FI104639B - Hepatiitti B:n S- ja PreS2 -proteiinien ilmentäminen metylotrooppisissa hiivoissa - Google Patents
Hepatiitti B:n S- ja PreS2 -proteiinien ilmentäminen metylotrooppisissa hiivoissa Download PDFInfo
- Publication number
- FI104639B FI104639B FI892312A FI892312A FI104639B FI 104639 B FI104639 B FI 104639B FI 892312 A FI892312 A FI 892312A FI 892312 A FI892312 A FI 892312A FI 104639 B FI104639 B FI 104639B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- gene
- pichia pastoris
- isolated
- dna
- aox1
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 134
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims description 30
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 title abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 60
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 26
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 93
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 84
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 80
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 74
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 33
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 29
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 29
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 27
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 25
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 19
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 claims description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- 101150005709 ARG4 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 7
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100004044 Vigna radiata var. radiata AUX22B gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 2
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 claims 9
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 claims 9
- 101710093617 Dihydroxyacetone synthase Proteins 0.000 claims 5
- PVFDPMYXCZLHKY-MLLWLMKGSA-M sodium [(1R,2R,4aR,8aS)-2-hydroxy-5-[(2E)-2-[(4S)-4-hydroxy-2-oxooxolan-3-ylidene]ethyl]-1,4a,6-trimethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl sulfate Chemical compound [Na+].C([C@@H]1[C@](C)(COS([O-])(=O)=O)[C@H](O)CC[C@]11C)CC(C)=C1C\C=C1/[C@H](O)COC1=O PVFDPMYXCZLHKY-MLLWLMKGSA-M 0.000 claims 4
- 101150066375 35 gene Proteins 0.000 claims 1
- 241000235342 Saccharomycetes Species 0.000 claims 1
- -1 p40 Proteins 0.000 claims 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 abstract description 17
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 abstract description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 33
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 32
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 17
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 17
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 17
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 11
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 11
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 10
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 8
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 8
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 8
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 4
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 4
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 229940081969 saccharomyces cerevisiae Drugs 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 4
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N Dihydroxyacetone Natural products OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 229940120503 dihydroxyacetone Drugs 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 101150085823 hsdR gene Proteins 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ARVQIYGIIOWVCP-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethyl dihydrogen phosphite Chemical compound OP(O)OCCC#N ARVQIYGIIOWVCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150055869 25 gene Proteins 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100035893 CD151 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101710118846 CD151 antigen Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010016275 Fear Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 1
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241001149669 Hanseniaspora Species 0.000 description 1
- 208000028523 Hereditary Complement Deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 101100351324 Homo sapiens PDPN gene Proteins 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100174763 Mus musculus Galk1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102100037265 Podoplanin Human genes 0.000 description 1
- 229920002562 Polyethylene Glycol 3350 Polymers 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 101000836384 Rattus norvegicus Serpin H1 Proteins 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241001105470 Valenzuela Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 101150012763 endA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 101150041954 galU gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 101150101299 gene 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 101150096208 gtaB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 description 1
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108010045897 polyalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229940050929 polyethylene glycol 3350 Drugs 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 101150072534 sbcB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 1
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 1
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
104639
Hepatiitti B:n S- ja PreSÄ -proteiinien ilmentäminen metylo-trofisissa hiivoissa 5 Tämä keksintö koskee yhdistelmä-DNA -teknologian aluetta. Yhdeltä näkökannalta tämä keksintö koskee menetelmää antigeenisten partikkelien tehostetuksi ilmentämiseksi, jotka sisältävät pääasiallisesti hepatiitti B.-n S-proteiinin ja preS=-proteiinin, metylotrofisissa hiivoissa. Toiselta näkö-10 kannalta esillä oleva keksintö koskee uusia DNA-molekyylejä ja niillä transformoituja uusia hiivakantoja.
Hepatiitti B -virus (HBV) aiheuttaa sekä akuutteja että kroonisia sairauksia ja muodostaa maailmanlaajuisen kansanter-15 veysongelman. HBV ilmenee kroonisesti heikentävänä infektiona, joka voi johtaa koko ajan pahenevaan vakavaan maksavaurioon, primäärikarsinoomaan ja kuolemaan. Useimmissa tapauksissa potilaat toipuvat täydellisesti HBV.-stä. Merkittävä osa HBV:llä infektoituneesta populaatiosta kehittyy kroonisiksi 20 taudinkantajiksi, mikä mahdollistaa taudin tarttumisen muihin .
Viimeaikaiset edistysaskeleet DNA-tekniikoissa ovat tuoneet käyttöön monia käyttökelpoisia menetelmiä HBV .-n geneettisen . . 25 rakenteen selvittämiseksi, kuin myös keinojen tuottamiseksi rokotteiden valmistukseen HBV:tä vastaan. HBV:n genomin tiedetään tällä hetkellä koostuvan suunnilleen 3,2 kiloemäsparia sisältävästä osittain kaksoisjuosteisesta DNA.-sta, johon DNA-polymeraasi on kovalenttisesti liittynyt, kooltaan 27 nm .-n 30 nukleokapsidin sisällä. Nukleokapsidia verhoaa lipoproteii- „ nikuori, joka koostuu solulipideistä ja hepatiitti B.-n pinta- ” antigeeneistä (HBsAg); tätä nimitetään virioniksi, jonka , halkaisija on 42 nm. 1 • ·
On myös havaittu, että viruksen kuori koostuu kolmesta eri laisesta mutta läheisesti toisiaan muistuttavasta pintaprote- 2 104639
Unista. Näitä proteiineja nimitetään yleisesti S-, PreSz-ja PreSi-proteiineiksi. Jokainen virioni käsittää 300-400 S-proteiinimolekyyliä ja 40-80 preS=- ja preSi-proteiinimole-kyyliä.
5 S-proteiini sisältää 226 aminohappoa, ja se on normaalin viraalisen lipoproteiinikuoren pääkomponentti. S-proteiini käsittää suunnilleen 24-25 kilodaltonia (kDa), ja sitä voidaan nimittää P24:ksi tai P25:ksi. S-proteiini voidaan myös 10 glykosyloida 27-28 kilodaltonia käsittäväksi glykoproteiinik-si, joita nimitetään GP27:ksi tai GP28:ksi.
Toinen HBsAg-proteiini on PreSz-pinta-antigeeni, jota nimitetään myös HBsAg-keskipolypeptidiksi. PreS= käsittää 281 ami-15 nohappoa, jotka muodostuvat lisättäessä 55 aminohappoa S- proteiinin N-päähän. PreS3-proteiini käsittää suunnilleen 31 kilodaltonia, ja sitä voidaan nimittää P31-proteiiniksi, PreSz-proteiini sisältää kaksi glykosyloitunutta muotoa, 33 kilodaltonia ja 36 kilodaltonia, joita nimitetään vastaavasti 20 GP33:ksi ja GP36:ksi. Tämän antigeenin ajatellaan tuovan esiin antigeenisen lisävasteen henkilöissä, jotka eivät reagoi S:ään, tai jotka reagoivat heikosti S:ään.
Kolmas HBsAg-proteiini on PreSi-pinta-antigeeni, jota myös 25 nimitetään myöhäiseksi HBsAg-polypeptidiksi. PreSi käsittää *' aminohappoja välillä 389-400 (riippuen HBV.-n antigeenisestä alalajista). PreSi:lle ominainen sekvenssi käsittää 108-119 aminohappoa, joka sekvenssi on lisätty täydellisen PreS3-proteiinin N-päähän. PreSi-proteiini käsittää suunnilleen 43 30 kilodaltonia, ja sitä voidaan myös nimittää P43-proteiiniksi. PreSi esiintyy myös 46 kilodaltonia käsittävässä glykosyloi-dussa muodossa, jota nimitetään GP46-glykoproteiiniksi.
HBV-infektion edetessä, kokonaiset virusnukleokapsidit ovat - 35 verhoutuneina lipoproteiinikuoreen, muodostaen kooltaan 42 nm.· n partikkeleita. HBV-infektion aikana muodostuu myös tyh- * * 3 104639 jiä 22 nm:siä partikkeleita, jotka käsittävät enimmäkseen S-ja preS=-proteiineja, ja jonkin verran preSx-proteiineja. Samalla kun kokonainen virusnukleokapsidi on tarttuva, kooltaan 22 nm.· set tyhjät partikkelit eivät ole tarttuvia. Tyhjät * 5 partikkelit saavat kuitenkin aikaan immuunivasteen, joka riittää antamaan immuniteetin, ja joita voidaan käyttää HBV-rokotteiden valmistukseen.
Hepatiitti B -rokotteita, valmistettuina 22 nm:n partikkelien 10 avulla todenperäisesti, valmistettiin HBV:tä kantavien ihmisten plasmasta. Ihmisen plasmasta saatavat 22 nm:n partikkelit on valitettavasti perusteellisesti puhdistettava infektiivis-ten HBV-partikkelien, kuin myös kaikkien muiden plasmaperäis-ten patogeenien poistamiseksi. Hepatiitti B -rokotteen val-15 niistäminen on lisäksi ollut äärimmäisen rajallista, johtuen ihmisplasman rajoitetusta saatavuudesta.
Käyttämällä hyväksi yhdistelmä-DNA -teknologiaa, on ollut mahdollista ilmentää hepatiitin S-proteiinia 22 nm.-n partik-20 kelissä esimerkiksi transformoiduissa nisäkässolulinjoissa ja Saccharomyces cerevisiaessa. Yleisesti käytetyt nisäkäs-systeemit ovat kalliita käyttää, ja Saccharomyces-systeemit tuottavat suhteellisen alhaisia S-proteiinisaantoja.
25 Yritykset antigeenisen ja potentiaalisesti rokotteena tehokkaamman PreSz-proteiinin tuottamiseksi ovat osoittautuneet epätavallisen vaikeiksi. PreS3-proteiinin on todettu olevan hyvin altis proteolyysiin rekombinanttisysteemeissä. Prote-olyysissä muodostuu kaksi pienempää proteiiniosaa, jotka 30 eivät ehkä sisällä PreS=:n antigeenisyyttä. PreS2-proteiinia on lisäksi ollut hyvin vaikea ilmentää rekombinanttisystee-'* meissä. PreS=.-n ilmenemistaso on suunnilleen 1/10 samoissa rekombinanttisysteemeissä tuotetun S-proteiinin tasosta. 1 • ·
Ala edistyisi merkittävästi, jos kehitettäisiin tehostettu menetelmä antigeenisten HBV-partikkelien tuottamiseksi, jotka 4 104639 sisältävät HBV:n S-proteiinia ja PreSÄ-proteiinia. Näissä partikkeleissa toimisivat yhdessä pääasiallinen S-proteiini potentiaalisesti enemmän antigeenisen PreS=-proteiinin kanssa potentiaalisesti rokotteena tehokkaammassa muodossa.
5 Tämän keksinnön tarkoituksena on sen vuoksi tuoda käyttöön menetelmä antigeenisten HBV-partikkelien tehokkaaksi tuottamiseksi, jotka sisältävät pääasiallisesti HBV:n S-proteiinia ja PreS=-proteiinia.
10 Tämän keksinnön toisena tarkoituksena=on vielä tuoda käyttöön uusia vektoreita, jotka sisältävät DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat S-proteiinia ja PreSz-proteiinia.
15 Tämän keksinnön kohteena on edelleen tuoda käyttöön uusia metylotrofisiä hiivoja, jotka on transformoitu vektorilla tai vektoreilla, jotka mahdollistavat HBV-partikkelien tehokkaan tuotannon, jotka sisältävät S-proteiinia ja glykosyloi-tumatonta PreS=-proteiinia.
20 Tämän keksinnön toisena kohteena on vielä tuote, joka on tuotettu pääasiallisesti S-proteiinia ja PreS3-proteiinia sisältävän antigeenisen HBV-partikkelin tuotantomenetelmän avulla.
, 25 » < Nämä ja muut keksinnön raukaiset kohteet selviävät tässä yhteydessä käyttöön annettavasta selvityksestä ja patenttivaatimuksista .
30 Esillä olevan keksinnön mukaisesti on keksitty menetelmä antigeenisen HBV-partikkelin tehokkaaksi tuottamiseksi, joka ” menetelmä käsittää sen, että transformoidaan metylotrofinen hiiva vähintään yhdellä isäntään soveltuvalla ekspressioka-setilla, joka sisältää S-proteiinin rakennegeenin, ja vähin-35 tään yhdellä vektoriin soveltuvalla ekspressiokasetilla, joka sisältää PreSa-proteiinin rakennegeenin, ja viljellään muo- i 5 104639 dostuneita transformantteja olosuhteissa, jotka ovat sopivia partikkelituotannon aikaansaamiseksi.
Kuviossa 1 esitetään plasmidi pA0801, joka on pBR322-peräinen 5 plasmidi ilman EcoRI-paikkaa asemassa 1, ja joka sisältää Bglll-paikan pBR322:n PvuII-paikan tilalla, sisältäen 700 ep:a sisältävän Bglll/XhoI-palan 3’ AOX1-lopetussekvenssistä plasmidista pBSAGISI (NRRL no. 18021). j 10 Kuviossa 2 esitetään plasmidi pAO802, joka on plasmidin pA0801 johdannainen, sisältäen promoottori-geeni-terminaatto-ri -ekspressiokasetin plasmidista pBSAGISI (NRRL no. 18021) liitettynä plasmidin pA0801 Clal-paikkaan.
15 Kuviossa 3 esitetään plasmidi pA0803, joka on pA0802-peräinen plasmidi, josta HBsAg:tä koodittava sekvenssi on poistettu StuI-EcoRI-hydrolysaatin mukana, ja joka sisältää EcoRI-pai-kan liitettynä samaan paikkaan.
20 Kuviossa 4 esitetään plasmidi pA0811, joka saatiin plasmidista pA0803, hydrolysoimalla pA0803.-a BamHI.-llä ja liittämällä 2,0 ke sisältävä pala, joka sisälsi Saccharomyces ARG4 -geenin .
. 25 Kuviossa 5A annetaan käyttöön kaavion muodossa plasmidien ' v pA0801 ja pA0802 konstruointi.
Kuviossa 5B annetaan käyttöön kaavion muodossa plasmidien pA0803 ja pA0811 konstruointi.
30
Kuvio 6 sisältää esityksen HBV:stä, joka sisältää HBV:n adw- ’ serotyypin PreS3-geenin. Plasmidi AM6 on kuviossa 6 esitettä- . vän HBV-genomin johdannainen, jossa BamHI.-llä hydrolysoitu pBR322-plasmidi on liitetty BamHI-paikkaan asemassa 26.
Kuviossa 7 esitetään plasmidi pYM4, pBR322-perainen plasmidi, 35 • * 104639 6 - joka sisältää Pichia pastoris HIS4 -geenin liitettynä BamHI-paikassa. Sulut osoittavat tuhoutuneen paikan. HIS4-geeni on talletettuna pYJ30.-ssä (NRRL B-15890).
' 5 Kuviossa 8 esitetään plasmidi pYMIO. pYMIO on plasmidin pYJ30 (NRRL B-15890) johdannainen, jonka BamHI-kohta asemassa 2959 on tuhoutunut. Kuviossa olevat sulut osoittavat tuhoutuneen katkaisukohdan.
10 Kuviossa 9 esitetään plasmidi pA0804, joka sisältää lineaarisen yhdistävän paikkaspesifisen vektorin palassa, joka on myötäpäivään BglII:sta Bglll.-een. Rakennegeeni voidaan liittää tämän plasmidin erikoiseen EcoRI-paikkaan.
15 Rakennegeeni PreS2 tunnetaan alalla hyvin, ja sen on sekven-soinut Lo, Characteristics of PreS= Region of Hepatitis B Virus, 135 Biochemical and Biophysical Research Communications 382 (1986).Monet tämän alueen tutkijat ovat kloonanneet tämän rakennegeenin ja ilmentäneet sitä, kuten esimerkiksi 20 Lo, ja Valenzuela, Synthesis and Assembly in Yeast of Hepatitis B Surface Antigen Particles Containing the Polyalbumin Receptor, 3 Biotechnology 317 (1985), nimettynä vain kaksi. Rakennegeeni voidaan siten saada alan tutkijoilta, syntetisoida tai uudelleeneristää. On myös tunnettua, että mitä _ . 25 tahansa PreS2-serotyyppiä voidaan käyttää tämän keksinnön «
• I
soveltamisessa käytäntöön.
Rakennegeeni S on myös hyvin tunnettu 'alalla, ja Lo, edellä, on myös sekvensoinut sen. Rakennegeeni voidaan saada kaupal-30 lisesti, se voidaan syntetisoida tai uudelleeneristää. Tiedetään myös, että mitä tahansa S-serotyyppiä voidaan käyttää • tämän keksinnön soveltamisessa käytäntöön.
PreS3-rakennegeenin serotyyppiä adw, jota on käytetty yhdessä 35 tämän keksinnön mukaisessa suoritusmuodossa, saatiin plasmi-dista AM6. Plasmidi AM6 on kuviossa 6 esitetyn HBV-genomin • · Ί .
7 104639 johdannainen, jossa pBR322-plasmidi on liitettynä BamHI-koh-dassa asemassa 26. Tämän PreS2-rakennegeenin nukleotidisek-venssi annetaan taulukossa 1. Tässä käytettäviä plasmideja voidaan viljellä jokaisessa sopivassa E. coli -isännässä, 5 kuten esimerkiksi MCl061:ssä.
Kaksi osaa PreS^-rakennegeeneistä otettiin talteen plasmidis-ta AM6, ja N-pään 13 ensimmäisen aminohapon nukleotidisek-venssi syntetisoitiin in vitro. Tässä käytetty nukleotidisek-10 venssin synteesi voidaan suorittaa joko kemiallisella tai entsymaattisella tavalla, kuten esimerkiksi kemiallisilla menetelmillä, jotka perustuvat fosfotriesteri-, fosfiitti-tai syaanietyylifosforamidiittikemiaan.
15 C-pään koodattava alue, joka käsittää 75 % PreS3:n rakenne-geenistä, saatiin plasmidista AM6 plasmidin Dral-hydrolyysin avulla. Dral-hydrolyysi suoritettiin käyttämällä kaupallisesti saatavaa Dral-endonukleaasia (kaikki endonukleaasi käytettiin noudattaen valmistajan ohjetta). Dral-palat uutettiin 20 sen jälkeen fenolilla ja saostettiin etanolilla.
Oktameerinen Stul-linkkeri (AAGGCCTT) valmistettiin sen jälkeen nornaalin DNA-synteesitekniikan mukaisesti ja liitettiin Dral-palasiin käyttämällä T4-ligaasia tasapääligaatiossa.
- r 25 Ligaatio lopetettiin fenoliuutolla, jota seurasi etanolisaos-* tus. Muodostuneet palaset hydrolysoitiin sen jälkeen Stul-endonukleaasilla Stul-multimeerien poistamiseksi.
Stul-kytketyt palaset hydrolysoitiin sen jälkeen Xbal:llä.
30 Tuloksena oleva, suunnilleen 600 ep:a sisältävä Stul/Xbal- palanen, joka sisälsi PreSÄ-rakennegeenin C-pään koodattavan alueen, eristettiin geelielektroforeesin avulla.
Tämä 600 ep:a sisältävä pala liitettiin sen jälkeen TA-ligaa- 35 sin avulla plasmidin pYM4 5,7 ke:n Xbal/StuI-hydrolysaattiin, kuvio 2, joka oli eristetty agaroosigeelielektroforeesin • * . 8 104639 avulla .
Ligaatioseosta käytettiin sen jälkeen suoraan kompetenttien E. coli -solujen (MC1061) transformaatioon, joita kasvatet-5 tiin sen jälkeen ampisilliinin läsnä ollessa.
Taulukko 1 7 10 20 30
10 G A A T T C A T G CAGTGGAACTCCACTGCCTTC
PreS3:n alku AO 50 60 CACCAAACTCTGCAGGATCCCAGAGTCAGG 15 70 80 90
GGTCTGTATCTTCCTGCTGGTGGCTCCAGT
20 100 110 120
TCAGGAACAGTAAACCCTGCTCCGAATATT
25 130 140 150
GCCTCTCACATCTCGTCAATCTCCGCGAGG
160 170 172 180
30 ACTGGGGACCCTGTGACGAAC A T G G A G A A C
S: n alku 190 200 210 ATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTC 35 220 230 240
GTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACA
40 250 260 270
V AGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGAC
45 280 290 300
TCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGG
310 320 330
50 GGATCTCCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCG
340 350 360
CAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACC
- ·*· 55 370 380 390
TCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGC
400 410 420 TGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTC.
60 • · 9 104639
Taulukko 1 (jatkoa) 430 440 450 CTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTC 5 460 470 480
TTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATG
10 490 500 510
TTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCA
15 520 530 540
ACAACAACCAGTACGGGACCATGCAAAACC
550 560 570
20 TGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATG
580 590 600 TTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACG 25 610 620 630
GATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCA
30 640 650 660
TCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGG
35 670 680 690
GAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTC
700 710 720
40 AGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTC
730 740 750 GTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCA 45 760 770 780
GCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCA
so ' · 790 800 810
AGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTTATA
55 820 830 840 CCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGG.. ..
850 852 60 GTATACATT TAA . ioppukodoni
Onnistuneesti transformoituneita pesäkkeitä valikoitiin, ja plasmidi-DNA:ta uutettiin Birnboimin ja Dolyn menetelmällä 65 [Nucleic Acids Research 7.-1513 (1979)].
· 10 104639
Uutettua plasmidi-DNA:ta hydrolysoitiin Stul:llä, uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla. EcoRI-linkkereitä valmistettiin ja liitettiin Stul-palasiin. Linkkeriylimäärä poistettiin EcoRI-hydrolyysillä. EcoRI-kytketyt palat hydro-5 lysoitiin edelleen Xbal:llä ja elektroforesoitiin niiden palasten eristämiseksi, jotka sisälsivät preS2-rakennegeenin C-pään osan.
Xbal-EcoRI -hydrolysaatti liitettiin Xbal-EcoRI:llä katkais-10 tuun plasmidiin pUClö. Ligaatioseos transformoitiin kompe-tentteihin E. coli -soluihin (MC1061), joita kasvatettiin sen jälkeen ampisilliinin läsnä ollessa. Transformoituja soluja, jotka sisälsivät preS3-rakennegeenin C-pään osan, valikoitiin palahydrolyysianalyysillä käyttäen Clal:tä ja 15 Xbal:tä. Tällä menetelmällä valikoitua plasmidia merkittiin tunnuksella pHS2-B.
PreS^-geenin keskiosa otettiin talteen hydrolysoimalla ensin plasmidi AM6 Xbal:llä ja BamHI:llä. Tavoiteltu 250 ep.-a si-20 sältävä pala eristettiin geelielektroforeesin avulla. 250 ep:a sisältävä Xbal/BamHI-pala liitettiin sen jälkeen plasmidiin pUC18, joka oli hydrolysoitu Xbal:llä ja BamHI:llä, ja käytettiin E. colin MC1061 transformointiin. Viljelmät, jotka kasvoivat ampisilliinin läsnä ollessa, analysoitiin ottamalla . . 25 plasmidi-DNA talteen, ja hydrolysoimalla sitä BamHI:llä.
Niiden plasmidien, jotka sisälsivät 2,7 kb:sen palan elektro-foresoitaessa, katsottiin sisältävän halutun 250 ep:a sisältävän palasen. Yksi transformoitu pesäke, joka sisälsi 250 ep:sen palan, eristettiin, ja sitä kasvatettiin suuressa 30 mitassa. Plasmidi-DNA eristettiin ja puhdistettiin pesäkkeestä, joka hydrolysoitiin EcoRIrllä ja BamHI:llä. Vektorivyöhy-:’·· ke eristettiin elektroforeesilla. Vektori ligoitiin sen jäl keen seuraavan kinaasilla käsitellyn kaksijuosteisen oligo-nukleotidin kanssa.
* · · 35 „ 104639
PstI BamHI
5’ AATTCAATCCGTCTGCAG 3' - 3'GTTAGGCAGACGTCCTAG 5' • 5 Ligaatioreaktioseosta käytettiin E. colin MC1061 transfor- mointiin, ja pesäkkeet, joissa oli oikea insertti, valikoitiin ampisilliiniresistenssin perusteella. Tätä plasmidia nimitettiin koodilla pPS2.
10 PreS3:n N-pään koodittava alue valmistettiin synteettisenä oligonukleotidina, jolla on seuraava sekvenssi.
Hindlll PstI
5’ AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA 3' ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAG 5' 15 Tämä sekvenssi kloonattiin plasmidin pUCl8 Hindlll- ja Pstl-hydrolysaattiin. Halutut transformantit karakterisoitiin suunnilleen 75 ep:sen palan läsnäolon perusteella EcoRI-hyd-rolyysin ja elektroforeesin jälkeen. Tällä menetelmällä vali-20 koituja plasmideja merkittiin koodilla pTB0-2A.
Geenin keskiosa lisättiin hydrolysoimalla vektori pTBO-2A PstI:1la ja Xbal:llä; insertti oli 250 ep:a sisältävä Pstl-Xbal -pala pPS2:sta. Transformantit karakterisoitiin >300 25 ep:sen EcoRI-palan kuin myös 290 ep:sen Xbal/Hindlll-palan läsnäolon perusteella. Oikeaa isolaattia merkittiin koodilla pTBO-3. Kokonainen preS=-geeni saatiin aikaan liittämällä Hindlll/Xbal-pala pTBO-3:sta Xbal/Hindlll:11a hydrolysoituun pHS2B:hen. Ampisilliinille resistentit transformantit karak-30 terisoitiin 825 ep.-sen EcoRI-palan läsnäolon perusteella.
;· Tätä konstruktiota nimitettiin koodilla pTB04.
Edellä mainitun E. coli -kannan viljely voidaan suorittaa millä tahansa sopivalla menetelmällä. Alalla tunnetaan jo 35 hyvin yleiset menetelmät E. colin viljelemiseksi, ja kaikki näiden menetelmien mukaelmat tässä käytettyjen kantojen spe- « · 12 104639 sifisten vaatimusten mukaisesti ovat alaa tuntevien toteutettavissa .
Plasmidi-DNA:n talteenotto E. colista voidaan toteuttaa usei-5 den menetelmien avulla, johtuen sen tiiviistä koosta ja suljetusta pallomaisesta superkierremuodosta. Isäntäsolut voidaan esimerkiksi saaliin talteenoton jälkeen pelletoida sent-rifugoimalla, ja suspendoida sen jälkeen uudelleen ja hajottaa. Lysaatti tulisi sentrifugoida solujäänteiden poistami-10 seksi, ja DNA.-n sisältävä supernatantti tulisi jättää jäljelle. Sen jälkeen voidaan suorittaa fenoliuutto enimmän muun kontaminaation poistamiseksi DNA:sta. Fenolilla uutettua DNA:ta voidaan-sen jälkeen edelleen käsitellä, käyttäen ti-heysgradienttisentrifugoi-nti- tai geelisuodatustekniikkaa, 15 plasmidi-DNA:n erottamiseksi bakterisesta DNA:sta. Tekniikat edellä viitatun erottamisen aikaansaamiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja, ja lukuisia menetelmiä näiden tekniikoiden toteuttamiseksi tunnetaan.
20 Plasmidin nukleaasihydrolyysi voidaan suorittaa valitsemalla sopivat endonukleaasit, jotka katkaisevat valikoidun plasmidin siten, että preS=-rakennegeenin talteenotto helpottuu. Käytettävät endonukleaasit ovat riippuvaisia siitä plasmidis-ta, josta preSz-geeni on tarkoitus leikata. Plasmidin AM6 25 sisältämä preS=-rakennegeeni voitaisiin esimerkiksi ottaa talteen kuten on kuvailtu esimerkissä I.
DNA:n geelielektroforesointi voidaan suorittaa käyttämällä lukuisia alalla tunnettuja tekniikoita, kuten esimerkiksi P.
30 G. Sealy ja E. M. Southern, Gel Electrophoresis of Nucleic : : Acids - A Practical Approach (D. Rickwood ja B. D. Hames, edit.) s. 39 (1982). Eluointi voidaan myös toteuttaa käyttämällä lukuisia tekniikoita, jotka sopivat kyseessä olevalle geelille, kuten esimerkiksi elektroeluointi, diffuusio, gee-35 liliuotus (agaroosigeelit) tai fysikaalinen ekstruusio (aga-roosigeelit). On lisäksi tunnettua, että eluointi ei ehkä • * 104639- 13 ole välttämätöntä joillakin geeleillä, kuten esimerkiksi korkealaatuinen, alhaissulamislämpötila-agaroosi.
Silloin kun preS2-rakennegeenin tai sen osia sisältävä kappa-5 le eristetään, voidaan tarvita lisäkäsittelyjä ennenkuin se liitetään vektoriin. Nämä käsittelyt voivat sisältää, mutta eivät niihin rajoittuen, linkkerien lisäämisen tai palan tekemisen tasapäiseksi.
10 Yhtä tämän keksinnön mukaista suoritusmuotoa varten konstruoitiin S-geeni preSa-geenistä M13-mutageneesin avulla. M13-mutageneesia käytettiin ensimmäisten 165 emäsparin poistamiseksi (jotka koodittavat ensimmäiset 55 aminohappoa preS2-rakennegeenistä), mikä johti EcoRI-kohdan liittämiseen välit-15 tömästi S-rakennegeenin ATG-aloituskodonin 5'-puolelle. Ne, jotka tuntevat alaa, tuntevat hyvin Ml3-mutageneesin tekniikat, yhden tyypillisen tekniikan, jota voitaisiin käyttää, ollessa Zollerin ja Smithin tekniikka [Methods in Enzymology 100:468(1983)]. M13-vektoreita ja mutageneesiin tarvittavia 20 reagensseja on saatavissa kaupallisista lähteistä, kuten esimerkiksi New England Biolabs.
Mutageneesi, kuten edellä on kuvattu, aloitettiin liittämällä ensin preS=-rakennegeeni M13-vektorin kaksijuosteiseen, ympy-25 rän muotoiseen replikaatiomuotoon, eli RFrään (johtuen sen helppokäyttöisyydestä, ml3mpl8 valikoitiin, vaikka muita M13-vektoreita olisi voitu käyttää). PreS=.-rakennegeeniä, plasmi-dissa pTB04, lisättiin E. colissa MC1061, ja plasmidi-DNA eristettiin käyttämällä Birnboimin ja Dolyn, edellä, menetel-30 mää. pTB04-plasmidi hydrolysoitiin sen jälkeen EcoRI:llä.
: Suunnilleen 825 emäsparia sisältävä EcoRI-pala, joka sisälsi • *- preSsi-rakennegeenin, eristettiin geelielektroforeesin avulla.
Tämä palanen liitettiin sen jälkeen vektorin ml3mpl8 EcoRI-paikkaan. Ligaatioseosta käytettiin sen jälkeen transformoi-35 taessa kompetentteja bakteerisoluja, kuten esimerkiksi JM101 tai JM103. Transformantteja valikoitiin värireaktion perus- 104639 14 teella, joka osoitti, että haluttu palanen oli keskeyttänyt |3-galaktosidaasigeenin ja muodostaisi kirkkaita plakkeja sinisten asemesta indikaattorimaljoilla.
5 Liitännäisen sijaintiasema voidaan määrittää sekvensoimalla, endonukleaasihydrolyysillä ja geelielektroforesoinnilla, tai millä tahansa sopivalla tekniikalla. Yksi klooni, jossa ini-tiaattorimetioniini oli liitetty lähelle M13-yleisaluketta, eristettiin, ja sitä käytettiin ensimmäiseen mutageneesiin.
10
Seuraavaksi syntetisoitiin in vitro lyhyt oligonukleotidi, joka sisälsi seuraavan nukleotidisekvenssin: CGGGT-ACCGA-GCTCG-AATTC-ATGGA-GAACA-TCACA-TCAGG Tässä keksinnössä käytäntöön sovellettavia synteettisiä sek-15 venssejä voidaan tuottaa joko entsymaattisilla tai kemiallisilla menetelmillä. Sopiviin menetelmiin sisältyvät, mutta ei niihin rajoittuen, kemialliset menettelyt, jotka perustuvat fosfotriesteri-, fosfiitti- tai syaanietyylifosforami-diittikemiaan.
20
Vektorista M13 valmistettiin yksijuosteinen muoto, joka sisälsi liitetyn rakennegeenin. Synteettinen oligonukleotidi, joka on osittain komplementaarinen preSz-geenin viereisen 5'-alueen ja S:ää koodittavan alueen 5’-pään suhteen, yhdis-25 tettiin yksijuosteiseen M13-vektoriin, joka sisälsi preSz-'' rakennegeenin. Käyttämällä osittain komplementaarista syn teettistä oligonukleotidia alukkeena, DNA-synteesi suoritetaan in vitro Klenow-kappaleen ja deoksioligonukleotiditri-fosfaattien kanssa 4=0:533. Osittain komplementaarista syn-30 teettistä oligonukleotidia jatkettiin sen jälkeen ympyrän :: muotoisen M13-templaatin ympärille. Reaktioseosta käytettiin transformoitaessa kompetentteja JM101- tai JM103-soluja. Transformantteja seulottiin siirtämällä plakit nitrosellu-loosalle, ja hybridisoimalla radioaktiivisesti leimatun oli-35 gonukleotidin kanssa siten, että mutanttijuosteet hybridisoi-tuivat, kun taas alkuperäistemplaatti ei hybridisoitunut.
15 104639 Näitä mutantteja käytettiin sen jälkeen, kun valmistettiin templaatti, jota käytettiin JM103:n transformaatioon. Nämä transformantit seulottiin jälleen kuten aikaisemmin. Toisen seulonnan positiiviset sekvensoitiin sen jälkeen, ja oikean 5 sekvenssin sisältävät plakit identifioitiin. Näiden pesäkkeiden kaksijuosteinen yhdistävä muoto hydrolysoitiin sen jälkeen EcoRI:llä, ja 578 emäsparinen palanen eristettiin, joka sisälsi S-rakennegeenin. Tämä sekvenssi annetaan taulukossa 2.
10
Taulukko 2 170 172 180 190
15 G A A T T C A T G GAGAACATCACATCAG
S:n alku 200 210 220
GATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGG
20 230 240 250
CGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCA
25 260 270 280
CAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGA
30 290 300 310
C T T C T C T C A A T T T T C T A G G G G G A T C T C .C C G
320 330 340
35 TGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAA
350 360 370
CCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTC
: : 40 380 . 390 400
CAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTC
45 410 420 430
TGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCC
50 440 450 460
TGCTGCTATGCCTCATCTTCTTATTGGTTC
470 480 490
55 TTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTT
500 510 520
GTCCTCTAATTCCAGGATCAACAACAACCA
60 104639 16
Taulukko 2 (jatkoa) 530 540 550 GTACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTC 5 560 570 580
CTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCAT
10 590 600 610
GTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATT
15 620 630 640
GCACCTGTATTCCCATCCCATCGTCCTGGG
650 660 670
20 CTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCT
680 690 700 CAGTCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAG 25 710 720 730
TGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAG<3G"CTTT
30 740 750 760
CCCCCACTGTTTGGCTTTCAGCTATATGGA
35 770 780 790
TGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACA
800 810 820
40 GCATCGTGAGTCCCTTTATACCGCTGTTAC
830 840 850
CAATTTTCTTTTGTCTCTGGGTATACATTT
45
852 A A
loppukodoni ' 50 S- ja preS2-rakennegeenien eristämisen jälkeen geenit liitetään sopivaan metylotrofihiivavektoriin, kuten esimerkiksi plasmidiin tai lineaariseen paikkaspesifiseen yhdistävään vektoriin. Tämän keksinnön käytäntöön soveltamisen kannalta : 55 edullisia vektoreita ovat sellaiset, jotka soveltuvat Pichia- suvun kanssa, ja edullisimmin Pichia pastoriksen kanssa.
Plasmidit ovat olleet kauan eräitä peruselementtejä, joita on käytetty yhdistelmä-DNA -teknologiassa. Plasmidit ovat 60 renkaan muotoista ekstrakromosomaalista kaksijuosteista DNA:- 104639 17 ta, jota tavataan mikro-organismeista. Plasmidien on todettu esiintyvän yksinkertaisina tai moninkertaisina kopioina solua , kohti. Plasmidi-DNA:hän sisältyy informaatio, jota tarvitaan plasmidin lisäämiseen, so. replikoinnin alkukohta sisältyy 5 bakteerin replikointia varten. Yksi tai useampi keino valikoida plasmidi fenotyyppisesti transformoiduissa soluissa voidaan myös sisällyttää plasmidiin koodattuun informaatioon. Fenotyyppiset tai valikoivat markkerit, kuten esimerkiksi antibioottiresistenssigeenit tai geenit, jotka täydentävät 10 vajavuuksia isännän biokemiallisilla reiteillä, mahdollistavat transformoitujen isäntäsolujen kloonien tunnistamisen, valikoinnin, ja säilyttämisen.
PreSjz- ja S-rakennegeenien ilmentämiseksi metylotrofisessa 15 hiivassa, jokaisen geenin on oltava toiminnallisesti kytketty 5'-säätelyalueeseen ja 3'-loppusekvenssiin, mikä muodostaa ekspressiokasetin, joka liitetään isäntään vektorin välityksellä .
20 Seuraavat ilmaisut määritellään tässä selventämistarkoituk- sessa.
Toiminnallisesti kytketty--viittaa rinnakkaisasemaan, jossa komponentit ovat asettuneet niin, että ne suorittavat tehtä-25 vänsä.
* I
Säätelyalue--DNA-sekvenssejä, jotka reagoivat erilaisiin ärsykkeisiin ja vaikuttavat mRNA:n kopioinnin nopeuteen.
30 3'-loppusekvenssi--lopetuskodonin 3'-puolella olevat sekvens- , ; : sit, jt^tka toimivat mRNA: n stabiloimiseksi, kuten esimerkiksi sekvenssit, jotka saavat esiin polyadenylaation.
"Isäntäsoluun sopiva" tarkoittaa DNA-sekvenssejä, jotka suo-35 rittavat normaalia toimintaa isännissä, kuten esimerkiksi isäntäperäiset säätelyalueet ja 3'-loppusekvenssit.
104639 18
Yhdistävät vektorit ovat edullisia esillä olevan keksinnön käytäntöön soveltamisen kannalta, kuten esimerkiksi Cregg’in lineaarinen, paikkaspesifinen yhdistävä vektori, jota on 5 kuvailtu julkaisussa EP-A-0 226 752 (86 114 700,7). Sellaiset vektorit sisältävät mainitun järjestetyn sekvenssin, joka käsittää vähintään 1) ensimmäisen liitettävän DNA-palasen; 2) selektoitavan markkerigeenin; ja 3) toisen liitettävän DNA-palasen.
10
Liitettävät DNA-palaset ovat vähintään noin 200 nukleotidia pitkiä, ja sisältävät nukleotidisekvenssejä, jotka ovat homologisia isännän genomisen DNA:n osien kanssa. Lineaarisen, paikkaspesifisen yhdistävän vektorin eri komponentit ovat 15 sarjamaisesti järjestyneet, muodostaen lineaarisen DNA-palasen siten, että ekspressiokasetti ja selektoitava markkeri-geeni ovat* sijoittuneet ensimmäisen liitettävän DNA-palan 3’-pään ja toisen liitettävän DNA-palan 5'-pään väliin. Ensimmäinen ja toinen liitettävä DNA-palanen ovat suuntautuneet 20 toistensa suhteen sarjamaisesti järjestyneessä lineaarisessa palassa siten, kuin ne ovat suuntautuneet perusgenomissa.
Nukleotidisekvenssejä, jotka ovat käyttökelpoisia ensimmäisinä ja toisina liitettävinä DNA-paloina, ovat nukleotidisek- .. 25 venssit, jotka ovat homologisia natiivin genomisen paikan » « * erillisten osien kanssa, jossa paikassa genominen modifikaatio on tapahtuva.Siten, esimerkiksi, jos genominen modifikaatio on tapahtuva alkoholioksidaasigeenin lokuksessa, käytettävät ensimmäiset ja toiset DNA-palaset ovat sekvenssejä, 30 jotka ovat homologisia alkoholioksidaasigeenilokuksen eril- listen osien kanssa. Jotta genomista modifikaatiota tapahtui-* si esillä olevan keksinnön mukaisesti, kahden liitettävän DNA-palasen on suuntauduttava toistensa suhteen lineaarisessa palassa samassa keskinäisessä orientaatiossa kuin esiintyes-35 sään perusgenomissa. Esimerkkejä nukleotidisekvensseistä, - joita voitaisiin käyttää ensimmäisinä ja toisina liitettävinä 19 104639 DNA-palasina, ovat nukleotidisekvenssit, jotka on valikoitu ryhmästä, johon kuuluvat alkoholioksidaasi (AOXl) -geeni, dihydroksiasetonisyntetaasi (DHAS1) -geeni, p40-geeni ja HIS4-geeni. AOXl-geeni, DHASl-geeni, p40-geeni ja HIS4-geeni 5 tuodaan esille julkaisussa EP-A-0 183 071 (85 113 737,2), joka on sisällytetty tässä yhteydessä viitteenä.
Ensimmäinen liitettävä DNA-palanen voi sisältää toiminnallisen säätelyalueen, joka voi käsittää säätelyalueen, jota on 10 käytetty ekspressiokasetissa. Ensimmäisen liitettävän DNA- palasen käyttäminen ekspressiokasetin säätelyalueena on tämän keksinnön mukainen edullinen suoritusmuoto. Kuviossa 4 esitetään kaavakuva vektorista, jossa käytetäään ensimmäistä liitettävää DNA-palaa kasetin säätelyalueena.
15
Liitäntäpaikka tai paikat ja 3’-loppusekvenssi voidaan valinnaisesti sijoittaa välittömästi ensimmäisen liitettävän DNA-palan 3’-puolelle. Tämä lineaarisen, paikkaspesifisen yhdistävän vektorin konformaatio antaa lisäetuna käyttöön valmiin 20 paikan rakennegeenin liittämiseksi, tarvitsematta lisätä yhteensopivaa 3’-loppusekvenssiä.
Isäntäkannan transformaatiossa käytettävään DNA:hän on myös välttämätöntä sisällyttää vähintään yksi selektoitava markke-25 rigeeni. Tämä helpottaa niiden organismien valikointia ja · eristämistä, jotka ovat liittäneet itseensä transformoitua DNA:ta. Merkkigeeni antaa transformoidulle organismille feno-tyyppisen ominaisuuden, jota isännällä ei ollut, esim., spesifisen aminohapon tuottokyvyn palautuminen silloin, kun 30 transformoimattoman isäntäkannan spesifisen aminohapon bio- , : synteesireitti on vajaavainen, tai antibioottiresistenssi ja ’ vastaavat ominaisuudet.
Tyypilliset selektoitavat markkerigeenit voidaan valikoida 35 ryhmästä, johon kuuluvat HIS4-geeni ja ARG4-geeni Pichia pastoriksesta ja Saccharomyces cerevisiaesta, invertaasigeeni f « 20 104639 (SUC2) Saccharomyces cerevisiaesta, tai neomysiinifosfotrans-feraasigeeni E. colin Tn601- tai Tn903-transposonielementeis-tä .
5 Ne, jotka tuntevat alan, käsittävät, että muita DNA-sekvens-sejä voidaan myös sisällyttää vektoreihin, joita käytetään esillä olevan keksinnön soveltamisessa käytäntöön, kuten esimerkiksi bakterinen plasmidi-DNA, bakteriofagi-DNA ja vastaavat. Sellaiset sekvenssit mahdollistavat näiden vekto-10 rien monistumisen ja säilymisen bakteeri-isännissä.
Jos ensimmäinen liitettävä DNA-palanen ei sisällä säätely-aluetta, sopiva säätelyalue täytyy liittää toiminnallisesti kytkettynä rakennegeeniin, jotta saataisiin aikaan käyttökel-15 poinen ekspressiokasetti. Samalla tavalla, jos 3'-loppusek-venssiä ei ole käytettävissä liittämispaikassa, ekspressio-kasetin tekemiseksi täydelliseksi, 3'-pään loppusekvenssi on kytkettävä toiminnallisesti liitettävään rakennegeeniin.
20 Alaa tuntevat ovat tietoisia lukuisista säätelyalueista, jotka on karakterisoitu, ja joita voitaisiin käyttää yhdessä metylotrofisten hiivojen kanssa. Tyypillisiin säätelyalueisiin kuuluvat, mutta ei niihin rajoittuen, hiivan säätelyalueet, jotka on valikoitu ryhmästä, johon kuuluvat happamen 25 fosfataasin, galaktokinaasin, alkoholidehydrogenaasin, syto-
» I
·’* kromi c.-n, alfa-pariutumistekijän ja glyseraldehydi 3-fos- faattidehydrogenaasin säätelyalueet eristettyinä Saccharomyces cerevisiaesta; primäärisen alkoholioksidaasin (A0X1), dihydroksiasetonisyntetaasin (DHAS1), p40:n säätelyalueet, ja 30 HIS4 säätelyalue, jotka ovat peräisin Pichia pastoriksesta ; ja vastaavat. Tällä hetkellä edullisia säätelyalueita, joita ’ käytetään esillä olevan keksinnön käytäntöön soveltamisessa, ovat ne, joille on tunnusomaista niiden kyky reagoida meta-nolia sisältäviin alustoihin, sellaisten säätelyalueiden 35 ollessa valikoituna ryhmästä, johon kuuluvat AOX1, DHAS1, p40, ja joita on tuotu esille julkaisussa EP-A-0 183 071 (85 • · * 5 21 104639 113 737,2).
Edullisin säätelyalue tämän keksinnön käytäntöön soveltamisessa on AOXl-säätelyalue.
3'-pään loppusekvenssejä voidaan käyttää ekspressiokasetissa, tai ne voivat käsittää osan vektorista, kuten edellä on kuvailtu. 3'-pään loppusekvenssit voivat toimia siten, että ne päättävät, polyadenyloivat ja/tai stabiloivat lähetti-RNA:ta, 10 jota rakennegeeni koodittaa, ollessaan toiminnallisesti kytkettyinä geeniin. Muutamiin esimerkkeihin kuvaavista 3'-lop-pusekvenssilähteistä tämän keksinnön käytäntöön soveltamisessa, kuuluvat, mutta ei niihin rajoittuen, Saccharomyces cere-visiaen, Hansenula polymorphan, ja Pichian 3’-pään loppusek-15 venssit. Edullisia ovat ne, jotka ovat peräisin Pichia pasto-riksesta, kuten esimerkiksi ne, jotka on valikoitu ryhmästä, joka sisältää AOXl-geenin, DHASl-geenin, pAO-geenin ja HIS4-geenin 3'-pään loppusekvenssit. Erityisen edullinen on AOXl-geenin 3'-pään loppusekvenssi.
20
Ne, jotka tuntevat alan, tietävät, että muita DNA-sekvenssejä voidaan myös sisällyttää vektoreihin, joita käytetään esillä olevan keksinnön käytäntöön soveltamisessa, kuten esimerkiksi bakterinen plasmidi-DNA, bakteriofagi-DNA, ja vastaavat.
25 Sellaiset sekvenssit mahdollistavat näiden vektorien monistu-‘ * misen ja säilymisen bakteeri-isännissä.
Toinen sopiva vektori voisi olla yhdistävä vektori, joka sisältäisi järjestäytyneen sekvenssin käsittäen ainakin 1) 30 liitettävän DNA-palasen, 2) selektoitavan markkerigeenin, 3) ; ekspressiokasetin ja valinnaisesti A) toisen liitettävän DNA- • palasen. Yhdistävän vektorin komponentit vastaavat lineaari sessa, yhdistävässä paikkaspesifisessä vektorissa käytettäviä komponentteja, paitsi että tarvitaan vain yksi liitettävä 35 DNA-palanen, yhdistävien vektorien otaksutaan kuitenkin yhdistävän koko vektoria homologisen rekombinaation avulla.
22 104639
Ympyrän muotoiset yhdistävät vektorit ovat edullisia, kuten sellaiset, joita on esitetty kuviossa 4. Esillä olevan keksinnön käytäntöön soveltamisessa on tällä hetkellä edullista käyttää lineaarisia transformaatiovektoreita, kuten esimer-5 kiksi kuviossa 9 esitettyjen rakenteiden Bglll-palaset ja kuviossa 4 esitettävän yhdistävän vektorin ympyrän muotoinen muoto.
S- tai preS=.-rakennegeenin liittäminen sopiviin vektoreihin 10 voidaan toteuttaa millä tahansa sopivalla tekniikalla, joka katkaisee valitun vektorin sopivassa kohdassa tai kohdissa, ja johtaa vähintään yhteen käyttökelpoiseen ekspressiokaset-tiin, joka sisältää S- tai preSa-rakennegeenin, niiden ollessa läsnä vektorissa.
15 S- tai preSz-rakennegeenin ligointi voidaan toteuttaa millä tahansa sopivalla ligaatiotekniikalla, kuten esimerkiksi käyttäen T4 DNA -ligaasia.
20 S- tai preSz-rakennegeenin ja vektorin muodostaman ligaatio-seoksen alkuvalikointi, lisääminen ja valinnainen monistaminen suoritetaan edullisesti transformoimalla seos bakteeri-isäntään, kuten esimerkiksi E. coliin. Sopivat E. colin transformaatiotekniikat ovat alalla hyvin tunnettuja. Selek- ,, 25 tiomarkkerit ja bakteriset replikoinnin aloituskohdat, jotka > < ovat välttämättömiä vektorin säilymisen kannalta bakteeri-isännässä, tunnetaan lisäksi myös hyvin alalla.
Halutun plasmidin eristäminen ja/tai puhdistaminen, joka 30 plasmidi sisältää S- tai preSa-geenin ekspressiosysteemissä, > ; voidaan toteuttaa millä tahansa sopivalla menetelmällä plas- ’ midi-DNA:n erottamiseksi isäntä-DNA:sta.
Samalla tavalla vektorit, jotka ovat muodostuneet ligaatios-35 sa, voidaan testata edullisesti lisääntymisen jälkeen, jotta varmistettaisiin S- tai preSa-geenin länäolo ja sen käyttö- , 9 • 104639 23 kelpoinen kytkeytyminen säätelyalueeseen ja 3'-loppusekvens-siin. Tämä voidaan toteuttaa monella eri tekniikalla, joihin kuuluvat, mutta ei niihin rajoittuen, endonukleaasihydrolyy-si, geelielektroforeesi, tai endonukleaasihydrolyysi-Sout-5 hern-hybridisaatio.
Tämän keksinnön mukaisessa käytännössä vähintään kaksi eri yhteensopivaa ekspressiokasettia on transformoitava isäntä-, soluun. On olemassa useita menetelmiä, joiden avulla nämä 10 kaksi eri ekspressiokasettia voidaan liittää isäntään, kuten esimerkiksi kahden toiminnallisen ekspressiokasetin sijoittaminen vektoriin (virus, plasmidi tai lineaarinen, paikkas-pesifinen yhdistävä vektori), ja isännän transformointi näillä vektoreilla. Toinen menetelmä isännän transformoimiseksi 15 vähintään kahdella eri ekspressiokasetilla (S ja preSÄ) olisi isännän transformointi kahdella eri vektorilla, toisen sisältäessä S-ekspressiokasetin ja toisen sisältäessä preSÄ-eks-pressiokasetin. Transformointi kahdella eri vektorilla (kaksinkertainen transformaatio) voitaisiin toteuttaa samanaikai-20 sella transformaatiolla (molemmat vektorit läsnä yhdessä transformaatiotapahtumassa), tai perättäisesti (yhden vektorin transformointia isäntään seuraa toinen transformaatio toisella vektorilla aikaisemmin transformoituihin isäntäso-luihin). Kaksinkertainen perättäinen transformaatio on tällä . 25 hetkellä edullinen transf ormaatiomenetelmä.
Plasmidien tai lineaaristen vektorien transformointi hiiva-isäntiin voidaan toteuttaa sopivilla transformaatioteknii-koilla, mukaanlukien, mutta ei niihin rajoittuen, ne menetel-30 mät, joita ovat selittäneet Hinnen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 75, (1978) 1929; Ito et ai., J. Bacteriol. 153, (1983) * 163; Cregg et ai., Mol. Cell Biol.5 (1985) s. 3376; tai Sree- krishna et ai., Gene, 59 (1987) s. 115. Creggin transformaa-tiomenetelmä on tämän keksinnön käytännön kannalta edullinen. 35 Tämän keksinnön mukaisessa yhdessä suoritusmuodossa on edullista käyttää lineaaristen vektorien ylimäärää, ja valikoida 24 104639 moninkertaisia liitännäisiä Southern-hybridisaation avulla.
Hiivaisäntä transformaatiota varten voi olla mikä tahansa sopiva metylotrofinen hiiva. Metylotrofisiin hiivoihin lue-5 taan mukaan, mutta ei niihin rajoittuen, hiivat, jotka kykenevät kasvamaan metanolilla, valikoituina suvuista, joihin kuuluvat Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomy-ces, Torulopsis ja Rhodotorula. Luettelon spesifisistä lajeista, jotka ovat tyypillisiä esimerkkejä tähän luokkaan 10 kuuluvista hiivoista, voi löytää julkaisusta C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982). Tällä hetkellä edullisia ovat metylotrofiset hiivat, jotka kuuluvat Pichia-sukuun, kuten esimerkiksi auksotrofinen Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) tai PPF1 (NRRL Y-18017). Auksotrofiset mety-15 lotrofiset hiivat ovat myös edullisia tämän keksinnön mukaiselle käytännölle niiden helpon valikoitavuuden perusteella. Tiedetään, että villityyppisiä metylotrofisiä hiivakantoja voidaan käyttää yhtä hyvällä menestyksellä, jos valitaan sopiva transformoiva markkerigeeni, kuten esimerkiksi SUC2.-n 20 käyttäminen Pichia pastoriksen transformoimiseksi kannaksi, joka kykenee kasvamaan sakkaroosilla, tai käytetään antibi-oottiresistenssimarkkeria, kuten esimerkiksi G4418"-geeniä.
Esillä olevan keksinnön mukaisessa käytäntöön soveltamisessa 25 on edullista käyttää kahta selektiomarkkeria yhdessä, S:n ja 1 « preSz:n pysyvän transformaation isäntään valikoimiseksi. Keksinnön mukaisen käytännön kannalta on siten edullista käyttää isäntä- ja vektoriyhdistelmiä, jotka varmistavat, että kun käytetään kahta eri selektiomarkkeria kahdessa eri 30 vektorissa, kumpikin markkeri voidaan valikoida toisistaan ,· riippumatta. Yhtenä sellaisena isännän ja vektorin yhdistel mänä voisijoilla se, että käytetään PPFl:tä (HIS4, ARG4) vektorien pAO804 (HIS4-markkeri) ja pA08ll (ARG-markkeri) kanssa. Toinen mahdollinen yhdistelmä voisi olla se, että käyte-35 tään auksotrofia, joka on vajaavainen vain yhdellä reitillä, ; yhdessä geenin kanssa, joka on vajavuuden suhteen komplemen- « > i 9 104639 25 taarinen, ja antibioottiresistenssigeenin kanssa, tai geenin, joka synnyttää uuden fenotyypin, kuten esimerkiksi SUC2.
Transformoituja metylotrofisiä hiivasoluja voidaan valikoida 5 käyttämällä sopivia tekniikoita, mukaanlukien, mutta ei niihin rajoittuen, aikaisemmin auksotrofisten solujen viljely transformoinnin jälkeen ilman tarvittavaa biokemiallista tuotetta (johtuen solun auksotrofiästä), uuden fenotyypin ("metanolihidas") havaitsemisen perusteella, tai viljely 10 antibiootin läsnä ollessa, joka on toksinen hiivalle trans-formantin sisältämän resistenssigeenin puuttuessa.
Eristettyjä transformoituja metylotrofisiä hiivasoluja viljellään sopivilla fermentointimenetelmillä, kuten esimerkiksi 15 ravistelupullofermentaatio, suurtiheyksinen fermentaatio tai Cregg’in et ai. julkaisema menetelmä, High-Level Expression and Efficient Assembly of Hepatitis B Surface Antigen in the Methylotrophic Yeast, Pichia Pastoris, 5 Bio/Technology 479 (1987).
- 20
Ilmentäminen voidaan toteuttaa menetelmillä, jotka ovat sopivia käytettävälle säätelyalueelle. Jos käytetään metanolille reagoivia säätelyalueita, ilmentymisen indusointi voidaan toteuttaa altistamalla transformoidut solut ravintoalustassa 25 käytetyn säätelyalueen kannalta sopivalle alkoholille.
Antigeeniset partikkelit voidaan ottaa talteen raa'assa muodossa, hajottamalla transformoidut solut, joita on indusoitu riittävä ajanjakso, käyttämällä tavanomaisia menetelmiä, 30 kuten esimerkiksi lasihelmijauhatus, jota seuraa solujääntei-. den poistamiseen riittävä sentrifugointi. Ne, jotka tuntevat alaa, ovat tietoisia lukuisista menetelmistä, joita on saatavilla heterologisen proteiinin uuttamiseksi yksisoluisista 1 isäntäorganismeista, jotka voisivat korvata edellä olevan 35 yleisen uuttomenetelmän, tai lisäpuhdistamiseksi. Tämän keksinnön mukaisen käytännön kannalta edullinen puhdistusmene- 104639 26 telinä käsittää sen, että suoritetaan transformoitujen solujen hajotus puskuroitujen kaotrofisten yhdisteiden läsnä ollessa, seostetaan lipidit ja kontaminoivat proteiinit hajotuksessa saadusta supernatantista, diasuodatetaan supernatantti, käsi-5 tellään retentaattia piihapon kanssa, pestään kontaminoivat proteiinit piihappoon absorboidusta hepatiitti B -pinta-antigeenistä puskurilla, jonka pH on alueella 6-8, eluoidaan antigeeni piihaposta puskuroidulla eluentilla, jonka pH on alueella 9,5-11, ja joka on urean suhteen 0,5 - 8 molaarinen, 10 saatetaan siten saadut antigeeniä sisältävät jakeet geelisuo-datukseen, ja sen jälkeen saatetaan antigeeniä sisältävä jae anioninvaihtokromatograf iaan.
Seuraavat ei-rajoittavat esimerkit annetaan käyttöön tämän 15 keksinnön mukaisen käytännön valaisemiseksi edelleen.
Esimerkit
Kannat
Pichia pastoris GS115 (his4) NRRL Y-15851 oli näissä esimer-. 20 keissä käytetty isäntähiivakanta.
Pichia pastoris PPF1 (arg4 his4) NRRL Y-18017.
E. coli MCI061 NRRL 18016.
25
• E. coli JM103 delta (lac pro) thi rpsL (strA) supE endA sbcB
hsdR .
Alustat 30 YPD, 1 litra 20 g hiivauutetta . 20 g peptonia ’ 20 g dekstroosia LB-liemi, 1 litra 5,0 g hiivauutetta (Difco) 35 10,0 g tryptonia (Difco) - 5,0 g NaCl.-a j 27 104639 TE-puskuri 1,0 mM EDTA:a 0,01 M (pH 7,4) Tris-puskurissa 5 PEG-liuos 20 % polyetyleeniglykoli-3350: a 10 raM CaClÄ:a 10 mM Tris-HCl: a (pH 7,4) —steriloidaan suodattamalla 10 Liuos A 0,2 M Tris-HCl:a (pH 7,5) 0,1 M MgClz: a 0,5 M NaCl:a 0,01 M ditiotreitolia (DTT) 15 Liuos B 0,2 M Tris-HCl:a (pH7,5) 0,1 M MgCljs : a 0,1 M DTT:a 20X SSPE 4,4 g NaOH:a '20 7,4 g Naa-EDTAra 27,6 g NaHÄPCL*.HeO:a 210 g NaCl:a -- pH säädetään 7,5-8,0:ksi NaOH:11a -- H20:11a 1 litraksi ' . 25 1OX Siirtopuskuri 5,0 g NaCl:a 96,8 g Trizma Base:a 9,74 g glysiiniä vedellä 1 litraksi 30
Esi ronkki I
Vektorin TB04 konstruointi
Plasmidi AM6 on kuviossa 6 esitetyn HBV-genomin johdannainen, jossa pBR322-plasmidi on liitettynä BamHI-paikassa asemassa 35 26.
28 104639
Vektori TB04 sisältää geenin, joka koodittaa hepatiitti B -pinta-antigeenin 281 aminohappoista preSz-muotoa. Geeni konstruoitiin kolmessa osassa: C-terminaalinen 75 % rakennegee-nistä. N-terminaalinen linkkeri, joka koodittaa 13 aminohap-5 poa, ja jäljellä oleva keskiosa. Plasmidi AM6, joka sisälsi preSa-geenin, adw-serotyyppiä, oli lähteenä tässä käytetyille preS2-geenin C-terminaaliselle osalle ja keskiosalle. Sekvenssin ovat tuoneet esille Valenzuela et ai., ICN-UCLA Symposia on Animal Virus Genetics, ss. 57-70 (1980), seuraavasti 10 modifioituna:
natiivisekvenssi ATG-CAG-TGG-AAT-TCC
mutagenoitu sekvenssi ATG-CAG-TGG-AAC-TCC
15 A. PreSz-geenin C-terminaalinen osa (Kaikki restriktioentsyymit saatiin Boehringer Mannheim'lta, ja niitä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti).
C-terminaalinen osa eristettiin plasmidista AM6 (kuvio 1) 20 hydrolysoimalla Dral:llä, joka katkaisee HBV-genomin kahdessa paikassa, joista toinen on pinta-antigeenin viimeisen aminohapon kodonin kohdalla. Päät defosforyloitiin käsittelemällä vasikan suoliston alkaalisella fosfataasilla 30 μΐ:n reak-tiotilavuudessa (1 U entsyymiä 37°C:ssa 1 tunnin aikana 50 25 mM Tris . HC1: ssä , pH 9,0, jossa 1 mM MgCl^.-a, 100 μΜ ZnCl3: a , 1 mM spermidiiniä}. Koko hydrolysaatti uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla (Maniatis et ai.). Oktameerinen Stul-linkkeri (AAGGCCTT) syntetisoitiin Applied Biosystems'in Model 380A DNA-synteesilaitteella käyttäen syaanietyylifosfo-30 ramidiittikemiaa. 1 Mg Stul-linkkeriä liuotettiin tislattuun /; veteen. 10 ng:n erä poistettiin ja leimattiin fosfaatilla 50
μΐ:n kokonaistilavuudessa, joka sisälsi 70 mM Tris.HCl:a, pH
7,6, 10 mM MgClz:a, 5 mM ditiotreitoi ia, 1 mM ATP:a ja 10 yksikköä polynukleotidikinaasia, 30 minuutin aikana 37eC:Ssa. 35 Linkkereitä kuumennettiin 90^0: seen entsymaattisen reaktion lopettamiseksi, ja jäähdytettiin hitaasti huoneen lämpötilaan i 104639 29 kaksi juosteisen DNA .-n muodostumisen helpottamiseksi. Stul-linkkerit lisättiin edellä olevaan Dral-hydrolysaattiin ja ligoitiin T4-ligaasin kanssa seuraavasti. Reaktio tapahtui 10 μΐ:n tilavuudessa, joka sisälsi 6,6 M Tris.HCl:a, pH 7,6, 5 5 mM MgCl3:a, 5 mM ditiotreitolia, 1 mM ATP:a ja 1 Weissin yksikön T4-ligaasia, yhden tunnin aikana 23eC:ssa. Ligaatio-reaktio lopetettiin fenoliuutolla, jota seurasi etanolisaos-tus. Stul-restriktiohydrolyysi suoritettiin sen jälkeen >50 U:n kanssa entsyymiä yli yön, Stu-linkkerimultimeerien pois-10 tamiseksi. Dral-hydrolyysin ja Stul-linkkereiden yhdistelmä palautti translaation loppukodonin, jonka Dral-hydrolyysi 011 poistanut.
StuI: llä kytketyt Dral-palaset hydrolysoitiin Xbal.-llä, mikä 15 tuotti halutun StuI/Xbal-palan, joka sisälsi suunnilleen 600 ep.-a; se eristettiin 0,8-%:sta preparatiivisesta agaroosigee-listä. Tämä palanen sisälsi C-terminaalisen 75 % geenistä, ja se kloonattiin vektoriin pYM4 (kuvio 2), joka oli hydrolysoitu Xbalrllä ja Stul.-llä, ja defosforyloitiin kuten edel-- 20 lä. (pYM4 voidaan saada plasmidista pYM30 hydrolysoimalla PYM30 Clalrllä ja ligoimalla päät uudelleen. pYM30 on saatavissa E. coli-isännässä, joka on talletettu the Northern Regional Research Center'ssä, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, talletusnumero NRRL B-15890). 25 pYM4.-n 5,7 ke.-tä sisältävä restriktiopalanen eristettiin 0,8-%.-sta preparatiivisesta agaroosigeelistä. Vektoria pYM4 käytettiin pelkästään sen sopivien restriktiopaikkojen takia.
50 ng vektoria ja 500 ng liitännäistä ligoitiin 23°C.ssa 1 tunnin aikana 50 mM Tris.HCl:ssä, pH 7,4, jossa oli 10 mM 30 MgCl=:a, 10 mM ditiotreitolia, 1 mM spermidiiniä, 1 mM ATP.a ja 1 Weissin yksikkö T4-ligaasia 10 μ1:η tilavuudessa. Ligaa-tioreaktiota käytettiin suoraan transformoitaessa kompetentteja MC1061-soluja (E. coli) ampisilliiniresistenteiksi. E. coli -kantaa MC1061 on saatavissa the Northern Regional Re-35 search Center'stä, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, talletusnumerolla NRRL-18016. MC1061:n 104639 30
genotyyppi on seuraavanlainen: F(-), ara D139 delta (lacIPO-ZY) X74 galk galU hsr hsm(+) rpsL delta (araABOIC leu) 7697. MC1061 tehtiin kompetentiksi transformaatiota varten seuraa-valla tavalla. E. coli MC1061:n keskilogaritmivaiheinen kas-5 vusto (50 ml) otettiin talteen sentrifugoimalla Damon IEC
DPR600 -sentrifugilla nopeudessa 3000 rpm 5 minuutin aikana 4°C:ssa, ja pestiin 10 mM.-ssa NaClrssa. Kasvusto suspendoi-tiin uudelleen 25 ml:aan 50 mM CaCl=:a 30 minuutin aikana 0°C:ssa. Solut sentrifugoitiin kuten edellä ja suspendoitiin 10 uudelleen 2 ml.aan 50 mM CaCl2:a. Ligaatioreaktio lisättiin transformaatiota varten 100 ulraan kompetenttia solususpen-siota, ja inkuboitiin 0°C:ssa jäiden päällä 15 minuutin aikana, kuumashokkikäsiteltiin 37ec.-ssa 5 minuutin ajan ja inkuboitiin 23°C:ssa 5 minuutin ajan. Solut maljaviljeltiin suo-15 raan LB-agarmaljoille, jotka sisälsivät 50 pg/rol ampisillii-niä. Maljoja inkuboitiin 37°C:ssa 10-16 tunnin ajan. Muodostuneet pesäkkeet otettiin talteen ja karakterisoitiin rest-riktiohydrolyysin avulla. Soluja kasvatettiin 5 ml:ssa L-lientä, joka sisälsi 50 pg/ml ampisilliiniä, 5 tunnin ajan 20 37eC:ssa, ja DNA preparoitiin Birnboimin ja Dolyn menetelmäl lä [Nucleic Acids Research 7,1513 (1979)]. Pienimittaiset valmisteet hydrolysoitiin BamHI.-llä ja Xbal:llä. Viljelmien, jotka tuottivat 1,5 ke:siä Xba/Bam-palasia, ajateltiin sisältävän insertin, ja yhden viljelmän suurimittainen DNA-valmis-25 te puhdistettiin kuten edellä, minkä jälkeen se jaettiin vyöhykkeisiin keesiumkloridietidiumbromidigradientissa. Tätä kloonia nimitettiin koodilla pHSl.
Plasmidi pHSl hydrolysoitiin Stul:llä, defosforyloitiin kuten 30 edellä, uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla. EcoRI-. linkkerit (GGAATTCC), jotka oli syntetisoitu kuten edellä, * fosforyloitiin, niiden annettiin itsekseen yhdistyä, ja ne liitettiin tähän tasapäiseksi tehtyyn DNA:han. Ylimäärä link-kereistä poistettiin yön aikana EcoRI-hydrolyysillä, ja DNA 35 hydrolysoitiin myöhemmin Xbal:llä, minkä jälkeen uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla. Dupletti, joka sisälsi 104639 31 kiinnostuksen kohteena olevan 600 ep:sen Xbal-EcoRI-palasen ja 582 ep:sen (Xbal-EcoRI) vektoripalasen, eristettiin 1-%:11a preparatiivisella geelielektroforeesilla. Nämä palaset (500 ng) liitettiin Xbal-EcoRI:llä hydrolysoituun ja defosfo-5 ryloituun plasmidiin pUC18 (50 ng), kuten edellä on kuvattu, ja niitä käytettiin transformoitaessa MC1061 ampisilliinille resistentiksi kuten edellä on kuvailtu. Pienimittaisen DNA-valmisteen restriktiohydrolysaatteja käytettiin sen määrittämiseksi, kumpi kahdesta palasesta oli kloonautunut. Ei-toi-10 vottu pala sisälsi Clal-paikan, niin että Clal/Xbal-kaksois-hydrolyysi tuottaisi suunnilleen 560 ep.-sia + 2400 ep:sia palasia, kun taas oikea palanen tuotti lineaarisen 3 ke.-tä sisältävän palasen Clal/Xbal-hydrolyysissä. Kandidaatit hydrolysoitiin EcoRI:n ja Xbal:n kanssa, jolloin saatiin 600 15 ep.-a + 2400 ep.-a sisältäviä palasia. Yksi sellainen klooni puhdistettiin suuressa mittakaavassa, ja sitä nimitettiin koodilla pHS2-B. Tämä sisältää EcoRI-paikan viimeisen kodonin jälkeen täydellisen preS3-geenin C-terminaalisella alueella.
20 B. PreSs-geenin keskiosa
PreSz-geenin keskiosa kloonattiin seuraavasti. Plasmidi AM6 hydrolysoitiin Xbal:n ja BamHI.-n kanssa, ja 250 ep.-a sisältävä palanen eristettiin 0,8-%.-sta preparatiivisesta agaroosi-geelistä. Tämä pala (50 ng) ligoitiin kuten edellä on kuvail-25 tu 50 ngraan plasmidia pUC18, joka oli hydrolysoitu Xbalrn ja BamHI.-n kanssa, ja def osforyloitiin. Ligaatioreaktiota käytettiin transformoitaessa E. colin kanta MC1061 ampisilliinille resistentiksi kuten edellä. Pienimittaiset valmisteet hydrolysoitiin BamHI:llä, ja ne, jotka sisälsivät 2,7 30 ke:sen palasen, valittiin. Yhtä isolaattia kasvatettiin suu-ressa mitassa, ja DNA eristettiin ja puhdistettiin kuten on « kuvailtu. Tätä kloonia nimitetään koodilla pPSl. Klooni katkaistiin EcoRI:llä ja BamHI:llä, ja vektorivyöhyke eristettiin ja puhdistettiin 0,8-%:sen preparatiivisen agaroosigee-35 lielektroforeesin avulla. Tähän vektoriin liitettiin seuraavanlainen kinaasilla käsitelty kaksijuosteinen oligonukleoti- 104639 32 di, joka oli syntetisoitu kuten edellä:
EcoRI PstI BamHI 5’ AATTCAATCCGTCTGCAG 3' 5 3’ GTTAGGCAGACGTCCTAG 5'
Ligaatioreaktiota käytettiin transformoitaessa E. coli MC1061 ampisilliinille resistentiksi. Pienen mitan valmisteet karakterisoitiin Pstl-hydrolyysin avulla. Yksi klooni, joka sisäl-10 si 250 ep.-sen Pstl-palan, valittiin, suurimittainen DNA-pre-parointi suoritettiin, ja plasmidi pPS2 eristettiin.
C. PreS3-geenin N-terminaalinen osa N-terminaalinen alue, joka käsitti EcoRI-linkkerin ja kol-15 meatoista ensimmäistä aminohappoa koodittavat sekvenssit, muodostettiin synteettisestä oligonukleotidista, joka sisälsi seuraavan sekvenssin, joka oli syntetisoitu kuten edellä:
Hindlll EcoRI PstI
. 20 5’ AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA 3' 3’ ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAG 5’ Tämä palanen sisälsi Hindlll- ja Pstl-päät, kuin myös ATG:tä edeltävän EcoRI-sekvenssin. Tämä sekvenssi kloonattiin Hin-25 dlll.-lla ja Pstl.-llä hydrolysoituun ja defosforyloituun plas-' ' midiin pUC18, ligoimalla kymmenkertainen ylimäärä oligoa vektoriin, ja karakterisoimalla transformantit pienen EcoRl-paikan (noin 75 ep) läsnäolon perusteella. Sellaista kloonia merkittiin koodilla pTBO-2A.
30
, Geenin keskiosa lisättiin hydrolysoimalla vektori pTBO-2A
* Pstl.-llä ja Xbal:llä; liitännäinen oli 250 ep: nen Pst-Xba- pala pPS2:sta. Transformantit karakterisoitiin >300 ep:sen EcoRI-palan kuin myös 290 ep:sen Xbal/Hindlll-palan läsnäolon 35 perusteella. Oikeaa isolaattia nimitettiin koodilla pTBO-3.
Kokonainen preS=-geeni saatiin aikaan liittämällä Hindlll/- 33 104639
Xbal-pala pTBO-3:sta Xbal/Hindlll:11a hydrolysoituun pHS2B:-hen. Ampisilliinille resistentit transformantit karakterisoitiin kuten edellä 825 ep.-sen EcoRI-palan läsnäolon perusteella. Tätä rakennetta nimitettiin koodilla pTB04.
5
Esimerkki II
Vektorin pTB05A konstruointi
Vektori, joka sisälsi geenin, joka koodittaa preS=:ta, konstruoitiin vektoreista pAO804 ja pTB04 (esimerkit V ja I, vas-10 taavasti). 2 pg plasmidia pA0804 hydrolysoitiin EcoRI:llä kuten edellä ja käsiteltiin alkaalisella fosfataasilla 30 pl.-n reaktiotilavuudessa (1 U entsyymiä 37eC:ssa 1 tunnin aikana 50 mM Tris.HClrssä pH 9,0, joka sisälsi 1 mM MgCl=:a, 100 pM ZnCl=:a, 1 mM spermidiiniä). pTB04 hydrolysoitiin Eco-15 RI:llä, ja 825 ep.-a sisältävä palanen, joka koodittaa preS3-geeniä, irrotettiin. Tämä palanen puhdistettiin käyttäen preparatiivista agaroosigeelielektroforeesia, jossa käytettiin 0,8-%:sta agaroosia. 500 ng palasta ja 50 ng pA0804:ää ligoitiin käyttäen esimerkissä I kuvailtuja menetelmiä. Muo-. 20 dostunutta vektoria käytettiin transformoitaessa MC1061 am pisilliinille resistentiksi, käyttäen esimerkissä I kuvailtua menetelmää. DNA eristettiin käyttäen Birnboimin ja Dolyn menetelmää [Nucleic Acids Research 7:1513 (1979)] ja karakterisoitiin hydrolysoimalla Pstl.-llä. Kloonista, joka sisälsi 25 2,1 ke:sen Pstl-palan, määritettiin liitännäinen oikeassa orientaatiossa, ja sitä merkittiin koodilla pTB05A.
Esimerkki III
pTB047-templaatin konstruointi 30 1 pg kaksijuosteista ml3mpl8-DNA:ta (esimerkistä I) hydro- . ·, lysoitiin EcoRI:llä ja defosforyloitiin käsittelemällä vasi- kan suoliston alkaalisella fosfataasilla 30 μΐ.-η reaktiotila-, vuudessa (1 U entsyymiä 37eC:ssa 1 tunnin aikana 50 mM Tris.- HC1:ssä , pH 9,0, joka sisälsi 1 mM MgCl^ra, 100 μΜ ZnCl=:a, 35 1 mM spermidiiniä). 825 ep:a sisältävä EcoRI-palanen, joka ^ sisälsi preSz-geenin, eristettiin pTB04:stä (katso esimerkki 104639 34 I) hydrolysoimalla EcoRI:llä, ja eristettiin sen jälkeen 0,8-%.-sta preparatiivisesta agaroosigeelistä. 50 ng ml3mpl8-vek-toria ja 500 ng EcoRI-liitännäistä ligoitiin T4 DNA -ligaa-sin kanssa seuraavasti. Reaktio tapahtui 10 μ1:η tilavuudes-5 sa, joka sisälsi 6,6 M Tris.HCl.-a, pH 7,6, 5 mM MgCl=;a, 5 mM ditiotreitolia, 1 mM ATP:a ja 1 Weissin yksikön T4-ligaa-sia, 1 tunnin aikana 23öc.-ssa.
Ligaatioseosta käytettiin sen jälkeen transformoitaessa E.
10 coli JM103 -soluja, jotka oli tehty kompetenteiksi seuraaval-la tavalla. E. coli JM103 -solujen keskilogaritmivaiheessa oleva kasvusto (50 ml) otettiin talteen sentrifugoimalla kliinisellä Damon IEC DPR600 -sentrifugilla nopeudessa 3000 rpm 5 minuutin aikana 40C:ssa, ja pestiin 10 mM NaCl.-ssa.
15 Viljelmä suspendoitiin uudelleen 25 ml:aan 50 mM CaCl=:a 30 minuutin aikana 0öC:ssa. Solut sentrifugoitiin kuten edellä ja suspendoitiin uudelleen 2 ml:aan 50 mM CaClz;a.
Transformaatiota varten ligaatioreaktio lisättiin 100 ul:aan . 20 kompetenttia solususpensiota ja inkuboitiin 0°C:ssa jäiden päällä 5 minuutin ajan. Solut viljeltiin sen jälkeen pehmyta-gariin, joka sisälsi IPTG:a ja X-gal:a, ja levitettiin LB-alustoille ja inkuboitiin 37eC:ssa yli yön, ja maljoilta seulottiin kirkkaita plakkeja.
25
Sen määrittämiseksi, mitkä plakit sisälsivät liitännäisen oikeassa orientaatiossa, valmistettiin kaksijuosteista DNA:-ta, ja suoritettiin erilliset hydrolysoinnit EcoRI:llä ja Xbal:llä. Liitännäisen initiaattorimetioniinin todettiin 30 olevan M13-yleisalukkeen vieressä, ja sen jälkeen voitiin luoda templaatti, joka sisälsi liitännäisen merkityksettömän ' juosteen. Tätä merkittiin koodilla pTB047.
Esimerkki IV
35 pTBO-6:n ja pHB6:n konstruointi i DNA-sekvenssi, joka koodittaa HBsAgrn (S-muoto) 226 aminohap- 35 104639 poista muotoa, muodostettiin poistamalla 165 ep:a, jotka koodittivat preS=>: n 55 ensimmäistä aminohappoa. Tämä toteutettiin altistamalla templaatti pTB047 (esimerkistä III) M13-alukekohdisteiseen deleetiomutageneesiin, käyttämällä seuraa-, 5 vaa oligonukleotidialuketta:
EcoRI
5' CGGGTACCGAGCTCGAATTCATGGAGAACATCACATCAGG 3' Tämä syntetisoitiin käyttäen Applied Biosystems'in Model 380A 10 DNA -synteesilaitetta käyttäen syaanietyylifosforamidiittike-miaa. Mutageneesi suoritettiin seuraavalla tavalla.
Suurimittainen minipreparointi suoritettiin positiivisilla plakeilla, joita oli inkuboitu suunnilleen 7 tunnin ajan 2 15 ml:ssa LB-alustaa . 25 ml .-aan LB-alustaa siirrostettiin 250 μΐ vastakasvatettuja JM103-soluja. Viljelmää kasvatettiin 1 tunnin ajan, ja siihen siirrostettiin 100 μΐ 7 tunnin ikäistä plakkivi.1 jelmää. Kasvustoa kasvatettiin sen jälkeen yli yön. Kasvusto sentrifugoitiin kahdesti nopeudella 10000 rpm 10 20 minuutin aikana Sorvali RC-5B -roottorissa SS34, supernatan-tin kirkastamiseksi. 3,5 ml 20-%:sen PEG:n/2,5 M NaCl:n liuosta lisättiin kasvustoon, ja sitä inkuboitiin 5 tunnin ajan 4°C:ssa. Kasvustoa sentrifugoitiin sen jälkeen kuten edellä 10 minuutin aikana. Supernatantti hylättiin, ja pelletti 25 suspendoitiin uudelleen 2 ml .-aan TE-puskuria. Pellettiä uutettiin sen jälkeen fenolilla (tasapainotettu TE:llä), uutettiin kerran fenoli/klorof ormilla , uutettiin kahdesti CHCl;, ;-11a ja kerran eetterillä. 8 M LiCl.-a lisättiin loppupitoisuu-den 0,8 M saavuttamiseksi. 3 tilavuuserää etanolia lisättiin, 30 ja liuos jätettiin yöksi seisomaan 20°C:ssa, läsnä olevan DNA:n saostamiseksi. Liuos sentrifugoitiin sitten nopeudella 10000 rpm 10 minuutin ajan, kuten aikaisemmin on kuvailtu, ja huuhdeltiin 70-%:11a etanolilla. Sakka suspendoitiin uudelleen 150 pl:aan 10 mM Tris.HCl.a, pH 7,4.
Yksi pmooli M13-rekombinanttitemplaattia sekoitettiin 20 35 104639 36 pmoolin kanssa oligonukleotidialuketta ja 1 μΐ.-η kanssa liuos A:ta. Tislattua vettä lisättiin, jotta saatiin lopputilavuu-deksi 10 μΐ. Näytettä inkuboitiin 65eC:ssa 5 minuutin ajan, ja lämpötila alennettiin sen jälkeen 37^0: seen 30 minuutiksi. 5
Seuraavia komponentteja lisättiin sen jälkeen näytteeseen: Liuos B 1 lii 10 mM dATP 1 μΐ 10 mM dCTP 1 μΐ 10 10 mM dGTP 1 μΐ 10 mM dTTP 1 μΐ 5u/pl Klenow 2 μΐ tisl. vesi 3 μΐ 20 μΐ 15 ja annettiin inkuboitua 15°C:ssa vähintään 4-6 tunnin ajan.
Näytettä laimennettiin sen jälkeen 1:40 tislatulla vedellä.5 μΐ:aa käytettiin transformoimaan 6 putkea, jotka sisälsivät kompetentteja JM103-soluja (200 μΐ kussakin). Transformoidut 20 JM103-solut maljattiin LB-alustoille pehmytagar pintakerroksena. Positiiviset plakit seulottiin sen jälkeen suodatushy-bridisaatiolla. Hybridisaatiokoetin, joka oli komplementaarinen oligonukleotidialukkeen suhteen, syntetisoitiin kuten edellä on kuvailtu. 15 pmoolia tätä koetinta inkuboitiin 25 65°c.-ssa 10 minuutin aikana kokonaistilavuudessa 25 μΐ. 3 μΐ 10X kinaasipuskuria (Maniatis et ai.), 1 μΐ 10 mM ATP:a, ja 1 μΐ polynukleotidikinaasia (100 U/μΙ) lisättiin. Näytettä inkuboitiin 1 tunnin ajan 37eC:Ssa, ja se ajettiin Sephadex G-50 -kolonnin läpi. Ensimmäinen kolonnista tullut piikki 30 otettiin talteen.
Nitroselluloosasuotimet valmistettiin edellä mainitulla koet-timella hybridisaatiota varten, asettamalla ja suuntaamalla suotimet transformaatiomaljoille 5-10 minuutiksi. Suotimet 35 poistettiin sen jälkeen maljoilta, ja niitä kellutettiin denaturoivan liuoksen pinnalla (1,5 M NaCl, 0,5 N NaOH) 3 37 104639 minuutin aikana, takasivun ollessa liuoksen päällä. Suotimet upotettiin denaturoivaan liuokseen 5 minuutin ajaksi ja siir-. rettiin sen jälkeen neutraloivaan liuokseen (1 M Tris.HCl, pH 8, 1,5 M NaCl) 5 minuutin ajaksi. Neutraloitu suodin siir- 5 rettiin sen jälkeen 2X SSC-liuokseen (IX SSC on 150 mM NaCl:- a, 15 mM Na-sitraattia) 5 minuutin ajaksi. Suodin ilmakuivat-tiin, ja sitä paistettiin 1 tunnin ajan 80eC:ssa vakuumissa. Suotimia esihybridisoitiin 1 tunnin ajan 65e:ssa, saumatussa muovipussissa, joka sisälsi 5 ml hybridisaatiopuskuria, 10X 10 Denhardts:ia (IX Denhardts on 0,02 % Ficoll:ia, 0,02 % poly-vinyylipyrrolidonia, 0,02 % naudan seerumin albumiinia), 0,5 % SDS:a, ja 5X SSPE:a. Puskuri korvattiin 5 ml:lla/suodin tuoretta hybridisaatiopuskuria. Aikaisemmin valmistettua radioaktiivista komplementaarista oligonukleotidia inkuboi-15 tiin ensin 65eC:ssa 5 minuutin ajan, ja sen jälkeen lisättiin riittävä määrä koetinta tuoreeseen hybridisaatiopuskuriin, joka sisälsi suotimen, jotta saatiin 1 x 10®· cpm/ml. Hybridisaatio suoritettiin 5°c.-tta alle koettimen lasketun sula-mislämpötilan 4 tunnin aikana.
20
Suotimia pestiin sen jälkeen kolme kertaa, 10 minuuttia/ kerta, 6X SSC:n kanssa huoneen lämpötilassa. Suotimia pestiin lopuksi yhden kerran 6X SSC:11a hybridisaatiolämpötilassa.
Suotimet asetettiin 3 MM:n Whatman-paperille kuivatettaviksi, 25 ja valotettiin sen jälkeen filmille yön ajaksi (orientaatio merkittynä). Kolme positiivista plakkia poimittiin ja kasvatettiin kukin erikseen 2 ml.-ssa LB-lientä 37^0:553 5 tunnin aikana.
30 Minitemplaattipreparointeja suoritettiin kullakin näistä positiivisista plakeista. Yksi ml plakkiviljelmää siirrettiin • Eppendorf-putkeen ja sentrifugoitiin 5 minuutin aikana Eppen- dorf Model 5414 -sentrifugilla. 800 μΐ supernatanttia otettiin talteen, ja 200 ui 20-%.-sta PEG:iä/2,5 M NaCl.-a lisät-35 tiin siihen. Supernatanttia inkuboitiin sen jälkeen huoneen lämpötilassa 10 minuutin ajan ja sentrifugoitiin 10 minuuttia r 104639 38
Eppendorf-sentrifugissa. Supernatantti poistettiin aspiroi-malla, ja pelletti liuotettiin uudelleen 200 μΐ.-aan TE:a (10 inM TriS:a, pH 7,4; 1 mM EDTA: a) . Uudelleenliuotettu pelletti uutettiin sen jälkeen fenoli/kloroformilla, ja ylemmän vesi-5 faasin sisältämä templaatti-DNA saostettiin lisäämällä LiCl-liuosta, kunnes saavutettiin 0,8 M LiCl-pitoisuus. 2,5-3 tilavuusosaa etanolia lisättiin, ja näyte saostettiin kuivan jään päällä 5 minuutin aikana. Saostumaa sentrifugoitiin 10 minuutin ajan, kuten edellä on kuvailtu. Lopulliseksi tila-10 vuudeksi säädettiin 150 μΐ TE:llä.
200 μΐ kompetentteja JM103-soluja transformoitiin talteenote-tulla DNA :11a. 1 μΐ eristetyn fagi-DNA.-n 1/10-laimennusta käytettiin transformointiin. Transformaatioseos viljeltiin, 15 ja plakit seulottiin oligonuleotidin kanssa, kuten aikaisemmin on kuvailtu.
Suuren mitan minipreparointi suoritettiin positiivisilla plakeilla, joita oli inkuboitu suunnilleen 7 tunnin ajan 2 . - 20 ml.-ssa LB-alustaa. 25 ml: aan LB-alustaa siirrostettiin 250 μΐ vasta kasvatettuja JM103-soluja. Viljelmää kasvatettiin yhden tunnin ajan, ja siihen siirrostettiin 100 μΐ 7 tunnin ikäistä plakkikasvustoa. Viljelmää kasvatettiin sen jälkeen yli yön ja sentrifugoitiin sen jälkeen kahdesti nopeudella 25 lOOOOrpm 10 minuutin ajan Sorvali RC-5B -sentrifugin SS34-' roottorissa, supernatantin kirkastamiseksi. 3,5 ml 20-%:ta PEG:iä/2,5 M NaCl:a lisättiin viljelmään, ja sitä inkuboitiin 5 tuntia 4°C:ssa. Kasvusto sentrifugoitiin sen jälkeen kuten edellä 10 minuutin aikana. Supernatantti heitettiin pois, ja 30 pelletti suspendoitiin uudelleen 2 ml:aan TE-puskuria. Pel-. lettiä uutettiin sen jälkeen fenolilla, tasapainotettiin *’ TE:llä, uutettiin kerran fenoli/kloroformilla, uutettiin kahdesti CHCl3.-lla ja kerran eetterillä. 8 M LiCl:a lisättiin, jotta saataisiin loppupitoisuudeksi 0,8 M. Kolme tila-35 vuusosaa etanolia lisättiin, ja liuos jätettiin seisomaan yli yön, läsnä olevan DNA:n saostamiseksi. Liuosta sentrifu- 39 104639 goitiin 10 minuutin ajan nopeudessa 10000 rpm kuten aikaisemmin on kuvailtu, ja huuhdeltiin 70-%:lla etanolilla. Sakka suspendoitiin uudelleen 150 μΐ:aan 10 mM Tris:a (pH 7,4).
, 5 Positiiviset pesäkkeet identifioitiin pesäkehybridisaation avulla [Grunstein ja Hogness, PNAS 72,3961 (1975)] ja sekven-soitiin käyttäen dideoksisekvensointia niiden M13-rakenteiden löytämiseksi, jotka sisälsivät oikean mutaation. RF-DNA otettiin talteen käyttäen alkaalista hajotusmenetelmää, Maniatis 10 et ai. 678 ep:a sisältävä EcoRI-palanen eristettiin 0,8-%:-sella preparatiivisella agaroosigeelillä ja subkloonattiin plasmideihin pA0804 ja pA0811 (katso esimerkit V ja VI, vastaavasti). E. coli MC1061 -soluja transformoitiin kummallakin näistä kahdesta vektorista, kuten on kuvailtu esimerkissä I. 15 Transformantit, jotka sisälsivät oikean orientaation, identi fioitiin pienen mitan DNA-valmisteiden Xbal-hydrolyysillä (myös kuvailtu esimerkissä I). Toista transformanttia, joka saatiin pAO804:stä, nimitettiin koodilla pTB06; pA0811-pe-räistä transformanttia nimitettiin koodilla pHB6.
. 20
’ Esimerkki V
pA0803 : n ja pAO804.-n konstruointi pA0804 on vektori, joka kykenee paikkaspesifiseen P. pastoris AOX1 -lokuksen katkaisemiseen. Se sisältää seuraavat elemen-25 tit: AOXl-promoottori ja kopioinnin lopettaja, joita erottaa erikoinen EcoRI-kloonauspaikka; villityyppisen Pichian HIS4-geeni; genominen DNA-osa AOXl-lokuksen 3'-päästä kopioinnin lopettajan alapuolella; sekvenssit, jotka ovat välttämättömiä valikointiin ja replikointiin bakteeri-isännässä. Komponentit 30 ovat järjestyneet siten, että vektorin restriktiohydrolysaa-tista vapautuu DNA-palanen, joka sisältää ekspressiokasetin ' ja selektoitav^n markkerin, joiden päät ovat homologisia genomin jatkuvan osan, AOXl-lokuksen, suhteen, ja ne voidaan pysyvästi liittää kromosomiin transformaation aikana.
pAO804 on hepatiitti B.-n pinta-antigeeniekspressioplasmidin 35 104639 40 pBSAGI5I johdannainen (NRRL 18021). Se koottiin pBR322-peräi-seen plasmidiin, joka sisälsi seuraavat modifikaatiot. pBR322 hydrolysoitiin EcoRI:llä, mitä seurasi fenoliuutto ja etano-lisaostus. Päät täytettiin sen jälkeen käyttäen Klenow-poly-5 meraasia. 2 pg EcoRI-hydrolysoitua plasmidia pBR322 inkuboi-tiin huoneen lämpötilassa 15 minuutin aikana 25 μΐ.-η reak-tiotilavuudessa, joka sisälsi 50 mM Tris.HCl:a, pH 7,2, 10 mM MgSO^:a, 100 μΜ ditiotreitolia, 50 pg/ml naudan seerumin albumiinia, 100 μΜ dATP.-a, 100 μΜ dTTP:a ja 1 yksikön Klenow-10 polymeraasia. Fenoliuuton ja etanolisaostuksen jälkeen DNA ' ligoitiin plasmidin sulkemiseksi, ja ligaatioreaktiota käy tettiin transformoitaessa E. coli MC1061. Transformantteja seulottiin EcoRI-paikan puuttumisen suhteen, kuin myös diagnostisten paikkojen, kuten esimerkiksi PstI, PvuII ja Sali, 15 suhteen. Sellaista plasmidia nimitettiin koodilla pBR322-RI.
Tätä plasmidia modifioitiin edelleen Bglll-paikan sisällyttämiseksi PvuII-paikkaan. Plasmidi hydrolysoitiin PvuII:11a, ja fosforyloituja Bglll-linkkereitä (GAGATCTC) lisättiin 20 tasapääligaatiossa. Linkkeriylimäärä poistettiin yli yön kestäneellä Bglll-hydrolyysillä, ja plasmidi suljettiin jälleen käyttäen T4 DNA -ligaasia. Ligaatioreaktiota käytettiin transformoitaessa E. coli MC1061 ampisilliinille resistentiksi. Transformantit karakterisoitiin restriktiohydrolyysillä 25 BglII:n kanssa Bglll-paikan läsnäolon osoittamiseksi, ja «
Sall/Bglll-hydrolyysillä, mikä osoitti, että Bglll-paikka oli entisessä PvuII-paikassa. Tätä plasmidia merkittiin koodilla pBR322 BglII-Rl.
30 pA0804 ja pA0811 muodostettiin poistamalla DNA-palasia pBSA- GI5I:sta, ja kokoamalla ne pBr322 BglII-RI:een. AOXl-lokuksen ’ 3’-pään kohdesegmentti poistettiin pBSAGI5I:stä 700 ep:sena
Bglll/XhoI-palana, josta 50 ng liitettiin 5 ng.-aan kantaplas-midia, jota oli hydrolysoitu Sall.-llä ja BglII:lla. Ligaa-35 tioreaktiota käytettiin transformoitaessa E. coli MC1061 ampisilliinille resistentiksi. Transformantit karakterisoi- 104639 41 täin pienessä mitassa tehdyn DNA.-n BamHI/Bglll-hydrolysaatin avulla, kuten on kuvailtu esimerkissä I,' siten että suunnil-, leen 900 ep:a sisältävä pala todettiin. Yksi sellainen trans- formantti valittiin, ja DNA puhdistettiin suuressa mitassa.
5 Sellaiselle plasmidille annettiin nimi pA0801.
Plasmidi pBSAGISI hydrolysoitiin Clal:llä, ja 2,1 ke:nen palanen, joka sisälsi promoottori-geeni-terminaattori -eks-pressiokasetin, eristettiin. 2 Mg plasmidia pA0801 hydroly-10 soitiin Clal:llä ja käsiteltiin alkaalisella fosfataasilla 30 μΐ.-η reaktiotilavuudessa (1 U entsyymiä 37°C.-ssa 1 tunnin aikana 50 mM Tris.HOI:ssä, joka sisälsi 1 mM MgCl2:a, 100 μΜ ZnCl=:a, 1 mM spermidiiniä). 50 ng Clal-palasta liitettiin 5 ng:aan pA0801-vektoria, ja ligaatioreaktioseosta käytettiin 15 transformoitaessa E. coli MC1061 ampisilliinille resistentiksi. Nämä pesäkkeet karakterisoitiin Bglll-hydrolyysillä sen varmistamiseksi, että pala oli liittynyt ja oli oikeassa orientaatiossa, antaen 2,3 ja 2,7 kiloemäksisten palasten spektrin. Tätä yksinkertaista transformanttia nimitettiin 20 koodilla pA0802.
Plasmidi pAO802 hydrolysoitiin tunnusomaisessa Stul-paikassa hepatiitti B:n pinta-antigeenin geenin 3'-päässä. EcoRI-link-kerit fosforyloitiin, yhdistettiin ja ligoitiin Stul:llä 25 hydrolysoituun plasmidiin. Linkkeriylimäärä poistettiin yli « yön kestäneellä EcoRI-hydrolyysillä. EcoRI-hydrolyysi katkaisee myös HBsAg-rakennegeenin 5'-päässä, poistaen siten geenin. Ligoitaessa uudelleen, promoottori ja kopioinnin ter-minaattori yhdistettiin tunnusomaisen EcoRI-paikan avulla.
30 Ampisilliinille resistentit transformantit karakterisoitiin . ·, taas Bglll-hydrolyysin avulla, ja transformantti, joka sisäl- si oikean spektrin {2,3 & 2,1 ke:tä) identifioitiin, ja sitä nimitettiin koodilla pA0803. 1
Plasmidi pAO803 hydrolysoitiin BamHIrllä, ja 2,7 ke:stä sisältävä pala pYM10:stä (kuvio 8) eristettiin preparatiivisel- 104639 42 la agaroosigeelielektroforeesilla ja liitettiin BamHI:llä hydrolysoituun defosforyloituun plasmidiin pA0803. [pYMlO on plasmidin pYJ30 (NRRL B-15890) johdannainen, BamHI-paikan asemassa 2959 ollessa tuhoutunut]. Transformant!t karakte-5 risoitiin Xbal-paikan läsnäolon suhteen , tuottaen 7,4 ke:sen palasen ja 2,3 ja 5,1 ke:sen Bglll-spektrin. Tätä plasmidia nimitettiin koodilla pA0804.
Esimerkki VI
10 pA0811:n konstruointi
Toinen asiaan liittyvä plasmidi, joka sisältää Saccharomyces ARG4 -geenin Pichia HIS4 -geenin asemesta, konstruoitiin myös. Yksi mahdollinen ARG4-geenin lähde on 2,0 ke:nen Hpal-palanen, joka on saatu pYM25:stä, plasmidi E. coli-isännässä 15 NRRL B-18015. Tämä plasmidi on saatavissa the Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture’sta, Peoria, Illinois.
Pala puhdistettiin 0,8-%:sta preparatiivisesta agaroosigee-< 20 listä. 500 ng palasta liitettiin 50 ng:aan BamHI:llä hydrolysoitua, täytettyä plasmidia pAO803 (katso esimerkki V).' ' Ligaatioreaktiota käytettiin transformoitaessa E. coli MC1061 ampisilliinille resistentiksi. Transformantit karakterisoitiin Bglll-hydrolyysin avulla, ja oikea inserttikoko varmis-25 tettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Tätä plasmidia nimi-tettiin koodilla pA08ii.
Esimerkki VII
Hiivan pienessä mitassa preparoitu DNA
30 10"* solua/ml kasvatettiin 5 ml: ssa YPD.-tä 30°C:ssa yli yön, *. ja pelletoitiin käyttäen kliinistä Damon IEC DPR600 -sentri- « fugia nopeudella 3000 rpm 5 minuutin ajan. Pelletti suspen-doitiin uudelleen 0,5 ml:aan 1 M sorbitolia, 0,1 ml:aan 0,5 M EDTA:a, pH 7,5, ja näyte siirrettiin 1,5 ml:n mikrofugiput-35 keen. 0,02 ml 2,5 mg/ml Zymolyase 60000 (Miles Laboratories)-- liuosta lisättiin, ja näytettä inkuboitiin 37°C:ssa 60 minuu- 104639 43 tin ajan. Solut pelletoitiin käyttäen raikrofugia 1 minuutin ajan suurella nopeudella, ja suspendoitiin uudelleen 0,5 ml: aan 50 raM Tris.HCl:a pH 7,4 ja 20 mM EDTA.-a. 0,05 ml 10-%:sta SDS:ää lisättiin, näyte sekoitettiin, ja sitä inkuboi-• 5 tiin öS^C.ssa 30 minuutin ajan. 0,2 ml 5 M kaliumasetaattia, ja näytettä inkuboitiin jäiden päällä 60 minuuttia. Näyte sentrifugoitiin jälleen mikrofugissa suurella nopeudella 5 minuutin ajan.
10 Supernatantti siirrettiin uuteen 1,5 ml:n mikrofugiputkeen, ja 1 tilavuusosa isopropanolia lisättiin huoneen lämpötilassa. Näytettä sekoitettiin, ja sen annettiin seistä huoneen lämpötilassa 5 minuuttia, sen jälkeen sitä sentrifugoitiin hyvin lyhyesti (10 sekuntia) mikrofugissa suurella nopeudel- 15 la. Supernatantti kaadettiin pois, ja pelletti ilmakuivat-tiin. Kun pelletti oli suspendoitu uudelleen 0,3 ml:aan 10 mM Tris.HCl.-a, pH 7,4 ja 1 mM EDTA:a, lisättiin haiman 1 mg/ml RNaasi-liuosta, ja näytettä inkuboitiin 37°C:ssa 30 minuuttia. 0,03 ml 3 M natriumasetaattia lisättiin, näyte ' 20 sekoitettiin, ja 0,2 ml isopropanolia lisättiin. Näyte sent rifugoitiin mikrofugissa suurella nopeudella DNA:n pelletoi-miseksi. Supernatantti kaadettiin sen jälkeen pois, pelletti kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen 0,1-0,3 ml:aan 10 mM Tris.HCl.-a, pH 7,4 ja 1 mM EDTA:a. (Huomattakoon: ennen DNA: n 25 käyttämistä restriktiohydrolyysissä, voi olla tarpeellista ' ’ ' sentrifugoida liuosta 15 minuuttia suurella nopeudella mikro fugissa, kaiken liukenemattoman aineen poistamiseksi, joka voi inhiboida hydrolyysiä).
30 Esimerkki VIII
Sekapartikkelikantojen kehittäminen «
Kaksi sekapartikkelikantaa, jotka sisälsivät ekspressiokaset-teja, jotka koodattavat hepatiitti B:n pinta-antigeenin S (p24)- ja preS3 (p31)-muotoja, konstruoitiin seuraavasti.
35 Pichia pastoris PPF1 (arg4 his4) transformoitiin 1 ug:lla katkaisematonta pHB6-plasmidia, käyttäen Creggin et ai. ku- 44 104659 vailemaa sferoplastitransformaatiotekniikkaa, Bio/Technology 5, 479 (1987). (pHB6 on pA0811-plasmidin subklooni, joka sisältää S-geenin, jota on kuvailtu esimerkeissä IV ja VI). Transformantit, jotka osoittivat arginiiniprototrofiaa, re-5 generoitiin minimaalialustoilla, jotka sisälsivät histidii-niä, ja seulottiin integraatiokohdan suhteen seuraavasti.
Näiden transformanttien ja villityyppisen Pichia pastoriksen DNA:ta preparoitiin, kuten on kuvailtu esimerkissä VII, hyd-10 rolysoitiin EcoRI:llä, ja elektroforesoitiin 0,8-%:lla aga-roosilla. Näiden DNA-preparaattien Southern-blottaukset suoritettiin (Maniatis et ai. 1983), ja suotimet hybridisoitiin AOXl-spesifisen koettimen (pPG4,0 NRRL no. 15868) kanssa tai HIS4-spesifisen koettimen (pYM4) kanssa. pYM4:ää on kuvattu 15 esimerkissä I.
Integraatiopaikka määritettiin vertailemalla tietyn transfor-mantin hybridisaatiospektriä villityyppiseen kantaan. Kaikki muutokset villityyppisen vyöhykkeen koossa olivat osoituksena 20 integraatiosta siinä lokuksessa. Transformanttia, joka sisälsi integraation AOXl-lokuksen 5'-päässä, ja silti sisälsi villityyppisen AOXl-geenin, kuin myös HIS4-mutaation, nimitettiin koodilla PPFl/pHB6.
25 Tähän kantaan transformoitiin sen jälkeen Bglll-katkaistu • « ' ' pTB05A (esimerkistä II), kuten edellä on kuvailtu. Transfor- mantit, jotka osoittivat histidiiniprototrofiaa, regeneroitiin minimaalialustoilla ja seulottiin "metanolihidas" (Mut-) -fenotyypin suhteen, mikä osoitti AOXl-lokuksen integ-30 raation. Fenotyyppiseulonta suoritettiin seuraavalla tavalla.
• Transformantit kerättiin yhteen raapimalla maljan pintaa steriilin tislatun veden läsnä ollessa, ja niitä sonikoitiin pienellä teholla 15 sekunnin ajan. Ne laimennettiin myöhemmin 35 Aeoo-arvoon = 0,1 ja siirrostettiin rinnakkaislaimennuksina = 10-3 ja 10-* minimaalimaljoille, jotka sisälsivät glyserolia t 45 104639 hiilenlähteenä, ja niitä inkuboitiin 30°C:ssa 2-3 päivää.
Sen jälkeen ne toistomaljättiin minimaalimaljoille, joihin lisättiin 100 μΐ raetanolia höyryfaasissa. 24-tuntisen inku-boinnin jälkeen 30°C:ssa oli ilmeistä, että 10-20 % transfor-, 5 mänteistä kasvoi hitaammin metanolilla kuin muut transforman- tit. Kymmenen näistä hitaasti kasvavista pesäkkeistä valikoitiin sen jälkeen analysoitaviksi edelleen. Ne poimittiin minimaalimaljalta, joka sisälsi glyserolia, niitä kasvatettiin ravistelupulloissa, kuten on kuvailtu esimerkissä IX, 10 ja niistä määritettiin 22 nm.-ä vastaavan partikkelin aktiivisuus, kuten on kuvailtu esimerkissä XI. Transformantit karakterisoitiin, kuten on kuvailtu edellä pHB6:n osalta. Yhtä muodostettua kantaa nimitettiin koodilla PPFl/pTB012-l, ja se ilmensi yhden kopion sekä p24- että p31-proteiineja.
15
Toinen kanta identifioitiin, joka oli integroinut kaksi kopiota preSss-ekspressiokasetista. Sitä nimitettiin koodilla PPFl/pTB012-2, ja se ilmensi kahta kopiota preS=-geenistä, ja yhtä kopiota S-geenistä.
20
Partikkeliekspressiotasot esitetään taulukossa 3.
Taulukko 3 Partikkeliekspressiotasot
Kanta_Kasetti Proteiinit (AUSRIA™) 25 PPFl/pTB012-l 1 preSz p31 noin 150-200 pg partikke- lia/ml lysaattia 1 S p24 PPFl/pTB012-2 2 preSÄ p31 noin 150-200 pg partikke- lia/ml lysaattia 30 IS p24
Lisäksi, SDS/PAGE-analyysi ja osittain puhdistetun proteiinivalmisteen hopeavärjäys osoittivat sekä p24:n että p31:n läsnäolon.
35 46 1046-39
Esimerkki IX
Ravistelupulloekspressiokokeet
Ennen fermentointia kaikkia kantoja kasvatettiin ravistelu-pulloissa seuraavasti, ekspressiotasojen varmistamiseksi.
5 Transformantti siirrostettiin tavanomaisesti 0,67-%:seen hiivan typpiperusalustaan, joka sisälsi 2-5 % glyserolia, ja sitä kasvatettiin yli yön 30°C.-ssa keski- myöhäislogaritmi-seen vaiheeseen. Solut kerättiin sen jälkeen talteen sentri-fugoimalla, käyttäen kliinistä Damon IEC DPR600 -sentrifugia 10 nopeudella 3000 rpm 5 minuutin ajan. Pellettiä pestiin steriilissä vedessä kahdesti, se siirrostettiin sen jälkeen tiheydessä 0,5 Ae.0o-yksikköä/ml fosfaattipuskuroituun 0,67-%: seen YNB:hen, joka sisälsi 1 % metanolia, ja sitä kasvatettiin 4-6 päivää 30eC:ssa kohtalaisessa sekoituksessa. Eri 15 ajankohtina poistettiin näyte-eriä, jotka sisälsivät 50 A60o-yksikköä, ja niitä säilytettiin -20°C:ssa. Näistä näyte-eristä valmistettiin proteiiniuutteita käytettäviksi AUSRIA™ (katso esimerkki XI(- ja Western blot-analyyseihin [Towbin et ai. PNAS 76, 4350, (1979)]. Vasta-aine oli Calbiochem'in 20 Lot no. 702106, käytettynä 1.-1000-laimennoksena. Solueriä (100 Αβ,οο-yksikköä) siirrettiin borosilikaattisiin kasvatus-putkiin, 13 x 100 mm, ja niitä pestiin kahdesti sentrifugoi-malla Sorvali Model RC-5B:ssä nopeudella 12000 rpm, 4°C:ssa 20:llä tilavuusosalla hajotuspuskuria [0,5 M NaCl:a, 0,1 % 25 Triton X-lOO.-a (w/v) , 1 M fenyylimetyylisulfonyylifluoridia • · ja 10 mM natriumfosfaattia, pH 7,5). Solunäytteet suspendoi-tiin uudelleen 0,5 gramman kanssa happopestyjä lasihelmiä (0,5 mm) plus 0,35 ml hajotuspuskuria, ja niitä sekoitettiin kahdeksan sekoituskertaa yhden minuutin intervallein maksi-30 minopeudella, käyttäen pyörresekoittajaa. Intervallien välissä seosta jäähdytettiin jäissä vähintään yhden minuutin ajan. Sen jälkeen kun hajotus oli lopetettu, rikottu solususpensio poistettiin, ja lasihelmet pestiin 0,35 ml:lla hajotuspuskuria. Kyseiset kaksi liuosta yhdistettiin sen jälkeen ja sent-35 rifugoitiin, käyttäen Sorvali RC-5B:tä nopeudella 13000 rpm, , 4°c:ssa, solujäänteiden poistamiseksi. Proteiininäytteet 47 104639 määritettiin sen jälkeen AUSRIA™- ja Western blot-analyy-seillä. Proteiinipitoisuus määritettiin Lowryn menetelmällä TCA-saostuksen jälkeen.
5 Esimerkki X
Fermentointiekspressiokokeet
Fermentaatiot suoritettiin seuraavasti. Viiteensataan ml:aan Yeast Nitrogen Base (YNB)-alustaa + 2 % glyserolia Fernbachin pullossa siirrostettiin ymppiviljelmää tai minimaaliglukoo-10 simaljaviljelmää. (Maljoja voidaan säilyttää siirrostaen kuukausittain ilman havaittavaa kannan degeneroitumista).
Yhden ravistelupäivän jälkeen nopeudella 200 rpm 30°C:ssa, ymppi siirrostettiin 7,5 litraan minimaalialustaa (taulukko 4), joka sisälsi 480 g glyserolia, 40 mg biotiinia, ja 40 ml 15 hivensuolaliuosta (taulukko S). Fermentoria pidettiin 30°C:- ssa ja pH:ssa 5,5 viljelmän kasvaessa panoskasvatuksena, kunnes glyseroli kului loppuun (noin 24 tuntia). pH:ta säädettiin lisäämällä NH^-kaasua. Glyserolin loppuminen havaittiin C03;n kehittymisen äkkinäisenä laskemisena ja liuenneen 20 hapen terävänä kohoamana (tai hapenottonopeuden laskuna).
Metanolin syöttö aloitettiin nopeudella 18 ml/h, fermentori-pitoisuuden saattamiseksi tasolle noin 0,5 % MeOH:a saakka, ja sitä pidettiin tällä tasolla. Virtausnopeutta säädettiin perustuen metanolin todelliseen kulutusnopeuteen. Hivensuolo-25 ja lisättiin kahdenkymmenen ml:n erissä suunnilleen kahden päivän välein metanolin kulutusnopeuden ylläpitämiseksi.
HBsAg:n taso lisääntyi suunnilleen 7-8 päivää metanolisyötön aikana.
30 35 ΛΒ 104639
Taulukko 4
Alustan koostumus (7.5 litraa) > «480 g glyserolia 40 mg biotiinia 5 134 ml H3PCW:ää (85 %) 5,8 g CaSCU.2H=0:ta 92 g H=SCu:ää 75 g MgSCU.7H30:ta 21 g KOH:ia 10
Taulukko 5 IMx-hivensuolaliuos Kuprisulfaatti.5Ha0 0,06
Kaliumjodidi 0,08 15 Mangaanisulfaatti.Η=θ 0,30
Natriummolybdaatti 0,20
Boorihappo 0,02
Sinkkisulfaatti.HÄ0 2,00
Ferrikloridi.HzO 4,8 20 Rikkihappo 5,00 ml/litra
Esimerkki XI
AUSRIA™-RIA-menettelyohje
Abbott'in AUSRIA™-määrityspakkausta käytettiin Pichian tuo-25 tantosysteemin avulla syntetisoituneen HBsAg.-n määrän määrit- » · :: tämiseksi. Pakkauksen sisältämä vasta-aine sitoutuu HBsAg- partikkeleihin, ei HBsAg-monomeereihin. Kaikki laimennukset tehtiin 1,0-%.-seen BSA.-han, 0,02-%:seen Na-atsidiin fosfaat-tipuskuroidussa saliinissa, pH 7,4. Noudatettu menettely 30 vastasi pääasiallisesti pakkausohjeissa selvitettyä ohjetta. Standardikäyrä valmistettiin seuraavasti .
35 104639 49 r* ί
Putki no. ng määrityksessä Puskuria(ui) Posit, kontr.(ul) I- 4 ei NSB:tä ei 200 vain puskuria 5-6 0,1 195 5 7-8 0,2 190 10 5 9-10 0,5 175 25 II- 12 1,0 150 50 13-14 2,0 100 100 15-16 3,0 50 150 17-18 4,0 ei 200 10
Mikrotiitterilevyn kaivoja merkittiin seuraavasti
AA BB CC DD
1 12 3 4 15 2 5 6 7 8 3 9 10 11 12 4 13 14 15 16 5 17 18 19 20 jne...
20 Jokaiseen kaivoon lisättiin ensin helmet, sen jälkeen puskuri, ja lopuksi standardi (positiivinen kontrolli) tai laimennettu näyte. Tuntemattomat laimennettiin, niin että saatiin : signaalit standardikäyrän alueelle. Näytepitoisuuksien estimaatit mg/ml:na jaettiin tyypillisesti 0,02:11a, jotta saa-25 tiin käytettävä laimennus. Tavallisesti lisättiin 100 μΐ näytettä kaivoon, joka sisälsi 100 μΐ puskuria. Kaivot peitettiin, ja tarjotinta kopautettiin kevyesti työtasoa vasten.
Näytteitä inkuboitiin sen jälkeen yli yön huoneen lämpötilassa, maksimaalisen sitoutumistehon saavuttamiseksi. Seuraavana 30 aamuna jokainen kaivo pestiin 4 kertaa deionisoidulla vedel-- \ lä, käyttäen Pentawash-systeemia, jonka oli toimittanut Abbott Labs. 200 μΐ 13SJ anti-HBs.-ää lisättiin jokaiseen kai- r voon, tarjotinta kopautettiin kevyesti, ja sitä inkuboitiin sen jälkeen 45°C:sessa vesihauteessa 1 tunnin ajan. Helmet 35 pestiin kuten edellä ja laskettiin. Tuntemattomien pitoisuudet määritettiin standardikäyrältä.
t «
Claims (10)
1. Menetelmä antigeenisten HBV-partikkelien tuottamiseksi, jotka sisältävät pääasiallisesti S- ja preS2-proteiineja, Pichia pastoris -kannasta, tunnettu siitä, että se käsittää 5 (a) Pichia pastoris -kannan transformoinnin ensimmäisellä ekspressiokasetilla, joka sisältää hepatitis B -viruksen S-proteiinin rakennegeenin, toiminnallisesti kytkettynä 5'-säätelyalueeseen, joka on valittu Pichia pastoriksesta eristetystä AOX1 5'-säätelyalueesta tai 10 DHAS 5'-säätelyalueesta ja Pichia pastoriksen 3'-pään lopetussekvenssin; ja (b) Pichia pastoris -kannan transformoinnin toisella ekspressiokasetilla, joka sisältää hepatitis B -viruksen preS2-proteiinin, toiminnallisesti kytkettynä 5'-sääte- 15 lyalueeseen, joka on valittu Pichia pastoriksesta eris tetystä AOX1 5'-säätelyalueesta tai DHAS 5'-säätelyalueesta, ja Pichia pastoriksen 3'-pään lopetussekvenssin; ja sen jälkeen (c) muodostuneen transformoidun Pichia pastoris -kannan 20 viljelyn sopivissa olosuhteissa, jotta saadaan aikaan mainittujen HBV-partikkelien tuotanto.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu transformaatio suoritetaan vähintään yhden 25 vektorin kanssa, joka valikoidaan ryhmästä, johon kuuluu plasmideja tai lineaarisia, yhdistäviä paikkaspesifisiä vektoreita.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu sii-30 tä, että vektorit ovat yhdistäviä.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään a) ensimmäistä yhdistävää paikkaspesifistä vektoria, joka 35 sisältää seuraavan sarjamaisen järjestyksen: i) ensimmäinen liitettävä DNA-palanen, ii) markkerigeeni ja vähintään yksi ekspressiokasetti, joka sisältää preS2:n rakennegeenin, toiminnallisesti kytket- Ί 51 104639 tynä säätelyalueeseen ja 3'-pään lopetussekvenssiin, ja iii) toinen liitettävä DNA-palanen, jossa markkerigeenin ja komponentin (ii) kasetin keskinäistä järjestystä voi- 5 daan vaihtaa; b) ja toista yhdistävää vektoria, joka sisältää seuraavaa: i) vähintään yksi liitettävä DNA-palanen, ii) markkerigeeni ja vähintään yksi ekspressiokasetti, joka sisältää S:n rakennegeenin, toiminnallisesti kytkettynä 10 säätelyalueeseen ja 3'-pään lopetussekvenssiin, jossa vektorissa markkerigeenin ja komponentin (ii) kasetin keskinäistä järjestystä voidaan vaihtaa.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu sii-15 tä, että mainittu liitettävä DNA-palanen saadaan Pichia pas- toriksesta eristetyn geenin DNA-sekvenssistä ja valikoidaan ryhmästä, johon kuuluvat AOX1, p40, DHAS ja HIS4.
6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu sii-20 tä, että vähintään yksi ekspressiokasetti käsittää a) säätelyalueen, joka valikoidaan ryhmästä, johon kuuluvat AOX1 ja DHAS, eristettynä Pichia pastoriksesta, toiminnallisesti kytkettyinä b) preS2:n tai S:n rakennegeeniin, toiminnallisesti kytket- 25 tynä c) 3'-pään lopetussekvenssiin Pichia pastoriksesta valikoituna ryhmästä, johon kuuluu 3'-pään 1opetussekvenssejä, jotka on eristetty AOX1-geenistä, p40-geenistä, DHAS-geenistä ja HIS4-geenistä. 30
7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu sii- ·’ . tä, että mainittu markkerigeeni valikoidaan ryhmästä, johon kuuluvat HIS4 ja ARG4, eristettynä Pichia pastoriksesta, SUC2 eristettynä Saccharomyces cerevisiaesta ja neomysii-35 nigeeni Tn903:sta ja Tn601:stä. 52 104639
8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu vektori, joka sisältää preS2-rakennegee-nin, käsittää a) ensimmäisen liitettävän DNA-palan, joka on noin yhden 5 kiloemäksen 5'-pään AOX1-säätelyalueesta, eristettynä Pichia pastoriksesta, toiminnallisesti kytkettynä b) preS2:n rakennegeeniin, toiminnallisesti kytkettynä c) AOXl:n 3'-pään lopetussekvenssiin, eristettynä Pichia pastoriksesta, ligoituna 10 d) markkerigeeniin, joka on HIS4, eristettynä Pichia pastoriksesta, ligoituna e) toiseen liitettävään DNA-palaan, joka on noin 0,65 emästä 3'-pään AOXl-lopetussekvenssistä.
9. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että mainittu vektori, joka sisältää S-rakennegeenin, käsittää a) liitettävän DNA-palasen, joka on noin yhden kiloemäksen 5'-pään A0X1-säätelyalueesta, eristettynä Pichia pasto- 20 riksesta, toiminnallisesti kytkettynä b) S:n rakennegeeniin, toiminnallisesti kytkettynä c) 3'-pään AOX1-lopetussekvenssiin, eristettynä Pichia pastoriksesta, ligoituna d) markkerigeeniin, joka on ARG4, eristettynä Saccharo- · 25 my ces cerevisiaesta, ligoituna e) liitettävään DNA-palaan, joka on noin 0,65 kiloemästä 3'-pään AOXl-lopetussekvenssistä.
10. Pichia pastoria PPF1(NRRL Y-18017), johon on transfor-30 moitu yksi pTB05A:n (ks. esimerkki II) ekspressiokasetin kopio tai Pichia pastoris PPF1 (NRRL Y-18017), johon on transformoitu pTB05A:n (ks. esimerkki II) preS2-geenin kaksi kopiota ja S-geenin yksi kopio. t« 53 104639
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US19371488A | 1988-05-13 | 1988-05-13 | |
| US19371488 | 1988-05-13 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI892312A0 FI892312A0 (fi) | 1989-05-12 |
| FI892312A FI892312A (fi) | 1989-11-14 |
| FI104639B true FI104639B (fi) | 2000-03-15 |
Family
ID=22714736
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI892312A FI104639B (fi) | 1988-05-13 | 1989-05-12 | Hepatiitti B:n S- ja PreS2 -proteiinien ilmentäminen metylotrooppisissa hiivoissa |
| FI992546A FI107265B (fi) | 1988-05-13 | 1999-11-29 | Hepatiitti B:n S- ja PreS2-proteiinien ilmentäminen metylotrofisissa hiivoissa |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI992546A FI107265B (fi) | 1988-05-13 | 1999-11-29 | Hepatiitti B:n S- ja PreS2-proteiinien ilmentäminen metylotrofisissa hiivoissa |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5650296A (fi) |
| EP (1) | EP0341746B1 (fi) |
| JP (1) | JP2614314B2 (fi) |
| KR (1) | KR100193701B1 (fi) |
| CN (1) | CN1038668A (fi) |
| AT (1) | ATE151109T1 (fi) |
| AU (1) | AU618596B2 (fi) |
| CA (1) | CA1340617C (fi) |
| DD (1) | DD285373A5 (fi) |
| DE (1) | DE68927921T2 (fi) |
| DK (1) | DK235289A (fi) |
| ES (1) | ES2101676T3 (fi) |
| FI (2) | FI104639B (fi) |
| GR (1) | GR3023985T3 (fi) |
| HU (1) | HU207532B (fi) |
| IE (1) | IE81158B1 (fi) |
| IL (1) | IL90161A0 (fi) |
| IN (1) | IN171696B (fi) |
| MX (1) | MX26715A (fi) |
| NO (1) | NO300465B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ228948A (fi) |
| PL (1) | PL161997B1 (fi) |
| PT (1) | PT90553A (fi) |
| YU (1) | YU98689A (fi) |
| ZA (1) | ZA893440B (fi) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5032516A (en) * | 1985-10-25 | 1991-07-16 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region |
| PL168408B1 (pl) * | 1989-08-03 | 1996-02-29 | Smithkline Beecham Biolog | Sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu PL |
| GB9007416D0 (en) * | 1990-04-02 | 1990-05-30 | Wellcome Found | Expression of heterologous protein in yeast |
| US6197548B1 (en) | 1990-04-02 | 2001-03-06 | Medeva Pharma Limited | Transformed Pichia expressing the pertactin antigen |
| EP0521348A1 (en) * | 1991-06-18 | 1993-01-07 | Korea Institute Of Science And Technology | Chimeric antibody with specificity for hepatitis B virus pre-S2 surface antigen and cell line producing same |
| LT3988B (en) | 1992-02-17 | 1996-06-25 | Fermentas Biotech Inst | Recombinant plasmides pfs19, pfps2-48 and pjlfds1 codingsynthesis of human hepatite b of surfice virus antigenes, methods fof producing thereof |
| CA2101610A1 (en) * | 1992-08-07 | 1994-02-08 | William D. Prevatt | Production of bacillus entomotoxins in methylotrophic yeast |
| GB9402832D0 (en) * | 1994-02-15 | 1994-04-06 | Smith Kline Beecham Biolog S A | Novel process |
| US5716808A (en) * | 1995-11-09 | 1998-02-10 | Zymogenetics, Inc. | Genetic engineering of pichia methanolica |
| US5955349A (en) * | 1996-08-26 | 1999-09-21 | Zymogenetics, Inc. | Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica |
| EP0862640A2 (en) * | 1995-11-09 | 1998-09-09 | ZymoGenetics, Inc. | Production of gad65 in methylotrophic yeast |
| MX9605082A (es) | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Univ Autonoma De Nuevo Leon | Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano. |
| WO2006033679A2 (en) * | 2004-05-25 | 2006-03-30 | Chimeracore, Inc. | Self-assembling nanoparticle drug delivery system |
| CN1704475A (zh) * | 2004-05-31 | 2005-12-07 | 成都生物制品研究所 | 羧端含前s2免疫决定簇的乙肝表面抗原融合基因及蛋白质 |
| JP2008507266A (ja) * | 2004-07-22 | 2008-03-13 | グライコフィ， インコーポレイテッド | ピチアにおける異種遺伝子発現のためのリンゴ酸シンターゼ調節配列 |
| CN100381171C (zh) * | 2004-12-30 | 2008-04-16 | 成都生物制品研究所 | 含前s1、前s2和s抗原决定簇的乙肝表面抗原复合颗粒 |
| ATE460922T1 (de) * | 2006-04-07 | 2010-04-15 | Chimeros Inc | Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von b-zellen-malignomen |
| AU2008236566A1 (en) * | 2007-04-09 | 2008-10-16 | Chimeros, Inc. | Self-assembling nanoparticle drug delivery system |
| WO2010120874A2 (en) | 2009-04-14 | 2010-10-21 | Chimeros, Inc. | Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same |
| WO2013036973A2 (en) | 2011-09-09 | 2013-03-14 | Biomed Realty, L.P. | Methods and compositions for controlling assembly of viral proteins |
| EP4357457B1 (en) | 2012-10-23 | 2024-10-16 | Toolgen Incorporated | Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR76274B (fi) * | 1981-08-04 | 1984-08-04 | Univ California | |
| EP0401941A3 (en) * | 1984-07-11 | 1991-04-17 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Hepatitis b virus surface antigen and production thereof |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| JPS62236496A (ja) * | 1986-04-07 | 1987-10-16 | Green Cross Corp:The | ＨＢｓＡｇの製造方法 |
| US4963483A (en) * | 1987-10-13 | 1990-10-16 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| NZ228774A (en) * | 1988-04-25 | 1991-05-28 | Phillips Petroleum Co | Hbv particles containing pres 2 proteins and recombinant processes for their production in yeast cells |
-
1989
- 1989-05-02 IL IL90161A patent/IL90161A0/xx unknown
- 1989-05-02 NZ NZ228948A patent/NZ228948A/en unknown
- 1989-05-09 ZA ZA893440A patent/ZA893440B/xx unknown
- 1989-05-11 HU HU892372A patent/HU207532B/hu not_active IP Right Cessation
- 1989-05-11 NO NO891921A patent/NO300465B1/no not_active IP Right Cessation
- 1989-05-11 KR KR1019890006430A patent/KR100193701B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-05-12 MX MX2671589A patent/MX26715A/es unknown
- 1989-05-12 ES ES89108632T patent/ES2101676T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-12 EP EP89108632A patent/EP0341746B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-12 DD DD89328581A patent/DD285373A5/de unknown
- 1989-05-12 AU AU34734/89A patent/AU618596B2/en not_active Expired
- 1989-05-12 DE DE68927921T patent/DE68927921T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-12 DK DK235289A patent/DK235289A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-05-12 AT AT89108632T patent/ATE151109T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-05-12 PT PT90553A patent/PT90553A/pt not_active Application Discontinuation
- 1989-05-12 PL PL89279426A patent/PL161997B1/pl unknown
- 1989-05-12 IE IE156389A patent/IE81158B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-05-12 YU YU98689A patent/YU98689A/sh unknown
- 1989-05-12 FI FI892312A patent/FI104639B/fi active IP Right Grant
- 1989-05-13 CN CN89103330A patent/CN1038668A/zh active Pending
- 1989-05-15 CA CA000599724A patent/CA1340617C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-15 JP JP1121313A patent/JP2614314B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-22 IN IN388/CAL/89A patent/IN171696B/en unknown
-
1995
- 1995-06-06 US US08/467,660 patent/US5650296A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-06 US US08/467,345 patent/US5670630A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-07-02 GR GR970401639T patent/GR3023985T3/el unknown
-
1999
- 1999-11-29 FI FI992546A patent/FI107265B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI104639B (fi) | Hepatiitti B:n S- ja PreS2 -proteiinien ilmentäminen metylotrooppisissa hiivoissa | |
| FI95929B (fi) | Hepatitis B pinta-antigeenin tuotanto hiivassa | |
| FI94427B (fi) | Säätelyalue heterologista geeni-ilmaisua varten hiivassa | |
| US5133961A (en) | Vaccines comprising yeast-derived hepatits b virus polypeptides | |
| FI80720B (fi) | Saccharmyces cerevisiae-hybridvektorer och deras anvaendning foer framstaellning av plypeptider. | |
| JPH0380083A (ja) | 新規な抗原物質及びその製法 | |
| IE65996B1 (en) | Synthesis of human virus antigens by yeast | |
| EP0103201B1 (en) | Shuttle vector | |
| US4803164A (en) | Preparation of hepatitis b surface antigen in yeast | |
| AU605036B2 (en) | Expression of hepatitis B2 pres protein in methylothrophic yeasts | |
| US4983520A (en) | DNA sequence encoding modified hepatitis B virus surface antigen P31 protein | |
| US5164485A (en) | Modified hepatitis B virus surface antigen P31 and production thereof | |
| EP0251460B1 (en) | Method for producing hepatitis b virus core antigen (hbcag) in yeast | |
| PL168408B1 (pl) | Sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu PL | |
| KR900005534B1 (ko) | 복합 프로모터를 이용한 효모 발현 벡터에 의한 b형 간염 바이러스 표면항원들의 제조방법 | |
| EP0277770A1 (en) | Alpha-mating factor promoter is modified by deleting pre-pro secretory leader sequence | |
| IE903178L (en) | Synthesis of human virus antigens by yeast |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB | Transfer or assigment of application |
Owner name: RESEARCH CORPORATION TECHNOLOGIES, INC. |
|
| FG | Patent granted |
Owner name: RESEARCH CORPORATION TECHNOLOGIES, INC. |