ES2988190T3 - Soja con altas tasas de germinación y contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa - Google Patents

Abstract

Semillas de soja que tienen un fenotipo de rafinosa y estaquiosa ultrabajo. También se describe un alelo mutante de soja denominado SG-ULRFO que da como resultado un fenotipo de rafinosa y estaquiosa ultrabajo. La presente invención también se refiere a una semilla de soja, una planta de soja y partes de una planta de soja y un híbrido de soja que comprende el alelo mutante. También se describen semillas de soja con un contenido de rafinosa y estaquiosa ultrabajo que tienen tasas de germinación inesperadamente mayores en comparación con líneas de soja que no tienen un contenido de semilla bajo de rafinosa y estaquiosa. También se describen genes RS3 y RS4 mutantes con polimorfismos que contribuyen al fenotipo de rafinosa y estaquiosa ultrabajo como se describe en la presente invención. La presente invención también se refiere a un método de uso de las semillas y plantas de soja de la presente invención, a partes de plantas derivadas de la presente invención, a métodos de producción de plantas transgénicas utilizando las plantas y semillas de la presente invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Soja con altas tasas de germinación y contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un alelo mutante de soja que da como resultado un fenotipo con niveles ultrabajos de rafinosa y estaquiosa. La presente invención también se refiere a una semilla de soja, una planta de soja y partes de una planta de soja y un híbrido de soja que comprende el alelo mutante. Asimismo, la presente invención se refiere a transferir este alelo mutante a otras plantas de soja. La presente invención también se refiere a novedosos polimorfismos de genes de rafinosa sintasa de soja que se asocian con un fenotipo con niveles ultrabajos de rafinosa y estaquiosa. La presente invención también se refiere a nuevas semillas de soja que tienen tanto un fenotipo con niveles ultrabajos de rafinosa como de estaquiosa y que tienen altas tasas de germinación.

La soja[Glycine max(L.) Merr.] representa uno de los cultivos económicos más importantes en los Estados Unidos y se considera similar en importancia al maíz (zeamaysL.) en cuanto a superficie cultivada y segunda después del maíz en valor (Sleper y Poehlman, 2006). La composición de aceite, proteína y carbohidratos de la semilla de soja generalmente controla su uso. Las semillas de cultivares de soja en los Estados Unidos tienen una composición promedio del 20 % de aceite, 40 % de proteína y 15 % de carbohidratos solubles en pesos secos de cotiledones de semillas no germinadas (Hsuet al.,1973).

La harina gruesa de soja es un componente principal de las dietas de animales monogástricos y su utilidad se determina, en parte, por el componente de carbohidratos. El componente de carbohidratos de la harina gruesa de soja está compuesto por tres oligosacáridos principales: sacarosa, rafinosa y estaquiosa (Openshaw y Hadley, 1978). De las tres, sólo la sacarosa es nutricionalmente útil y puede ser digerida completamente por animales monogástricos. La rafinosa y la estaquiosa se consideran unidades antinutricionales porque no pueden ser digeridas debido a la falta de actividad de a-galactosidasa en el intestino de los animales monogástricos. Se ha informado que la eliminación de la rafinosa y la estaquiosa de la harina gruesa de soja aumenta la energía metabolizable de la dieta hasta en un 20 % (Coonet al.,1990). Los efectos de la rafinosa y la estaquiosa en las dietas se han estudiado en cerdos (Smirickyet al.,2002), perros (Zuoet al.,1996), pollos (Parsonset al.,2000) y seres humanos (Suarezet al.,1999). Generalmente, la rafinosa y la estaquiosa son mal digeridas por los monogástricos; la eliminación de la rafinosa y la estaquiosa de la harina gruesa de soja aumenta la energía metabolizable de la dieta y reduce la producción de flatulencia (Coonet al.,1990; Parsonset al.,2000; Suarezet al.,1999).

Se han publicado en la bibliografía científica estudios botánicos exhaustivos sobre la presencia de rafinosa y estaquiosa (véase Dey, P. M. en Biochemistry of Storage Carbohydrates in Green Plants, Academic Press, Londres, (1985) págs. 53-129). Se cree que la rafinosa y la estaquiosa ocupan el segundo lugar, después de la sacarosa, entre los carbohidratos no estructurales en cuanto a abundancia en el reino vegetal. De hecho, la rafinosa y la estaquiosa pueden estar omnipresentes, al menos entre las plantas superiores. La rafinosa y la estaquiosa se acumulan en cantidades significativas en la porción comestible de muchas especies de cultivos económicamente importantes. Los ejemplos incluyen soja(Glycine maxL. Merrill), remolacha azucarera(Beta vulgaris),algodón(Gossypium hirsutum L.),colza (Brassica sp.) y todos los principales cultivos leguminosos comestibles, incluyendo judías(Phaseolussp.), garbanzo(Cicer arietinum),caupí(Vigna unguiculata),soja verde(Vigna radiata),guisantes(Pisum sativum),lenteja(Lens culinaris)y altramuz(Lupinussp.).

La biosíntesis de la rafinosa y la estaquiosa ha sido bastante bien caracterizada. Véase Dey, P. M. en Biochemistry of Storage Carbohydrates in Green Plants (1985). La reacción comprometida de la biosíntesis de la rafinosa y la estaquiosa implica la síntesis de galactinol a partir de UDP galactosa y mioinositol. La enzima que cataliza esta reacción es la galactinol sintasa. Se cree que la síntesis de rafinosa y homólogos superiores de la rafinosa y la estaquiosa a partir de la sacarosa está catalizada por distintas galactosiltransferasas (por ejemplo, rafinosa sintasa, estaquiosa sintasa, etc.).

Además de evaluar las plantas a nivel molecular, el fitomejoramiento es un área importante en el desarrollo de cualquier germoplasma vegetal novedoso y deseable. El fitomejoramiento comienza con el análisis y la definición de los problemas y las debilidades del germoplasma actual, el establecimiento de los objetivos del programa y la definición de objetivos específicos de mejoramiento. La siguiente etapa es la selección del germoplasma que posee los rasgos necesarios para cumplir los objetivos del programa. Estos rasgos importantes pueden incluir un mayor rendimiento de las semillas, resistencia a enfermedades e insectos, mejores tallos y raíces, tolerancia a la sequía y al calor, y mejor calidad agronómica.

La complejidad de la herencia influye en la elección del método de mejoramiento cuando se desarrollan nuevas líneas de soja. El mejoramiento por retrocruzamiento se usa para transferir uno o unos pocos genes favorables para un rasgo altamente heredable a un cultivar deseable. Este enfoque se ha usado ampliamente para el mejoramiento de cultivares resistentes a enfermedades. Se usan diversas técnicas de selección recurrente para mejorar cuantitativamente los rasgos heredados, controlados por numerosos genes. La utilización de selección recurrente en cultivos autógamos depende de la facilidad de polinización, la frecuencia de los híbridos exitosos de cada polinización y del número de descendientes híbridos de cada cruce exitoso.

Cada programa de mejoramiento debe incluir una evaluación periódica y objetiva de la eficiencia del procedimiento de mejoramiento. Los criterios de evaluación varían según la meta y los objetivos, pero deben incluir la ganancia de la selección por año basándose en comparaciones con un estándar apropiado, el valor general de las líneas de mejoramiento avanzadas y el número de líneas exitosas producidas por unidad de insumo (por ejemplo, por año, por dólar gastado, etc.).

Una de las tareas más difíciles es la identificación de líneas genéticamente superiores, porque, para la mayoría de los rasgos, el verdadero valor genotípico está enmascarado por otros rasgos de la planta o factores ambientales que pueden confundirlo. Un método para identificar una planta superior es observar su rendimiento en relación con otras plantas experimentales y con un cultivar estándar crecido ampliamente. Si una sola observación no es concluyente, las observaciones replicadas pueden proporcionar una mejor estimación de su valor genético.

Además de las observaciones fenotípicas, también se puede examinar el genotipo de una planta. Hay muchas técnicas de laboratorio disponibles para el análisis, la comparación y la caracterización del genotipo de la planta; entre ellos se encuentran la electroforesis de isozimas, polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés), ADN polimórficos amplificados aleatoriamente (RAPD, por sus siglas en inglés), reacción en cadena de la polimerasa con cebadores arbitrarios (AP-PCR, por sus siglas en inglés), identificación de la amplificación del ADN (DAF, por sus siglas en inglés), regiones amplificadas caracterizadas por secuencias (SCAR, por sus siglas en inglés), polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLP, por sus siglas en inglés), repeticiones de secuencias simples (SSR, por sus siglas en inglés, también denominadas microsatélites) y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés).

La soja,Glycine max(L), es un cultivo de campo importante y valioso. Por lo tanto, un objetivo permanente de los obtentores de plantas de soja es desarrollar líneas de soja estables y de alto rendimiento con importantes rasgos comerciales y agronómicos.

Los ejemplos anteriores de la técnica relacionada y las limitaciones relacionadas con la misma están destinados a ser ilustrativos y no excluyentes. Otras limitaciones de la técnica relacionada resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras la lectura de la memoria descriptiva.

SUMARIO DE LAS ENSEÑANZAS TÉCNICAS

Las siguientes realizaciones y aspectos de las mismas se describen junto con sistemas, herramientas y métodos que pretenden ser de ejemplo, no limitantes en su alcance. En diversas realizaciones, uno o más de los problemas descritos anteriormente se han reducido o eliminado, mientras que otras realizaciones se refieren a otras mejoras.

En un aspecto, la invención proporciona semillas y plantas de soja que tienen un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa. También se divulgan las partes de esta planta, incluyendo, pero sin limitación, polen, un óvulo y una célula. Además, se divulga un cultivo tisular de células regenerables de la planta, en donde el cultivo tisular regenera plantas de soja capaces de expresar todas las características fisiológicas y morfológicas de la semilla y las plantas de la presente invención. Las células regenerables pueden ser embriones, células meristemáticas, polen, hojas, raíces, puntas de raíces o flores o protoplastos o callos procedentes de las mismas. Además, se divulga una planta o semilla de soja regenerada a partir del cultivo tisular capaz de expresar todas las características fisiológicas y morfológicas de la planta o semilla de partida.

La presente invención se refiere a un alelo mutante derivado de la soja que se expresa fenotípicamente mediante un bajo contenido de rafinosa y estaquiosa en las semillas y altas tasas de germinación. La invención se refiere además a plantas, semillas y otras partes de una planta, tales como polen y óvulos, que contienen el alelo mutante.

La invención también se refiere a la introducción del alelo de la presente invención en plantas cruzando una planta que carece del alelo mutante con una planta que tiene el alelo, autofecundando las generaciones resultantes y seleccionando a continuación las plantas que tienen el alelo mutante.

La invención también se refiere a un método para producir una planta o semilla de soja que comprende cruzar un primer progenitor de planta de soja con un segundo progenitor de planta de soja y cosechar la semilla resultante, en donde uno o ambos progenitores contienen el alelo mutante de la invención y a semillas híbridas, plantas y partes de las mismas producidas por dichos métodos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un contenido ultrabajo de rafinosa en las semillas, definido como un contenido de rafinosa en las semillas del 0 % al 0,13 % en peso seco o húmedo contenido total en las semillas, incluyendo del 0,01 %, 0,03 %, 1,06 %, 0,07 %, 0,10 %, 0,11 % y el 0,13 %, incluyendo todos los números enteros y fracciones de los mismos.

En otro aspecto de la invención, un contenido ultrabajo de estaquiosa en las semillas se define como un contenido de estaquiosa en las semillas del 0,19%al 1,6%en peso seco o húmedo contenido total en las semillas, incluyendo del 0,1 %, 0,2 %, 0,4 %, 0,55 %, 0,73 %, 0,85 %, 0,91 %, 1,05 %, 1,06 %, 1,08 %, 1,1 %, 1,15 %, 1,19 %, 1,23 %, 1,33 %, 1,37 %, 1,42 %, 1,46 %, 1,49 %, 1,52 %, 1,56 %, 1,59 %, 1,6 %, incluyendo todos los números enteros y fracciones de los mismos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un contenido ultrabajo combinado de rafinosa y estaquiosa en las semillas del 0,19 % al 1,75 % en peso seco o húmedo contenido total en las semillas, incluyendo del 0,02 %, 0,05 %, 0,07 %, 0,12 %, 0,16 %, 0,21 %, 0,26 %, 0,34 %, 0,38 %, 0,48 %, 0,49 %, 0,51 %, 0,55 %, 0,59 %, 0,63 %, 0,67 %, 0,78 %, 0,80 %, 0,85 %, 0,91 %, 0,96 %, 1,12 %, 1,19 %, 1,23 %, 1,28 %, 1,33 %, 1,38 %, 1,45 %, 1,49 %, 1,56 %, 1,57 %, 1,63 %, 1,68 %, 1,71 %, 1,73 %, 1,75 %, incluyendo todos los números enteros y fracciones de los mismos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una mayor tasa de germinación con el contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas, donde las tasas de germinación de dichas semillas son del 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y el 99 %, incluyendo todos los números enteros y fracciones de los mismos.

En otro aspecto, la invención se refiere a una planta o semilla de soja con un fenotipo hereditario de (i) un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas de menos del 0,13 % en peso seco o húmedo contenido total en las semillas; (ii) un contenido ultrabajo de estaquiosa en las semillas de menos del 1,6 % en peso seco o húmedo contenido total en las semillas; y (iii) una tasa de germinación de las semillas de al menos el 83 %.

La invención también se refiere a métodos para introducir el contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas de la presente invención en otras plantas cruzando una planta que carece del fenotipo de contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa con una planta que presenta el contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas y seleccionando a continuación las plantas que presentan el contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas.

La presente invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislada que contribuye al contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas, como se muestra en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:3, y a un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

La presente invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislada que contribuye al contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas, como se muestra en la secuencia de ADN SEQ ID NO:5, y a un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6.

La presente invención se refiere a una semilla de soja que tiene un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en la semilla y que contiene la secuencia de ácido nucleico mutante de RS2 (SEQ ID NO:1), la secuencia de ácido nucleico mutante de RS3 (SEQ ID NO:3) y la secuencia de ácido nucleico mutante de RS4 (SEQ ID NO:5).

La presente invención también se refiere a un gen quimérico que comprende cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aisladas de la presente invención unidas operativamente a una secuencia reguladora, y a una célula, una planta y una semilla que comprenden el gen quimérico.

La presente invención también se refiere a un vector que comprende cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aisladas mencionadas anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir semillas de soja con un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas y con altas tasas de germinación. El método puede implicar cruzar las plantas de soja con un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa y una alta tasa de germinación con otra soja que no comprenda estos rasgos, cosechar la semilla de dicho cruce y seleccionar semillas que tengan estos rasgos deseados durante una o más generaciones. Cuando se desee, el método puede incluir analizar las semillas de soja de la progenie para determinar el contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas y realizar pruebas para determinar las altas tasas de germinación.

La presente invención también se refiere a cualquiera de dichos métodos que usan plantas de soja que tienen un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas y altas tasas de germinación como parte de esta invención: autofecundación, retrocruzamientos, producción de híbridos y cruces con poblaciones, y todas las plantas producidas usando dichas plantas y semillas de soja como al menos un progenitor.

Sumario de la invención

Por consiguiente, la invención proporciona una planta de soja de progenie obtenible mediante un proceso que comprende la etapa de cruzar la planta de soja depositada en la ATCC con el número de acceso PTA-10830 y que comprende: (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 2 (RS2) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 2, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 3 (RS3) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 4, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 4 (RS4) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 6; o (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 2 (RS2) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 3 (RS3) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 4 con otra planta de soja que carece de dichas secuencias de ácido nucleico, comprendiendo dicho proceso opcionalmente además una o más etapas de cruzamiento adicionales para obtener plantas de soja de generaciones posteriores que contienen dichas secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos como se expone en (a) las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6; o (b) las SEQ ID NOS: 2 y 4.

La invención también proporciona una semilla de dicha planta de soja, conteniendo dicha semilla de soja dichas secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos como se expone en (a) las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6; o (b) las SEQ ID NOS: 2 y 4.

La invención también proporciona un vector que comprende: (a) la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:3 y la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:5; o (b) la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 y la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:3.

La invención también proporciona una planta o semilla de soja transgénica que comprende dicho vector.

La invención también proporciona un método, en donde el método comprende producir un producto vegetal básico a partir de una planta o semilla de soja, en donde dicha planta o semilla de soja comprende: (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 2 (RS2) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 2, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 3 (RS3) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 4, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 4 (RS4) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 6; o (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 2 (RS2) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 3 (RS3) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 4; en donde el producto vegetal básico es concentrado de proteína, aislado de proteínas, cáscaras de soja, harina gruesa, harina o aceite.

En las reivindicaciones dependientes se definen aspectos adicionales y realizaciones preferidas. Cualquier aspecto, realización y ejemplos de la presente divulgación que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona únicamente con fines ilustrativos.

Definiciones

En la descripción y las tablas a continuación, se usan varios términos y expresiones. Con el fin de proporcionar una comprensión clara y coherente de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, incluyendo el alcance que se le debe dar a dichos términos y expresiones, se proporcionan las siguientes definiciones:

Alelo. Un alelo es cualquiera de una o más formas alternativas de un gen que se refiere a un rasgo o característica. En una célula u organismo diploide, los dos alelos de un gen dado ocupan los correspondientes locus en un par de cromosomas homólogos.

Retrocruzamiento. El retrocruzamiento es un proceso en el que un obtentor cruza repetidamente la progenie híbrida con uno de los progenitores, por ejemplo, un híbrido F1 de primera generación con uno de los genotipos progenitores del híbrido F1.

Célula. Como se usa en el presente documento, el término célula incluye una célula vegetal, ya sea aislada, en cultivo tisular o incorporada en una planta o parte de una planta.

Secuencia codificante. Se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos específica. "Secuencias reguladoras" se refiere a secuencias de nucleótidos ubicadas cadena arriba (secuencias 5' no codificantes), dentro o cadena abajo (secuencias 3' no codificantes) de una secuencia codificante y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líder de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación.

Cotiledón. Un cotiledón es un tipo de hoja de semilla. El cotiledón contiene los tejidos de almacenamiento de alimentos de la semilla.

Derivado/a de. La expresión "derivado/a de" incluye genes, ácidos nucleicos y proteínas cuando incluyen fragmentos o elementos ensamblados de tal manera que producen una unidad funcional. Los fragmentos o elementos se pueden ensamblar a partir de múltiples organismos siempre que conserven la función conservada evolutivamente. Los elementos o dominios podrían ensamblarse a partir de diversos organismos y/o sintetizarse parcial o totalmente, siempre que conserven la función, los elementos o los dominios conservados evolutivamente. En algunos casos, la derivación podría incluir cambios para que los codones se optimicen para la expresión en un organismo particular.

Embrión. El embrión es la planta pequeña contenida dentro de una semilla madura.

Expresión. El término "expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a la transcripción y acumulación estable de ARN codificante (ARNm) o no codificante procedente del fragmento de ácido nucleico de la invención. La expresión también puede referirse a la traducción de ARNm en un polipéptido.

Gen. Como se usa en el presente documento, "gen" se refiere a un segmento de ácido nucleico. Un gen puede introducirse en el genoma de una especie, ya sea de una especie diferente o de la misma especie, mediante transformación o diversos métodos de mejoramiento.

Silenciamiento génico. La interrupción o supresión de la expresión de un gen a nivel de transcripción o traducción.

Genotipo. Se refiere a la constitución genética de una célula u organismo.

Ligadura. Se refiere a un fenómeno en donde los alelos del mismo cromosoma tienden a segregarse juntos con más frecuencia de lo esperado por casualidad si su transmisión fuera independiente.

Desequilibrio de ligadura. Se refiere a un fenómeno en donde los alelos tienden a permanecer juntos en grupos de ligadura cuando se segregan de los progenitores a la descendencia, con una frecuencia mayor de la esperada a partir de sus frecuencias individuales.

Locus. Un locus confiere uno o más rasgos tales como, por ejemplo, esterilidad masculina, tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, almidón céreo, metabolismo modificado de ácidos grasos, metabolismo modificado de ácido fítico, metabolismo modificado de carbohidratos y metabolismo modificado de proteínas. El rasgo puede ser, por ejemplo, conferido por un gen de origen natural introducido en el genoma de la planta mediante retrocruzamiento, una mutación natural o inducida, o un transgén introducido mediante técnicas de transformación genética. Un locus puede comprender uno o más alelos integrados en una única ubicación cromosómica.

Grupo de madurez. Se refiere a una división industrial acordada de grupos de variedades basadas en zonas en las que están adaptadas, principalmente según la duración del día o la latitud. Consisten en variedades con una duración del día muy larga (Grupos 000, 00, 0) y se extienden a variedades con una duración del día muy corta (Grupos VII, VIII, IX, X).

Oligosacárido. Un oligosacárido significa un sacárido que contiene de tres a diez componentes (anillos).

Fenotipo. Las características detectables de una célula u organismo, cuyas características que son la manifestación de la expresión génica.

Planta. Como se usa en el presente documento, el término "planta" incluye la referencia a una planta entera inmadura o madura, incluyendo una planta de la que se han eliminado las semillas, los granos o las anteras. La semilla o el embrión que producirá la planta también se considera la planta.

Partes de la planta. Como se usa en el presente documento, la expresión "partes de la planta" (o una planta de soja, o una parte de la misma) incluye, pero sin limitación, protoplastos, hojas, tallos, raíces, puntas de raíces, anteras, pistilos, semilla, grano, embrión, polen, óvulos, cotiledón, hipocótilo, vaina, flor, brote, tejido, pecíolo, células y células meristemáticas.

Progenie. Como se usa en el presente documento, incluye una planta de soja F1 producida a partir del cruce de dos plantas de soja, donde al menos una planta incluye una planta de soja de la presente invención y la progenie incluye además, pero sin limitación, cruces generacionales F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9 y F10 posteriores con la línea progenitora recurrente.

Proteína o polipéptido. Una "proteína" o "polipéptido" es una cadena de aminoácidos dispuesta en un orden específico determinado por la secuencia codificante en un polinucleótido que codifica el polipéptido. Cada proteína o polipéptido tiene una función única.

Locus de rasgos cuantitativos (QTL, por sus siglas en inglés). Los locus de rasgos cuantitativos (QTL) se refieren a los locus genéticos que controlan hasta cierto punto los rasgos numéricamente representables que suelen estar distribuidos de forma continua.

Rafinosa. La rafinosa es un trisacárido, una molécula de 3 anillos, compuesta por glucosa, fructosa y galactosa. Polinucleótido recombinante. La expresión polinucleótido recombinante se refiere a un polinucleótido que se obtiene mediante la combinación de dos segmentos de secuencia que de otro modo estarían separados, mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de polinucleótidos mediante técnicas de ingeniería genética o síntesis química. Al hacerlo, se pueden unir segmentos de polinucleótidos de funciones deseadas para generar una combinación deseada de funciones.

Regeneración. La regeneración se refiere al desarrollo de una planta a partir de un cultivo tisular.

Conversión de un solo gen (conversión). Las plantas con un solo gen convertido (conversión) se refieren a plantas que se desarrollan mediante una técnica de fitomejoramiento denominada retrocruzamiento, en donde se recuperan básicamente todas las características morfológicas y fisiológicas deseadas de una variedad, además del gen único transferido a la variedad mediante la técnica de retrocruzamiento o mediante ingeniería genética.

Estaquiosa. La estaquiosa es un tetrasacárido, una molécula de 4 anillos, compuesta por glucosa, fructosa y 2 moléculas de galactosa.

Sacarosa. La sacarosa es un disacárido compuesto por fructosa y glucosa (azúcar de mesa).

Breve descripción de las figuras

Las realizaciones de ejemplo se ilustran en las figuras a las que se hace referencia. Se pretende que las realizaciones y las figuras divulgadas en el presente documento se consideren ilustrativas en lugar de limitantes.

La figura 1 compara la secuencia de aminoácidos de RS2 mutante con una línea de tipo natural (control), Williams 82, una línea pública, PI 200508 y las líneas de soja 247F y 222-18-1, en donde la línea 222-18-1 de la presente invención tiene el contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas y altas tasas de germinación.

La figura 2 compara la secuencia de aminoácidos de RS3 mutante con una línea de tipo natural (control), Williams 82, una línea pública, PI 200508 y las líneas de soja 247F y 222-18-1, en donde la línea 222-18-1 de la presente invención tiene el contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas y altas tasas de germinación.

La figura 3 compara la secuencia de aminoácidos de RS4 mutante con una línea de tipo natural (control), Williams 82, una línea pública, PI 200508 y las líneas de soja 247F y 222-18-1, en donde la línea 222-18-1 de la presente invención tiene el contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas y altas tasas de germinación.

La figura 4 compara el contenido de sacarosa, rafinosa y estaquiosa de la semilla de soja para las cinco líneas avanzadas con contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa de la presente invención en dos entornos/estaciones de cultivo diferentes. Las líneas se cultivaron por primera vez en los EE. UU. en 2008 y 2009. 932D129, 932D130 y 932D132 representan líneas de soja con tres maduraciones tempranas y 926D112 y 928D120 representan líneas de soja con dos maduraciones tardías.

La figura 5 compara las tasas de germinación de las líneas avanzadas con contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa de la presente invención en comparación con las líneas de verificación con la madurez apropiada. Cada línea se ensayó para determinar germinación en temperaturas cálidas y frías. Las semillas para crear estos datos se produjeron en una temporada de cultivo en EE. UU. de 2009. Los primeros cinco pares de barras comparten una madurez temprana tres. Los primeros tres pares tienen fenotipos con contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa y los dos últimos representan líneas de verificación (control). Los últimos tres pares o barras comparten madurez tardía dos; los dos primeros pares tienen fenotipos con contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa y el último par representa una línea de verificación.

La figura 6 muestra las tasas de germinación promedio para las líneas avanzadas con contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en comparación con las tasas de germinación promedio para las líneas de verificación (control) con madurez similar. La germinación se ensayó en temperaturas cálidas y frías y se midió como el porcentaje de semillas que germinaron para esa línea.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS LISTADOS DE SECUENCIAS

La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de ácido nucleico del gen de rafinosa sintasa RS2 mutante.

La SEQ ID NO:2 muestra la secuencia de aminoácidos del gen de rafinosa sintasa RS2 mutante.

La SEQ ID NO:3 muestra la secuencia de ácido nucleico del gen de rafinosa sintasa RS3 mutante.

La SEQ ID NO:4 muestra la secuencia de aminoácidos del gen de rafinosa sintasa RS3 mutante.

La SEQ ID NO:5 muestra la secuencia de ácido nucleico del gen de rafinosa sintasa RS4 mutante.

La SEQ ID NO:6 muestra la secuencia de aminoácidos del gen de rafinosa sintasa RS4 mutante.

La SEQ ID NO:7 muestra la secuencia de ácido nucleico de un cebador para la genotipificación (ensayo de marcadores SNP) del gen de rafinosa sintasa RS2.

La SEQ ID NO:8 muestra la secuencia de ácido nucleico de un cebador para la genotipificación (ensayo de marcadores SNP) del gen de rafinosa sintasa RS2.

La SEQ ID NO:9 muestra la secuencia de ácido nucleico de un cebador para la genotipificación (ensayo de marcadores SNP) del gen de rafinosa sintasa RS2.

La SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de ácido nucleico de un cebador de expresión para el gen de rafinosa sintasa RS2.

La SEQ ID NO: 11 muestra la secuencia de ácido nucleico de un cebador de expresión para el gen de rafinosa sintasa RS2.

La SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia de ácido nucleico de un cebador para la genotipificación (ensayo de marcadores SNP) del gen de rafinosa sintasa RS3.

La SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de ácido nucleico de un cebador para la genotipificación (ensayo de marcadores SNP) del gen de rafinosa sintasa RS3.

La SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia de ácido nucleico de un cebador para la genotipificación (ensayo de marcadores SNP) del gen de rafinosa sintasa RS3.

La SEQ ID NO: 15 muestra la secuencia de ácido nucleico de un cebador de expresión para el gen de rafinosa sintasa RS3.

La SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia de ácido nucleico de un cebador de expresión para el gen de rafinosa sintasa RS3.

La SEQ ID NO: 17 muestra la secuencia de ácido nucleico de un cebador de expresión para un factor de elongación constitutivo 1a (usado para el análisis de expresión y como control).

La SEQ ID NO: 18 muestra la secuencia de ácido nucleico de un cebador de expresión para un factor de elongación constitutivo 1a (usado para el análisis de expresión y como control).

Descripción detallada de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier aspecto, realización y ejemplos de la presente divulgación que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona únicamente con fines ilustrativos.

Aunque son abundantes en muchas especies, los oligosacáridos de la familia de la rafinosa, es decir, rafinosa, estaquiosa y verbascosa (también conocidos como RFO), son un obstáculo para la utilización eficiente de algunas especies de cultivos económicamente importantes. La rafinosa y la estaquiosa no se digieren directamente por los animales, principalmente porque la a-galactosidasa no está presente en la mucosa intestinal. Gitzelmann y AuricchioPediatrics(1965) 36:231-236, Rutloffet al.Nahrung (1967) 11:39-46. Sin embargo, la microflora en el intestino inferior puede fermentar fácilmente la rafinosa y la estaquiosa, lo que da como resultado una acidificación del intestino y la producción de dióxido de carbono, metano e hidrógeno. Murphyet al.(1972) J.Agr. Food Chem.20:813-817, Cristofaroet al.en Sugars in Nutrition, (1974) Capítulo 20, 313-335, Reddyet al. J. Food Science(1980) 45:1161-1164. La presencia de rafinosa y estaquiosa restringe el uso de soja en las dietas animales, incluidas las humanas, porque de lo contrario esta especie es una excelente fuente de proteína y fibra. Adicionalmente, se cree que los RFO son una fuente importante de energía durante la germinación de las semillas. En contraste con su potencial para promover la germinación, los RFO representan unidades antinutricionales para los animales monogástricos cuando se consumen como un componente del alimento.

Aunque la función exacta de los RFO en la germinación de las semillas es en gran parte desconocida, está claro que las semillas requieren una gran cantidad de energía durante la germinación (Bewley y Black, 1994). Se plantea la hipótesis de que esta energía provenga de los carbohidratos almacenados. La sacarosa y los RFO son los azúcares solubles más abundantes (Peterbauer y Richter, 2001), pero representan solo una pequeña porción de los carbohidratos totales presentes en las semillas (Ziegler, 1995). Los problemas y costes asociados con los RFO podrían reducirse o eliminarse mediante la disponibilidad de genes que confieran una reducción del contenido de RFO en las semillas de soja. Dichos genes podrían usarse para desarrollar variedades de soja que tengan niveles inherentemente reducidos y ultrabajos de contenido de rafinosa y estaquiosa en las semillas. Las variedades de soja con un contenido de RFO inherentemente reducido mejorarían la calidad nutricional de los productos proteínicos de soja derivados y reducirían los costes de procesamiento asociados con la eliminación de los RFO. Las variedades de soja con un contenido ultrabajo de RFO serían más valiosas que las variedades convencionales para las dietas animales y humanas y permitirían a la humanidad utilizar más plenamente las cualidades nutricionales deseables de esta legumbre comestible. Por lo tanto, el desarrollo de un producto de soja con propiedades de importancia comercial es una alta prioridad en la mayoría de los programas de desarrollo de cultivares de soja.

La etapa clave en la biosíntesis de rafinosa y estaquiosa está mediada por la enzima rafinosa sintasa. La enzima rafinosa sintasa pertenece a un grupo de enzimas de la familia de las hidrolasas que ejecutan una transferencia de galactosilo de galactinol a sacarosa. Esta transferencia produce la molécula de tres anillos rafinosa; el mioinositol se forma como subproducto. De manera similar, la estaquiosa se forma por la acción de la estaquiosa sintasa que combina rafinosa y galactinol. Por lo tanto, la rafinosa sintasa y la estaquiosa sintasa comparten un sustrato idéntico, el galactinol, y un segundo sustrato similar, la sacarosa o la rafinosa, respectivamente. No se sabe si la sintasa de la rafinosa sintasa y la estaquiosa sintasa tienen una actividad enzimática superpuesta en la soja.

No se ha determinado el papel exacto de los RFO durante el desarrollo y la germinación de las semillas de soja, pero se ha teorizado que los r Fo son necesarios para una germinación exitosa. Véanse Obendorf, R.L.,et al. Crop Science.

48:2396-2403 (2008), Obendorf, R.L.,et al.Crop Science. 49:329-341 (2009) y Patente de EE. UU. N.° 6.147.193.

La técnica anterior no ha logrado proporcionar plantas de tales características, presumiblemente debido a la dificultad de combinar el fenotipo con contenido ultrabajo de RFO con tasas de germinación comercialmente aceptables. Al describir métodos para la producción de dichas plantas y proporcionar ejemplos de estas plantas, la invención ahora permite la preparación de un número potencialmente ilimitado de variedades de soja novedosas que exhiben un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas comercialmente significativo. Una vez que se produce dicha variedad de soja, el fenotipo deseado se puede transferir a otras variedades de soja con retrocruzamiento y selección adecuados para mantener los rasgos deseables como se describe en el presente documento.

La presente invención se refiere a un nuevo alelo mutante del género Glycine que se expresa fenotípicamente como un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas y que tiene altas tasas de germinación. La presente invención también se refiere a una semilla de soja, una planta de soja y partes de plantas que comprenden el alelo mutante. La presente invención también se refiere a un método para producir plantas y semillas de soja.

El alelo mutante de la presente invención se puede introgresar en cualquier planta o semilla que carezca del alelo mutante. El alelo mutante y los métodos de la presente invención se pueden usar para modificar el contenido de rafinosa y estaquiosa en las semillas de las semillas soja para la producción comercial. Generalmente, los métodos implican la polinización controlada de brotes o el cultivo de óvulos. Los cruces se pueden realizar usando cualquiera de los progenitores como progenitor de polen.

Se puede obtener una planta de la presente invención cruzando una planta que tenga el alelo mutante de la invención con cualquier planta que carezca del alelo mutante.

Se pueden usar otros esquemas de mejoramiento para introducir el alelo mutante en la planta de soja deseada. El esquema particular usado no es crítico para la invención, siempre que el alelo se incorpore de forma estable en el genoma de la planta o semilla de soja. Por ejemplo, se puede usar un gen marcador. Se puede usar una sonda de ácido nucleico que se hibrida con el gen marcador para identificar las plantas deseadas en la generación Fi.

El alelo mutante se introducirá ventajosamente en variedades que contienen otros rasgos genéticos deseables, tales como resistencia a enfermedades o plagas y tolerancia a la sequía.

La presente invención también se refiere a métodos para producir una planta de soja o una que contenga en su material genético uno o más transgenes y a la planta de soja transgénica producida por ese método. Preferentemente, el transgén es el alelo mutante de la invención o el ADNc del alelo mutante.

La presente invención describe semillas y plantas de soja que tienen un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas. También se divulgan las partes de esta planta, incluyendo, pero sin limitación, polen, un óvulo y una célula. Además, se divulga un cultivo tisular de células regenerables de la planta, en donde el cultivo tisular regenera plantas de soja capaces de expresar todas las características fisiológicas y morfológicas de la semilla y las plantas de la presente invención. Las células regenerables pueden ser embriones, células meristemáticas, polen, hojas, raíces, puntas de raíces o flores o protoplastos o callos procedentes de las mismas. Además, se divulga una planta o semilla de soja regenerada a partir del cultivo tisular capaz de expresar todas las características fisiológicas y morfológicas de la planta o semilla de partida.

De acuerdo con la presente invención, un contenido ultrabajo de rafinosa en las semillas se define como un contenido de rafinosa en las semillas del 0%al 0,13%en peso seco o húmedo del contenido total en las semillas, incluyendo del 0,01 %, 0,03 %, 1,06 %, 0,07 %, 0,10 %, 0,11 % y el 0,13 %, incluyendo todos los números enteros y fracciones de los mismos.

En otra realización de la presente invención, un contenido ultrabajo de estaquiosa en las semillas se define como un contenido de estaquiosa en las semillas del 0,19 % al 1,6 % en peso seco o húmedo contenido total en las semillas, incluyendo de aproximadamente el 0,1 %, 0,2 %, 0,4 %, 0,55 %, 0,73 %, 0,85 %, 0,91 %, 1,05 %, 1,06 %, 1,08 %, 1,1 %, 1,15 %, 1,19 %, 1,23 %, 1,33 %, 1,37 %, 1,42 %, 1,46 %, 1,49 %, 1,52 %, 1,56 %, 1,59 %, 1,6 %, incluyendo todos los números enteros y fracciones de los mismos.

En otra realización, la presente invención proporciona un contenido ultrabajo combinado de rafinosa y estaquiosa en las semillas del 0,19 % al 1,75 % en peso seco o húmedo contenido total en las semillas, incluyendo del 0,02 %, 0,05 %, 0,07 %, 0,12 %, 0,16 %, 0,21 %, 0,26 %, 0,34 %, 0,38 %, 0,48 %, 0,49 %, 0,51 %, 0,55 %, 0,59 %, 0,63 %, 0,67 %, 0,78 %, 0,80 %, 0,85 %, 0,91 %, 0,96 %, 1,12 %, 1,19 %, 1,23 %, 1,28 %, 1,33 %, 1,38 %, 1,45 %, 1,49 %, 1,56 %, 1,57 %, 1,63 %, 1,68 %, 1,71 %, 1,73 %, 1,75 %, incluyendo todos los números enteros y fracciones de los mismos.

En otra realización, la presente invención proporciona una mayor tasa de germinación para la semilla de soja con el contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas, donde las tasas de germinación de dichas semillas son del 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y el 99 %, incluyendo todos los números enteros y fracciones de los mismos.

La presente invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico que contribuye al contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas, que tiene al menos un 60 %, preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 80 % y mucho más preferentemente al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1; y a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos de un 60 %, preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 80 % y mucho más preferentemente al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con y que tiene la misma función que la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

La presente invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislada que contribuye al contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas, que tiene al menos un 60 %, preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 80 % y mucho más preferentemente al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3; y a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos de un 60 %, preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 80 % y mucho más preferentemente al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con y que tiene la misma función que la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

La presente invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico que contribuye al contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas, que tiene al menos un 60 %, preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 80 % y mucho más preferentemente al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5; y a un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos de un 60 %, preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 80 % y mucho más preferentemente al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con y que tiene la misma función que la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6.

La presente invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico que contribuye al contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas, que tiene al menos un 60 %, preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 80 % y mucho más preferentemente al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de RS2 (SEQ ID NO: 1) y una secuencia de nucleótidos que contribuye al contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas, que tiene al menos un 60 %, preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 80 % y mucho más preferentemente al menos aproximadamente un %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de RS3 (SEQ ID NO:3) y una secuencia de nucleótidos que contribuye al contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas, que tiene al menos un 60 %, preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 80 % y mucho más preferentemente al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de RS4 (SEQ ID NO:5).

La presente invención también se refiere a una semilla de soja que comprende una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido de RS2 que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO:2 y una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido de RS4 que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO. 6. Además, la presente invención proporciona una semilla de soja que comprende una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido de RS2 que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO:2 y una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido de RS3 que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO. 4. La presente invención también proporciona una semilla de soja que comprende una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido de RS2 que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO:2, una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido de RS3 que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO. 4 y una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido de RS4 que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO. 6.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una síntesis repetitiva, enzimática y con cebadores de una secuencia de ácido nucleico. Este procedimiento se conoce bien y lo usan habitualmente los expertos en la técnica (véase Mullis, Patentes de EE. UU. N.° 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159; Saikiet al.(1985) Science 230:1350-1354). La PCR se basa en la amplificación enzimática de un fragmento de ADN de interés que está flanqueado por dos cebadores de oligonucleótidos que se hibridan con cadenas opuestas de la secuencia diana. Los cebadores están orientados con los extremos 3' apuntando uno hacia el otro. Los ciclos repetidos de desnaturalización por calor del molde, la hibridación de los cebadores con sus secuencias complementarias y la extensión de los cebadores hibridados con una ADN polimerasa dan como resultado la amplificación del segmento definido por los extremos 5' de los cebadores de PCR. Dado que el producto de extensión de cada cebador puede servir como molde para el otro cebador, cada ciclo duplica básicamente la cantidad de molde de ADN producido en el ciclo anterior. Esto da como resultado la acumulación exponencial del fragmento diana específico, hasta varios millones de veces en unas pocas horas. Al usar una ADN polimerasa termoestable, tal como la Taq polimerasa, que se aísla de la bacteria termófila,Thermus aquaticus,el proceso de amplificación se puede automatizar por completo. Los expertos en la técnica conocen otras enzimas que se pueden usar.

Las técnicas estándar para la clonación, el aislamiento, la amplificación y la purificación de ADN, para las reacciones enzimáticas que implican la ADN ligasa, la ADN polimerasa y las endonucleasas de restricción, y diversas técnicas de separación son las conocidas y empleadas habitualmente por los expertos en la técnica. Se describen varias técnicas estándar en Sambrooket al.(1989) Molecular Cloning, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Nueva York; Maniatiset al.(1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Nueva York; Wu (ed.) (1993)Meth. Enzymol.218, Parte I; Wu (ed.) (1979)Meth. Enzymol.68; Wuet al.(eds.) (1983)Meth. Enzymol.100 y 101; Grossman y Moldave (eds.) Meth.Enzymol.65; Miller (ed.) (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York; Old y Primrose (1981) Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkley; Schleif y Wensink (1982) Practical Methods in Molecular Biology; Glover (ed.) (1985) DnA Cloning Vol. I y II, IRL Press, Oxford, RU; Hames y Higgins (eds.) (1985) Nucleic Acid Hybridization, iRl Press, Oxford, RU; Setlow y Hollaender (1979) Genetic Engineering: Principles and Methods, Vol. 1-4, Plenum Press, Nueva York; y Ausubelet al.(1992) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, Nueva York, Nueva York. Las abreviaturas y la nomenclatura, cuando se emplean, se consideran convencionales en el campo y se usan comúnmente en revistas profesionales tales como las que se citan en el presente documento. La clonación intermedia de los productos de PCR se puede realizar usando el kit de reparación de extremos PCRTerminator y el vector pSMART del kit CLoneSmart (Lucigen, Middleton, WI). Los expertos en la técnica conocen diversos métodos de clonación basados en PCR.

Es bien sabido en la técnica que las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención pueden truncarse y/o mutarse de modo que algunos de los fragmentos y/o mutantes resultantes de la secuencia de longitud completa original puedan conservar las características deseadas de la secuencia de longitud completa. Se conoce bien una amplia diversidad de enzimas de restricción que son adecuadas para generar fragmentos a partir de moléculas de ácido nucleico más grandes. Asimismo, es bien sabido que la exonucleasa Bal31 se puede usar convenientemente para la digestión limitada controlada en el tiempo de ADN. Véase, por ejemplo, Maniatis (1982)Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, páginas 135-139. Véase también Weiet al. J. Biol. Chem.258:13006-13512 (1983). Mediante el uso de la exonucleasa Bal31 (comúnmente denominada como procedimientos Aerase-a-base), el experto puede eliminar nucleótidos de uno o ambos extremos de los ácidos nucleicos en cuestión para generar un amplio espectro de fragmentos que son funcionalmente equivalentes a las secuencias de nucleótidos en cuestión. Un experto en la técnica puede, de esta manera, generar cientos de fragmentos de longitudes controladas y variables a partir de ubicaciones a lo largo de una secuencia de nucleótidos de partida. El experto puede ensayar o examinar de forma rutinaria los fragmentos generados en cuanto a sus características y determinar la utilidad de los fragmentos como se enseña en el presente documento. También es bien sabido que las secuencias mutantes de la secuencia de longitud completa, o fragmentos de la misma, se pueden producir fácilmente con mutagénesis dirigida. Véanse, por ejemplo, Larionov, O. A. y Nikiforov, V.G.Genetika18(3):349-59 (1982); Shortle, D., DiMaio, D., y Nathans, D.Annu. Rev. Genet.15:265-94 (1981). El experto en la técnica puede producir rutinariamente mutaciones de tipo deleción, inserción o sustitución e identificar aquellos mutantes resultantes que contienen las características deseadas de la secuencia de tipo natural de longitud completa, o fragmentos de la misma, es decir, aquellos que conservan la actividad promotora. Es bien conocido en la técnica que existe una diversidad de otros métodos mediados por PCR, tal como PCR superpuesta, que se pueden usar.

Se dice que una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido codifica un polipéptido si, en su estado natural o cuando se manipula por métodos conocidos por los expertos en la técnica, se puede transcribir y/o traducir para producir el polipéptido o un fragmento del mismo. También se dice que la cadena no codificante de tal polinucleótido codifica la secuencia.

La identidad significa el grado de relación de secuencia entre dos polipéptidos o dos secuencias de polinucleótidos, según se determina por la identidad de la correspondencia entre dos cadenas de dichas secuencias. La identidad se puede calcular fácilmente. Aunque existen varios métodos para medir la identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, el término "identidad" se conoce bien por los expertos (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Los métodos comúnmente empleados para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, los divulgados en Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J Applied Math. 48:1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las dos secuencias analizadas. Dichos métodos están codificados en programas informáticos. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el paquete de programas GCG (Genetics Computer Group, Madison Wis.) (Devereux, J.,et al.,Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLAS<t>P, BLASTN,<f>A<s>TA (Altschulet al.(1990); Altschulet al.(1997)). También puede usarse el algoritmo de Smith Waterman bien conocido para determinar la identidad.

A modo de ilustración, por un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos, por ejemplo, un 95 % de "identidad" con una secuencia de nucleótidos de referencia se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia salvo por que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta un 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia puede eliminarse o sustituirse por otro nucleótido, o puede insertarse en la secuencia de referencia un número de nucleótidos de hasta un 5 % de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones terminales 5 o 3 de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier sitio entre estas posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

La presente invención también se refiere a células hospedadoras o virus que comprenden un gen quimérico de una o más de las secuencias de ácidos nucleicos aisladas de la presente invención unidas operativamente a una secuencia reguladora, y a una célula, una planta y una semilla que comprenden el gen quimérico. Los ejemplos de células hospedadoras que se pueden usar para poner en práctica la invención incluyen, pero sin limitación, levadura, bacterias y plantas.

Una secuencia de nucleótidos está unida operativamente cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor efectúa la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Unido operativamente también significa que las secuencias que se unen son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, son contiguas y están en el marco de lectura; y, por ejemplo, un promotor está unido operativamente con una secuencia codificante cuando es capaz de afectar a la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden unirse operativamente a secuencias reguladoras en orientación codificante o no codificante. Sin embargo, es bien sabido que determinados elementos genéticos, tales como potenciadores, pueden estar operativamente unidos incluso a distancia, es decir, incluso si no son contiguos.

Para una expresión eficiente, las secuencias codificantes están preferentemente también unidas operativamente a una secuencia no traducida 3'. La secuencia no traducida 3' incluirá una secuencia de terminación de la transcripción y una secuencia de poliadenilación. La región no traducida 3' se puede obtener de las regiones flanqueantes de genes deAgrobacterium,virus vegetales, plantas u otros eucariotas. Las secuencias no traducidas 3' adecuadas para su uso en plantas incluyen, pero sin limitación, las del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor, el gen de la proteína de almacenamiento de la semilla de faseolina, el gen de la subunidad pequeña E9 de la ribulosa bifosfato carboxilasa del guisante, los genes de la proteína de almacenamiento 7S de la soja, el gen de la octopina sintasa y el gen de la nopalina sintasa.

Los promotores constitutivos adecuados para su uso en plantas incluyen promotores de virus vegetales, tales como el promotor del caulimovirus de la estría clorótica del cacahuete (PCI s V) (PCI SV) (Patente de EE. UU. N.° 5.850.019), el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Odellet al., Nature313:810-812 (1985)), promotores de genes de metiltransferasa del virusChlorella(Patente de EE. UU. N.° 5.563.328), y el promotor de transcripción de longitud completa del virus del mosaico de la escrofularia (FMV) (Patente de EE. UU. N.° 5.378.619); los promotores de genes como la actina del arroz (McElroyet al., Plant Cell2:163-171 (1990)), ubiquitina (Christensenet al., Plant Mol. Biol.12:619-632 (1989) y Christensenet al., Plant Mol. Biol.18:675-689 (1992)), pEMU (Lastet al., Theor. Appl. Genet.81:581-588 (1991)), MAS (Veltenet al., PMBO J.3:2723-2730 (1984)), la histona H3 del maíz (Lepetitet al., Mol. Gen. Genet.231:276-285 (1992) y Atanassovaet al., Plant Journal2(3):291-300 (1992)), ALS3 deBrassica napus(documento WO 97/41228); y promotores de diversos genes deAgrobacterium(véanse las Patentes de EE. UU. N.° 4.771.002, 5.102.796, 5.182.200 y 5.428.147). Finalmente, se pueden usar promotores compuestos por porciones de otros promotores y promotores parcial o totalmente sintéticos. Véase, por ejemplo, Niet al., Plant J ,7:661-676 (1995) y el documento WO 95/14098 que describen dichos promotores para su uso en las plantas.

El promotor puede incluir, o modificarse para incluir, uno o más elementos potenciadores. Preferentemente, el promotor incluirá una pluralidad de elementos potenciadores. Los promotores que contienen elementos potenciadores proporcionan niveles más altos de transcripción en comparación con los promotores que no los incluyen. Los elementos potenciadores adecuados para su uso en plantas incluyen el elemento potenciador PC1SV (Patente de EE. UU. N.° 5.850.019), el elemento potenciador CaMV 35S (Patentes de EE. UU. N.° 5.106.739 y 5.164.316) y el elemento potenciador FMV (Maitiet al., Transgenic Res.6:143-156 (1997)). Véase también el documento WO 96/23898 yEnhancers and Eukaryotic Expression(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1983).

La presente invención también se refiere al uso de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención para crear plantas y semillas transgénicas en las que determinados oligosacáridos están presentes en niveles inferiores a los de las plantas y semillas normales o de tipo natural. Esto tendría, por ejemplo, el efecto de reducir el nivel de rafinosa y estaquiosa en las semillas de soja y aumentar el nivel de sacarosa.

La regeneración, el desarrollo y el cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplastos de plantas individuales o de diversos explantos transformados también es bien conocido en la técnica (Weissbach y Weissbach, en: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic Press, Inc. San Diego, Calif., (1988)). Este proceso de regeneración y crecimiento incluye típicamente las etapas de selección de células transformadas, cultivo de esas células individualizadas a través de las etapas habituales de desarrollo embrionario hasta la etapa de plántula enraizada. Los embriones y semillas transgénicos se regeneran de manera similar. Los brotes enraizados transgénicos resultantes se plantan posteriormente en un medio de crecimiento vegetal apropiado, tal como el suelo. Preferentemente, las plantas regeneradas se autopolinizan para proporcionar plantas transgénicas homocigotas. Por otra parte, el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con plantas cultivadas a partir de semillas de líneas agronómicamente importantes. Por el contrario, el polen de plantas de estas líneas importantes se usa para polinizar las plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa se cultiva usando métodos bien conocidos por un experto en la técnica.

Existe una diversidad de métodos para la regeneración de plantas a partir de tejido vegetal. El método particular de regeneración dependerá del tejido vegetal de partida y de la especie vegetal particular que se vaya a regenerar.

Los métodos de transformación para obtener plantas transgénicas se conocen bien y se han publicado para soja (Patentes de EE. UU. N.° 6.576.820; 5.569.834; 5.416.011, McCabeet al.(1988)Biol Technology6:923, Christouet al.(1988)Plant Physiol.87:671-674); algodón (Pat. de EE. UU. N.° 5.004.863; 5.159.135; 5.518.908);Brassica(Pat. de EE. UU. N.° 5.463.174); cacahuete (Chenget al.(1996)Plant Cell Rep.15:653-657, McKentlyet al.(1995)Plant Cell Rep.14:699-703); papaya y guisante (Grantet al.(1995)Plant Cell Rep.15:254-258).

Se puede usar una construcción de ADN para transformar cualquier tipo de planta o célula vegetal. Se puede usar un marcador genético para seleccionar células vegetales transformadas ("un marcador de selección"). Los marcadores de selección típicamente permiten recuperar células transformadas mediante selección negativa (es decir, inhibiendo el crecimiento de células que no contienen el marcador de selección) o mediante el cribado de un producto codificado por el marcador de selección. El gen marcador seleccionable más comúnmente usado para la transformación de plantas es el gen de la neomicina fosfotransferasa II (nptll), aislado de Tn5, que, cuando se coloca bajo el control de señales de control de expresión de la planta, confiere resistencia a la kanamicina. Fraleyet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA80:4803 (1983). Otro gen marcador seleccionable comúnmente usado es el gen de la higromicina fosfotransferasa que confiere resistencia al antibiótico higromicina. Vanden Elzenet al., Plant Mol. Biol.,5:299 (1985). Otros genes marcadores seleccionables de origen bacteriano que confieren resistencia a los antibióticos incluyen la gentamicina acetiltransferasa, estreptomicina fosfotransferasa, aminoglucósido-3'-adeniltransferasa y el determinante de resistencia a la bleomicina (Hayfordet al.1988.Plant Physiol.86:1216, Joneset al.1987.Mol. Gen. Genet.210:86; Svabet al.1990.Plant Mol. Biol.14:197, Hilleet al.1986.Plant Mol. Biol.7:171). Otros genes marcadores seleccionables confieren resistencia a herbicidas tales como glifosato, glufosinato o bromoxinilo (Comaiet al.1985.Nature317:741-744, Stalkeret al.1988.Science242:419-423, Hincheeet al.1988.Bio/Technology6:915-922, Stalkeret al.1988.J. Biol. Chem.263:6310-6314, y Gordon-Kammet al.1990.Plant Cell2:603-618).

Los marcadores seleccionables adicionales útiles para la transformación de plantas incluyen, sin limitación, la dihidrofolato reductasa de ratón, la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa de plantas y la acetolactato sintasa de plantas (Eichholtzet al.1987.Somatic Cell Mol. Genet.13:67, Shahet al.1986. Science 233:478, Charestet al.1990.Plant Cell Rep.8:643; documento EP 154.204).

Los genes comúnmente usados para el cribado de células presuntamente transformadas incluyen, pero sin limitación, p-glucuronidasa (GUS), p-galactosidasa, luciferasa y cloranfenicol acetiltransferasa (Jefferson, R. A. 1987.Plant Mol. Biol. Rep.5:387, Teeriet al.1989.EMBO J.8:343, Konczet al.1987.Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:131, De Blocket al.1984.EMBO J.3:1681), proteína verde fluorescente (GFP) y sus variantes (Chalfieet al.1994.Science263:802, Haseloffet al.1995. TIG 11:328-329 y el documento WO 97/41228). Otro enfoque para la identificación de eventos de transformación relativamente raros ha sido el uso de un gen que codifica un regulador constitutivo dominante de la vía de pigmentación de la antocianina deZea mays(Ludwiget al.1990. Science 247:449).

Se han desarrollado ensayos de expresión génica basados en la expresión transitoria de construcciones de ácidos nucleicos clonados introduciendo las moléculas de ácidos nucleicos en células vegetales mediante tratamiento con polietilenglicol, electroporación o bombardeo de partículas (Marcotteet al.,Nature 335:454-457 (1988); Marcotteet al., Plant Cell1:523-532 (1989); McCartyet al., Cell66:895-905 (1991); Hattoriet al., Genes Dev.6:609-618 (1992); Goffet al., EMBO J.9:2517-2522 (1990)).

Pueden usarse sistemas de expresión transitoria para diseccionar funcionalmente construcciones de fragmentos de ácidos nucleicos aislados (véase generalmente, Maligaet al.,Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995)). Se entiende que cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se puede introducir en una célula vegetal de manera permanente o transitoria junto con otros elementos genéticos tales como vectores, promotores, potenciadores, etc.

Además de los procedimientos analizados anteriormente, los materiales de recursos estándar que describen condiciones y procedimientos específicos para la construcción, manipulación y aislamiento de macromoléculas (por ejemplo, moléculas de ADN, plásmidos, etc.), generación de organismos recombinantes y cribado y aislamiento de clones (véanse, por ejemplo, Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989); Maligaet al.,Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995); Birrenet al.,Genome Analysis: Detecting Genes, 1, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); Birrenet al.,Genome Analysis: Analyzing DNA, 2, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer, Nueva York (1997)) se conocen bien.

La sobreexpresión de las proteínas de la presente invención puede lograrse construyendo primero una construcción de ADN recombinante en la que la región codificante está unida operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión de un gen en los tejidos deseados en la etapa deseada de desarrollo. La construcción de ADN recombinante puede comprender secuencias promotoras y secuencias líder de traducción derivadas de los mismos genes. También se pueden proporcionar secuencias no codificantes 3' que codifican señales de terminación de la transcripción. La presente construcción de ADN recombinante también puede comprender uno o más intrones para facilitar la expresión génica de la construcción de ADN recombinante.

También puede ser deseable reducir o eliminar la expresión de genes que codifican los presentes polipéptidos en plantas para algunas aplicaciones. Para conseguirlo, se puede construir una construcción de ADN recombinante diseñada para la supresión conjunta del presente polipéptido uniendo un gen o fragmento de gen que codifica ese polipéptido a secuencias promotoras de plantas. Como alternativa, se puede construir una construcción de ADN recombinante diseñada para expresar ARN no codificante para todo o parte del presente fragmento de ácido nucleico uniendo el gen o fragmento de gen en orientación inversa a secuencias promotoras de plantas. Tanto las construcciones de ADN recombinante de supresión conjunta como no codificantes se podrían introducir en plantas mediante transformación en donde se reduce o se elimina la expresión de los genes endógenos correspondientes.

Las soluciones genéticas moleculares para la generación de plantas con expresión génica alterada tienen una clara ventaja sobre los enfoques de fitomejoramiento más tradicionales. Se pueden producir cambios en los fenotipos de las plantas inhibiendo específicamente la expresión de uno o más genes mediante inhibición no codificante o supresión conjunta (Pat. de EE. UU. N.° 5.190.931, 5.107.065 y 5.283.323). Una construcción no codificante o de supresión conjunta actuaría como un regulador negativo dominante de la actividad génica. Si bien las mutaciones convencionales pueden producir una regulación negativa de la actividad génica, es muy probable que estos efectos sean recesivos. La regulación negativa dominante disponible con un enfoque transgénico puede ser ventajosa desde una perspectiva de mejoramiento. Asimismo, la capacidad de restringir la expresión de un fenotipo específico a los tejidos reproductivos de la planta mediante el uso de promotores específicos de tejido puede conferir ventajas agronómicas en relación con las mutaciones convencionales que pueden tener un efecto en todos los tejidos en los que uno o más genes mutantes se expresan habitualmente.

El experto en la técnica sabrá que existen consideraciones especiales asociadas con el uso de tecnologías no codificantes o de supresión conjunta para reducir la expresión de genes particulares. Por ejemplo, el nivel adecuado de expresión de genes codificantes o no codificantes puede requerir el uso de diferentes construcciones de ADN recombinante que utilicen diferentes elementos reguladores conocidos por el experto en la técnica. Una vez que se obtienen plantas transgénicas mediante uno de los métodos descritos anteriormente, será necesario cribar las transgénicas individuales para encontrar aquellas que muestren de manera más eficaz el fenotipo deseado. Por consiguiente, el experto en la técnica desarrollará métodos para cribar grandes cantidades de transformantes. La naturaleza de estos cribados se elegirá generalmente en función de criterios prácticos. Por ejemplo, se puede cribar buscando cambios en la expresión génica mediante el uso de anticuerpos específicos para la proteína codificada por el gen que se está suprimiendo, o se podrían establecer ensayos que midan específicamente la actividad enzimática. Un método preferido será uno que permita procesar rápidamente grandes cantidades de muestras, ya que se esperará que una gran cantidad de transformantes sean negativos para el fenotipo deseado.

En otra realización, la presente invención se refiere a un vector que comprende una o más de las secuencias de ácidos nucleicos aisladas de la presente invención. Una realización adicional de la presente invención incluye un vector que contiene un gen que codifica una o más de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención que se introduce en la soja.

Pueden construirse vectores plasmídicos que comprenden los presentes polinucleótidos aislados (o construcciones de ADN recombinante). La elección del vector plasmídico depende del método que se usará para transformar las plantas hospedadoras. El experto en la técnica conoce bien los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector plasmídico para transformar, seleccionar y propagar con éxito las células hospedadoras que contienen la construcción de ADN recombinante o la construcción de ADN recombinante. El experto en la técnica también reconocerá que diferentes eventos de transformación independientes darán como resultado diferentes niveles y patrones de expresión (Joneset al.(1985)EMBO J.4:2411-2418; De Almeidaet al.(1989)Mol. Gen. Genetics218:78-86), y por lo tanto, que deben cribarse múltiples eventos para obtener líneas que presenten el nivel y patrón de expresión deseados. Tal cribado puede realizarse por análisis Southern de ADN, análisis Northern de la expresión de ARNm, análisis Western de la expresión de proteínas, o análisis fenotípico.

Se seleccionará un promotor apropiado y otras secuencias de vector necesarias para que sean funcionales en el hospedador. Se describen ejemplos de combinaciones viables de líneas celulares y vectores de expresión en Sambrooket al.(1989), véase anteriormente; Ausubelet al.(Eds.) (1995)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York; y Metzgeret al.(1988) Nature, 334: 31-36. Muchos vectores útiles para la expresión en células bacterianas, de levadura, fúngicas, de mamífero, insecto, vegetales u otras células se conocen bien en la técnica y pueden obtenerse de proveedores tales como Stratagene, New England Biolabs, Promega Biotech, CAMBIA y otros. Asimismo, la construcción puede unirse a un gen amplificable de modo que se puedan realizar múltiples copias del gen. Para un potenciador apropiado y otras secuencias de control de la expresión, véase tambiénEnhancers and Eukaryotic Gene Expression,Cold Spring Harbor Press, N.Y. (1983). Si bien dichos vectores de expresión pueden replicarse de forma autónoma, es menos preferible que se repliquen al ser insertados en el genoma de la célula hospedadora.

Los vectores de expresión y clonación probablemente contendrán un marcador seleccionable, es decir, un gen que codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de una célula hospedadora transformada con el vector. Aunque un gen marcador de este tipo puede estar presente en otra secuencia de polinucleótidos introducida conjuntamente en la célula hospedadora, lo más frecuente es que esté contenido en el vector de clonación. Sólo las células hospedadoras en las que se ha introducido el gen marcador sobrevivirán y/o crecerán en condiciones selectivas. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras sustancias tóxicas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, kanamicina, higromicina, BASTA, glifosato, etc.; (b) complementan deficiencias auxotróficas; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos. La elección del marcador seleccionable adecuado dependerá de la célula hospedadora; en la técnica se conocen marcadores apropiados para diferentes hospedadores.

Las células hospedadoras recombinantes, en el presente contexto, son aquellas que han sido modificadas genéticamente para contener una molécula de ADN aislada. El ADN se puede introducir por cualquier medio conocido en la técnica que sea apropiado para el tipo particular de célula, planta u organismo eucariota, incluyendo, sin limitación, transformación mediada porAgrobacterium, mediada por bacterias, lipofección, bombardeo de partículas o electroporación.

Los expertos en la técnica reconocen que las secuencias de ADN pueden variar debido a la degeneración del código genético y el uso de codones.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir semillas de soja con un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas y con altas tasas de germinación. El método puede implicar técnicas de mejoramiento tradicionales tales como cruzar las plantas de soja con un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa y una alta tasa de germinación con otra soja que no comprenda estos rasgos, cosechar la semilla de dicho cruce y seleccionar semillas que tengan estos rasgos deseados durante una o más generaciones. Cuando se desee, el método puede incluir analizar las semillas de soja de la progenie para determinar el contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas y realizar pruebas para determinar las altas tasas de germinación.

Otro aspecto de la presente invención incluye cualquier método de mejoramiento que use plantas de soja de la presente invención que tengan un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas y altas tasas de germinación que forman parte de esta invención: autofecundación, retrocruzamientos, producción de híbridos y cruces con poblaciones, y todas las plantas producidas usando dichas plantas de soja como al menos un progenitor están dentro del alcance de esta invención.

Como se usa en el presente documento, el término "retrocruzamiento" se refiere al cruce repetido de una progenie híbrida con el progenitor recurrente, es decir, retrocruzamiento 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más veces con el progenitor recurrente. La planta de soja progenitora que aporta el gen para la característica deseada se denomina progenitor no recurrente o donante. Esta terminología se refiere al hecho de que el progenitor no recurrente se usa una vez en el protocolo de retrocruzamiento y, por lo tanto, no es recurrente. La planta de soja progenitora a la que se transfieren el gen o los genes del progenitor no recurrente se conoce como progenitor recurrente, ya que se usa en varias rondas del protocolo de retrocruzamiento (Poehlman y Sleper (1994); Fehr, Principles of Cultivar Development, págs. 261-286 (1987)). En un protocolo de retrocruzamiento típico, la variedad original de interés (progenitor recurrente) se cruza con una segunda variedad (progenitor no recurrente) que lleva el único gen de interés que se va a transferir. A continuación, la progenie resultante de este cruce se cruza de nuevo con el progenitor recurrente y el proceso se repite hasta que se obtiene una planta de soja en donde se recuperan básicamente todas las características morfológicas y fisiológicas deseadas del progenitor recurrente en la planta convertida, además del único gen transferido del progenitor no recurrente.

La selección de un progenitor recurrente adecuado es una etapa importante para un procedimiento de retrocruzamiento exitoso. El objetivo de un protocolo de retrocruzamiento es alterar o sustituir un solo rasgo o característica en la variedad original. Para lograr esto, se modifica o se sustituye un solo gen de la variedad recurrente por el gen deseado del progenitor no recurrente, mientras se conserva básicamente todo el resto de la constitución genética deseada, y por lo tanto, la constitución fisiológica y morfológica deseada, de la variedad original. La elección del progenitor no recurrente particular dependerá del propósito del retrocruzamiento; uno de los propósitos principales es añadir algún rasgo agronómicamente importante a la planta. El protocolo exacto de retrocruzamiento dependerá de la característica o rasgo que se esté alterando para determinar un protocolo de prueba apropiado. Aunque los métodos de retrocruzamiento se simplifican cuando la característica que se está transfiriendo es un alelo dominante, también se puede transferir un alelo recesivo. En este caso, puede ser necesario introducir una prueba de la progenie para determinar si la característica deseada se ha transferido con éxito.

Se han identificado muchos rasgos de un solo gen que no se seleccionan regularmente en el desarrollo de una nueva variedad, pero que se pueden mejorar mediante técnicas de retrocruzamiento. Los rasgos de un solo gen pueden ser o no transgénicos; los ejemplos de estos rasgos incluyen, pero sin limitación, esterilidad masculina, almidón céreo, resistencia a herbicidas, resistencia a enfermedades bacterianas, fúngicas o virales, resistencia a insectos, fertilidad masculina, calidad nutricional mejorada, uso industrial, estabilidad del rendimiento y mejora del rendimiento. Estos genes se heredan generalmente a través del núcleo. Varios de estos rasgos de un solo gen se describen en las Pat. de EE. UU. N.° 5.959.185; 5.973.234; y 5.977.445.

Una conversión de retrocruzamiento de plantas de soja de la presente invención se produce cuando se introducen secuencias de ADN a través de retrocruzamiento (Hallaueret al.,"Corn Breeding"Corn and Corn Improvements,N.° 18, págs. 463-481 (1988)), con el cultivar de soja 247F y 222-181-1 usado como progenitor recurrente. Pueden introducirse secuencias de ADN tanto de origen natural como transgénicas a través de técnicas de retrocruzamiento. Una conversión de retrocruzamiento puede producir una planta con una conversión de rasgo o locus en al menos dos o más retrocruces, incluyendo al menos 2 cruces, al menos 3 cruces, al menos 4 cruces y al menos 5 cruces. Se puede utilizar el mejoramiento o selección asistidos por marcadores moleculares para reducir el número de retrocruces necesarios para lograr la conversión de retrocruzamiento. Por ejemplo, véanse, Openshaw, S.J.,et al.,Markerassisted Selection in Backcross Breeding. En:Proceedings Symposium of the Analysis of Molecular Data,agosto de 1994, Crop Science Society of America, Corvallis, Oreg., donde se demuestra que se puede realizar una conversión de retrocruzamiento en tan solo dos retrocruces.

La complejidad del método de conversión de retrocruzamiento depende del tipo de rasgo que se transfiere (genes individuales o genes estrechamente unidos frente a genes no unidos), el nivel de expresión del rasgo, el tipo de herencia (citoplasmática o nuclear) y los tipos de progenitores incluidos en el cruce. Los expertos en la técnica entienden que, para los rasgos de un solo gen que son relativamente fáciles de clasificar, el método de retrocruzamiento es eficaz y relativamente fácil de manejar. (Véase, Hallaueret al., Corn and Corn Improvement,Sprague y Dudley, Tercera Ed. (1998)). Los rasgos deseados que pueden transferirse mediante conversión de retrocruzamiento incluyen, pero sin limitación, esterilidad (nuclear y citoplasmática), restauración de la fertilidad, mejoras nutricionales, tolerancia a la sequía, utilización de nitrógeno, perfil de ácidos grasos alterado, bajo contenido de fitato, mejoras industriales, resistencia a enfermedades (bacterianas, fúngicas o virales), resistencia a insectos y resistencia a herbicidas. Asimismo, un sitio de introgresión en sí mismo, tal como un sitio FRT, un sitio Lox u otro sitio de integración específico del sitio, puede insertarse mediante retrocruzamiento y utilizarse para la inserción directa de uno o más genes de interés en una diversidad de plantas específica. Un solo locus puede contener varios transgenes, tal como un transgén para la resistencia a enfermedades que, en el mismo vector de expresión, también contiene un transgén para la resistencia a herbicidas. El gen para la resistencia a herbicidas puede usarse como un marcador seleccionable y/o como un rasgo fenotípico. Una conversión de un solo locus del sistema de integración específico del sitio permite la integración de múltiples genes en los locus convertidos.

La conversión por retrocruzamiento puede ser resultado de la transferencia de un alelo dominante o de un alelo recesivo. La selección de la progenie que contiene el rasgo de interés se logra mediante la selección directa de un rasgo asociado con un alelo dominante. Los transgenes transferidos mediante retrocruzamiento funcionan típicamente como un rasgo dominante de un solo gen y son relativamente fáciles de clasificar. La selección de la progenie para un rasgo que se transfiere mediante un alelo recesivo requiere el crecimiento y la autofecundación de la primera generación de retrocruzamiento para determinar qué plantas son portadoras de los alelos recesivos. Los rasgos recesivos pueden requerir pruebas de progenie adicionales en generaciones sucesivas de retrocruzamiento para determinar la presencia del locus de interés. La última generación de retrocruzamiento normalmente se autofecunda para dar progenie de mejoramiento pura para el uno o más genes que se transfieren, aunque una conversión por retrocruzamiento con un rasgo introgresado de manera estable también se puede mantener mediante un retrocruzamiento adicional con el progenitor recurrente con la selección del rasgo convertido.

Junto con la selección del rasgo de interés, se selecciona la progenie para el fenotipo deseado. El retrocruzamiento es una forma de endogamia, y las características del progenitor recurrente se recuperan automáticamente después de retrocruces sucesivos. Poehlman,Breeding Field Crops,pág. 204 (1987). Poehlman sugiere de uno a cuatro o más retrocruces, pero como se señaló anteriormente, el número de retrocruces necesarios se puede reducir con el uso de marcadores moleculares. Otros factores, tal como un progenitor donante genéticamente similar, también pueden reducir el número de retrocruces necesarios. Como señaló Poehlman, el retrocruzamiento es más fácil para rasgos simplemente heredados, dominantes y fácilmente reconocibles.

Las nuevas plantas de soja de la presente invención también proporcionan una fuente de material de mejoramiento que puede usarse para desarrollar otras nuevas variedades de soja. Las técnicas de fitomejoramiento conocidas en la técnica y usadas en un programa de fitomejoramiento de soja incluyen, pero sin limitación, selección recurrente, selección en masa, selección en bloque, retrocruzamiento, mejoramiento de pedigrí, mejoramiento por polinización abierta, selección mejorada por polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción, selección mejorada por marcadores genéticos, obtención de haploides dobles y transformación. A menudo se usan combinaciones de estas técnicas. El desarrollo de variedades de soja en un programa de fitomejoramiento requiere, en general, el desarrollo y evaluación de variedades homocigotas. Hay muchos métodos analíticos disponibles para evaluar una nueva variedad. El método de análisis más antiguo y tradicional es la observación de rasgos fenotípicos, pero también puede usarse el análisis genotípico.

Esta invención también se refiere a métodos para producir una planta de soja cruzando una primera planta de soja progenitora con una segunda planta de soja progenitora, en donde la primera o la segunda planta de soja progenitora contiene el alelo mutante de la presente invención. Además, esta invención también se refiere a métodos para producir una planta de soja derivada de un alelo mutante de soja mediante el cruce de una línea de soja que contiene el alelo mutante de la invención con una segunda planta de soja y el cultivo de la semilla de la progenie, y repetir las etapas de cruce y cultivo con dicha planta derivada de un alelo mutante de soja de 1, 2, 3, 4, 5, 6 a 7 veces. Por lo tanto, puede usarse cualquiera de dichos métodos: autofecundación, retrocruzamientos, producción de híbridos y cruces con poblaciones. Estos métodos son bien conocidos en la técnica y algunos de los métodos de mejoramiento más comúnmente usados se describen a continuación. Se pueden encontrar descripciones de métodos de mejoramiento en uno de varios libros de referencia (por ejemplo, Allard, Principles of Plant Breeding (1960); Simmonds, Principles of Crop Improvement (1979); Sneepet al.(1979); Fehr, "Breeding Methods for Cultivar Development", Capítulo 7, Soybean Improvement, Production and Uses, 2.a ed., editor Wilcox (1987).

A continuación se describen métodos de mejoramiento que pueden usarse con las plantas de soja de la presente invención en el desarrollo de otras plantas de soja. Una de dichas realizaciones comprende: obtener la planta de soja, o una parte de la misma, de la planta de soja de la presente invención, utilizar dicha planta o parte de la planta como fuente de material de mejoramiento y seleccionar plantas de progenie de soja con marcadores moleculares en común con las plantas de soja de la presente invención y/o con características morfológicas y/o fisiológicas. Las etapas de mejoramiento que pueden usarse en el programa de mejoramiento de plantas de soja incluyen mejoramiento de pedigrí, retrocruzamiento, mejoramiento por mutación y selección recurrente. Junto con estas etapas, pueden utilizarse técnicas tales como selección mejorada por RFLP, selección mejorada por marcadores genéticos (por ejemplo, marcadores SSR) y la creación de haploides dobles.

Un experto en la técnica del fitomejoramiento sabría cómo evaluar los rasgos de las plantas de soja de la presente invención para determinar si no hay una diferencia significativa entre los rasgos expresados por las plantas de soja de la presente invención y otras plantas de soja.

El mejoramiento de pedigrí comienza con el cruce de dos genotipos si los dos progenitores originales no proporcionan todas las características deseadas, se pueden incluir otras fuentes en la población de mejoramiento. En el método de pedigrí, las plantas superiores se autofecundan y se seleccionan en generaciones filiales sucesivas. En las generaciones filiales sucesivas, la condición heterocigota da paso a variedades homogéneas como resultado de la autopolinización y la selección. Típicamente, en el método de mejoramiento de pedigrí, se ponen en práctica cinco o más generaciones filiales sucesivas de autofecundación y selección: F1 con respecto a F2; F2 con respecto a F3; F3 con respecto a F4; F4 con respecto a F5; etc. Después de una cantidad suficiente de endogamia, las generaciones filiales sucesivas servirán para aumentar la semilla de la variedad desarrollada.

Además de usarse para crear una conversión de retrocruzamiento, el retrocruzamiento también se puede usar junto con el mejoramiento de pedigrí. Como se ha analizado previamente, el retrocruzamiento se puede usar para transferir uno o más rasgos específicamente deseables de una variedad, el progenitor donante, a una variedad desarrollada denominada progenitor recurrente, que tiene buenas características agronómicas en general pero carece de ese rasgo o rasgos deseables. Sin embargo, el mismo procedimiento se puede usar para mover la progenie hacia el genotipo del progenitor recurrente pero al mismo tiempo conservar muchos componentes del progenitor no recurrente deteniendo el retrocruzamiento en una etapa temprana y procediendo a la autofecundación y la selección. Por ejemplo, una variedad de soja puede cruzarse con otra variedad para producir una planta progenie de primera generación. A continuación, la planta progenie de primera generación puede retrocruzarse con una de sus variedades progenitoras para crear una BC1 o BC2. La progenie se autofecunda y se selecciona de modo que la variedad recientemente desarrollada tenga muchos de los atributos del progenitor recurrente y, sin embargo, varios de los atributos deseados del progenitor no recurrente. Este enfoque aprovecha el valor y las fortalezas del progenitor recurrente para su uso en nuevas variedades de soja.

La selección recurrente es un método usado en un programa de mejoramiento vegetal para mejorar una población de plantas. El método implica que las plantas individuales se polinicen entre sí para formar una progenie. La progenie se cultiva y la progenie superior se selecciona mediante diversos métodos de selección, que incluyen plantas individuales, progenie de medios hermanos, progenie de hermanos completos y progenie autofecundada. La progenie seleccionada se poliniza de forma cruzada entre sí para formar la progenie de otra población. Esta población se planta y de nuevo se seleccionan plantas superiores para que se polinicen de forma cruzada entre sí. La selección recurrente es un proceso cíclico y, por lo tanto, se puede repetir tantas veces como se desee. El objetivo de la selección recurrente es mejorar los rasgos de una población. A continuación, la población mejorada se puede usar como fuente de material de mejoramiento para obtener nuevas variedades para uso comercial o de mejoramiento, incluida la producción de un cultivar sintético. Un cultivar sintético es la progenie resultante formada por el entrecruzamiento de varias variedades seleccionadas.

La selección en masa es una técnica útil cuando se usa junto con la selección mejorada por marcadores moleculares. En la selección en masa, las semillas de los individuos se seleccionan en función del fenotipo o el genotipo. A continuación, estas semillas seleccionadas se agrupan y se usan para cultivar la siguiente generación. La selección en bloque requiere cultivar una población de plantas en una parcela grande, permitir que las plantas se autopolinicen, cosechar las semillas en bloque y a continuación usar una muestra de las semillas cosechadas en bloque para plantar la siguiente generación. Además, en lugar de la autopolinización, se podría usar la polinización dirigida como parte del programa de mejoramiento.

Las técnicas de mejoramiento tradicionales se pueden mejorar mediante el uso de marcadores moleculares, que incluyen marcadores identificados mediante el uso de técnicas como electroforesis de isozimas, polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), ADN polimórficos amplificados aleatoriamente (RAPD), reacción en cadena de la polimerasa con cebadores arbitrarios (AP-PCR), identificación de la amplificación del ADN (DAF), regiones amplificadas caracterizadas por secuencias (SCAR), polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), repeticiones de secuencias simples (SSR) y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), que pueden usarse en métodos de fitomejoramiento que utilizan las plantas de soja de la presente invención.

La electroforesis de isozimas y los RFLP se han usado ampliamente para determinar la composición genética. Shoemaker y Olsen, Molecular Linkage Map of Soybean (Glycine max L. Merr.), págs. 6.131-6.138 (1993). En S. J. O'Brien (ed.)Genetic Maps: Locus Maps of Complex Genomes,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, se desarrolló un mapa de ligadura genética molecular que consistía en 25 grupos de ligadura con aproximadamente 365 RFLP, 11 RAPD (ADN polimórfico amplificado al azar), tres marcadores clásicos y cuatro locus de isoenzimas. Véanse también, Shoemaker R. C.

1994 RFLP Map of Soybean, págs. 299-309; en R. L. Phillips e I. K. Vasil (ed.)DNA-based markers in plants,Kluwer Academic Press Dordrecht, Países Bajos.

La tecnología SSR es actualmente la tecnología de marcadores más eficiente y práctica; se pueden usar de forma rutinaria más locus marcadores y se pueden encontrar más alelos por locus marcador usando SSR en comparación con RFLP. Por ejemplo, Diwan y Cregan describieron un locus microsatélite altamente polimórfico en la soja con hasta 26 alelos. (Diwan, N., y P. B. Cregan, Automated sizing of fluorescent-labelled simple sequence repeat (SSR) markers to assay genetic variation in SoybeanTheor. Appl. Genet.95:220-225 (1997). Los polimorfismos de un solo nucleótido también pueden usarse para identificar la composición genética única de la invención y las variedades de progenie que conservan esa composición genética única. Pueden usarse diversas técnicas de marcadores moleculares en combinación para mejorar la resolución general.

Los mapas de ligadura de marcadores moleculares de ADN de soja se han construido rápidamente y se han aplicado ampliamente en estudios genéticos. Uno de estos estudios se describe en Creganet al.,"An Integrated Genetic Linkage Map of the Soybean Genome"Crop Science39:1464-1490 (1999). Las secuencias y las condiciones de PCR de los locus SSR en la soja, así como el mapa genético más actualizado, pueden encontrarse en Soybase en Internet.

Un uso de los marcadores moleculares es el mapeo de locus de rasgos cuantitativos (QTL). El mapeo de QTL es el uso de marcadores, que se sabe que están estrechamente vinculados a alelos que tienen efectos medibles en un rasgo cuantitativo. La selección en el proceso de mejoramiento se basa en la acumulación de marcadores vinculados a los alelos de efecto positivo y/o la eliminación de los marcadores vinculados a los alelos de efecto negativo del genoma de la planta.

Los marcadores moleculares también se pueden usar durante el proceso de mejoramiento para la selección de rasgos cualitativos. Por ejemplo, los marcadores estrechamente vinculados a alelos o marcadores que contienen secuencias dentro de los alelos reales de interés se pueden usar para seleccionar plantas que contienen los alelos de interés durante un programa de mejoramiento por retrocruzamiento. Los marcadores también se pueden usar para seleccionar el genoma del progenitor recurrente y contra el genoma del progenitor donante. El uso de este procedimiento puede minimizar la cantidad de genoma del progenitor donante que permanece en las plantas seleccionadas. También se puede usar para reducir el número de cruces con el progenitor recurrente necesarios en un programa de retrocruzamiento. El uso de marcadores moleculares en el proceso de selección se denomina a menudo selección mejorada por marcadores genéticos. Los marcadores moleculares también pueden usarse para identificar y excluir determinadas fuentes de germoplasma como variedades progenitoras o ancestros de una planta proporcionando un medio de seguimiento de perfiles genéticos a través de cruces.

La presente invención, también se refiere a una planta o semilla de soja con un fenotipo hereditario de (i) un contenido ultrabajo de rafinosa en las semillas de menos del 0,13 % en peso seco o húmedo contenido total en las semillas; (ii) un contenido ultrabajo de estaquiosa en las semillas de menos del 1,6 % en peso seco o húmedo contenido total en las semillas; y (iii) una tasa de germinación de las semillas de al menos el 83 %.

La presente invención también se refiere a métodos para introducir el fenotipo con contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa de la presente invención en plantas cruzando una planta que carece del fenotipo de contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa con una planta que presenta el contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas y seleccionando a continuación las plantas que presentan el fenotipo ultrabajo.

La semilla de soja de la presente invención que tiene un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas se puede utilizar para alimentos humanos, pienso para ganado y como materia prima en la industria. La semilla de soja se puede triturar o se puede extraer un componente de la semilla de soja para formar un componente para un producto alimenticio o de pienso.

Los usos industriales del aceite de soja que se somete a un procesamiento posterior incluyen ingredientes para pinturas, plásticos, fibras, detergentes, cosméticos, lubricantes y combustible biodiesel. El aceite de soja puede dividirse, interesterificarse, sulfurarse, epoxidarse, polimerizarse, etoxilarse o escindirse. El diseño y la producción de derivados del aceite de soja con una funcionalidad y una oleoquímica mejoradas es un campo en rápido crecimiento. La mezcla típica de triglicéridos suele dividirse y separarse en ácidos grasos puros, que a continuación se combinan con alcoholes o ácidos derivados del petróleo, nitrógeno, sulfonatos, cloro o con alcoholes grasos derivados de grasas y aceites.

La soja también se usa como fuente de alimento tanto para animales como para seres humanos. La soja se usa ampliamente como fuente de proteínas en piensos para aves de corral, cerdos y ganado vacuno. Durante el procesamiento de la soja entera, se elimina la cáscara fibrosa y se extrae el aceite. La harina gruesa de soja restante es una combinación de carbohidratos y aproximadamente un 50 % de proteína.

Para el consumo humano, la harina gruesa de soja se transforma en harina de soja que a continuación se procesa para obtener concentrados de proteínas que se usan para extender la carne o alimentos especiales para mascotas. La producción de ingredientes proteicos comestibles a partir de soja ofrece un reemplazo más saludable y menos costoso de la proteína animal en carnes y productos lácteos.

Ejemplos

Introducción a las líneas de soja Williams 82 y PI 200508

Dierking y Bilyeu(The Plant Genome,1(2): 135-145, noviembre de 2008) analizaron los genes de rafinosa sintasa: genes de rafinosa sintasa 2 (RS2), rafinosa sintasa 3 (RS3) y rafinosa sintasa 4 (RS4) en una línea de introducción vegetal, PI 200508, que se había identificado que tenía niveles reducidos de rafinosa y estaquiosa y niveles elevados de sacarosa (Kerr y Sebastian, 2000). Se investigó la actividad de la enzima rafinosa-sintasa de soja en la línea PI 200508 con bajo contenido de rafinosa y estaquiosa y en la línea de control de tipo natural, Williams 82.

Ejemplo 1: Descubrimiento de la planta mutante original con un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa

La presente invención surgió de una mutación de una población de plantas derivadas de PI 200508 en 2008. Dos líneas candidatas, 247F y 222-18-1, exhibieron un contenido reducido de rafinosa y estaquiosa en las semillas, según el análisis inicial del bajo contenido de rafinosa y estaquiosa en las semillas. Cuando se compararon los niveles de rafinosa y estaquiosa en las semillas entre las dos líneas, la línea 222-18-1 tenía un contenido de rafinosa y estaquiosa en las semillas significativamente e inesperadamente menor y se seleccionó para un análisis posterior.

De las dos líneas candidatas, la 222-18-1 exhibió un nivel ultrabajo de contenido de rafinosa y estaquiosa en las semillas. Esta semilla de soja con alelo mutante se caracteriza por un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas y altas tasas de germinación que no se habían caracterizado antes en las semillas de soja.

Introgresión del alelo mutante en diferentes bases genéticas

La única planta mutante, 222-18-1, que contiene el alelo mutante de la presente invención, se autopolinizó y la progenie se sembró en 2008. La planta mutante 222-18-1 que contiene el alelo mutante de la presente invención también se cruzó con diferentes bases genéticas de soja y las semillas de la progenie se sembraron y cultivaron en condiciones controladas de invernadero y campo. En la Tabla 1 se muestra un ejemplo de la progenie producida, donde las líneas de soja de la presente invención exhibieron un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas y altas tasas de germinación.

Anteriormente, se pensaba que las líneas con bajo contenido de rafinosa y estaquiosa tenían una germinación deficiente. Para cuantificar los niveles ultrabajos de contenido de rafinosa y estaquiosa en las semillas, se analizaron líneas de soja de acuerdo con el protocolo que se detalla en el Ejemplo 2. Las tasas de germinación se analizaron de acuerdo con el protocolo que se detalla en el Ejemplo 3.

Ejemplo 2: Análisis de perfiles de oligosacáridos por HPLC de Elsing

Se molieron muestras de semillas de soja con un molino Stein. La preparación y extracción de las muestras se realizó de la siguiente manera. Se pesaron cinco gramos de cada muestra y se transfirieron a un matraz volumétrico de 500 ml, al que se le añadieron aproximadamente 250 ml de agua desionizada. El matraz se colocó sobre una placa calefactora y se llevó a ebullición. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y se completó el volumen del matraz con agua desionizada y se mezcló. Se tomaron cinco mililitros del matraz y se transfirieron a un matraz volumétrico de 25 ml. El matraz de 25 ml se completó en volumen con agua desionizada y se mezcló, y 0,75 ml de este extracto se eliminaron por filtración en un vial de automuestreador de HPLC usando un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros y se tomaron lecturas. El sistema de HPLC usado fue: Fase móvil (NaOH 0,1 N en agua DI/OI), bomba de HPLC (Waters 510, flujo 1,0 ml/min), automuestreador de HPLC (Micromeritics 728, 30 pl de volumen de inyección), detector de HPLC: Dionex PAD-2 (detector amperométrico pulsado), columna de HPLC (Dionex Carbopac PA-1) y calentador de columna de HPLC (50 °C). Los métodos de uso del análisis por HPLC se conocen bien por los expertos en la técnica.

Ejemplo 3: Análisis de las tasas de germinación en temperaturas cálidas y frías

Se probaron las tasas de germinación de las semillas de soja en temperaturas cálidas y frías de acuerdo con los siguientes protocolos.

Protocolo para la prueba de germinación de semillas en temperaturas cálidas

Las semillas de soja se colocaron en una sola hoja (18 capas) de Versa-Pak (KimPak) o un medio de papel de celulosa crepado similar en una bandeja de germinación. A la bandeja se le añadieron 500 ml ± 50 ml de agua usando el sistema de riego en bandejas automático en la configuración especificada para la prueba en caliente de soja (véanse las AOSA Rules for Testing Seed, el AOSA Seedling Evalution Handbook y el AOSA Seed Vigor Testing Handbook). El agua se distribuyó uniformemente en el medio sin áreas secas. Se añadieron aproximadamente 500 ml de agua a una bandeja de germinación vacía en el estante inferior del carro de germinación para mantener la humedad en el carro. Se colocaron cuatro réplicas de exactamente 100 semillas cada una en la Versa-Pak usando tableros de recuento de semillas. Se colocó al menos una etiqueta de identificación de muestra en cada bandeja para cada muestra. La bandeja en un carro de germinación se colocó dejando un estante de la bandeja vacío entre cada bandeja de muestra para permitir el alargamiento del hipocótilo. Cuando el carro estuvo lleno, se aseguró que la bandeja inferior estuviera regada. Los números de identificación de las muestras en el carro se registraron en una tarjeta con código de color y la fecha de lectura también se registró en la tarjeta; esta información se adjuntó a la parte exterior trasera del carro para que los números fueran legibles desde el exterior. Los números de identificación de las muestras se registraron en el calendario de pared en la fecha de lectura (siete días a partir de la fecha de plantación). Por ejemplo, si la semilla se planta el 10 de noviembre, las muestras se registrarán en el calendario en el espacio correspondiente al 17 de noviembre. La puerta del carro se cerró y se bloqueó y se puso en la cámara de germinación a 25 °C ± 1 °C, normalmente durante siete días; se permitió la lectura anticipada si se consideraba que la muestra había alcanzado el máximo potencial de germinación. El carro se retiró de la cámara y se evaluó de acuerdo con la versión actual de lasAOSA Rules for Testing Seedy elAOSA Seedling Evaluation Handbook.Los resultados se registraron y se enviaron a Tags & Records para la introducción de los datos.

Protocolo para la prueba de germinación de semillas en temperaturas frías

Las semillas de soja se colocaron en una sola hoja (18 capas) de Versa-Pak (KimPak) o un medio de papel de celulosa crepado similar en una bandeja de germinación. A la bandeja se le añadieron 750 ml ± 50 ml de agua usando el sistema de riego en bandejas automático en la configuración especificada para la prueba en frío de soja (véanse las AOSA Rules for Testing Seed, el AOSA Seedling Evalution Handbook y el AOSA Seed Vigor Testing Handbook). El agua se distribuyó uniformemente en el medio sin áreas secas. Se añadieron aproximadamente 500 ml de agua a una bandeja de germinación vacía en el estante inferior del carro de germinación para mantener la humedad. Se colocó una réplica de exactamente 100 semillas cada una en la Versa-Pak usando tableros de recuento de semillas. Se puso una etiqueta de identificación de muestra con cada réplica de semilla en las bandejas. Cada muestra se cubrió con aproximadamente 1/8" de tierra. La bandeja se colocó en un carro de germinación dejando un estante de la bandeja vacío entre cada bandeja de muestra para permitir el alargamiento del hipocótilo. Cuando el carro estuvo lleno, o cuando no se iban a plantar muestras adicionales, se aseguró que la bandeja inferior estuviera regada. Los números de identificación de las muestras contenidas en el carro se registraron en una etiqueta/tarjeta codificada por colores con información, tal como la fecha de plantación, la fecha de transferencia y la fecha de lectura, que se incluyeron en la tarjeta. Esta información se adjuntó a la parte exterior trasera del carro para que los números fueran legibles desde el exterior. Los números de identificación de las muestras se registraron en el calendario de pared en la fecha de lectura (once días a partir de la fecha de plantación). Por ejemplo, si la semilla se plantó el 10 de noviembre, las muestras se registraron en el calendario en el espacio correspondiente al 21 de noviembre. La puerta del carro se cerró y se bloqueó y se puso en la cámara de germinación fría a 10 °C ± 1 °C, normalmente durante siete días. El carro se retiró de la cámara fría y se colocó en la cámara tibia a 25 °C ± 1 °C durante cuatro días; se permitió la lectura anticipada si se consideraba que la muestra había alcanzado el máximo potencial de germinación. El carro se retiró de la cámara y se evaluó de acuerdo con la versión actual de lasAOSA Rules for Testing Seedy elAOSA Seedling Evaluation Handbook.

Ejemplo 4: Comparación del contenido de sacarosa, rafinosa y estaquiosa en semillas de soja de la presente invención con verificaciones de comparación de datos recopilados en 2008 en Argentina y los EE. UU.

En la Tabla 1, el contenido de sacarosa, rafinosa y estaquiosa en las semillas y el contenido combinado de rafinosa y estaquiosa de la semilla derivada de líneas de soja patentadas que tienen la 222-18-1 de soja en su pedigrí se comparan con una línea de verificación (control) designada 388.TC. La columna 1 muestra la línea, las columnas 2-5 muestran los datos del perfil de azúcar recopilados en abril de 2008 en Argentina, la columna 2 muestra el contenido de sacarosa, la columna 3 muestra el contenido de rafinosa, la columna 4 muestra el contenido de estaquiosa, la columna 5 muestra el contenido combinado de rafinosa y estaquiosa, las columnas 6-9 muestran los datos del perfil de azúcar recopilados en octubre de 2008 en los EE. UU., la columna 6 muestra el contenido de sacarosa, la columna 7 muestra el contenido de rafinosa, la columna 8 muestra el contenido de estaquiosa y la columna 9 muestra el contenido de rafinosa y estaquiosa. El contenido de sacarosa, rafinosa y estaquiosa se mide como porcentaje del peso seco del contenido en las semillas. Los datos se recopilaron en abril de 2008 en Argentina y en octubre de 2008 en los Estados Unidos con fines comparativos y para minimizar las diferencias ambientales. La semilla de soja que contiene 222-18-1 en su pedigrí tenía un contenido de rafinosa, un contenido de estaquiosa y un contenido combinado de rafinosa y estaquiosa significativamente menores, mientras que tenía un contenido de sacarosa mayor en comparación con la 388.TC de verificación de soja que no exhibe el fenotipo con contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa. El contenido combinado de rafinosa y estaquiosa de las plantas de soja de la presente invención varió del 0,27 % al 1,75 %, mientras que el contenido combinado de rafinosa y estaquiosa de 388.TC fue un promedio del 4,77 %. Por lo tanto, las líneas de soja de la presente invención tienen un contenido reducido de rafinosa y estaquiosa de aproximadamente 2,73 a 17,67 veces menor que la variedad de verificación.

__________________________TABLA 1__________________________

Abril de 2008 - AR Octubre de 2008 - EE. UU.

S R S Sacarosa R S R S

,33 0,,36 7,,0 0 ,04 0,39 0,43

932D129 3 1 0,00 0,19 0 19 7,,1 0 ,05 0,39 0,44

932D130 7,8 0 ,04 0,38 0,42 8,,0 0 ,03 0,32 0,35

926D108K 5 1 0,05 1,04 1,09 7,,1 0 ,09 1,09 1,18

222-18-1 7 ,5 0 ,13 0,58 0,71 7,,1 0 ,05 0,37 0,42

928D119 3,6 0 ,03 0,60 0,63 6,,0 0 15 1,60 1,75

931D125 6 ,3 0 ,00 0,27 0,27 8,,1 0 ,03 1,33 0,36

933D132 5,8 0 ,10 1,10 1,20 7,,3 0 ,08 1 1,14

934D201 5,5 ,71 0,77 5,,6 0 13 1,25 1

936D205 2 ,3 ,32 0,35 5,,6 0 13 1,25 1,38

938D211A 2 ,8 0 ,06 0,77 0,83 5,,5 0 14 1,29 1,43

939D214A 5,4 0 ,08 0,94 1,02 5,,2 0 11 1,00 1,11

______________ (continuación)_________________________

Abril de 2008 - AR Octubre de 2008 - EE. UU.

Sacarosa R S R S Sacarosa R S R S

941D221A 5,4 0,07 0,84 0,91 5,0 0,15 1,15 1,30

388.TC 4,4 0,97 3,8 4,77

Ejemplo 5: Comparación del contenido de sacarosa, rafinosa y estaquiosa en semillas de soja de la presente invención en 2008 y 2009 de EE. UU.

En la figura 4, se analiza el contenido de tres oligosacáridos, sacarosa, rafinosa y estaquiosa, en las cinco líneas avanzadas con contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en dos entornos/estaciones de cultivo diferentes. Las líneas se cultivaron primero en EE. UU. en 2008 y a continuación se desarrollaron en Argentina durante el invierno de 2008. 932D129, 932D130 y 932D132 representan líneas de soja con tres maduraciones tempranas y 926D112 y 928D120 representan líneas de soja con dos maduraciones tardías. El nivel de rafinosa y estaquiosa es muy estable en todos los entornos y estaciones. Estas líneas también presentan una reducción significativa de rafinosa y estaquiosa en comparación con las variedades estándar lanzadas al mercado.

Ejemplo 6: Comparación del contenido de sacarosa, rafinosa y estaquiosa y las tasas de germinación en la semilla de soja de la presente invención con verificaciones de comparación en 2009 en los EE. UU.

En la Tabla 2, el contenido de sacarosa, rafinosa y estaquiosa y las tasas de germinación (tanto en temperaturas cálidas como frías) se comparan con las líneas de soja con un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas de la presente invención con las líneas de verificación (control) (285.HPC y 348.TC) que tienen un contenido normal de rafinosa y estaquiosa normal en las semillas. Las líneas de soja de la presente invención, 926D112 y 928D120, comparten una madurez tardía dos con la variedad de verificación 258F.HPC, mientras que las líneas de soja de la presente invención, 932D129, 932D130 y 933D132, comparten madurez temprana tres con la variedad de verificación 348.TC. La columna 1 muestra la línea, la columna 2 muestra el contenido de sacarosa, la columna 3 muestra el contenido de rafinosa, la columna 4 muestra el contenido de estaquiosa, la columna 5 muestra el contenido de rafinosa y estaquiosa y las columnas 6 y 7 muestran las tasas de germinación en temperaturas cálidas y frías, respectivamente.

Los perfiles de sacarosa, rafinosa y estaquiosa se tomaron usando HPLC. Anteriormente, se pensaba que las líneas con bajo contenido de rafinosa y estaquiosa tenían una germinación deficiente. La Tabla 2 muestra que se puede lograr un fenotipo con contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa sin una reducción significativa en la germinación en comparación con las líneas de verificación.

Los datos se tomaron del verano de 2009 en la temporada de EE. UU. y muestran que una reducción significativa en la rafinosa y estaquiosa en líneas avanzadas de la presente invención en comparación con variedades de verificación con madurez similar no da como resultado una reducción significativa en la germinación.

Tabla 2

Línea % de azúcar (peso seco) % de germinación Sacarosa Rafinosa Estaquiosa Rafinosa Estaquiosa Caliente Frío

926D112 7,85 0,06 0,46 0,52 99 86

928D120 7,94 0,06 0,62 0,68 99 90

258F.HPC 5,30 0,94 4,35 5,29 99 95

932D129 6,04 0,00 0,52 0,52 84 83

932D130 6,68 0,06 0,67 0,73 93 92

933D132 6,27 0,09 1,78 1,87 96 89

348.TC 5,08 0,67 4,94 5,61

Ejemplo 7: Comparación de las tasas de germinación entre la semilla de soja de la presente invención y las verificaciones de comparación

La figura 5 compara los datos de germinación de las líneas avanzadas con contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa de la presente invención en comparación con las líneas de verificación (control) con la madurez apropiada. Cada línea se ensayó para determinar germinación en temperaturas cálidas y frías. Las semillas para crear estos datos se produjeron en una temporada de cultivo en EE. UU. de 2009. Los primeros cinco pares de barras comparten una madurez temprana tres. Los primeros tres pares tienen los fenotipos bajos de RFO y los dos últimos representan líneas de verificación. Los últimos tres pares o barras comparten madurez tardía dos; los dos primeros pares tienen contenidos bajos de rafinosa y estaquiosa en las semillas y el último par representa líneas de verificación (control). Como se muestra en la figura 5, inesperadamente no hay diferencias significativas en la germinación para una línea de contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa de la presente invención en comparación con una línea de verificación con niveles convencionales de rafinosa y estaquiosa.

La figura 6 muestra la germinación promedio para las líneas avanzadas con contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en comparación con la germinación promedio para las líneas de verificación con madurez similar. La germinación se ensayó en temperaturas cálidas y frías. La germinación se mide como un porcentaje. Como se muestra en la figura 6 , inesperadamente no hay diferencias significativas en la germinación para una línea de contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa de la presente invención en comparación con una línea de verificación con niveles convencionales de estos oligosacáridos.

Ejemplo 8 : Identificación de polimorfismos en las rafinosa sintasas RS3 y RS4 y asociación de los genes de RS3 y RS4 mutantes con el fenotipo con contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa

Con el fin de determinar los elementos genéticos responsables del contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa en las semillas y las altas tasas de germinación, se usó un enfoque molecular con rafinosa sintasas de soja como genes candidatos.

La línea PI 200508 es una línea de soja que se asoció con un bajo contenido de rafinosa y estaquiosa en las semillas. Se sabe que la línea PI 200508 tiene un gen de RS2 que se pensaba que confería un bajo contenido de rafinosa y estaquiosa. Dierking y Bilyeu.The Plant Genome,1(2): 135-145 (noviembre de 2008). Debido a la secuencia de RS2 común entre las líneas PI 200508 y 247F con bajo contenido de rafinosa y estaquiosa, es obvio que este gen es necesario para el fenotipo de bajo contenido de rafinosa y estaquiosa. Sin embargo, el fenotipo único con contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa observado en 222-18-1 debe deberse a la acción de genes adicionales de la rafinosa sintasa en la soja. Los genes candidatos restantes de RS3 y RS4 se han caracterizado por la diferencia de nucleótidos entre líneas con fenotipo con bajo contenido de rafinosa y estaquiosa (PI 200508 y 247F) y una línea con fenotipo con contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa (222-18-1). RS3 se amplificó por PCR y se secuenció como se describe. Dierking y Bilyeu.The Plant Genome,1(2): 135-145 (noviembre de 2008). El gen de RS4 se descubrió después de la publicación de la secuencia genómica de la soja debido a su homología con los genes de la rafinosa sintasa de la soja, el guisante yArabidopsis.Este gen se amplificó mediante cebadores específicos del gen y se secuenció a partir de Williams 82, PI 200508, 247F y 222-18-1. Los genes de RS3 y RS4, que son exclusivos de la línea 222-18-1 con niveles ultrabajos de rafinosa y estaquiosa, se identificaron primero usando los cebadores que se describen en las SEQ ID NO:8 a SEQ. ID NO: 18. A continuación, se identificaron los polimorfismos en los genes de RS3 y RS4 usando un conjunto de cebadores para cada exón por separado. Estos polimorfismos únicos dan como resultado cambios de aminoácidos y confieren el fenotipo con contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa.

Para la secuencia de RS3 mutante, existen cuatro polimorfismos en la secuencia de RS3 de 222-18-1 en comparación con la secuencia de 247F (247F y Williams 82 son idénticos para RS3). Dos de estos polimorfismos son silenciosos y, por lo tanto, no dan como resultado cambios de aminoácidos. De los dos restantes, uno se produce en el exón uno, y el segundo en el exón 2. El polimorfismo del exón 1 es un cambio de aminoácido de prolina a alanina (C28G; P10A). El polimorfismo del exón 2 es un cambio de aminoácido de arginina a glicina (C1105G; R369G).

La secuencia de RS4 mutante de 222-18-1 es única, ya que contiene tres mutaciones en comparación con la secuencia de tipo natural (las secuencias de Williams 82, PI 200508 y 247F son todas idénticas para el gen de RS4). La secuencia novedosa contiene tres polimorfismos, uno en el exón uno y un segundo y un tercero en el exón dos. El polimorfismo del exón uno es silencioso, mientras que uno de los polimorfismos del exón dos es silencioso y uno da como resultado un cambio de aminoácido de ácido glutámico a un residuo de glicina (A1061G; E354G).

INFORMACIÓN DE DEPÓSITO

Las semillas de soja que contienen el alelo mutante de la presente invención y que expresan el fenotipo con contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa de la presente invención se han depositado en virtud del Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Virginia, por Schillinger Genetics, Inc. La fecha de depósito fue el 16 de abril de 2010 y el número de acceso es PTA-10830. El depósito se realizó con la referencia Soybean Glycine max (L.) SG-ULRFO.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Una planta de soja de progenie obtenible mediante un proceso que comprende la etapa de cruzar la planta de soja depositada en la ATCC con el número de acceso PTA-10830 y que comprende:

(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 2 (RS2) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 2, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 3 (RS3) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 4, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 4 (RS4) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 6; o

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 2 (RS2) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 3 (RS3) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 4

con otra planta de soja que carece de dichas secuencias de ácido nucleico, comprendiendo dicho proceso opcionalmente además una o más etapas de cruzamiento adicionales para obtener plantas de soja de generaciones posteriores que contienen dichas secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos como se expone en (a) las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6; o (b) las SEQ ID NOS: 2 y 4.

2. La planta de soja de la reivindicación 1, en donde dicha planta de soja tiene un fenotipo hereditario de (i) un contenido ultrabajo de rafinosa en las semillas de menos del 0,13 % en peso seco o húmedo contenido total en las semillas; y (ii) un contenido ultrabajo de estaquiosa en las semillas de menos del 1,6 % en peso seco o húmedo contenido total en las semillas.

3. Semilla de la planta de soja de la reivindicación 1, conteniendo dicha semilla de soja dichas secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos como se expone en (a) las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6; o (b) las SEQ ID NOS: 2 y 4.

4. La semilla de soja de la reivindicación 3, en donde dicha semilla de soja tiene un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa, en donde el contenido de rafinosa en las semillas es menor del 0,13 % en peso seco o húmedo contenido total en las semillas y en donde el contenido de estaquiosa en las semillas es menor del 1,6 % en peso seco o húmedo contenido total en las semillas.

5. Un vector que comprende:

(a) la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 y la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5; o

(b) la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 y la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:3.

6. Una planta o semilla de soja transgénica que comprende el vector de la reivindicación 5.

7. Un método, en donde el método comprende producir un producto vegetal básico a partir de una planta o semilla de soja, en donde dicha planta o semilla de soja comprende:

(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 2 (RS2) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 2, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 3 (RS3) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 4, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 4 (RS4) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 6; o

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 2 (RS2) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de rafinosa sintasa 3 (RS3) mutante que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 4;

en donde el producto vegetal básico es concentrado de proteína, aislado de proteínas, cáscaras de soja, harina gruesa, harina o aceite.

8. El método de la reivindicación 7, en donde dicha semilla de soja tiene un contenido ultrabajo de rafinosa y estaquiosa, en donde el contenido de rafinosa en las semillas es menor del 0,13 % en peso seco o húmedo contenido total en las semillas y en donde el contenido de estaquiosa en las semillas es menor del 1,6 % en peso seco o húmedo contenido total en las semillas.

9. El método de la reivindicación 7, en donde dicha planta de soja tiene un fenotipo hereditario de (i) un contenido ultrabajo de rafinosa en las semillas de menos del 0,13 % en peso seco o húmedo contenido total en las semillas; y (ii) un contenido ultrabajo de estaquiosa en las semillas de menos del 1,6 % en peso seco o húmedo contenido total en las semillas.