FI104883B - Menetelmä valmistaa Epstein-Barr-viruksen BCRF1-proteiinia ja rekombinantti-ekspressiovektori - Google Patents

Description

104883

Menetelmä valmistaa Epstein-Barr-viruksen BCRF1-proteiinia ja rekömbinantti-ekspressiovektori 5 Keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa Epstein-Barr-viruksen BCRF1 -proteiinia ja rekombinantti-ekspressiovektori seä menetelmä valmistaa seoksia, joilla hoidetaan liialliseen γ-interferonin (γ-IFN) tuottoon liittyviä tauteja.

Immuunijärjestelmä muodostuu kudosten, solutyyppien ja liukoisten tekijöiden 10 erittäin vuorovaikutteisesta kompleksista. Äskettäin on ehdotettu, että useat taudit ja immuunitaudit voivat liittyä immuunijärjestelmän tiettyjen komponenttien välisiin tasapainoihin, erityisesti sytokiinien tasapainoihin: esim. Mors-mann et ai., Ann. Rev. Immunol., Voi. 7, s. 145-173 (1989); Cher et ai., X Immunol.. Voi. 138, s. 3688-3694 (1987); Mosmann et ai., Immunol. Today.

15 Voi. 8, s. 223-227 (1987); ja Heinzel et ai., J. Exd. Med.. Voi. 169, s. 59-72 (1989).

Runsas todistusaineisto viittaa esimerkiksi siihen, että liiallinen gamma-interferonin (γ-IFN) tuotto on syynä suureen histokompatibiliteettikompleksiin 20 (MHC) liittyviin autoimmuunisairauksiin: Hooks et ai., New England J. Med..

• · · « % ';··’ Voi. 301, s. 5-8 (1979) (kohonneet seerumin γ-IFN-tasot kolleroivat autoimmu- « « ; " niteetin kanssa); Bashman et ai., J. Immunol.. Voi. 130, s. 1492-1494 (1983) • « \ " (γ-IFN voi lisätä MHC-geenituotteen ekspressiota); Battazzo et ai., Lancet.

• < · *; s. 1115-1119 (11/12/83) (poikkeava MHC-geenituotteen ekspressio korreloi • · · 25 eräiden autoimmuniteettimuotojen kanssa); Hooks et ai., Ann. N.Y. Acad. Sei..

• · « * * Voi. 301, s. 21-32 (1980) (korkeammat γ-IFN-tasot koreloivat taudin suurem- ... paan vakavuuteen SLE-potilailla, ja interferonin histamiinin vapautumista lisää- • · · vä aktiivisuus voidaan estää anti-interferoniseerumeilla); Jacob et ai., J. Exp.

• · I

Med.. Voi. 166, s. 798-803 (1987) (sairaustilojen lievittäminen ja käynnistymi- • « « * ’; 30 sen viivästyminen punahukan (SLE) hiirimalleissa blokkaamalla anti-Y-IFN mo-

’ noklonaaliset vasta-aineet); ja Iwatani et ai., J. Clin. Endocrin, and MetaboL

! Voi. 63, s. 695-708 (1986) (anti-Y-IFN monoklonaalinen vasta-aine poisti leu- koagglutiniinilla stimuloitujen T-solujen kyvyn indusoida HLA-DR:n ekspres- 2 104883 siota). On esitetty hypoteesi, että ylimääräinen γ-interferoni aiheuttaa MHC-geenituotteiden epäasianmukaisen ekspressoitumisen, mikä vuorostaan aiheuttaa autoimmuunireaktioita niitä kudoksia vastaan, joiden solut ekspressoivat MHC-tuotteet epäasianmukaisesti ja joilla on autoantigeenejä tuotteisiin liitty-5 en. Siten McDevit, [Clin. Res.. Voi. 34, s. 163-175 (1985)] on ehdottanut, että y-IFN-tasojen alentamisella autoimmuunipotilailla, esimerkiksi antamalla y-IFN-antagonisteja, saattaisi olla edullisia vaikutuksia.

Edellä mainittujen todisteiden lisäksi γ-interferonilla voi myös olla osuus aller-10 giassa sen kyetessä lisäämään Fcs-reseptoreiden määrää ja tiheyttä monosyy-teillä; se on implikoitu sarkoidoosin ja psoriasiksen patogeneesissa; ja sen uskotaan lisäävän solujen välittämää immuniteettiä, millä on tärkeä osuus kudoksen hyljinnässä allogeenisissa siirrostepotilaissa.

15 y-IFN-tasoja alentamaan kykenevien yhdisteiden saatavuus olisi edellä olevassa valossa erittäin edullista hoidettaessa tauteja, jotka liittyvät epäasianmukaisiin immuunireaktioihin, kuten eräitä parasiittitauteja, allergiaa ja MHC:an liittyviä imuunitauteja, mukaanlukien seuraavat: reumaattinen artriitti, systeeminen lupus erythematosus (SLE), myasthenia gravis, insuliinista riippuva diabe-20 tes mellitus, tyroidiitti ja vastaavat.

• · • · “ Keksinnön kohteena olevalle menetelmälle on tunnusomaista se, että; ·’. '* muodostetaan vektori, joka sisältää BCFS1-proteiinia koodaavan nukleotidi- • · · *; *j sekvenssin, joka nukleotidisekvenssi kykenee ekspressoitumaan isännällä, • · · 25 joka sisältää vektorin ja joka nukleotidisekvenssi on valittu ryhmästä, joka • * « koodaa BCRF1-proteiineja; yhdistetään vektori isäntään; ja • ♦ · pidetään isäntä viljelyalustalla olosuhteissa, jotka ovat sopivia nukleotidisek- • · · venssin ekspressoimiseen BCRF1-proteiiniin.

• « « ' 30 * * « I · . ' Keksintö käsittää edelleen rekombinantti-BCRF1 :n tuottamiseen tarkoitetut •« · : ekspressointivektorit, puhdistetun BCRF1:n ja farmaseuttiset seokset, joita menetelmässä käytetään. Keksinnössä käytetty BCRF1 on mieluummin valittu 3 104883 valmiiden polypeptidien joukosta, joilla on SEQ ID NO: 1 :ssa esitetyn aminohapposekvenssin määrittelemä avoin lukukehys, jolloin lyhennykset viittaavat aminohappojen L-muotoihin, ja aminohapot on luetteloitu N-päästä alkaen.

5 Piirustuksissa:

Kuvio 1 esittää kaaviollisesti BCRF1 :n tuottamisessa hyödyllistä nisäkkään ekspressointivektoria.

10 Kuvio 2 esittää kaaviollisesti BCRF1 :n tuotossa hyödyllistä bakteerin ekspressointivektoria.

Keksintö perustuu osittain siihen havaintoon, että nukleiinihapposekvenssillä, joka koodaa äskettäin löydettyä proteiinia, josta käytetään nimitystä sytokiini-15 synteesin inhibitiotekijä (CSIF), on erittäin suuri homologia EBV BCRF1 :n avoimen lukukehyksen kanssa. EBV on kaikissa ihmispopulaatioissa endeeminen ihmisen herpes-virus ja se on yhdistetty moniin sairauksiin: esim. Dillner et ai., Adv. Cancer Res,. Voi. 50, s. 95-158 (1988); Thorley-Lawson, Biochim. Biophvs. Acta. Voi. 948, s. 263-286 (1988); ja Tasato, Adv, Cancer Rs.. Voi.

20 49, s. 75-125 (1987). EBV.lla on kaksisäikeinen noin 172 kiloemäksen pituinen * 4 DNA-genomi [Baer et ai., Nature. Voi. 310, s. 207-211 (1984)]. Genomi sisäl- 4 « " tää monia avoimia lukukehyksiä, jotka ilmeisesti vastaavat EBV:n tuottamia 4 4 ·. " proteiinia, joista yksi on BCRF1.

• · · • · · • · • · • · · • ·« 25 Keksintö käsittää valmiit polypeptidit tai proteiinit, joilla on BCRF1 :n avoin • · · lukukehys. Erittyvillä proteiineilla avoin lukukehys tavallisesti koodaa polypep- ..... tidiä, joka muodostuu valmiista tai erittyneestä tuotteesta, joka on kovalentti- • · · sesti kytketty N-päässään signaalipeptidiin. Signaalipeptidi lohkaistaan ennen • · · valmiin tai aktiivisen polypeptidin erittymistä. Lohkaisukohta voidaan ennustaa * · · '· 30 suurella tarkkuudella kokeellisista säännöistä [esim. von Heijne, Nucleic Acids

Research, Voi. 14, s. 4683-4690 (1986)], eikä signaalipeptidin tarkka amino- 4 4 | i happokoostumus näytä olevan kriittinen sen toiminnalle [esim. Randall et ai.,

Science. Voi. 243, s. 1156-1159(1989); Kaiser et ai., Science. Voi. 235, s.

4 104883 312-317 (1987)]. Valmiita proteiineja ekspressoivat siten helposti vektorit, jotka koodaavat signaalipeptidejä, jotka ovat täysin erilaisia kuin kaavan I määrittelemän avoimen lukukehyksen koodaamat peptidit.

5 Keksinnön mukaisten proteiinien tuottamiseen voidaan käyttää hyvin erilaisia ekspressointisysteemejä, (so. isännän ja ekspressointivektorin yhdistelmiä). Mahdollisiin isäntäsolutyyppeihin kuuluvat, näihin kuitenkaan rajoittumatta, bakteeri-, hiiva-, hyönteis- ja nisäkässolut ja vastaavat. Saatavissa on monia yleiskatsauksia, jotka neuvovat spesifisten ekspressointisysteemien valintaa 10 ja/tai modifiointia: esim. (muutama mainitaksemme), de Boerja Shepard, "Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli", s. 205-247, kirjassa Kroon, toim. Genes: Structure and Expression (John Wiley & Sons, New York, 1983), yleiskatsaus useista E.coli-ekspressointisysteemeistä; Kucherlapati ete al., Critical Reviews in Biochemistry. Vol. 16, Issue 4, s.

15 349-379 (1984), ja Banerji et al., Genetic Engineering. Vol. 5, s. 19-31 (1983) yleiskatsaus nisäkässolujen transfektointi- ja transformointimenetelmistä; Reznikoff ja Gold, toim., Maximizing Gene Expression (Butterworths, Boston, 1986) yleiskatsaus valituista aiheista, jotka koskevat geenien ekspressointia E. coli-, hiiva-ja nisäkässoluissa; ja Thilly Mammalian Cell Technlogy (Butter-,,, 20 worths, Boston, 1986); yleiskatsaus nisäkäsekspressointisysteemeistä. Samoin

4 I

.; · ·' on saatavissa monia yleiskatsauksia, jotka kuvaavat tekniikoita ja olosuhteita, ' joilla yhdistetään ja/tai manipuloidaan spesifisiä cDNA-lajeja ja ekspressoinnin • · * · · \ . kontrollointisekvenssiä niin, että saadaan ja/tai modifioidaan esillä olevassa • · · | keksinnössä käytettäväksi sopivia ekspressointivektoreita, esim. Sambrook et • · ♦ * 25 al., Molecular cloning: A Laboratory Manua, 2. painos (Cold Spring Harbor

Laboratory, N.Y., 1989).

• · · • · · • ♦ ·

Eräs E. coli'n ekspressointisysteemi on esitetty US-patentissa 4,431,739 • · · 9 .· . (Riggs), joka on mainittu tässä yhteydessä viitteenä. Erityisen hyödyllisiä pro- • · · ' ; 30 moottoreita E. coli'ssa tapahtuvaan tehokkaaseen ekspressointiin ovat tac- promoottori, joka on esitetty US-patentissa 4,551,433 (de Boer), joka on mai- ·' ·’ nittu tässä yhteydessä viitteenä, ja pL-promoottori, jonka on esittänyt Reumaut • * · '··' et al., Gene. Voi. 15, s. 81-93 (1981), joka on mainittu tässä yhteydessä viittee- 6 104883 nä. E. coli-isännille on saatavissa myös erityisekspressointivektoreita. Erityisen hyödyllisiä ovat Ghrayeb'in et ai., EMBO J.. Voi. 3, s. 2437-2442 (1984), julkaisemat pIN-lll-ompA-vektorit, joissa transkriptoitava cDNA on fuusioitu E. coli'n ompA-geenin osaan, joka koodaa ompA-proteiinin signaalipeptidiä, joka vuo-5 rostaan saa valmiin proteiinin erittymään bakteerin periplasmiseen tilaan. Erillisekspressointivektoreita on annettu prokaryooteille myös US-patenteissa 4,336,336, 4,411,994, 4,332,892 ja 4,338,397. Nämä julkaisut on siten mainittu tässä yhteydessä viitteenä. Lukuisat bakteerikannat sopivat prokaryoottisten ekspessointivektoreiden isänniksi, mukaanlukien E. coli-kannat, kuten W3110 10 (ATCC n:o 27325), JA221, C600, ED767, DH1, LE392, HB101, X1776 (ATCC n:o 31244), X2282, RR1 (ATCC n:o 31343) MRCI; Bacillus subtilis-kannat ja muut entrobakteerit, kuten Salmonella Typhimurium tai Serratia marcescens ja erilaiset Pseudomonas-lajit. Curtis III on US-patentissa 4,190,495 antanut yleismenetelmiä tällaisten bakteerikantojen, kuten E. coli K12 X1776 saami-15 seen, jotka ovat hyödyllisiä eukaroyyttisten proteiinien ekspressoinnissa. Tämä patentti on siten mainittu tässä yhteydessä viitteenä. Prokaryoottisten ja euka-ryoottisten mikro-organismien lisäksi keksinnön mukaisten proteiinien tuottamiseen voidaan käyttää myös ekspressointisysteemejä, joissa on monisoluisen organismin soluja. Erityisen mielenkiintoisia ovat nisäkäsekspressointisystee-20 mit, koska niiden translaation jälkeinen prosessointikoneisto tuottaa todennä-

I I

köisemmin biologisesti aktiivisia nisäkäsproteiineja.

« ·

• · I

« « *. " Useita DNA-tuumoriviruksia on käytetty vektoreina nisäkäsisännille. Erityisen • · · .* *j tärkeitä ovat lukuisat vektorit, jotka käsittävät SV40:n replikaation, transkription • Il 25 ja/tai translaation kontrollisekvenssit kytkettynä bakteereiden replikaation • · · kontrollisekvensseihin, esim. Okayama'n ja Berg'in, Mol. Cell. Biol., voi. 2, s. 161-170 (1982) ja Mol. Cell. Biol.. Voi. 3, s. 280-289 (1983), kehittämät pcD- * · · vektorit, joita Takebe et ai., Mol. Cell. Biol.. Voi. 8, s. 466-472 (1988), ovat

I I I

,· . kehittäneet. Nämä viitteet on siten mainittu tässä yhteydessä viitteenä. Muihin « I « ‘ 30 SV40-pohjaisiin nisäkäsekspressointivektoreihin kuuluvat ne, jotka sisältävät . ’ adenoviruksen säätelyelementtejä ja jotka on julkaissut Kaufman ja Sharp, • « · ·' Mol. Cell. Biol.. Voi. 2, s. 1304-1319 (1982), ja Clark et ai. US-patentissa

I M

'···* 4,675,285, jotka kummatkin on tässä yhteydessä mainittu viitteenä. Tavallisesti 6 104883 apinasoluja pidetään parhaina isäntinä edellä mainittuihin vektoreihih. tällaiset vektorit, jotka sisältävät SV40-ori-sekvenssit ja ehjän A-geenin, voivat replikoitua autonomisesti apinasoluissa (jolloin saadaan suurempi kopiomäärä ja/tai pysyvämpiä kopionumeroita kuin ei-autonomisesti replikoituvilla plasmideilla).

5 Lisäksi vektorit, jotka sisältävät SV40-ori-sekvenssit ilman ehjää A-geeniä, voivat replikoitua autonomisesti korkeiksi kopiomääriksi (mutta ei stabiileiksi) COS7-apinasoluissa. Näitä vektoreita on kuvannut Gluzman, Cell.. Voi. 23, s. 175-182 (1981) ja niitä on saatavissa ATCC:sta (tallennusnumero CRL 1651). Nämä SV40-pohjaiset vektorit kykenevät myös transformoimaan muita isäntä-10 soluja, kuten hiiren L-soluja, kun ne integroidaan isäntäsolun DNA:an.

Keksinnön mukaisten BCRF1-proteiinien biologinen aktiivisuus voidaan helposti määrittää γ-interferonin inhibitiomenetelmissä. Nämä määritykset edellyttävät solulinjaa tai solupopulaatiota, jotka syntetisoi γ-interferonia. tällaisena 15 solupopulaationa voidaan tarkoituksenmukaisesti käyttää periferiaveren lymfosyyttejä (PBL-soluja), joita on stimuloitu mytogeenillä, kuten fytohemaggluti-niinila (PHA). Karkeasti sanoen menetelmä toimii seuraavasti. PHA:lla stimuloidut PBL-solut jaetaan kahteen yhtä suureen osaan. Toiseen osaan lisätään BCRF1:a sisältävää näytettä. Toinen osa toimii kontrollina. Usean päivän 20 kuluttua testataan kummankin viljelmän supernatanteista γ-IFN. Tämä tehdään • ( tarkoituksenmukaisesti normaalilla ELISA-menetelmällä käyttämällä kaupal- ’* lisesti saatavissa olevia monoklonaalisia ja polyklonaalisia vasta-aineita i Y-IFN:lle, esim. Genzyme, Inc. (Boston, MA). Menetelmän tulos voi vaihtoehto!- • · · • · · .* sesti olla transkriptoitu γ-IFN mRNA-määrä, joka mitataan esimerkiksi RNA- * · · /../ 25 blottauksella, PCR:lla tai vastaavalla metodologialla. PBL-solut saadaan · · standarditekniikoilla, esim. Mishell et ai., toim., Selected Methods in Cellular Immumology (Freeman, New York, 1980).

• · · ·* · • · · • · · .· . Kun esillä olevan keksinnön mukaiset polypeptidit ekspressoidaan liukoisessa « · « ‘ ; 30 muodossa, esimerkiksi transformoitujen hiiva-tai nisäkässolujen erittyneinä . tuotteina, ne voidaan puhdistaa alan standardimenetelmillä, mukaan lukien vaiheissa, joissa seostetaan ammoniumsulfaatilla, suodatetaan ioninvaihtokro- • < · ' · * matografia, geelisuodatetaan, suodatetaan elektroforeesi, affiniteettikromato- 7 104883 grafialla ja/tai vastaavasti; esim. Enzyme Purification and Related Techniques, Methods in Enzvmoloav. 22:233-577 (1977), ja Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, New York, 1982) antavat neuvoja tällaisiin puhdistuksiin. Samoin kun keksinnön mukaiset polypeptidit ekspres-5 soidaan liukoisessa muodossa, esimerkiksi aggregaatteina, inkluusiokappalei-na tai vastaavina, ne voidaan puhdistaa alan standardimenetelmillä, mukaan lukien erottamalla inkluusiokappaleet hajotetuista isäntäsoluista sentrifugoi-malla, liuentamalla inkluusiokappaleet kaotrooppisilla aineilla ja pelkistimillä, laimentamalla liuennettu seos ja alentamalla kaotrooppisen ja pelkistävän 10 aineen konsentraatiota niin, että polypeptidi ottaa biologisen ja aktiivisen komformaation. Nämä viimeiset menetelmät on esitetty seuraavissa viitteissä, jotka on mainittu tässä yhteydessä viitteenä: Winkler et ai., biochemistry. 25: 4041-405 (1986); Winkler et ai., Biotehnoloov. 3: 992-998 (1985); Koths et ai., US-patentti 4,569,790; ja eurooppalaiset patenttihakemukset 86306917.5 ja 15 86306353.3.

'Tehokas määrä" tarkoittaa tässä yhteydessä käytettynä määrää, joka riittää lievittämään liiallisen γ-interferonin välittämän tautitilan oiretta. Jollekin tietylle potilaalle tehokas määrä voi vaihdella riippuen sellaisista tekijöistä kuin hoidet- ... 20 tavan taudin tila, potilaan kokonaisterveys, antamismenetelmä, sivuvaikutusten • · .’:··* vakavuus ja vastaavat seikat. Yleisesti sanoen BCRF1 annetaan farmaseutti- « · sena seoksena, joka sisältää tehokkaan määrän BCRF1 :a ja farmaseuttista « · . kantajaa tai apuainetta. Farmaseuttinen kantaja voi olla mikä tahansa yhteen- • · · S' | sopiva, toksiton aine, joka sopii keksinnön mukaisten aineiden antamiseen • ·· .*./ 25 potilaalle. Tällaisten lääkeaineiden parenteraaliseen antamiseen hyödylliset • · · seokset ovat yleisesti tunnettuja, esiemrkiksi Remington's Pharmaceutical Science, 15. painos (Mack Publishing Company, Easton, PA1980). Keksinnön • · · .·*:·. mukaiset seokset voidaan vaihtoehtoisesti viedä potilaan kehoon siirrostetta- ♦ · · .· . van lääkkeen antojärjestelmän avulla: esim. Urquhart et ai., Ann. Rev. Pharma- • · · ' \ 30 col. Toxicol.. Voi. 24, s. 199-236 (1984); Lewis, toim. Controlled Release of . Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum Press, New York, 1981); US-patentti 4 t * • ·** 3,773,919; US-patentti 3,270,960; ja vastaavat.

• · « « • 4 · β 104883

Kun BCRF1 annetaan parenteraalisesti, se formuloidaan injisoitavaan yksikkö-annostusmuotoon (esim. liuos, suspensio tai emulsio) yhdessä farmaseuttisen kantajan kanssa. Tällaiset kantajat ovat luonnostaan toksittomia ja ei-terapeut-tisia. Esiemrkkejä tällaisista kantajista ovat normaali suolaliuos, Ringer'in liuos, 5 dekstroosiliuos ja Hank'in liuos. Myös vedettömiä kantajia, kuten kasviöljyjä ja etyylioleaattia, voidaan käyttää. Eräs hyvänä pidetty kantaja on 5 % dekstroo-si/suolaliuos. Kantaja voi sisältää pienehköjä määriä lisäaineita, kuten aineita, jotka parantavat isotoonisuutta ja kemiallista pysyvyyttä, esimerkiksi puskureita ja säilytysaineita. BCRF1 formuloidaan mieluummin puhdistetussa muodossa, 10 joka ei oleellisesti sisällä aggregaatteja ja muita proteiineja, konsentraatiovälil-lä noin 5 - 20 pg/ml. BCRF1 annetaan mieluummin jatkuvana infuusiona niin, että päivää kohti annettu määrä on noin 50 - 800 pg (so. noin 1-16 pg/kg/päivä). Päivittäistä infuusiomäärää voidaan vaihdella seurattujen sivuvaikutusten, veren solumäärien ja vastaavien perusteella.

15

ESIMERKIT

Esimerkki 1. BCRF1:n ekspressointi COS 7 aoinasoluissa 20 BCRF1 :n avointa lukukehästä koodaava geeni omistettiin polymeraasiketju-

I I

'; · * ’ reaktion avulla käyttämällä alukkeita, jotka mahdollistavat monistetun fragmen- « « ” tin myöhemmän insertoinnin EcoRI:lla pilkottuun pcD(SRa)-vektoriin (kuvio 1).

« · *. *.* Insertoidun fragmentin koodaava säie on esitetty SEQ ID N0.2:ssa.

• ♦ · ♦ · · • · * · • · · • · · s*/ 25 Kloonit, joissa insertti oli oikeassa orientaatiossa, tunnistettiin BCRF1 :n ja/tai • · · restriktiopilkkeiden elektroforeettisen kuvion avulla. Eräälle tällaiselle vektoril-le, jossa oli BCRF1-geeni, annettiin nimeksi pBCRFI(SRa) ja tämä tallennet- • · · tiin ATCC-kokoelmaan tallennusnumerolla 68193. pBCRFI (SRa) monistettiin • · · E. coli MC 1061 :ssa, eristettiin standarditekniikoilla ja käytettiin COS 7-apina- • · 30 solujen transfektoimiseen seuraavasti: Yksi päivä ennen transfektointia siirros-tettiin noin 1,5 x 106 COS 7-apinasolua yksittäisille 100 mm maljoille Dulbec- * · « : ' ·: co'n modifioidussa Eagle'n alustassa (DME), joka sisälsi 5 % vasikansikiösee- * « '···* rumia (FCS) ja 2 mM glutamiinia. COS 7-solut siirrettiin transfektoinnin suorit- 104883 g tamista varten maljoilta inkuboimalla trypsiinin kanssa, pestiin kaksi kertaa seerumittomassa DME:ssa ja suspendoitiin seerumittomaan DME-alustaan 107 solua/ml. 0,75 ml erä sekoitettiin 20 pg kanssa DNA:ta ja siirrettiin steriiliin 0,4 cm elektroporaatio kyvettiin. 10-minuutin kuluttua soluja pulssitettiin Bio-5 Rad Gene Pulser-yksikössä 200 voltin jännitteellä ja 960 pF kapasitenssilla.

10 minuutin kuluttua solut poistettiin kyvetistä ja lisättiin 20 ml.aan DME-alus-taa, joka sisälsi 5 % vasikansikiöseerumia, 2 mM glutamiinia, penisilliiniä, streptomysiiniä ja gentamysiiniä. Seos jaettiin neljälle 100 mm kudosviljelymal-jalle. Seos pidettiin 12-24 tuntia 37°C:ssa, 5 % Co2:ssa, minkä jälkeen alusta 10 korvattiin samanlaisella alustalla, joka sisälsi vain 1 % vasikansikiöseerumia, ja inkubointia jatkettiin vielä 72 tuntia 37°C:ssa ja 5 % C02:ssa, minkä jälkeen alusta otettiin talteen ja siitä määritettiin sen kyky inhiboida y-interferonin synteesiä.

15 10 ml eriä juuri eristettyjä PBL-soluja (noin 2 x 106 solua/ml) inkuboitiin 37°C:ssa PHA:n kanssa (100 ng/ml) alustassa, joka sisälsi (i) 90 % DME-alus- taa, joka oli täydennetty 5 %:lla vasikansikiöseerumia ja 2 mM glutamiinilla, ja (ii) 10 % supernatanttia COS 7-soluista, jotka oli jo transfektoitu pBCRF1(SRa):lla. 24 tunnin kuluttua solut ja supematantit otettiin talteen ja 20 määritettiin niistä vastaavasti γ-IFN mRNA:n tai γ-IFN-proteiinin mukanaolo.

Kontrollit käsiteltiin samalla tavoin paitsi, että 10 % supernatanttia oli COS

: 7-viljelmistä, jotka oli ennalta transfektoitu plasmidilla, jossa oli asiaanliittymä- tön cDNA-insertti. BCRF1 :lla käsitellyt näytteet estivät noin 50-prosenttisesti ♦!*·! γ-interferonin synteesin kontrolleihin verrattuna.

Vl 25 • · · : Esimerkki 2. BCRF1:n ekspressointi Echerichia coli'ssa • · · : Geeni, joka koodaa valmista BCRF1-proteiinia, jolla on SEQ ID NO. 3:ssa • · · : annettu sekvenssi, voidaan ekspressoida E.coli'ssa: 30 •:1 · i pBCRFI (SRa):n cDNA-insertti kloonataan uudelleen M13-plasmidiin, jossa se : v. muutetaan kahdesti paikkamutageneesilla: ensin muodostetaan Cla1-kohta • « .*··. valmista BCRF1-polypeptidiä koodaavan alueen 5-päähän. Toisessa muta- «« » 10 104883 geenissä muodostetaan BamHI-kohta valmista BCRF1-polypeptidiä koodaa-van alueen 3-päähän. Sen jälkeen mutatoitu sekvenssi voidaan helposti inser-toida jäljempänä kuvattuun TRPC11-ekspressointivektoriin.

5 TRPC11 -vektori rakennettiin ligatoimalla synteettisen RBS-consensusfrag- mentti Clal-linkkereihin (ATGCAT) ja kloonaamalla saadut fragmentit Clal1:lla käsiteltyyn pMT11hc-plasmidiin, (joka oli ennalta modifioitu niin, että se sisälsi Cla1 -kohdan). pMT11hc on pBR322:n pieni (2,3 kiloemästä) suurikopioinen, AMPr, TETs-johdos, jossa on nVX-plasmidin EcoRI-Hindlll-polylinkkerialue.

10 (nVX:n on kuvannut Maniatis et ai., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Tämä modifioitiin sisältämään Clal-kohta käsittelemällä pMT11hc EcoRlilla ja BamHlilla, täyttämällä saadut tarttuvat 5-päät ja ligatoimalla Clal-linkkerillä (CATCGATG), mikä palautti EcoRI-ja BamHI-kohdat ja korvasi Smal-kohdan Clal-kohdalla. Yhdellä TRPC11-raken-15 teestä saadulla transformantilla oli Call-kohtien ympäröimä RBS-tandemsek-venssi. Toinen Clal-kohdista ja osa RBS-sekvenssin toisesta kopiosta poistettiin pilkkomalla tämä plasmidi Pstlilla, käsittelemällä Bal31-nukleaasilla, pilkkomalla EcoRlilla ja käsittelemällä T4 DNA-polymeraasilla kaikkien neljän deok-sinukleotiditrifosfaatin läsnäollessa. Saadut 30 - 40 bp fragmentit otettiin tal-20 teen PAGE:lla ja kloonattiin Smal:lla pilkottuun plasmidiin pUC12. pKC101:sta saatu (kuvannut Nichols et ai. kirjassa Methods in Enzvmoloav. Voi. 101, s.

155 (Academic Press, N.Y. 1983)) 248 bp E. coli trpPin sisältävä EcoRI-frag-mentti kloonattiin tämän jälkeen EcoRI-kohtaan. Valmiste TRPC11-konstruktio on esitetty kuviossa 2. BCRF1 :n vektorina käytetään TRPC11 :a pilkkomalla se V·: 25 ensin Clalilla ja BamHlilla, puhdistamalla se ja sen jälkeen sekoittamalla se • I· : standardiligatointiliuokseen yhdessä M13:n, jossa on valmista BCRF1-proteii nia koodaava nukleotidisekvenssi, Clal-BamHI-fragmentin kanssa. Inserin • · · : sisältävä TRPC11, josta käytetään nimitystä TRPC11-BCRF1, kasvatetaan • · · : E. coli K12-kannassa JM101, joka on saatavissa esimerkiksi ATCCista tallen- 30 nusnumerolla 33876.

Keksinnön hakijat ovat tallentaneet E. coli MC1061:n, jossa on pBCRFI(SRa), .···. American Type Culture Collection-kokoelmaan, Rockville, MD, USA (ATCC), „ 104883 tallennusnumerolla 68193. Tämä tallennus tehtiin 20.12.1989 ATCC:n Culture Deposit for Patent Purposes-sopimuksen mukaisesti, mikä varmistaa, että tallennus on USA:n Patenttikomissaarin käytettävissä (US Commissioner of Patent and Trademarks) 35 USC 122:n ja 37 CFR 1.14:n mukaisesti ja tulee 5 yleisön saataville US-patentin myöntämisen jälkeen, mikä edellyttää tallennuksen ylläpitämistä. Tallennetun kannan saatavuutta ei tule pitää lisenssinä keksinnön hyödyntämiselle vastoin oikeuksia, jotka on myönnetty minkä tahansa viranomaisen toimesta patenttilakien mukaisesti.

10 Tallennusta on muutettu niin, että se vastaa mikro-organismien tallentamista koskevan Budapestin sopimuksen vaatimuksia.

Edellä olevien keksinnön suoritusmuotojen kuvaukset on tehty keksinnön havainnollistamiseksi ja kuvaamiseksi. Niitä ei tule pitää täydellisinä eikä kek- 15 sintöä juuri esitettyihin muotoihin rajoittavina, vaan edellä olevan kuvauksen valossa on mahdollista tehdä monia modifikaatioita ja muunnelmia.

Suoritusmuotojen valinnan ja kuvauksen tarkoituksena on ollut parhaimmalla tavalla kuvata keksinnön periaatteita ja näin tehdä mahdolliseksi muille alan ammattimiehille keksinnön hyödyntäminen eri suoritusmuodoissa ja erilaisin 20 muunnelmin, jotka sopivat kuhunkin aiottuun käyttöön. Keksinnön alan määrit- : ’ ‘ ]: televät keksintöön liitetyt patenttivaatimukset.

• 1 • · • 1 · • · • · · • · · • · • · « • · · • · * · · • · · • · · • · · • · · • · · • · » • · · • · · · * · 12 104883

SEKVENSSILUETTELO

SEQ ID NO: 1 SEKVENSSITYYPPI: Aminohappo 5 SEKVENSSIN PITUUS: 170 aminohapporyhmää SÄIKEISYYS: yksisäikeinen TOPOLOGIA: lineaarinen MOLEKYYLITYYPPI: proteiini/polypeptidi ALKUPERÄINEN ORGANISMIN LÄHDE: Epstein'in ja Barbin virus 10 OMINAISUUDET: BCRF-1

Met Glu Arg Arg Leu Vai Vai Thr Leu Gin Cys Leu Vai Leu Leu 5 10 15

Tyr Leu Ala Pro Glu Cys Gly Gly Thr Asp Gin Cys Asp Asn Phe 15 20 25 30

Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Vai Lys 35 40 45

Thr Phr Phe Gin Thr Lys Asp Glu Vai Asp Asn Leu Leu Leu Lys 50 55 60 20 Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala 65 70 75

Leu Ser Glu Met Ile Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Vai Met Pro Gin 80 85 90

Ala Glu Asn Gin Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Vai Asn Ser Leu 25 95 100 105

Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His .·:·*. 110 115 120 • · *

Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Vai Glu Gin Ile 125 130 135 • · · 20 Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala ·! ' 140 145 150

Met Ser Gly Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met :··: 155 160 165

Thr Ile Lys Ala Arg 35 170 13 104883 SEQ ID NO: 2 SEKVENSSITYYPPI: Nukleotidi SEKVENSSIN PITUUS: 498 emästä SÄIKEISYYS: yksisäikeinen 5 TOPOLOGIA: lineaarinen MOLEKYYLITYYPPI: DNA-sekvenssi ALKUPERÄINEN ORGANISMIN LÄHDE: Epstein'in ja Barr'in virus OMINAISUUDET: BCRF-1 10 AATTC ATG GAG CGA AGG TTA GTG GTC ACT CTG CAG TGC CTG GTG CTG 47 CTT TAC CTG GCA CCT GAG TGT GGA GGT ACA GAC CAA TGT GAC AAT 92 TTT CCC CAG ACC TAA GAG ATG CCT TCA TGC GTG TTA AAA CCT TTT 137 TCC AGA CAA AGG ACG AGG TAG ΑΤΑ ACC TTT TGC TCA AGG AGT CTC 182 TGC TAG AGG ACT TTA AGG ATG CCA GGC CCT GTC AGA AAT GAT CCA 227 15 ATT CT A CCT GGA GGA AGT CAT GCC ACA GGC TGA AAC CAG CAG CCT 272 GAA GCC AAA GAC CAT GTC AAT TCT TTG GGT GAA AAT CTA AAG ACC 317 CT A CGG CTC CGC CTG CGC AGG TGC CAC AGG TTC CTG CCG TGT GAG 362 ACC AAG AGT AAA GCT GTG GAA CAG ATA AAA AAT GCC TTT AAC AAG 407 CTG CAG GAA AAA GGA ATT TAC AAA GCC ATG AGT GAA TTT GAC ATT 452 20 TTT ATT AAC TAC ATA GAA GCA TAC ATG ACA AAT AAA GCC AGG TGA G 498 i i • t « · · » «« • · • · · • ·· • · • · ♦ · ♦ • ·« • · • · ψ • · · • · · • · · • · ♦ • · « ··· « « « • · · « « « «

< I

I · I · t · 14 104883 SEQ ID NO: 3 SEKVENSSITYYPPI: Aminohappo SEKVENSSIN PITUUS: 147 aminohapporyhmää SÄIKEISYYS: yksisäikeinen 5 TOPOLOGIA: lineaarinen MOLEKYYLITYYPPI: proteiini/polypeptidi ALKUPERÄINEN ORGANISMIN LÄHDE: Epstein'in ja Barbin virus OMINAISUUDET: BCRF-1 10 The Asp Gin Cys Asp Asn Phe Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg 5 10 15

Asp Ala Phe Ser Arg Vai Lys Thr Phe Phe Gin Thr Lys Asp Glu 20 25 30

Vai Asp Asn Leu Leu Ley Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys 15 35 40 45

Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala Leu Ser Glu Met Ile Gin Phe Tyr 50 55 60

Leu Glu Glu Vai Mer Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asn Pro Glu Ala 65 70 75 20 Lys Asp His Vai Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg 80 85 90

Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys ::l‘ 95 100 105 !. Ser Lys Ala Vai Glu Gin Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin *./! 25 110 115 120 *. ; Glu Lys Glu Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile *:./ 125 130 135 *·’ ’ Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg 140 145 • · · • « · • · · • · · • · · • · · • « · · · • 1 « · • · ·«

Claims (11)

104883

1. Menetelmä valmistaa Epstein-Barr-viruksen BCRF1 -proteiinia, joka kykenee estämään interferoni-yin synteesin, tunnettu siltä, että 5 muodostetaan vektori, joka sisältää BCFS1-proteiinia koodaavan nukleotidi-sekvenssin, joka nukleotidisekvenssi kykenee ekspressoitumaan isännällä, joka sisältää vektorin ja joka nukleotidisekvenssi on valittu ryhmästä, joka koodaa BCRF1 -proteiineja; yhdistetään vektori isäntään; ja 10 pidetään isäntä viljelyalustalla olosuhteissa, jotka ovat sopivia nukleotidisek-venssin ekspressoimiseen BCRF1-proteiiniin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistettu proteiini on määritelty SEQ ID NO. 3:ssa estetyllä aminohapposekvenssillä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleoti-disekvenssilla on DNA-sekvenssi, joka on esitetty SEQ ID NO. 2:ssa.

4. Rekombinantti-ekspressointivektori, joka kykenee ekspressoimaan Epstein-

20 Barr-viruksen BCRF1-proteiinin isännässä, tunnettu siitä, että Epstein-Barr- I I « viruksen BCRF1 -proteiini kykenee estämään γ-interferonin synteesin. : '·· 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen ekspressointivektori, tunnettu siitä, että • · • · · ’· BCRF1-proteiini on SEQ ID NO. 3:ssa esitetyn aminohapposekvenssin määrit- *· *: 25 telemä. • · · • · · • · t

6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen ekspressointivektori, tunnettu siitä, • · · että isäntä on nisäkäs. • · · • · · ' · *' 30 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen ekspressointivektori, tunnettu siitä, että se I < > M muodostuu pBCRFI (SRa).sta, joka on tallennettu American Type Collection-kokoelmaan, Rockville, MD, USA, tallennusnumerolla ATCC 68193. « « « 104883

8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen ekspressiontivektori, tunnettu siitä, että isäntä on bakteeri.

9. Menetelmä liiallisen γ-interferonin tuottoon liittyvän sairauden hoitamiseen 5 tarkoitetun farmaseuttisen seoksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että sekoitetaan Epstein-Barr-viiruksen BCRF1-proteiinia farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai apuaineen kanssa, joka BCRF1-proteiini kykenee estämään interferoni-y:n synteesin.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että BCRF1- proteiini on valittu ryhmästä kypsät proteiinit, joilla on SEQ ID NO. 1:ssä esitetyn aminohapposekvenssin määrittelemä avoin lukukehys.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kypsä 15 proteiini on määritelty SEQ ID NO. 3:ssa estetyllä aminohapposekvenssillä. » · · • · « · · ♦ · m • · • · • · · • · · • · • · · « · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · I 4 104883