloin saatiin raakatuote viskoosina öljynä, jota trituroitiin dietyyli-35 eetterin (30 ml) kanssa ja joka haihdutettiin, jolloin 67 104898 saatiin 650 mg (saanto 100 %) 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyy li] -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani4,7,10-trietikkahapon trietyyliesteriä, joka karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 5 ^-NMR (CDC13) : 8,2 (d) , 7,6 (d) , 4,3 (q) , 2,6 - 3,8 (m), 1,55 (t); FAB-massaspektri: [M + H]+ = 588.

Esimerkki 20 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsalo syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon valmistus

Suspensioon, joka sisälsi 200 mg (0,35 mmol) 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani- 4,7,10-trietikkahapon trietyyliesteriä (valmistettu esimerkin 19 mukaisella menettelytavalla) 15 ml:ssa vettä, 15 lisättiin 59 μΐ NaOH:a (50-painoprosenttista, 3 ekv.). Seosta sekoitettiin 80 °C:ssa 6 tuntia. Syntynyt homogeeninen oranssi liuos jäähdytettiin sitten huoneen lämpötilaan ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin oranssia kiinteätä ainetta, joka puhdistettiin HPLCrn (Q-Sepharose™, 20 HPLC-systeemi III) avulla käyttämällä lineaarista 60 minuutin liuotingradienttia, jonka muodosti 0 - 10-%:inen HOAc:n vesiliuos, jolloin saatiin (50 %) hydrolysoitu tuote 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsasyklo-dodekaani-4,7,10-trietikkahappo, joka karakterisoitiin • 25 seuraavien tietojen perusteella: "H-NMR (D20) : 8,22 (d), 7,55 (d), 3,60 - 3,90 (m), 3,10 -3,40 (m).

Esimerkki 21 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-30 syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon (EA-D03A) valmistus

Parrin hydrauslaitteeseen laitettiin 50 ml vesiliuosta, joka sisälsi 214 mg (0,43 mmol) 1-[2-(4-nitrofenyyl-i)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trie-tikkahappoa (valmistettu esimerkin 20 mukaisella menette-35 lytavalla) ja 40 mg 10 % Pd/C -katalysaattoria. Suspensio- 68 104898 ta ravistettiin, kunnes vedyn kulutus lakkasi. Suodatuksen jälkeen vesiliuos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 197 mg (98 %) 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-4,7,10-trietikkahappoa kellertävänruskeana 5 kiinteänä aineena, joka karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 1H-NMR (D20) : 7,35 (d) , 7,20 (d) , 3,10 - 3,70 (m); 13C-NMR (D20) : 173,85, 172,50, 137,90, 131,90, 130,22, 121,55, 56,25, 55,14, 54,42, 50,12, 49,65, 49,31, 31,00.

10 Esimerkki 22 1- (2-metoksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-trimetyylies-terin valmistus

Asetonitriililiuokseen (20 ml), joka sisälsi 1,0 g 15 (3 mmol) 1-(2-metoksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra- atsasyklododekaania (valmistettu esimerkin E mukaisella menettelytavalla), lisättiin yhdessä erässä 1,6 g (11 mmol) metyylibromiasetaattia. Tunnin kuluttua lisättiin kaliumkarbonaattia (0,3 g), ja sekoitusta jatkettiin 20 huoneen lämpötilassa 12 tuntia. Sen jälkeen reaktioseos suodatettiin ja suodos väkevöitiin (alipaineessa). Jäännös käsiteltiin kromatografisesti pylväässä (silikageeli, CH3CN-CH3OH-seos tilavuussuhteessa 9:1), jolloin saatiin haihdutuksen jälkeen triesteriä valkeana kiinteänä aineena - 25 68 %:n saannolla, ja se karakterisoitiin seuraavien tieto- jen perusteella: 1H-NMR (CDC13) : 8,19 (d) , 8,14 (s), 7,18 (d) , 2,58 - 3,99 (m) ; nC-NMR (CDC13) : 173,53, 172,83, 164,59, 142,28, 128,51, 30 127,69, 126,49, 112,30, 57,25, 56,90, 55,03, 54,21, 53,06, 52,09, 52,00, 51,54, 50,68, 50,30, 49,85, 49,63, 49,31, 49,00, 48,68, 48,37, 48,05, 47,70, 47,39.

Esimerkki 23 1- (2-metoksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-35 syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon valmistus 69 104898 6 M suolahappoon tehtyä liuosta (3 ml), joka sisälsi 0,25 g (0,45 mmol) 1-(2-metoksi-5-nitrobentsyyli)- 1.4.7.10- tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 4.7.10- trimetyyliesteriä (valmistettu esimerkin 22 mukai-5 sella menettelytavalla) , sekoitettiin ja kuumennettiin 100 °C:ssa 24 tuntia. Huoneen lämpötilaan jäähdytyksen jälkeen lisättiin 5 ml vettä ja vesiliuos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin kellertävänruskeaa kiinteätä ainetta. Pyl-väskromatografiakäsittelyn (silikageeli, liuotinseos 5) 10 trihappo eristettiin likaisenvalkoisena kiinteänä aineena (sp = 228 - 230 °C, hajoaa) 60 %:n saannolla ja karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: XH-NMR (D20) : 8,18 (s), 8,09 (s), 7,12 (d) , 3,87 (s), 2,10 - 3,60 (m); 15 13C-NMR (D20) : 180,45, 179,80, 163,66, 140,22, 128,60, 126,24, 122,66, 111,50, 59,91, 59,06, 56,44, 52,75, 50,92, 48,84.

Esimerkki 24 1- (2-metoksi-5-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-20 syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon valmistus

Typellä huuhdottuun vesiliuokseen (50 ml), joka sisälsi 50 mg Pt02:a, lisättiin 50 mg 1-(2-metoksi-5-nitro-bentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-tri-etikkahappoa (valmistettu esimerkin 23 mukaisella menette-; ' 25 lytavalla). Sen jälkeen kun liuosta oli hydrattu Parrin pommissa 1 tunti, se suodatettiin ja vesisuodos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin aniliinijohdannainen kellertävänruskeana kiinteänä aineena (saanto 95 %), sp. >240 °C (hajoaa) , ja se karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tieto-30 jen perusteella: ^H-NMR (D20) : 7,54 (leveä s) , 7,21 (d) , 7,09 (d) , 7,05 (s), 6,88 (s), 3,84 (s), 3,78 (s), 2,85 - 3,56 (m) ; 13C-NMR (D20) : 180,59, 179,77, 153,38, 124,16, 124,03, 122,82, 120,18, 113,68, 112,43, 59,06, 57,02, 55,96, 35 53,67, 50,52, 50,08, 49,70, 49,04, 48,32.

70 104898

Esimerkki 25 1-(2-hydroksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon valmistus

Vesiliuokseen (1 ml) , joka sisälsi 1-(2-hydroksi-5-5 nitrobentsyyli)-1,4,7,10 -1etra - atsasyklododekaania (200 mg, 0,62 mmol; valmistettu esimerkin F mukaisella menettelytavalla), lisättiin bromietikkahappoa (309 mg, 2,2 mmol) ja NaOH:a (2,5 ml, noin 1 M) sekoittaen liuosta samalla huoneen lämpötilassa. Reaktion etenemistä seurat-10 tiin LC:n avulla (anionivaihto, Q-Sepharose™) , ja pH pidettiin suunnilleen arvossa 8 lisäämällä tarpeen mukaan NaOH:a. 12 tunnin kuluttua liuos kylmäkuivattiin ja kiinteä jäännös käsiteltiin kromatografisesti (pylväs) silika-geelillä käyttäen eluointiin liuotinseosta 5. Keltainen 15 pääjae väkevöitiin, liuotettiin veteen ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin haluttua tuotetta kirkkaankeltaisena jauheena (150 mg, 49 %), sp = 230 - 235 °C (hajoaa) , ja se karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella : 20 13C-NMR (D20) : 166,41, 165,60, 160,00, 119,91, 116,02, 113,85, 111,71, 104,59, 45,20, 44,50, 43,96, 36,43.

Esimerkki 26 1- (2-hydroksi- 5 -aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon valmistus : 25 Argonilla huuhdottuun vesiliuokseen (25 ml) , joka sisälsi N-(2-hydroksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahappoa (200 mg, 0,4 mmol; valmistettu esimerkin 25 mukaisella menettelytavalla), lisättiin Pt02: a (130 mg) ja johdettiin sen jäl-30 keen H2:ä (Parrin hydrauslaite). Sen jälkeen kun keltainen väri oli hävinnyt kokonaan, liuos huuhdottiin argonilla ja suodatettiin. Sen jälkeen vesiliuos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin haluttu tuote kellertävänruskeana kiinteänä aineena (146 mg, 78 %).

35 71 104898

Esimerkki 27 α-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietikka) hapon 2-isopropyyli-4,7,10-trimetyyliesterin (PN-DOTMA-5 trimetyyli-isopropyyliesterin) valmistus

Liuokseen, joka sisälsi 1,00 g (2,37 mmol) a-[3-(4-nitrofenyyli)propyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1-etikkahapon 1-metyyliesteriä (valmistettu esimerkin P mukaisella menettelytavalla) 35 mlrssa kuivaa asetonitrii-10 liä, lisättiin 1,15 g (8,32 mmol) vedetöntä kaliumkarbonaattia samalla voimakkaasti typen alla sekoittaen. Lisättiin optisesti aktiivista maitohapon metyyliesterin bent-seenisulfonaattia (1,79 g, 7,36 mmol, S:R = 98,2), ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 60 tuntia. TLC-15 analyysi osoitti uusien tuotteiden muodostuneen (otsikon mukaisten tetraestereiden Rf = 0,71, liuotinsysteemi 2, ja triestereiden Rf = 0,89). Tulokseksi saatu liuos, joka sisälsi suspendoituneita karbonaattisuoloja, kaadettiin 40 ml:aan kloroformia ja saostuneet epäorgaaniset suolat 20 suodatettiin pois. Tästä suodoksesta poistettiin liuotin, ja puhdistamaton oranssi öljy käsiteltiin kahdesti kroma-tografisesti flash-silikageelipylväässä, jonka koko oli 2,5 cm x 41 cm, käyttäen eluenttina liuotinseosta 2, jolloin saatiin otsikon mukaista tuotetta erottamattomien ; 25 tetraesteridiastereomeerien seoksena (1,00 g, 1,47 mmol, saanto 62 %), joka ei sisältänyt alialkyloituneita tuotteita .

Tämän aineen ^-NMR-analyysi osoitti sen sisältävän noin 0,5 ekvivalenttia reagoimatonta bentseenisulfonaatti-30 johdannaista. Tämän aineen NMR-spektrit eivät sulautuneet ·· yhteen 6 0 °C:ssa kloroformissa: Ή-NMR (CDC13, 60 °C) : 7,9 - 8,1 (m, 2 H), 7,2 - 7,4 (m, 2 H), 5,06 (m, 1 H), 3,4 - 4,0 (m, 9 H), 1,7 - 3,4 (m, 20 H), 1,0-1,7 (m, 15 H); 72 104898 IR (CDClj, cm'1) : 2980, 2840, 1725, 1710 (esterikarbonyyli) , 1590, 1510, 1440 , 1340; FAB-massaspektri (m/e) : 702 ( [M + Na+]+) , 687.

Esimerkki 28 5 a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietik-ka) hapon 2-isopropyyli-4,7,10-trimetyyliesterin (PA-DOTMA-trimetyyli-isopropyyliesterin) valmistus a-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-10 syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietik ka) hapon 2-isopropyyli-4,7,10-trimetyyliesteri (950 mg, 1,40 mmol, korjaamatta) (valmistettu esimerkin 27 mukaisella menettelytavalla), joka sisälsi reagoimatonta a-[3-(4-nitrofenyyli)propyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-15 ni-l-etikkahapon 1-metyyliesteriä, liuotettiin 10 ml:aan metanolin 30-%:ista vesiliuosta, joka sisälsi 1,00 g 10 % Pd/C -katalysaattoria typpikaasukehän alla. Liuoksen läpi johdettiin ylimäärin vetyä 7 tunnin ajan. Tässä vaiheessa TLC-tutkimus osoitti voimakkaasti ninhydriinipositiivisen 20 aineen muodostuneen (Rf = 0,62, liuotinseos 2, lähtöaineen Rf = 0,71). Metanolia sisältävä katalysaattoriliete suodatettiin piimään läpi, ja haihdutettaessa liuotin saatiin 800 mg puhdistamatonta otsikon mukaista tuotetta kirkkaana öljynä, joka sisälsi bentseenisulfonaattiesterin samanai-' 2 5 kaisen hydrogenolyysin seurauksena muodostunutta bentsee- nisulfonihappoa (Rf = 0,09, liuotinseos 2). Epäpuhdas öljy käsiteltiin kromatografisesti flash-silikageelipylväässä, jonka koko oli 2,5 cm x 20 cm, käyttäen eluenttina 10 % metanolia sisältävää kloroformia, joka eluoi huokostilaan 30 vaaleankeltaisen vyöhykkeen. Sen jälkeen käytettiin liuo-tinseosta 2 otsikon mukaisen tuotteen (480 mg) eluointiin 52 %:n saannolla erottamattomien diastereomeerien ja geometristen isomeerien seoksena. 1H-NMR-spektrin aromaattisella alueella havaittiin kolme eri AB-kvartettia: 73 104898 lH-NMR (CDCI3, 30 °C) : 6,63 - 8,0 (kvartetit, 4 H) , 5,07 (tn, 1 H, isopropyylin metiini-H) , 3,53 - 3,9 (m, 13 H, neljä singlettiä kohdissa 3,85, 3,73, 3,69 ja 3,56), 3,46 (m, 1 H), 3,25 (leveä t, 3 H) , 2 - 3,1 (m, 14 H) , 1,0 - 5 2,0 (m, 15 H) ; 13C-NMR (CDCI3, 30 °C) : 177,3, 177, 176,4, 176,2, 175,9, 174,3, 172,9, 170,6, 145,3, 144,9, 130,8, 129,7, 129,3, 129,1, 128,8, 128,4, 127,5, 126,3, 115,2, 115,1, 114,9, 69,0, 68,4, 67,3, 61,6, 57,8, 57,4, 56,7, 56,5, 56,4, 10 52,9, 52,7, 52,1, 50,8, 50,7, 50,6, 47,3, 47,1, 47,0, 46.9, 46,5, 46,3, 44,8, 44,5, 44,3, 34,1, 32,9, 32,5, 32,2, 31,8, 24,8, 22,2, 22,1, 22,0, 21,8, 21,6, 15,8, 14.9, 7,7, 7,5, 7,4, 7,1; IR (CDC13, cm'1) : 2960, 2840, 1720, 1510, 1450, 1375; 15 FAB-massaspektri (m/e) : 672 ([M + Na*]+), 686.

Esimerkki 29 a-(2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietikka) hapon (PADOTMA) valmistus 20 a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietik-ka) hapon 2-isopropyyli-4,7,10-trimetyyliesterin diastereo-meerien seos (400 mg, 0,59 mmol; valmistettu esimerkin 28 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin 50 ml:aan väkevää y ' 25 (6 N) suolahappoa, ja liuosta refluksoitiin 30 tuntia.

TLC-analyysi (liuotinseos 1) osoitti esterin (Rf = 0,98, liuotinseos 1) muuttuneen kahdeksi uudeksi täpläksi (nopeammin liikkuvan diastereomeerin Rf = 0,6 ja hitaammin liikkuvan Rf = 0,54, liuotinseos 1, molemmat täplät UV-, 30 ninhydriini- ja jodipositiivisia). Ylimääräinen liuotin .. poistettiin pyöröhaihduttimellä, ja kuivauksen jälkeen saatiin otsikon mukaisen tuotteen puhdistamattomien dia-stereomeerien seos (403 mg) hydrokloridisuolana. Otsikon mukaisen tuotteen kahden diastereomeerin preparatiivinen 35 erotus tehtiin siirtämällä 290 mg (0,51 mmol) raakasuolaa 74 104898 flash-silikageelikromatografiapylvääseen, jonka koko oli 1 cm x 13 cm ja joka eluoitiin liuotinseoksella 8. Suuremman Rf-arvon omaava diastereomeeri (119 mg, 0,21 mmol) saatiin puhtaammassa muodossa kuin diastereomeeri (90 mg, 5 0,16 mmol), jonka Rf-arvo oli pienempi, koska suuremman

Rf-arvon omaava diastereomeeri eluoitui pylväästä ensin. Sen diastereomeerin XH-NMR-spektri, jolla oli suurempi Rf: ^H-NMR (DjO, 90 °C, pD = 7,5): 7,12 (d, 2 H), 6,80 (d, 2 H), 3,66 (m, 1 H), 3,57 (leveä t, 3 H), 2 - 3,4 (m, 19 10 H), 1,89 (m, 1 H), 1,37 (m, 1 H), 1,15 (d, 3 H), 1,10 (d, 3 H), 1,06 (d, 3 H); 13C-NMR (D20, 90C, pD = 7,5): 184,4, 184,2, 184,0, 183,3, 135,9, 132,6, 131,7, 119,1, 78,2, 69,0, 61,7, 61,5, 61,1, 57,4, 54,1, 49,7, 49,6, 48,2, 47,7, 47,2, 34,8, 33,8, 9,6, 15 9,1, 9,0; FAB-massaspektri (m/e): 566 ([M + H"] ") , 588 ((M + Na+]+), 604 ([M + K+]+), 626 ( [M + K* + Na+ - H*] +) , 642 ([M + 2K+ -H*n.

Lopputuotteiden, kompleksien, valmistus 20 Metalli-ligandikompleksit valmistettiin erilaisin, alla esitetyin menetelmin. Menetelmät käsittivät metallin ja ligandin sekoittamisen vesiliuoksessa ja pH:n säätämisen haluttuun arvoon. Kompleksien muodostus toteutettiin liuoksissa, jotka sisälsivät suoloja ja/tai puskureita : 25 sekä vettä. Joskus kuumennettujen liuosten havaittiin an- tavan parempia saantoa kuin muodostettaessa kompleksi ympäristön lämpötilassa. Myös BFC:n valmistuksessa käytetyn tuotteeneristys- ja -puhdistusmenettelyn on osoitettu vaikuttavan kompleksin muodostukseen.

30 Esimerkki 30 a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon ammoniumsuolan samarium (III) -kompleksin [Sm(BA-DOTA)] valmistus

Pieni erä (53 mg, 0,094 mmol) a-(4-aminofenyyli)-35 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-1etraet ikkahap- 75 104898 poa (valmistettu esimerkin 3 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin 100 μ1:ΆΆΏ. vettä ja käsiteltiin 3 ml :11a 0,043 M Sm (OAc) 3-liuosta (48,8 mg, 0,128 mmol) pHrssa 6-7. Tätä liuosta kuumennettiin 100 °C:ssa ja määritet-5 tiin kompleksinmuodostumisaste anioninvaihto-HPLC:llä. Kun kompleksin muodostuminen oli täydellistä anionivaihtokro-matografian mukaan (HPLC-systeemi III), liuos jäähdytettiin huoneen lämpötilaan (noin 25 °C) ja kylmäkuivattiin. Samariumkompleksi puhdistettiin silikageelikromatografiän 10 avulla (eluenttina liuotinseos 1). Tämä menettelytapa antoi tulokseksi otsikon mukaista tuotetta 82 %:n saannolla. Tämä kompleksi karakterisoitiin TLC:n, FAB-massaspektro-metrian ja anioninvaihto-HPLC:n avulla sekä lisäksi seu-raavien tietojen perusteella: 15 1H-NMR (Da0) : 8,94, 7,81, 7,21, 6,97, 6,80, 5,63, 5,01, 4,58, 4,01, 3,56, 1,78, 1,53, 1,24, 1,10, 0,77, -2,80, -2,95, -3,21, -3,91; 13C-NMR (Da0) : 190,3, 184,9, 181,4, 146,8, 134,3, 122,7, 116,4, 80,8, 72,6, 64,2, 57,2, 55,8, 54,7, 53,4, 51,5, 20 49,7, 45,5, 43,5, 23,6.

FAB-massaspektri: [M + H+]+ = 645 (Sm-isotooppimalli). Esimerkki 31 a- (4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)kompleksin val-; 25 mistus

Valmistettiin liuos, joka sisälsi 150 μΐ Sm-153:a (3 x 10'4 mol/1 0,1 N HCl:ssa) ja 600 μΐ SmCl3:a (3 x 10'4 mol/1 0,1 N HCl:ssa), lisäämällä Sm-153-liuos SmCl3-liuokseen. Sitten lisättiin 5,0 μΐ 2,0 M NaOAc:a ja 30 sen jälkeen 45 μΐ 50 mM ligandin (valmistettu esimerkin 3 mukaisella menettelytavalla) HEPES-puskuriliuosta. Liuokseen pH säädettiin 275 μ1:1ΐ3 0,5 M HEPES:ää arvoon 7. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 μ1:η suuruiseen osaan, ja toista osaa kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa.

76 104858

Liuokset laskettiin SP-Sephadex™-kationinvaihto-hartsin läpi. Kompleksoituneen metallin prosenttiosuus määritettiin aikaisemmin kuvattua menettelytapaa käyttäen. Tulokset osoittavat, että 99,6 % metallista oli kompleksi-5 na kuumennetun näytteen tapauksessa ja 96,6 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.

Kelaattien pH-stabiilisuus

Metalli-ligandikompleksien stabiilisuus mitattiin asettamalla ne alttiiksi erilaisille pH-arvoille ja analy-10 soimalla kompleksi liuoksesta. Matalassa pH:ssa ligandin protonoituminen voi aiheuttaa metallin vapautumisen. Korkeassa pH:ssa metallihydroksidit kilpailevat kelaatin muodostumisen kanssa. Niinpä inerttejä kelaatteja etsittäessä toivottu inertti kelaatti säilyy siis kelaattina sekä kor-15 keassa että matalassa pH:ssa.

Eräiden keksinnön mukaisesti saatavien kelaattien inerttiysprofiilit muodostettiin seuraavissa esimerkeissä kuvattuja menetelmiä käyttäen. Joissakin tapauksissa kela-toitumaton metalli poistettiin laskemalla liuos kationin-20 vaihtohartsin läpi. Kompleksiliuosten pH: n säätämiseen noin arvosta 1 suunnilleen arvoon 14 käytettiin laimeita natriumhydroksidi- ja suolahappoliuoksia. Kompleksina säilyneen metallin prosenttiosuus määritettiin sitten aikaisemmin kuvatuin menetelmin.

: 25 Samalla tavalla valmistettiin useita bifunktionaa- lisiä kelaattikonjugaatteja, ja ne asetettiin alttiiksi pH:lie 2,8, 4,0 ja 6,0. Liuoksessa säilyneen konjugaatin määrä määritettiin HPLC:llä säteilynmittausdetektoria käyttäen. Tulokset on esitetty biologisessa osassa esimer-30 kissä XX.

·· Esimerkki 32 a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium (III)kompleksin pH-stabiilisuus 104898 77

Esimerkistä 30 peräisin olevat kuumennettu ja kuumentamaton näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen osaan, joiden koko oli 250 μΐ. Toisen 250 μ1:η erän pH säädettiin HClrlla seuraavassa taulukossa esitettyihin 5 arvoihin. Toisen 250 μ1:η erän pH säädettiin mikrolitra-luokkaa olevilla määrillä NaOH:ta haluttuihin arvoihin. Kun haluttu pH saavutettiin, otettiin 25 μ1:η näyte ja siitä määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla tavalla. Tulokset olivat seulo raavat:

Kompleksina % pH .Ruumen- Kuumen nettu tamaton 15 _______- Ί . 98,9 92,7 3__99 T 6 93f 3 5__99 T 6 92,9 7 99,6 95.7 20 9__99f 9 95 T 8 n__99,6 95,7 13__99,6 9H,5 . 25 Nämä tulokset osoittavat tämän näytteen stabiili- suuden, kuumennettiin sitä sitten tai ei, testaus-pH:sta riippumatta.

Esimerkki 33 a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-30 ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon yttrium(III)kompleksin val mistus 10 pl:aan liuosta, joka sisälsi 1,4 mg a-(4-amino-fenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l, 4,7,10-tetra-etikkahappoa/100 μΐ (valmistettu esimerkin 3 mukaisella 35 menettelytavalla), lisättiin 100 μΐ Y(OAc)3:a (0,003 M), 7β 104898 johon oli lisätty Y-90.-ää. Tähän liuokseen lisättin 500 μΐ vettä ja sen jälkeen 125 μΐ NaOAcra (0,5 M). Liuokseen lisättiin vettä (265 μΐ) sen kokonaistilavuuden saamiseksi 1 ml:ksi. Tämä liuos jaettiin kahteen yhtä suureen osaan.

5 Toinen osa kuumennettiin 100 °C:seen 1 tunniksi. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua kationinvaihtomenettelyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että 84 % metallista oli kompleksina kuumen-10 netun näytteen tapauksessa ja 4 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.

Esimerkki 34 a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon lutetium(III)kompleksin val-15 mistus a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahappoliuos (valmistettu esimerkin 3 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin tislattuun veteen niin, että liuoksen väkevyydeksi tuli 1,63 mg/ml.

20 Lutetiumkloridiliuos valmistettiin liuottamalla lutetiumkloridi 0,1 N HCl:oon niin, että tuloksena oli liuos, jonka väkevyys oli 3,9 mg/ml (0,01 M). Merkkiaineena käytettiin lutetium-177:ää (0,3 mM).

30 μΐ 0,01 M lutetiumliuosta lisättiin 2 μΐ-.aan Lu-: 25 177-liuosta. Lisättiin asianmukainen määrä edellä saatua ligandia ja kokonaistilavuuden kasvattamiseksi 1,0 ml:ksi HEPES-puskuria (0,1 M, pH 7,6). Syntyneet liuokset olivat 0,3 mM ligandin ja lutetiumin suhteen. Liuos kuumennettiin sitten 100 °C:seen 1 tunniksi, ja kompleksina olevan Lu:n 30 prosenttiosuudeksi määritettiin aikaisemmin kuvatulla ka-·· tioninvaihtomenetelmällä 86 %.

Esimerkki 35 o-(4-isotiosyanaattofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)-35 kompleksin valmistus 104898 79 Näyte-erä, 7 mg (10,8 μπιοί) , a- (4-aminofenyyli) - 1.4.7.10- tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkaha-pon samarium(III)kompleksia (valmistettu esimerkin 30 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin 400 μΐ-.aan vettä.

5 Lisättiin ylimäärin (50 μΐ) tiofosgeenia ja sen jälkeen 400 μΐ CHCl3:a, ja kaksifaasista reaktioseosta sekoitettiin voimakkaasti 30 minuuttia. Tämän jälkeen vesikerros uutettiin 500 μ1:1ΐ3 CHCl3:a (neljästi) ja kylmäkuivattiin sitten, jolloin saatiin haluttua otsikon mukaista tuotetta 10 kvantitatiivisella saannolla.

UV-spektrissä tällä yhdisteellä esiintyi absorptio-huippu aallonpituuksilla 272 nm ja 282 nm. TLC (silikagee-li, kehitys CH3CN-H20-seoksella tilavuussuhteessa 75:25) antoi Rf-arvoksi 0,38. Lähtöaineen R£-arvo on 0,19. 15 IR-spektrissä esiintyi SCN-venytyshuippu aaltoluvulla 2100 cm'1; FAB-massaspektri: [M + H] * = 687.

Esimerkki 36 a- (4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon ammoniumsuolan yttrium(III)-20 kompleksin valmistus Näyte-erä, 90 mg (160 mmol), a-(4-aminofenyyli)- 1.4.7.10- tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkahap-poa (valmistettu esimerkin 3 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin 1 ml:aan vettä. Tähän liuokseen lisättiin 3 ml : 25 vettä, joka sisälsi 51 mg (192 mmol) Y(OAc)3:a. Reaktio- seosta (pH =6-7) kuumennettiin sitten 100 °C:ssa 2 tuntia. Tulokseksi saatu liuos laskettiin sitten lasivillan läpi ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 126 mg keltaista kiinteätä ainetta. Tämä kiintoaine käsiteltiin kromatogra-30 fisesti silikageelillä (liuotinseos 1) , jolloin saatiin ;· 71 mg (76 %) haluttua kompleksituotetta. Anioninvaih- toanalyysi osoitti viipymäajan samaksi kuin vastaavalla Sm-kompleksilla. Otsikon mukainen tuote karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 80 104898 13C-NMR (D20) : 180,8, 180,5, 179,9, 146,1, 133,4, 122,0, 116,1, 74,9, 66,3, 56,3, 55,8, 55,4, 55,1, 54,8, 52,2, 46,0, 44,0, 23,6; ^-NMR (D20) ; 6,90 (d) , 6,70 (d) , 4,40 (s) , 3,45 - 3,06 5 (m), 2,71 - 2,10 (m), 1,75 (s) ; FAB-massaspektri: [M + H+] = 582.

Esimerkki 37 a-(4-isotiosyanaattofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon natriumsuolan 10 yttrium (III) kompleksin valmistus Näyte-erä o-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon yttrium(III)kompleksia (valmistettu esimerkin 36 mukaisella menettelytavalla; 10 mg, 17 μΐ) liuotettiin 400 μΐ-.aan. vettä. Tähän 15 liuokseen lisättiin 64 μΐ (ylimäärin) tiofosgeenia ja 400 μΐ CHCl3:a, ja tulokseksi saatua reaktioseosta sekoitettiin voimakkaasti 40 minuuttia. Tänä aikana tehtiin useita pieniä kiinteän NaHC03:n lisäyksiä pH:n pitämiseksi suunnilleen arvossa 8. Reaktion päätyttyä vesikerros ero-20 tettiin ja uutettiin 1 ml :11a CHCl3:a (neljästi) ja kylmä-kuivattiin. Otsikon mukainen tuote karakterisoitiin TLC:n ja UV-spektroskopian avulla.

Esimerkki 38 a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-: 25 syklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkahapon yttrium(III)komp- leksin ammoniumsuolan, NH4 [Y(PA-DOTA)] :n, valmistus

Ligandi, a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappo (valmistettu esimerkin 8 mukaisella menettelytavalla), muun-30 nettiin protonoidun muodon ja ammoniumsuolan sekoituk-·. seksi kromatografisesti voimakasta kationinvaihtohartsia ' (SP-Sephadex™ C-25, Pharmacia) käyttäen. Pylväs oli proto- noidussa muodossa ja huuhdottiin tislatulla vedellä. Li-gandin väkevä vesiliuos laitettiin pylvääseen, jonka jäl-35 keen pylväs huuhdottiin tislatulla vedellä. Ligandi eluoi- 104898 o 1 tiin pylväästä 0,5 M NH4OH:lla. Eluentti poistettiin haihduttamalla liuos kuiviin.

Liuos, joka sisälsi Y(OAc) 3 *4H20: ta (0,0728 g, 0,215 mmol) 5 ml:ssa tislattua vettä, lisättiin lämpimään 5 liuokseen, joka sisälsi protonoidussa ja ammoniumsuolan muodossa olevaa sekaligandia (0,120 g, 0,215 mmol) 5 ml:ssa vettä. Liuos kuumennettiin palautusjäähdyttimen alla kiehuvaksi, ja sen pH säädettiin 0,1 M NH40H:lla suunnilleen arvoon 7,0. Tunnin refluksoinnin jälkeen liuos 10 jäähdytettiin ja haihdutettiin kuiviin. Ylimääräinen NH4OAc poistettiin kuumentemalla valkeata kiinteätä ainetta öljy-hauteessa noin 105 °C:ssa alipaineessa. Otsikon mukaisen tuotteen (joka sisälsi noin 1 ekvivalentin ammoniumase-taattia) saanto oli 0,142 g (94 %) , ja se karakterisoitiin 15 seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20, 88 °C, 75 MHz): 23,8, 27,6, 35,4, 49,6, 55,0, 56,2, 56,9, 57,1, 65,7, 68,0, 121,7, 132,6, 138,8, 180,7, 181.4, 182,0, 183,1 FAB-massaspektri (m/e): 610 (positiivinen ioni, [M" + 20 2H+]+) , 608 (negatiivinen ioni, M').

Esimerkki 39 a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III) -kompleksin ammoniumsuolan, NH4 [Sm(PA-DOTA)] :n, valmistus • ·* 25 Toistettaessa esimerkin 38 mukainen menettely käyt- tämällä Y(OAc) 3 *4H20:n tilalla Sm(OAc) 3 *3H20: ta (0,082 g, 0,215 mmol) saatiin valmistetuksi otsikon mukainen tuote (joka sisälsi noin 1 ekvivalentin ammoniumasetaattia) 0,155 g:n (94 %) saannolla, ja se karakterisoitiin seuraa-30 vien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20, 88 °C, 75 MHz): 23,5, 27,2, 35,6, 50,5, 54,5, 4 56,0, 57,2, 57,9, 69,5, 71,5, 122,3, 133,0, 139,7, 181,2, 188.4, 189,3, 190,9; 104898 82 FAB-massaspektri (m/e) : 673 (positiivinen ioni, [M' + 21Γ]+, Sm-isotooppimalli), 671 (negatiivinen ioni, M', Sm-isotooppimalli).

Esimerkki 40 5 a-[2-(4-isotiosyanaattofenyyli)-etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium (III) kompleksin ammoniumsuolan, NH4 [Sm(SCN-PA-DOTA)] :n, valmistus

Liuokset, jotka sisälsivät Sm(OAc) 3-3H20: ta 10 (27,9 mg, 381,56 g/mol, 73,1 μπιοί) 10 ml:ssa tislattua vettä ja 42 mg (632,97 g/mol, 66,4 μπιοί) PA-DOTA:n ammo-nium-kaliumsekasuolaa (valmistettu esimerkin 8 mukaisella menettelytavalla) 10 ml:ssa tislattua vettä, sekoitettiin ja niitä kuumennetiin höyryhauteella. 30 minuutin kuluttua 15 reaktio Sm(PA-DOTA):n muodostamiseksi oli mennyt loppuun HPLC:llä esimerkissä 41 kuvattua menetelmää käyttäen määritettynä. Liuoksen annettiin reagoida toisen liuoksen kanssa, joka sisälsi 45,4 mg CSCl2:a (114,98 g/mol, 395 μπιοί) 20 ml:ssa kloroformia, ravistemalla niitä ero-20 tussuppilossa. Reaktio meni loppuun noin 1 minuutissa HPLC:llä määritettynä ja sillä perusteella, että positiivista reaktiota ei ilmennyt ninhydriinitestissä (0,2 % etanolissa), kun vesiliuoksesta suoritettiin täpläanalyysi silikageeli-TLC-levyllä [lähtökelaatti, Sm(PA-DOTA), oli :· 25 testissä positiivinen]. Kloroformikerros poistettiin ja vesikerros pestiin kahdella 20 ml:n erällä kloroformia. Vesikerros haihdutettiin kuiviin lisäämällä siihen 100 ml asetonitriiliä ja tekemällä haihdutus ympäristön lämpötilassa typpivirran alla, jolloin saatiin 56 mg otsikon mu-30 kaista tuotetta.

FAB-massaspektri (m/e): 715 (positiivinen ioni, [M' +2ΙΓ]*, Sm-isotooppimalli), 713 (negatiivinen ioni, M', Sm-isotooppimalli).

104898 83

Esimerkki 41 Y3t:n ja PA-DOTA:n välisen kelaatin muodostumisno-peuden HPLC-analyysi PA-DOTA:n ja Y3+:n välisen kelaatin muodostumisen 5 nopeutta tutkittiin PA-DOTA:n valmistuksessa käytetyn tuotteeneristys- ja -puhdistusmenettelyn funktiona. Kelaa-tinmuodostumisastetta seurattiin HPLC:llä 100 mm:n Alltech Econosphere™ C18 -kolonnia käyttäen. Käytetty gradientti oli: A) 0,05 M NaOAc-puskuri, pH 6,0, ja CH3CN suhteessa 10 95:5, B) 0,05 M NaOAc-puskuri, pH 6,0, ja CH3CN suhteessa 30:70, A vaihtui B:ksi 15 minuutissa. Sekä PA-DOTA:n hyd-rokloridisuolan (viipymäaika = 1,31 min) että PA-DOTA:n ammonium-kaliumsekasuolan (viipymäaika = 4,55 min), jotka molemmat oli valmistettu esimerkin 8 mukaisella menettely-15 tavalla, liuos valmistettiin väkevyydeltään 1,6 mM:ksi 0,5 M NaOAc-puskuriin, pH 6,0. Yhden millilitran (1,6 μπιοί) kumpaakin liuosta annettiin reagoida 0,2 ml:n (8 μπιοί) kanssa Y (OAc) 3 *4H20-liuosta (40 mol/1 0,5 M NaOAc-puskurissa, pH 6,0). Kelaatin muodostuminen määritettiin 20 retentioajalla 3,96 min esiintyvän piikin perusteella (varmistettu esimerkistä 38 peräisin olevaan näytteeseen vertaamalla). Tulokset kelaatin muodostumisesta olivat seuraavat: 25 I PA-DOTA-suola I Komplek-|Aika (min)/- sinä (%) lämpötila_.

>90 juoneen lämpöt.

PA-DOTA:n ammonium- <10 15/huoneen lämpöt

kaliumsekasuola >85 10/ 90°C

30 ;· BFC:n puhdistuksessa käytetty menetelmä vaikuttaa selvästi kelaatin muodostumisen nopeuteen.

Esimerkki 42 a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-35 syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(metyylietikka)- 104898 84 hapon samarium(III)kompleksin ammoniumsuolan, NH„[Sm(PA-DOTMA)]:n, valmistus

Sm (OAc) 3 *3H20-liuos (13,2 mg 2 ml: ssa tislattua vettä) lisättiin a- [2- (4-aminofenyyli) etyyli] -1,4,7,10-tetra-5 atsasyklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(metyylietik-ka)hapon (valmistettu esimerkin 29 mukaisella menettelytavalla; diastereomeeri, jonka Rf-arvo on suurempi) liuokseen (30 mg 2 ml:ssa tislattua vettä). Liuosta, jonka pH oli 6,5, kuumennettiin höyryhauteella ja reaktiota seurattiin 10 HPLC:n avulla. 30 minuutin kuumennuksen jälkeen liuos haihdutettiin kuiviin pyöröhaihduttimellä ja kuivattiin vakuumiuunissa.

FAB-massaspektri (m/e) : 715 (positiivinen ioni, [M" + 2H*]*, Sm-isotooppimalli) , 737 (positiivinen ioni, [M + H+ + Na*]*, 15 Sm-isotooppimalli), 713 (negatiivinen ioni, M', Sm-isotooppimalli) .

Seuraavissa esimerkeissä kompleksien liuokset laskettiin ioninvaihtopylvään läpi mahdollisen ylimääräisen vapaan metallin poistamiseksi liuoksesta. Labiilit systee-20 mit palaisivat tasapainotilaan ja liuoksessa olisi samanlainen määrä vapaata metallia. Inertit systeemit eivät palaisi tasapainotilaan eikä kelatoitumattoman metallin määrän pitäisi pienentyä. Niinpä, vaikka kompleksia voikin muodostua pienellä saannolla, puhdistus laskemalla se : 25 ioninvaihtohartsin voisi tuottaa tulokseksi sopivan sta biilin kompleksin, joka ei sisällä kompleksoitumatonta metallia.

Esimerkki 43 a-(2-metoksi-5-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-3 0 syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium (III)- kompleksin valmistus

Valmistettiin a-(2-metoksi-5-aminofenyyli)- 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon (valmistettu esimerkin 12 mukaisella menettelytavalla) 35 3 x 10'2 M liuos liuottamalla 5,8 mg sitä 325 μΐ-.aan NANO- 104898 85 pure™-vettä. 10 /xl: n erä tätä liuosta lisättiin 990 /xl:aan 3 x 10~4 M SmCl3:a (0,1 N HClrssa), johon oli lisätty Sm-153:a. Liuoksen pH säädettiin sitten NaOHrlla arvoon 7,0. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista 5 kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua ka-tioninvaihtomenettelyä käyttäen. Liuos laskettiin sitten SP-Sephadex™-hartsin läpi. Taas määritettiin kompleksoitu-10 minen puhtaista näytteistä. Tulokset on esitetty seuraa-vassa taulukossa:

Kuumennettu Kuumentamaton 15 Puhdistettu Puhdistama- Puhdistettu Puhdistama- ton ton

Komplek- 96 95 97 89 sinä (%)

Esimerkki 44 20 a-(2-metoksi-5-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)-kompleksin pH-stabiilisuus

Esimerkistä 43 peräisin olevat kuumennettu ja kuumentamaton näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen :* 25 osaan, joiden koko oli 250 /xl. Toisen erän pH säädettiin HCl:lla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuva-30 tulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset on esitetty .. seuraavassa taulukossa: 86 1 0 4 8 9 8

Kompleksina (%) pH Ruumen- tKuumen- nettu tamaton 5 2 95 94 3 97 95 5__98 97 7__96 97 10 9__98 96 11__97 98 13 Ϊ55 99

Esimerkki 45 15 a-( 2-metoksi-5-nitrofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)-kompleksin valmistus

Valmistettiin a-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)- 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkaha-20 pon (valmistettu esimerkin 11 mukaisella menettelytavalla) 3 x 10'2 M liuos liuottamalla 7,9 mg sitä 464 pl:aan NANO-pure™-vettä. 10 μ1:η erä tätä liuosta lisättiin 950 plraan 3 x 10"4 M SmCl3:a (0,1 N HClissa), johon oli lisätty Sm-153:a. Liuoksen pH säädettiin sitten NaOH:lla arvoon ;· 25 7,0. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 eC:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua kationinvaihtomenettelyä käyttäen. Liuokset lasket-30 tiin SP-Sephadex™-hartsin läpi. Sen jälkeen määritettiin kompleksoituminen puhtaista näytteistä edellä kuvattua yleismenettelyä käyttäen. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa: 87 104898

Kuumennettu Kuumentamaton 5 Puhdistettu Puhdistama- Puhdistettu Puhdistama- ton ton KömpTe^“ 100 72 100 46

Esimerkki 46 10 a-( 2-metoksi-5-nitrofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)- kompleksin pH-stabiilisuus

Esimerkistä 45 peräisin olevat kuumennettu ja kuumentamaton, puhdistettu näyte jaettiin kumpikin kahteen 15 yhtä suureen osaan. Toisen erän pH säädettiin laimealla HCl:lla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuva- 20 tulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:

Puhdistettu 25 u —..... .

• ph Ruumen- Kuumen nettu tamaton """ 2 99 ~99 Ϊ 100 100 30 5 Töö röö 7 100 100 9 100 ToÖ n loo Toö 35 13 Töö Töö e, 104898

Esimerkki 47 α- (4-nitrofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7-trietikkahapon samarium(III )kompleksin valmistus a- (4-nitrofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-5 ni-1,4,7-trietikkahapon (valmistettu esimerkin 4 mukaisel la menettelytavalla) 0,0219 M liuos (100 μΐ, 2,195 mmol) saatettiin kosketuksiin 0,043 M Sm(OAc)3-liuoksen (25 μΐ, 1,075 mmol) kanssa. Reaktioseokselle tehtiin anioninvaih-to-HPLC-käsittely (Q-Sepharose™-kolonni, 1 cm x 25 cm, 10 virtausnopeus 2 ml/min, eluointi 0 - 1 M NH4OAc-gradientil-la 30 minuutin aikana). Tunnin kuluttua kompleksia (viipy-mäaika - 11,1 min) oli muodostunut 77 %:n (pinta-ala-%) saannolla ja se oli täysin erillään ligandihuipusta (vii-pymäaika - 15,5 min). Lisäosoitus otsikon mukaisen komp-15 leksin muodostumisesta saatiin silikageeli-TLC:llä (liuo-tinseos 4), jossa ligandin Rf-arvo oli 0,59 ja kompleksin Rf-arvo 0,00.

Esimerkki 48 a-(4-aminofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-20 ni-1,4,7-trietikkahapon samarium(III)kompleksin ja a-(4- aminofenyyli )-l,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,10-trietikkahapon samarium(III)kompleksin valmistus

Isomeerien (valmistettu esimerkin 5 mukaisella menettelytavalla) 0,022 M liuos (100 μΐ, 2,2 pmol) saatet-25 tiin kosketuksiin 0,043 M Sm(OAc)3-liuoksen (6,4 μΐ, 0,275 mmol) kanssa. Reaktioseokselle tehtiin anioninvaih-to-HPLC-käsittely (Q-Sepharose™-kolonni, 1 cm x 25 cm, virtausnopeus 2 ml/min, eluointi 0 - 0,25 M NH4OAc-gradien-tilla 30 minuutin aikana). 40 minuutin kuluttua kompleksia 30 (viipymäaika = 9,0 min) oli muodostunut 66 %:n (pinta-ala-%) saannolla ja se oli täysin erillään ligandihuipusta • · (viipymäaika = 18,5 min).

β9 104898

Esimerkki 49 α-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l, 4, 7-trietikkahapon samarium- 153-kompleksin ja a-(4-aminofenyyli)-l,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l, 4,10-5 trietikkahapon samarium-153-kompleksin valmistus

Valmistettiin a-(4-aminofenyyli)-l,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l, 4, 7-trietikkahappopentahydrokloridin ja a-(4-aminofenyyli)-l,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani- 1,4,10-trietikkahappopentahydrokloridin (valmistettu esi-10 merkin 5 mukaisella menettelytavalla) 3 x 10~2 M liuos liuottamalla 4,2 mg niitä 300 pl:aan NANOpure™-vettä. 10 μ1:η erä tätä liuosta lisättiin 15 pl:aan 2 x 10~5 M SmCl3:a (0,1 N HClrssa), johon oli lisätty Sm-153:a. Liuoksen tilavuudeksi muodostettiin 1 ml lisäämällä siihen vet-15 tä. pH säädettiin sitten Na0H:lla arvoon 7,0. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 eC:ssa.

Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrit-20 tämiseksi aikaisemmin kuvattua kationinvaihtomenettelyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että 89 % metallista oli kompleksina kuumennetun näytteen tapauksessa ja 96 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.

Esimerkki 50 .'. 25 a- (4-aminofenyyli )-l, 4,7,10-tetra-atsasyklododekaa ni-l, 4,7-trietikkahapon samarium(III)kompleksin ja a-(4-aminofenyyli )-l,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,10-trietikkahapon samarium(III)kompleksin pH-stabiilisuus

Esimerkistä 49 peräisin oleva kuumennettu ja kuu-30 mentamaton näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen osaan. Toisen erän pH säädettiin HCl:lla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina olevan metal- 90 1 0 4 8 9 8

Iin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtome-netelmällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:

Kompleksina (%) ^ pH Ruumen-.'.Kuumen nettu tamaton 1 86 83 3 99 99 10 5 99 99 7 89 96 9 99 98 Γ5 96 89 15 13 97 97

Esimerkki 51 a- (4-nitrof enyyli )-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7-trietikkahapon samarium(III)kompleksin valmistus 20 Seoksen, joka sisälsi 13 μΐ α-(4-nitrofenyyli)- 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7-trietikkahapon (valmistettu esimerkin 4 mukaisella menettelytavalla) 2 x 10'2 M liuosta, 15 μΐ 0,02 M SmCl3:a (0,1 N HClrssa) ja 2 μΐ Sm-153:a, tilavuudeksi muodostettiin 1 ml NANOpure™-vettä j. 25 lisäämällä. pH säädettiin sitten NaOHrlla arvoon 7,0. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua ka-30 tioninvaihtomenettelyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että • « .. 74 % metallista oli kompleksina kuumennetun näytteen ta pauksessa ja 24 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.

91 104898

Esimerkki 52 0- (4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7-trietikkahapon samar ium (111) kompleksin pH-stabiilisuus 5 Esimerkin 51 mukainen kuumennettu näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen osaan. Toisen erän pH säädettiin HCl:lla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritet- 10 tiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa: oH Kompleksina (%) 15 1 *67 2 70 5 70 ~ 5 72 20 7 7¾ 9 76 TO 76 12 "75 ... 25 I ’3 I T6

Esimerkki 53 1- [2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4 ,7,10-trietikkahapon lutetium(III)komplek- 30 sin valmistus

Valmistettiin EA-D03a:n (valmistettu esimerkin 17 * · < mukaisella menettelytavalla) liuos liuottamalla kiinteä aine veteen. Loppupitoisuus oli 0,01 mmol/ml.

Lutetiumkloridiliuos valmistettiin liuottamalla 35 lutetiumkloridi 0,1 N HClroon. Tulokseksi saatu lutetium- 92 1 0 4 8 9 8 kloridipitoisuus oli 3,9 mg/ml (0,01 mmol Lu:a/ml). Merkkiaineena käytettiin lutetium-177:ää.

30 μΐ 0,01 M Lu-liuosta lisättiin 2 μΐ-.aan Lu-177-liuosta. Lisättiin 30 μΐ ligandia ja kokonaistilavuuden 5 kasvattamiseksi 1,0 ml:ksi HEPES-puskuria (0,1 M, pH 7,6). Syntyneet liuokset olivat 0,3 mM ligandin ja lutetiumin suhteen.

Kompleksina olevan Lu:n prosenttiosuudeksi määritettiin aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtomenetelmällä 10 98 %.

Esimerkki 54 1-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon yttrium(III)kompleksin, Y(EA-D03A):n, valmistus 15 Ligandi, 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahappo (valmistettu esimerkin 17 mukaisella menettelytavalla), muunnettiin protonoidun muodon ja ammoniumsuolan sekoitukseksi kroma-tografisesti voimakasta kationinvaihtohartsia (SP-Sepha-20 dex™ C-25, Pharmacia) käyttäen. Pylväs oli protonoidussa muodossa ja huuhdottiin tislatulla vedellä. Ligandin väkevä vesiliuos laitettiin pylvääseen, jonka jälkeen pylväs huuhdottiin tislatulla vedellä. Ligandi eluoitiin pylväästä 0,5 M NH40H:lla. Eluaatti poistettiin haihduttamalla .. 25 liuos kuiviin pyöröhaihduttime11a ja kuivattiin vakuumiuu- nissa.

Liuos, joka sisälsi Y (OAc) 3 *4H20: ta (0,203 g, 338,101 g/mol, 0,600 mmol) 10 ml:ssa tislattua vettä, lisättiin lämpimään liuokseen, joka sisälsi protonoidussa ja 30 ammoniumsuolan muodossa olevaa sekaligandia (0,300 g, 499,615 g/mol, 0,600 mmol) 10 ml:ssa tislattua vettä. Liuos kuumennettiin palautusjäähdyttimen alla kiehuvaksi, ja sen pH säädettiin 0,1 M NH4OH:lla suunnilleen arvoon 7,0. 15 minuutin refluksoinnin jälkeen liuos jäähdytettiin ja 35 haihdutettiin kuiviin pyöröhaihduttimellä. Ylimääräinen 93 104898 ammoniumasetaatti poistettiin kuumentemalla valkeata kiinteätä ainetta öljyhauteessa noin 105 °C:ssa alipaineessa. Otsikon mukaisen tuotteen (joka sisälsi noin 1 ekvivalentin ammoniumasetaattia) saanto oli 373 mg (99 %) , ja se 5 karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20, 88 °C, 75 MHz) : 24,4, 28,4, 51,2, 56,5, 57,2 (2 C) , 57,7, 67,2, 67,6, 120,5, 132,3, 135,2, 182,1, 182,5, 183,0; FAB-massaspektri (m/e) : 552 (positiivinen ioni, [M + H+] *) , 10 610 (negatiivinen ioni, [M + OAc']') .

Esimerkki 55 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)kompleksin, Sm(EA-D03A):n, valmistus 15 Toistettaessa esimerkin 54 mukainen menettely käyt tämällä Y(OAc) 3 *4H20:n tilalla Sm(OAc) 3-3H20: ta (0,229 g, 381,531 g/mmol, 0,600 mmol) saatiin valmistetuksi otsikon mukainen tuote (joka sisälsi noin 1 ekvivalentin ammoniumasetaattia) 408 mg:n (99 %) saannolla, ja se karakterisoi-20 tiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20, 88 °C, 75 MHz): 23,8, 27,0, 51,4, 57,5, 58,1 (3 C) , 68,7, 73,4, 120,3, 132,2, 134,7, 185,0, 186,8, 192,1; FAB-massaspektri (m/e): 615 (positiivinen ioni, [M + H+]+, 25 Sm-isotooppimalli), 673 (negatiivinen ioni, [M + OAc"]~,

Sm-isotooppimalli).

Esimerkki 56 1-[2 -(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)kömpiek-30 sin valmistus **' 10 μΐ liuosta, joka sisälsi 1,48 mg 1-(4-nitrofe nyyli) -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikka-happoa/100 μΐ (0,03 M; valmistettu esimerkin 20 mukaisella menettelytavalla), lisättiin 15 /xl:aan0,02 M SmCl3-liuosta 35 (0,1 N HClsssa), johon oli lisätty Sm-153:a. Liuoksen ti- 94 104898 lavuudeksi muodostettiin 1 ml lisäämällä siihen NANOpure™-vettä. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan 5 metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi edellä kuvattua kationinvaihtomenettelyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että 81 % metallista oli kompleksina kuumennetun näytteen tapauksessa ja 43 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.

Esimerkki 57 10 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)kompleksin pH-stabiilisuus

Esimerkin 56 mukainen kuumennettu näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen osaan. Toisen erän pH sää-15 dettiin HCl:lla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset on esi-20 tetty seuraavassa taulukossa: pH Kompleksina __L*l—_ 1 20 .. 25-- : ' 2 37 4 49 5 58 7 81 30 9 62 ·· 10 64 12 64 il 54 35 95 104898

Esimerkki 58 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)kompleksin valmistus 5 3 μΐ liuosta, joka sisälsi 4,65 mg 1-(4-aminofenyy li) -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahap-poa/100 ml (valmistettu esimerkin 20 mukaisella menettelytavalla) , lisättiin 15 μ1ι&3.η 0,02 M SmCl3-liuosta (0,1 N HClrssa), johon oli aikaisemmin lisätty Sm-153:a. Liuoksen 10 tilavuudeksi muodostettiin 1 ml lisäämällä siihen NANOpure™-vettä. Tämä liuos jaettiin kahteen yhtä suureen osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi 15 aikaisemmin kuvattua kationinvaihtomenettelyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että 96 % metallista oli kompleksina kuumennetun näytteen tapauksessa ja 93 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.

Esimerkki 59 . 20 1-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)kompleksin pH-stabiilisuus

Esimerkin 58 mukaiset kuumennettu ja kuumentamaton näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen osaan. Toisen .. 25 erän pH säädettiin HClrlla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset 30 on esitetty seuraavassa taulukossa: * ·« «· « 96 104898

Kompleksina (%) pH --

Kuumenettu Kuumentamaton 5 1 ~~ MM 13 3 50 _M2 5 ‘ 73__55 7__96__93 10 9 9B 98

Ti 89 90 13 28 _37_

Esimerkki 60 15 1-(2-hydroksi-5-nitrobentsyyli)-l,4,7,10-tetra- atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(lii)-kompleksin valmistus

Valmistettiin l-(2-metoksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 20 (valmistettu esimerkin 25 mukaisella menettelytavalla) 3 x 10'2 M liuos liuottamalla 3,9 mg sitä 260 yl:aan NANOpure™-vettä. 10 pl:n erä tätä liuosta lisättiin 15 pl:aan 2 x 10'2 M SmCl3-vesiliuosta, johon oli lisätty 10 μΐ 3 x 10"* M Sm-153:a (0,1 N HCltssa). Liuoksen tilavuus muodostettiin 25 1 ml:ksi lisäämällä siihen 965 μΐ tislattua vettä. pH sää dettiin sitten Na0H:lla arvoon 7,0. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden 30 määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua kationinvaihtomenet- • · .. telyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että 71 % metallista oli kompleksina kuumennetun näytteen tapauksessa ja 74 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.

97 1 0 4 8 9 8

Esimerkki 61 1-(2-hydroksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III )-kompleksin pH-stabiilisuus 5 Esimerkin 60 mukaiset kuumennettu ja kuumentamaton näyte jaettiin kumpikin kahteen 250 μ1:η osaan. Toisen erän pH säädettiin HCl:lla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä 10 määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:

Kompleksina (%) 15 nH --

Pn Kuumen-.Kuumen nettu tamaton 1 65 51 ~~ 3 *98 93 ~ 20 5 “ 99 99 7 100 100 9 TOO 99 ΤΪ T5Ö 96 25 13 100 ' 98

Esimerkki 62 1 — (2-hydroksi-5-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)-30 kompleksin valmistus * Valmistettiin 1-(2-hydroksi-5-aminobentsyyli)- 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon (valmistettu esimerkin 26 mukaisella menettelytavalla) 3 x 10‘2 M liuos liuottamalla 3,2 mg sitä 100 pl:aan NANOpure™-35 vettä. 10 μ1:η erä tätä liuosta lisättiin 15 pl:aan 2 x 98 104898 ΙΟ'2 M SmCl3-vesiliuosta, johon oli lisätty Sm-153:a. Liuoksen tilavuus muodostettiin 1 ml:ksi lisäämällä siihen 950 μΐ tislattua vettä ja 20 μΐ 0,1 N NaOH:a. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennet-5 tiin 1 tunti 100 eC:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua kationin-vaihtomenettelyä käyttäen. Kun alle 95 % metallista oli kompleksoituneena, liuos laskettiin SP-Sephadex™-hartsin 10 läpi. Kompleksina olevan metallin prosenttiosuus määritettiin uudelleen. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:

Kuumennettu Kuumentamaton 15 -—----γ—-:-

Puhdis- Puhdis- Puhdis- Puhdistettu tamaton tettu tamaton

Komplek- 99 68 99 21 sinä (%) 20

Esimerkki 63 1— (2-hydroksi-5-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)-kompleksin pH-stabiilisuus V 25 Esimerkistä 62 peräisin olevat kuumennettu ja kuu mentamaton, puhdistettu näyte jaettiin kumpikin kahteen 250 μ1:η osaan. Toisen 250 μ1:η erän pH säädettiin HCl:lla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annet-30 tiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina .* olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla ka- tioninvaihtomenetelmällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa: 99 104898

Kompleksina (%) pH ,Kuumen- Kuumen nettu tamaton 1 60 56 2 74 76 3 84 87 5 97 98 10 7 ~ 99 99 9 99 98 11 99 99 13 9999 15 Käyttömenetelmät - biologia

Bifunktionaaliset kelaatinmuodostajat, jotka sisältävät samassa molekyylissä metallin kanssa kelaatin muodostavan ryhmän, kuten esimerkiksi DTPA:n, ja reaktiivisen 5 kytkentäryhmän (aryyliamiinin), tiedetään voitavan liittää kovalenttisesti erilaisiin kohteeseen ohjaaviin biomole-kyyleihin, jotka ovat spesifisiä syöpä- tai kasvainsolujen epitooppien tai antigeenien suhteen. Sellaisten konjugaat-tien sisältämät radionuklidikompleksit ovat käyttökelpoi-10 siä diagnostisissa ja/tai terapeuttisissa sovellutuksissa keinona kuljettaa radionuklidi kasvain- tai syöpäsoluun. [Lähdeviite: Meares et ai., Anal. Biochem. 142 (1984) 68 -78; tutustukaa myös pohdintaan Mearesin ja Goodwinin julkaisussa J. Protein Chem. 3 (1984), nro 2, sivuilla 215 -15 216; tuoreempia kirjallisuuslähteitä ovat US-patenttijul kaisu 4 678 677 (Meares), joka on julkaistu 7. heinäkuuta 1987, US-patenttijulkaisu 4 652 519 (Warshawsky et ai.), joka on julkaistu 24. maaliskuuta 1987, ja Brechbiel et ai., Inorg. Chem. 25 (1986) 2772 - 2781.] On ajateltavis-20 sa, että tuotteita, joissa käytetään radioaktiivisia tai loo 104898 luminesoivia metalleja, voidaan käyttää myös in vitro tehtävissä imuunimäärityksissä.

Taustatietoja

Leimattujen vasta-aineiden käyttökelpoisuus riippuu 5 monista seikoista, esimerkiksi (1) vasta-aineen spesifisyydestä, (2) kompleksin inerttiydestä tai stabiilisuudes-ta käyttöolosuhteissa (so. stabiilisuudesta seerumissa) ja (3) vasta-aineen integriteetistä, ts. siitä, että leimaus-prosessi ei vaikuta haitallisesti vasta-aineen spesifisyy-10 teen tai immuunireaktiivisuuteen.

Kompleksin stabiilisuus tai inerttiys on äärimmäisen tärkeätä, jotta radionuklidi-vasta-ainekonjugaatti on tehokas diagnostisena ja/tai terapeuttisena aineena. Kineettinen labiilisuus voi johtaa epästabiilisuuteen esi-15 merkiksi seerumissa ja radionuklidin eroamiseen kompleksista. Siten sen diagnostinen ja terapeuttinen tehokkuus alenee. Lisäksi mahdollisuus normaalille kudokselle aiheutuvaan yleiseen säteilyvaurioon kasvaa. [Cole et ai., J. Nucl. Med. 28 (1987) 83 - 90.] 20 Radionuklidin liittäminen vasta-aineeseen

Radionuklidin liittäminen vasta-aineeseen voidaan toteuttaa konjugoimalla vasta-aine etukäteen muodostettuun (ympäristön tai korotettu lämpötila) metalli-BFC-kompleksiin. [Meares et. ai., Acc. Chem. Res. 17 (1984) 25 202 - 209.] Annetaan esimerkkejä:

Esimerkki ZA (vertailuesimerkki) 1-(4-isotiosyanaattobentsyyli)dietyleenitriamiini-pentaetikkahapon samarium-153-kompleksin konjugointi IgGthen ja CC-49:n F(ab')2:een; [153Sm (SCN-Bz-DTPA) ]-IgG ja 30 [153Sm (SCN-Bz-DTPA) ] -F (ab ' ) 2-fragmentti : 1-(4-isotiosyanaattobentsyyli)dietyleenitriamiini- pentaetikkahapon samarium-153-kompleksi [153Sm(SCN-Bz-DTPA) ] valmistettiin sekoittamalla 150 ^l:aan liuosta, joka sisälsi 153Sm: a 0,1 N HC1: ssa, 9 μΐ 1-(4-isotiosyanaattobent-35 syyli)dietyleenitriamiinipentaetikkahappoa, johon oli li- 101 104898 sätty HEPES-puskuria (0,5 M, pH 8,9, noin 30 μΐ) sen pH:n säätämiseksi suunnilleen arvoon 6. Konjugaation toteuttamiseksi 153Sm-kompleksiin sekoitettiin 22,5 x 10'9 mol IgG:tä tai CC-49:n F(ab')2:ta (proteiinin pitoisuus noin 5 1 x 10"4 mol/1 50 mmol:ssa HEPES:ää, pH 8,5) , ja pH säädet tiin natriumkarbonaattiliuosta (1,0 M, 12 - 15 μΐ) lisäämällä arvoon 8,9. Konjugointi tehtiin huoneen lämpötilassa (noin 25 °C) sen kestoajan ollessa noin 3 tuntia. 153Sm-kompleksilla leimattu IgG tai F(ab')2 eristettiin ja karak-10 terisoitiin esimerkissä XII kuvatulla tavalla.

Biologiaa koskeva kokeellinen osa

Esimerkit I ja II sekä vertailuesimerkit A - D:

Bifunktionaalisten kelaattien tutkiminen in vivo

Eräiden harvinaisten maametallien kelaattien sta-15 biilisuutta on testattu An vivo eläimillä. Esimerkiksi Rosoff et ai. ovat raportoineet julkaisussa International Journal of Applied Radiation and Isotopes 14 (1963) 129 -135 radioaktiivisten harvinaisten maametallien kelaattien jakautumisesta hiirissä tiettyjen aminokarboksyylihappojen 20 tapauksessa. Havaittiin, että in vivo "kelaatinmuodostajan ja elimistön aineosien (epäorgaanisten ja orgaanisten) välinen kilpailu harvinaisen maametallin ioneista määrää sen kerrostumisen ja erittymisen". Tämän keksinnön mukaisten harvinaisten maametallien vahvojen kelaattien arvel-: 25 laan hajoavan hyvin vähäisessä määrin ja erittyvän, kun sen sijaan alalla tunnetut heikot ja kestävuudeltään keskinkertaiset kelaatit hajoavat helpommin ja kerrostuvat siten elimiin, kuten esimerkiksi maksaan. Maksan radionuk-lidipitoisuus ei kuitenkaan aina aiheudu heikon kompleksin 30 muodostumisesta vaan on joissakin tapauksissa seurausta ·; metallikelaatin affiniteetista maksaan. Kelaatteja on itse asiassa valmistettu ja käytetty maksan toiminnan tutkimiseen (Alan R. fritzberg, Radiopharmaceuticals: Progress and Clinical Perspectives, osa 1, 1986; US-patenttijulkai-35 sut 4 088 747 ja 4 091 088) .

102 104898

Esimerkin 3 mukaisen yhdisteen yttrium- ja samari-umkelaattien, jotka ovat esimerkkejä harvinaisten maame-tallien vahvoista kelaateista, biologinen jakautuminen määritettiin ja prosenttiosuutta annoksesta käytettiin in 5 vivo -tutkimusmenettelynä kelaattien stabiilisuuden arvi-oimisesti kvalitatiivisesti. NTA:n ja EDTA:n kelaatit ovat mukana vertailun vuoksi. Myös samariumia injektoitiin vertailuaineeksi kelatoimattomassa muodossa samariumkloridi-na.

10 Sprague-Dawley-rotat, jotka painoivat 150 - 200 g, hankittiin Charles River Laboratoriesilta. Nämä eläimet sijoiitettiin häkkeihin, ja niille annettiin vettä ja ruokaa rajoittamattomasti. Eläimiä totutettiin oolosuhteisiin vähintään 5 vuorokauden ajan ennen käyttöä. Ennen komplek-15 sin injektointia eläimet sijoitettiin lämpölampun alle (15 - 30 minuutiksi) häntälaskimon laajentamiseksi. Sen jälkeen eläin laitettiin rajoittavaan häkkiin, häntä puhdistettiin alkoholilla pyyhkäisemällä ja eläimelle annettiin ruiske (50 - 200 μΐ) häntälaskimoon. Injektoinnin 20 jälkeen eläin sijoitettiin toiseen häkkiin 2 tunniksi, jonka jälkeen se lopetettiin katkaisemalla siltä kaula. Eläin leikeltiin sitten, osat huuhdottiin deionisoidulla vedellä, läpsäytettiin kuiviksi ja punnittiin laskentapul-loon, jonka oma paino oli määritetty. Valmistettiin vähin-: 25 tään 3 vertailunäytettä samasta aineesta, jota injektoi tiin, ja niistä suoritettiin laskenta eläinkudosten kanssa. Prosenttiosuus annoksesta on pulssien lukumäärä elimessä jaettuna pulssien lukumäärällä vertailunäytteessä kerrottuna 100:11a (ks. seuraava taulukko).

30 « · 103 104898

Taulukko

Tiedot biologisesta jakautumisesta “ ’ : jMaksaan pää- 5 Esimerkki Ligandi esi- Metalli tyhyt osa(%h nro merkistä* injektoidus ta annoksesta Ϊ 3 Ϊ 0.17 II 3 Sm 0.29

10 (A) ~ EDTA Sm__S.H

(B) EDTA Sm (cl NTA Sm 8.6 (D) SmC1.3 Sm 39 15 *Kompleksien valmistuksessa käytettiin ligandi-metallisuh-detta 1:1 esimerkeissä I ja II, 5:1 esimerkeissä A ja noin 300:1 esimerkeissä 5 ja C.

Esimerkit III ja E

Valmistettiin edellä kuvatuin menetelmin yttriumin 20 (johon oli lisätty pieni määrä 90Y:a) 1:1-kompleksit esimerkin 3 mukaisen ligandin kanssa, joka on BA-DOTA, ja EDTA:n (vertailuesimerkki E) kanssa. Muutama 100 pl:n erä siirrettiin sitten eri sentrifugiputkeen. Y(III):a lisättiin ylimäärin, niin että tilavuuden kokonaismuutos saa-. 25 tiin minimoiduksi, ja aika rekisteröitiin. Puolen tunnin kuluttua metallin lisäyksestä määritettiin kompleksin määrä prosentteina edellä kuvatulla kationinvaihtomenetelmäl-lä ja sitä verrattiin alkuperäiseen kompleksin määrään. Kompleksin määrä prosentteina lisätun metallin funktiona 30 antaa viitteen ligandi-metallikompleksin labiilisuudesta. .. Tulokset on esitetty taulukossa.

104 104898

Taulukko

Metallin ja li- Kompleksina (%) 5 gandin mooli- __

SUhde 3A-D0TA EDTA

Ϊ 80 98 10 — 86 10 100 — 78 250 88 H8 500 80 16

Esimerkki IV

15 1- [2-(4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium-153-kompleksin, [153Sm (SCN-EA-D03A) ] -kompleksin, valmistus

100 μl:aan. liuosta, joka sisälsi 153Sm:a 0,1 N

HCl:ssa, lisättiin 5 μΐ SCN-EA-D03A:ta (5 mmol/1 50 mM 20 HEPES:ssä, pH 8,2). Tätä seosta sekoitettiin pyörresekoit-timessa ja siihen lisättiin vähitellen HEPES-puskuria (0,5 M, pH 8,9; yhteensä noin 25 μΐ) pH:n säätämiseksi suunnilleen arvoon 7. Kelaatin muodostumisen etenemistä seurattiin HPLC:llä GF-250 -kolonnia käyttäen (HPLC-sys-: 25 teemi I) . Saavutettiin noin 50 %:n saanto.

Esimerkki V

tt-[2-(4-aminofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-

kompleksin, [153Sm (PA-DOTA) ] -kompleksin, valmistus 30 150 μl:aa^n liuosta, joka sisälsi 153Sm:a 0,1 N

HCl:ssa (noin 4,6 mCi), lisättiin 1 μΐ natriumasetaattia (2,0 M) ja 9 μΐ a-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,19-tetraetikkahapon ammo-nium-kaliumsekasuolaa (5 mmol 50 mmol:ssa HEPES:ää, pH 35 8,5, valmistettu esimerkin 9 mukaisella menettelytavalla).

105 1 0 4 8 9 8

Seosta sekoitettiin mekaanisesti ja se titrattiin vähitellen HEPES-puskurilla (0,5 M, pH 8,9, lisäys noin 31 /il) pH-arvoon 7. Tätä seosta kuumennettiin sitten 98 °C:ssa hiukkahauteessa 1 tunti. Kuumennuksen päätyttyä 5 μΐ seok-5 sesta käytettiin analyysiin Mono-Q™-kolonnissa HPLC-sys-teemillä II käyttäen eluoinnissa gradienttiliuotinsystee-miä (0 - 15 minuuttia, 0 %:sta 100 %:iin B:tä; jossa systeemissä A = vesi ja B = 1,0 M ammoniumasetaatti, joka sisälsi 0,1 mmol EDTA:a). Saavutettiin 85 - 95 %:n saanto-10 ja 153Sm:iin perustuen. Näin valmistettu o- [2- (4-aminofenyy-li)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksi karakterisoitiin vertaamalla sen kromatografiakäyttäytymista Mono-Q™- ja GF-250-kolonnissa identtisen ei-radioaktiivisen näytteen 15 käyttäytymiseen.

Lisäosoitusta radioaktiivisen kompleksin läsnäolosta hankittiin muuntamalla se isotiosyanaattojohdannaisek-seen ja konjugoimalla se sitten vasta-aineeseen. Kompleksi on myös valmistettu ilman kuumennusta (ympäristön lämpöti-20 lassa) 6-18 tuntia inkuboimalla, jolloin tuloksena oli 70 - 80 %:n saanto.

Esimerkki VI

a - [2-(4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon sama-: 25 rium-153-kompleksin, [153Sm(SCN-PA-DOTA) ]-kompleksin, valmis tus

Esimerkissä V saatuun reaktioseokseen lisättiin 2 μΐ HEPES-puskuria (0,5 M, pH 8,9), 2 μΐ tiofosgeenia ja 0,2 ml kloroformia. Seosta sekoitettiin voimakkaasti me-30 kaanisesti 2 tai 3 kertaa muutama sekunti kerrallaan. Klo- *; roformikerros heitettiin pois ja vesikerros, joka sisälsi pääasiallisesti haluttua tuotetta, säästettiin ja puhdistettiin tarkemmin. a-[2-(4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkaha-35 pon samarium-153-kompleksin saanto oli HPLC:llä GF-250- 106 104898 kolonnissa HPLC-systeemiä I käyttäen tehdyn 153Sm-aktiivi-suusmittauksen perusteella 85 - 90 %. Vesikerros johdettiin sen puhdistamiseksi SEP-Pak™ C-18 -patruunan läpi ja eluoitiin asetonitriili-vesiseoksella, joka sisälsi 90 % 5 asetonitriiliä. Ensimmäiset 300 μΐ eluaattia heitettiin pois, ja seuraavissa 900 μΐ:ssa ulos tullut SCN-johdannainen karakterisoitiin HPLC:llä GF-250-kolonnissa. 153Sm-aktiivisuuden talteensaanti oli parempi kuin 90 %. Pääosa liuottimesta haihdutettiin sitten 1,5 - 2 tunnin 10 aikana, ja jäännös käytettiin vasta-aineeseen konjugointiin .

Esimerkki VII

a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksin, 15 [153Sm (BA-DOTA) ]-kompleksin, valmistus

200 ^l:aan liuosta, joka sisälsi 153Sm:a 0,1 N

HCl:ssa, lisättiin 1 μΐ natriumasetaattia (2,0 M) ja 12 μΐ a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,19-tetraetikkahappoa (5 mmol 50 mmol:ssa HEPES:ä, 20 pH 8,5; valmistettu esimerkin 3 mukaisella menetelmällä). Seosta sekoitettiin mekaanisesti ja se titrattiin vähitellen HEPES-puskurilla (0,5 M, pH 8,9, lisäys noin 38 μΐ) pH-arvoon 7. Tätä seosta kuumennettiin sitten 98 °C:ssa hiukkahauteessa 1 tunti. Kuumennuksen päätyttyä 5 μΐ seok-: 25 sesta käytettiin analyysiin Mono-Q™-kolonnissa (HPLC-sys- teemillä II, eluointi gradienttiliuotinsysteemillä: 0-15 minuuttia, 0 %:sta 100 %:iin B:tä; jossa systeemissä A = vesi ja B = 1,0 M ammoniumasetaatti, joka sisälsi 0,1 mmol EDTA:a) . Yleensä saavutettiin 85 - 95 %:n saantoja 153Sm:iin 30 perustuen. Kompleksi on valmistettu myös inkuboimalla ·; seosta huoneen lämpötilassa 12 - 18 tuntia, mikä johti otsikon mukaisen tuotteen saantoon 80 - 90 %. Näin valmistettu a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-kaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksi 35 karakterisoitiin vertaamalla sen kromatografiakäyttäyty- 104898 mistä Mono-Q™-kolonnissa autenttisen näytteen käyttäytymiseen, muuntamalla se isotiosyanaattojohdannaisekseen ja konjugoimalla se sitten vasta-aineeseen.

Esimerkki VIII

5 a-(4-isotiosyanaattofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksin, [153Sm(SCN-BA-DOTA) ] -kompleksin, valmistus

Esimerkissä VII saatuiin reaktioseokseen lisättiin 2 μΐ HEPES-puskuria (0,5 M, pH 8,9), 2 μΐ tiofosgeenia ja 10 0,2 ml kloroformia. Seosta sekoitettiin voimakkaasti me kaanisesti 2 tai 3 kertaa muutama sekunti kerrallaan. Klorof ormikerros heitettiin pois ja vesikerros, joka sisälsi pääasiallisesti haluttua tuotetta, säästettiin ja puhdistettiin tarkemmin, a-(4-isotiosyanaattofenyyli)-1,4,7,10-15 tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon sama rium- 153 -kompleksin saanto oli HPLC:llä GF-250-kolonnissa HPLC-systeemiä I käyttäen tehdyn, 153Sm-aktiivisuuteen perustuvan analyysin mukaan yli 90 %. Vesikerros johdettiin sen puhdistamiseksi SEP-Pak™ C-18 -patruunan läpi ja elu-20 oitiin asetonitriili-vesiseoksella, joka sisälsi 90 % ase-tonitriiliä. Ensimmäiset 0,3 ml eluaattia heitettiin pois, ja haluttu tuote tuli ulos seuraavissa 1,2 ml:ssa saannon ollessa 86 - 93 %. Pääosa liuottimesta haihdutettiin sitten noin 2 tunnin aikana, ja jäännös käytettiin vasta-ai-; · 25 neeseen konjugointiin.

Esimerkki IX

1- [2- (4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium-153-kompleksin konjugointi vasta-aineeseen; [153Sm(SCN-EA-30 D03A)]-IgG-konjugaatti ·;· Käytetty vasta-aine oli CC-49, hiiren monoklonaali- nen IgG, joka sitoutuu TAG-72:n, kasvaimiin yhteydessä olevan antigeenin, epitooppiin. Konjugaation toteuttamiseksi 187 μΐ :aan vasta-aineliuosta (1,20 x 10'4 mol/1 50 mM 35 HEPES :ssä, pH 8,5) sekoitettiin 4,5 x 10*8 mol 153Sm(SCN-EA- 109 1 0 4 8 9 8 D03A):ta, joka oli valmistettu esimerkissä IV kuvatulla tavalla, ja seokseen lisättiin sen jälkeen natriumkarbo-naattiliuosta (1,0 M) sen pH:n nostamiseksi arvoon 8,9. Reaktion annettiin jatkua 2 tuntia huoneen lämpötilassa.

5 Sen päätyttyä 153Sm:lla leimattu IgG eristettiin keskipako-geelisuodatuksella Sephadex GF-25 (2,2 ml) -kertakäyttöko-lonneissa ja puhdistettiin edelleen HPLC:llä GF-250-kolon-nissa käyttäen eluenttina sitraattipuskuria (0,25 M, pH 7,4). Leimattua IgG:tä sisältävät jakeet yhdistettiin ja 10 väkevöitiin ja tehtiin vaihto (3 x) PBSrään Centricon™-väkevöintilaitteita käyttäen. Näin valmistetun 1S3Sm:llä leimatun IgG:n ominaisaktiivisuus oli noin 0,16 μCi/μg proteiinia. [153Sm(SCN-EA-D03A) ] -IgG-valmisteen integriteetti varmistettiin HPLC:llä [S. I. Sivakoff, BioChrom 1 15 (1986) , nro 1, 42 - 48] ja tavanomaisin biokemiallisin menettelytavoin, esimerkiksi natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja autoradiografi-alla sekä radioimmunologisella kiinteäfaasimäärityksellä (RIA) . [Ks. David Colcher et ai., Cancer Res. 43 (1983) 20 736 - 742.]

Esimerkki X

1- [2- (4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium-153-kompleksin konjugointi CC-49:n F (ab') 2-fragmenttiin; 25 [153Sm (SCN-EA-D03A) ] - CC-49-F (ab ' ) 2-fragmentti

CC-49 : n F (ab') 2-f ragmenttiin, joka oli valmistettu entsymaattisesti hajottamalla Lamoyin ja Nisonoffin esittämällä menettelytavalla [E. Lamoyi ja A. Nisonoff, J. Immunol. Methods 56 (1983) 235 - 243] (225 μΐ 1 x 10‘4 M

30 liuosta, jossa liuottimena oli 50 mM HEPES, pH 8,5) sekoitettiin 2,9 x 10'8 mol esimerkissä IV kuvatulla tavalla valmistettua 1S3Sm(SCN-EA-D03A) :ta. Lisättiin natriumkarbonaattia (1,0 M, noin 5 μΐ) pH:n säätämiseksi arvoon 8,9, ja reaktiota jatkettiin noin 2,5 tuntia. Sen päätyttyä 109 104898 153Sm:lla leimattu fragmentti eristettiin ja karakterisoitiin esimerkissä IX kuvatulla tavalla.

Esimerkki XI (A ja B) [153Sm(EA-D03A) ] -IgG:n ja [153Sm(EA-D03A) ] -F (ab' )2:n 5 paikallistaminen in vivo t153Sm(EA-D03A) ] :11a leimatun CC-49:n IgG:n (esimerkistä IX) ja F(ab')2:n (esimerkistä X) käyttökelpoisuutta havainnollistettiin leimattujen materiaalien kerääntymisellä kateenkorvattomien hiirien ihmisestä peräisin olevan 10 kasvainsiirrännäiseen. Kateenkorvattorniin naarashiiriin (Nu/Nu, CDl-tausta) inokuloitiin subkutaanisesti (s.c.) (0,1 ml/lähde) ihmisen paksusuolensyöpäsolulinjaa, LS-174 T (noin 1 x 106 solua/eläin) . Noin 2 viikon kuluttua inokulaatiosta kuhun eläimeen ruiskutettiin häntälaskimon 15 kautta noin 2 μ(Γϊ (15 - 30 μg) 153Sm:lla leimattua vasta-ainetta PBS:ssä. Hiiret lopetettiin erilaisin aikavälein. Verettömäksi tekemisen jälkeen kasvain ja tietyt kudokset leikattiin irti ja punnittiin, ja niiden radioaktiivisuus mitattiin gamma-laskurilla. Määritettiin 153Sm:n aiheuttama 2 0 pulssimäärä minuutissa (min"1) kussakin kudoksessa, ja se on ilmoitettu yksikkönä min'Vgramma kudosta injektoitua annosta kohden kerrottuna 100:11a (prosenttia injektoidusta annoksesta/gramma). Tulokset on esitetty kuvissa 1-14 ja taulukoissa IA ja IB. 153Sm(SCN-Bz-DTPA) :11a leimattu IgG j'" 25 ja CC-49:n F(ab')2 (esimerkistä ZA) otettiin mukaan tutki- mukseen vertailun vuoksi. Tulokset on esitetty taulukoissa IC ja ID.

Esimerkki XII

a - [2- (4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-30 tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon sama- ·· rium-153-kompleksin konjugointi vasta-aineeseen; [153Sm(SCN- PA-DOTA)]-IgG-konjugaatti Käytetty vasta-aine oli CC-49, hiiren monoklonaali-nen IgG, joka sitoutuu TAG-72:n, kasvaimiin yhteydessä 35 olevan antigeenin, epitooppiin. Konjugaation toteuttami- 110 104898 seksi 178 μΐ:aan vasta-aineliuosta (1,26 x 10'4 mol/1 50 mM HEPES: ssä, pH 8,5) sekoitettiin 3,4 x 10~8 mol a-[2-(4-iso-tiosyanaattofenyyli)etyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-kaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksia 5 (valmistettu esimerkissä VI kuvatulla tavalla), ja seokseen lisättiin sen jälkeen natriumkarbonaattiliuosta (1,0 M, noin 17 μΐ) sen pH:n nostamiseksi arvoon 8,9. Reaktion annettiin jatkua 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Sen päätyttyä 153Sm:lla leimattu IgG eristettiin keskipako-10 geelisuodatuksella Sephadex™ GF-25 (2,2 ml) -kertakäyttö-kolonneissa ja puhdistettiin edelleen HPLC:llä GF-250-kolonnissa käyttäen eluenttina sitraattipuskuria (0,25 M, pH 7,4). Leimattua IgG:tä sisältävät jakeet yhdistettiin ja väkevöitiin ja tehtiin vaihto (3 x) PBS:ään Centricon™-15 väkevöintilaitteita käyttäen. Näin valmistetun 153Sm:llä leimatun IgG:n ominaisaktiivisuus oli noin 0,16 μCi/μg proteiinia. a-[2-(4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksi-IgG-valmisteen homogeenisuus ja 20 integriteetti varmistettiin HPLC:llä ja tavanomaisin biokemiallisin menettelytavoin kuten esimerkissä IX.

Esimerkki XIII

a- [2-(4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l, 4 ,7,10-tetraetikkahapon sama-' 25 rium-153-kompleksin konjugointi CC-49:n F (ab' ) 2-fragmenttiin; [153Sm (SCN-PA-DOTA) ] - CC-49-F (ab') 2-f ragmentti CC-49:n F (ab') 2-fragmenttiin [joka oli valmistettu entsymaattisesti hajottamalla menettelytavalla, jonka ovat esittäneet E. Lamoyi et ai., J. Immunol. Methods 56 (1983) 30 235 - 243] (225 μΐ 1 x ΙΟ'4 M liuosta, jossa liuottimena .. oli 50 mmol HEPES:ää, pH 8,5) sekoitettiin 2,9 x 10"8 mol esimerkissä VI kuvatulla tavalla valmistettua a-[2-(4-iso-tiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l, 4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksia. 35 Lisättiin natriumkarbonaattia (1,0 M, noin 9 μΐ) pH:n sää- 104898 tämiseksi suunnilleen arvoon 8,9, ja reaktiota jatkettiin noin 2,5 tuntia. 153Sm:lla leimattu fragmentti eristettiin ja karakterisoitiin esimerkissä IX kuvatulla tavalla. Omi-naisaktiivisuus oli noin 0,4 μα/μ%.

5 Esimerkki XIV (A ja B) «- [2- (4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon sama-rium-153-kompleksilla leimatun IgG:n tai F(ab')2:n muodostaman konjugaatin, [153Sm(SCN-PA-DOTA) ]-IgG:n ja [153Sm(SCN-10 PA-DOTA)]-F(ab1)2:n, paikallistaminen in vivo a- [2- (4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium- 153 -kompleksilla leimatun CC-49:n IgG:n tai F(ab')2:n (esimerkeistä XII ja XIII) käyttökelpoisuutta havainnol-15 listettiin leimattujen materiaalien kerääntymisellä ka-teenkorvattomien hiirien ihmisestä peräisin olevaan kas-vainsiirrännäiseen. Biologinen jakautuminen määritettiin esimerkissä XI kuvatulla menetelmällä. Tulokset on esitetty kuvissa 1-7 IgG:n tapauksessa ja kuvissa 8-14 20 F(ab')2:n tapauksessa; ks. myös taulukot IIA ja IIB.

153Sm(SCN-Bz-DTPA) :11a leimattu IgG ja CC-49:n F(ab')2 (valmistettu esimerkissä ZA) otettiin mukaan tutkimukseen vertailun vuoksi. [Ks. taulukot IC ja ID.] Esimerkki XV

: 25 a-(4-isotiosyanaattofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksin konjugointi vasta-aineeseen; [153Sm (SCN-BA-DOTA)]-IgG-konjugaatti CC-49:n kokonaiseen IgG:hen (174 μΐ 1,2 x 10'4 mol/1 30 0,25 M HEPES:ssä, pH 8,7) sekoitettiin 2,0 x 10'8 mol a-(4- Γ* isotiosyanaattifenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani- 1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksia (2,8 mCi), joka oli valmistettu esimerkin VIII mukaisesti, ja seokseen lisättiin sen jälkeen natriumkarbonaattiliuos-35 ta (1,0 M, noin 2 μΐ) sen pH:n pitämiseksi suunnilleen 112 104898 arvossa 8,7. Reaktion annettiin jatkua 2,5 tuntia huoneen lämpötilassa. Sen päätyttyä 153Sm:lla leimattu IgG eristettiin keskipakogeelisuodatuksella Sephadex™ GF-25 (2,2 ml) -kertakäyttökolonneissa ja puhdistettiin edelleen HPLC:llä 5 GF-250-kolonnissa käyttäen eluenttina sitraattipuskuria (0,25 M, pH 7,4). Leimattua IgGrtä sisältävät jakeet yhdistettiin ja väkevöitiin ja tehtiin vaihto (kolmesti) PBS:ään Centricon™-väkevöintilaitteita käyttäen. ls3Sm:llä leimatun IgG-valmisteen homogeenisuus ja integriteetti 10 varmistettiin HPLCrllä ja tavanomaisin biokemiallisin menettelytavoin, kuten esimerkissä IX on esitetty.

Esimerkki XVI

a - (4 - isotiosyanaattofenyyli)-1,4,7,10 -tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153- 15 kompleksin konjugointi CC-49:n F (ab1) 2-fragmenttiin; [153Sm (SCN-BA-DOTA) ] - CC-49-F (ab' ) 2-fragmentti CC-49:n F (ab ' ) 2-f ragmenttiin (84 μΐ 2,4 x 10'4 M liuosta, jossa liuottimena oli 0,25 M HEPES-puskuri, pH 8,7), joka oli valmistettu entsymaattisesti hajottamal-20 la menettelytavalla, jonka ovat esittäneet E. Lamoyi et ai., sekoitettiin 2,1 x 10~B mol a-(4-isotiosyanaattofenyy-li)-1,4,7,10 -tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksia (valmistettu esimerkin VIII mukaisella menettelytavalla). Lisättiin natriumkarbo-; · ' 25 naattia (1,0 M, noin 2 μΐ) pH:n säätämiseksi suunnilleen arvoon 8,7, ja reaktiota jatkettiin noin 2 tuntia. Sen päätyttyä 153Sm:lla leimattu fragmentti eristettiin ja karakterisoitiin esimerkissä IX kuvatulla tavalla.

Esimerkki XVII (A ja B) 30 a-(4-isotiosyanaattofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa- ;· syklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153- kompleksilla leimatun IgG:n (esimerkki XV) ja F(ab')2:n (esimerkki XVI) , [153Sm (BA-DOTA) ]-IgG:n ja [153Sm (BA-DOTA) ] - F(ab')2:n, paikallistaminen in vivo 113 104898

In vivo -tutkimukset tehtiin esimerkissä XI kuvatulla tavalla, ja tulokset on esitetty kuvissa 1 - 14 ja taulukoissa IIIA ja IIIB.

Esimerkki XVIII (A ja B) 5 a-[2-(4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon 177Lu-kompleksilla leimatun IgG:n ja F(ab')2:n, [177Lu (PA-DOTA) ] -

IgG:n ja [177Lu (PA-DOTA) ] -F (ab1 ) 2 :n, paikallistaminen in vivo 10 Otsikon mukaiset yhdisteet valmistettiin ja in vivo -tutkimukset tehtiin esimerkeissä V, VI, XI, XII ja XIII kuvatulla tavalla, ja tulokset on esitetty taulukoissa IVA ja IVB.

Esimerkki XIX (A ja B) 15 a- [2-(4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra- atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon yttrium-90-kompleksilla leimatun IgG:n ja F(ab')2:n, [90Y- (PA-DOTA) ]-IgG:n ja [90Y(PA-DOTA) ] -F (ab*) 2 :n, paikallistaminen in vivo 20 Otsikon mukaiset yhdisteet valmistettiin ja in vivo -tutkimukset tehtiin esimerkissä XI kuvatulla tavalla, paitsi että kudokset hajotettiin ja niille suoritettiin nestetuikelaskenta, ja tulokset on esitetty taulukoissa VA ja VB.

: 25 Esimerkki XX

[153Sm (BFC) ] -CC-49-IgG:n ja [177Lu (BFC) ] -CC-49-IgG:n pH-stabiilisuus in vitro [153Sm(BFC) ] -CC-49-IgG:n tai [177Lu (BFC) ]-CC-49-IgG: n annettin seistä 0,2 M NaOAc-puskurissa pHrssa 6,0, 4,0 ja 30 2,8 huoneen lämpötilassa proteiinipitoisuuden ollessa noin Γ 5 x 10~6 mol/1 ja kompleksin ja vasta-aineen suhteen olles sa noin 0,5. Näytteitä otettiin tietyin aikavälein, ja ne analysoitiin HPLC:llä (GF-250 -kolonni) 153Sm- tai 177Lu-ak-tiivisuuden häviämisen proteiinista määrittämiseksi. Tut- 35 kimus kesti yleensä 5 vuorokautta tai siihen saakka, että 104898 90 % radioisotoopeista oli dissosioitunut. Tulokset on ilmoitettu radioisotooppihäviön alkunopeutena vuorokaudessa. Tulokset osoittivat 153Sm (PA-DOTA) : n, 177Lu (PA-DOTA) : n, 153Sm (BA-DOTA) :n, 153Sm (PA-DOTMA) :n ja 153Sm (MeO-BA-DOTA) :n 5 erinomaisen stabiilisuuden happamalla pH-alueella vertai-lukompleksiin 153Sm (Bz-DTPA) nähden. Tulokset on esitetty alla olevassa taulukossa.

Tämä kompleksien suurempi stabiilisuus in vitro korreloi myös hyvin 153Sm:n ja 177Lu:n nopeamman elimistöstä 10 ja ei-kohdekudoksista (esim. munuaisesta, maksasta) poistumisen kanssa; ks. kuvat 1-34.

Isotooppihäviö (%)/vuorokausi SPC Isotooppi pH

15 6,0 V 2?8

Bz-DTPA 'IDJSm <2 35 35 PA-DOTA '^Sm <2 <2 <2 BA-DOTA 1^Sm <2 <2 <2 PA-DOTA ^'<Lu <2 <2 <2 20 j -- " —---------------

MeOBA-DOTA 1:?JSm <2 <2 <2 EA-D03A ^Sm <2 90 95 PA-DOTMA 153sm <2 <2 - ; 25 Esimerkki XXI (A ja B) a-(2-metoksi-5-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153 -kompleksilla leimatun IgG:n ja F(ab')2:n, [153Sm (MeO-BA- DOTA) ]-IgG:n ja [153Sm (MeO-BA-DOTA) ]-F (ab1 ) 2:n, paikallista- 30 minen in vivo ;* Otsikon mukaiset yhdisteet valmistettiin esimer keissä V, VI, XII ja XIII esitetyin menettelytavoin, ja in vivo -tutkimukset tehtiin esimerkin XI mukaisin menettelytavoin. Tulokset on esitetty taulukoissa VIA ja VIB.

35 115 104898

Esimerkki XXII

100 μΐ-.aan 153Sm-liuosta (väkevyys 0,3 x 10'3 M 0,01 N HCl:ssa; 5 mCi) lisättiin 6 μΐ PA-DOTMA:ta (esimerkin 29 mukaisella menetelmällä valmistettua diastereomee-5 ria, jolla on korkea Rf-arvo; 5 mmol/1 Milli-Q™-vedessä) , 20 μΐ MES-puskuria (1,0 M, pH 6) ja 1 μΐ HEPES-puskuria (0,5 M, pH 8,7). Tämä liuos sekoitettiin pyörresekoitti-mella, ja sen loppu-pH oli noin 6. Sen jälkeen kun seosta oli kuumennettu 90 °C:ssa 30 minuuttia, siitä analysoitiin 10 HPLC:llä GF-250-kolonnissa kompleksoitumisaste, ja yleensä saavutettiin vähintään 90 %:n saanto. 153Sm-DOTMA karakterisoitiin vertaamalla sitä ei-radioaktiiviseen Sm-komplek-siin, joka oli valmistettu ja karakterisoitu erikseen esimerkissä 42 kuvatulla tavalla.

15 Esimerkki XXIII

153Sm(SCN-PA-DOTMA) :n valmistus

Esimerkissä XXI valmistettuun 153Sm(PA-DOTMA)-kompleksiin, jota oli jäähdytetty huoneen lämpötilassa 20 minuuttia, lisättiin 10 μΐ l-%:ista tiofosgeeniliuosta, jos-20 sa väliaineena oli asetonitriili-vesiseos, joka sisälsi 90 % asetonitriiliä. Seosta sekoitettiin voimakkaasti pyörresekoittimessa, ja sen annettiin seistä huoneen lämpötilassa 5-20 minuuttia. HPLC-analyysiseurannan mukaan reaktio tapahtui välittömästi. Aktivoitu 153Sm-kompleksi • ' 25 uutettiin sen puhdistamiseksi kolmesti kloroformilla (200 μΐ/kerta), ja vesikerros johdettiin PRP-patruunan läpi (PRP-patruuna = Mini-clean™-patruuna, joka oli hankittu Alltech Associatesilta, Deerfield, IL) , joka oli esikäsitelty 5 ml :11a metanolia ja 5 ml :11a MES-puskuria 30 (20 mM, pH 5,8) . Pesun jälkeen, joka tehtiin 5 ml :11a MES- T puskuria ja 5 ml :11a Milli-Q™-vettä, se uutettiin 900 μ1:1ΐ3 90-%:ista asetonitriiliä heittäen ensimmäiset 100 μΐ pois, jolloin saatiin talteen noin 90 % 153Sm-aktii-visuudesta. Seos haihdutettiin kuiviin alennetussa pai-35 neessa alle 40 °C:n lämpötilassa, ja jäännös sisälsi suu- 116 104898 rimmaksi osaksi otsikon mukaista yhdistettä, joka käytettiin vasta-aineeseen konjugointiin.

Esimerkki XXIV (A ja B) 153Sm(SCN-PA-DOTMA) :n konjugointi IgG:hen ja F (ab1 )2-5 CC-49:ään

Yleensä vasta-aine väkevöitiin ja tehtiin vaihto karbonaattipuskuriin (pH 9,1 tai 9,5, 50 mM) Centricon™- väkevöintilaitteessa (moolimassaltaan 30 kilodaltonia pienemmät poistettiin), jolloin tuloksena oli vähintään pro-10 teiinipitoisuus 1,5 x 10'4 mol/1. Konjugaation toteuttamiseksi 153Sm(PA-DOTMA) :n isotiosyanaattijohdannaiseen (valmistettu esimerkissä XXIII) lisättiin sellainen pieni määrä karbonaattipuskuria, joka oli tarpeen lopullisen proteiinipitoisuuden alentamiseksi 1,5 x 10'4 mooliin/1, ja sen 15 jälkeen ekvivalenttinen määrä väkevöityä vasta-ainetta suhteessa BFC-153Sm-kompleksiin. Seos sekoitettiin pyörre-sekoittimessa, ja sen annettiin reagoida huoneen lämpötilassa 1 tunti tai siihen saakka, että 40 - 50 % 153Sm:sta oli sitoutunut vasta-aineeseen GF-250-kolonnissa tehdyn 20 HPLC-analyysin mukaan. Leimattu vasta-aine eristettiin kahdella peräkkäisellä keskipakogeelisuodatuksella Sepha-dex™ G-25 -kolonneja (2,2 ml) käyttäen. Leimatun vasta-aineen homogeenisuus, integriteetti ja immuunireaktiivi-suus määritettiin HPLC-analyysillä ja tavanomaisin bioke-25 miallisin menettelytavoin, joita on kuvattu edellä.

Esimerkki XXV (A ja B) 153Sm(PA-DOTMA) :11a leimatun IgG:n ja F (ab') 2-CC-4 9 :n biologista jakautumista koskevat tutkimukset

Tutkimukset tehtiin esimerkissä XI kuvatulla taval-30 la. Tulokset on esitetty taulukoissa VIIA ja VIIB. Ks. kuvat 15 - 28.

Esimerkki XXVI

177Lu (PA-DOTMA)-kompleksin valmistus 30 μ1:33η 177Lu-liuosta (6 x 10'3 mol/1 1,1 N 35 HCl:ssa, 4 mCi) lisättiin 36 μΐ PA-DOTMA:n (valmistettu 117 104898 esimerkin 29 mukaisella menettelytavalla) 5 mM Milli-Q™-vedessä. Liuosta sekoitettiin pyörresekoittimessa, ja lisättiin 115 μΐ MES-puskuria (1,0 M, pH 6,0) liuoksen pH:n säätämiseksi suunnilleen arvoon 5,5 - 6. Tätä liuosta kuu-5 mennettiin 90 °C:ssa 30 minuuttia yli 90-%:isen kelatoitu-misen saavuttamiseksi. Seos johdettiin PRP-patruunan läpi, joka oli esikäsitelty 5 ml :11a metanolia ja 5 ml :11a MES-puskuria (20 mM, pH 5,8). Se pestiin 5 ml:lla Milli-Q™-vedellä. 1000 ui:aan 90-%:ista asetonitriiliä uutetuksi 10 saatu kompleksi vastasi noin 78 % lähtö-177Lu-aktiivisuudes-ta (ensimmäiset 100 μΐ uutetta heitettiin pois).

Esimerkki XXVII 177Lu(SCN-PA-DOTMA) :n valmistus 90-%:isessa asetonitriilissä olevaan 177Lu(PA-15 DOTMA)-kompleksiin, joka saatiin esimerkissä XXVI, lisättiin 6 μΐ liuosta, joka sisälsi 10 % tiofosgeenia ja 90 % asetonitriiliä. Tätä liuosta sekoitettiin pyörresekoittimessa, ja 20 minuutin kuluttua siitä analysoitiin isotio-syanaattijohdannaisen muodostuminen HPLC:llä. Reaktio on 20 yleensä kvantitatiivinen. Liuottimen ja ylimääräisen tio-fosgeenin poisto toteutettiin 1-2 tunnin alipainehaihdu-tuksella alle 40 °C:n lämpötilassa. Jäännös käytettiin vasta-aineeseen konjugointiin.

Esimerkki XXVIII

25 177Lu (PA-DOTMA) :n konjugointi IgG-CC-49 : ään

Karbonaattipuskurissa (50 mM, pH 9,1) olevaan vasta-aineeseen IgG-CC-49:ään sekoitettiin ekvivalenttinen moolimäärä massa puskurissa olevaa isotiosyanaattijohdannaista (valmistettu esimerkin XXVII:n mukaisella menette-30 lytavalla). Reaktiota jatkettiin 70 minuuttia vasta-aine-pitoisuuden ollessa 1,5 x 10'4 M, ja leimattu vasta-aine eristettiin ja karakterisoitiin esimerkissä IX kuvatulla menettelytavalla.

118 104898

Esimerkki XXIX

177Lu (PA-DOTMA) :11a ja 177Lu (PA-DOTA) : 11a leimatun IgG-CC-49:n biologista jakautumista pitkällä aikavälillä koskevat tutkimukset 5 Pitkäaikainen eläinkoe tehtiin 177Lu:lla leimatulla vasta-aineella käyttäen hyväksi sen pitkää puoliintumisai-kaa (161 tuntia). Koe tehtiin Balb/c-hiirillä kolmen viikon aikana esimerkissä XI esitetyä ohjelmaa noudattaen. Tulokset on esitetty taulukossa VIHA. Ks. kuvat 29 - 34.

10 Kuvissa, joissa seuraavien taulukoiden tulokset on esitetty graafisesti, on käytetty seuraavia symboleja:

Konjugaatit ΙΤ^Ζ |K“Vat 'Β1?1’ boli lukko 'esim.

15 i1;^Sn(EA-D03A)]-IgG-CC-iJ9 Δ IA 1-7 IX

(1:>->SRj(EA-D03A))-F(ab· 2)-CC-49 Δ 13 8-1») X

[]?;Sm(Ez-DTPA)]-IgG-CC-49 Ö IC W ZA

['^SmiBz-DTPA^-FUb^-CC^ O ID 8-14 ZA

ί ] H^Sm( PA-DOTA) ]-IgG-CC-49 □ IIA 1-7 XII

[1:j-'Sm(PA-DOTA))-F(ab'2)-CC-49 □ 113 6-14 XIII

20 l '^Sm(BA-DOTA)]-I6G-CC-4 9 ΣΙΙΑ W XV

i1;>3Sm(BA-DOTA)]-F(ab,2)-CC-49 “ JIIB 8-14 XVI

f) ·?^3πΐ( PA-DOTMA)] —! gG — CC — 4? V VI IA 15-21 XXIV

[154Sm(PA-DOTMA)]-r (ab'2)-CC-49 V VIIB 22-28 XXV

[ 1'?'7Lu(PA-D0TMA)]-IgG-CC-4O · VIIIA 29-34 XXIX

[rn Lu(PA-DOTA )]-IgG-CC-4 9 V "viIIA 29-34 XXIX

: 25

Oheisissa kuvissa esitetyt tiedot ovat seuraavat: •.

119 104898

Kuva Elin Otsikko 1 Veri 153Sm-BFC:n biol.jakau? c 2 Maksa - " - 3 | Perna__- " - _ ~ Munuainen - " -_ 5 Kasvain τ " - 6 Reisi - " - 7 Retentio „ in koko ..eli- “ “ .

1U _ mistossa__ 8 Veri - " - ** 9 Maksa - " - 10 Munuainen - - " -_ n Perna__- " -_ ^ 12 Kasvain - " - 13 Reisi «·. glilnSi?- "-3I : “ _. mistÖssä__ 15 Veri - " - Ιό Maksa - " -_' 20 “7 Perna - " - 18 Munuainen - " - 19 Kasvain - " - 20 Reisi - " - 21 £S£§niK- - ” - _mistössä___ 25 22 Veri — " — ! 23 Maksa - " - 2-i Perna - " - 25 Munuainen.,’ - " - • · 30 *CC49-IgG karvattomissa hiirissä, joilla on LS174-T-kas-vain **CC49-F(ab')2 karvattomissa hiirissä, joilla on LS174-T-kasvain 35 ***CC49-IgG balb/c-hiirissä 120 104898

Kuva Elin Otsikko 5 26 Kasvain 153Sm-BFC:n bioL.jakaut.

27 Reisi - " - 28 Retentio „ koko eli- -mistä s s ä_____

29 Veri l'^u-BFC n bioL jaka^£A

30 Maksa - " - 10 31 j^na . - " - 32 Munuainen ' - " - 33 Reisi - " - K teli?- - - - _{[riistossa·___ 15 *CC49-IgG karvattomissa hiirissä, joilla on LS174-T-kas-vain **CC49-F(ab')2 karvattomissa hiirissä, joilla on LS174-T-kasvain 20 ***CC49-IgG balb/c-hiirissä 1 · 121 104898 5 θ' ο Ν Οΐ n ϊ »o ^ t» in t\j m 'rt ·^ ·~ ^ v n ^ , J3 1- ο — o m ο ο 1 Μ 1 id ω Μ Λ > ta 0 ~Τ3 —

° ™ > Ο Ν [\| ο Γ· n W

- ^ «(-ΛΟιΝΟΙΜΙΓι 2 Τ] in t— -=r m σ' ·=τ ο Ί m σ' n) Ο w -° 5oCMCM\OOOr- Λ 5 OvOSt-t-Mr- |rt w ^ κ ^ c jj ο ο ο σ> o o ” H 1 & (1) “ Λ > £ co -σ-------- rH -j. p1 f\icoc\j^r·— coo 2 oa in ό f— o r— m

S

3 Tj «-vo^rromcMo S « ^ ^

o <U

P tn « λ; ^ 2; 5 ^OvOiomcjcvjax M £Γ μ .H 7 in λ ιλ -- in o £ ui m +J cm o O 0 cm 0 0

X ad M h M

SC O c w 3 σ> C -15 —π-------- (¾ 'r id K _ ph I f\j r in co o — cr> cn 0 0 «1 ”f\iinoo»-inc\j cj -p .3 11 -~ 1- ·- ·- - ' 1 to Π t- in sr c- c\j 0 us m «- cv»

o» 10 S

1 O--Ξ________ v —g : Μ ή vo co cr> co m o\ • rija> ·η m (M in vo ·— 0

fO "Π id as K

0 c f cm — 0 0 — 1 0

Q ·Η H

1 0) rij — > ω t»p - — C — Λ —--------- mew ^ r as in h- o» s· vo WGW 2 0 cr. — m ·— % % Z M Z! ^ ^ - 1 0 kj +J O CO ^ * 0)

K

G G <— 0) 0) 0 a G g g~

•H ·Η -H H

(H id id id id -H <d id W -hcoc £ > co > co >-l Λί ^ C CO -HUIO ~ 0) id 0) 9 id ui idie n > S Λ sg 1 « 1 g c __1—L—L—J 1 122 104898

3 ·— (M ro t- ο O' N

|H O Ui -T ΙΛ ~ OJ CM

Ή ·- ·— ·— *— ^ *— t_

2 o o — o <- O O

0) A > i o "Ό 3 cm > in — co m m cr\ .=r S '“IjO’-OvOincrvsr

Jl Tjoaoinc— in.=ro 'H· ·— ro tn C Φ

a) M

e --------- ’il ,2 en cr\ vo in — q .2] o ω σ in in f- -- 0 _2 ooocv^-oo •H u Λ a) * Λ > C —ET —------ g t: ,> oo'-NO'-aj en h cm o co <- a· oj fT| *0 ·- ♦* r- f- m "fj o co 3· s ^ ro o -« Tn 0 ^ 3 __5*________ Ό - pq-H cm r- a »- <0 tn ho j-a-rocMcot— cmcm o ^ ~ JS o^-Nno^o- ·η " *· 3 C & C - « H -H \ w Λ p 3 (0 ““O— ------ 5¾ t! r-j > CMOVIOOJ — tn=r E-<C m 2 m o σ> m o ~ m 2 S jl — co^r^roiMo 10 w UP 0) UP « (0 --g— —--------

rt» ΜΛ T o m in O

; . -£CT\vOCMOC~-OC\J

(ö 3 "H OO '-•in·— 00 - « a> fn H ·> 1 O ^ ^ £ λ —g-------- < φ ^ Γ νΟΓο — oinain

m ·γί J ro-cnouvf-N

Ο Ρ .η - - - - - - · -

Q ·Η y m?-in-t\l(\JO

I W ~ ^ <1 —>· 0) .. W rt» v; ^ C — -— g 0) ------- ω e m

n -H 3 acmes o) ai G

H 3 W _ CC f=— ^ ^ O 5 -H -H H _ j m m <d m -h ien ^ m ·Ηΐοα3>ιη>« ., w ^^HCW-HUIK " Φ ra φ 3 <0 a; ran: _

> S 0< S « « «!E

_f ' |-> —___.j-,. I ., |. - i_ 123 104898 S <x> in ro — o o •-J t— zr us m co m

Ή C K «S K

2 --0000 pj ' M ro

<U V

Xi > ro

o ”TJ

tM ·> a· ro 00 VO n in — U es =r e— t— ro c\j

I Id «.t-kK*·!, Q

1 rjininroro — n ^ Γ» « vfl

£ W

3 φ O

rt ui t— * -------—--- .JH, P. o t— — — o in Η Ό O 00 Ό ro t«- 0) ^CM’-OOCOOpj rt M ro Ί rt si > in o -n-------- 0 5- r — 00 tM — CO t~-

H y 30 VO C- CO ΓΟ O

Λ .2 «- — ·-»-*- ·- vrj * c\j in = ro vo — £ 2 w *" " g ® r- w « r- fo ^ 1/1 i: in in so co ro co ^ 12 3Γ o ro 00 o m u rt U No-0‘90 e Ό M in O Ή —. W v

Λί O &> r< > CO

.* -P — ^ —σ-------- « o ^ &£::££££ 3 , 4JrH J300000000 rt C tn II .2 ,> r- * .Τ' vo

E-,.h a) e 2 Oiosrrocv- 'X

tn —1 n — * f ;rt -V e) o ® g_________Ξ_ ' σ> e ^ iö ·“! f- in - a- co w ; 1 -H o ro o O — — QJ (Q •O*'.·*·»·»*.·.

0 -M Τ' ro — — — roo _ • 1 w ” rl OS rt

Cn Ό ^ H -P Jd -n— __J______ ^ 10 Γ t- 3- ON ΛΙ o « — -f· «j o t— vi> in o ro ^Thincn(v ΐ s -s 1 ~ - 1 rt in

N —. *< CO

m <#> — ------ — rt —

β rt C I

. tn e w d) 0>-trt • · n -h s CC' —Min in £ S C H -H -*-> <u tn rHpin -h id id id id -h e ΰ

^ +j O «n -h tn C S > tn ajo-P

H n Ai M e tn -H -ΡΛίιη o» nj a) S id <u (UOri > 2 a. S «oi dime 124 104898 3 (\j (M a- in o o ar — m

J ^ K K K

5 O-Oun-O CQ

I U =r 3 ' <D v

+J iC > <M

3 Ο "TJ

[0 rg > p· o a r- a in ·* *— W 10 oo c\j «- in co *0 R] ^ K k ».

-HoinmovOCNJil? - no U1 C in *~

<D φ O

5 *-------Z.

n ^bot-tMinoo ^ jj Ο Ό vO CO CO “

Λ _i fc. 4. K v K

•H 20000'rj°o Λ M ar „ rt v 3 .C > ·=Γ

MMM M ^ M M M. mm—M

g CÖ u to 5- > ^ a- in w in to ro h r\j ·— »£> a- in — in

r—i -rj o vo on *- uo c\j rJ

« vO «— C tn *' n <U C3

O * LO

Ή ^ " ~ ** ”**" 0 j 3 a in Λ o o ti - a - - c- - oj Q « -— 2 {j o oj m o — c —-n |j{ fv O -H C « M (ö w X3 ^ Ό MM -P ~U-------- 3C m oj f; mm(M f-o t- 3 <* tn rt ^ ^ h T o 32 ~ ^ gV~ ~ u c « ra u c <u oj 1 rt fc«S t— o* --3-------- Γ' jj '“J ^J· 00 t- en co —

0 Tn '7 X o Oi o o (M

: * £ 5 - o-o^- _ ΐ o £ * Ϊ5 S ä -Tr-_______Ξ.

< ai ir. K

O, m 10 r on to- o — Ln co E-ι C £ O o un f- en ar Q -H -H w ·- .u.

1 w m t~ a o uo oj ‘ ’ n — « - - - °i.

« *» <U

e ** co .. to C m ---- • ro <U O _

* in C O , C I

rH -H tn Ϊ _ OHirt <j g o cc >-m tn ^ c w 3 -h -h -PO) tn

h rt rt m rt <n C «D

H h tn e 3 > tn tuo-p W MVMCW H-P^tn o) rt 0) „ e rt o> cdo-h

> S Λ S « OS PiMB

125 104898 3 m no in c— σ' σ\ m f-t (VI Ο O' ΙΛ Μ νΟ - •Η I ™ -=Τ ·“ — Ο ΓΠ Ο Ο 3 £ m -Ρ η 3 Λ « (0 * r-J —Q--------

(0 ‘j t> 7 ιΟ " O O - O

h n - m (\j m 3· (M

Ifl c «-tf-JTJTmco'-o Ϊ M t- c n •H fl>

Cn « O -----------

Tl 3 CO CM C\J CT> CO C— m o tn m m in ro <— Λ Ji*-ooo*-oo e H ™ ·· fl) tn -e —p-------- ro ϋ in σ» p* cocnt— •s'O'O'io rH ^ y (\i in m ? in vo -- 5 v - e "J m in q- m n >- o O ^ T“ K.

-Ö « -H — <» 0 O'_________ < -3 - m h Λί o *- o in m cm o m o <o Π — cm tn co ro cm 'Π -P e ^ ► i. r- o C w* jj CM o O O CO o o * -h φ r

v> (Λ H

3 «rt Ä ® Ή C o II ^ 3 .. CC10 —n-----—-— (0 ON G ^ ™ > 3 N in ιΟ - ΓΜ 5· ίη 7 « «»-O'O’-coom Λ m * «_-·*-«*·»- y ^ 2 λ in in m n n o 1 to to *" ~

U3 <U

en T3 « H -H--g—------- . J U <-* ON^rovoO’— ctv

• ·_? x -Hco«— co o — CM

ί Ä S ™ - - o" cvv O cT

§ -S Λ « l in ^ <C -» - —rr— —— — — — —_ rininco — »-erNp- E JjNOCMONOmoro en e to i ί ·* n. λ -e v» ηΦ3 Γ; -=r co o — — cm o m e 3 Tn cm — Il .. <rl Ή W Ϊ ^ e O $ ; e « G G—· O) tue e G G £—

5 rl -H H

j <0 3 tJ <fl H rö <t)

Ti HtOG3>co>cfl W P * M 3 M H toto

<D HJ <D 3 (0 oi (ÖrtJ

> s i< 3 « x pe 126 104898 0 vo O iti - o m

r-i ΙΟ (\l «“ t— f\J ·“ CM

*H ^ PV K ^ x 1 rt o o o m — o o 3 +» *

£ U

0 0) 2 Λ >_______ rt O ~0— ™ (\i .►> ro — — on — m ·— k OO^rr-coin^r n n( p-pv^nv^si^ S •ΗΟ’-'-σΝιηοο c * - -rO «n o __^-------

H

O 3 CO — (Mr-~— (MO

•H 'J O CO >- on CM ·- 5 o o o αο *- o o

s S

E j3 > w Ä Jl________

**» CO

m 2r r mcoon— mc— on

n h nn^-moNON’— (M

r· V- ·- tv r· p- .

c -r! o 5· m - T - o 0 ^ ίΛ p—

TJ M

•H O) 0 « -P - ------------ -¾ fj mojinor-inm „21 — m^r — oro — ffl tn tn *H p- ^ ^ ^ v. p.

H .5 ~ £ 2 ooocoooo <Ö il U * O ad -P c 4> ^ c «n w ' - > M ·· Φ Λ —o-------- O on tn zr ,η^τ λ; rvj ζ in 3- n co en - en 3 1 o J^roorjc^-om·— fO U C " .5 - — — Vv Pv »S _

EhU C rjcdinmcoco — o 1 (ö *5 ^ ™ 0) <0 ui -P----------- Λ ω 0 . rt 0 '-•Norvj^rrnmc^co • — ό -H t- o o o in o -h nj 1 o +> o o o in o o o r> -P ^ _J M tt) <4 O > H -n χ _________

O C P

Q -H iti ^^rmocoONmo ^ ^ , »- k V «>. <, Λ <** "2 ~ t' e· - t- (M o __ e ω ^ *· en e w <u il

* m a) 0 W

. in C O -—:--------C

r-i -rt W * ^ e ° „ „ e &— Φ <utr e e C B- *H *rt H rt rt rt rt -H rt rt m -rtinc3>w>w m ^ P e ω -h tnw Φ rt a) 0 rt a) rtrt

> S d* S « 04 *E

127 104898 rj a· ίο o m o co ip M 5\ in N 3· 3· - H v v.

ni no·- o m o o

~ +> * * (VJ

-p M

° g p —o-- --

C t>OOvOOO>v£>t— O

nJ M vOftlf-q-CM’-CVI

-¾ id k*s».c rt -H oo^rmroin— o ^ M co • w C <r> <1) κέ C --—-—------ 5 m o in e- m o vo o " ιη^Γηιητηο o j0. O o' O o~ ·—~ o~ o •H M * * *~

Xl 0) ^ X3 > c —n-------- e 2 > - in co s t co o co M vo m t— «— co o c\i n ™ ·-->»"·>·>*.«- ιη ·γ· m in a· m in n o ^ tn c « 0 __Ξ________ •O rt <-w ^ p o\ (m s vo in in r mo en jC— ooros-mo M-P ~ 3 v ^ ^ ^ ^

M M O^—OvOOO

Q) id in f v-> w ^ u

O -n -P M P

.* C M C -h « M -H Q) w ·Ρ > C W —O—— --—---

Ti :5 oi !>; mvomoin-M

£ „ g g in^ocMoo -

Men e .2*»νν*-ν·~·- H 5 § m ^ *n in m a - o 1 UI m u ro <u

u +j M

i en --=— —------ en ir) M enen — oo^roj M -h -H m t~ vo in oun n i o S '"·'*'·-*«--··-

. +j -P — OOOOJOO

«< o Ä 5! i M -n in ^ ' O C * —n—;------- q -h ^ i; l ^ r o m m s- - s· r < —. S ® in in o - in m 0Q dP .3 1*.^·.-.*.*.^.

— ~ _v - f- in m e n o __ e „ Tn cm - ^ en e m ä ., en O 0 S 11 in e O __rv.

• r) ·Η M - P

^ e ° e c~ * Q) 0)0 cc ε~

C ·Η τ| H

.3 id n) id id -h idid rt« -h m e C > en >« ro M X P C to -H into O) id <u 3 id o id id

> S Ok a « cö <E

128 104898 m o t— — m o 'j o CM m vo in m *— , £ooocmcmoo 3 M * +) 0> 3 Ä > <0 0 —0

•ί M > momoo>oiM

.z. yoin a- σ\ m vo ·— 3 ^o-r-s-f^oo 0) w ™ G m ·*· tT> --=-------- o 4 rH rr co co ifl in es io

o HOCOmf-CMCMO

•H η}-·>··~-·~*--·.

Λ jjOOOt— moo - * C d) c x: > m co "g-------- n ja- r aoojco^-inmt— m Jj (M (\i co a· o o - G OTNOC-'-o •O « <11 0 ·__«_ 3 miu _ h cm cm cm cm — in c- h *® 9 .H ~ co in cm co - o lj H w Ig ** ** *· ^ ** h -h in 4j o o o m *- o o (0 II P * o ad -pc.. o> ; λ; ·· a) ^ —o—;------- 3 σ» tn Jr Σ»

,π ,¾ CM r (MOCOIOON

οι o S - ^ ^ n m - ίου c ^ - fh m c cMomr—jr — o 1 (0 m t cm

CM QJ

-—. UJ

+J--=—_________ Λ in 5 (0 3 r-l O -- M O' J o oo : — Ό ] ot-iociiM-o . U-i Ή I Ο Τ' OOO — ΓΜΟΟ ^ ^ £ * <C ai > £ ·Ρ Λ —rj—_______ O G r Q -H u' r cMO\mo'camc'- I ·Λ O on Λ| in - f- ί5 " ' »- r- *~ »- r- T- r- ^ m c— — o — cm o n w *“ m — co c m 3 *c • n a) 3__*< * Η ή w - - lo g o G G—

^ c ^ <U (DO

3 3 &— ^ Ή ·Η Ή .3 rd (0 <0 (0 ·Η f0<0 «—I ·η ui 3 3 > ui>tfl M C4 M u 3 w -H win 0) ia o 3 <0 a) <oio

> s Λ a « « *E

129 104898 O — m cm in c\j ctn — H <- vo co * m o Ή r* t t. *s k i. ·— *d ro o »- m o o +> — * * U m 0) A > h. ' U—

1 tncMO

3 «— Wc— t—minocn·- 4-J id * 3 ή i-ffinnwi-o «3 Λί — · C\ M 10 id Q) -<-> __w_________

£ 5 CM «- «- O ;=r Cs C\J

2 >] t-^nnrjno -5 Ία ·* * * * v *~.

i 5 —οοο-οο o u * * * I—I 0) o A > A CO “5-------- 2- r ONr-mmvo— co G « oo ·- sr *- m «- o 0 '[1 t m e m vo cm o . Ί λ I— ir\ 5 _J________ >c *ί o\ ·— a- in «— ocm.

ho -jinmcMs-CMroo 0-H 37 2— O’-omoo ^ O _ ^ f ******* PM ^ c « HQ) id — _c O-η +J U 1 -------- ® 5 m rj ^ fdit-rOmiDOl H-Η o CM u =T r- =r *- o o 2 2 *'·'·'·'·*·' *- *2 *0 ‘3 ΟΌ ΙΛ C Oi rj o .. G *--***;r** σι c Q) * * Ί3* id t>< 1 --jg— ------- ; H 2 H f\j a· o in σι o o\ .. I to -h mmincomoo 0 <0

Cn Ό f1 om·— O

V ’3 I

S £ -c 4-_______ rtj 0) .Λ fe; H -1-v u' JjOr-ONOa-C^m 0 C 3 ins-wooir-'- Q -H .j — *·»«»» — ·-·_ 1 o ot-om— c\jo

< — (0 CM *— II

• 'Z ~ _ « c Ω C to ——J——I----i------ * f'- OP - - h -S S See® ^ E O -5 H ^ .:3 id id id id h id io h hw C O > co>tn

ro WiiWGlOHWW

0) id « O « m die > s Oi S « K pe 130 104898 3 m f- m o m ro r-ι o ro <\i — r~- c\j —

«Ö oooojoocT

P 3* *C *

M

3 35 ^ 0) ** ,,------- G o 0 •H oo ·> -=r O m cd co> cr\ tr ·— j-ι o m m o io a· - q id *- · ^ *- ,Η -H o — *— in^xoo 0 M ·-

•rl W

Λ (U

K__ G ---" - - ----- " 3 a in i· t- in γλ vd 3 ^03-0-=ΓΓΟΖΓΟ

^ * O O O v£> C\J O O

r- 4-»

rH M

a) G Λ > G -U-“----—-- *2 2 > ma o in j in t'

χ M 3· M o ~ 3· O O

H ro — ^ 2 -h o ro ro co in o o a> m ~ ^ •n» Φ 3 Cn__frS________ m 2 3 co — tn m co on m m 3 % 3 ^ ^ ~ o ^ o

H O' S 5 OOOOOJOO

t3> 2 Τ'******* oi o c Φ ^ a c -3 ________ h cm 10 7Γ > o — o o o m o 3 ~ ro w £* — in o jr- — — >- ro +j Ε-ιΛ m ‘3 ro in n c on ^ o ro 3 * * * * f. r- * * Γ *3 S * * 1 o__iz____ o-, -P 3 — λ; rHo- i>- m im cn m ro

< <D ·<Η C3 f\l t?\ r o O O

H M—1 ro - r- r- K. ^

O G G -P OOOOOvJOO

- - o <u -h M * * i e a> < ’H Λ > λ e #> - “3 — ·« —--------- j 3 ω 10 rinoNr-oocjNrroo ^ rT ro 3 S omNeo·-- r~, vf ro .ro - *- — n

iro ro n 5 ^--ooNO

'-J -n o tn m— G

oj *

K

G G—

O) Φ O

_ G G g— G ·Η -ro h •ri ro ro ro ro ή ro ro ή -h w c 3 > i» >» W II A! Vi c M -H min a) ro a) 3 ro a) roro

> g Oi S « « *:E

131 104898 3 a- o o m - m »J oi n o m rn r

fl CNi - O O *“ O

S w tt) C ,nÄ > g "o ~TJ------- 3 II <\l ·> (VI CO 0\ t~ N ^

2 ·— Vt O vO *- iT ro O

5 c id ·,·.·.·».·* v

Jj •H vO IIV ϊ (VI O ^ 3 ^ f— 3 in S o» ie __*__-_____ •rv ,-f P — vO OO O 03 *- c Π =o ον n λ a· >- oi ‘d *.*-*-**»- ·> c 2 o o o o in o •H tl 5,1 * * * S' » 0 ^ “Ό------- •h ~ > m (M vo o <- σ\ Λ 11 y o in (O ιΰ " t~

IQ K v V

G c ‘d in o ιλ m o >- · "f; *— vo

>H W

O 0» σν « c --“—------ ^ S ,ί: cr\ t« m o m c

o £ en -H o f- e- O - (A

3 o * * oi"o o 3 4J +) H * •H .K tn 4) 1,1 0 (DO) > id ·ι—ι tn tr>·^ —q— — — —— — — — H -HO 11 ^ £ cj *- © tn m — e 2 M O KV m M3 ad e G .3 ~ fi <3 £ 3 N m ^ ·· tn *“ — σι (0 m 'S· +· s* 1 tn--2—______ US 3 : u Ό η o n vo o oun • i -h ‘3 av — c\j tn r— ·— U O « r- -

DV-P f-^-OOOOO

M -V ft 1 φ ω e -h ~ P :------ H 11 “* r ;in in ra ? in kv 2 * G S ~.°

JL ^ u iin o in m (\i (M

£ tn « ™ • —-3 0) I* O ^ « _ O M —-----ro

^4 ° C II II

a> cc cc C τ| ·η * * •h id id id id ή *

,π -H in e S > M

to vt ,¾ vt e tn -h <u id a) s id Q) > S o* S * « 132 104898

3 iCM (Μ =τ Ο Os CM

f—t o m m o o —

•H

id ;o o o tv c\i o S s <d a> .5 Ä t>______

e O U

5 fy ·> a-iomvonco R .-koinmmoocn tl id - - — *-*-»- a -H o - - CM in o -¾ « 10 Q) __K______ £ ii m m t— o% co c o m f- io o ·- "&» «* o o o sr in o ° s *

0 <U

•S X!>______ -° —"TT~ oo j> *— *— =r — cj\ G ^ M pooinmcom ·· id »·.*·. >s

X -H O m N N O

o M =r — en V) a) e « CP CJ --— — — — — >T3 3 o cm en cm e— sr 00 d = = 1 S - «ooom^o- 3 a) tn „ u Ή τη f. φ 3 e Id 3 - >

Id ·Η 4J *®· --——--— H :<d S £ £ ™ ? 2 3 ™ S 5 2 - o · en O -H OJ m un OJ - '»C „ ° ™ 1 e 0) u Id « U --=------- i id ^

CSJ4J rH en — in CM CO CM

_ m -H — CD ro in CO CM

: “3 rd->*.-.v^-> λό f *- o o in o o <d —i ft * — o ®

Cm -U > 1 -¾ A —n_______

K, a> P

—J-r-t in rf-cot— ococm < G 3 co en cm o O ~ H Ή 5 s »- K s ». »s 0 TI en id =r — m »- Q ^ ^ 1 -p « <c - ω . Dj Im — 0) ------— • iH 3

° 3 C II

o? w (D

^ O C C C

h ·Η *H ♦ •H id id id id -h ri -h tn e 3 > m

W n m le e w -H

ω ιΰ ω 3 id m > S P* S « « 104898 c --

0) r) IvO N - O' N O

C iH , O (\l 3- - O' " -H ^ k. p‘ s k,

6 rt — O O O — O

3 -P CM

+J n 3 rt rt Ό'Λ > Λ n O “Ο ™ 11 cm · > ^ 3· m i» λ σ> π u -rt- m m s· cm cm G rt ~^ 5 ^ es sr sr m £ - c ui -rl o> U* k* O --S----«rt--- o 3 ® r- m ιλ o en e- S’ O' 3- N (\l Λ 5 O O θ' θ' ΙΤί ο" C u e « e Δ > V3 ** . JL,-------

unm JJ

m ~ > ω N θ' e- 5· m .π π ^ jj ' o\ en o ? m o e C -h m o sr m cd cm 3 Mr- m Ό w •H rt 0 *4 P --------- ---

5 CO CO sr - e- CM

< a> ~ ^ <- ό ό r m m ί^ Γ> tn *3 - - . r- ^ ^ w £ — o O o m o '

o m M

X M +i rt X C en inn. > 3-0) Λ —π— — ——--- •h en m nsr S . _ _ _ _ 3 v pj Γ C~ CM O ΓΟ — — iöi o e 2 1Λ (M O N ΰ O'

Eh U C .2 *- ** - - - u e £ sr o sr m = - 1 rt m *“ - C3 a)

Cn rt ui H 4J -------- —=_______ i m rv. s •h in m o - - n

—} >rt ·2 f* O' e (\l O' N

< -h S ·* *· - »- *- *-

*· · Eho t; O ·- «- O CO O

0 4J S * * Q Ai g 1 d) in ·* < 1—1 *C “"'M" __ _„ ___ __ m e n._. k! i -h 10 L o o o> co o — Q C 30000—010 Q) ^ -rj _ — ·*_ — s <#> - σ> in ίο o c\j 'a ^ to ™ — W (0 Ä n 3 ______ ‘. in 3 ------ • rh m *^t o e n ai cc e C -H -H * •H rt rt rt rt *h rj -h to e 3 > en w u M M C to -rt ® rt a> 3 rt a) > S CU S * 05 134 104898 3 m m co jt m o ·] o u*\ ud t— o —

f? O O O M O O

m * * 0) * Λ > o ”"0 cxi · > in λ co in »· es

·“ H O 3· -- (M (\l O

ra

Tl o cj (M sr in o M pj

C M

ra at C Ui •H ” '" ™" “[_r -* — ' ΪΓ 2 m t- o en o m

^ 5 O N ? ΛΙ O O

O (rt - V- —

pOOOvOOO

Λ M * * 0) C Ä > g CO · “P------- LO Sr r — n o\ ω m o fn « m vo in vo m σ\ in .2 ^ *- »~ rH o a· (M t- (M o c ra 5 a) -a __«__ •H 3 0 1 MO O M O r.

+> Π m ·— c~ o Ό m mat ~ ij o — o co o > ? ΐ tl > -5 c . « O — XJ ^ λ: aa ~σ------- •*C S' Kjgrof-rnvoO’- H * ra ra ra 7 ra 3

Eh u a) w ^ ,

Uw ra

1 a: K

(N O "3—r—----- ~ S '“j o o c— in o o xi JS ^ m - in o oim

: ; — (0 £ O O O LH ΓΟ O

— fci 4-* (D * * IM > * * K 3 ^ —Jo λ —pr-______ <ί ·η m p

En O Jrt so co in t~- σ> — 0 +> ra O' m en o in 43 Q Ai -H ~ 1 a) Ai c\i o m r~- oj r\j < -n ra — -e- — m e e a> i a) -n o e -- •, Q) -rl .—. ------ s e <#>

C

6 +) ra co 3 ra _, CC <n «*

n ro e .5 H *«H

m x s Σ <a ra ra ra -h n u rH ra m S -rHraCC>«

Vj-1-ιΟ M Jrt C W -H cc ra ra ra e ra ra *·* > s m S ui « * 104898 ρ - own λ o ο «-J on νο m co vo o

rt o O O O m O

M

0) *3 > o *TJ-------

S r-kpNt—t-’-a’C'J

QJ rt v ·“ 5 ·Η 33 rr m m vo »—

e ·* vO

E 10 3 rt P w 3 --2— —----- 5 P λ n ιλ in m o S 3 5 o o o o o o c u * - a; ai 5 Λ -> o· co ”P------- o S- p . a co ie in o ^ f-h h t— on vo σν t~ a* 0 * v..

•h ·π *· s· n m r » Λ -¾ — s-

M

C rt H ---------- ^ W ? r— O LH *- (M r-

H S -H

>·-' ^ S - - o O M O

UI j r O G II M * Λί O C ® Λί Ό *_* r*. > 3 -H -° —O------- «R ϊΓ ^ 3 0 0 f- in o rt £ ON 3 un vO C\J o CO o * £ ^ 3

G -P « *“ M

-H 10 φ Q) k ao W ———TS— — — -· — — — ..o '"l — — ro ro o o

.. en c ·2 <- tn o (v »· (M

:. ^ c .S

1 fö +> —* O ’— O CM o u « * U rt > I -P ^ 0 in Λ —rt”_____

Cn G in > ---- h ό μ o ^ in o o 3·

l-H (H O f— O O ~ ON

'S. R *r| V

-P ^mc^vomo’— a ·* w im — S « * fcn Π iy : O G * • D -H ------•«S·

< — G II

1¾ dP 0)

” ” - G G G

g G -H ·Η * tn en rt rt rt rt ή rop rj -H tn g 0 > in mo w μ ^ ti e n ·η •H» rt rt a) G rt 0) M O > S & S ^ ^ 136 104898 Γ" T~' ""Τ' 3 (M t\i m ο *- a· h o m «— vo o c\j ·*} o o o o m o f * * t-i e) Ä > o ~0------- (M i> r— m oj in o cr\ »- H O On O'* CO O' t- id ·> ·- . ·- *- *-

- Ή O ^ O C T O

^ ^ f» 2 io 5 oi £ --*------- J3 3 tn w ? no co O ^JOvOvOOOOCd *H **J ·* ·* *·

2 O O O t- C\j O

c M

c Φ P Ä > m “0------- n ~ > o in o\ o> o o m ^ h 1 n « o N N o» r{ Id ^ ·- #- ·«.»..·.

•H o m oj in in O

c ^4 ja* «- 3 in O 0) •H « 0 ---------- _ Ή i ro Ch - m w m S ^ ^ - 5· m «o o - >'c n * o o o m - o

Λ Ή CH H

° ^ C e> M vo cd w ö. ^ A< C -P ^ -O--------- ΓΗΟΛ S c\j F* ^rococ^t-'-o 3 S n <d go m ra m ru o

Suo 5 ^ to ^ U c «n in »- 1 c 0)

(N (0 __K

. . - m fj — — — — — ——

• XI 4J ·] O C\) f- v£> m O

‘ ia oi υ o in m cm (M o — 3 3 - -

fxi Ό M - O O in N O

I -H 0) ^ ° >

^ Φ Λ —n—— — — ---S

E-· -r-> Cinrucocoint— o c c «i =o *- o cu ο ία £ -h " ,Λ ~ - J C (M iT O *“ *" < ’2 in — in — : ‘ fr £ #> a, :> e B w __*_ co 3 oi — —--- n id 3 in M 3 c - ' «H id oi a) ^ -1-1 o _ cc Z! m id (d <d w n

s -H UI C 3 > -H

w UXl-lCUld) C

<u (d <u 3 id oi * > z Oi S * 137 104898 III ad ·<η ad rd ™ σι in in o > jj οο m ιλ in m -h u _ d" d- 0s* o'- ad -0) 3 C '?« _£_d______ a) _

C Γ1 I

•h ^ m co r- m r* r-» g λ; o «5 >? ο *- io 3 ?, > d" rsP f-x p t4 id __ 10 .li " .2, {+ in t- co m m

° ’ ^U O v© On ,=r f\J

c Μ φ 3 - ^ - ^ - _T *-

a) ad > γη O Ο O O

c cu ------ •rl 3· I __ tjl r- *3 ^

π o *“ vO On ,=r vO

rH tO > *- t““ Ο ~ ΓΟ o 0)1-1 *- *- w *-

•H Jää Id »— VO CO m CM

Λ ------- c ·Η ·> ad id o 3 ad +i *- on co ρ- o ►q > μ ; t— e— ·* o» ·— r— · *H <d 3 «.. ·* o »-. ·-

r- ad>iH o O* O O

rH (X ---— ..... -

. I

< C t- -rj on m3 to ^ P ” ·“ t— ·“ ~

Η Ό II p* ·- NO CM CO

M-H C 0} £ CJ ·> O V

>0 i*i 3 <\i co — in oj +-i . --------------- 0 M O'

M 0) ^ I

·*·(?"} ^ on t- 3 “ · S " ’ * S “ 1 =g I * *3 ? - ? o' o" o CO - 2 ~ .1 in <v *-

T 3 * 0 C\l CvJ O'» ~ PO

u tn> _Γ ~ ., uid a) l-ι £, H Ξ ,Γ _J~ :.: i+J <d m — «- vo _ 0 in 1- 1 -

tn 3 -H

ho id _ _ 1 -r-ι 4J NO NO VO no in P^O μ no a- — o .=- _J 4J 0) 3 - *- — - «.-

ft Μ Λ > H l\) O — (NO

s 0) " ' ' -—

Η ·γη ~ I

0 c cm -h in ·- m q -Η λ: O on o *- f\j r~- 1 · m >-·»*. in on < —. 0) In *- o o : (¾ <*o aä id m »— »- o m

3 1 I

3 w -H

j^. d 3 id id *h t r- 3 C-Hwesm

MW -Η μ -H fi C -H II

kj o rH φ Id Id 3 0) ID

w > a sac « c 138 104898 aö ·Η m — m τγ

5 <0 3 T <7 O ’V

c > ti ^ ^ ^ ? c % jL3______

-H JT

E r\j ’, ui r-~ -ςτ o -- 3 '•H coooot^ 3 m > CO" o" θ'- γνΓ~ r-"

(0 OH

Λί _i6 rt______

3 I

° « *S σ> - ^+J CO CO O — o S > M - ~ - "· ™ C .da)3 *~ - *~ · *- O *>.

•5 % > H _®__O - « O

tri ~ o sr I „

,—| «— Ή CO

0 ^ o t— m t— o ^-H ω> Ό CM CM m 3 .Q 0) M “*--·«- ««.

0 «nj*-voo\mr\j M G -------

+> .. I

rO 3 -H

•n i3 ao »0 ~ r- 5+1 ro - in o — r- o o ro in ;r rtJrH .2 O) 3

H aö^1-* *“ O O

H G O, —------

^ ^ I

> Ό ^ ·Η o CM

•h m MO en o o co co 0 0 II w > V. (M v CTN 0\ M -P c <D >-r — .-· O »'t.

.* Λί tn « rt cm cr> ro 3 <U ^ --- - —- - - —

Ή *r~i f0 I

3 C -P -H

(0 -H CD 3 ^vr<m ti CO t~- ~ en ^ C JS S 3 ^ ^ ^ ^ "O Ä > M ro —o"' o"

σι G

-a· 3 5 Λ 10 -H CM — in ura * 0-^=^2-

! : I 4J w > _ ' * & 'O

σ 3 S ro cm - - m ro

M Ό I

1 -H ’jj .

® +> in — r— ro ro irt —. ro co o S <u a) 3 o

En to r > Ή * - — o O C _ ------------— " 1 — ^ H CM ' ro — o

< ί n rouocoi-LO

£ ** «5 > 0-· rT ^ ? ®s S ^ 2 t- „ *3 cd ——let— ,—·τ --

r- 3 I

i" 3 -H _ o? . ® G 3 3 3 -H "~ O ή -H tn E 3 in „

—l U M -H C G -H

W (1) 3330 CU — __>_ ase. m -

Claims (21)

139 104898

1. Menetelmä terapeuttisesti aktiivisen metalli -kompleksiyhdisteen valmistamiseksi, jonka muodostaa kaavan 5 (IA) “ ^— v.... >-f H Q mukainen yhdiste, jossa kaavassa 15 kukin Q on itsenäisesti vety tai (CHR5)pC02R, Q1 on vety tai C02R, kukin R on itsenäisesti vety tai Cx.4-alkyyli, sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q ja Q1 on muita kuin vetyjä ja että kun Q1 on vety niin R3 20 on muu kuin vety, kukin Rs on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, n on kokonaisluku nollasta viiteen, p on 1 tai 2, R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikar- ; 25 batsido-, tiosemikarbatsido-, maleimido-, bromiasetamido- • · tai karboksyyliryhmä, R3 on C^-alkoksi, -0CH2C02H, hydroksi tai vety, R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikar-batsido-, tiosemikarbatsido-, maleimido-, bromiasetamido- 30 tai karboksyyliryhmä, sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola kompleksoi-tuneena metalli-ionin kanssa, joka on La, Ce, Pr, Nd, Pm, 140 104898 Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y tai Se, tunnettu siitä, että (A) yhdiste, jolla on kaava 5 1 /7~\ ?' \ / <va> 02u -V7 -(CH2)-c-N N-H \=/ n ; / \ H jossa

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan IA mukaisena yhdisteenä käy- 20 tetään 1-[2-(4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,- 10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahappoa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan IA mukaisena yhdisteenä käytetään 1- (2-metoksi-5-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa- ; ' 25 syklododekaani-4,7,10-trietikkahappoa.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan IA mukaisena yhdisteenä käytetään 1-(2-hydroksi-5-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-at-sasyklododekaani-4,7,10-trietikkahappoa.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- n e t t u siitä, että kaavan IA mukaisena yhdisteenä käytetään a-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-l-(R,S-etikka)-4,7,10-tris-(R-metyyli- e-tikka)hapon l-isopropyyli-4,7,10-trimetyyliesteriä. 145 104898

5 Q1, R, R2 ja R5 ovat vetyjä ja R4 on amino, tai (I) yhdiste, jolla on kaava H

5 Q1, R5 ja n ovat edellä määritellyt, R3, R4 ja R ovat vetyjä ja R2 on amino, tai (G) yhdiste, jolla on kaava 10 h □ 3' · /' 'N-(CH2)-C-.N N- H (IVA)

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan IA mukaisena yhdisteenä käytetään a- [2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1-(R,S-etikka)-4,7,10-tris-(R-metyylietik- 5 ka)happoa.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan IA mukaisena yhdisteenä käytetään a- [2-(4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1-(R,S-etikka)-4,7,10-tris-(R- 10 metyylietikka)happoa.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan IA mukaisena yhdisteenä käy-teään o-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7-trietikkahappoa.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että kaavan IA mukaisena yhdisteenä käytetään o-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-l,4,10-trietikkahappoa.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että kaavan IA mukaisena yh disteenä käytetään a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-at-sasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappoa.

10. OMe ^ N /-\ Ql C / // 'S-(CH2)-C-N N- H (VIHA) " H

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan IA mukaisena yh- l 25 disteenä käytetään a-(4-isotiosyanaattofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappoa.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan IA mukaisena yhdisteenä käytetään a-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- 3. tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10 -tetraetikkahapon . 1,4,7,10-tetrametyyliesteriä.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan IA mukaisena yhdisteenä käytetään a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- 146 104898 tetra-atsasyklododekaani-1,4, 7 , 10-tetraetikkahapon 1,4,7,10-tetrametyyliesteriä.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan IA mukaisena yh- 5 disteenä käytetään a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappoa.

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan IA mukaisena yhdisteenä käytetään a- [2- (4-isotiosyanaattofenyyli) etyyli] - 10 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikka happoa .

15 S°2 » jossa Q1 on C02R, R on C^-alkyyli ja 20. on kokonaisluku nollasta viiteen, satetaan reagoimaan o-halogeenikarboksyylihappojohdannaisen kanssa, jolla on kaava BrCH2C02R • ' 25 jossa R on edellä määritelty, orgaanisen liuottimen ja emäksen läsnäollessa 0 °C:n ja refluksointilämpötilan välillä olevassa lämpötilassa, kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa

30 Q1, Q ja n ovat edellä määritellyt, R2 on vety ja R4 on nitro, tai (J) vaiheen (I) tuote saatetaan reagoimaan de-es-teröintiaineen, kuten vahvan hapon, kanssa ja sen jälkeen 35 hydrausaineen, kuten Pd/C:n ja vedyn, kanssa tavanomai- 144 104898 sissa reaktio-olosuhteissa kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa Q1, Q ja n ovat edellä määritellyt, R, R2 ja R5 ovat vetyjä ja 5 R4 on amino, tai (K) vaiheen (B), (F) , (H) tai (J) tuote saatetaan reagoimaan tiofosgeenin kanssa vastaavan yhdisteen saamiseksi, jossa R2 tai R4 on isotiosyanaatto; (L) mahdollisesti kaavan IA mukainen yhdiste saate-10 taan tunnetuilla menetelmillä reagoimaan sopivan reagens- sin kanssa yhdisteen kalium-, natrium-, litium-, ammonium-, kalsium-, magnesium- tai vetykloridiadduktin saamiseksi farmaseuttisesti hyväksyttävänä suolana, ja (M) jollakin menetelmistä (A) - (L) valmistettu 15 yhdiste saatetaan reagoimaan metalli-ionin kanssa, joka metalli-ioni on La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y tai Se.

15 H NC>2 ' i H jossa R3' on C^-alkoksi, -0CH2C02H tai hydroksi ja 20 n on kokonaisluku nollasta viiteen, satetaan reagoimaan α-halogeenikarboksyylihapon kanssa, jolla on kaava BrCH2C02H : ' 25 • < orgaanisen liuottimen ja emäksen läsnäollessa 0 °C:n ja refluksointilämpötilan välillä olevassa lämpötilassa, kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa R3 on sama kuin edellä määritelty R3' , 30. on edellä määritelty, Q1 ja R2 ovat vetyjä ja R4 on nitro, tai (H) vaiheen (G) tuote saatetaan reagoimaan hydra-usaineen, kuten Pd/C:n ja vedyn, kanssa tavanomaisissa 143 104898 reaktio-olosuhteissa kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa R3 on sama kuin edellä määritelty R31 , n on edellä määritelty,

15. COOR * '''H 0 o — S— o έ jossa R ja Rs ovat edellä määritellyt, kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa • 25 Q1, R5 ja n ovat edellä määritellyt, R3 ja R4 ovat vetyjä, R on C^-alkyyli ja R2 on nitro, tai (E) vaiheen (D) tuote saatetaan reagoimaan hydra-30 usaineen, kuten Pd/C:n ja vedyn, kanssa tavanomaisissa . reaktio-olosuhteissa kaavan IA mukaisen yhdisteen saarni- seksi, jossa Q1, R5 ja n ovat edellä määritellyt, R3 ja R4 ovat vetyjä, 35. on C^-alkyyli ja 142 104898 R2 on amino, tai (F) vaiheen (E) tuote saatetaan reagoimaan de-es-teröintlaineen, kuten vahvan hapon, kanssa kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa

15 Q1 on C02R, R on C1.4-alkyyli ja n on kokonaisluku nollasta viiteen, satetaan reagoimaan a-halogeenikarboksyylihappoesterin kanssa, jolla on kaava 20 BrCH2C02R jossa R on C^-alkyyli, orgaanisen liuottimen ja emäksen läsnäollessa 0 °C:n ja refluksointilämpötilan välillä ole-j . 25 vassa lämpötilassa, kaavan IA mukaisen yhdisteen saarni- • · i seksi, jossa Q1 ja n ovat edellä määritellyt, R3, R4 ja R5 ovat vetyjä, R on C-^-alkyyli ja 30 R2 on nitro, tai (B) vaiheen (A) tuote saatetaan reagoimaan hydra-usaineen, kuten Pd/C:n ja vedyn, kanssa tavanomaisissa reaktio-olosuhteissa kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa

35 Q1 ja n ovat edellä määritellyt. 141 104898 R3, R4 ja R5 ovat vetyjä, R on C^-alkyyli ja R2 on amino, tai (C) vaiheen (B) tuote saatetaan reagoimaan de-es-5 teröintiaineen, kuten vahvan hapon, kanssa kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa Q1 ja n ovat edellä määritellyt, R3, R4 ja Rs ovat vetyjä, R on vety ja 10 R2 on amino, tai (D) edellä määritelty kaavan VA mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan optisesti aktiivisen a-bentseenisul-fonaatin kanssa, jolla on kaava R3

16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan IA mukaisena yhdisteenä käytetään a-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)-1,4,7,10- 15 tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappoa.

17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan IA mukaisena yhdisteenä käytetään a-(2-metoksi-5-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappoa tetra- 20 ammoniumsuolan muodossa.

18. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan IA mukaisena yhdisteenä käytetään a-(2-metoksi-5-isotiosyanaattofen-yyli) -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetra- ; ' 25 etikkahappoa tetra-ammoniumsuolan muodossa. • I

19. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-18 mukai nen menetelmä, tunnettu siitä, että metalli-ioni on 153Sm, 166Ho, 90Y, 149Pm, 159Gd, 140La, 177Lu, 175Yb, 47Sc tai 142Pr.

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että metalli-ioni on 153Sm, 177Lu tai 90 y

21. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan IA 35 mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan metalli-ionin kanssa kuumentamalla reaktioseosta. 147 104898