ES2991391T3

ES2991391T3 - Tapiz fibroso para muestreo de metaboloma

Info

Publication number: ES2991391T3
Application number: ES21714219T
Authority: ES
Inventors: Lynn Vanhaecke; Spiegeleer Margot De; Clerck Karen De; Jozefien Geltmeyer; Varoon Singh
Original assignee: Universiteit Gent
Current assignee: Universiteit Gent
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2024-12-03
Anticipated expiration: 2041-03-29
Also published as: US20230375566A1; EP4125613B1; EP4125613A1; WO2021191467A1

Abstract

Estera fibrosa (100) para su uso en la toma de una muestra de metaboloma y para su uso en la desorción de la muestra de metaboloma. La estera fibrosa (100) comprende una red abierta de al menos una nanofibra (110) a base de polímero, en donde el diámetro de la al menos una nanofibra está comprendido entre 50 nm y 1500 nm, y se caracteriza porque se proporciona una capa de cubierta en la parte superior y/o en la parte inferior de la red abierta de al menos una nanofibra para excluir que las partículas con un tamaño mayor de 2000 Da interactúen con la red abierta de al menos una nanofibra bloqueando y/o excluyendo el acceso a estas partículas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tapiz fibroso para muestreo de metaboloma

Campo de la invención

La invención se refiere al campo del muestreo y desorción del metaboloma. En particular al campo de muestreo, desorción e ionización del metaboloma. Más específicamente, se refiere a un dispositivo y método para tomar una muestra de metaboloma y para la desorción de los metabolitos muestreados o para la desorción e ionización de los metabolitos muestreados.

Antecedentes de la invención

Hasta la fecha, los avances en sofisticadas plataformas de análisis químico y herramientas informáticas han hecho posible medir simultáneamente miles de metabolitos en fluidos corporales tales como la sangre y la orina. La elaboración de perfiles y la cuantificación de biomoléculas se logran mejor mediante espectrometría de masas de alta resolución (HRMS), convenientemente combinada con técnicas de separación cromatográfica tal como la cromatografía de líquidos (LC). En concreto, se ha realizado el perfil metabólico de muestras fecales mediante cromatografía de gases (GC)/MS, LC/MS y espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN). Sin embargo, estas poderosas plataformas metabolómicas para el descubrimiento de biomarcadores son muy costosas y laboriosas. Además, imponen una gran instrumentación cuyos resultados analíticos sólo pueden ser manejados por expertos (bio)analíticos en el campo de la metabolómica basada en MS, y el extenso pretratamiento de las muestras requerido (protocolos de extracción y preparación) antes del análisis está asociado con el riesgo de alteraciones o pérdidas de metabolitos durante las etapas de procesamiento y, además, puede inducir una posible selectividad indeseada en su análisis resultante. Por lo tanto, es muy poco probable que las técnicas actuales combinadas de HRMS se traduzcan en un cribado a gran escala de poblaciones muy grandes que proporcione suficiente potencia estadística para una evaluación confiable de biomarcadores y también en aplicaciones en el punto de atención (POC), que requieren pruebas in situ.

El documento US2012/045752 A1 se refiere a un dispositivo de recolección de biopartículas y a un sistema de recolección de aerosol. El dispositivo incluye un medio de recolección que incluye una pluralidad de fibras formadas en un tapiz de fibra y configuradas para recolectar biopartículas sobre ellas. Este tapiz de fibra se coloca en una corriente de gas inducida por un dispositivo de bombeo de aerosol.

El documento WO 2017/209628 se refiere a un aparato mejorado de recolección y almacenamiento de pruebas, que comprende un recipiente y un hisopo que se puede usar para la recolección, almacenamiento y análisis de una muestra. También se describe un tapiz como se define en el preámbulo de la reivindicación 1.

El documento WO 2007/054040 se refiere a filtros para eliminar impurezas físicas y/o biológicas.

El pretratamiento de muestras implica la separación de analitos y/o componentes, incluyendo compuestos de interés, de matrices biológicas complejas, y tradicionalmente se realiza mediante protocolos de extracción líquidolíquido con respecto al análisis del metaboloma. Estos métodos consumen mucho tiempo, son difíciles de automatizar, y requieren un consumo significativo de muestras y disolventes orgánicos de alta pureza y costosos que generan importantes desechos químicos. De manera similar, la extracción en fase sólida es una etapa de preconcentración que requiere mucho tiempo. Por lo tanto, los enfoques de ionización ambiental (combinados con MS) que desorben/ionizan directamente analitos y/o componentes, incluyendo compuestos, generando compuestos/iones en fase gaseosa a partir de la superficie de la muestra bruta al aire libre y permitiendo la posterior introducción en el espectrómetro de masas, permiten evitar la preparación de la muestra y la separación cromatográfica, lo que permite un análisis en el POC in situ, rápido, de bajo coste y operativamente simple. La simplicidad operativa, la velocidad (por ejemplo, < 10 segundos por muestra) y los requisitos de limpieza limitados entre muestras respaldan aún más la traducción de la información de MS en decisiones de atención médica personalizadas directas (en el sitio) para futuras aplicaciones POC.

Actualmente, en los estudios metabolómicos en muestras de heces, es una práctica común recolectar muestras fecales completas, lo que depende en gran medida de la necesidad fecal individual, y a menudo está contaminado con orina y/o agua del inodoro, lo que implica un análisis adicional. Además, las muestras recolectadas deberán almacenarse de forma inmediata y precisa en el congelador de los pacientes, y ser transportadas urgentemente a un laboratorio analítico. El análisis posterior se somete entonces a protocolos de extracción que requieren mucho trabajo y tiempo, lo que implica variaciones tanto experimentales como técnicas, antes del análisis mediante LC combinada con MS con el fin de generar resultados cualitativos y cuantitativos (sesgados). Además, se han desarrollado y optimizado extracciones líquido-líquido y otros métodos analíticos para una fracción específica del metaboloma, introduciendo así una selectividad no deseada.

Cuando, a modo de ejemplo, se consideran aplicaciones clínicas en niños, las medidas tales como la evaluación del modelo homeostático de resistencia a la insulina (HOMA-IR) y el índice de Matsuda se realizan con mayor frecuencia para investigar la IR en niños. Estos métodos implican la extracción de sangre, lo que supone dolor y estrés para el niño. Sin embargo, el estrés (por ejemplo, el cortisol) se considera un factor que contribuye al desarrollo de enfermedades metabólicas, y por lo tanto, el análisis previo de la sangre extraída podría estar sesgado ya en esta etapa. Además de esto, el procedimiento actual para diagnosticar la alergia a la leche de vaca implica la historia clínica del paciente, seguido de varias pruebas diagnósticas basadas en exposición, de las cuales la más precisa es la exposición alimentaria con doble enmascaramiento, controlada con placebo. Sin embargo, esta prueba es costosa, requiere mucho tiempo, y puede provocar reacciones alérgicas graves. Una alternativa a esta prueba es la medición de anticuerpos de inmunoglobulina E (IgE) en una muestra de sangre venosa o mediante una prueba de punción cutánea. La sensibilidad de estas pruebas es muy alta, pero 1 de cada 4 niños recibe resultados falsos positivos, lo que lleva a la imposición innecesaria de dietas restrictivas.

Respecto al análisis de muestras biológicas minimizando la preparación de la muestra, la MS de desorciónionización láser asistida por matriz (MALDI) y la metabolómica de escopeta(shotgun)son técnicas comunes, en las que se elimina la separación previa mediante G/LC. Sin embargo, la primera implica el uso de una matriz orgánica, lo que constituye un inconveniente sustancial en la detección de moléculas pequeñas (que provoca una interferencia de fondo significativa en el intervalo de masa baja < 1000 Da), y además introduce el riesgo de formación de artefactos y tiene límites de resolución relacionados con el tamaño de cristal, lo que a su vez provoca una reproducibilidad deficiente. Con respecto a la última técnica, es decir, la metabolómicashotgun,no se ha informado sobre efectos de matriz problemáticos ni fue posible distinguir analitos y/o componentes isoméricos, incluyendo compuestos.

Por lo tanto, existe la necesidad de un buen dispositivo y de un buen método para tomar y liberar muestras de metaboloma.

Sumario de la invención

Un objeto de las realizaciones de la presente invención es proporcionar un buen material/dispositivo y proporcionar un buen método para tomar y liberar muestras de metaboloma.

El objetivo anterior se logra mediante un método y un dispositivo según la presente invención.

En un primer aspecto, las realizaciones de la presente invención se refieren a un tapiz fibroso como se define en la reivindicación 1.

Una ventaja de las realizaciones de la presente invención es que sólo los metabolitos (con un tamaño menor que 2000 Da) se extraen del biofluido y se adsorben y/o absorben a/en la red abierta de una o más nanofibras. Los inventores han descubierto que las partículas con un tamaño más grande de 2000 Dalton pueden eliminarse de la capa de cubierta, y que los metabolitos permanecerán adsorbidos y/o absorbidos a/en la red abierta al eliminar por lavado las partículas presentes en la capa de cubierta.

La desorción puede ser, por ejemplo, asistida por láser. La desorción se puede activar, por ejemplo, térmicamente (por ejemplo, mediante un mecanismo de calentamiento radiativo y Joule).

La desorción puede ser seguida de o se puede combinar con la ionización de la muestra de metaboloma. En realizaciones de la presente invención, el tapiz fibroso se usa en la ionización de la muestra de metaboloma, tal como la ionización asistida por láser de la muestra de metaboloma. Se puede usar cualquier técnica de ionización conocida en la técnica para la ionización de la muestra de metaboloma. Por ejemplo, ionización por electropulverización (ESI) o ionización por electropulverización por desorción (DESI).

En realizaciones de la presente invención, la red abierta comprende poros interconectados.

En realizaciones de la presente invención, el tapiz fibroso comprende nano- o micropartículas que se incorporan en la red abierta. Las nano- o micropartículas se pueden incorporar en la al menos una nanofibra, o se pueden embeber en la red abierta formada por la nanofibra.

En realizaciones de la presente invención, el tapiz fibroso es parcialmente hidrófobo y parcialmente hidrófilo.

En realizaciones de la presente invención, la al menos una nanofibra comprende uno o más materiales seleccionados de:

una lista de polímeros hidrófilos que comprende poliacrilato, poliacrilonitrilo, polivinilpirrolidona (PVP), y/o de una lista de polímeros hidrófobos que comprende poliestireno (PS), divinilbenceno, polidimetilsiloxano, polidivinilbenceno,

y/o de una lista de polímeros hidrófobos/hidrófilos combinados que comprenden polidivinilbenceno-copolivinilpirrolidona, divinilbenceno hidrófilo, polivinilpirrolidona reticulada, polianilina.

En realizaciones de la presente invención, la red abierta de nanofibras puede comprender nanofibras de PVP/PS. Estas pueden cubrirse con una capa de cobertura de PAN.

Las realizaciones de la presente invención también pueden referirse a un dispositivo de muestreo que comprende un tapiz fibroso según las realizaciones de la presente invención y un soporte al cual se fija el tapiz fibroso.

En un segundo aspecto, las realizaciones de la presente invención se refieren a un método para la desorción de una muestra de metaboloma, como se define en la reivindicación 10.

En realizaciones de la presente invención, la desorción se puede combinar con la ionización de la muestra de metaboloma. Esto se puede lograr mediante ionización asistida por láser.

En un método según realizaciones de la presente invención, el tapiz fibroso proporcionado es un tapiz según realizaciones de la presente invención.

Las realizaciones de la presente invención se refieren a un método para proporcionar un tapiz fibroso, como se define en la reivindicación 14.

En realizaciones de la presente invención, el al menos un polímero se hila de tal manera que se forman poros interconectados entre las nanofibras, por ejemplo entre nanofibras enmarañadas. Cuando en realizaciones de la presente invención se hace referencia a nanofibras enmarañadas, se hace referencia a una distribución no tejida de nanofibras. Preferiblemente no existe ninguna conexión física entre las nanofibras enmarañadas. Sin embargo, puede haber una conexión física entre las nanofibras enmarañadas.

En realizaciones de la presente invención, el electrohilado se realiza sobre un soporte, tal como poliuretano por ejemplo.

Aspectos particulares y preferidos de la invención se exponen en las reivindicaciones independientes y dependientes adjuntas. Las características de las reivindicaciones dependientes pueden combinarse con características de las reivindicaciones independientes y con características de otras reivindicaciones dependientes según corresponda y no simplemente tal como se establece explícitamente en las reivindicaciones.

Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes y se aclararán con referencia a la o las realizaciones descritas aquí a continuación.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra un dibujo esquemático de un dispositivo de muestreo y de una red abierta de al menos un tapiz fibroso a base de polímero según realizaciones de la presente invención.

La FIG. 2 muestra un diagrama de flujo de un método para la desorción de una muestra de metaboloma según realizaciones de la presente invención.

La FIG. 3 muestra una imagen de SEM de una red abierta de al menos una nanofibra basada en polímero de un tapiz fibroso según realizaciones de la presente invención.

La FIG. 4 muestra una imagen de SEM de una nanofibra usada en un tapiz fibroso según realizaciones de la presente invención.

La FIG. 5 muestra una imagen de SEM de una red abierta de al menos una nanofibra basada en polímero de un tapiz fibroso, en la que las micropartículas están embebidas en la red abierta, según realizaciones de la presente invención.

La FIG. 6 muestra una imagen de SEM de un tapiz fibroso hidrófilo/hidrófobo de PVP/PS con separación de fases, según realizaciones de la presente invención.

La FIG. 7 ilustra las etapas del método y el uso de un tapiz fibroso para tomar una muestra de metaboloma y para la desorción o desorción e ionización y el análisis espectrométrico de masas de alta resolución (HRMS) de la muestra de metaboloma.

La FIG. 8 es un gráfico que ilustra la cobertura del metaboloma de diferentes tapices fibrosos según realizaciones de la presente invención en comparación con las heces como tales.

La FIG. 9 muestra un modelo multivariado validado (OPLS-DA) de heces de niños con CMA sobre un tapiz fibroso, según realizaciones de la presente invención.

La FIG. 10 muestra una imagen de SEM de un tapiz fibroso que comprende una capa de cubierta de PAN sobre una capa de PVP/PS, según realizaciones de la presente invención.

La FIG. 11 muestra una imagen de SEM de una red abierta de fibras de PVP/PS de un tapiz fibroso, según realizaciones de la presente invención.

La FIG. 12 muestra una imagen de SEM de fibras de PAN en una capa de cubierta de un tapiz fibroso, según realizaciones de la presente invención.

La FIG. 13 muestra un dibujo químico que ilustra interacciones químicas de restos de nanofibras, de un tapiz fibroso según realizaciones de la presente invención, con analitos de ejemplo de diferente polaridad (intervalo de log P = -2,5 a 14,5).

Las FIG. 14 y FIG. 15 muestran los espectros de masas de heces obtenidas usando un tapiz fibroso y sin usar un tapiz fibroso, según realizaciones de la presente invención.

Las FIG. 16 y FIG. 17 muestran los espectros de masas de saliva obtenidos usando un tapiz fibroso y sin usar un tapiz fibroso, según realizaciones de la presente invención.

Las FIG. 18 y 19 muestran los espectros de masas de orina obtenidos obtenidos usando un tapiz fibroso y sin usar un tapiz fibroso, según realizaciones de la presente invención.

La FIG. 20 muestra el recuento de características espectrales de masas para diferentes composiciones de tapices fibrosos con PAN recubierto por debajo y/o por encima, según realizaciones de la presente invención.

La FIG. 21 muestra una imagen de SEM de una red abierta de al menos una nanofibra basada en polímero de un tapiz fibroso según realizaciones de la presente invención, que comprende adicionalmente micropartículas incorporadas como parte de una o más nanofibras.

Las imágenes de la FIG. 22 muestran configuraciones de medida para medir la deformación del tapiz fibroso.

La FIG. 23 y la FIG. 24 muestran imágenes de SEM de tapices fibrosos no coherentes que se están deshaciendo y disolviendo debido al hecho de que están sumergidos en agua.

Los signos de referencia en las reivindicaciones no se interpretarán como limitativos del alcance. En los diferentes dibujos, los mismos signos de referencia se refieren a elementos iguales o análogos.

Descripción detallada de realizaciones ilustrativas

La presente invención se describirá con respecto a realizaciones particulares y con referencia a ciertos dibujos, pero la invención no está limitada a ellos sino únicamente por las reivindicaciones. Los dibujos descritos son solo esquemáticos y no limitantes. En los dibujos, el tamaño de algunos de los elementos podrá estar exagerado y no dibujado a escala con fines ilustrativos. Las dimensiones y las dimensiones relativas no corresponden a reducciones reales para la práctica de la invención.

Cabe señalar que el término "que comprende", utilizado en las reivindicaciones, no debe interpretarse como restringido a los medios enumerados a continuación; no excluye otros elementos o etapas. Por lo tanto, debe interpretarse como que especifica la presencia de las características, números enteros, etapas o componentes indicados a los que se hace referencia, pero no excluye la presencia o adición de una o más características, números enteros, etapas o componentes, o grupos de los mismos. Por lo tanto, el alcance de la expresión "un dispositivo que comprende los medios A y B" no debe limitarse a dispositivos que consisten únicamente en los componentes A y B. Significa que con respecto a la presente invención, los únicos componentes relevantes del dispositivo son A y B.

La referencia a lo largo de la presente memoria descriptiva a "una realización" significa que un rasgo, una estructura o una característica particulares descritos con respecto a la realización se incluye en al menos una realización de la presente invención. De este modo, las apariciones de las frases "en una realización" o "en una realización" en diversos lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no se refieren todas ellas necesariamente a la misma realización, pero pueden hacerlo. Además, los rasgos, estructuras o características particulares se pueden combinar de cualquier manera adecuada, como sería evidente para un experto en la técnica a partir de esta divulgación, en una o más formas de realización.

De manera similar, se debe apreciar que en la descripción de formas de realización de ejemplo de la invención, varias características de la invención a veces se agrupan en una sola forma de realización, figura o descripción de la misma con el fin de simplificar la divulgación y ayudar en la comprensión de una o más de los diversos aspectos inventivos. Sin embargo, este procedimiento de divulgación no debe interpretarse como que refleja la intención de que la invención reivindicada requiera más características de las que se enumeran expresamente en cada reivindicación. Más bien, como reflejan las reivindicaciones siguientes, los aspectos inventivos residen en menos de todas las características de una única forma de realización descrita anteriormente. Por lo tanto, las reivindicaciones que siguen a la descripción detallada se incorporan expresamente a la presente descripción detallada, siendo cada reivindicación por sí misma una forma de realización separada de la presente invención.

Además, si bien algunas realizaciones descritas aquí incluyen algunas, pero no otras características incluidas en otras realizaciones, las combinaciones de características de diferentes realizaciones están destinadas a estar dentro del alcance de la invención y formar diferentes realizaciones, como lo entenderían aquellos en la técnica. Por ejemplo, en las siguientes reivindicaciones, cualquiera de las realizaciones reivindicadas se puede usar en cualquier combinación

En la descripción proporcionada en el presente documento, se exponen numerosos detalles específicos. Sin embargo, se entiende que las formas de realización de la invención se pueden poner en práctica sin estos detalles específicos. En otros casos, los procedimientos, estructuras y técnicas bien conocidos no se han mostrado en detalle para no oscurecer la comprensión de la presente descripción.

Cuando en realizaciones de la presente invención se hace referencia a una red abierta, se hace referencia a una red en la que los poros están interconectados y/o las nanofibras están enmarañadas. Con poros interconectados se entiende aquellos poros de un pasaje. Este pasaje puede ser de un lado de la red abierta al otro lado de la red abierta. Sin embargo, esto no es estrictamente necesario.

En un primer aspecto, las realizaciones de la presente invención se refieren a un tapiz fibroso 100 para uso en la toma de una muestra de metaboloma, y para uso en la desorción de la muestra de metaboloma. El tapiz fibroso 100 comprende una red abierta 115 de al menos una nanofibra 110 a base de polímero. El diámetro de la al menos una nanofibra 110, también denominada fibra, está comprendido entre 50 nm y 1500 nm.

La red abierta de nanofibras permite distribuir el contenido de la muestra de metaboloma dentro del tapiz fibroso y adsorber y/o absorber eficientemente la muestra de metaboloma a/en la red abierta de al menos una nanofibra. En realizaciones de la presente invención, se proporciona una capa de cubierta 125 en la parte superior y/o en la parte inferior de la red abierta 115 de al menos una nanofibra para excluir que las partículas (por ejemplo, biopartículas), con un tamaño mayor de 2000 Dalton, interactúen con la red abierta de nanofibra o nanofibras, al bloquear estas partículas. 1 Dalton equivale aproximadamente a 1,66x10-27 Kg.

La capa de cubierta 125 debe ser tal que los metabolitos puedan pasar a través de la capa de cubierta hacia la red abierta de al menos una nanofibra. Tal capa puede ser, por ejemplo, una capa de cubierta de PAN.

En realizaciones de la presente invención, la capa de cubierta puede excluir, por ejemplo, las siguientes biopartículas (esta lista no es exhaustiva): bacterias, virus, macromoléculas tales como ADN, ARN y/o proteínas, para que no interactúen con la red abierta de al menos una nanofibra.

En realizaciones de la presente invención, la capa de cubierta 125 puede comprender principalmente (o incluso solamente) un polímero que sirve como filtro de corte de peso molecular y bloquea las partículas (por ejemplo, biopartículas). En realizaciones de la presente invención, la al menos una nanofibra basada en polímero de la red abierta, por otra parte, es parcialmente hidrófoba y parcialmente hidrófila. Puede comprender una mezcla de restos hidrófilos e hidrófobos.

La FIG. 10 muestra una imagen de SEM de una parte de un tapiz fibroso, según realizaciones de la presente invención. El tapiz fibroso comprende una red abierta 115 de al menos una nanofibra basada en polímero y una capa de cubierta 125 en un lado del tapiz fibroso. En este ejemplo, la capa de cubierta 125 es una capa de PAN, y la red abierta 115 está hecha de una o más fibras de PVP/PS.

En realizaciones de la presente invención, la red abierta puede comprender una nanofibra o una pluralidad de nanofibras. El porcentaje en peso de la nanofibra individual o de la pluralidad de nanofibras puede ser al menos 50 %. En realizaciones de la presente invención, el porcentaje en peso de la o las nanofibras puede ser incluso más del 60 %, o incluso más del 70 %, o incluso más del 80 %, o incluso más del 90 %, o incluso hasta el 100 %.

En realizaciones de la presente invención, la relación de restos hidrófilos/hidrófobos de la al menos una nanofibra se selecciona de manera que la deformación después de la exposición al agua sea menor que 5 % en tamaño.

Una ventaja de las realizaciones de la presente invención es que se obtiene un tapiz fibroso no soluble en agua de al menos un polímero soluble en agua hilándolo simultáneamente con al menos un polímero o polímeros no solubles en agua. De este modo, se puede obtener una relación de restos hidrófilos/hidrófobos. Esto también se puede lograr usando un único polímero que contenga los restos hidrófilos e hidrófobos.

Una ventaja de las realizaciones de la presente invención es que, al introducir al menos 50 % en peso de nanofibras basadas en polímeros, y al seleccionar una relación de superficie hidrófila/hidrófoba de la al menos una nanofibra, se puede obtener un tapiz fibroso que puede absorber agua y al mismo tiempo no se deforma significativamente. La deformación puede incluso ser menor que 3 % en tamaño, o incluso menor que 1 %. La deformación puede ser causada por el hinchamiento debido a la absorción de agua, o puede ser causada por la disolución de algunas de las nanofibras. La deformación se mide a lo largo de una dimensión característica paralela a la superficie del tapiz. Se mide únicamente la parte coherente del tapiz. No se miden los bordes que se disuelven. Al final de la descripción se dan ejemplos de deformación en tamaño.

En realizaciones de la presente invención, la relación de restos hidrófilos/hidrófobos está entre 10/90 y 75/25. La relación de restos hidrófilos/hidrófobos puede estar entre 20/80 y 75/25, o incluso entre 30/70 y 70/30, o incluso entre 40/60 y 60/40.

Al proporcionar la o las nanofibras que son parcialmente hidrófobas y parcialmente hidrófilas, y/o al proporcionar nanofibras algunas de las cuales son hidrófobas y algunas son hidrófilas, se puede obtener un tapiz fibroso que tiene una cobertura de extracción de metabolitos que incluyen compuestos que portan un amplio intervalo de polaridades. En realizaciones de la presente invención, una nanofibra hidrófila se puede hilar junto con una nanofibra hidrófoba. En realizaciones de la presente invención, el tapiz fibroso se puede obtener mediante electrohilado. Un ejemplo de una red abierta de al menos una nanofibra basada en polímero de un tapiz fibroso, según realizaciones de la presente invención, se ilustra esquemáticamente en las FIG. 1 y FIG. 3. Las FIG. 3 y FIG. 4 muestran imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) con diferentes aumentos. La FIG. 3 indica una cobertura homogénea de nanofibras. En el ejemplo, el diámetro promedio de la fibra fue 450 nm, medido usando una herramienta de caracterización del diámetro de nanofibras (ImageJ). Las muestras se hilaron usando mezclas de polímeros compuestas por PVP y PS (que oscilaban de 35 a 55 % en peso de PVP), y dieron diámetros de fibra en el intervalo de 300-800 nm.

Una ventaja de las realizaciones de la presente invención es que los analitos y/o componentes, incluidos los compuestos, pueden ser capturados de manera eficiente por el tapiz fibroso. La adhesión no sólo es posible en la superficie de la red abierta de al menos una nanofibra basada en polímero, sino también internamente en la red abierta. Esto es posible porque la red fibrosa es una red abierta fibrosa, lo que significa que hay poros presentes en la red. Usando dicho tapiz fibroso, se puede capturar un amplio intervalo fisicoquímico de moléculas del metaboloma. El intervalo de masas (m/z) de los analitos y/o componentes, incluidos los compuestos, puede estar, por ejemplo, entre 55 y 2000 Da. Su log P puede oscilar entre -10 y 23.

En la tabla anterior se muestra una lista de ejemplos de analitos añadidos en biofluidos sobre un tapiz fibroso. Su nombre estándar se puede encontrar en la primera columna. Su clase de compuesto se obtiene de la base de datos del metaboloma humano (HMDB) y de LIPD MAPS®. Como se puede recuperar en HMDB, todos son detectables en las heces. Su Log P se recupera de la base de datos PubChem de los National Institutes of Health. Su masa monoisotrópica se recupera de HMDB. Estos analitos se pueden detectar usando un método según las realizaciones de la presente invención, que ilustra la cobertura fisicoquímicamente amplia de un tapiz fibroso según las realizaciones de la presente invención.

Es especialmente ventajoso que el tapiz fibroso no sólo sea particularmente adecuado para capturar dichos compuestos, sino que también permita una buena desorción, y posiblemente también una buena ionización del metaboloma. La ionización de la muestra puede lograrse, por ejemplo, aplicando un voltaje sobre el tapiz fibroso o muestra, o mediante ionización asistida por láser, o mediante otros métodos conocidos adecuados para la ionización.

En realizaciones de la presente invención, el tapiz fibroso se puede usar para diagnosticar un metaboloma tomando la muestra del metaboloma, ionizando la muestra del metaboloma, y analizando los iones obtenidos para obtener un diagnóstico con fines curativos. El análisis se puede realizar, por ejemplo, mediante espectroscopía de masas. De este modo, los metabolitos de la muestra del metaboloma se pueden perfilar y/o cuantificar.

En realizaciones de la presente invención, la red abierta no está tejida. La al menos una nanofibra puede ser biocompatible. La capa de cubierta en particular también puede ser biocompatible.

El diámetro de la al menos una nanofibra puede oscila entre 50 y 1500, o incluso entre 50 y 1200, o incluso entre 50 y 1000 nm, o incluso entre 50 y 500 nm, o incluso entre 400 nm y 800 nm, tal como 200 nm, o 300 nm.

Un tapiz fibroso 100 según realizaciones de la presente invención se puede usar en la ionización asistida por láser de la muestra de metaboloma.

Una ventaja de un tapiz fibroso según las realizaciones de la presente invención es que permite una buena disipación del láser y la posterior desorción de analitos y/o componentes capturados, incluidos los compuestos. Sin estar limitados a la teoría, se supone que las propiedades del tapiz fibroso permiten una rápida transferencia de energía y la absorción de energía láser. Una ventaja de las realizaciones de la presente invención es que el tapiz fibroso permite una alta eficiencia de transferencia de la energía láser para el análisis de muestras biológicas.

Es ventajoso usar un tapiz fibroso según las realizaciones de la presente invención para tomar una muestra de metaboloma y para la ionización asistida por láser de la muestra de metaboloma, debido a que evita el uso de una matriz orgánica (considerada especialmente exquisita para el análisis de moléculas pequeñas) y reduce sustancialmente el problema de los efectos de la matriz, además de que reduce el pretratamiento y análisis de la muestra que consume tiempo a una fracción de minuto. Las moléculas de agua, que están presentes en gran medida en biofluidos tales como, por ejemplo, heces, orina, saliva y sangre, pueden actuar como una matriz endógena, ya que la longitud de onda del láser IR se puede ajustar (por ejemplo, 2,94 pm) para excitar la banda vibracional más intensa (modo de estiramiento de O-H) de las moléculas de agua.

En realizaciones de la presente invención, la red abierta comprende poros. Los poros se forman entre las nanofibras. Estos poros son parte de la red nanofibrosa interconectada. Los poros interconectados permiten distribuir el contenido de la muestra de metaboloma dentro del tapiz fibroso y adsorber eficientemente (y posteriormente, mediante análisis instrumental, desorber) la muestra a la superficie de las nanofibras.

En realizaciones de la presente invención, el tapiz fibroso puede comprender nano- o micropartículas 135 que están incorporadas en la red interconectada. Sus ejemplos se muestran en las FIG. 5 y FIG. 21. Estas figuras muestran imágenes de SEM de una red abierta enmarañada fibrosa de un tapiz fibroso, según realizaciones de la presente invención, en la que están embebidas micropartículas. Para este ejemplo, las micropartículas se mezclaron en la disolución de polímero que consiste en PVP/PS. Estas nano- o micropartículas pueden ser (co)polímeros que pueden tener diversas estructuras. Pueden ser por ejemplo esféricas, o tener una estructura tubular. Pueden ser, por ejemplo, nanotubos de carbono. Su tamaño (por ejemplo, diámetro interno para esferas, longitud para tubos) puede oscilar, por ejemplo, entre 100 nm y 1500 nm, o entre 1 pm y 40 pm, por ejemplo hasta 30 pm, o hasta 20 pm, o hasta 10 pm.

En realizaciones de la presente invención, las nano- o micropartículas pueden estar recubiertas. Pueden tener, por ejemplo, un recubrimiento polar que atraiga más moléculas hidrófilas.

Una ventaja de las realizaciones de la presente invención es que la cobertura del metaboloma se puede aumentar incorporando nano- o micropartículas en la red interconectada. Además, permiten una buena disipación de la energía láser, lo que resulta ventajoso para la ionización asistida por láser de la muestra de metaboloma, por ejemplo.

La FIG. 6 muestra una imagen de SEM de una separación de fases hidrófila/hidrófoba de fase PVP/PS de las diferentes morfologías que puede proporcionar el procedimiento de electrohilado, es decir, desde materiales intensamente mezclados hasta materiales separados en fases para cubrir el metaboloma holístico. En este ejemplo, los tapices fibrosos se hilaron usando mezclas de polímeros compuestas por PVP y PS (al 55 % en peso de PVP), y dieron diámetros de fibra en el intervalo de 300-800 nm.

Un dispositivo de muestreo 200 según realizaciones de la presente invención, por ejemplo un hisopo, se puede formar fijando el tapiz fibroso a un soporte 210. Un ejemplo de ello se ilustra en la FIG. 1. El tapiz fibroso puede envolver el soporte 210. De este modo resulta ventajoso que el tapiz fibroso forme una misma fase envolvente con respecto a la superficie del soporte sólido. En realizaciones de la presente invención, el tapiz fibroso está fijado a un extremo exterior del dispositivo de muestreo. Este extremo exterior también se conoce como cabeza del hisopo. El cabezal del hisopo puede estar unido, por ejemplo, a un mango de acero inoxidable 220. La invención no se limita a ello. También se pueden considerar otros materiales, preferiblemente no inflamables. Estos pueden ser, por ejemplo, plásticos térmicamente resistentes tales como polipropileno o polietileno. Un dispositivo de muestreo, según realizaciones de la presente invención, puede permitir el muestreo en condiciones ambientales. Puede configurarse como un hisopo médico para uso rectal capaz de capturar un amplio intervalo de metabolitos fisicoquímicamente diversos y directamente aplicable como sustrato para SALDI ambiental en la superficie del tapiz fibroso.

En un segundo aspecto, las realizaciones de la presente invención se refieren a un método 300 para la desorción de una muestra de metaboloma. En la FIG. 7 se ilustra un diagrama de flujo de tal método. El método comprende proporcionar 310 un tapiz fibroso que porta una muestra de metaboloma. El tapiz fibroso comprende (a) una red abierta de al menos una nanofibra basada en polímero, y el diámetro de la al menos una nanofibra oscila entre 50 nm y 1500 nm, y (b) se proporciona una capa de cubierta en la parte superior y/o en la parte inferior de la red abierta de al menos una nanofibra para excluir que partículas con un tamaño mayor a 2000 Da interactúen con la red abierta de al menos una nanofibra bloqueando y/o excluyendo el acceso a estas partículas.

El método comprende, además, someter 320 el tapiz fibroso a un dispositivo configurado para desorber (o desorber e ionizar) la muestra de metaboloma, y desorber 330 la muestra de metaboloma. La desorción de la muestra de metaboloma se puede combinar con la ionización de la muestra de metaboloma, que se puede realizar mediante ionización asistida por láser.

En realizaciones de la presente invención, la capa de cubierta se puede limpiar mediante lavado (por ejemplo, un lavado rápido de 10 s) antes de someter el tapiz fibroso al dispositivo configurado para desorber (e ionizar) la muestra de metaboloma. Este lavado se puede optimizar por biofluido. Una ventaja de las realizaciones de la presente invención es que las partículas (por ejemplo, biopartículas) se eliminan antes del análisis, mientras que los metabolitos que se absorben y/o adsorben a/en la red abierta de al menos una nanofibra basada en polímero (por ejemplo, fibras de PVP/PS) no se eliminan mediante el lavado.

El penacho de analitos y/o componentes generados, incluidos los compuestos, resultantes de la ionización de la muestra del metaboloma, se puede introducir en una entrada de MS (por ejemplo, para el análisis de HRMS). La etapa de separación de la técnica anterior, que se realiza convencionalmente por medio de LC para reducir los efectos de la matriz, se reemplaza así por el uso de una estrategia de muestreo y enriquecimiento de compuestos muy eficiente mediante el uso de un tapiz fibroso según las realizaciones de la presente invención para tomar la muestra de metaboloma y para ionizar la muestra de metaboloma directamente desde el tapiz fibroso 100.

En realizaciones de la presente invención, proporcionar 310 el tapiz fibroso comprende tomar la muestra de metaboloma usando el tapiz fibroso. Un tapiz fibroso según las realizaciones de la presente invención permite capturar analitos y/o componentes, incluyendo compuestos, de la matriz biológica de interés, por ejemplo el recto o la boca. El tapiz fibroso puede estar diseñado para la captura a gran escala de analitos y/o componentes, incluyendo compuestos, o para la captura dirigida de compuestos.

El tapiz fibroso 100 se puede colocar durante un período de tiempo requerido, durante el cual se realiza la extracción máxima, en el lugar en el que se toma la muestra. Por ejemplo, se puede colocar en el recto (1 a 2 cm más allá del borde anal) y hacerse girar suavemente 360°. Posteriormente, cuando la extracción, tal como la microextracción, se ha producido en un grado suficiente (por ejemplo, aproximadamente en el intervalo de minutos), el tapiz fibroso se retira y se coloca en un portamuestras. Durante la investigación clínica, el tapiz fibroso se puede colocar en un recipiente de almacenamiento esterilizado, para el transporte a un laboratorio. El portamuestras puede ser un portamuestras giratorio.

El portamuestras puede ser parte de un montaje configurado para la ionización de la muestra de metaboloma. Puede ser un montaje de láser para llevar a cabo la desorción de los analitos y/o componentes, incluyendo compuestos, extraídos del tapiz fibroso. Los analitos y/o componentes en fase gaseosa obtenidos, incluyendo compuestos, se pueden transportar a través de un tubo (por ejemplo, un tubo de PTFE) para su posterior análisis. El tubo se puede colocar justo encima del portamuestra y conectarse directamente a la entrada del equipo de análisis (por ejemplo, el instrumento de MS). Un ejemplo de ello se ilustra en la FIG. 7. El PTFE es un plástico versátil que se caracteriza por una alta resistencia química y térmica, y es muy poco reactivo. Por ejemplo, un montaje de ionización por desorción láser (LDI) se puede combinar con el aparato de HRMS a través de un tubo de PTFE que permite la transferencia de los iones en fase gaseosa generados a la entrada del MS, lo que posibilita el análisis remoto y la libertad de movimiento.

El uso de un tapiz fibroso según realizaciones de la presente invención para tomar una muestra de metaboloma y la ionización posterior de la muestra de metaboloma puede permitir, por ejemplo, detectar en última instancia indicadores predictivos y pronósticos que apuntan hacia trastornos metabólicos durante la primera infancia para prevenir y/o predecir el pronóstico del desarrollo de enfermedades metabólicas y complicaciones a largo plazo. Se permite un muestreo rectal u oral fácil, in situ e in vivo, usando un tapiz fibroso compuesto polimérico electrohilado nanofibroso biocompatible y flexible según realizaciones de la presente invención.

Una ventaja de las realizaciones de la presente invención es que el uso del tapiz fibroso 100 como sustrato para una muestra de metaboloma en un enfoque de SALDI-HRMS abre puertas para trascender el estado actual de la técnica de la metabolómica para la medicina de precisión. La aplicación permite abordar una serie de problemas de salud (pediátricos) importantes, tales como la predicción y prevención de la obesidad/(pre)diabetes, así como el diagnóstico de la alergia a la leche de vaca, por ejemplo.

Un tapiz fibroso 100, según realizaciones de la presente invención, puede comprender componentes específicos (polímeros, partículas) dirigidos a una amplia cobertura del metaboloma. Un tapiz fibroso según realizaciones de la presente invención puede ser parcialmente hidrófobo y parcialmente hidrófilo. Dependiendo de la aplicación, el porcentaje de superficie hidrófoba/superficie hidrófila puede variar. Por ejemplo, cuando la aplicación pretende tener la máxima cobertura del metaboloma fecal, es preferible una relación hidrófoba/hidrófila de 30-60 % / 40-70 %, por ejemplo aproximadamente 40 % / 60 %. Dependiendo de la aplicación, se pueden usar otras relaciones que oscilan desde puramente hidrófila a puramente hidrófoba.

El carácter hidrófobo/hidrófilo mixto del tapiz fibroso se puede obtener a través de diversas implementaciones. Por ejemplo, al menos una nanofibra puede ser parcialmente hidrófoba y parcialmente hidrófila, y/o al menos una nanofibra puede ser hidrófoba y al menos una nanofibra puede ser hidrófila, y/o el núcleo de una nanofibra puede ser hidrófilo y la cubierta hidrófoba, o viceversa, y/o las nano- o micropartículas del tapiz fibroso pueden ser hidrófobas o hidrófilas. En realizaciones de la presente invención, una fibra puede comprender un componente hidrófilo y un componente hidrófobo. En realizaciones de la presente invención, se puede añadir material hidrófilo e hidrófobo a la al menos una fibra.

Un tapiz fibroso según realizaciones de la presente invención puede comprender una mezcla de polímeros. Estos pueden ser hidrófilos, hidrófobos, o incluso pueden ser polímeros que contengan restos tanto hidrófilos como hidrófobos, tales como los copolímeros. De esta forma se puede obtener un tapiz fibroso que tiene una cobertura de extracción de analitos y/o componentes, incluyendo compuestos, que tienen un amplio intervalo de polaridades. Ejemplos de polímeros hidrófilos son: poliacrilato (PA), poliacrilonitrilo (PAN), polivinilpirrolidona (PVP), poliamida, PVP reticulado.

Ejemplos de polímeros hidrófobos son: poliestireno (PS), divinilbenceno (DVB), tal como por ejemplo polidivinilbenceno (PDVB), polidimetilsiloxano (PDMS), tetrafluoroetileno sulfonado (capacidades protonantes). Ejemplos de copolímeros hidrófilos/hidrófobos: PDVB-co-PVP, DVB hidrófilo.

La al menos una nanofibra puede comprender, por ejemplo, poliestireno y polivinilpirrolidona. La relación de peso PVP/PS (%) puede oscilar, por ejemplo, de 70/30 a 10/90, o incluso entre 60/40 y 40/60.

Las interacciones de los restos de nanofibras con los analitos de la tabla anterior se ilustran usando el dibujo químico de la FIG. 13. En este ejemplo, la microfibra comprende PVP/PS. Se muestran los siguientes tipos de interacciones: Enlace de hidrógeno, interacciones iónicas (intercambio de cationes, intercambio de aniones), interacciones hidrófobas (intercationes n-n), interacciones de Van der Waals (dipolo-dipolo, ion-dipolo, fuerzas de London). Esta figura ilustra que la cobertura se puede ampliar combinando restos hidrófobos e hidrófilos en una nanofibra. Una ventaja de algunas realizaciones de la presente invención es que el tapiz fibroso no se deforma incluso aunque haya restos hidrófilos en el tapiz fibroso. Esto se logra proporcionando un tapiz fibroso que comprende al menos una nanofibra que tiene una combinación adecuada de restos hidrófilos/h id rófobos.

En realizaciones de la presente invención, las interacciones químicas y las interacciones físicas a través del uso de la combinación de polímeros hidrófilos e hidrófobos en un tapiz (nano)fibroso se pueden aplicar y beneficiar de la alta área superficial específica del tapiz (nano)fibroso. Las interacciones químicas (apilamiento pi-pi, interacciones de Van Der Waals, enlaces de hidrógeno, enlaces covalentes, etc.) imparten adsorción y absorción, e incluyen unión química y física y adhesión física.

La FIG. 14 muestra los espectros de masas de heces obtenidos usando un tapiz fibroso y sin usar un tapiz fibroso. Los espectros se obtienen para un intervalo de masas de 200 a 520 Dalton.

El espectro superior muestra un espectro obtenido usando un método según realizaciones de la presente invención (es decir, recolectando una muestra de metaboloma, heces por ejemplo, con el tapiz fibroso, desorbiendo la muestra de metaboloma, e ionizando la muestra de metaboloma y recolectando el espectro).

El espectro inferior muestra el espectro del propio biofluido (sin usar un tapiz fibroso).

De manera similar a la FIG. 14, el espectro superior en la FIG. 15 se obtiene usando un tapiz fibroso, según realizaciones de la presente invención, y el espectro inferior muestra el espectro del propio biofluido, heces por ejemplo. Los espectros se obtienen para un intervalo de masas de 480 a 880 Dalton.

Como se puede observar en estos gráficos, se obtiene una amplia cobertura cuando se usa un tapiz fibroso según realizaciones de la presente invención.

De manera similar a las FIG. 14 y FIG. 15, las FIG. 16 y FIG. 17 muestran los espectros de saliva obtenidos usando un tapiz fibroso (arriba) y sin usar un tapiz fibroso (abajo). Para la FIG. 16, los espectros se obtienen de 200 a 500 Dalton. Para la FIG. 17, los espectros se obtienen para un intervalo de masas de 570 a 780 Dalton.

Las FIG. 18 y FIG. 19 muestran los espectros de orina obtenidos usando un tapiz fibroso (arriba) y sin usar un tapiz fibroso (abajo). Para la FIG. 18, los espectros se obtienen para un intervalo de masas de 200 a 550 Dalton. Para la FIG. 19, los espectros se obtienen para un intervalo de masas de 550 a 870 Dalton.

La FIG. 20 muestra el recuento de características para diferentes composiciones de muestreador (es decir, un tapiz fibroso). En el eje horizontal se presentan las siguientes composiciones (de izquierda a derecha): Heces como tales, un tapiz fibroso de PVP/PS que está recubierto por encima, un tapiz fibroso de PVP/PS que está recubierto por encima y por debajo (por ejemplo, PAN), un tapiz fibroso de PVP/PS. La red abierta se obtiene disolviendo los componentes poliméricos en un disolvente, y electrohilando al menos un polímero. La relación PVP/PS es 60 % frente a 40 % en peso. Los componentes poliméricos se disuelven en CHCh:DMF (2:1). La capa de cubierta se puede obtener disolviendo PAN en dimetilformamida (por ejemplo: 5 % (p/v) en DMF), y, por ejemplo, electrohilando. El eje vertical muestra el número de características. El número de características se puede obtener, por ejemplo, de los espectros de masas. En este experimento, el recuento de características se obtiene para un intervalo de masas de 600 a 800 Dalton. Como se puede ver en esta figura, las diferencias entre con o sin recubrimiento son marginales.

Se pueden añadir al tapiz fibroso restos específicos tales como divinilbenceno hidrófilo (DVB, N-metil-N-vinilamida) y Waters Oasis HLB®. Al seleccionar los polímeros y los restos, se puede optimizar la cobertura de extracción de analitos y/o componentes, incluyendo compuestos, que tienen un amplio intervalo de polaridades (que oscilan desde aminoácidos, es decir, metabolitos polares, hasta triacilgliceroles, es decir, metabolitos no polares).

La optimización se puede realizar en enfoques de de diseño de experimentos (DOE) y de modelado de superficie de respuesta (RSM) (por ejemplo, el software JMP 14 (SAS)). De este modo, el DOE y el RSM se pueden centrar en maximizar la cobertura del metaboloma y comparar las intensidades de señal obtenidas mediante SALDI del tapiz fibroso impregnado frente al análisis de los biofluidos como tales.

Los polímeros de la lista se caracterizan por tener las características necesarias para usar el tapiz fibroso para tomar una muestra de metaboloma, es decir, biocompatibilidad, flexibilidad, elasticidad y estabilidad en un amplio intervalo de pH (por ejemplo, el pH intrarrectal medio diana de los niños es 6,75, pero puede llegar hasta 13).

En realizaciones de la presente invención, los polímeros se pueden seleccionar por su estabilidad mecánica y comportamiento termoplástico (por ejemplo, soportar la temperatura de irradiación láser).

Una ventaja de las realizaciones de la presente invención es que la fase de extracción es un tapiz fibroso homogéneo 100 con una cobertura de extracción de analitos y/o componentes, incluyendo compuestos, que tienen un amplio intervalo de polaridades (el log P puede oscilar entre -10 y 23). Este tapiz se puede aplicar a un soporte 210. Una ventaja de las realizaciones de la presente invención es que de una sola vez se puede obtener una cobertura completa.

La FIG. 8 muestra un gráfico que ilustra la cobertura del metaboloma de diferentes tapices fibrosos según realizaciones de la presente invención en comparación con las heces como tales. Este gráfico muestra un análisis estadístico (no dirigido) basado en la evaluación de medidas repetidas de corriente iónica total (TIC) por los polímeros electrohilados mencionados (PVP reticulado, PVP 50 % - PS 50 %, y PVP 20 % -PS 80 %). En este análisis, se demostró que los tapices fibrosos electrohilados mostraron una cobertura similar (no significativamente diferente) y significativamente mayor (en términos de TIC) en comparación con el análisis de heces como tales (es decir, no impregnadas en tapices fibrosos electrohilados) mediante la mencionada técnica de LDI.

La FIG. 9 muestra un modelo de OPLS-DA multivariado de heces de niños con alergia a la leche de vaca (CMA) sobre un tapiz fibroso, según realizaciones de la presente invención, que permite una clasificación válida según el estado de salud. Los círculos totalmente negros indican CMA IgE. Los círculos blancos con circunferencia negra indican pacientes sanos.

En realizaciones de la presente invención, el material del tapiz fibroso se puede seleccionar para asegurar una desorción mejorada y/o una señal de fondo reducida y/o limpia tras SALDI. La optimización se puede realizar mediante un DOE que puede incluir la distancia entre el tapiz fibroso y el láser que se usa para ionizar 330 la muestra de metaboloma (se puede usar un portamuestras giratorio para un análisis completo de la superficie del tapiz fibroso), la rotación del tapiz fibroso (° y rpm), la energía del pulso (mJ), la anchura del pulso (ns), y el tiempo de ablación (s).

Al realizar medidas usando SALDI-REIMS-MS, los parámetros de SALDI-REIMS-MS se pueden ajustar de manera fina para ambas modalidades de polaridad considerando la matriz biológica.

Un tapiz fibroso 100 según realizaciones de la presente invención se puede usar, por ejemplo, para tomar una muestra de metaboloma para muchas enfermedades humanas comunes cuyo origen se ha asociado con alteraciones en la composición microbiana gastrointestinal, tales como enfermedad inflamatoria intestinal (EII), cáncer colorrectal, alergias (por ejemplo, alergia a la leche de vaca), obesidad, diabetes mellitus (DM), etc. Con respecto a la obesidad, por ejemplo, existe una aparición cada vez mayor de sobrepeso, obesidad y perturbaciones metabólicas relacionadas en todo el mundo en adultos, adolescentes, e incluso en aumento alarmante durante la primera infancia. Por ello, es muy necesario realizar pruebas de detección a la población joven lo antes posible. La obesidad infantil se asocia, entre otras cosas, a un estado de marcada resistencia a la insulina. Hasta la fecha, todavía no existen valores de referencia internacionales para la sensibilidad a la insulina “anormal”. Además de la obesidad infantil, la creciente prevalencia de alergias alimentarias en los niños, tal como la alergia a la leche de vaca, es motivo de gran preocupación, ya que actualmente el único tratamiento para esta enfermedad es la implementación de una dieta de eliminación. Esto último resalta la importancia de un diagnóstico preciso y específico. Un método 300 para la ionización de una muestra de metaboloma, según realizaciones de la presente invención, permite obtener una corriente de iones que puede diagnosticarse según realizaciones de la presente invención. Se pueden usar metodologías del estado de la técnica para diagnosticar la corriente de iones. Un tapiz fibroso 100 según realizaciones de la presente invención permite tomar la muestra de metaboloma, y se puede usar en la ionización asistida por láser de la muestra de metaboloma. Por lo tanto, permite correlacionar los espectros de masas con signos moleculares de alteraciones metabólicas, y proporcionar información sobre marcadores de enfermedades y rutas biológicas aberrantes para mejorar las estrategias de intervención (personalizadas), tales como los enfoques terapéuticos. Esto se ilustra en la FIG. 2, que ilustra la toma de la muestra de metaboloma usando el tapiz fibroso y la desorbición de la muestra. La desorción de la muestra se puede combinar con la ionización de la muestra. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la desorción láser y la ionización de la muestra sobre el tapiz fibroso. La muestra ionizada se puede analizar, por ejemplo, mediante espectrometría de movilidad iónica.

Una ventaja de las realizaciones de la presente invención es que requiere una cantidad menor de muestra biológica que en el caso de que se necesite recolectar una muestra de biofluido completa. Además, el hisopado se puede realizar en cualquier momento. El tapiz fibroso, según la presente invención, permite capturar eficientemente el o los compuestos, y además permite una buena disipación del láser (energía) y posterior desorción de los analitos y/o componentes capturados, incluyendo compuestos.

La desorción-ionización láser asistida por superficie (SALDI), combinada con HRMS, se puede usar, por ejemplo, como metodología analítica. Una ventaja de las realizaciones de la presente invención es que esto elimina los largos tiempos de preparación y análisis de muestras, ya que se puede lograr una reducción de tiempo de aproximadamente el 70 % en comparación con la adquisición LC-MS estándar (con un promedio de 15 minutos) sin siquiera tener en cuenta los procedimientos de preparación de la muestra requeridos para tal plataforma analítica.

Además, el uso de un tapiz fibroso según realizaciones de la presente invención para tomar la muestra de metaboloma y para la ionización asistida por láser de la muestra de metaboloma reduce en gran medida el uso de reactivos costosos y ambientalmente (tóxicos) peligrosos (orgánicos). Cuando se usa un tapiz fibroso según realizaciones de la presente invención, se pueden aplicar restos específicos y una composición de mezcla de polímeros variable para una cobertura de extracción mejorada de analitos y/o componentes, incluyendo compuestos, que tienen un amplio intervalo de polaridades. El principio de microextracción que usa el tapiz fibroso, según realizaciones de la presente invención, minimiza aún más la contaminación de la instrumentación (por ejemplo, un instrumento de MS), y se ocupa de las posibles interferencias de la matriz debido al análisis de la muestra biológica cruda extraída sobre el tapiz fibroso.

En realizaciones de la presente invención, los iones se pueden formar fuera del eventual instrumento de medida, que puede ser, por ejemplo, un espectrómetro de masas. Como se discutió anteriormente, la ionización 330 de la muestra de metaboloma en el tapiz fibroso se puede lograr usando un láser.

Se pueden aplicar enfoques de MS con ionización ambiental (AIMS) para analizar la muestra de metaboloma en el tejido. La MS de ionización evaporativa rápida (REIMS) es uno de los enfoques de MS de ionización ambiental (AIMS).

Un tapiz fibroso, según realizaciones de la presente invención, se puede obtener mediante electrohilado. El tapiz fibroso se puede fabricar, por ejemplo:

• disolviendo al menos un componente polimérico en un disolvente en el que están presentes restos hidrófobos e hidrófilos en el al menos un componente polimérico,

• electrohilando el al menos un componente polimérico disuelto, formando de ese modo una red abierta de al menos una nanofibra basada en polímero, en el que la al menos una nanofibra se hila con un diámetro que oscila entre 50 nm y 1500 nm,

• proporcionando una capa de cubierta en una parte superior y/o en una parte inferior de la red abierta de al menos una nanofibra para excluir que las partículas con un tamaño mayor a 2000 Da interactúen con la red abierta de la o las nanofibras bloqueando y/o excluyendo el acceso a estas partículas.

En realizaciones de la presente invención, se puede disolver más de un componente polimérico. Uno puede ser, por ejemplo, hidrófobo, y otro hidrófilo. En algunas realizaciones de la presente invención, un solo componente polimérico puede comprender restos hidrófobos e hidrófilos.

La capa de cubierta se puede aplicar usando electrohilado. Alternativamente, para aplicar la capa de cobertura, se puede usar recubrimiento por inmersión, pulverización catódica, recubrimiento por centrifugación, etc. La técnica de electrohilado es especialmente adecuada para crear fibras con un diámetro en el intervalo nanométrico. En realizaciones de la presente invención, el tapiz fibroso está creado por una o más fibras que están enmarañadas. Los componentes hidrófobos e hidrófilos se pueden disolver en el disolvente para el electrohilado. De esta manera se puede obtener una nanofibra que es en parte hidrófoba y en parte hidrófila.

El electrohilado se puede realizar sobre un soporte 210. De este modo, se puede formar un dispositivo de muestreo haciendo girar directamente el tapiz fibroso 100 sobre el soporte 210.

En realizaciones de la presente invención se usan polímeros biocompatibles para el tapiz fibroso. La biocompatibilidad se considera por tanto como la ausencia de reacciones tóxicas o rechazo inmunológico. Se puede aplicar a la fibra un recubrimiento biocompatible. El PAN es por ejemplo un recubrimiento biocompatible (o capa de cobertura). El recubrimiento biocompatible permite que el dispositivo se introduzca directamente en matrices biológicas complejas. Una ventaja de las realizaciones de la presente invención es que un tapiz fibroso que comprende una red abierta de al menos una nanofibra basada en polímero es capaz de capturar los analitos y/o componentes que incluyen compuestos de interés, ayudado por su alta porosidad y gran área superficial de las nanofibras, lo que permite sustanciales capacidades de carga de compuestos. Además, la gran área superficial permite una rápida transferencia de energía y la absorción de energía láser. El tapiz biocompatible polimérico nanofibroso conductor permite una buena eficiencia de transferencia de la energía láser para el análisis de muestras biológicas.

La impronta molecular de los polímeros (MIP) se puede usar para aumentar la eficiencia de la extracción y contribuir a la sensibilidad y especificidad del análisis reduciendo aún más los posibles efectos de la matriz.

La siguiente tabla muestra diferentes experimentos en un diseño factorial fraccionado en el que se usan diferentes tapices fibrosos para tomar una muestra de heces o rectal y para desorber y obtener el número de características moleculares de la muestra. De esta forma, la mezcla de PVP/PS se puede optimizar para heces o contenido rectal.

En cada experimento se usa un tapiz fibroso diferente. La primera columna muestra el número del experimento. La segunda columna muestra la duración del hilado de las nanofibras de PVP/PS. La tercera columna muestra la duración de la aplicación de la capa de cobertura de PAN. La cuarta columna muestra el porcentaje en peso de PVP respecto a la masa total del polímero. La quinta columna muestra el porcentaje en peso total del polímero en disolución. La sexta columna muestra el número de características moleculares detectadas. La séptima columna muestra el porcentaje de características con CV < 30 %, y la última columna muestra la intensidad normalizada resumida. Estos se obtienen en base a un mínimo de 3 repeticiones, y se promedian usando los espectros de masas obtenidos.

La FIG. 11 muestra una imagen de SEM de nanofibras de PVP/PS con acción más óptima frente a la huella molecular de las heces. En la imagen de SEM se muestra la separación de fases entre PVP y PS (esto se indica mediante la flecha SEP).

La FIG. 12 muestra una imagen de SEM de fibras de PAN 120 de una capa de cubierta 125 de un tapiz fibroso, según realizaciones de la presente invención.

Como se discutió anteriormente, el tapiz fibroso puede comprender nano- o micropartículas incorporadas en la red abierta de la una o más nanofibras. En las FIG. 5 y FIG. 21 se muestran imágenes de SEM de tal red abierta 115 que comprende micropartículas 135. El tapiz fibroso es un tapiz compuesto por fibras de PS/PVP. En los ejemplos, se dispersaron 3-9 % de partículas HLB (1,5-20 gm de tamaño) en una disolución de PS/PVP al 8 % en peso. El disolvente fue DMF/CHCl3. Las fibras, obtenidas mediante electrohilado, tenían un diámetro inferior a 900 nm. Las imágenes muestran partículas que están atrapadas dentro de las nanofibras, y en algunos casos son parte de las nanofibras.

La siguiente tabla muestra diferentes experimentos en un diseño factorial fraccionado en el que se usan diferentes tapices fibrosos para tomar una muestra de saliva y para desorber y obtener el número de características moleculares de la muestra. De esta forma, la mezcla de PVP/PS y la cobertura de PAN se pueden optimizar para saliva.

La siguiente tabla muestra diferentes experimentos en un diseño factorial fraccionado en el que se usan diferentes tapices fibrosos para tomar una muestra de orina y para desorber y obtener el número de características moleculares de la muestra. De esta forma, la mezcla de PVP/PS y la cobertura de PAN se pueden optimizar para orina.

En los siguientes párrafos se analizan los experimentos de deformación tras la exposición al agua. Se seleccionaron dos membranas de trabajo (es decir, tapices fibrosos) con diferentes porcentajes en peso de PVP/PS (40/60-60/40), y una membrana de control negativo con porcentajes en peso de PVP/PS (80/20).

Para el protocolo de prueba de deformación, se ejecutaron las siguientes etapas:

• Las membranas se cortaron en 3x3 cm;

• S e acondicionaron a 60 °C durante 48 horas;

• Las membranas se sumergieron en agua en una placa de Petri durante 30 minutos, 1 y 2 horas;

• Las dimensiones de la membrana se midieron nuevamente usando una escala de medida.

Los resultados para la membrana N6 se muestran en la siguiente tabla.

Los resultados para la membrana N18 se muestran en la siguiente tabla.

Las medidas se llevaron a cabo por triplicado, y se obtuvieron usando una configuración de medida como la ilustrada en las imágenes en la FIG. 22. Detrás de cada tapiz fibroso hay una regla que permite medir una dimensión característica (por ejemplo, ancho o diámetro) del tapiz en diferentes momentos. Se observó que las membranas no se encogían, hinchaban ni disolvían en agua destilada. Tampoco se observó ningún cambio de color.

Para la membrana de control negativo con PVP/PS % de (80/20), se observó una incoherencia del tapiz. Se observó una pérdida de fibras y una deformación de la membrana. Además, las membranas se pegaron a la placa de Petri, y cuando se retiraron, formaron una estructura similar a un gel. La FIG. 23 muestra un ejemplo que ilustra nanofibras que se desprenden de la membrana y se disuelven en agua destilada. La FIG. 24 muestra cómo las membranas se adhieren a la placa de Petri.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un tapiz fibroso (100), configurado

para uso en la toma de una muestra de metaboloma y para uso en la desorción de la muestra de metaboloma, comprendiendo el tapiz fibroso (100) una red abierta (115) de al menos una nanofibra (110) basada en polímero, en el que el diámetro de la al menos una nanofibra (110) oscila entre 50 nm y 1500 nm,

caracterizado por que se proporciona una capa de cubierta (125) en una parte superior y/o en una parte inferior de la red abierta de al menos una nanofibra para excluir que las partículas con una masa mayor que 3,32x10'24 Kg (2000 Da) interactúen con la red abierta (115) de al menos una nanofibra (110) bloqueando y/o excluyendo el acceso a estas partículas.

2. Un tapiz fibroso (100) según la reivindicación 1, en el que se selecciona una relación de restos hidrófilos/hidrófobos de la al menos una nanofibra (110) de tal manera que la deformación del tapiz fibroso sea menor que 5 % en tamaño después de la exposición al agua.

3. Un tapiz fibroso (100) según la reivindicación 2, en el que la relación de restos hidrófilos/hidrófobos oscila de 75/25 a 10/90.

4. Un tapiz fibroso (100) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, configurado para uso en la desorción e ionización de la muestra de metaboloma.

5. Un tapiz fibroso (100) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, configurado para uso en la desorción asistida por láser de la muestra de metaboloma.

6. Un tapiz fibroso (100) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, configurado para uso en el diagnóstico de la muestra de metaboloma.

7. Un tapiz fibroso (100) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo el tapiz fibroso nano- o micro-partículas (135) que están incorporadas en la red abierta (115) de la al menos una nanofibra basada en polímero, o en la al menos una nanofibra basada en polímero.

8. Un tapiz fibroso (100) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la al menos una nanofibra (110) comprende uno o más materiales seleccionados de:

una lista de polímeros hidrófilos que comprende poliacrilato, poliacrilonitrilo, polivinilpirrolidona, y/o de una lista de polímeros hidrófobos que comprende poliestireno, divinilbenceno, polidimetilsiloxano, polidivinilbenceno, y/o de una lista de polímeros hidrófobos/hidrófilos combinados que comprenden polidivinilbenceno-copolivinilpirrolidona, divinilbenceno hidrófilo, polivinilpirrolidona reticulada.

9. Un dispositivo de muestreo (200) que comprende un tapiz fibroso (100) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un soporte (210) al que se fija el tapiz fibroso.

10. Un método (300) para la desorción de una muestra de metaboloma, comprendiendo el método

- proporcionar (310) un tapiz fibroso (100) según la reivindicación 1, que porta una muestra de metaboloma, - someter (320) el tapiz fibroso (100) a un dispositivo configurado para desorber la muestra de metaboloma - desorber (330) la muestra de metaboloma.

11. Un método (300) según la reivindicación 10, en el que proporcionar (310) el tapiz fibroso (100) comprende tomar la muestra de metaboloma usando el tapiz fibroso.

12. Un método (300) según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en el que la desorción es seguida de o se combina con la ionización (330) de la muestra de metaboloma.

13. Un método (300) según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el tapiz fibroso proporcionado (100) es un tapiz según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.

14. Un método (310) para proporcionar un tapiz fibroso (100), en el que proporcionar (310) el tapiz fibroso comprende:

- disolver al menos un componente polimérico en un disolvente en el que están presentes restos hidrófilos e hidrófobos en el al menos un componente polimérico,

- electrohilar el al menos un componente polimérico disuelto, formando así un tapiz fibroso (100) que comprende (a) una red abierta (115) de al menos una nanofibra (110) basada en polímero, en el que la al menos una nanofibra (110) se hila con un diámetro que oscila entre 50 nm y 1500 nm, proporcionando (b) una capa de cubierta (125) en una parte superior y/o en una parte inferior de la red abierta (115) de al menos una nanofibra (110) para excluir que partículas con una masa mayor de 3,32x10-24Kg (2000 Da) interactúen con la red abierta (115) de al menos una nanofibra (110), bloqueando y/o excluyendo el acceso a estas partículas.

15. Un método (310) según la reivindicación 14, en el que el al menos un polímero se hila de manera que se forman poros interconectados entre las nanofibras (110) de la red abierta (115).