ES2990881T3 - Composición de inhibidor de IL-1BETA y uso de la misma - Google Patents

Abstract

Se describe una composición terapéutica que puede utilizarse para tratar o prevenir enfermedades asociadas con la modulación de la actividad de IL-1β humana. En ciertos aspectos, la invención divulgada se basa en la ingeniería de un ensamblaje de proteína heterodímera que es capaz de unirse a IL-1β humana y atenuar su función. El ensamblaje de proteína heterodímera comprende porciones extracelulares de IL1-R1 humana y de IL-1RAcP humana, o sus fragmentos funcionales. Cada una, la porción IL1-R1 y la porción IL-1RAcP, está fusionada a un mutante distinto de la porción Fc de la Ig Gamma-1 humana. Los dos mutantes Fc distintos en el ensamblaje de proteína heterodímera están diseñados para favorecer la formación de dímeros heteroméricos entre los dos mutantes Fc sobre cualquier ensamblaje homomérico. También se proporcionan vectores de expresión de ADN y sistemas de expresión para sobreproducir los polipéptidos en células de mamíferos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición de inhibidor de IL-1 p y uso de la misma

Campo de la invención

En general, la invención se refiere al campo de los productos farmacéuticos biológicos, así como a su uso en afecciones asociadas con trastornos inflamatorios (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, etc.), diabetes, enfermedad cardiovascular y gota. Más específicamente, la invención se refiere a una composición derivada de IL-1 R1/IL-1 RAcP heterodimérica que es capaz de inhibir la citoquina IL-1 p.

Antecedentes

La familia de citoquinas de interleucina-1 (IL-1) comprende 11 proteínas (IL-1 F1 a IL-1F11) codificadas por 11 genes distintos en humanos y ratones. Las citoquinas de tipo IL-1 son los principales mediadores de las reacciones inmunitarias innatas, y el bloqueo de los miembros fundadores IL-1 o IL-1 p por el antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1 RA) ha demostrado tener un papel central de IL-1 en una serie de enfermedades autoinflamatorias humanas. IL-1 o IL-1 p aumentan rápidamente la expresión de ARN mensajero de cientos de genes en múltiples tipos de células diferentes. Las potentes actividades proinflamatorias de IL-1 e IL-1 p están restringidas a tres niveles principales: (i) síntesis y liberación, (ii) receptores de membrana y (iii) transducción de señales intracelulares. Esta ruta resume la señalización extracelular e intracelular de IL-1 o IL-1 p, incluidos los mecanismos de retroalimentación positiva y negativa que amplifican o terminan la respuesta de IL-1. En respuesta a la unión al ligando del receptor, una secuencia compleja de eventos de fosforilación y ubiquitinación combinatorias da como resultado la activación de la señalización del factor nuclear kappa-B y las rutas de proteína quinasa activadas por mitógenos JNK y p38, que, de forma cooperativa, inducen la expresión de genes diana canónicos de IL-1 (tales como IL-6, IL-8, MCP-1, COX-2, IB, IL-1, IL-1 p, MKP-1) mediante mecanismos transcripcionales y postranscripcionales. Cabe destacar que la mayor parte de los componentes intracelulares que participan en la respuesta celular a IL-1 también median las respuestas a otras citoquinas (IL-18 e IL-33), receptores de tipo Toll (TLR) y muchas formas de estrés citotóxico (véase Weber A., et al., Sci Signal., 19 de enero de 2010;3(105)).

IL-1 e IL-1 p se unen independientemente al receptor de IL-1 de tipo I (IL-1R1), que se expresa de forma ubicua. Un tercer ligando específico, el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1 RA), se une al IL-1 RI con especificidad y afinidad similares, pero no activa el receptor ni desencadena la señalización corriente abajo. La proteína accesoria del receptor de IL-1 (IL-1 RAcP) sirve como un correceptor que se requiere para la transducción de señales de complejos IL-1/IL-1 RI, y este correceptor también es necesario para la activación de IL-1 R1 por otros miembros de la familia IL-1, en particular IL-18 e IL-33. El receptor de IL-1 tipo II (IL-1R2) se une a IL-1 e IL-1 p, pero carece de una parte citosólica competente para la señalización y, por lo tanto, sirve como receptor señuelo. El 11,-1 RA, el IL-1R2 anclado a la membrana plasmática y los dominios “desprendidos” de origen natural de cada una de las cadenas de receptores de IL-1 extracelulares (que se denominan sIL-1 RI, sIL-1 RII y sIL-1RAcP, donde “s” significa soluble) proporcionan reguladores negativos inducibles de la señalización de IL-1 en el espacio extracelular cuya abundancia, que está regulada por una combinación de transcripción aumentada y liberación controlada, puede limitar o terminar los efectos de IL-1.

La etapa inicial en la transducción de señales de IL-1 es un cambio conformacional inducido por ligando en el primer dominio extracelular del IL-1 RI que facilita el reclutamiento de IL-1 RacP. A través de regiones citosólicas conservadas llamadas dominios de tipo Toll e IL-1R (TIR), el complejo trimérico ensambla rápidamente dos proteínas de señalización intracelular, el gen de respuesta primaria de diferenciación mieloide 88 (MYD88) y la proteína quinasa activada por el receptor de interleucina-1 (IRAK) 4. Los ratones que carecen de MYD88 o IRAK4 muestran defectos graves en la señalización de IL-1. De manera similar, los humanos con mutaciones en el gen IRAK4 tienen defectos en la señalización de IL-1 RI y del receptor de tipo Toll (TLR). IL-1, IL-1 RI, IL-RAcP, MYD88 e IRAK4 forman un primer módulo de señalización estable inducido por IL-1. Esto es paralelo a la (auto)fosforilación de IRAK4, que posteriormente fosforila IRAK1 e IRAK2, y luego esto es seguido por el reclutamiento y la oligomerización del factor asociado al factor de necrosis tumoral (TRAF) 6. IRAK1 y 2 funcionan como adaptadores y proteínas quinasas para transmitir señales corriente abajo. Los complejos de IRAK1, IRAK2 y TRAF6 se disocian del complejo receptor inicial, y las células que carecen de estas proteínas tienen una activación alterada de los factores de transcripción factor nuclear kappa-B (NF-kappa-B) y proteína activadora 1 (AP-1).

La sobreproducción de IL-1 es la causa de muchos trastornos inflamatorios. Por ejemplo, la IL-1 se ha relacionado con la patología de la diabetes, las enfermedades cardiovasculares, la gota y determinados tipos de artritis (por ejemplo, la artritis reumatoide (AR)).

Rilonacept es un antagonista de IL-1 que incluye una proteína de fusión específica de IL-1 que comprende una parte de unión a IL-1 del dominio extracelular de IL1 -RAcP humana, una parte de unión a IL-1 del dominio extracelular de IL-1 RI humana y un componente multimerizante. Esta proteína de fusión específica de IL-1 se describe en la patente US-6.472.179, en la publicación de patente estadounidense número 2003/0143697, publicada el 31 de julio de 2003, la patente US-7.361.350, y la publicación de patente estadounidense número 2005/0.197.293, publicada el 8 de septiembre de 2005.

Rilonacept, bajo el nombre comercial ARCALYST, fue aprobado por la Food and Drug Administration (FDA, administración de alimentos y medicamentos de los Estados Unidos) para el tratamiento de los Síndromes Periódicos Asociados a la Criopirina (CAPS), incluido el Síndrome Autoinflamatorio Familiar por Frío (FCAS) y el Síndrome de Muckle-Wells (MWS) en adultos y niños mayores de 12 años. Actualmente se están realizando más ensayos clínicos de rilonacept, es decir, para la gota.

En el artículo de ECONOMIDES A.N. et al., “Cytokine traps: multi-component, high-affinity blockers of cytokine action” , NATURE MEDICINE, NATURE PUB. CO, NUEVA YORK, vol. 9, n.21, (01 -01 -2003), páginas 47-52, XP002.256.034, se describe la modificación de construcciones separadas que codifican el dominio extracelular de IL6Ra o gp130 fusionado a la porción Fc de la inmunoglobulina humana 1. El artículo también informa sobre el diseño de una segunda generación de trampas de citoquinas, en donde los dominios extracelulares de dos receptores distintos se fusionan en línea y luego se fusionan con la porción Fc de la LgG1 humana.

Resumen de la invención

En determinados aspectos, la presente invención proporciona una composición de proteínas heterodiméricas capaz de unirse a IL-1 p humana (GenBank: AAH08678.1). La composición de proteínas comprende un primer polipéptido que incluye una primera secuencia de aminoácidos que contiene los aminoácidos 18 a 333 de la IL1-R1 humana (GenBank: AAM88423.1), y una segunda secuencia de aminoácidos que contiene un primer mutante de una porción Fc de Fc de inmunoglobulina gamma-1 humana (GenBank: J00228.1). La composición de proteínas también comprende un segundo polipéptido que incluye otra primera secuencia de aminoácidos que contiene los aminoácidos 21 a 358 de II,1-RAcP humana (GenBank: BAA25421.1), y otra segunda secuencia de aminoácidos que contiene un segundo mutante de la porción Fc de Fc de inmunoglobulina gamma-1 humana. En la composición de proteínas, los mutantes primero y segundo se seleccionan para favorecer el ensamblaje heterodimérico entre los mutantes primero y segundo sobre cualquier ensamblaje homodimérico. En la composición de proteínas, el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 1 y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n. ° 2. La composición de proteínas puede presentar actividad de unión a IL-1 p humana en un ensayo ELISA con una EC50 de aproximadamente 50 ng/ml.

En determinados aspectos, la presente invención proporciona una composición terapéutica. La composición terapéutica comprende una composición de proteínas heterodiméricas capaz de unirse a IL-1 p humana. La composición de proteínas comprende un primer polipéptido que incluye una primera secuencia de aminoácidos que contiene los aminoácidos 18 a 333 de IL1-R1 humana, y una segunda secuencia de aminoácidos que contiene un primer mutante de la porción Fc de Fc de inmunoglobulina gamma-1 humana. La composición de proteínas también comprende un segundo polipéptido que incluye otra primera secuencia de aminoácidos que contiene los aminoácidos 21 a 358 de IL1-RAcP humana, y otra segunda secuencia de aminoácidos que contiene un segundo mutante de la porción Fc de Fc de inmunoglobulina gamma-1 humana. En la composición de proteínas, los mutantes primero y segundo se seleccionan para favorecer el ensamblaje heterodimérico entre los mutantes primero y segundo sobre cualquier ensamblaje homodimérico.

En la composición de proteínas, el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 1 y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 2.

La composición terapéutica puede presentar una semivida de la composición de proteínas heterodiméricas en circulación sistémica en ratones después de una administración subcutánea a una dosis de 5 mg/kg de al menos aproximadamente 88 horas, como se analiza mediante ELISA de Fc humano.

En determinados aspectos, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de la id. de sec. n.° 1, id. de sec. n.° 2, id. de sec. n.° 3 y la id. de sec. n.° 5.

El uso de codones del ácido nucleico puede optimizarse para una alta expresión del polipéptido en una célula de mamífero.

En determinados aspectos, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 3 y que comprende la secuencia de la id. de sec. n. ° 4, o una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 5 y que comprende la secuencia de la id. de sec. n.° 6.

El ácido nucleico puede comprender un vector de expresión.

En determinados aspectos, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado de la id. de sec. n.° 7.

En determinados aspectos, la presente invención proporciona un sistema de expresión heterólogo. El sistema de expresión alberga un vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un primer polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 3 y otra secuencia de ácidos nucleicos que codifica un segundo polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 4. El vector de expresión del sistema de expresión puede estar alojado en una célula de mamífero. La célula de mamífero puede ser una célula de CHO. El sistema de expresión puede ser capaz de expresar una proteína heterodimérica que comprende un primer polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 1 y un segundo polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 2. El nivel de expresión de la proteína heterodimérica puede ser de al menos 300 mg por litro de cultivo celular.

En determinados aspectos, la presente invención proporciona una sustancia para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad asociada con la modulación de la actividad de la IL-1 p humana. La sustancia comprende una proteína heterodimérica compuesta por un primer polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 1 y un segundo polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 2. La enfermedad asociada con la modulación de la actividad de la IL-1 p humana puede ser una artritis, una gota, una artritis reumatoide, un Síndromes Periódicos Asociados a la Criopirina (CAPS), una esclerodermia, una diabetes, una aterosclerosis, una enfermedad del ojo seco, una alergia ocular o una uveítis.

En determinados aspectos, la presente invención proporciona una composición de proteínas heterodiméricas capaz de unirse a humana, en donde dicha composición heterodimérica comprende un primer polipéptido que comprende la id. de sec. n.° 1 y un segundo polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 2. La composición de proteínas es capaz de inhibir la producción de IL-6 humana en fibroblastos de pulmón humano en respuesta al tratamiento de los fibroblastos con IL-1 p humana. La inhibición se caracteriza por un valor IC50 de aproximadamente 2,3 pM.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos y descripciones se proporcionan para ayudar a comprender la invención:

laFigura 1ilustrativamente muestra un ensamblaje de proteínas heterodiméricas de las presentes enseñanzas que comprende una porción extracelular de IL1-R1 fusionada con un dominio IgG-Fc (Fc-II) a través de un enlazador flexible y una porción extracelular de IL1-RAcP fusionada con otro dominio IgG-Fc (Fc-V) a través de otro enlazador flexible;

laFigura 2muestra esquemáticamente el mapa del plásmido PKN012 y la secuencia anotada utilizada en la clonación de los polipéptidos de la presente invención;

laFigura 3muestra una curva de crecimiento de transfección representativa obtenida en el proceso de generación de líneas celulares estables para expresar los polipéptidos de la presente invención;

laFigura 4muestra un cromatograma analítico de HPLC de exclusión por tamaño de la muestra que contiene heterodímeros que comprenden el polipéptido de la id. de sec. n.° 1 y el polipéptido de la id. de sec. n.° 2 después de la etapa de purificación por cromatografía de intercambio aniónico;

laFigura 5muestra un análisis de SDS-PAGE de la muestra que contiene heterodímeros que comprenden el polipéptido de la id. de sec. n.° 1 y el polipéptido de la id. de sec. n.° 2 después de la etapa de purificación por cromatografía de intercambio aniónico;

laFigura 6muestra una curva de unión típica de una muestra purificada que contiene heterodímeros que comprenden el polipéptido de la id. de sec. n.° 1 y el polipéptido de la id. de sec. n.° 2 en un ensayo ELISA utilizando IL-1 p humana disponible comercialmente;

laFigura 7muestra la curva de calibración obtenida en el experimento de ensayo de inhibición de la producción de IL-6 mediada por anticuerpos IL-1;

laFigura 8muestra los resultados de la producción de IL-6 mediada por IL-1 p y la recuperación de IL-6 del medio de cultivo donde las células MRC5 se incubaron durante 24 horas con IL-1 p a una concentración final de 50 pg/ml (IL-1 sola) o se dejaron sin tratar (Cells Ctrl) mientras que el medio de cultivo no expuesto a las células se enriqueció con IL-6 a una concentración final de 20 pg/ml para estimar la recuperación de IL-6;

laFigura 9muestra los resultados de las mediciones de la producción de IL-6 mediada por IL-1 p y la recuperación de IL-6 del medio de cultivo donde las células MRC5 se incubaron durante 24 horas con IL-1 p a una concentración final de 50 pg/ml (IL-1 sola) o se dejaron sin tratar (Células Ctrl). El medio de cultivo no expuesto a las células se enriqueció con IL-6 a una concentración final de 20 pg/ml para estimar la recuperación de IL-6;

laFigura 10muestra la curva de calibración obtenida en el ensayo de inhibición de la producción de IL-6 realizado con el heterodímero IL1 R-FcV-RAcP-FcII de las presentes enseñanzas;

laFigura 11muestra los resultados de las mediciones de inhibición de la producción de IL-6 mediada por IL-1 p con heterodímero IL1 R-FcV-RAcP-FcII y la recuperación de IL-6 del medio de cultivo donde las células MRC5 se incubaron durante 24 horas con IL-1 p a una concentración final de 50 pg/ml (IL-1 sola) o se dejaron sin tratar (Células Ctrl) mientras que el medio de cultivo no expuesto a las células se enriqueció con IL-6 a una concentración final de 30 pg/ml para estimar la recuperación de IL-6 (RPH-10 30 pg/ml IL6); para garantizar la consistencia entre dos placas de cultivo celular utilizadas para este experimento, se compararon los efectos de IL-1 en la producción de IL-6 de ambas placas (IL-1 sola e IL1 sola Placa 2, para las placas 1 y 2 respectivamente); también se analizó el efecto de la concentración más alta (20 pg/ml) del heterodímero II ,1R-FcV-RAcP-Fcn sobre la producción de IL-6 (RPH-10 solamente); También se incluyó la dilución del heterodímero IL1R-FcV-RAcP-FcII correspondiente a una concentración final de 204,8 ng/ml para demostrar la uniformidad de los datos entre las dos placas (RPH10 Placa 2); y

LaFigura 12muestra los resultados de las mediciones de la curva de titulación para el experimento de heterodímero L1R-FcV-RAcP-FcII donde las células MRC5 se incubaron con IL-1 p o IL-1 p mezcladas previamente con diversas concentraciones de heterodímero L1 R-FcV-RAcP-FcII; La producción de IL-6 se midió mediante ELISA de Quantakine y los datos se analizaron utilizando un algoritmo de ajuste de 4 parámetros; el coeficiente C en la ecuación resultante es numéricamente igual a un valor de IC50 de 0,3 ng/ml o aproximadamente 2,4 pM.

Descripción detallada de la invención

Las enseñanzas descritas en la presente memoria se basan, en parte, en la modificación de un ensamblaje de proteínas heterodiméricas que es capaz de unirse a IL-1 p humana y atenuar su función. El ensamblaje de proteínas heterodiméricas de las presentes enseñanzas comprende porciones extracelulares de IL1-R1 (GenBank: AAM88423.1) y de IL-1RAcP (GenBank: BAA25421.1), o fragmentos funcionales de las mismas. La porción IL1-R1 y la porción IL-1 RAcP, se fusiona ambas a un mutante distinto de la porción Fc de la Ig Gamma-1 humana (GenBank: J00228.1). Los dos mutantes de Fc distintos en el ensamblaje de proteínas heterodiméricas se modifican para favorecer la formación de dímeros heteroméricos entre los dos mutantes de Fc sobre cualquier ensamblaje homomérico. Para permitir la producción recombinante del ensamblaje de proteínas heterodiméricas de las presentes enseñanzas, se ha construido un vector de expresión de ADN para sobreproducir el ensamblaje de proteínas heterodiméricas en un sistema de expresión de proteína heteróloga, y se han preparado células de mamífero que expresan de forma estable el ensamblaje de proteínas heterodiméricas a un alto nivel de expresión. Se ha ideado un procedimiento de purificación de proteínas que permite obtener una preparación fisiológicamente relevante sustancialmente pura del ensamblaje de proteínas heterodiméricas de las presentes enseñanzas. Por lo tanto, la molécula de proteína purificada demuestra un alto grado de actividad específica en un ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA)in vitroutilizando IL-1 p humana (GenBank: AAH08678.1). Inesperadamente, la molécula de proteína presenta un perfil farmacocinético aceptable tras la administración subcutánea en animales, sin provocar ninguna pérdida de peso corporal ni ningún evento clínico adverso.

Los términos utilizados en esta memoria descriptiva generalmente tienen sus significados ordinarios en la técnica, dentro del contexto de esta invención y en el contexto específico donde se utiliza cada término. Determinados términos se discuten a continuación, o en otra parte de la memoria descriptiva, para proporcionar orientación adicional al profesional al describir las composiciones y métodos de la invención y cómo hacerlos y usarlos. El alcance o significado de cualquier uso de un término será evidente a partir del contexto específico en el que se utiliza el término. “Alrededor de” y “ aproximadamente” generalmente significarán un grado aceptable de error para la cantidad medida dada la naturaleza o precisión de las mediciones. Típicamente, los grados de error ejemplares no se diferencian en más de 20 por ciento (%), preferiblemente 10 % y, más preferiblemente, 5 % de un valor o rango de valores dado. Alternativamente, y particularmente en sistemas biológicos, los términos “ alrededor de” y “aproximadamente” pueden significar valores que están dentro de un orden de magnitud, preferiblemente de 5 veces y, más preferiblemente, de 2 veces un valor dado. Las cantidades numéricas dadas en la presente memoria son aproximadas salvo que se indique lo contrario, lo que significa que se puede inferir el término “alrededor de” o “ aproximadamente” cuando no se indica expresamente.

Los métodos descritos en la presente memoria pueden incluir etapas de comparación de secuencias entre sí, incluida la secuencia de tipo salvaje con uno o más mutantes (variantes de secuencia). Dichas comparaciones típicamente comprenden alineaciones de secuencias de polímeros, por ejemplo, utilizando programas y/o algoritmos de alineación de secuencias que son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, BLAST, FASTA y MEGALIGN, por nombrar algunos). El experto en la técnica puede apreciar fácilmente que, en tales alineamientos, cuando una mutación contiene una inserción o deleción de residuo, el alineamiento de secuencia introducirá un “ hueco” (típicamente representado por un guion o “A” ) en la secuencia polimérica que no contiene el residuo insertado o eliminado.

Los métodos descritos en la presente memoria pueden incluir cálculos estadísticos, por ejemplo, la determinación de los valores de IC50 o EC50, etc. El experto en la técnica puede apreciar fácilmente que esto se puede realizar utilizando una variedad de software disponible comercialmente, por ejemplo, PRISM (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, EE. UU.) o similar.

“ Homólogo” , en todas sus formas gramaticales y variaciones ortográficas, se refiere a la relación entre dos proteínas que poseen un “origen evolutivo común” , incluidas las proteínas de superfamilias en la misma especie de organismo, así como las proteínas homólogas de diferentes especies de organismo. Dichas proteínas (y sus ácidos nucleicos codificantes) tienen homología de secuencia, como se refleja por su similitud de secuencia, ya sea en términos de porcentaje de identidad o por la presencia de residuos o motivos específicos y posiciones conservadas. Sin embargo, en el uso común y en la presente solicitud, el término “ homólogo” , cuando se modifica con un adverbio tal como “altamente” , puede referirse a la similitud de secuencia y puede o no relacionarse con un origen evolutivo común.

El término “similitud de secuencia” , en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos que pueden o no compartir un origen evolutivo común.

Los términos “proteína” y “ polipéptido” se usan indistintamente. Los polipéptidos descritos en la presente memoria pueden estar compuestos por más de una cadena de aminoácidos contigua, formando así dímeros u otras formaciones oligoméricas. En general, los polipéptidos descritos en la presente memoria para su uso en mamíferos se expresan en células de mamífero que permiten modificaciones postraduccionales adecuadas, tales como las líneas celulares CHO o HEK293, aunque también se espera que sean útiles otras líneas celulares de expresión de mamífero. Por lo tanto, se prevé que los polipéptidos descritos en la presente memoria puedan modificarse postraduccionalmente sin afectar sustancialmente a su función biológica.

En determinados aspectos, las variantes funcionales de los ensamblajes de proteínas heterodiméricas descritas en la presente memoria incluyen proteínas de fusión que tienen al menos una parte biológicamente activa de la IL1-R1 o IL-1 RAcP humana o un fragmento funcional de esta, y uno o más dominios de fusión. Los ejemplos bien conocidos de tales dominios de fusión incluyen, aunque no de forma limitativa, polihistidina, Glu-Glu, glutatión S-transferasa (GST, por sus siglas en inglés), tiorredoxina, proteína A, proteína G, una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, una Fc), proteína de unión a maltosa (MBP, por sus siglas en inglés) o albúmina sérica humana. Se puede seleccionar un dominio de fusión para conferir una propiedad deseada. Por ejemplo, las porciones de polipéptido IL1-R1 o IL-1RAcP pueden fusionarse con un dominio que estabiliza los polipéptidos IL1-R1 o IL-1 RAcPin vivo(un dominio “estabilizador” ), opcionalmente a través de un enlazador peptídico adecuado. El término “estabilizador” significa cualquier cosa que aumente la vida media de un polipéptido en la circulación sistémica, independientemente de si esto se debe a una disminución de la destrucción, una disminución de la eliminación u otro efecto farmacocinético. Se sabe que las fusiones con la porción Fc de una inmunoglobulina confieren propiedades farmacocinéticas deseables a determinadas proteínas. Del mismo modo, las fusiones con albúmina sérica humana pueden conferir propiedades deseables. Otros tipos de dominios de fusión que pueden seleccionarse incluyen dominios de multimerización (por ejemplo, dimerización, tetramerización) y dominios funcionales que confieren una función biológica adicional, por ejemplo, favorecer la acumulación en el sitio de acción dianain vivo.

En determinados aspectos, los ensamblajes de proteínas heterodiméricas descritos en la presente memoria comprenden una porción extracelular de IL1 -R1, o un fragmento funcional de esta, fusionada con un dominio IgG-Fc, y una porción extracelular de IL-1 RAcP, o un fragmento funcional de esta, fusionada con otro dominio IgG-Fc. El dominio IgG-Fc y el otro dominio IgG-Fc se escogen para favorecer un ensamblaje de proteínas heterodiméricas sobre cualquier ensamblaje de proteínas homodiméricas. La porción extracelular de IL1 -R1 puede fusionarse con el dominio IgG-Fc a través de un enlazador flexible, mientras que IL-1 RAcP, o un fragmento funcional de esta, puede fusionarse con el otro dominio IgG-Fc a través del enlazador flexible de la misma secuencia de aminoácidos o a través de otro enlazador flexible.

En una realización ilustrativa, mostrada ilustrativamente en laFigura 1,la porción extracelular de IL1-R1 fusionada con el dominio IgG-Fc (Fc-II) mediante un enlazador flexible puede comprender la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 1, mientras que IL-1 RAcP fusionada con otro dominio IgG-Fc (Fc-V) a través de un enlazador flexible puede comprender la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 2.

Polipéptido hlL1-R1-hlgG1-Fc (id. de sec. n.° 1) LEADKCKERE EKIILVSSAN EIDVRPCPLN PNEHKGTITW YKDDSKTPVS TEQASRIHQH 60

KEKLWFVPAK VEDSGHYYCV VRNSSYCLRI KISAKFVENE PNLCYNAQAI FKQKLPVAGD 120 GGLVCPYMEF FKNENNELPK LQWYKDCKPL LLDNIHFSGV KDRLIVMNVA EKHRGNYTCH 180 ASYTYLGKQY PITRVIEFIT LEENKPTRPV IVSPANETME VDLGSQIQLI CNVTGQLSDI 240 AYWKWNGSVI DEDDPVLGED YYSVENPANK RRSTLITVLN ISEIESRFYK HPFTCFAKNT 300 HGIDAAYIQL IYPVTNGSGG GDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV 360 TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY 420 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV 480 EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFKLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK 540

SLSLSPGK 548

Polipéptido hlL-1RAcP-hlgG1-Fc (id. de sec. n.° 2) SERCDDWGLD TMRQIQVFED EPARIKCPLF EHFLKFNYST AHSAGLTLIW YWTRQDRDLE 60

EPINFRLPEN RISKEKDVLW FRPTLLNDTG NYTCMLRNTT YCSKVAFPLE VVQKDSCFNS 120

PMKLPVHKLY IEYGIQRITC PNVDGYFPSS VKPTITWYMG CYKIQNFNNV IPEGMNLSFL 180 IALISNNGNY TCWTYPENG RTFHLTRTLT VKWGSPKNA VPPVIHSPND HWYEKEPGE 240 ELLIPCTVYF SFLMDSRNEV WWTIDGKKPD DITIDVTINE SISHSRTEDE TRTQILSIKK 300 VTSEDLKRSY VCHARSAKGE VAKAAKVKQK VPAPRYTVGS GGGDKTHTCP PCPAPELLGG 360

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCWVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN 420 STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPCRDE 480 LTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SALTVDKSRW 540 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 570

En determinados aspectos, las presentes enseñanzas proporcionan una molécula de ADN recombinante que tiene un marco de lectura abierto que codifica para un polipéptido que comprende los 333 aminoácidos principales de la IL1-R1 humana fusionada con el dominio IgG-Fc (Fc-II) a través de un enlazador flexible, y para otra molécula de ADN recombinante que tiene un marco de lectura abierto que codifica para otro polipéptido que comprende los 358 aminoácidos principales de la IL-1 RAcP humana fusionada con otro dominio IgG-Fc (Fc-V) a través de un enlazador flexible.

En una realización ilustrativa, el polipéptido que comprende los 333 aminoácidos principales de la IL1-R1 humana fusionada con el dominio IgG-Fc (Fc-II) a través de un enlazador flexible comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 3. La molécula de ADN correspondiente puede comprender la secuencia de nucleótidos de la id. de sec. n.° 4. El otro polipéptido comprende los 358 aminoácidos principales de la IL-1 RAcP humana fusionada con otro dominio IgG-Fc (Fc-V) a través de un enlazador flexible puede comprender la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 5. La molécula de ADN correspondiente puede comprender la secuencia de nucleótidos de la id. de sec. n.° 6.

Polipéptido hIL1-R1-hIgG1-Fc (id. de sec. n.° 3)

MKVLLRLICF IALLISSLEA DKCKEREEKI ILVSSANEID VRPCPLNPNE HKGTITWYKD 60

DSKTPVSTEQ ASRIHQHKEK LWFVPAKVED SGHYYCWRN SSYCLRIKIS AKFVENEPNL 120 CYNAQAIFKQ KLPVAGDGGL VCPYMEFFKN ENNELPKLQW YKDCKPLLLD NIHFSGVKDR 180 LIVMNVAEKH RGNYTCHASY TYLGKQYPIT RVIEFITLEE NKPTRPVIVS PANETMEVDL 240 GSQIQLICNV TGQLSDIAYW KWNGSVIDED DPVLGEDYYS VENPANKRRS TLITVLNISE 300 IESRFYKHPF TCFAKNTHGI DAAYIQLIYP VTNGSGGGDK THTCPPCPAP ELLGGPSVFL 360 FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV WDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV 420 VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVCTLP PSRDELTKNQ 480 VSLSCAVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFKLVSKLTV DKSRWQQGNV 540

FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK 565

ADN de hIL1-R1-hIgG1-Fc (id. de sec. n.° 4)

ATGAAGGTCC TGCTCAGGCT GATCTGCTTCATTGCCCTGC TCATCAGCAG CCTGGAAGCC 60 GACAAGTGCA AGGAGAGGGA GGAGAAGATCATCCTCGTCA GCTCCGCCAA CGAGATTGAT 120 GTCAGGCCCT GCCCCCTCAA CCCCAATGAGCACAAGGGCA CAATCACCTG GTACAAGGAC 180 GACAGCAAGA CCCCTGTCTC CACCGAGCAGGCCAGCAGAA TCCACCAGCA CAAAGAGAAG 240 CTGTGGTTCG TGCCTGCCAA GGTGGAAGACAGCGGCCACT ACTACTGTGT GGTGAGGAAC 300 AGCTCCTACT GCCTCAGGAT CAAGATCTCCGCCAAGTTCG TGGAGAACGA GCCCAACCTC 360 TGTTACAACG CTCAGGCTAT TTTCAAGCAAAAGCTCCCCG TGGCTGGAGA CGGAGGCCTG 420 GTCTGTCCCT ACATGGAGTT CTTCAAGAATGAGAATAATG AGCTCCCCAA GCTCCAGTGG 480 TACAAGGACT GTAAGCCTCT GCTCCTGGACAACATCCACT TCTCCGGCGT GAAGGACAGA 540 CTGATCGTCA TGAACGTGGC CGAGAAGCACAGGGGAAACT ACACCTGTCA CGCCTCCTAC 600 ACCTACCTCG GCAAGCAATA TCCCATCACCAGGGTCATCG AGTTCATCAC CCTCGAAGAG 660 AACAAGCCCA CAAGGCCTGT CATCGTCAGCCCCGCCAATG AAACCATGGA GGTGGACCTC 720 GGCAGCCAGA TCCAGCTGAT CTGCAACGTGACAGGCCAGC TCAGCGACAT TGCCTACTGG 780 AAGTGGAACG GCTCCGTGAT CGACGAAGAT GATCCCGTGC TGGGCGAGGA CTACTATAGC 840 GTGGAGAACC CCGCCAACAA AAGAAGGAGCACCCTGATCA CCGTGCTGAA CATCAGCGAG 900 ATCGAGTCCA GATTCTATAA GCATCCTTTCACCTGCTTTG CCAAGAACAC CCACGGCATC 960 GACGCCGCTT ACATCCAGCT GATCTATCCCGTGACCAACG GATCCGGTGG AGGTGACAAA 1020 ACTCACACAT GCCCACCGTG CCCAGCTCCGGAACTCCTGG GCGGACCGTC AGTCTTCCTC 1080 TTCCCCCCAA AACCCAAGGA CACCCTCATGATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACATGCGTG 1140 GTGGTGGACG TGAGCCACGA AGACCCTGAGGTCAAGTTCA ACTGGTACGT GGACGGCGTG 1200 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGT ACAACAGCAC GTACCGTGTG 1260 GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGACTGGCTGAATG GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG 1320 GTCTCCAACA AAGCCCTCCC AGCCCCCATCGAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG 1380 CCCCGAGAAC CACAGGTGTG TACCCTGCCCCCATCCCGGG ATGAGCTGAC CAAGAACCAG 1440 GTCAGCCTGA GTTGCGCGGT CAAAGGCTTCTATCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG 1500 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAGACCACGCCTC CCGTGTTGGA CTCCGACGGC 1560 TCCTTCAAGC TCGTCAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCA GGTGGCAGCA GGGGAACGTC 1620 TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC 1680 CTGTCTCCGG GTAAA 1695 Polipéptido hIL-1 RAcP-hIgG1-Fc (id. de sec. n.° 5)

MTLLWCVVSL YFYGILQSDA SERCDDWGLD TMRQIQVFED EPARIKCPLF EHFLKFNYST 60 AHSAGLTLIW YWTRQDRDLE EPINFRLPEN RISKEKDVLW FRPTLLNDTG NYTCMLRNTT 120 YCSKVAFPLE VVQKDSCFNS PMKLPVHKLY IEYGIQRITC PNVDGYFPSS VKPTITWYMG 180 CYKIQNFNNV IPEGMNLSFL IALISNNGNY TCWTYPENG RTFHLTRTLT VKVVGSPKNA 240 VPPVIHSPND HVVYEKEPGE ELLIPCTVYF SFLMDSRNEV WWTIDGKKPD DITIDVTINE 300 SISHSRTEDE TRTQILSIKK VTSEDLKRSY VCHARSAKGE VAKAAKVKQK VPAPRYTVGS 360 GGGDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCWVDVS HEDPEVKFNW 420 YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS 480 KAKGQPREPQ VYTLPPCRDE LTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 540 LDSDGSFFLY SALTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 590 ADN de hIL-1 RAcP-hIgG1-Fc (id. de sec. n.° 6)

ATGACTCTGC TGTGGTGCGT CGTGTCCCTC TACTTCTACG GCATCCTCCA GTCCGACGCC 60

AGCGAGAGGT GCGATGACTG GGGCCTGGAC ACCATGAGGC AGATCCAGGT GTTTGAGGAC 120 GAGCCTGCCA GGATTAAGTG CCCCCTCTTC GAGCACTTTC TGAAGTTCAA CTACAGCACC 180 GCTCACAGCG CTGGCCTGAC ACTGATCTGG TACTGGACAA GGCAGGACAG GGATCTCGAG 240 GAGCCCATCA ACTTCAGGCT GCCCGAAAAC AGAATCAGCA AGGAGAAGGA CGTGCTGTGG 300 TTCAGACCCA CCCTCCTCAA CGACACAGGC AACTACACCT GCATGCTCAG GAACACCACC 360 TACTGCAGCA AGGTGGCCTT CCCTCTCGAG GTGGTCCAGA AGGACAGCTG CTTCAACAGC 420 CCCATGAAGC TGCCCGTCCA TAAACTGTAC ATCGAGTACG GCATCCAGAG GATCACATGC 480 CCCAACGTGG ACGGCTACTT CCCCAGCTCC GTGAAGCCCA CCATCACATG GTACATGGGC 540 TGTTACAAAA TCCAGAACTT TAACAACGTC ATCCCCGAGG GCATGAATCT GTCCTTCCTG 600 ATCGCCCTGA TCAGCAACAA CGGCAATTAC ACCTGCGTCG TGACCTACCC CGAAAACGGC 660 AGGACCTTCC ACCTGACCAG GACCCTGACC GTGAAAGTCG TGGGAAGCCC CAAGAATGCC 720 GTGCCCCCCG TGATCCATTC CCCCAACGAC CACGTGGTGT ACGAGAAGGA GCCTGGAGAG 780 GAGCTGCTGA TCCCCTGCAC AGTGTACTTC TCCTTCCTGA TGGACTCCAG GAATGAAGTG 840 TGGTGGACCA TCGACGGCAA GAAGCCTGAC GACATCACCA TCGATGTGAC CATCAACGAG 900 AGCATCAGCC ACAGCAGGAC CGAGGACGAG ACCAGGACCC AGATCCTGAG CATCAAGAAA 960 GTCACCAGCG AGGACCTCAA GAGAAGCTAC GTCTGTCACG CCAGAAGCGC CAAAGGCGAG 1020 GTGGCCAAGG CTGCTAAGGT GAAACAGAAA GTGCCCGCTC CTAGGTACAC AGTCGGATCC 1080 GGTGGAGGTG ACAAAACTCA CACATGCCCA CCGTGCCCAG CTCCGGAACT CCTGGGCGGA 1140 CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC CCCAAAACCC AAGGACACCC TCATGATCTC CCGGACCCCT 1200 GAGGTCACAT GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CACGAAGACC CTGAGGTCAA GTTCAACTGG 1260 TACGTGGACG GCGTGGAGGT GCATAATGCC AAGACAAAGC CGCGGGAGGA GCAGTACAAC 1320 AGCACGTACC GTGTGGTCAG CGTCCTCACC GTCCTGCACC AGGACTGGCT GAATGGCAAG 1380

AAAGCCAAAG GGCAGCCCCG AGAACCACAG GTGTACACCC TGCCCCCATG TCGGGATGAG 1500 CTGACCAAGA ACCAGGTCAG CCTGTGGTGC CTGGTCAAAG GCTTCTATCC CAGCGACATC 1560 GCCGTGGAGT GGGAGAGCAA TGGGCAGCCG GAGAACAACT ACAAGACCAC GCCTCCCGTG 1620 TTGGACTCCG ACGGCTCCTT CTTCCTCTAC AGCGCGCTCA CCGTGGACAA GAGCAGGTGG 1680 CAGCAGGGGA ACGTCTTCTC ATGCTCCGTG ATGCATGAGG CTCTGCACAA CCACTACACG 1740 CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC TCCGGGTAAA 1770

En determinados aspectos, la presente descripción proporciona un plásmido de expresión recombinante de mamífero para una alta expresión de un polipéptido que comprende los 333 aminoácidos principales de la IL1-R1 humana fusionada con el dominio IgG-Fc (Fc-II) a través de un enlazador flexible, y otra molécula de ADN recombinante que tiene un marco de lectura abierto que codifica otro polipéptido que comprende los 358 aminoácidos principales de la IL-1RAcP humana fusionada con otro dominio IgG-Fc (Fc-V) a través de un enlazador flexible. Este plásmido comprende dos promotores de citomegalovirus (CMV) para impulsar la transcripción de los dos genes que codifican dicho polipéptido y dicho otro polipéptido, cada uno seguido de una secuencia de terminación de la transcripción y una secuencia de poliadenilación. El plásmido también contiene un origen de replicación y un gen que confiere resistencia a la ampicilina, para favorecer la propagación y selección del plásmido en bacterias. El plásmido contiene además un gen para la glutamina sintetasa, un marcador seleccionable ampliamente utilizado para establecer líneas celulares CHOK1 y NSO estables. El plásmido de la presente descripción se muestra ilustrativamente en laFigura 2.

En una realización ilustrativa, el plásmido de expresión de mamífero de las presentes enseñanzas comprende la secuencia de nucleótidos de la id. de sec. n.° 7.

Plásmido de expresión hIL1-R1 -hIgG1 -Fc-II/IL-1 RAcP-hIgG1-Fc-V (id. de sec. n.° 7)

AGCTTGCCAC CATGAAGGTC CTGCTCAGGC TGATCTGCTT CATTGCCCTG CTCATCAGCA 60

GCCTGGAAGC CGACAAGTGC AAGGAGAGGG AGGAGAAGAT CATCCTCGTC AGCTCCGCCA 120

ACGAGATTGA TGTCAGGCCC TGCCCCCTCA ACCCCAATGA GCACAAGGGC ACAATCACCT 180 GGTACAAGGA CGACAGCAAG ACCCCTGTCT CCACCGAGCA GGCCAGCAGA ATCCACCAGC 240 ACAAAGAGAA GCTGTGGTTC GTGCCTGCCA AGGTGGAAGA CAGCGGCCAC TACTACTGTG 300 TGGTGAGGAA CAGCTCCTAC TGCCTCAGGA TCAAGATCTC CGCCAAGTTC GTGGAGAACG 360 AGCCCAACCT CTGTTACAAC GCTCAGGCTA TTTTCAAGCA AAAGCTCCCC GTGGCTGGAG 420 ACGGAGGCCT GGTCTGTCCC TACATGGAGT TCTTCAAGAA TGAGAATAAT GAGCTCCCCA 480 AGCTCCAGTG GTACAAGGAC TGTAAGCCTC TGCTCCTGGA CAACATCCAC TTCTCCGGCG 540 TGAAGGACAG ACTGATCGTC ATGAACGTGG CCGAGAAGCA CAGGGGAAAC TACACCTGTC 600 ACGCCTCCTA CACCTACCTC GGCAAGCAAT ATCCCATCAC CAGGGTCATC GAGTTCATCA 660 CCCTCGAAGA GAACAAGCCC ACAAGGCCTG TCATCGTCAG CCCCGCCAAT GAAACCATGG 720 AGGTGGACCT CGGCAGCCAG ATCCAGCTGA TCTGCAACGT GACAGGCCAG CTCAGCGACA 780 TTGCCTACTG GAAGTGGAAC GGCTCCGTGA TCGACGAAGA TGATCCCGTG CTGGGCGAGG 840 ACTACTATAG CGTGGAGAAC CCCGCCAACA AAAGAAGGAG CACCCTGATC ACCGTGCTGA 900 ACATCAGCGA GATCGAGTCC AGATTCTATA AGCATCCTTT CACCTGCTTT GCCAAGAACA 960 CCCACGGCAT CGACGCCGCT TACATCCAGC TGATCTATCC CGTGACCAAC GGATCCGGTG 1020 GAGGTGACAA AACTCACACA TGCCCACCGT GCCCAGCTCC GGAACTCCTG GGCGGACCGT 1080 CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG 1140 TCACATGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG 1200 TGGACGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TACAACAGCA 1260 CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT 1320 ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG 1380 CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA CCACAGGTGT GTACCCTGCC CCCATCCCGG GATGAGCTGA 1440 CCAAGAACCA GGTCAGCCTG AGTTGCGCGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG 1500 TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGTTGG 1560 ACTCCGACGG CTCCTTCAAG CTCGTCAGCA AGCTCACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGC 1620 AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA 1680 AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGTAAATAAT AGAATTCATT GATCATAATC AGCCATACCA 1740 CATTTGTAGA GGTTTTACTT GCTTTAAAAA ACCTCCCACA CCTCCCCCTG AACCTGAAAC 1800 ATAAAATGAA TGCAATTGTT GTTGTTAACT TGTTTATTGC AGCTTATAAT GGTTACAAAT 1860 AAAGCAATAG CATCACAAAT TTCACAAATA AAGCATTTTT TTCACTGCAT TCTAGTTGTG 1920 GTTTGTCCAA ACTCATCAAT GTATCTTATC ATGTCTGGCG GCCGCCGATA TTTGAAAATA 1980 TGGCATATTG AAAATGTCGC CGATGTGAGT TTCTGTGTAA CTGATATCGC CATTTTTCCA 2040 AAAGTGATTT TTGGGCATAC GCGATATCTG GCGATAGCGC TTATATCGTT TACGGGGGAT 2100 GGCGATAGAC GACTTTGGTG ACTTGGGCGA TTCTGTGTGT CGCAAATATC GCAGTTTCGA 2160 TATAGGTGAC AGACGATATG AGGCTATATC GCCGATAGAG GCGACATCAA GCTGGCACAT 2220 GGCCAATGCA TATCGATCTA TACATTGAAT CAATATTGGC CATTAGCCAT ATTATTCATT 2280 GGTTATATAG CATAAATCAA TATTGGCTAT TGGCCATTGC ATACGTTGTA TCCATATCAT 2340 AATATGTACA TTTATATTGG CTCATGTCCA ACATTACCGC CATGTTGACA TTGATTATTG 2400 ACTAGTTATT AATAGTAATC AATTACGGGG TCATTAGTTC ATAGCCCATA TATGGAGTTC 2460 CGCGTTACAT AACTTACGGT AAATGGCCCG CCTGGCTGAC CGCCCAACGA CCCCCGCCCA 2520 TTGACGTCAA TAATGACGTA TGTTCCCATA GTAACGCCAA TAGGGACTTT CCATTGACGT 2580 CAATGGGTGG AGTATTTACG GTAAACTGCC CACTTGGCAG TACATCAAGT GTATCATATG 2640 CCAAGTACGC CCCCTATTGA CGTCAATGAC GGTAAATGGC CCGCCTGGCA TTATGCCCAG 2700 TACATGACCT TATGGGACTT TCCTACTTGG CAGTACATCT ACGTATTAGT CATCGCTATT 2760 ACCATGGTGA TGCGGTTTTG GCAGTACATC AATGGGCGTG GATAGCGGTT TGACTCACGG 2820 GGATTTCCAA GTCTCCACCC CATTGACGTC AATGGGAGTT TGTTTTGGCA CCAAAATCAA 2880 CGGGACTTTC CAAAATGTCG TAACAACTCC GCCCCATTGA CGCAAATGGG CGGTAGGCGT 2940 GTACGGTGGG AGGTCTATAT AAGCAGAGCT CGTTTAGTGA ACCGTCAGAT CGCCTGGAGA 3000 CGCCATCCAC GCTGTTTTGA CCTCCATAGA AGACACCGGG ACCGATCCAG CCTCCGCGGC 3060 CGGGAACGGT GCATTGGAAC GCGGATTCCC CGTGCCAAGA GTGACGTAAG TACCGCCTAT 3120 AGAGTCTATA GGCCCACCCC CTTGGCTTCT TATGCATGCT ATACTGTTTT TGGCTTGGGG 3180 TCTATACACC CCCGCTTCCT CATGTTATAG GTGATGGTAT AGCTTAGCCT ATAGGTGTGG 3240 GTTATTGACC ATTATTGACC ACTCCCCTAT TGGTGACGAT ACTTTCCATT ACTAATCCAT 3300 AACATGGCTC TTTGCCACAA CTCTCTTTAT TGGCTATATG CCAATACACT GTCCTTCAGA 3360 GACTGACACG GACTCTGTAT TTTTACAGGA TGGGGTCTCA TTTATTATTT ACAAATTCAC 3420 ATATACAACA CCACCGTCCC CAGTGCCCGC AGTTTTTATT AAACATAACG TGGGATCTCC 3480 ACGCGAATCT CGGGTACGTG TTCCGGACAT GGGCTCTTCT CCGGTAGCGG CGGAGCTTCT 3540 ACATCCGAGC CCTGCTCCCA TGCCTCCAGC GACTCATGGT CGCTCGGCAG CTCCTTGCTC 3600 CTAACAGTGG AGGCCAGACT TAGGCACAGC ACGATGCCCA CCACCACCAG TGTGCCGCAC 3660 AAGGCCGTGG CGGTAGGGTA TGTGTCTGAA AATGAGCTCG GGGAGCGGGC TTGCACCGCT 3720 GACGCATTTG GAAGACTTAA GGCAGCGGCA GAAGAAGATG CAGGCAGCTG AGTTGTTGTG 3780 TTCTGATAAG AGTCAGAGGT AACTCCCGTT GCGGTGCTGT TAACGGTGGA GGGCAGTGTA 3840 GTCTGAGCAG TACTCGTTGC TGCCGCGCGC GCCACCAGAC ATAATAGCTG ACAGACTAAC 3900 AGACTGTTCC TTTCCATGGG TCTTTTCTGC AGTCACCGTC CTTGACACGA AGCTTGCCAC 3960 CATGACTCTG CTGTGGTGCG TCGTGTCCCT CTACTTCTAC GGCATCCTCC AGTCCGACGC 4020 CAGCGAGAGG TGCGATGACT GGGGCCTGGA CACCATGAGG CAGATCCAGG TGTTTGAGGA 4080 CGAGCCTGCC AGGATTAAGT GCCCCCTCTT CGAGCACTTT CTGAAGTTCA ACTACAGCAC 4140 CGCTCACAGC GCTGGCCTGA CACTGATCTG GTACTGGACA AGGCAGGACA GGGATCTCGA 4200 GGAGCCCATC AACTTCAGGC TGCCCGAAAA CAGAATCAGC AAGGAGAAGG ACGTGCTGTG 4260 GTTCAGACCC ACCCTCCTCA ACGACACAGG CAACTACACC TGCATGCTCA GGAACACCAC 4320 CTACTGCAGC AAGGTGGCCT TCCCTCTCGA GGTGGTCCAG AAGGACAGCT GCTTCAACAG 4380 CCCCATGAAG CTGCCCGTCC ATAAACTGTA CATCGAGTAC GGCATCCAGA GGATCACATG 4440 CCCCAACGTG GACGGCTACT TCCCCAGCTC CGTGAAGCCC ACCATCACAT GGTACATGGG 4500 CTGTTACAAA ATCCAGAACT TTAACAACGT CATCCCCGAG GGCATGAATC TGTCCTTCCT 4560 GATCGCCCTG ATCAGCAACA ACGGCAATTA CACCTGCGTC GTGACCTACC CCGAAAACGG 4620 CAGGACCTTC CACCTGACCA GGACCCTGAC CGTGAAAGTC GTGGGAAGCC CCAAGAATGC 4680 CGTGCCCCCC GTGATCCATT CCCCCAACGA CCACGTGGTG TACGAGAAGG AGCCTGGAGA 4740 GGAGCTGCTG ATCCCCTGCA CAGTGTACTT CTCCTTCCTG ATGGACTCCA GGAATGAAGT 4800 GTGGTGGACC ATCGACGGCA AGAAGCCTGA CGACATCACC ATCGATGTGA CCATCAACGA 4860 GAGCATCAGC CACAGCAGGA CCGAGGACGA GACCAGGACC CAGATCCTGA GCATCAAGAA 4920 AGTCACCAGC GAGGACCTCA AGAGAAGCTA CGTCTGTCAC GCCAGAAGCG CCAAAGGCGA 4980 GGTGGCCAAG GCTGCTAAGG TGAAACAGAA AGTGCCCGCT CCTAGGTACA CAGTCGGATC 5040 CGGTGGAGGT GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA GCTCCGGAAC TCCTGGGCGG 5100 ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC CTCATGATCT CCCGGACCCC 5160 TGAGGTCACA TGCGTGGTGG TGGACGTGAG CCACGAAGAC CCTGAGGTCA AGTTCAACTG 5220 GTACGTGGAC GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTACAA 5280 CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC TGAATGGCAA 5340 GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGC CCTCCCAGCC CCCATCGAGA AAACCATCTC 5400 CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC CTGCCCCCAT GTCGGGATGA 5460 GCTGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGTGGTG CCTGGTCAAA GGCTTCTATC CCAGCGACAT 5520 CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT 5580 GTTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCGCGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG 5640 GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA ACCACTACAC 5700 GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA ATAATAGAAT TCATTGATCA TAATCAGCCA 5760 TACCACATTT GTAGAGGTTT TACTTGCTTT AAAAAACCTC CCACACCTCC CCCTGAACCT 5820 GAAACATAAA ATGAATGCAA TTGTTGTTGT TAACTTGTTT ATTGCAGCTT ATAATGGTTA 5880 CAAATAAAGC AATAGCATCA CAAATTTCAC AAATAAAGCA<TTTTTTTCAC>TGCATTCTAG 5940 TTGTGGTTTG TCCAAACTCA TCAATGTATC TTATCATGTC TGGATCCTCT ACGCCGGACG 6000 CATCGTGGCC GGCATCACCG GCGCCACAGG TGCGGTTGCT GGCGCCTATA TCGCCGACAT 6060 CACCGATGGG GAAGATCGGG CTCGCCACTT CGGGCTCATG AGCGCTTGTT TCGGCGTGGG 6120 TATGGTGGCA GGCCCCGTGG CCGGGGGACT GTTGGGCGCC ATCTCCTTGC ATGCACCATT 6180 CCTTGCGGCG GCGGTGCTCA ACGGCCTCAA CCTACTACTG GGCTGCTTCC TAATGCAGGA 6240 GTCGCATAAG GGAGAGCGTC GACCTCGGGC CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC ATAGGCTCCG 6300 CCCCCCTGAC GAGCATCACA AAAATCGACG CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA ACCCGACAGG 6360 ACTATAAAGA TACCAGGCGT TTCCCCCTGG AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCGAC 6420 CCTGCCGCTT ACCGGATACC TGTCCGCCTT TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG CGCTTTCTCA 6480 TAGCTCACGC TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT 6540 GCACGAACCC CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTATC GTCTTGAGTC 6600 CAACCCGGTA AGACACGACT TATCGCCACT GGCAGCAGCC ACTGGTAACA GGATTAGCAG 6660 AGCGAGGTAT GTAGGCGGTG CTACAGAGTT CTTGAAGTGG TGGCCTAACT ACGGCTACAC 6720 TAGAAGAACA GTATTTGGTA TCTGCGCTCT GCTGAAGCCA GTTACCTTCG GAAAAAGAGT 6780 TGGTAGCTCT TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA 6840 GCAGCAGATT ACGCGCAGAA AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATCT TTTCTACGGG 6900 GTCTGACGCT CAGTGGAACG AAAACTCACG TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA 6960 AAGGATCTTC ACCTAGATCC TTTTAAATTA AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT 7020 ATATGAGTAA ACTTGGTCTG ACAGTTACCA ATGCTTAATC AGTGAGGCAC CTATCTCAGC 7080 GATCTGTCTA TTTCGTTCAT CCATAGTTGC CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT 7140 ACGGGAGGGC TTACCATCTG GCCCCAGTGC TGCAATGATA CCGCGAGACC CACGCTCACC 7200 GGCTCCAGAT TTATCAGCAA TAAACCAGCC AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA GAAGTGGTCC 7260 TGCAACTTTA TCCGCCTCCA TCCAGTCTAT TAATTGTTGC CGGGAAGCTA GAGTAAGTAG 7320 TTCGCCAGTT AATAGTTTGC GCAACGTTGT TGCCATTGCT ACAGGCATCG TGGTGTCACG 7380 CTCGTCGTTT GGTATGGCTT CATTCAGCTC CGGTTCCCAA CGATCAAGGC GAGTTACATG 7440 ATCCCCCATG TTGTGCAAAA AAGCGGTTAG CTCCTTCGGT CCTCCGATCG TTGTCAGAAG 7500 TAAGTTGGCC GCAGTGTTAT CACTCATGGT TATGGCAGCA CTGCATAATT CTCTTACTGT 7560 CATGCCATCC GTAAGATGCT TTTCTGTGAC TGGTGAGTAC TCAACCAAGT CATTCTGAGA 7620 ATAGTGTATG CGGCGACCGA GTTGCTCTTG CCCGGCGTCA ATACGGGATA ATACCGCGCC 7680 ACATAGCAGA ACTTTAAAAG TGCTCATCAT TGGAAAACGT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC 7740 AAGGATCTTA CCGCTGTTGA GATCCAGTTC GATGTAACCC ACTCGTGCAC CCAACTGATC 7800 TTCAGCATCT TTTACTTTCA CCAGCGTTTC TGGGTGAGCA AAAACAGGAA GGCAAAATGC 7860 CGCAAAAAAG GGAATAAGGG CGACACGGAA ATGTTGAATA CTCATACTCT TCCTTTTTCA 7920 ATATTATTGA AGCATTTATC AGGGTTATTG TCTCATGAGC GGATACATAT TTGAATGTAT 7980 TTAGAAAAAT AAACAAATAG GGGTTCCGCG CACATTTCCC CGAAAAGTGC CACCTGACGT 8040 CTAAGAAACC ATTATTATCA TGACATTAAC CTATAAAAAT AGGCGTATCA CGAGGCCCTG 8100 ATGGCTCTTT GCGGCACCCA TCGTTCGTAA TGTTCCGTGG CACCGAGGAC AACCCTCAAG 8160 AGAAAATGTA ATCACACTGG CTCACCTTCG GGTGGGCCTT TCTGCGTTTA TAAGGAGACA 8220 CTTTATGTTT AAGAAGGTTG GTAAATTCCT TGCGGCTTTG GCAGCCAAGC TAGATCCGGC 8280 TGTGGAATGT GTGTCAGTTA GGGTGTGGAA AGTCCCCAGG CTCCCCAGCA GGCAGAAGTA 8340 TGCAAAGCAT GCATCTCAAT TAGTCAGCAA CCAGGTGTGG AAAGTCCCCA GGCTCCCCAG 8400 CAGGCAGAAG TATGCAAAGC ATGCATCTCA ATTAGTCAGC AACCATAGTC CCGCCCCTAA 8460 CTCCGCCCAT CCCGCCCCTA ACTCCGCCCA GTTCCGCCCA TTCTCCGCCC CATGGCTGAC 8520 TAATTTTTTT TATTTATGCA GAGGCCGAGG CCGCCTCGGC CTCTGAGCTA TTCCAGAAGT 8580 AGTGAGGAGG<C T T T T T T G G A>GGCCTAGGCT TTTGCAAAAA GCTAGCTTGG GGCCACCGCT 8640 CAGAGCACCT TCCACCATGG CCACCTCAGC AAGTTCCCAC TTGAACAAAA ACATCAAGCA 8700 AATGTACTTG TGCCTGCCCC AGGGTGAGAA AGTCCAAGCC ATGTATATCT GGGTTGATGG 8760 TACTGGAGAA GGACTGCGCT GCAAAACCCG CACCCTGGAC TGTGAGCCCA AGTGTGTAGA 8820 AGAGTTACCT GAGTGGAATT TTGATGGCTC TAGTACCTTT CAGTCTGAGG GCTCCAACAG 8880 TGACATGTAT CTCAGCCCTG TTGCCATGTT TCGGGACCCC TTCCGCAGAG ATCCCAACAA 8940 GCTGGTGTTC TGTGAAGTTT TCAAGTACAA CCGGAAGCCT GCAGAGACCA ATTTAAGGCA 9000 CTCGTGTAAA CGGATAATGG ACATGGTGAG CAACCAGCAC CCCTGGTTTG GAATGGAACA 9060 GGAGTATACT CTGATGGGAA CAGATGGGCA CCCTTTTGGT TGGCCTTCCA ATGGCTTTCC 9120 TGGGCCCCAA GGTCCGTATT ACTGTGGTGT GGGCGCAGAC AAAGCCTATG GCAGGGATAT 9180 CGTGGAGGCT CACTACCGCG CCTGCTTGTA TGCTGGGGTC AAGATTACAG GAACAAATGC 9240 TGAGGTCATG CCTGCCCAGT GGGAACTCCA AATAGGACCC TGTGAAGGAA TCCGCATGGG 9300 AGATCATCTC TGGGTGGCCC GTTTCATCTT GCATCGAGTA TGTGAAGACT TTGGGGTAAT 9360 AGCAACCTTT GACCCCAAGC CCATTCCTGG GAACTGGAAT GGTGCAGGCT GCCATACCAA 9420 CTTTAGCACC AAGGCCATGC GGGAGGAGAA TGGTCTGAAG CACATCGAGG AGGCCATCGA 9480 GAAACTAAGC AAGCGGCACC GGTACCACAT TCGAGCCTAC GATCCCAAGG GGGGCCTGGA 9540 CAATGCCCGT GGTCTGACTG GGTTCCACGA AACGTCCAAC ATCAACGACT TTTCTGCTGG 9600 TGTCGCCAAT CGCAGTGCCA GCATCCGCAT TCCCCGGACT GTCGGCCAGG AGAAGAAAGG 9660 TTACTTTGAA GACCGCGGCC CCTCTGCCAA TTGTGACCCC TTTGCAGTGA CAGAAGCCAT 9720 CGTCCGCACA TGCCTTCTCA ATGAGACTGG CGACGAGCCC TTCCAATACA AAAACTAATT 9780 AGACTTTGAG TGATCTTGAG CCTTTCCTAG TTCATCCCAC CCCGCCCCAG AGAGATCTTT 9840 GTGAAGGAAC CTTACTTCTG TGGTGTGACA TAATTGGACA AACTACCTAC AGAGATTTAA 9900 AGCTCTAAGG TAAATATAAA ATTTTTAAGT GTATAATGTG TTAAACTACT GATTCTAATT 9960 GTTTGTGTAT TTTAGATTCC AACCTATGGA ACTGATGAAT GGGAGCAGTG GTGGAATGCC 10020 TTTAATGAGG AAAACCTGTT TTGCTCAGAA GAAATGCCAT CTAGTGATGA TGAGGCTACT 10080 GCTGACTCTC AACATTCTAC TCCTCCAAAA AAGAAGAGAA AGGTAGAAGA CCCCAAGGAC 10140 TTTCCTTCAG AATTGCTAAG TTTTTTGAGT CATGCTGTGT TTAGTAATAG AACTCTTGCT 10200 TGCTTTGCTA TTTACACCAC AAAGGAAAAA GCTGCACTGC TATACAAGAA AATTATGGAA 10260 AAATATTCTG TAACCTTTAT AAGTAGGCAT AACAGTTATA ATCATAACAT ACTGTTTTTT 10320 CTTACTCCAC ACAGGCATAG AGTGTCTGCT ATTAATAACT ATGCTCAAAA ATTGTGTACC 10380 TTTAGCTTTT TAATTTGTAA AGGGGTTAAT AAGGAATATT TGATGTATAG TGCCTTGACT 10440 AGAGATCATA ATCAGCCATA CCACATTTGT AGAGGTTTTA CTTGCTTTAA AAAACCTCCC 10500 ACACCTCCCC CTGAACCTGA AACATAAAAT GAATGCAATT GTTGTTGTTA ACTTGTTTAT 10560 TGCAGCTTAT AATGGTTACA AATAAAGCAA TAGCATCACA AATTTCACAA ATAAAGCATT 10620 TTTTTCACTG CATTCTAGTT GTGGTTTGTC CAAACTCATC AATGTATCTT ATCATGTCTG 10680 GATCTAGCTT CGTGTCAAGG ACGGTGACTG CAGTGAATAA TAAAATGTGT GTTTGTCCGA 10740 AATACGCGTT TTGAGATTTC TGTCGCCGAC TAAATTCATG TCGCGCGATA GTGGTGTTTA 10800 TCGCCGATAG AGATGGCGAT ATTGGAAAAA TCGATATTTG AAAATATGGC ATATTGAAAA 10860 TGTCGCCGAT GTGAGTTTCT GTGTAACTGA TATCGCCATT TTTCCAAAAG TGATTTTTGG 10920 GCATACGCGA TATCTGGCGA TAGCGCTTAT ATCGTTTACG GGGGATGGCG ATAGACGACT 10980 TTGGTGACTT GGGCGATTCT GTGTGTCGCA AATATCGCAG TTTCGATATA GGTGACAGAC 11040 GATATGAGGC TATATCGCCG ATAGAGGCGA CATCAAGCTG GCACATGGCC AATGCATATC 11100 GATCTATACA TTGAATCAAT ATTGGCCATT AGCCATATTA TTCATTGGTT ATATAGCATA 11160 AATCAATATT GGCTATTGGC CATTGCATAC GTTGTATCCA TATCATAATA TGTACATTTA 11220 TATTGGCTCA TGTCCAACAT TACCGCCATG TTGACATTGA TTATTGACTA GTTATTAATA 11280 GTAATCAATT ACGGGGTCAT TAGTTCATAG CCCATATATG GAGTTCCGCG TTACATAACT 11340 TACGGTAAAT GGCCCGCCTG GCTGACCGCC CAACGACCCC CGCCCATTGA CGTCAATAAT 11400 GACGTATGTT CCCATAGTAA CGCCAATAGG GACTTTCCAT TGACGTCAAT GGGTGGAGTA 11460 TTTACGGTAA ACTGCCCACT TGGCAGTACA TCAAGTGTAT CATATGCCAA GTACGCCCCC 11520 TATTGACGTC AATGACGGTA AATGGCCCGC CTGGCATTAT GCCCAGTACA TGACCTTATG 11580 GGACTTTCCT ACTTGGCAGT ACATCTACGT ATTAGTCATC GCTATTACCA TGGTGATGCG 11640 GTTTTGGCAG TACATCAATG GGCGTGGATA GCGGTTTGAC TCACGGGGAT TTCCAAGTCT 11700 CCACCCCATT GACGTCAATG GGAGTTTGTT TTGGCACCAA AATCAACGGG ACTTTCCAAA 11760 ATGTCGTAAC AACTCCGCCC CATTGACGCA AATGGGCGGT AGGCGTGTAC GGTGGGAGGT 11820 CTATATAAGC AGAGCTCGTT TAGTGAACCG TCAGATCGCC TGGAGACGCC ATCCACGCTG 11880 TTTTGACCTC CATAGAAGAC ACCGGGACCG ATCCAGCCTC CGCGGCCGGG AACGGTGCAT 11940 TGGAACGCGG ATTCCCCGTG CCAAGAGTGA CGTAAGTACC GCCTATAGAG TCTATAGGCC 12000 CACCCCCTTG GCTTCTTATG CATGCTATAC TGTTTTTGGC TTGGGGTCTA TACACCCCCG 12060 CTTCCTCATG TTATAGGTGA TGGTATAGCT TAGCCTATAG GTGTGGGTTA TTGACCATTA 12120 TTGACCACTC CCCTATTGGT GACGATACTT TCCATTACTA ATCCATAACA TGGCTCTTTG 12180 CCACAACTCT CTTTATTGGC TATATGCCAA TACACTGTCC TTCAGAGACT GACACGGACT 12240 CTGTATTTTT ACAGGATGGG GTCTCATTTA TTATTTACAA ATTCACATAT ACAACACCAC 12300 CGTCCCCAGT GCCCGCAGTT TTTATTAAAC ATAACGTGGG ATCTCCACGC GAATCTCGGG 12360 TACGTGTTCC GGACATGGGC TCTTCTCCGG TAGCGGCGGA GCTTCTACAT CCGAGCCCTG 12420 CTCCCATGCC TCCAGCGACT CATGGTCGCT CGGCAGCTCC TTGCTCCTAA CAGTGGAGGC 12480 CAGACTTAGG CACAGCACGA TGCCCACCAC CACCAGTGTG CCGCACAAGG CCGTGGCGGT 12540 AGGGTATGTG TCTGAAAATG AGCTCGGGGA GCGGGCTTGC ACCGCTGACG CATTTGGAAG 12600 ACTTAAGGCA GCGGCAGAAG AAGATGCAGG CAGCTGAGTT GTTGTGTTCT GATAAGAGTC 12660 AGAGGTAACT CCCGTTGCGG TGCTGTTAAC GGTGGAGGGC AGTGTAGTCT GAGCAGTACT 12720 CGTTGCTGCC GCGCGCGCCA CCAGACATAA TAGCTGACAG ACTAACAGAC TGTTCCTTTC 12780 CATGGGTCTT TTCTGCAGTC ACCGTCCTTG ACACGA 12816

En determinados aspectos, las presentes enseñanzas proporcionan un sistema de expresión de mamífero para la producción de un ensamblaje de proteínas heterodiméricas que comprende un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 18 a 333 de la IL1-R1 humana fusionada con el dominio IgG-Fc (Fc-II) a través de un enlazador flexible, y otro polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 21 a 358 de la IL-1 RAcP humana fusionada con otro dominio IgG-Fc (Fc-V) a través de un enlazador flexible.

En una realización ilustrativa, el sistema de expresión de mamífero de la presente invención comprende células de ovario de hámster chino (CHO-K1) que albergan un plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos de la id. de sec. n.° 7.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran los aspectos anteriores y otros aspectos de las presentes enseñanzas. Estos ejemplos no limitativos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica realizaciones ilustrativas sobre cómo se fabrican y evalúan los compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos reivindicados en la presente memoria.

Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones.

Ejemplo 1:Construcción de plásmidos para la expresión de los polipéptidos de la presente invención.

Se sintetizaron químicamente secuencias génicas optimizadas que comprendían secuencias que codifican los residuos de los residuos de aminoácidos 1 a 333 de IL-1R1 o los residuos 1 a 358 de IL-1rACP. Los fragmentos resultantes se clonaron en marco en los vectores intermedios receptores que comprenden secuencias que codifican Fc-V o Fc-II, a través de los sitios de restricción HindIII y BspEI. Los clones positivos obtenidos se verificaron mediante secuenciación de ADN. Las construcciones resultantes se denominaron PKN001'-IL-1R-FcV y PKN001'-RAcP-FcII, respectivamente.

El gen que codifica IL-1R1-Fc-V se clonó a continuación en un segundo vector intermedio, denominado PKN002, a través de los sitios de restricción HindIII y EcoRI. Los clones positivos se analizaron mediante doble digestión y la secuencia de inserción de los plásmidos correctos se verificó mediante secuenciación de ADN. Las construcciones resultantes se denominaron PKN002-IL-1 R-FcV.

Finalmente, el casete de expresión para RAcP-FcII de PKN001'-RAcP-FcII se integró en el plásmido PKN002-II,-1R-FcV a través de los sitios de restricción NotI y SalI y produjo una nueva construcción recombinante que contenía elementos de expresión tanto para RAcP-FcII como para IL-1R-FcV. Los clones resultantes se analizaron mediante doble digestión NotI y SalI seguida de electroforesis en gel de ADN, los clones correctos presentaban una banda que migraba aproximadamente como un fragmento de ADN de 8 kb y otra banda que migraba aproximadamente como un fragmento de ADN de 4 kb. El plásmido final se denominó PKN012-IL1 R-FcV-RAcP-FcII.

El plásmido recombinante PKN012-IL1 R-FcV-RAcP-FcII combina casetes de expresión para RAcP-FcII e IL-1 R-FcV. El plásmido se puede utilizar para coexpresar las proteínas RAcP-FcII e IL-1 R-FcV en una relación de 1 a 1 bajo el control de un promotor de CMV. La mayoría de estas dos proteínas de fusión formarían entonces heterodímeros IL1R-FcV/RAcP-FcII después de la secreción. El plásmido también expresa la proteína glutamina sintetasa (GS) a través de un promotor SV40, que se puede utilizar como marcador de selección para generar líneas celulares estables para la producción de heterodímero IL1R-FcV/RAcP-FcII. El mapa de plásmidos para PKN012-II,1R-FcV-RAcP-FcII se muestra ilustrativamente en la Figura 2.

Ejemplo 2:Generación de líneas celulares estables para expresar polipéptidos de la presente invención.

Se ha generado un clon estable de células CHO-K1 que coexpresan el polipéptido hIL1 -R1 -h IgG1 -Fc de la id. de sec. n.° 1 y el polipéptido hIL-IRAcP-hIgGI-Fc de la id. de sec. n.° 2 a través de protocolos de biología celular estándar. El plásmido de expresión PKN012-IL1 R-FcV-RAcP-FcII descrito en el Ejemplo 1 se utilizó para generar líneas celulares estables para una alta expresión de dichos polipéptidos. Los niveles de expresión de dichos polipéptidos en una pluralidad de clones fueron de alrededor de o más de 100 mg/L en un cultivo por lotes de 7 días. Una línea celular clonal mostró niveles de expresión de alrededor de o más de 300 mg/L en cultivo por lotes en matraz de agitación. Materiales

Se obtuvieron células de ovario de hámster chino (CHO-K1) como soluciones madre congeladas de ATCC (CCL-61™). Las células se adaptaron internamente en un medio CD CHO. El medio y el reactivo se obtuvieron de una fuente comercial. Tras la adaptación completa, las células se cultivaron a alta densidad durante unos pocos pases. Las células resultantes se subclonaron. Uno de los clones resultantes con un tiempo de duplicación inferior a 20 h y buena morfología se seleccionó como línea celular parental.

Métodos

Las células CHO-K1 en el pase 4 se cultivaron en medio definido químicamente CD-CHO (Invitrogen) que contenía L-glutamina 6 mM. Las células se mantuvieron mediante divisiones 1:3 después de alcanzar una densidad celular de 4x106 células/ml. Las células se extendieron por centrifugación y se resuspendieron en 1 ml de medio definido químicamente CD-CHO (Invitrogen).

Se utilizó el siguiente protocolo de electroporación:

• Se usaron 40 ug de ADN plasmídico en 100 ul de tampón TE esterilizado para una electroporación; en el día de la transfección, la viabilidad de las células fue de al menos el 95 %;

• las células se centrifugaron a 800 rpm durante 5 min; se retiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en 10 ml de medio CD CHO y se centrifugaron de nuevo;

• se retiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en un pequeño volumen de medio CD CHO a 1,43x107 células/ml;

• se añadieron 0,7 ml de células (107 células) al ADN y se mezclaron suavemente mediante pipeteo, evitando generar burbujas;

• las células se electroporaron inmediatamente suministrando un solo pulso de 300 voltios, 900 uF a cada cubeta;

• 50 ml de CD CHO (sin L-glutamina) se añadieron inmediatamente a las células electroporadas y se mezclaron suavemente;

• la suspensión celular se distribuyó en diez placas de 96 pocillos a 50 ul/pocillo; al día siguiente, se añadieron 150 ul de CD CHO que contenía MSX 33,3 uM a cada pocillo.

Se llevaron a cabo varias transfecciones en células CHO-K1 en el proceso de generación de una posible línea celular de expresión de IL1 R-FcV-RAcP-Fcll; se muestra una curva de crecimiento de transfección representativa en laFigura 3y los datos se muestran en la Tabla 1. Los niveles de expresión de proteínas se analizaron mediante SDS-PAGE. Las líneas celulares con altos niveles de sobreexpresión de proteínas presentan una banda fuerte con un peso molecular aparente de alrededor de 180 kDa. Con base en el análisis preliminar, se seleccionaron cuatro clones para un análisis adicional, donde los niveles de expresión se evaluaron adicionalmente mediante SDS-PAGE y ELISA. Los clones con buenos niveles de expresión se inocularon en matraces de agitación de 125 ml, las células se expandieron y se congelaron.

La línea celular de mayor producción elegida se seleccionó y descongeló en CD-CHO. Se evaluaron las curvas de crecimiento en la línea celular y se recogieron muestras diariamente para el recuento de células, la viabilidad celular y la productividad de IL1 R-FcV-RAcP-Fcll. Con base en estos estudios, se determinó que la línea celular de mayor productividad seleccionada expresaba el heterodímero IL1R-FcV-RAcP-FcII en medios CD-CHO en las cantidades necesarias para facilitar la producción comercial. El rendimiento del heterodímero después de la purificación fue de al menos alrededor de 300 mg/L (sin ninguna optimización de la producción).

Ejemplo 3:Purificación de los polipéptidos de la presente invención.

El polipéptido hIL1-R1-hIgG1-Fc de la id. de sec. n.° 1 y el polipéptido hIL-1 RAcP-hIgG1-Fc de la id. de sec. n.° 2 se coexpresaron en CHO-K1 esencialmente como se describe en el Ejemplo 2 anterior. Las células se recolectaron y se lisaron utilizando protocolos bien establecidos. Después de la clarificación del lisado celular, el sobrenadante a una concentración de proteína de alrededor de 0,4 mg/ml, que contenía polipéptidos hIL1 -R1 -h IgG1 -Fc /hIL-IRAcP-hIgGI-Fc expresados, se aplicó a una columna de afinidad de proteína A. La etapa de purificación por afinidad se llevó a cabo según el procedimiento descrito en la Tabla 2. El eluato de proteína A que contiene hIL1-R1-hIgG1-Fc /hIL1RAcP-hIgG1-Fc a pH de alrededor de 3,5 - 3,7 se incuba durante 45-60 minutos para inactivar potencialmente existente en los materiales contaminantes.

Después de la incubación del material durante alrededor de 45 minutos a pH 3,6 a temperatura ambiente, su pH se ajusta a alrededor de 7,9-8,1 con Tris-HCl 2 M pH 9,5 (~ 3,5 % v/v del eluato de Pro A diluido). El eluato de proteína A tratado con pH bajo se ajusta a un pH de alrededor de 8,0 usando T ris-HCl 1 M, pH 9,0. La conductividad se ajusta a alrededor de 5,5 mS/cm con agua desionizada (dH2O) si es necesario.

Para reducir el contenido de ADN, HCP, endotoxina y posibles contaminantes virales, el eluato de la columna de proteína A con pH ajustado se purificó adicionalmente mediante cromatografía de intercambio aniónico (AIEX) utilizando resina Q Sepharose. La etapa de AIEX se realiza según un procedimiento de elución de etapas descrito en la Tabla 3. Las fracciones de pico de elución agrupadas se concentran mediante microfiltración hasta una concentración de alrededor de 20 mg/ml, seguido de la adición de una solución madre de sacarosa al 20 % hasta una concentración final de sacarosa de alrededor del 1 % (p/v) y congelación a -80 0C.

Una muestra de proteína así purificada se analizó mediante HPLC de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) y SDS-PAGE (reductora y no reductora). Los resultados del análisis se presentan en la Figura 4 yFigura 5,respectivamente. En laFigura 5,los carriles 1 y 3 muestran la SDS-PAGE de hIL1-R1-hlgG1-Fc/hIL-1RACP-hlgG1-Fc en condiciones no reductoras, mientras que los carriles 4, 6, corresponden a condiciones reductoras. Los carriles 2, 5 muestran marcadores de peso molecular. El heterodímero hIL1-R1-hIgG1-Fc /hIL-1RAcP-hIgG1-Fc tiene un peso molecular aparente de alrededor de 180 kDa, que consiste en dos monómeros unidos por disulfuro, cada uno de un peso molecular aparente de alrededor de 90 kDa.

El procedimiento operativo SEC-HPLC se describe en la Tabla 4. La muestra de carga se diluye con fase móvil para alcanzar una concentración de proteínas de alrededor de 5 mg/ml. La forma biológicamente relevante del heterodímero hIL1-R1-hIgG1-Fc /hIL-IRAcP-hIgGI-Fc está representada por el pico principal con tiempo de retención RT=14,979 min.

Tabla 2:El procedimiento operativo de la cromatografía de afinidad de proteína A

Etapa Tampón Vol CV Flujo cm/hAclarar antes de usar dH2O 3 150 Equilibramiento NaPh 10 mM, pH 6,0 5 150 Carga de muestra Recolección de células 150 Lavado 1 NaPh 10 mM, pH 6,0 3 150 Lavado 2 NaPh 25 mM, NaCl 0,5 M, isopropanol al 5 % pH 7,0 5 150 Reequilibrio NaPh 10 mM, pH 6,0 3 150 Elución Citrato de Na 20 mM, pH 3,4 4 150 Reequilibrio PB 10 mM, pH 6,0 3 150 CIP NaOH 0,1 M (tiempo de contacto 15 min), flujo inverso, 3 100 CIP cada 5 ciclos

Aclarar con NaCl NaCl 1 M 3 150 Aclarar después de su uso dH2O 3 150 Almacenamiento 20 % (v/v) de etanol, NaPh 20 mM, pH 7,0 3 150

Tabla 3:El procedimiento operativo de AIEX

Etapa Tampón Vol CV Flujo cm/hAclarar antes de usar dH2O 3 150 Recarga Tris-HCl 10 mM, NaCl 1 M, pH 8 3 150 Equilibramiento Tris-HCl 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8 3 150 Carga de muestra Carga Q preparada - 150 Lavado Tris-HCl 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8 3 150 Elución Tris-HCl 10 mM, NaCl 0,35 M, pH 8,0 3 150

CIP NaOH 1 M (tiempo de contacto 1 hora), flujo inverso 3 40

Etapa Tampón Vol CV Flujo cm/hRegeneración Tris-HCl 10 mM, NaCl 1 M, pH 8,0 3 150 Aclarar después de su uso dH2O 3 150 Almacenamiento Etanol al 20 % (v/v) 3 150

Tabla 4:El procedimiento operativo de SEC-HPLC

Fase móvil: Fosfato 20 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4

Velocidad de flujo: 0,5 mL/min

Columna: G2000 SWxl, 7,8 mmx300 mm, TOSOH Bioscience

Columna de guardia: Protector TSK SWxl, 6,0 mm x40 mm, TOSOH Bioscience Temperatura de la columna: 25 °C

Temperatura del muestreador: Temperatura ambiente

Volumen de inyección: 10 pl

Longitud de onda del detector: 280 nm

Tiempo de ejecución: 30 minutos

La actividad de la muestra así purificada, que se expresó y purificó esencialmente como se describe en este ejemplo, se analizó en un ensayo ELISA estándar usando IL-1 p humana disponible comercialmente (PrimGene, Shanghai, China; n.° de cat.: 101-01B). Una curva de unión típica obtenida en el ensayo se muestra en laFigura 6.Según el análisis de la curva, el valor de EC50 calculado es de alrededor de 50 ng/ml.

Ejemplo 4:Caracterización de la inhibición de la producción de IL-6 inducida por IL-1 p con heterodímero IL1 R-FcV-RAcP-FcII en células humanas.

El presente Ejemplo demuestra potentes propiedades funcionales (inhibidoras) del heterodímero IL1 R-FcV-RAcP-FcII para dirigirse a IL-1 p humana. Como comparador funcional, se utilizaron anticuerpos monoclonales de ratón previamente caracterizados contra IL-1 p. Los fibroblastos pulmonares humanos MRC5 producen IL-6 en respuesta al tratamiento con IL-1 p. La cuantificación de la producción de IL-6 inducida por IL-1 p en células MRC5 se utilizó como el resultado funcional del ensayo. La inhibición de la producción de IL-6 por el heterodímero IL1R-FcV-RAcP-FcII y por el anticuerpo anti IL-1 p de control proporciona una medida cuantitativa de las propiedades inhibidoras de la preparación del heterodímero IL1R-FcV-RAcP-FcII.

Los polipéptidos del heterodímero II,1R-FcV-RAcP-Fcn (id. de sec. n.° 1 e id. de sec. n.° 2) se coexpresaron y purificaron esencialmente como se describe en los ejemplos anteriores. La concentración de proteína del heterodímero IL1R-FcV-RAcP-FcII sustancialmente puro en la muestra utilizada fue de 0,9 mg/ml en NaCl 100 mM, NaH2PO4/Na2HPÜ425 mM, clorhidrato de arginina 25 mM, sacarosa al 1 %; pH = 6,3.

Se usaron los siguientes materiales en el ensayo:

Células: Células MRC5, fibroblastos pulmonares humanos, ATCC n.° de cat. CCL-171, n.° de lote 59474707.

Medio: DMEM, modificación de Dulbecco del medio de Eagle, alta glucosa (4,5 g/L), Mediatech, n.° de cat 10-017-CM, n.° lote 10017204, suplementado con L-glutamina y 1x penn/strep y 10 % suero bovino fetal, Omega Scientific, n.° de cat FB-05, n.° lote 105104

Reactivos: IL-1 p, recombinante humano, derivado de E. coli, Ala1 17-Ser269, n.° de acceso NP_000567, R&D Systems, n.° de cat 201-LB, n.° de lote ADM1411062; anticuerpos monoclonales contra IL-1 p humana, n.° de clon 8516, R&D Systems, n.2 de cat MAB201, n.2 lote AWE1011081;

inmunoensayo de Quantakine IL-6 humana, R&D Systems, n.° de cat D6050, n.° lote 300070.

Se utilizaron los siguientes procedimientos en el ensayo:

Mantenimiento de las células:

1. Propagar las células MRC5 en el DMEM que contiene FBS al 10 % en frascos T75 según las recomendaciones del fabricante. Registrar el número de pase;

2. Tripsinizar las células, resuspender en DMEM que contiene 10 % de FBS;

3. Evaluar la viabilidad celular utilizando el reactivo Guava ViaCount. La viabilidad estándar debe ser >85 %, si es menor, no utilizar este lote de células;

4. Preparar diluciones de las células para el cultivo en placas a la densidad deseada de 2 x 103 células/pocillo por pocillo de placa de 48 pocillos o 5 x 103 por ml;

5. Dejar que las células se adhieran durante 16-24 horas a 37 °C, 5 % de CO<2>, luego retirar el medio;

6. Reemplazar con medio DMEM nuevo suplementado con FBS al 10 %, 0,4 ml/pocillo para una placa de 48 pocillos, incubar 5-10 minutos y reemplazar el medio nuevamente con el mismo volumen;

7. Añadir a los pocillos IL-1 p, sustancias de prueba mezcladas previamente con IL-1 p y controles apropiados; 8. Incubar las células después del tratamiento durante 24 horas y luego cosechar los sobrenadantes;

9. Centrifugar los sobrenadantes a 300 x g durante 10 min, recoger los sobrenadantes aclarados y usarlos para ELISA directamente o con una dilución de 1/3 si es apropiado;

Protocolo ELISA:

Principio del ensayo: el ensayo emplea la técnica cuantitativa de inmunoensayo enzimático de sándwich. Una microplaca se recubre previamente con un anticuerpo monoclonal específico para IL-6.

Los patrones y las muestras se pipetean en los pocillos de la microplaca y la IL-6 presente se une a los anticuerpos inmovilizados. Después de lavar las sustancias no unidas, se añade a los pocillos un anticuerpo policlonal ligado a enzimas específico para IL-6. Después de un lavado para eliminar el reactivo de anticuerpo-enzima no unido, se añade una solución de sustrato a los pocillos y se desarrolla el color en proporción a la cantidad de IL-6 unida. Se detiene el desarrollo del color y se mide la intensidad del color.

Procedimiento de ensayo:

1. Preparar todos los reactivos y patrones de trabajo como se describe en el manual del fabricante (http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=D6050)

2. Retirar el exceso de tiras de microplacas del marco de la placa, devolverlas a la bolsa de lámina de metal que contiene el paquete desecante y volver a sellarlas.

3. Añadir 100 pL de diluyente de ensayo RD1W a cada pocillo.

4. Añadir 100 pL de patrón, muestra o control por pocillo. Cubrir con la tira adhesiva proporcionada. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. Se proporciona un diseño de placa para registrar los patrones y las muestras analizadas.

5. Aspirar cada pocillo y lavar, repitiendo el proceso tres veces para un total de cuatro lavados. Lavar llenando cada pocillo con tampón de lavado (400 pL) usando una botella de chorro de laboratorio, un dispensador múltiple o un lavador automático. La eliminación completa del líquido en cada etapa es esencial para un buen rendimiento. Después del último lavado, retirar los restos de tampón de lavado aspirándolo o decantándolo. Invertir la placa y secarla con toallas de papel limpias.

6. Añadir 200 pL de conjugado de IL-6 a cada pocillo. Cubrir con una tira adhesiva nueva. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.

7. Repetir la aspiración/lavado como en la etapa 5.

8. Añadir 200 pL de solución de sustrato a cada pocillo. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Proteger de la luz.

9. Añadir 50 pL de solución de terminación a cada pocillo. El color de los pocillos debe pasar de azul a amarillo. Si el color de los pocillos es verde o el cambio de color no parece uniforme, golpear suavemente la placa para garantizar una mezcla completa.

10. Determinar la densidad óptica de cada pocillo en 30 minutos, utilizando un lector de microplacas configurado a 450 nm. Si la corrección de longitud de onda está disponible, configurarla a 540 nm o 570 nm. Si la corrección de longitud de onda no está disponible, restar las lecturas a 540 nm o 570 nm de las lecturas a 450 nm. Esta sustracción corregirá las imperfecciones ópticas de la placa. Las lecturas realizadas directamente a 450 nm sin corrección pueden ser más altas y menos precisas.

A continuación se presentan los datos experimentales obtenidos:

Inhibición de la producción de IL-6 por anticuerpos anti-LL-1 p de control:

1. Las células MRC5 (pase 5) se sembraron en una placa de 48 pocillos (Costar, n.° de cat 3548) a razón de 2 x 103 células por pocillo, 0,4 ml por pocillo, y se incubaron durante 24 horas;

2. El día del ensayo, el medio de los pocillos se aspiró y se reemplazó con 0,4 ml de DMEM suplementado con FBS al 10 %, se incubó 10-15 min y se reemplazó con la misma cantidad del mismo medio fresco nuevamente; 3. Se utilizó IL-1 p a una concentración final de 50 pg/ml durante todo el experimento;

4. Se utilizaron anticuerpos anti-IL-1 p humana a concentraciones finales de 0,192, 0,96, 4,8, 24, 120 y 600 ng/ml;

5. Tanto los anticuerpos IL-1 p como anti-IL-1 p humana se prepararon como soluciones concentradas 10 veces; 6. Antes de añadir las sustancias de prueba a las células, se mezclaron 55 pl de IL-1 p 10 veces concentrada con 55 pl de solución de anticuerpo anti-IL-1 p humana 10 veces concentrada correspondiente (o control apropiado) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min;

7. Después de la incubación, se añadieron 100 pl de cada mezcla a los pocillos que contenían 0,4 ml de medio de crecimiento;

8. Las células se incubaron en presencia de las sustancias de prueba durante 24 horas y se recogieron los sobrenadantes, se centrifugaron a 300 x g durante 10 min y se utilizaron para el ensayo ELISA de IL-6;

9. Para probar la recuperación de IL-6 en presencia de anticuerpo anti-IL-1 p, este último se utilizó a una concentración final de 600 ng/ml y se enriqueció con patrón de IL-6 a una concentración final de 20 pg/ml.

La curva de calibración obtenida en el ensayo de inhibición de la producción de IL-6 mediada por anticuerpos contra IL-1 se muestra en laFigura 7.Los resultados de las mediciones de la producción de IL-6 mediada por IL-1 p y de la recuperación de IL-6 del medio de cultivo en el experimento se muestran en laFigura 8y laFigura 9.Los valores numéricos obtenidos para la producción de IL-6 junto con sus desviaciones estándar se presentan en laTabla 5. Tabla 5:Resumen de los valores de producción de IL-6.

El experimento anterior reveló que: (1) el anticuerpo de control anti-IL-1 p es un inhibidor muy potente de la ruta de señalización de la IL-1 p con una IC50 de alrededor de 2,1 ng/ml o alrededor de 14 pM; (2) es adecuada una densidad celular de cultivo en placas de 2 x 103 células por pocillo 24 horas antes de la configuración del ensayo; (3) la recuperación de IL-6 enriquecida en el medio de cultivo a una concentración final de 20 pg/ml es de aproximadamente 114 %.

Inhibición de la producción de IL-6 por la preparación del heterodímero IL1 R-FcV-RAcP-FeII:

1. Las células MRC5 (pase 6) se colocaron en placas de 48 pocillos (Costar, n.° de cat 3548) a 2 x 103 células por pocillo, 0,4 ml por pocillo y se incubaron durante 24 horas;

2. El cultivo en placas para este experimento se llevó a cabo por duplicado. Cada duplicado de cultivo en placas se midió por duplicado en placa de ELISA, generando 4 puntos experimentales por tratamiento

3. El día del ensayo, el medio de los pocillos se aspiró y se reemplazó con 0,4 ml de DMEM suplementado con FBS al 10 %, se incubó 10-15 min y se reemplazó con la misma cantidad del mismo medio fresco nuevamente; 4. Se utilizó IL-1 p a una concentración final de 50 pg/ml durante todo el experimento;

5. Se utilizó el heterodímero II,1R-FcV-RAcP-Fcn a concentraciones finales de 0,0536, 0,134, 0,335, 0,839, 2,097, 5,24,13,1,32,8, 81,9, 204,8, 512, 1280, 3200 y 20000 ng/ml;

6. Tanto el heterodímero IL1R-FcV-RAcP-FcII como IL-1 p se prepararon como soluciones 10 veces concentradas;

7. Antes de añadir las sustancias de prueba a las células, se mezclaron 120 pl de IL-1 p/IL-1 F2 10 veces concentrada con 120 pl de solución de heterodímero II,1 R-FcV-RAcP-Fcn 10 veces concentrada correspondiente (o control apropiado) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min;

8. Después de la incubación, se añadieron 100 pl de cada mezcla a los pocillos que contenían 0,4 ml de medio de crecimiento;

9. Las células se incubaron en presencia de las sustancias de prueba durante 24 horas y se recogieron los sobrenadantes, se centrifugaron a 300 x g durante 10 min y se utilizaron para el ensayo ELISA de IL-6.

La curva de calibración obtenida en la inhibición mediada por el heterodímero II,1R-FcV-RAcP-Fcn del ensayo de producción de IL-6 se muestra en laFigura 10.Los resultados de las mediciones de la producción de IL-6 mediada por el heterodímero IL1R-FcV-RAcP-FcII y de la recuperación de IL-6 del medio de cultivo en el experimento se muestran en laFigura 11y laFigura 12.Los valores numéricos obtenidos para la producción de IL-6 junto con sus desviaciones estándar se presentan en laTabla 6.

Tabla 6:Resumen de los valores de producción de IL-6.

Cada punto experimental se colocó en placas por duplicado y la producción de IL-6 se midió adicionalmente por duplicado, lo que dio como resultado 4 lecturas experimentales por punto de concentración. Los datos obtenidos demostraron una alta reproducibilidad del procedimiento experimental y del ensayo. El experimento anterior reveló que el valor de IC50 para el heterodímero IL1 R-FcV-RAcP-FcII en este experimento fue de alrededor de 0,3 mg/ml o aproximadamente 2,4 pM.

Ejemplo 5:Farmacocinética (PK) del heterodímero IL1 R-FcV-RAcP-FcII después de la administración subcutánea en ratones.

Los polipéptidos del heterodímero II,1R-FcV-RAcP-Fcn (id. de sec. n.° 1 e id. de sec. n.° 2) se coexpresaron y purificaron esencialmente como se describe en los ejemplos anteriores. Para la administración a animales, los polipéptidos se formularon en el siguiente tampón: 1 % p/v de sacarosa, cloruro de sodio 100 mM, clorhidrato de L-arginina 20 mM, bicarbonato de sodio 25 mM, pH 6,3. La concentración madre de dosificación usada fue de 0,5 mg/mL del polipéptido.

Se aleatorizaron catorce ratones Balb/c nu/nu hembra en función del peso corporal en siete grupos de dos animales el día 0 del estudio. Se administró un único tratamiento de los polipéptidos (5 mg/kg) por vía subcutánea (dorsal) el día 0 a todos los grupos, excepto a los ratones del grupo 1, que se sangraron mediante punción cardíaca para la preparación de plasma el día 0 del estudio. Se extrajeron muestras de sangre de ratones a través del seno orbitario en los grupos restantes en diversos momentos a lo largo del estudio para la preparación del plasma.

Se registraron los pesos corporales de todos los animales el día del tratamiento (día 0) y luego tres veces por semana, incluido el día de finalización de cada grupo.

Los grupos de ratones se sacrificaron en momentos determinados para la preparación del plasma. Los cambios en el peso corporal no se midieron en los grupos seleccionados para la recolección de muestras a las 0 horas y en el trascurso de las 36 horas posteriores a la administración de la dosis. Todos los demás ratones aumentaron de peso corporal y no se notificaron signos clínicos adversos durante el período de estudio.

Tras la fase inicial del estudio, las muestras de plasma se analizaron mediante ELISA para detectar proteínas Hu-Fc. La cuantificación de Hu-Fc en muestras de plasma de ratón mediante ELISA se usó como lectura de los niveles circulantes de los polipéptidos. El ensayo se realizó en muestras de todos los ratones del estudio.

Los polipéptidos se detectaron en el plasma de los animales 1 hora después de la administración. A continuación, se utilizó una ecuación del modelo de desintegración de una fase utilizando Prism 5.0c (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, EE. UU.) para determinar la farmacocinética de los polipéptidos detectados mediante ELISA Hu-Fc. Se determinó que el nivel máximo circulante de Hu-Fc (Cmáx) fue de 1,65 pg/mL, y el tiempo hasta alcanzar los niveles circulantes máximos (Tmáx) fue de 36 horas después del tratamiento. La semivida (T1/2) fue de 88,15 horas y la constante de velocidad (K) fue de 0,0079 h-1. Los niveles de Hu-Fc fueron insignificantes en el plasma de los animales del Grupo 1 no tratados. Los resultados del estudio se resumen en la Tabla 7.

Tabla 7:Concentración media de proteína Fc humana ± SEM (pg/mL) en cada momento posterior a la administración

Grupo Tratamiento Programa de sangrado (tiempo Concentración media de SEM después de la administración) proteína Fc humana [pg/mL]

1 Sin tratamiento 0 horas 0,00<-*>2 polipéptido de las id. 30 minutos 0,02 0,01 3<de sec. n.° 1 y n.° 2>;(5 mg/kg, solo una1 horaA 0,12 0,00 4 vez, s.c.) 2 horasA 0,24 0,09 5 4 horasA 0,76 0,03 6 8 horasA1,110,10 7 10 horasA 1,53 0,08 2 24 horas# 1,47 0,14 3 36 horas# 1,65 0,11 4 96 horas# 1,27 0,01 5 7 días# 0,43 0,01 Grupo Tratamiento Programa de sangrado (tiempo Concentración media de SEM después de la administración) proteína Fc humana [pg/mL] ;6 14 días# 0,13 0,07 7 21 días# 0,06 0,04 *SEM no se pudo calcular ya que el nivel de Hu-Fc estaba por debajo del límite detectable de ELISA para una de las muestras en el grupo. La concentración de proteína humana-Fc se determinó mediante el software Prism a partir de la absorbancia media de las muestras por triplicado. Sangrado a través del seno orbitario# Sangrado a través de punción cardíaca terminal

Ejemplo 6:Evaluación de la toxicidad del heterodímero II,1R-FcV-RAcP-Fcn después de 28 días de dosificación repetida en ratones C57BL6.

A continuación se presenta un resumen de los resultados del estudio de evaluación de toxicidad murina con dosis repetidas. El tratamiento de ratones C57BL6 con polipéptidos del heterodímero II,1 R-FcV-RAcP-Fcn (id. de sec. n.° 1 e id. de sec. n.° 2) con el artículo de ensayo mediante inyección subcutánea dos veces por semana a niveles de dosis de 10, 30 y 100 mg/kg fue bien tolerado en el estudio. No hubo muertes no programadas antes de la finalización del estudio. El tratamiento con el artículo de ensayo no se asoció con morbilidad ni signos clínicos de toxicidad. No hubo ningún efecto en el peso corporal consistente relacionado con el sexo o el tratamiento. Se observó un aumento del consumo de alimentos que se consideró un posible efecto del tratamiento, pero no se consideró adverso.

Si bien había pruebas de cambios funcionales en los parámetros relacionados con la bioquímica clínica, no se consideró que tuvieran importancia toxicológica, ya que había pruebas de reversibilidad en la mayoría de estos parámetros, aunque no completas en algunos. En ausencia de evaluación toxicocinética, no fue posible evaluar la importancia de la aparente irreversibilidad de algunas de estas diferencias. Sin embargo, ninguna de las diferencias se asoció con cambios histopatológicos ni se consideró adversa. Las diferencias observadas eran de un tipo que típicamente es reversible y es posible que el período de reversibilidad no fuera suficiente para demostrarlo.

Se concluyó que, por lo tanto, el nivel sin efectos adversos observados (NOAEL) en el estudio de dosificación del heterodímero IL1 R-FCV-RacP-FcII en ratones durante 28 días se consideró de 100 mg/kg.

El alcance total de la invención debe determinarse haciendo referencia a las reivindicaciones y la memoria descriptiva.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   i. Una composición de proteínas heterodiméricas capaz de unirse a la IL-1p humana, comprendiendo dicha composición de proteínas:

   un primer polipéptido que comprende

   una primera secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 18 a 333 de la IL1-R1 humana, y

   una segunda secuencia de aminoácidos que comprende un primer mutante de una porción Fc de Fc de inmunoglobulina gamma-1 humana;

   un segundo polipéptido que comprende

   otra primera secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 21 a 358 de ILI-RAcP humana, y

   otra segunda secuencia de aminoácidos que comprende un segundo mutante de la porción Fc de Fc de inmunoglobulina gamma-1 humana; y

   en donde dichos primer y segundo mutantes se seleccionan para favorecer el ensamblaje heterodimérico entre dichos primer y segundo mutantes sobre cualquier ensamblaje homodimérico, en donde el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 1 y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 2.
2. 2. La composición de proteínas de la reivindicación 1, en donde dicha composición de proteínas presenta actividad de unión a IL-1 p humana en un ensayo ELISA con una EC50 de 50 ng/ml.
3. 3. Una composición terapéutica, comprendiendo la composición una composición de proteínas heterodiméricas capaz de unirse a IL-1 p humana, comprendiendo dicha composición de proteínas heterodiméricas:

   un primer polipéptido que comprende

   una primera secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 18 a 333 de la IL1-R1 humana, y

   una segunda secuencia de aminoácidos que comprende un primer mutante de una porción Fc de Fc de inmunoglobulina gamma-1 humana;

   un segundo polipéptido que comprende

   otra primera secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 21 a 358 de IL-RACP humana, y

   otra segunda secuencia de aminoácidos que comprende un segundo mutante de la porción Fc de Fc de inmunoglobulina gamma-1 humana; y

   en donde dichos primer y segundo mutantes se seleccionan para favorecer el ensamblaje heterodimérico entre dichos primer y segundo mutantes sobre cualquier ensamblaje homodimérico, en donde el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 1 y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 2.
4. 4. La composición terapéutica de la reivindicación 3, en donde la semivida de dicha composición de proteínas heterodiméricas en la circulación sistémica en ratones después de una administración subcutánea a una dosis de 5 mg/kg es de al menos 88 horas, como se analiza mediante ELISA de Fc humana.
5. 5. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de la id. de sec. n.° 1, id. de sec. n.° 2, id. de sec. n.° 3 y la id. de sec. n.° 5.
6. 6. El ácido nucleico de la reivindicación 5, en donde el uso de codones está optimizado para una alta expresión de dicho polipéptido en una célula de mamífero.
7. 7. El ácido nucleico de la reivindicación 5, en donde la secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 3 y comprende la secuencia de la id. de sec. n.° 4, o en donde la secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 5 y comprende la secuencia de la id. de sec. n.° 6.
8. 8. El ácido nucleico de la reivindicación 7, en donde dicho ácido nucleico comprende un vector de expresión.
9. 9. Un ácido nucleico aislado de la id. de sec. n.° 7.
10. 10. Un sistema de expresión heterólogo, albergando el sistema de expresión un vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un primer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 3 y otra secuencia de ácidos nucleicos que codifica un segundo polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 5.
11. 11. El sistema de expresión de la reivindicación 10, en donde dicho vector de expresión está albergado en una célula de mamífero, preferiblemente en donde dicha célula de mamífero es una célula de CHO.
12. 12. El sistema de expresión de la reivindicación 11, en donde dicho sistema de expresión es capaz de expresar una proteína heterodimérica que comprende un primer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 1 y un segundo polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 2, y en donde el nivel de expresión de dicha proteína heterodimérica es de al menos 300 mg por litro de cultivo celular.
13. 13. Una proteína heterodimérica que comprende un primer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 1 y un segundo polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 2 para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad asociada con la modulación de la actividad de la IL-1 p humana, en donde dicha enfermedad es una artritis, o en donde dicha enfermedad es una gota, o en donde dicha enfermedad es una artritis reumatoide, o en donde dicha enfermedad es un Síndromes Periódicos Asociados a la Criopirina (CAPS), o en donde dicha enfermedad es una esclerodermia, o en donde dicha enfermedad es una diabetes, o en donde dicha enfermedad es aterosclerosis, o en donde dicha enfermedad es una enfermedad del ojo seco, o en donde dicha enfermedad es una alergia ocular, o en donde dicha enfermedad es una uveítis.
14. 14. Una composición de proteínas heterodiméricas capaz de unirse a IL-1 p humana, siendo dicha composición de proteínas capaz de inhibir la producción de IL-6 humana en fibroblastos de pulmón humano en respuesta al tratamiento de los fibroblastos con IL-1 p humana, teniendo dicha inhibición un valor de IC50 de 2,3 pM, en donde la composición de proteínas heterodiméricas comprende un primer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 1 y un segundo polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.° 2.