ES2987424T3 - Inducción de una respuesta celular de reacción cruzada contra antígenos de rinovirus - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a: a) un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos VP4 de un rinovirus, o un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho péptido, colocada bajo el control de los elementos necesarios para su expresión en una célula de mamífero; y/o b) un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 100 aminoácidos que es al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos situada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa de un rinovirus, o un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho péptido, colocada bajo el control de los elementos necesarios para su expresión en una célula de mamífero; y c) un adyuvante Th1 cuando dicha composición inmunogénica comprende uno o más de dichos péptidos aislados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inducción de una respuesta celular de reacción cruzada contra antígenos de rinovirus

La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas que permiten inducir una respuesta inmunitaria de reacción cruzada en un sujeto contra antígenos de rinovirus.

Las infecciones por rinovirus humano (HRV) son la causa más frecuente del resfriado común y están muy asociadas a las exacerbaciones del asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) en individuos de riesgo. A pesar de la gran carga de morbilidad y de los costes sanitarios atribuibles a las infecciones por HRV, actualmente no se dispone de una vacuna ni de una terapia antiviral específica.

No se conocen bien los requisitos para la inmunidad frente al HRV. Tanto las infecciones experimentales como las naturales inducen anticuerpos que proporcionan cierta protección contra la reinfección con el mismo tipo de HRV. Sin embargo, existen más de 100 serotipos del HRV, un número que probablemente aumentará con la identificación y caracterización de nuevos serotipos. Actualmente, los principales esfuerzos para desarrollar una vacuna candidata contra el HRV se centran en la identificación de antígenos que induzcan una amplia respuesta de anticuerpos neutralizantes. Este enfoque se describe en la solicitud internacional WO 2011/050384, en la que se demuestra que los anticuerpos generados contra una proteína recombinante de la cápside del rinovirus, VP1, muestran protección cruzada contra cepas del HRV distintamente relacionadas. Otro estudio (Katpally et al. (2009) J.Virol. 83:7040-7048) muestra que los anticuerpos dirigidos al N-terminal enterrado de la proteína de la cápside del rinovirus, VP4, muestran neutralización serotipica cruzada. Sin embargo, no hay certeza de que una estrategia vacunal basada únicamente en la generación de anticuerpos neutralizantes pueda proporcionar una protección suficiente y amplia para prevenir las frecuentes infecciones por HRV que se producen a lo largo de la vida.

Por lo tanto, existe una importante necesidad de desarrollar estrategias de vacunación alternativas que puedan tener más éxito.

Las estrategias de vacunación basadas en la inducción de respuestas de células T a antígenos conservados se han explorado en varias enfermedades infecciosas, incluidas las infecciones por virus respiratorios. La ventaja de dicha estrategia radica en la capacidad de las células T para reconocer regiones internas del virus, que con frecuencia están más conservadas que los epítopos de anticuerpos expuestos en la superficie. Por lo tanto, las células T son potencialmente reactivas cruzadas contra diferentes cepas de virus, como se ha demostrado con los virus de la gripe (Lee et al. (2008) J. Clin. Invest. 118:3478-3490 ; Richards et al. (2010) J. Immunol. 185:4998-5002) para los que la variabilidad antigénica de superficie es una barrera importante para el diseño eficaz de vacunas.

En el caso de las HRVs, se ha demostrado que las células T de memoria naturales responden a serotipos cruzados (Gern et al. (1997) J. Infect. Dis. 175:1108-1114 ; Wimalasundera et al. (1997) J. Infect. Dis. 176:755-759) y se ha sugerido que la inmunización de ratones con péptidos de las proteínas de la cápside VP1 y VP3 del HRV es capaz de inducir células T reactivas de serotipo cruzado (Hastings et al. (1993) Eur. J. Immunol.

23:2300-2305). Sin embargo, no se ha demostrado que una respuesta inmunitaria mediada por células T contra el HRV sea protectora contra la infección por rinovirus.

U. Katpally et al., Journal of Virology, vol. 83, n° 14, 15 de julio de 2009, páginas 7040-7048, enseña la producción de anticuerpos contra las N-terminales de HRV14 P4 y VP1. US 2010/233677 y "Human rhinovirus 16 polyprotein sequence", GENESEQ, 25 de noviembre de 2010, XP002766604, divulgan la secuencia de la poliproteína del rinovirus humano 16.

Los inventores han presentado ahora nuevas composiciones inmunogénicas que son capaces de inducir una amplia respuesta inmunitaria celular de reacción cruzada entre rinovirus, y que se ha demostrado que también aceleran la eliminación de rinovirus en sujetos infectados por rinovirus.

Basándose en la conservación de secuencias lineales entre los HRVs, los inventores identificaron antígenos que eran capaces de inducir respuestas de células T específicas de antígeno, reactivas cruzadas y orientadas al tipo I, así como respuestas mejoradas de anticuerpos neutralizantes tras la infección en ratones. Dichos antígenos corresponden a dominios conservados en la poliproteína P1 del HRV y en la ARN polimerasa del HRV.

Específicamente, los inventores identificaron como antígeno particularmente útil:

- un péptido aislado que comprenda, o consista en, una secuencia de aminoácidos que sea idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos VP4 de un rinovirus;

- un péptido de fusión que comprenda una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos VP4 de un rinovirus, unida covalentemente a otra secuencia de aminoácidos conservada de la poliproteína "grande" del rinovirus, incluyendo en particular toda o parte de la secuencia de aminoácidos VP2 y/o dominios conservados de la ARN polimerasa; o

- un péptido aislado que comprenda, o consista en, una secuencia de aminoácidos de al menos 100 aminoácidos que sea idéntica en al menos un 90% a una secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa de un rinovirus.

En particular, la administración a ratones de un péptido que comprende el péptido VP4 del HRV16, más particularmente un péptido que consiste en la poliproteína VPo del HRV16, o un péptido cuya secuencia de aminoácidos está situada dentro de los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa del HRV16, permitió inducir una respuesta inmunitaria de reacción cruzada contra el HRV16, pero también contra otros serotipos del HRV, como el HRV14, el HRV1B o el HRV29.

La invención es tal como se define en las reivindicaciones y cualquier otro aspecto, configuración o realización expuestos en el presente documento que no entren dentro del ámbito de las reivindicaciones son meramente informativos. Además, cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

Por lo tanto, la presente divulgación se refiere a una composición inmunogénica que comprende:

a) un péptido aislado o un péptido de fusión como el descrito anteriormente que comprenda una secuencia de aminoácidos que sea idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos VP4 de un rinovirus, o un polinucleótido aislado que comprenda una secuencia de ácido nucleico que codifique dicho péptido, colocado bajo el control de los elementos necesarios para su expresión en una célula de mamífero; y/o

b) un péptido aislado que comprenda una secuencia de aminoácidos de al menos 100 aminoácidos que sea idéntica en al menos un 90% a una secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa de un rinovirus, o un polinucleótido aislado que comprenda una secuencia de ácido nucleico que codifique dicho péptido, colocado bajo el control de los elementos necesarios para su expresión en una célula de mamífero; y

c) un adyuvante Th1 cuando dicha composición inmunogénica comprenda uno o más de dichos péptidos aislados o péptidos de fusión.

La presente divulgación también se refiere a una composición inmunogénica como la definida anteriormente para su uso en un mamífero con el fin de inducir una respuesta inmunitaria específica mediada por células de reacción cruzada contra al menos dos serotipos de rinovirus.

La presente divulgación se refiere además a una composición inmunogénica como la definida anteriormente para su uso en un mamífero con el fin de inducir una respuesta específica de anticuerpos neutralizantes cuando es infectado por un rinovirus.

La presente divulgación también se refiere a una composición inmunogénica como se ha definido anteriormente para su uso en un mamífero para acortar o prevenir una infección por un rinovirus, y/o para reducir o prevenir los síntomas clínicos asociados con la infección. Por lo tanto, la composición inmunogénica como se ha definido anteriormente puede utilizarse como vacuna para proteger contra la infección por rinovirus.

Descripción detallada de la invención

Rinovirus

En el contexto de la invención, el término "rinovirus" o "HRV" (Rinovirus humano) se refiere a cualquier miembro de la familia Picornaviridae géneroEnterovirussegún la taxonomía reciente. Existen 3 grupos diferentes de rinovirus: Rinovirus humano A (HRV-A) también llamado rinovirus de tipo A, Rinovirus humano B (HRV-B) también llamado rinovirus de tipo B y Rinovirus humano C (HRV-C) también llamado rinovirus de tipo C.

Los HRVs se clasifican además según su serotipo, del que se han descrito más de 100 hasta ahora.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "serotipo" se refiere a una subdivisión dentro de un grupo de rinovirus y se basa en la secuencia del gen VP1 del rinovirus. Un serotipo dado de rinovirus puede contener una o varias cepas que se distinguen por características secundarias. Los HRVs se han clasificado en función de otros parámetros, como la especificidad del receptor, la susceptibilidad antiviral y las homologías de la secuencia de nucleótidos. La especie HRV-A incluye en particular los serotipos siguientes: HRV1A, HRV1B, HRV2, HRV7, HRV8, HRV9, HRV10, HRV11, HRV12, HRV13, HRV15, HRV16, HRV18, HRV19, HRV20, HRV21, HRV22, HRV23, HRV24, HRV25, HRV28, HRV29, HRV30, HRV31, HRV32, HRV33, HRV34, HRV36, HRV38, HRV39, HRV40, HRV41, HRV43, HRV44, HRV45, HRV46, HRV47, HRV49, HRV50, HRV51, HRV53, HRV54, HRV55, HRV56, HRV57, HRV58, HRV59, HRV60, HRV61, HRV62, HRV63, HRV64, HRV65, HRV66, HRV67, HRV68, HRV71, HRV73, HRV74, HRV75, HRV76, HRV77, HRV78, HRV80, HRV81, HRV82, HRV85, HRV88, HRV89, HRV90, HRV94, HRV95, HRV96, HRV98, HRV100, HRV101, HRV102 y HRV103; la

especie HRV-B incluye en particular los serotipos siguientes: HRV3, HRV4, HRV5, HRV6, HRV14, HRV17,

HRV26, HRV27, HRV35, HRV37, HRV42, HRV48, HRV52, HRV69, HRV70, HRV72, HRV79, HRV83, HRV84,

HRV86, HRV91, HRV92, HRV93, HRV97 y HRV99; y la especie HRV-C incluye en particular los serotipos siguientes: HRVC-1, HRVC-2, HRVC 3, HRVC-4, HRVC-5, HRVC-6, HRVC-7, HRVC-8, HRVC-9, HRVC-10,

HRVC-11, HRVC-12, HRVC-13, HRVC-14, HRVC-15, HRVC-16, HRVC-17, HRVC-18, HRVC-19, HRVC-HRVC-21, HRVC-22, HRVC-23, HRVC-24, HRVC 25, C-26, HRVC-27, HRVC-28, HRVC-29, HRVC-3 HRVC-31, HRVC-32, HRVC-33, HRVC-34, HRVC-35, HRVC 36, HRVC-37, HRVC-38, HRVC-39, HRVC-4 HRVC-41, HRVC-42, HRVC-43, HRVC-44, HRVC-45, HRVC-46, HRVC 47, HRVC-48 y HRVC-49.

Los serotipos del HRV también pueden agruparse de acuerdo con el uso del receptor en virus del grupo menor

y virus del grupo mayor.

Los virus del grupo menor, tales como el HRV2, utilizan la familia de receptores de lipoproteínas de baja

densidad como receptor. Son lábiles a los ácidos y tienen una dependencia absoluta de un pH bajo para

eliminar el recubrimiento. Los virus del grupo principal, como HRV14 y HRV16, utilizan la molécula de adhesión

intercelular 1 (ICAM-1) como receptor. Por lo general, también son lábiles a los ácidos pero, a diferencia de los

virus del grupo menor, no tienen una dependencia absoluta de un pH bajo para eliminar el recubrimiento.

Como bien sabe la persona con experiencia, los HRVs del grupo menor incluyen 11 serotipos, que incluyen

HRV1A, HRV1B, HRV2, HRV23, HRV25, HRV29, HRV30, HRV31, HRV44, HRV47, HRV49 y HRV62, y los

HRVs del grupo mayor incluyen los serotipos restantes.

Los HRVs tienen una cápside de 25 nm de simetría icosaédrica, formada por 60 copias de cada una de las

cuatro proteínas codificadas por el virus (VP1, VP2, VP3 y VP4) y que encierra un genoma de ARN monocatenario de aproximadamente 7.500 nucleótidos. El ARN es de polaridad positiva, está poliadenilado en

su terminal 3' y está unido covalentemente en su extremo terminal 5' a una pequeña proteína, la VPg. El

producto de traducción primario de este ARN es una única poliproteína "grande", dividida en tres poliproteínas

más pequeñas denominadas P1, P2 y P3, que posteriormente se procesan por escisión proteolítica para dar

producir las proteínas maduras del virus. La poliproteína P1 está compuesta por cuatro péptidos (1A o VP4, 1B

o VP2, 1C o VP3, y 1D o VP1), la poliproteína P2 está compuesta por tres péptidos (2A, 2<b>y 2C) y la poliproteína P3 está compuesta por cuatro péptidos (3A, 3B, 3C y 3D, que corresponde a la ARN polimerasa).

La poliproteína P1 es el precursor que da lugar a las cuatro proteínas estructurales de la nucleocápside. La poliproteína P1 se escinde primero para producir la poliproteína VPo, que contiene la secuencia de aminoácidos

de los péptidos VP4 y VP2, el péptido VP3 y el péptido VP1. Una vez que el virus se ha ensamblado, la poliproteína VPo se escinde en el péptido VP4 y el péptido VP2.

En el contexto de la invención, el término "poliproteína VPo", "péptido VPo" o "péptido 1AB" se refiere por tanto

al precursor proteico derivado de la poliproteína HRV P1 y que consiste en la secuencia de aminoácidos de los

péptidos VP4 y VP2. La poliproteína VPo típicamente tiene una longitud de aproximadamente 330 aminoácidos.

Como sabe la persona con experiencia, la secuencia de aminoácidos de la poliproteína VPo puede variar ligeramente de acuerdo con el serotipo o grupo del HRV.

En el contexto de la invención, el término "aproximadamente", tal como se utiliza en el presente documento al

referirse a un valor mensurable, como una cantidad, una duración o un número, como el número de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos, se entiende que abarca variaciones de ± 5%.

En el contexto de la invención, el término "un" o "una" entidad se refiere a una o más de esa entidad. Por

ejemplo, "un polinucleótido", "un péptido aislado", "un péptido de fusión", "un polinucleótido aislado" se entiende

que representan respectivamente al menos uno o más "polinucleótidos", al menos uno o más "péptidos

aislados", al menos uno o más "péptidos de fusión", al menos uno o más "polinucleótidos aislados".

En el contexto de la invención, los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" deben interpretarse como términos abiertos (es decir, que significan "que incluye, pero no se limita a") a menos que

se indique lo contrario. Además, el término "que comprende" engloba "que consiste" (por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por

ejemplo, X+Y).

En una realización, la secuencia de aminoácidos de la poliproteína VPo es la secuencia de aminoácidos de la poliproteína VPo del serotipo HRV16, que consiste típicamente en la secuencia:

MGAQVSRQNVGTHSTQNMVSNGSSLNYFNINYFKDAASSGASRLDFSQDPSKFTDPVKD VLEKGTPTLQSPS\TEACGYSDRITQITRGDSTITSQDVANAWGYG\AVPHYLTPQDATATD KPTQPDTSSNRFYTLDSKMWNSTSKGWWWKLPDALKDMGIFGENMFYHFLGRSGYTV HVQCNASKFHQGTLL\7VMIPEHQLAT\7NKGNVNAGYKYTHPGEAGREVGTQVENEKQP SDDNWLNFDGTLLGNLL1FPHQFINLRSNNSATL1VPYVNAVPMDSMVRHNNWSLV1IP VCQLQSNNISNIVPITVS1SPMCAEFSGARAKTVV(SEQ ID NO: 6).

En otra realización, la secuencia de aminoácidos de la poliproteína VPo es la secuencia de aminoácidos de la poliproteína VPo del serotipo HRV14, que consiste típicamente en la secuencia:

MGAQVSTQKSGSHENQNILTNGSNQTFTVINYYKDAASTSSAGQSLSMDPSKFTEPVKDL MLKGAPALNSPNVEACGYSDRVQQITLGNSTITTQEAANAWCYAEWPEYLPDVDASDV NKTSKPDTSVCRFYTLDSKTWTTGSKGWCWKLPDALKDMGVTGQNMFFHSLGRSGYTV HVQCNATKFHSGCLLWVIPEHQLASHEGGNVSVKYTFTHPGERGIDLSSANEVGGPVK DV1YNMNGTLLGNLL1FPHQFINLRTNNTATIVIPY1NSVPIDSMTRHNNVSLMVIPLAPLT VPTGATPSLPITVTIAPMCTEFSGIRSKSIV (SEQ ID NO: 8).

El experto puede determinar fácilmente la secuencia de aminoácidos de la poliproteína VPo correspondiente de otros serotipos del HRV, típicamente mediante la alineación de secuencias, tal como la alineación global por pares.

En el contexto de la invención, el término "péptido VP4" o "péptido 1A" se refiere a una cápside de proteína HRV, derivada del precursor de la poliproteína VPo, que se encuentra en la interfaz entre la cápside y el ARN genómico interior. El péptido VP4 tiene una longitud de aproximadamente 68 o 69 aminoácidos y se sitúa generalmente del aminoácido 1 al aminoácido 69 de la poliproteína VP0. Como sabe la persona con experiencia, la longitud de la secuencia de aminoácidos del péptido VP4 puede variar ligeramente de acuerdo con el serotipo del HRV.

De acuerdo con una realización, la secuencia de aminoácidos del péptido VP4 es la secuencia de aminoácidos del péptido VP4 del serotipo HRV16, que consiste típicamente en la secuencia:

MGAQVSRQNVGTHSTQNMVSNGSSLNYFNINYFKDAASSGASRLDFSQDPSKFTDPVKD VJLEKGIPTLQ (SEQ ID NO: l).

De acuerdo con otra realización, la secuencia de aminoácidos del péptido VP4 es la secuencia de aminoácidos del péptido VP4 del serotipo HRV14, que consiste típicamente en la secuencia:

MGAQVSTQKSGSHENQNILTNGSNQTFTVINYYKDAASTSSAGQSLSMDPSKFrEPVKDL MLKGAPALN (SEQ ID NO: 2).

El experto puede determinar fácilmente la secuencia peptídica VP4 correspondiente de otros serotipos del HRV, normalmente mediante alineación de secuencias, como la alineación global por pares.

En el contexto de la invención, el término "péptido VP2" o "péptido 1B" se refiere a una cápside de proteína HRV, derivada del precursor de la poliproteína VPo, que se encuentra en el lado externo de la cápside. El péptido VP2 tiene una longitud de aproximadamente 270 aminoácidos. Generalmente, el péptido VP2 se sitúa entre los aminoácidos 70 y 339 de la poliproteína VP0. Como sabe la persona con experiencia, la longitud de la secuencia de aminoácidos del péptido VP2 puede variar ligeramente de acuerdo con el serotipo del HRV.

De acuerdo con una realización, la secuencia de aminoácidos del péptido VP2 es la secuencia de aminoácidos del péptido VP2 del serotipo HRV16, que consiste típicamente en la secuencia:

SPSVEACGYSDRIIQITRGDSTTrSQDVANAWGYGVWPHYLTPQDATAIDKPTQPDTSSN RFYTLDSmWNSTSKGWWWKLPDALKDMGIFGENMFYHFLGRSGYTVHVQCNASKFH QGTLLYAA'1IPEHQLATVTSÍKGNY:NAGYKYTHPGEAGREY7GTQY7ENEKQPSDDNWLNFD

GTLJLGN LLIFPHQFIN LRSNN SATLIVPYVNAVPMDSMVRH N N WSLVIIP VCQ LQSN NIS NIVPITVSISPMCAEFSGARAKTW (SEQ ID NO: 3).

De acuerdo con otra realización, la secuencia de aminoácidos del péptido VP2 es la secuencia de aminoácidos del péptido VP2 del serotipo HRV14, que consiste típicamente en la secuencia:

SPNVEACGYSDRVQQITLGNSTITTQEAANAWCYAEWPEYLPDVDASDVNKTSKPDTSV CRFYTLDSKTWTTGSKGWCWKLPDALKDMGVFGQNMFFHSLGRSGYTVHVQCNATKF HSGCLLVWIPEHQLASHEGGNVSVKYTFTHPGERGIDLSSANEVGGPVKDVIYNMNGTL LGNLLIFPHQFINLRTNNTATIVIPYINSVPIDSMTRHNNVSLMVIPIAPLTVPTGATPSLPI TVTIAPMCTEFSGIRSKSIV (SEQ ID NO: 4).

El experto puede determinar fácilmente la secuencia peptídica VP2 correspondiente de otros serotipos del HRV, normalmente mediante alineación de secuencias, como la alineación global por pares.

En el contexto de la invención, el término "ARN polimerasa" o "péptido 3D" se refiere a la ARN polimerasa dependiente de ARN del HRV, situada en el extremo carboxi-terminal de la poliproteína precursora "grande", dentro de la proteína P3, y que es la enzima de núcleo utilizada tanto para la síntesis de ARN de cadena negativa como para la síntesis reiterativa de múltiples copias de ARN de cadena positiva para su empaquetamiento en viriones progenie. La ARN polimerasa del HRV se describe típicamente en Appleby et al. (2005) J. Virol. 79:277-288. La ARN polimerasa del HRV típicamente tiene aproximadamente 460 aminoácidos de longitud. Como sabe la persona con experiencia, la longitud de la secuencia de aminoácidos de la ARN polimerasa puede variar ligeramente de acuerdo con el serotipo del HRV.

De acuerdo con una realización, la secuencia de aminoácidos de la ARN polimerasa es la secuencia de aminoácidos de la ARN polimerasa del serotipo HRV16, que consiste típicamente en la secuencia:

GQIQISKHVKDVGLPSIHTPTKTKLQPSVFYDIFPGSKEPAVLTEKDPRLKVDFDSALFSKY KGNTECSLNEHIQVAVAHYSAQLATLD1DPQPIAMEDSVFGMDGLEALDLNTSAGYPYVT LG1KKKDL1NNKTKDISKLKLALDKYDVDLPMITFLKDELRKKDKIAAGKTRVIEASSIND TTLFRTVYGNLFSKFHLNPGWTGCAVGCDPETFWSKTPLMLD GDCTMAFDYTNYD GSTH PTWFKALGMVLDNLSFNPT'LTNRLCNSKHTFKSTYYEVEGGWSGCSGTSTFNSMTNNITTR TLVLDAYKHIDLDKLKILAYGDDVIFSYKYKLDMEA1AKEGQKYGLTITPADKSSEFKELDY GNVTFLKRGFRQDDKYKFLIHPTFPVEEIYESIRWTKKPSQMQEHVLSLCHLMWHNGPE

lYKDFETKIRSVSAGRALYIPPYELLRHEWYEKF (SEQ ID NO: 15).

De acuerdo con otra realización, la secuencia de aminoácidos de la ARN polimerasa es la secuencia de aminoácidos de la ARN polimerasa del serotipo HRV14, que consiste típicamente en la secuencia:

G QVIARHKVREFNINPVNTPTKSKLHPSVFYDVFPGD KEPAVLS DN DPRLEVKLTESLFS K YKGNVNTEPTENMLVAVDHYAGQLLSLD1PTSELTLKEALYGVDGLEPIDITTSAGFPYVS LGIKKRDILNKETQDTEKMKFYLDKYGIDLPLVTYIKDELRSVDKVRLGKSRLIEASSLND SVNMRMKLGNLYKAFHQNPGVLTGSAVGCDPDVFWSVIPCLMDGHLMAFDYSNFDASL SPVWFVCLEKVLTKLGFAG SSLTQSICNTH HIFRDEIYWEG GMPSGCSGTSIFN SMINNTTT RTLTLDAYKGTDLDKLKTLAYGDDLTVSYPYELDPQVLATLGKNYGLTITPPDKSETFTKMT WENLTFLKRYFKPDQQFPFLVHPVMPMKDIHESTRWTKDPKNTQDHVRSLCMLAWHS GEKEYNEFIQKIRTTD1GKCLILPEYSVLRRRWLDLF (SEQ ID NO: 16).

La secuencia de ARN polimerasa correspondiente de otros serotipos del HRV puede determinarse fácilmente por la persona experta, típicamente por alineación de secuencias, como la alineación global por pares.

En el contexto de la invención, el término "dominio C-terminal de la ARN polimerasa de un rinovirus" se refiere al extremo C-terminal de la ARN polimerasa del HRV como se ha definido anteriormente, en particular a los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa del HRV como se ha definido anteriormente. Como sabe la persona con experiencia, la longitud de la secuencia de aminoácidos del dominio C-terminal de la ARN polimerasa del HRV puede variar ligeramente de acuerdo con el serotipo del HRV.

De acuerdo con una realización, la secuencia de aminoácidos del dominio C-terminal de la ARN polimerasa es la secuencia de aminoácidos del dominio C-terminal de la ARN polimerasa del serotipo HRV16, que consiste típicamente en la secuencia:

EDSVFGMDGLEALDLNTSAGYPYVTLGIKKKDLINNKTKDISKLKLALDKYDVDLPMITFL

KDELRKKDKIAAGKTRMEASSINDTILFRTVYGNLFSKFHLNPGWTGCAVGCDPETFWS

KIPLMLDGDCIMAFDYTNYDGSIHPIWFKALGMVLDNLSFNPTLINRLCNSKHIFKSTYYE

VEGGVPSGCSGTSIFNSMINNIIIRTLVLDAYKHIDLDKLKIIAYGDDVIFSYKYKLDMEAIA KEGQKYGLTTTPADKSSEFKELDYGNVTFLKRGFRQDDKYKFLTHPTFPVEETYESTRWTK

KPSQMQEmXSLCHLMWHNGPEIYKDFETKIRSVSAGRALYIPPYELLRHEWYEKF

(SEQ ID NO: 13).

De acuerdo con otra realización, la secuencia de aminoácidos del dominio C-terminal de la ARN polimerasa es la secuencia de aminoácidos del dominio C-terminal de la ARN polimerasa del serotipo HRV14, que consiste típicamente en la secuencia:

KEALYGVDGLEPIDnTSAGFPYVSLGIKKRDILNKETQDTEKMKFYLDKYCIDLPLVTYIK

DELRSVDKVRLGKSRLIEASSLNDSVNMRMKLGNLYKAFHQNPGVLTGSAVGCDPDVF

WSVIPCLMDGHLMAFDYSNFDASLSPVWFVCLEKVLTKLGFAGSSLIQSICNTHHIFRDEI

YWEGGMPSGCSGTSIFNSMINNIIIRTLILDAYKGIDLDKLKILAYGDDLIVSYPYELDPQV

LATLGKNYGLTITPPDKSETFTKMTWENLTFLKRYFKPDQQFPFLVHPVMPMKDtHESIR

WTKDPKNTQ D H VRS LCMLAWHS GEKEYNEFIQ KIRTTDIGKCLILPEYSVLRRRWLD LF

(SEQ ID NO: 14).

La secuencia correspondiente del dominio C-terminal de la ARN polimerasa de otros serotipos del HRV puede ser determinada fácilmente por la persona experta, típicamente mediante alineación de secuencias, como la alineación global por pares.

Péptidos

Basándose en la conservación de secuencias lineales entre los HRVs, los presentes inventores identificaron antígenos capaces de inducir una respuesta inmunitaria reactiva cruzada contra diferentes serotipos de rinovirus y, de forma aún más inesperada, contra rinovirus pertenecientes a diferentes grupos de rinovirus (respuesta inmunitaria reactiva cruzada entre serotipos y/o entre grupos). Dichos antígenos corresponden a dominios conservados en la poliproteína VPo del HRV y la ARN polimerasa del HRV, tal como se definen en la sección "Rinovirus" del presente documento. En particular, los inventores demostraron que la administración a ratones de un péptido que comprende el péptido VP4 del HRV16, más concretamente un péptido que consiste en la poliproteína VPo del HRV16, permitía inducir una respuesta inmunitaria de reacción cruzada contra el HRV16, pero también contra otros serotipos del HRV, como el HRV14, el HRV1B o el HRV29. En concreto, los inventores identificaron como antígeno particularmente útil:

- un péptido aislado a) que comprenda, o consista en, una secuencia de aminoácidos que sea idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos VP4 de un rinovirus, tal como se define en la sección"Rinovirus"del presente documento, o

- un péptido de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos VP4 de un rinovirus, tal como se define en la sección"Rinovirus" delpresente documento, unido covalentemente a otra secuencia conservada de aminoácidos localizada en la poliproteína "grande", tal como se define en la sección"Rinovirus" delpresente documento, de un rinovirus.

Los inventores también identificaron como otro antígeno particularmente útil, un péptido aislado b) que comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos de al menos 100 aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa de un rinovirus, como se define en la sección"Rinovirus"del presente documento.

Por "una secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa" se entiende una secuencia de aminoácidos que consiste en una cadena de aminoácidos contiguos que se encuentran en la región definida por los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa, es decir, un fragmento de dicha región.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aislado" significa retirado del medio natural, es decir, de rinovirus o células infectadas por un rinovirus. Usualmente, se refiere a un péptido, un péptido de fusión o un ácido nucleico sustancialmente libre de material celular, material bacteriano, material viral o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente.

El término "sustancialmente" abarca "completamente" o "casi" (por ejemplo, una composición "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y o contener una cantidad residual de Y).

De acuerdo con la invención, un polipéptido, péptido o péptido de fusión consiste en al menos aproximadamente 60 aminoácidos, en particular al menos aproximadamente 68 aminoácidos, al menos 69 aminoácidos, al menos 120 aminoácidos, al menos 140 aminoácidos, al menos 160 aminoácidos, al menos 180 aminoácidos, al menos 200 aminoácidos, al menos 220 aminoácidos, al menos 240 aminoácidos, al menos 260 aminoácidos, al menos 280 aminoácidos, al menos 300 aminoácidos, al menos 320 aminoácidos, al menos 340 aminoácidos, o incluso al menos 370 aminoácidos.

De acuerdo con la invención, un polipéptido, péptido o péptido de fusión consta de menos de 500 aminoácidos, en particular de menos de 450, menos de 400 o incluso menos de 380 aminoácidos.

En consecuencia, el tamaño de un polipéptido, péptido o péptido de fusión está típicamente entre 60 y 500 aminoácidos de largo, en particular entre 68 y 500 aminoácidos de largo, más particularmente entre 100 y 500 aminoácidos de largo, todavía particularmente entre 100 y 400 aminoácidos de largo, estando incluidos los límites.

Tal y como se utiliza aquí, el término "aminoácido" se entiende que incluye los 20 aminoácidos naturales.

Tal como se utiliza aquí, una primera secuencia de aminoácidos es al menos x% idéntica a una segunda secuencia de aminoácidos significa que x% representa el número de aminoácidos en la primera secuencia que son idénticos a sus aminoácidos emparejados de la segunda secuencia cuando ambas secuencias están óptimamente alineadas, en relación con la longitud total de la segunda secuencia de aminoácidos. Ambas secuencias están óptimamente alineadas cuando x es máximo. El alineamiento y la determinación del porcentaje de identidad pueden realizarse manual o automáticamente utilizando, por ejemplo, el algoritmo de Needleman y Wunsch, descrito en Needleman and Wunsch (1970) J. Mol Biol. 48:443-453, con, por ejemplo, los siguientes parámetros para la comparación de secuencias polipeptídicas:

matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919, penalidad de brecha: 8 y penalidad por longitud de brecha: 2;

y los siguientes parámetros para la comparación de secuencias de polinucleótidos:

matriz de comparación: coincidencias = 10, falta de coincidencia = 0; penalidad de brecha: 50 y penalidad por longitud de brecha: 3.

Un programa útil con los parámetros anteriores está disponible públicamente tal como el programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros antes mencionados son los parámetros por defecto, respectivamente, para las comparaciones de péptidos (junto con ninguna penalidad de brechas en los extremos) y para las comparaciones de ácidos nucleicos.

En particular, el péptido aislado a) de la composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 90%, al menos idéntica en un 95%, al menos idéntica en un 97%, al menos idéntica en un 98%, al menos idéntica en un 99% o incluso idéntica en un 100% a la secuencia de aminoácidos VP4 de un rinovirus, según se define en la sección"Rinovirus"del presente documento. Por ejemplo, cualquier secuencia de aminoácidos VP4 de una cepa de rinovirus que sea al menos un 90% idéntica al péptido VP4 del serotipo HRV16 (SEQ ID NO: 1) o del serotipo HRV14 (SEQ ID NO: 2) es adecuada para los fines de la divulgación.

El péptido aislado b) de la composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos de al menos 100 aminoácidos, por ejemplo al menos 105, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 330, 340 o 350 aminoácidos, en particular al menos 360 aminoácidos que es al menos un 90% idéntico a una secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa de un rinovirus como se define en la sección"Rinovirus"del presente documento. Más particularmente, el péptido aislado b) de la divulgación comprende, o consiste en una secuencia de aminoácidos de al menos 100 aminoácidos que es al menos 95% idéntica, al menos 97% idéntica, al menos 98% idéntica, al menos 99%, o incluso 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la ARN polimerasa de un rinovirus, como se define en la sección"Rinovirus" del presentedocumento. Por ejemplo, cualquier secuencia de aminoácidos de al menos 100 aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa de una cepa de rinovirus que sea al menos un 90% idéntica a la correspondiente secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa del serotipo HRV16 (SEQ ID NO: 13) o del serotipo HRV14 (SEQ ID NO: 14) es adecuada para los fines de la divulgación.

En algunos casos particulares, aunque no se prefiera, un aminoácido natural puede sustituirse por un aminoácido modificado post-traduccionalmente invivo,incluyendo por ejemplo la hidroxiprolina, la fosfoserina y la fosfotreonina; por aminoácidos inusuales incluyendo, pero sin limitarse a ellos, el ácido 2-aminoadípico, la hidroxilisina, la isodesmosina, la nor-valina, la nor-leucina y la ornitina o por otro aminoácido modificado químicamente.

Los péptidos y péptidos de fusión de la divulgación pueden sintetizarse por cualquier método bien conocido por la persona con experiencia. Tales métodos incluyen síntesis química convencional (en fase sólida o en fase líquida homogénea), síntesis enzimática a partir de aminoácidos constitutivos o derivados de los mismos, así como métodos de producción biológica por tecnología recombinante.

La síntesis química puede ser particularmente ventajosa porque permite una gran pureza, especificidad antigénica, ausencia de subproductos indeseados y facilidad de producción. El péptido obtenido por tales métodos puede entonces opcionalmente purificarse utilizando cualquier método conocido por la persona con experiencia. El método de producción también puede incluir una o más etapas de modificación química o enzimática del péptido para mejorar su estabilidad o su biodisponibilidad.

La síntesis química incluye la síntesis de tipo Merrifield y los métodos de síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc (véase por ejemplo " Fmoc solid Phase peptide synthesis, a practical approach", publicado por W.C. Chan et P. D. White, Oxford University Press, 2000).

El péptido o péptido de fusión de la divulgación también puede obtenerse mediante un proceso de producción biológica con una célula huésped recombinante. En dicho proceso, un vector que contiene un ácido nucleico que codifica el péptido o péptido de fusión de la divulgación, en particular un ácido nucleico como se define en la sección "Ácidosnucleicos''más adelante, se transfiere a una célula huésped, que se cultiva en condiciones que permiten la expresión del péptido o péptido de fusión correspondiente. El péptido o péptido de fusión así producido puede recuperarse y purificarse.

Los métodos de purificación que pueden utilizarse son bien conocidos por la persona con experiencia. El péptido recombinante o péptido de fusión obtenido puede purificarse a partir de lisados y extractos celulares, del sobrenadante del medio de cultivo, por métodos utilizados individualmente o en combinación, como fraccionamiento, métodos cromatográficos, métodos de inmunoafinidad utilizando anticuerpos mono o policlonales específicos, etc....

Péptidos de fusión

En el contexto de la invención, el término "péptido de fusión" se refiere a un péptido compuesto por toda o parte de la secuencia de aminoácidos de al menos dos o más unidades peptídicas individuales de un rinovirus unidas entre sí mediante un enlace covalente, por ejemplo, mediante enlaces peptídicos (amida).

Más específicamente, el péptido de fusión incluido en la composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación se refiere a la secuencia de aminoácidos VP4 de un rinovirus, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos VP4 de un rinovirus, unida por un enlace covalente a otra secuencia de aminoácidos conservada presente en la poliproteína "grande" de un rinovirus.

Incluso si, entre todos los péptidos de rinovirus (VP4, VP1, VP2, VP3, péptidos 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D), se considera que la secuencia de aminoácidos VP4 es la secuencia de aminoácidos más conservada entre los rinovirus, los inventores han encontrado que cuando la secuencia de aminoácidos VP4 se une covalentemente a una secuencia de aminoácidos localizada en la secuencia de aminoácidos VP2 de un rinovirus y/o a una secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa, que son dominios que los inventores han identificado como conservados entre los rinovirus, tales péptidos de fusión asociados con un adyuvante Th1 son capaces de inducir una respuesta inmunitaria de reacción cruzada contra diferentes serotipos de rinovirus. Más inesperadamente, se ha observado una respuesta de células inmunitarias de reactividad cruzada contra rinovirus pertenecientes a diferentes especies de rinovirus. Además, los inventores han demostrado que dichos péptidos de fusión pueden inducir rápidamente la eliminación del virus en ratones infectados por rinovirus.

En una realización preferida, el péptido aislado a) de la composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación es un péptido de fusión que comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos VP4 de un rinovirus tal como se define en la sección"Rinovirus"del presente documento, unida, por enlace covalente, a otra secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos situada en la secuencia de aminoácidos Vp2 de un rinovirus, tal como se define en la sección"Rinovirus"del presente documento.

La secuencia completa de aminoácidos de VP2 tiene aproximadamente 270 aminoácidos de longitud. La secuencia de aminoácidos localizada en la secuencia de aminoácidos VP2 que está unida covalentemente a la secuencia de aminoácidos VP4 puede ser toda o parte de la secuencia de aminoácidos VP2. Cuando es sólo una parte de la secuencia de aminoácidos VP2, puede ser cualquier porción de la secuencia de aminoácidos VP2. Puede ser la parte N-terminal, la parte C-terminal o la parte central de la secuencia de aminoácidos VP2. Preferiblemente, el péptido de fusión comprende la totalidad o parte de los dominios más conservados de la secuencia de aminoácidos VP2 que están situados entre los aminoácidos 70 y 191 y entre los aminoácidos 243 y 297 en la secuencia de aminoácidos de la poliproteína VP0. En vista de lo anterior, el tamaño de la secuencia de aminoácidos VP2 que está unida covalentemente a la secuencia de aminoácidos VP4 tiene una longitud de al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 100, al menos 150, al menos 200, al menos 250 aminoácidos consecutivos. Las secuencias de aminoácidos VP4 y VP2 que están unidas entre sí no son necesariamente secuencias de aminoácidos contiguas en la poliproteína VPo. Preferiblemente, el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos VP4 está unido covalentemente mediante un enlace peptídico al extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos VP2.

Los diferentes dominios del péptido de fusión de la composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación generalmente se acoplan directamente entre sí. Opcionalmente, en caso de que facilite el proceso de producción del péptido de fusión, los diferentes dominios pueden acoplarse mediante un enlazador que puede ser un aminoácido, un péptido de longitud adecuada o una molécula diferente que proporcione las características deseadas. El experto sabe cómo diseñar moléculas enlazadoras apropiadas, en particular péptidos enlazadores basados en su conocimiento común. Por ejemplo, los enlazadores peptídicos pueden seleccionarse de la base de datos LIP (Loops in Proteins) (Michalsky et al. (2003) Prot. Eng. 56:979-985).

De acuerdo con una realización, el péptido de fusión de la composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica, al menos un 95% idéntica, en particular al menos un 96% idéntica, un 97%, un 98%, un 99% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos VP4 de un rinovirus, según se define en la sección"Rinovirus"del presente documento, unida, mediante un enlace covalente, en particular un enlace peptídico, a otra secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica, en particular al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos situada en la secuencia de aminoácidos VP2 del mismo rinovirus o de un rinovirus diferente, tal como se define en la sección"Rinovirus"del presente documento. Preferiblemente, el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos VP4 está unido covalentemente mediante un enlace peptídico al extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos VP2.

Por ejemplo, un péptido de fusión que comprende cualquier secuencia de aminoácidos VP4 de una cepa de rinovirus que es al menos un 90% idéntica al péptido VP4 del serotipo HRV16 (SEQ ID NO: 1) unido a cualquier secuencia de aminoácidos localizada en la secuencia de aminoácidos VP2 de una cepa de rinovirus que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos correspondiente en la secuencia de aminoácidos VP2 del rinovirus del serotipo HRV16 (SEQ ID NO: 3) es adecuado para el propósito de la divulgación.

Del mismo modo, un péptido de fusión que comprende cualquier secuencia de aminoácidos VP4 de una cepa de rinovirus que es al menos un 90% idéntica al péptido VP4 del serotipo HRV14 (SEQ ID NO: 2) unido a cualquier secuencia de aminoácidos situada en la secuencia de aminoácidos VP2 de una cepa de rinovirus que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos correspondiente en la secuencia de aminoácidos VP2 del rinovirus del serotipo HRV14 (SEQ ID NO: 4) es adecuado para el propósito de la divulgación.

En otra realización, el péptido de fusión de la composición inmunogénica de acuerdo con la invención comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica, en particular al menos un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos localizada en la poliproteína VPo de un rinovirus, como se define en la sección"Rinovirus"del presente documento.

En particular, dicha secuencia de aminoácidos localizada en la poliproteína VPo es una secuencia de aminoácidos constituida de 120 a 370 aminoácidos consecutivos, más particularmente de 140 a 340 aminoácidos, de 160 a 320 aminoácidos, de 180 a 300 aminoácidos, de 200 a 280 aminoácidos o de 220 a 260 aminoácidos. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos localizada en la poliproteína VPo comprende toda la secuencia de aminoácidos VP4.

A modo de ejemplo, los presentes inventores demostraron que un péptido de fusión que comprende los primeros 135 aminoácidos N-terminales de la poliproteína VP0 o toda la poliproteína VP0 de un rinovirus induce una respuesta inmunitaria celular de reacción cruzada contra diferentes serotipos de rinovirus, y también puede inducir rápidamente la eliminación del virus en ratones infectados por rinovirus.

Por consiguiente, en una realización particular, el péptido de fusión de la composición inmunogénica de acuerdo con la invención comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos que consiste en los primeros 135 aminoácidos N-terminales de la poliproteína VP0 de un rinovirus, como se define en la sección"Rinovirus"del presente documento.

Más particularmente, el péptido de fusión de la composición inmunogénica de acuerdo con la invención comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica, más particularmente al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos que consiste en los primeros 135 aminoácidos N-terminales de la poliproteína VPo de HRV16, dichos primeros 135 aminoácidos N-terminales que consisten típicamente en la secuencia

MGAQVSRQNVGTHSTQNMVSNGSSLNYFNINYFKDAASSGASRLDFSQDPSKFTDPVKD

VLEKGIPTLQSPSVEACGYSDRTTQTTRGDSTTTSQDVANAWGYGVWPHYLTPQDATATD

KPTQPDTSSNRFYTL (SEQ ID NO: 5).

Alternativamente, el péptido de fusión de la composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica, más particularmente al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos que consiste en los primeros 135 aminoácidos N-terminales de la poliproteína VPo de HRV14, dichos primeros 135 aminoácidos N-terminales que consisten típicamente en la secuencia

MGAQVSTQKSGSHENQNILTNGSNQTFTVINYYKDAASTSSAGQSLSMDPSKFTEPVKDL

MLKGAPALNSPNVEACGYSDRVQQITLGNSTITTQEAANAVVCYAEWPEYLPDVDASDV

NKTSKPDTSVCRFYTL (SEQ ID NO: 7).

Todavía en particular, el péptido de fusión de la composición inmunogénica de acuerdo con la invención comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica, más particularmente al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia completa de aminoácidos de la poliproteína VPo de HRV16 o de la poliproteína VPo de HRV14, como se define en la sección"Rinovirus"del presente documento.

Con el objetivo de reducir el número de antígenos, los presentes inventores también diseñaron péptidos de fusión entre las regiones conservadas situadas en la poliproteína VPo y las situadas en la ARN polimerasa, que conservaban un tamaño de antígeno global fácil de expresar.

Por consiguiente, en una realización particular, el péptido de fusión de la composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación comprende, o consiste, en (i) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica, más particularmente al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos VP4 de un rinovirus, tal como se define en la sección"Rinovirus"del presente documento, unida, mediante un enlace covalente, a (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 90%, en particular al menos idéntica en un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% a una secuencia de aminoácidos situada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa del mismo rinovirus o de un rinovirus diferente.

Por ejemplo, un péptido de fusión que comprende cualquier secuencia de aminoácidos VP4 de una cepa de rinovirus que es al menos un 90% idéntica al péptido VP4 del serotipo HRV16 (SEQ ID NO: 1) o del serotipo HRV14 (SEQ ID NO: 2) unido a cualquier secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa de una cepa de rinovirus que sea al menos un 90% idéntica a la correspondiente secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa del serotipo HRV16 (SEQ ID NO: 13) o del serotipo HRV14 (SEQ ID NO: 14) es adecuado para los fines de la divulgación. Preferiblemente, el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos de VP4 está unido covalentemente mediante un enlace peptídico al extremo N-terminal del dominio C-terminal de la secuencia de aminoácidos de la ARN polimerasa.

En particular, dicha secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa de un rinovirus es una secuencia de aminoácidos constituida aproximadamente de 100 a 363 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos de la ARN polimerasa, más particularmente de 105 a 350 aminoácidos consecutivos, 110 a 340, 120 a 330, 140 a 320, 160 a 300, 180 a 280, 200 a 260 o 220 a 240 aminoácidos consecutivos.

En particular, los presentes inventores demostraron que un péptido de fusión que comprendía los últimos 105 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa conservaba la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria de reacción cruzada.

Por consiguiente, en una realización particular, la secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa de un rinovirus incluida en el péptido de fusión de la composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación consiste en los últimos 105 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa de un rinovirus, como se define en la sección"Rinovirus"del presente documento.

Más particularmente, la secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa de un rinovirus incluida en el péptido de fusión de la composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación consiste en los últimos 105 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa de HRV16, dichos últimos 105 aminoácidos C-terminales consisten típicamente en la secuencia:

ADKSSEFKELDYGNVTFLKRGFRQDDKYKFLIHPTFPVEEIYESIRWTKKPSQMQEHVLS LCHLMWHNGPEIYKDFETK1RSVSAGRALYIPPYELLRHEWYEKF (SEQ ID NO: 9).

En otra realización, la secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa de un rinovirus incluida en el péptido de fusión de la composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación consiste en los últimos 105 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa de HRV14, dichos últimos 105 aminoácidos C-terminales consisten típicamente en la secuencia:

PDKSETFTKMTWENLTFLKRYFKPDQQFPFLVHPVMPMKDIHESIRWTKDPKNTQDHV RSLCMLAWHSGEKEYNEF1QKIRTTDIGKCLILPEYSVLRRRWLDLF (SEQ ID NO: 10).

De acuerdo con otra realización, el péptido de fusión de la composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica, al menos 95% idéntica, en particular al menos 96% idéntica, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos VP4 de un rinovirus, tal como se define en la sección"Rinovirus"del presente documento, unida, mediante un enlace covalente, en particular un enlace peptídico, a (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica, en particular al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos localizada en la secuencia de aminoácidos VP2 del mismo rinovirus o de un rinovirus diferente, tal como se define en la sección"Rinovirus"del presente documento, que está unida, mediante un enlace covalente, en particular un enlace peptídico, a (iii) una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90%, en particular en al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% a una secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa del mismo rinovirus o de un rinovirus diferente.

Por ejemplo, un péptido de fusión que comprenda cualquier secuencia de aminoácidos VP4 de una cepa de rinovirus que sea al menos idéntica en un 90% al péptido VP4 del serotipo HRV16 (SEQ ID NO: 1) o del serotipo HRV14 (SEQ ID NO: 2) acoplado a cualquier secuencia de aminoácidos situada en la secuencia de aminoácidos VP2 de una cepa de rinovirus que sea al menos idéntica en un 90% a la correspondiente secuencia de aminoácidos situada en la secuencia de aminoácidos VP2 del serotipo HRV16 (SEQ ID NO: 3) o del serotipo HRV14 (SEQ ID NO: 4), que está acoplada a cualquier secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa de una cepa de rinovirus que es al menos un 90% idéntica a la correspondiente secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa del serotipo HRV16 (SEQ ID NO: 13) o del serotipo HRV14 (SEQ ID NO: 14) es adecuada para los fines de la divulgación. Preferiblemente, el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos VP4 está unido covalentemente mediante un enlace peptídico al extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos VP2 y el extremo C-terminal de dicha secuencia de aminoácidos VP2 está unido covalentemente mediante un enlace peptídico al extremo N-terminal del dominio C-terminal de la secuencia de ARN polimerasa.

En particular, el péptido de fusión de la composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica, más particularmente al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos que consiste en los primeros 135 aminoácidos N-terminales de la poliproteína VPo de un rinovirus, unido, mediante un enlace covalente, en particular un enlace peptídico, a (ii) una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90%, en particular en al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% a una secuencia de aminoácidos localizada en los últimos 363 aminoácidos C-terminales de la ARN polimerasa del mismo rinovirus o de otro diferente. Más particularmente, el péptido de fusión de la composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación comprende, o consiste, en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica, en particular al menos 85% idéntica, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos

MGAQVSRQNVGTHSTQNMVSNGSSLNYFNTNYFKDAASSGASRLDFSQDPSKFTDPVKD

VLEKGIPTLQSPSVEACGYSDRTIQrrRGDSTITSQDVANAWGYGVWPHYLTPQDATAID

KPTQPDTSSNRFYTLADKSSEFKELDYGNVTFLKRGFRQDDKYKFLIHPTFPVEEIYESIR

WTKKPSQMQEHYTSLCHLMWHNGPEIYKDFETKIRSVSAGRALYIPPYELLRHEWYEKF

(SEQ ID NO: ii).

En otra realización particular de la divulgación, el péptido de fusión de la composición inmunogénica de la divulgación comprende, o consiste, en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica, en particular al menos 85% idéntica, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos

MGAQVSTQKSGSHENQNILTNGSNQTFTVTNYYKDAASTSSAGQSLSMDPSKFTEPVKDL

MLKGAPALNSPNVEACGYSDRVQQrTLGNSTrrrQEAANAWCYAEWPEYLPDVDASDV

NKTSKPDTSVCRFYTLPDKSETFTKMTWENLTFLKRYFKPDQQFPFLVHPVMPMKDIHE

SIRWTKDPKNTQDHVRSIX1MIJUVHSGEKEYNEFIQKIRTTDIGKCLILPEYSVLRRRWLD

LF (SEQ ID NO: 12).

Ácidos nucleicos

La presente invención también se refiere a una composición inmunogénica que comprende un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico correspondiente a (es decir, que codifica) al menos uno de los péptidos a) o b) definidos en la sección"Péptidos" delpresente documento, o el péptido de fusión definido en la sección"Péptidos de fusión"del presente documento, y diseñado de manera que pueda administrarse a mamíferos, en particular a seres humanos. Por lo general, la secuencia de ácido nucleico colocada bajo el control de los elementos necesarios para su expresión en una célula de mamífero, en particular en células humanas, se incorpora en un plásmido, que puede formularse además en un vehículo de administración, tal como liposomas, para facilitar su introducción en la célula huésped.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "ácido nucleico" incluye el ADN y el ARN y puede ser de doble cadena o de cadena simple.

En el contexto de la invención, la expresión "elementos necesarios para la expresión en una célula de mamífero" se entiende como todos los elementos que permiten la transcripción de un ADN o fragmento de ADN en ARNm y la traducción de este último en proteína, dentro de una célula de mamífero, como una célula humana. Típicamente, los elementos necesarios para la expresión de un ácido nucleico en una célula de mamífero incluyen un promotor que es funcional en la célula de mamífero seleccionada y puede ser constitutivo o inducible; un sitio de unión al ribosoma; un codón de inicio (ATG) si es necesario; una región que codifica un péptido señal (por ejemplo, un péptido señal de lipidación); un codón de parada; y una región terminal 3' (terminador de traducción y/o transcripción). Otros elementos de control de la transcripción, como potenciadores, operadores y represores, también pueden asociarse operativamente con el polinucleótido para dirigir la transcripción y/o traducción en la célula. La región codificadora del péptido señal es preferiblemente adyacente al ácido nucleico incluido en la composición inmunogénica de la invención y se sitúa en el marco de lectura adecuado. La región codificadora del péptido señal puede ser homóloga o heteróloga a la molécula de ADN que codifica el péptido maduro o el péptido de fusión de la invención y puede ser específica del aparato de secreción del huésped utilizado para la expresión. El marco de lectura abierto constituido por el ácido nucleico incluido en la composición inmunogénica de la invención, solo o junto con el péptido señal, se coloca bajo el control del promotor para que se produzca la transcripción y la traducción en el sistema huésped. Los promotores (y las regiones que codifican el péptido señal) son ampliamente conocidos y están a disposición de los expertos en la técnica.

Por último, las secuencias de ácido nucleico pueden optimizarse mediante codones de manera que se mejore la transcripción del ADN que codifica los péptidos y/o los péptidos de fusión de la invención y/o se prolongue la traducción del ARNm que codifica los péptidos y/o los péptidos de fusión.

Por "secuencia de ADN o ARNm optimizada para codón" se entiende una secuencia de ácido nucleico que ha sido adaptada para una mejor expresión en la célula huésped tal como una célula humana, sustituyendo uno o más codones por uno o más codones que se utilizan con mayor frecuencia en los genes de dicha célula huésped, como se describe en US 2004/0209241 en el caso de secuencias de ADN optimizadas para codones, o para maximizar el contenido G/C de la secuencia de ARNm según la célula huésped utilizada, como se describe en US 2011/02699950 en el caso de secuencias de ARNm optimizadas para codones. La optimización de codones de las secuencias de ácido nucleico se gestiona adecuadamente de manera que no cambie significativamente la secuencia de aminoácidos de los péptidos y/o los péptidos de fusión, como se describe en las secciones"Péptidos"y"Péptidos de fusión"del presente documento, que se expresan en las células huésped.

Composición inmunogénica

En el contexto de la invención, la expresión "composición inmunogénica" se refiere a una composición de materia destinada a ser administrada a un sujeto que comprende al menos un antígeno o induce la expresión de al menos un antígeno de un rinovirus (en el caso de la inmunización con ácidos nucleicos) que tiene la capacidad de provocar una respuesta inmunológica en el sujeto al que se administra. Dicha respuesta inmunológica puede ser una respuesta inmunológica celular y/o mediada por anticuerpos dirigida al menos contra el antígeno de la composición.

Más específicamente, la composición inmunogénica de la invención comprende un péptido aislado como se define en la sección"Péptidos"del presente documento, un péptido de fusión como se define en la sección"Péptidos de fusión"del presente documento y/o un polinucleótido aislado como se define en la sección"Ácidos nucleicos"del presente documento.

Cuando la composición inmunogénica de la invención comprende al menos un péptido como se define en la sección"Péptidos"del presente documento y/o al menos un péptido de fusión como se define en la sección"Péptidos de fusión"del presente documento, también comprende un adyuvante Th1.

Un "adyuvante Th1" en el sentido de la invención se define a partir de la relación entre las citoquinas IFN-y e IL-5 que son producidas por los esplenocitos de ratones que han sido previamente inmunizados por vía subcutánea con un péptido o un péptido de fusión de la composición inmunogénica de acuerdo con la invención en presencia del adyuvante probado. Más específicamente, los esplenocitos se cosechan 28 días después de la inmunización y se reestimulanin vitrocon un grupo de péptidos de 15 mers (capaces de ser presentados por MHC de clase I y II) solapados sobre 11 aminoácidos, que cubren la secuencia de aminoácidos del mismo péptido o péptido de fusión en un medio de cultivo de acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 3. Después de 3 días de estimulación, se recogen los sobrenadantes de cultivo para medir las citoquinas IFN-<y>e IL-5 mediante Matriz de Perlas de Citometría. Si la relación IFN-y/IL-5 es >5, preferiblemente >10, el adyuvante ensayado se considera un adyuvante Th1.

Entre los ejemplos de adyuvantes Th1 que promueven una respuesta inmunitaria Th1 se incluyen agonistas TLR-9 tales como los oligonucleótidos CpG, o agonistas TLR-4.

En una realización particular, el adyuvante Th1 utilizado en las composiciones inmunogénicas de la invención comprende un oligonucleótido CpG. Puede usarse en una solución acuosa, formularse en emulsión de aceite en agua, por ejemplo con adyuvante de Freund incompleto o administrarse por otros medios. Como ejemplos de secuencias de oligobucleótidos CpG adecuadas se mencionan CpG ODN 1826 (secuencia 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID NO: 38)), CpG ODN 2216 (secuencia 5'ggGGGACGATCGTCggggg-3' (SEQ ID NO: 39)), CpG 2336 (secuencia 5'-gggGACGACGTCGTGgggggg-3' (SEQ ID NO: 40)), o CpG 7909 (5-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 41)), pero pueden utilizarse otras secuencias estimuladoras para los fines de la invención.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En el contexto de la invención, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo que es fisiológicamente aceptable para un mamífero tratado, en particular para humanos, al tiempo que conserva las propiedades profilácticas o terapéuticas del compuesto con el que se administra. Un vehículo farmacéuticamente aceptable ejemplar es la solución salina fisiológica. Otros vehículos fisiológicamente aceptables y sus formulaciones son conocidos por los expertos en la técnica y algunos ejemplos se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, (18a edición), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa..

Las composiciones pueden formularse para su uso en una variedad de sistemas de administración de fármacos. También pueden incluirse en las composiciones uno o más excipientes o portadores fisiológicamente aceptables para una formulación adecuada.

Las composiciones inmunogénicas pueden administrarse por vía intranasal (por ejemplo, por inhalación en aerosol o gotas nasales), parenteral (por ejemplo, por vía intramuscular, subcutánea, intravenosa, intradérmica, transcutánea, transdérmica o percutánea), cutánea, oral, mucosa, intrapulmonar y/o intratraqueal, o por aplicación tópica. La administración de liberación sostenida también se incluye en la invención, por medios como inyecciones de depósito o implantes o componentes erosionables. Así, la invención proporciona composiciones inmunogénicas para administración mucosa o parenteral que incluyen los péptidos definidos en la sección"Péptidos"en el presente documento, los péptidos de fusión definidos en la sección"Péptidos de fusión"en presencia del adyuvante Th1 definido anteriormente, y/o los polinucleótidos definidos en la sección"Ácidos nucleicos"en el presente documento, disueltos o suspendidos en un vehículo aceptable, preferiblemente un portador acuoso, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina, PBS, y similares. Las composiciones inmunogénicas pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, detergentes y similares. La invención también proporciona composiciones inmunogénicas para administración oral, que pueden contener ingredientes inertes como aglutinantes o cargas para la formulación de una tableta, una cápsula y similares. Además, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas para administración cutánea o local, que pueden contener ingredientes inertes como disolventes o emulsionantes adecuados para la penetración a través de la piel, para la formulación de una crema, un ungüento o la incorporación en un parche.

Para la administración oral, la composición inmunogénica puede ser de cualquiera de varias formas incluyendo, por ejemplo, una cápsula, una tableta, una suspensión o líquido, entre otros.

Las preparaciones inyectables, en forma de soluciones o suspensiones acuosas inyectables estériles, como liposomas, o emulsiones, como emulsiones de aceite en agua, pueden formularse según métodos conocidos utilizando agentes dispersantes, humectantes, agentes de suspensión, agentes emulsionantes y similares adecuados. Los vehículos y disolventes adecuados que pueden emplearse son agua, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio, tampón fosfato o Tris, entre otros. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente para la preparación de emulsiones. Para ello, puede emplearse cualquier aceite fijo insípido, incluidos los monoglicéridos o diglicéridos sintéticos, escualeno.

Las composiciones inmunogénicas también pueden prepararse en forma sólida (incluidos gránulos, polvos o supositorios).

Estas composiciones inmunogénicas pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales, o pueden filtrarse estérilmente. Las soluciones acuosas resultantes pueden empacarse y almacenarse en forma líquida o liofilizada, reconstituyéndose la preparación liofilizada con un portador acuoso estéril antes de su administración. El pH de las preparaciones estará típicamente entre 3 y 11, por ejemplo, entre 5 y 9, 6 y 8, o 7 y 8, tal como 7 a 7.5. Las composiciones resultantes en forma sólida pueden empacarse en múltiples unidades de dosis única, cada una de las cuales contiene una cantidad eficaz de péptidos, tal como se definen en la sección"Péptidos"del presente documento, péptidos de fusión, tal como se definen en la sección"Péptidos de fusión",y un adyuvante Th1, y/o polinucleótidos, tal como se definen en la sección"Ácidos nucleicos"del presente documento, como en un vial. Si hay incompatibilidad entre el adyuvante Th1 y el péptido o péptido de fusión, pueden almacenarse en empaques separados y mezclarse extemporáneamente antes de la administración al sujeto.

La composición inmunogénica de acuerdo con la presente invención puede prepararse utilizando cualquier método convencional conocido por los expertos en la técnica. Convencionalmente, los péptidos y/o péptidos de fusión de acuerdo con la invención se mezclan con un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, como agua o solución salina tamponada con fosfato, agentes humectantes, cargas, emulsionante y estabilizante. El excipiente o diluyente se seleccionará en función de la forma farmacéutica elegida, del método y la vía de administración y también de la práctica farmacéutica. Los excipientes o diluyentes adecuados, así como los requisitos en términos de formulación farmacéutica, se describen en la obra de Remington Pharmaceutical Sciences, que constituye un libro de referencia en este campo.

Indicaciones médicas

La presente invención también se refiere a un método para inducir una respuesta inmunitaria específica mediada por células de reacción cruzada en un mamífero dirigida contra al menos dos serotipos de rinovirus, más particularmente contra al menos dos serotipos de rinovirus de tipo A y/o de tipo B, que comprende administrar a un mamífero una cantidad eficaz de una composición inmunogénica como se define en la sección"Composición inmunogénica"del presente documento.

La presente invención se refiere además a una composición inmunogénica como se define en la sección"Composición inmunogénica"del presente documento " para su uso en un mamífero con el fin de inducir una respuesta inmunitaria mediada por células de reacción cruzada contra al menos dos serotipos de rinovirus, en particular contra al menos dos serotipos de rinovirus de tipo A y/o de tipo B.

La presente invención también se refiere al uso de un péptido a) o b) como se define en la sección"Péptidos" delpresente documento o un polinucleótido como se define en la sección 'Ácidosnucleicos"del presente documento, para la fabricación de una composición inmunogénica destinada a inducir una respuesta inmunitaria mediada por células de reacción cruzada contra al menos dos serotipos de rinovirus, en particular contra al menos dos serotipos de rinovirus de tipo A y/o de tipo B en un mamífero.

Principalmente, la respuesta inmunitaria inducida por una composición inmunogénica de la invención es una respuesta inmunitaria específica mediada por células no sólo dirigida al serotipo o serotipos homólogos de rinovirus de los que se deriva la composición inmunogénica, sino también a otros serotipos (heterólogos) de rinovirus del mismo grupo de rinovirus, que puede extenderse a serotipos de rinovirus de otro grupo de rinovirus. En particular, la respuesta inmunitaria mediada por células inducida por una composición inmunogénica de la invención supera la "barrera intergrupal" porque está dirigida en particular contra serotipos de rinovirus de tipo A y de tipo B. Dicha respuesta inmunitaria celular se denomina respuesta inmunitaria celular específica de reacción cruzada (o respuesta inmunitaria mediada por células específica de reacción cruzada), en la medida en que no se limita al serotipo homólogo de rinovirus contra el que se ha inmunizado al sujeto. La respuesta inmunitaria celular inducida por la composición inmunogénica de la invención está orientada a Th1- y/o Tc1.

En el contexto de la invención, la expresión "inducir una respuesta inmunitaria mediada por células específicas" significa la generación de una respuesta de linfocitos T específicos tras la administración de una composición inmunogénica en un sujeto.

Los dos principales efectores celulares de la respuesta de linfocitos T específica son las células T auxiliares y los linfocitos T citotóxicos (CTL).

Las células T CD4+ "auxiliares" o células T auxiliares, son mediadoras de la respuesta inmunitaria y desempeñan un papel importante en el establecimiento y la maximización de las capacidades de la respuesta inmunitaria adaptativa. Estas células pueden tener hasta cierto punto una actividad citotóxica directa, pero, en esencia, "gestionan" la respuesta inmunitaria, dirigiendo a otras células implicadas en la protección de los organismos contra los patógenos. La activación de una célula T auxiliar inalterada hace que libere citoquinas, que influyen en la actividad de muchos tipos celulares como los linfocitos B, los CTLs y las APCs (células presentadoras de antígeno) que la activaron. Las células T auxiliares requieren un estímulo de activación mucho más suave que las células T citotóxicas. Las células T auxiliares pueden proporcionar señales adicionales que "auxilan" la activación de células citotóxicas. Una APC profesional puede inducir dos tipos de respuestas de células T auxiliares CD4+ efectoras, denominadas Th1 y Th2. La medición de las citoquinas asociadas a las respuestas Th1 o Th2 dará una medición del éxito de la inmunización. Esto puede lograrse mediante ELISA o ELISPOT específicos diseñados para la medición de citoquinas Th1 tales como IFN-y, IL-2 y otras, o citoquinas Th2-tales como IL-4, IL-5, IL-13 entre otras.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "respuesta inmunitaria mediada por células T auxiliares" se refiere a una respuesta inmunitaria en la que las células T CD4+ o células T auxiliares se activan y secretan linfoquinas para estimular las ramificaciones del sistema inmunitario mediadas por células y mediadas por anticuerpos. Como sabe la persona con experiencia, la activación de las células T auxiliares promueve la secreción de linfoquinas, el cambio de isotipo de las inmunoglobulinas, la maduración de la afinidad de la respuesta de anticuerpos, la activación de macrófagos y/o el aumento de la actividad de las células T citotóxicas y asesinas naturales. Las linfoquinas son proteínas secretadas por los linfocitos que afectan a su propia actividad y/o a la actividad de otras células. Las linfoquinas incluyen, pero no se limitan a, interleuquinas y citoquinas, por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 o IFN-y.

Como es bien sabido por la persona con experiencia, las células T auxiliares se diferencian en dos subtipos principales de células conocidas como células Th1 y Th2 (también conocidas como células T auxiliares de tipo 1 y tipo 2, respectivamente).

Como sabe la persona con experiencia, las células Th1 secretan principalmente IL-2 e IFN-<y>. Promueven la respuesta inmunitaria celular maximizando la eficacia letal de los macrófagos y la proliferación de células T CD8+ citotóxicas. Además, la citoquina de tipo 1 IFN-y aumenta la producción de IL-12 por parte de las células dendríticas y los macrófagos y, a través de una retroalimentación positiva, la IL-12 estimula la producción de IFN-<y>en las células T auxiliares, promoviendo así el perfil Th1. El IFN-<y>también inhibe la producción de citoquinas como la IL-4, una importante citoquina asociada a la respuesta de tipo 2, por lo que también actúa para preservar su propia respuesta.

Por el contrario, las células Th2 secretan principalmente IL-4, IL-5 e IL-13, y promueven la respuesta inmune humoral estimulando la proliferación de las células B, induciendo el cambio de clase de anticuerpos de las células B. La respuesta de tipo 2 promueve además su propio perfil utilizando dos citoquinas diferentes. La IL-4 actúa sobre los linfocitos T colaboradores para promover la producción de citoquinas Th2 (incluida ella misma), mientras que la IL-10 inhibe diversas citoquinas, como la IL-2 y el IFN-y en las células T auxiliares y la IL-12 en las células dendríticas y los macrófagos.

Preferiblemente, dicha respuesta inmunitaria mediada por células inducida por la composición inmunogénica de la invención es principalmente una respuesta inmunitaria mediada por células Th1.

La inducción de una respuesta inmunitaria mediada por células orientada a Th1 por la composición inmunogénica de la invención puede determinarse a partir de la relación entre las citoquinas IFN-y e IL-5 que producen los esplenocitos de ratones que han sido previamente inmunizados por vía subcutánea con la composición inmunogénica de acuerdo con la invención. Más concretamente, los esplenocitos se recolectan 28 días después de la inmunización y se estimulanin vitrocon un grupo de péptidos de 15 mers solapados sobre 11 aminoácidos que cubren la secuencia de aminoácidos del péptido o péptido de fusión incluido en la composición inmunogénica o codificado por un ácido nucleico incluido en la composición inmunogénica, en un medio de cultivo de acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 3. Después de 3 días de estimulación, se recolectan los sobrenadantes de cultivo para medir las citoquinas IFN-<y>e IL-5 mediante Matriz de Perlas de Citometría. Si la relación IFN-<y>/IL-5 es >5, preferiblemente >10, la respuesta inmunitaria inducida es una respuesta inmunitaria mediada por células orientadas a Th1. Además, dado que la respuesta inmunitaria mediada por células orientada a Th1 es una respuesta inmunitaria mediada por células de reactividad cruzada, los esplenocitos recolectados 28 días después de la inmunización también pueden estimularsein vitrocon un grupo de péptidos de 15 mers solapados sobre 11 aminoácidos, que cubren la secuencia de aminoácidos de un péptido o péptido de fusión correspondiente de al menos otro serotipo de rinovirus de tipo A y/o de tipo B, y producir en el sobrenadante del cultivo celular cantidades de citoquinas IFN-y e IL-5 tales que la relación IFN-Y/IL-5 sea >5, preferiblemente >10 después de la dosificación mediante Matriz de Perlas de Citometría.

En el contexto de la invención, también puede observarse una respuesta Tc1 además de la respuesta inmunitaria mediada por células Th1.

Las células T citotóxicas (también conocidas como Tc, célula T asesina o linfocito T citotóxico (CTL)), que expresan generalmente el marcador CD8, son un subgrupo de células T y también pueden estar implicadas en la respuesta inmunitaria mediada por células T. Inducen la muerte de las células infectadas por virus (y otros patógenos). Estos CTLs atacan directamente a otras células portadoras de ciertas moléculas extrañas o anormales en su superficie. La capacidad de dicha citotoxicidad celular puede detectarse mediante ensayos citolíticosin vitro(ensayo de liberación de cromo). Así pues, la inducción de una inmunidad celular específica puede demostrarse por la presencia de dichas células T citotóxicas, cuando las células diana cargadas de antígeno son lisadas por CTLs específicos que se generanin vivotras la vacunación o la infección.

De forma similar a las células T auxiliares, las células T CD8+ incluyen subconjuntos distintos, que se denominaron, de forma análoga a la terminología Th1/Th2, Tc1 y Tc2.

La respuesta inmunitaria Tc1 implica células T CD8+ específicas productoras de IFN-y que se activan, proliferan y producen IFN-y tras la estimulación por antígenos específicos. El nivel de células T CD8+ productoras de IFN-Y puede medirse por ELISPOT y por citometría de flujo de IFN-y intracelular en estas células.

Las células T citotóxicas inalterada se activan cuando su receptor de células T (TCR) interactúa fuertemente con una molécula MHC de clase I unida a un péptido. Esta afinidad depende del tipo y orientación del complejo antígeno/MHC, y es lo que mantiene unidos al c Tl y a la célula infectada. Una vez activado, el CTL experimenta un proceso llamado expansión clonal en el que gana funcionalidad y se divide rápidamente para producir un ejército de células efectoras "armadas". A continuación, los CTL activados viajan por todo el cuerpo en busca de células portadoras de ese péptido único MHC de clase I . Esto podría utilizarse para identificar tales CTLsin vitromediante el uso de tetrámeros de péptido-MHC de clase I en ensayos de citometría de flujo.

Cuando se exponen a estas células infectadas, los CTL efectores liberan perforina y granulisina, citotoxinas que forman poros en la membrana plasmática de la célula diana, permitiendo que los iones y el agua fluyan hacia el interior de la célula infectada y provocando su ruptura o lisis. Los CTL liberan granzima, una proteasa de serina que entra en las células a través de los poros para inducir la apoptosis (muerte celular). La liberación de estas moléculas por parte de los CTL puede utilizarse como medida del éxito de la inducción de la respuesta inmunitaria celular tras la vacunación. Esto puede hacerse mediante un ensayo de inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA) o un ensayo de inmunospot enlazado a enzima (ELISPOT), en los que los CTL pueden medirse cuantitativamente. Dado que los CTL también son capaces de producir citoquinas importantes como IFN-y, la medición cuantitativa de las células CD8 productoras de IFN-y puede realizarse mediante ELISPOT y mediante citometría de flujo de IFN-<y>intracelular en estas células.

En particular, la inducción de una respuesta inmunitaria Tc1 por la composición inmunogénica de la invención puede determinarse a partir del nivel de citoquina IFN-<y>que se produce en las células T CD8+ de ratones que se han inmunizados previamente por vía subcutánea con la composición inmunogénica de acuerdo con la invención. Más concretamente, los esplenocitos se recolectan 28 días después de la inmunización y se estimulanin vitrocon un grupo de péptidos de 15 mers solapados sobre 1l aminoácidos que cubren la secuencia de aminoácidos del péptido o péptido de fusión incluido en la composición inmunogénica o codificado por un ácido nucleico incluido en la composición inmunogénica, en un medio de cultivo. Se añade Brefeldina A (BFA) para inhibir la secreción de citoquinas y se estimulan las células durante 5 h, tras lo cual se almacenan durante toda la noche. Al día siguiente, las células se permeabilizan, se fijan, se tiñen, y el porcentaje de células CD8+ IFN-Y+ y CD8+ IL5+ en la población de esplenocitos se mide por citometría de flujo tras la tinción intracelular de citoquinas (ICS).Si la relación CD8+ IFN-Y+/CD8+ IL5+ es superior a 1, la respuesta inmunitaria se considera una respuesta inmunitaria Tc1.

En el contexto de la invención, la expresión "inducir una respuesta inmunitaria de reactividad cruzada" significa que se induce una respuesta inmunitaria tanto contra el serotipo del HRV del que se deriva el péptido, péptido de fusión o ácido nucleico incluido en la composición inmunogénica de la invención (es decir "respuesta inmunitaria celular contra el serotipo homólogo"), y contra al menos un segundo serotipo del HRV diferente del serotipo del HRV del que se deriva el péptido, péptido de fusión o ácido nucleico incluido en la composición inmunogénica de la invención (es decir, "respuesta inmunitaria celular contra el serotipo heterólogo").

Por lo tanto, en una realización, el péptido, el péptido de fusión y/o el ácido nucleico de la composición inmunogénica de la invención inducen una respuesta inmunitaria celular tanto a serotipos homólogos como heterólogos de rinovirus, como se ha definido anteriormente.

Más en particular, puede inducirse una respuesta inmunitaria tanto contra el serotipo del HRV del que se deriva el péptido, el péptido de fusión o el ácido nucleico incluido en la composición inmunogénica de la invención, como contra al menos un segundo serotipo del HRV que es de un grupo diferente del serotipo del HRV del que se deriva el péptido, el péptido de fusión o el ácido nucleico incluido en la composición inmunogénica de la invención. En otras palabras, la composición inmunogénica de la invención puede inducir una respuesta inmunitaria reactiva intergrupal.

En una realización particular, el péptido, el péptido de fusión y/o el ácido nucleico de la composición inmunogénica de la invención se derivan de un serotipo de rinovirus de tipo A, en particular de HRV16, HRV29 o HRV1B, y se induce una respuesta inmunitaria contra el mismo serotipo de rinovirus de tipo A y al menos otro serotipo de rinovirus de tipo A y/o de tipo B, en particular HRV14.

En otra realización particular, el péptido, el péptido de fusión y/o el ácido nucleico de la composición inmunogénica de la invención se derivan de una cepa de rinovirus de tipo B, en particular de HRV14, y se induce una respuesta inmunitaria contra el mismo serotipo de rinovirus de tipo B y al menos otro serotipo de rinovirus de tipo B y/o de tipo A, en particular HRV16, HRV29 y/o HRV1B.

En otra realización particular, el péptido, el péptido de fusión y/o el ácido nucleico de la composición inmunogénica de la invención proceden de una cepa de rinovirus de tipo A o de tipo B de grupo mayor, en particular de HRV16 o HRV14, y se induce una respuesta inmunitaria contra la misma cepa de rinovirus de tipo A o de tipo B del grupo mayor y al menos otra cepa de rinovirus de tipo B o de tipo A del grupo menor, en particular HRV1B y/o HRV29, y/o al menos otra cepa de rinovirus de tipo A o de tipo B del grupo mayor.

Por consiguiente, la respuesta inmunitaria celular inducida por una composición inmunogénica de la invención supera la "barrera intergrupal" entre los rinovirus, ya que está dirigida al menos contra los serotipos de los rinovirus humanos de tipo A y de tipo B.

Las composiciones inmunogénicas de acuerdo con la invención son, por lo tanto, capaces de inducir una respuesta inmunitaria mediada por células de reactividad cruzada contra varios serotipos del HRV, que también puede considerarse como una respuesta inmunitaria mediada por células intergrupal.

En una realización particular, la respuesta inmunitaria mediada por células inducida por la administración de las composiciones inmunogénicas de la invención se potencia tras la infección por un rinovirus.

En el contexto de la invención, la expresión " respuesta inmunitaria mediada por células se potencia tras la infección por un rinovirus" significa la inducción de una respuesta inmunitaria mediada por células específicas de reacción cruzada tras la infección por rinovirus de sujetos ya inmunizados con una composición inmunogénica de la invención.

Aunque el péptido, el péptido de fusión y el ácido nucleico incluidos en la composición inmunogénica de acuerdo con la invención fueron diseñados por los inventores para inducir una respuesta inmunitaria mediada por células T, el auxiliar de células T también puede contribuir al desarrollo de una respuesta inmunitaria humoral eficaz. Los inventores también estudiaron el efecto de la inmunización con la composición inmunogénica de la invención sobre la respuesta inmunitaria humoral a la infección posterior con un rinovirus para determinar si las respuestas inmunitarias mediadas por células T inducidas por la inmunización podrían mejorar indirectamente este aspecto de la inmunidad.

Los presentes inventores demostraron que, si bien la sola administración de las composiciones inmunogénicas de la invención a un sujeto inducía una respuesta de anticuerpos no neutralizantes de reacción cruzada, permitía ventajosamente inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes específicos cuando se producía una infección por rinovirus en dicho sujeto. Además, la eliminación de la infección por rinovirus fue muy rápida.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes específicos en un mamífero cuando dicho mamífero está infectado por un rinovirus, que comprende administrar a un mamífero una cantidad eficaz de una composición inmunogénica como se define en la sección"Composición inmunogénica"del presente documento.

La presente invención se refiere además a una composición inmunogénica como se define en la sección"Composiciones inmunogénicas"del presente documento, para su uso en un mamífero (es decir, en seres humanos) para inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes específicos cuando dicho mamífero está infectado por un rinovirus.

La presente invención también se refiere al uso de un péptido como se define en la sección"Péptidos"del presente documento o un ácido nucleico como se define en la sección"Ácidos nucleicos"del presente documento, para la fabricación de una composición inmunogénica destinada a inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes específicos en un mamífero cuando dicho mamífero está infectado por un rinovirus.

En el contexto de la invención, un "anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo que impide que se produzca el ciclo de replicación de los rinovirus en las células permisivas de un sujeto. Las células permisivas son células que permiten la penetración y la multiplicación del virus. En el contexto de la invención, las células pulmonares son altamente permisivas a la infección por rinovirus.

En una realización particular, la composición inmunogénica, tal como se define en la sección"Composiciones inmunogénicas"del presente documento, se utiliza en un mamífero para inducir una respuesta inmunitaria específica mediada por células de reacción cruzada contra al menos dos serotipos de rinovirus, seguida de una respuesta específica de anticuerpos neutralizantes cuando dicho mamífero es infectado por dichos rinovirus.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden así administrarse para tratamientos profilácticos ("de protección cruzada"). En aplicaciones profilácticas, las composiciones inmunogénicas pueden administrarse a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) con susceptibilidad aumentada a la infección por el HRV. Las composiciones inmunogénicas de la invención se administrarán a un sujeto en una cantidad suficiente para acelerar la eliminación del virus, reducir o prevenir la aparición de la enfermedad clínica o subclínica o evitar las complicaciones víricas asociadas al virus infeccioso en el organismo, en particular en los pulmones.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para acortar o prevenir la infección por rinovirus en un mamífero, y/o para reducir o prevenir los síntomas clínicos asociados con la infección en un mamífero, que comprende administrar a un mamífero una cantidad eficaz de una composición inmunogénica como se define en la sección''Composición inmunogénica"del presente documento.

La presente invención se refiere además a una composición inmunogénica como se define en la sección"Composición inmunogénica"del presente documento para su uso para acortar o prevenir la infección por rinovirus en un mamífero y/o para reducir o prevenir los síntomas clínicos asociados con la infección.

La presente invención también se refiere al uso de un péptido como se define en la sección"Péptidos"del presente documento o un ácido nucleico como se define en la sección "Ácidosnucleicos"del presente documento, para la fabricación de una composición inmunogénica destinada a acortar o prevenir la infección por rinovirus en un mamífero y/o reducir o prevenir los síntomas clínicos asociados con la infección.

Dado que la composición inmunogénica de la invención protege al menos hasta cierto punto contra la infección por rinovirus, es por tanto adecuada para su uso como vacuna para prevenir la infección por rinovirus.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "vacuna" se refiere a una composición inmunogénica destinada a provocar una respuesta inmunitaria con el fin de establecer una inmunidad protectora total o parcial frente a una enfermedad, en particular frente a una enfermedad infecciosa.

Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la cantidad de dosificación y el régimen adecuados. La composición inmunogénica puede administrarse una sola vez, pero generalmente se utiliza un régimen de cebado/refuerzo. Usualmente se administran al sujeto al menos una o dos dosis de refuerzo después de la dosis de cebado. El intervalo de tiempo entre cada inmunización puede variar de acuerdo con el sujeto a inmunizar u otros factores como la formulación o la vía de administración de la composición inmunogénica, pero usualmente se respeta un intervalo de tiempo de al menos 15 días, al menos un mes, al menos dos meses o al menos seis meses entre cada inmunización.

La cantidad eficaz de la composición inmunogénica de la invención aplicada a mamíferos (por ejemplo, seres humanos) puede ser determinada por los expertos en la técnica teniendo en cuenta las diferencias individuales de edad, peso, integridad del sistema inmunitario y similares, de manera que produzca el efecto deseable en el sujeto inmunizado, que es al menos el acortamiento de la infección vírica y/o la disminución de los síntomas clínicos en el individuo infectado.

La administración de una composición inmunogénica de la presente invención a un mamífero puede llevarse a cabo utilizando cualquiera de las diversas técnicas conocidas por los expertos en la técnica. La composición puede procesarse de acuerdo con métodos farmacéuticos convencionales para producir agentes medicinales para su administración a pacientes, incluidos seres humanos y otros mamíferos.

Como se ha mencionado anteriormente, la composición inmunogénica puede administrarse por vía intranasal (por ejemplo, por inhalación en aerosol o gotas nasales), parenteral (por ejemplo, por vía intramuscular, subcutánea o intravenosa, intradérmica, transcutánea, transdérmica o percutánea), cutánea, oral, mucosa, intrapulmonar y/o por administración intratraqueal y/o por aplicación tópica, en formulaciones de unidades de dosificación.

Aunque las composiciones de la invención pueden administrarse como único agente farmacéutico activo, también pueden usarse en combinación con una o más composiciones o agentes (es decir, otras dianas inmunogénicas, moléculas coestimuladoras). Cuando se administran como combinación, los componentes individuales pueden formularse como composiciones separadas administradas al mismo tiempo o en momentos diferentes, o los componentes pueden combinarse como una única composición.

La presente invención se ilustrará con más detalle mediante las siguientes figuras y ejemplos.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un conjunto de histogramas que representan el número de células productoras de IFN-y (panel A) y de IL-5 (panel B) (/106 células), enumeradas por ELISPOT en esplenocitos de ratones inmunizados por vía subcutánea con la proteína VPo de HRV16 (VPo RV16) o con tampón, con o sin adyuvante IFA/CpG (IFA/Cpg), tras la estimulación de los esplenocitos con VP0 de HRV1B (VP0 RV1B) o de HRV14 (VP0 RV14) o con grupos de péptidos 3'Pol de<h>R<v>1B (3'Pol RV1B) o de HRV14 (3'Pol R<v>14), recolectándose los esplenocitos 28 días después de la inmunización.

n = 10 ratones/grupo. *** : p<0.001, ** : p<0.01.

La Figura 2 es un conjunto de histogramas que representan el nivel de IFN-<y>(panel A) e IL-5 (panel B) en sobrenadante (pg/ml), medido mediante matriz de perlas citométrica en esplenocitos de ratones inmunizados por vía subcutánea con la proteína VPo de HRV16 (VPo RV16) o tampón, con o sin adyuvante IFA/CpG (IFA/Cpg), tras la estimulación de los esplenocitos con VP0 de HRV1B (VP0 RV1B) o de HRV14 (VP0 RV14) o grupos de péptidos 3'Pol de HRV1B (3'Pol RV1B) o de HRV14 (3'Pol RV14); los esplenocitos se recolectaron 28 días después de la inmunización.

n = 10 ratones/grupo. *** : p<0.001, ** : p<0.01.

La figura 3 es un gráfico que representa el número de linfocitos (*105) en el lavado broncoalveolar (BAL), en ratones inmunizados subcutáneamente con la proteína VPo de HRV16 más el adyuvante IFA/CpG (inmunizados), o sólo con el adyuvante IFA/CpG (adyuvante), y desafiados intranasalmente con HRV1B (grupo RV-inmunizado (■) y grupo RV-adyuvante (□)) o desafiados de forma simulada con PBS (grupo PBS-inmunizado (°)), los linfocitos fueron contados por ensayo de cytospin. *** : p<0.001.

La Figura 4 es un conjunto de gráficos que representan el número de células T CD4+ (panel A) (*104) o células T CD8+ (panel B) (*106) en BAL o pulmón, en ratones inmunizados subcutáneamente con la proteína VPo de HRV16 más adyuvante IFA/CpG (inmunizados), o sólo con adyuvante IFA/CpG (adyuvante), y desafiados intranasalmente con HRV1B (grupo RV-inmunizado (■) y grupo RV-adyuvante (□)) o desafiados de manera simulada con PBS (grupo PBS-inmunizado (°)). *** : p<0.001; ** : p<0.01.

La Figura 5 es un conjunto de histogramas que representan el porcentaje de células T CD4+ (panel A) o células T CD8+ (panel B) en BAL o pulmón que expresan el marcador de activación temprana CD69, en ratones inmunizados subcutáneamente con la proteína HRV16 VP0 más adyuvante IFA/CpG (inmunizados), o sólo con adyuvante IFA/CpG (adyuvante), y desafiados intranasalmente con HRV1B (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) o desafiados de manera simulada con PBS (grupo PBS-inmunizado). *** : p<0.001; ** : p<0.01; * : p<0.05.

La figura 6 es un conjunto de histogramas que representan el nivel de proteína CXCL10/IP-10 (ng/ml) en BAL, en ratones inmunizados subcutáneamente con proteína HRV16 VP0 más adyuvante IFA/CpG (inmunizados), o sólo con adyuvante IFA/CpG (adyuvante), y desafiados intranasalmente con HRV1B (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) o desafiados de manera simulada con PBS (grupo PBS-inmunizado). *** : p<0.001.

La Figura 7 es un conjunto de histogramas que representan los niveles (copias/pl) de ARNm de IFN-<y>(panel A) e IL-4 (panel B) del tejido pulmonar, medidos mediante qPCR de Taqman, en ratones inmunizados subcutáneamente con la proteína HRV16 VP0 más IFA/CpG (inmunizados) o sólo con IFA/CpG (adyuvante) y desafiados intranasalmente con HRV1B (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) o desafiados de manera simulada con PBS (grupo PBS-inmunizado). *** : p<0.001; ** : p<0.01.

La Figura 8 es un conjunto de histogramas que representan los niveles (pg/ml) de IFN-y BAL medidos mediante ELISA, en ratones inmunizados subcutáneamente con la proteína HRV16 VP0 más FA/CpG (inmunizados) o sólo con IFA/CpG (adyuvante) y desafiados intranasalmente con HRV1B (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) o desafiados de manera simulada con PBS (grupo PBS-inmunizado). *** : p<0.001.

La Figura 9 es un conjunto de histogramas que representan el número de células productoras de IFN-y (/104 células), enumeradas por ELISPOT, en ratones inmunizados subcutáneamente con la proteína HRV16 VP0 más IFA/CpG (inmunizados) o sólo con IFA/CpG (adyuvante) y desafiados intranasalmente con HRV1B (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) o desafiados de manera simulada con PBS (grupo PBS-inmunizado), tras la incubación de células pulmonares (recolectadas 6 días después de la infección) de los 3 grupos distintos de ratones con los estímulos indicados. *** : p<0.001.

La Figura 10 es un gráfico que representa el número de linfocitos BAL (x105), contados por ensayo de cytospin, en ratones inmunizados subcutáneamente con la proteína HRV16 VP0 más IFA/CpG (inmunizados) o con el adyuvante IFA/CpG solamente (adyuvante) y desafiados intranasalmente con un HRV más distante, HRV29 (grupo RV-inmunizado (■) y grupo RV-adyuvante (□)) o desafiado con PBS (grupo PBS-inmunizado (°)). *** : p<0.001; ** : p<0.01.

La Figura 11 es un conjunto de gráficos que representan el número de células T CD3+CD4+ totales (*106) (panel A) y de células T CD3+CD4+ que expresan CD69 (*106) (panel B) en tejido pulmonar, contadas por citometría de flujo, en ratones inmunizados subcutáneamente con la proteína HRV16 VP0 más IFA/CpG (inmunizados) o sólo con el adyuvante IFA/CpG (adyuvante) y desafiados intranasalmente con un HRV más distante, HRV29 (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) o desafiados de manera simulada con PBS (grupo PBS-inmunizado). *** : p<0.001; * : p<0.05.

La Figura 12 es un conjunto de gráficos que representan el número de células T CD3+CD4+ totales (*106) (panel A) y de células T CD3+CD4+ que expresan CD69 (*105) (panel B) en BAL, contadas por citometría de flujo, en ratones inmunizados por vía subcutánea con la proteína HRV16 VP0 más IFA/CpG (inmunizados) o sólo con el adyuvante IFA/CpG (adyuvante) y desafiados por vía intranasal con un HRV más distante, HRV29 (grupo RV-inmunizado (■) y grupo RV-adyuvante (□)) o desafiados de manera simulada con PBS (grupo PBS-inmunizado (°)). *** : p<0.001; * : p<0.05.

La Figura 13 es un conjunto de histogramas que representan el número de células productoras de IFN-y (/105 células), enumeradas por ELISPOT, en ratones inmunizados subcutáneamente con la proteína HRV16 VP0 más IFA/CpG (inmunizados) o sólo con el adyuvante IFA/CpG (adyuvante) y desafiados intranasalmente con un HRV, HRV29 (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) o desafiado con PBS (grupo PBS-inmunizado), después de la incubación de células pulmonares (ercolectadas 6 días después de la infección) de los 3 grupos distintos de ratones con los estímulos indicados. *** : p<0.001; * : p<0.05.

La Figura 14 es un conjunto de histogramas que representan el porcentaje de células T CD4+ (panel A) o CD8+ (panel B) productoras de IFN-y, medido por citometría de flujo, en células pulmonares en ratones inmunizados subcutáneamente con la proteína HRV16 VP0 más IFA/CpG (inmunizados) o sólo con el adyuvante IFA/CpG (adyuvante) y desafiados intranasalmente con un HRV más distante, HRV29 (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) o desafiados de manera simulada con PBS (grupo PBS-inmunizado), tras la estimulación de las células pulmonares con PMA e ionomicina. *** : p<0.001; ** : p<0.01.

La Figura 15 es un conjunto de histogramas que representan el porcentaje de linfocitos T CD4+ pulmonares CD44+ CD62L bajos o CD62L- (panel A) o el número de linfocitos T CD4+ pulmonares CD44+ CD62L bajos o CD62L- (*106) (panel B), medidos por citometría de flujo, en el día 14 post-infección, en ratones inmunizados por vía subcutánea con la proteína HRV16 VP0 más IFA/CpG (inmunizados) o sólo con el adyuvante IFA/CpG (adyuvante) y desafiados por vía intranasal con HRV29 (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) o desafiados de manera simulada con PBS (grupo PBS-inmunizado). * : p<0.05.

La Figura 16 es un conjunto de histogramas que representan el porcentaje de linfocitos T CD4+ de pulmón CD44+ CD62+ (panel A) o el número de linfocitos T CD4+ de pulmón CD44+ CD62+ (*106) (panel B), medidos por citometría de flujo, en el día 14 post-infección, en ratones inmunizados subcutáneamente con la proteína HRV16 VP0 más IFA/CpG (inmunizados) o sólo con el adyuvante IFA/CpG (adyuvante) y desafiados intranasalmente con un HRV más distante, HRV29 (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) o desafiados de manera simulada con PBS (grupo PBS-inmunizado). *: p<0.05.

La Figura 17 es un conjunto de gráficos que representan los niveles de IgG2c (panel superior) e IgG1 (panel inferior) que se unen específicamente a HRV1B en el suero de ratones inmunizados subcutáneamente bien con la proteína HRV16 VP0 más IFA/CpG (inmunizados) o con adyuvante IFA/CpG solo (adyuvante) y desafiados con HRV1B (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) o desafiados con PBS (grupo PBS-inmunizado), medidos por ELISA 6 días (panel izquierdo) y 14 días (panel derecho) después del desafío (OD a 450 nm).

La Figura 18 es un conjunto de gráficos que representan los niveles de IgG2c (panel superior) e IgA (panel inferior) que se unen específicamente a HRV1B en el BAL de ratones inmunizados subcutáneamente bien con la proteína HRV16 VP0 más IFA/CpG (inmunizados), o con adyuvante IFA/CpG solo (adyuvante) y desafiados con HRV1B (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) o desafiados con PBS (grupo PBS-inmunizado), medidos por ELISA 6 días (panel izquierdo) y 14 días (panel derecho) después del desafío (OD a 450 nm)..

La Figura 19 es un conjunto de gráficos que representan los niveles de IgG2c (panel superior) e IgG1 (panel inferior) que se unen específicamente al HRV29 en el suero de ratones inmunizados por vía subcutánea bien con la proteína HRV16 VP0 más IFA/CpG (inmunizados) o con adyuvante IFA/CpG solo (adyuvante) y desafiados con HRV29 (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) o desafiados con PBS (grupo PBS-inmunizado), medidos por ELISA 6 días (panel izquierdo) y 14 días (panel derecho) después del desafío (OD a 450 nm).

La Figura 20 es un conjunto de gráficos que representan los niveles de IgG2c (panel superior) e IgA (panel inferior) que se unen específicamente a la unión de HRV29 en el BAL de ratones inmunizados por vía subcutánea ya sea con la proteína VPo de HRV16 más IFA/CpG (inmunizados) o con adyuvante IFA/CpG solo (adyuvante) y desafiados con HRV29 (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) o desafiados con PBS (grupo PBS-inmunizado), medido por ELISA 6 días (panel izquierdo) y 14 días (panel derecho) después del desafío (OD a 450 nm).

La Figura 21 es un conjunto de gráficos que representan el nivel de anticuerpos neutralizantes contra HRV1B en sueros agrupados de ratones inmunizados subcutáneamente bien con la proteína VPo de HRV16 más IFA/CpG (inmunizados) o sólo con adyuvante IFA/CpG (adyuvante) y desafiados intranasalmente con HRV1B (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) o desafiados de manera simulada con PBS (grupo PBS-inmunizado), medidos mediante un ensayo de viabilidad celular con violeta cristal 6 días (panel izquierdo) y 14 días (panel derecho) después del desafío.

Línea de puntos superior: viabilidad celular de las células de control no infectadas sólo en presencia de suero. Líneas de puntos inferiores: viabilidad celular de las células de control infectadas sin suero.

Control ATCC: suero de cobaya que contiene anticuerpos neutralizantes contra HRV1B (referencia positiva).

Los puntos de datos representan sueros agrupados de 4 ratones/grupo de tratamiento.

La Figura 22 es un conjunto de gráficos que representan el nivel de anticuerpos neutralizantes contra HRV29 en sueros combinados de ratones inmunizados subcutáneamente con la proteína HRV16 VP0 más IFA/CpG (inmunizados), o sólo con el adyuvante IFA/CpG (adyuvante) y desafiados intranasalmente con HRV29 (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) o desafiados de manera simulada con PBS (grupo PBS-inmunizado), 6 días (panel izquierdo) y 14 días (panel derecho) después del desafío.

Línea de puntos superior: viabilidad celular de las células de control no infectadas sólo en presencia de suero. Líneas de puntos inferiores: viabilidad celular de las células de control infectadas sin suero.

Control ATCC: suero de cobaya que contiene anticuerpos neutralizantes contra el HRV29 (referencia positiva).

Los puntos de datos representan sueros agrupados de 4 ratones/grupo de tratamiento.

La figura 23 es un conjunto de histogramas que representan el número de copias de ARN del HRV en el tejido pulmonar (/pl de ADNc) de ratones inmunizados por vía subcutánea con la proteína VPo de HRV16 más IFA/CpG (inmunizados) o sólo con el adyuvante IFA/CpG (adyuvante) y desafiados por vía intranasal con HRV1B (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) los días 1, 4 y 6 después de la infección. n.d.: no detectado.

La figura 24 es un conjunto de histogramas que representan el número de copias de ARN del HRV en el tejido pulmonar (/pl de ADNc) de ratones inmunizados por vía subcutánea con la proteína VPo de HRV16 más IFA/CpG (inmunizados) o sólo con el adyuvante IFA/CpG (adyuvante) y desafiados por vía intranasal con HRV29 (grupo RV-inmunizado y grupo RV-adyuvante) los días 1, 4 y 6 después de la infección. n.d.: no detectado. *: p<0.05.

La Figura 25 es un conjunto de histogramas que representan el nivel de IFN-y (panel A) e IL-5 (panel B) en sobrenadante (pg/ml), medido mediante matriz de perlas citométrica en esplenocitos de ratones inmunizados por vía subcutánea con proteína 3'Pol de HRV16 (proteína 3'Pol 16) o tampón, con o sin adyuvante IFA/CpG (IFA/CpG), tras la estimulación de los esplenocitos con grupos de péptidos 3'Pol de HRV1B (grupo A y grupo B) o grupos de péptidos VPo de HRV1B (grupo C y grupo D), siendo recolectados los esplenocitos el día 28.

La Figura 26 es un conjunto de histogramas que representan el número de células productoras de IFN-y (/105 células), enumeradas por ELISPOT, en esplenocitos de ratones inmunizados subcutáneamente con la proteína 3'Pol de HRV16 (proteína 3'Pol 16) o tampón, con o sin adyuvante IFA/CpG (IFA/CpG), tras la estimulación de los esplenocitos con grupos de péptidos 3'Pol de HRV1B (grupo A y grupo B) o grupo de péptidos 3'Pol de HRV14 (grupo F), siendo recolectados los esplenocitos el día 28.

La Figura 27 es un conjunto de histogramas que representan el nivel de IFN-y (panel A) e IL-5 (panel B) en sobrenadante (pg/ml), medido mediante matriz de microesferas citométrica en esplenocitos de ratones inmunizados por vía subcutánea con VP-Pol de HRV1B (proteína VP-Pol 1B) o tampón, con o sin adyuvante IFA/CpG (IFA/CpG), tras la estimulación de los esplenocitos con grupos de péptidos 3'Pol de HRV1B (grupo A y grupo B) o grupos de péptidos VPo de HRV1B (grupo C y grupo D), siendo recolectados los esplenocitos el día 28.

La Figura 28 es un conjunto de histogramas que representan el número de células productoras de IFN-<y>(/105 células), enumeradas por ELISPOT en esplenocitos de ratones inmunizados por vía subcutánea bien con ADN 3'Pol de HRV14 (ADN 3'Pol 14), bien con Ad N VPo de HRV16 (ADN VPo 16) o con tampón, tras la estimulación de los esplenocitos con grupos de péptidos 3'Pol de HRV1B (grupo A y grupo B) o con grupo de péptidos 3'Pol de HRV14 (grupo F), o con grupos de péptidos VPo de HRV1B (grupo C y grupo D), siendo recolectados los esplenocitos el día 28.

La Figura 29 es un esquema que representa, en la parte superior, el ácido nucleico que codifica los diferentes dominios de la poliproteína h Rv , en particular el péptido VPo, y, en la parte inferior, el plásmido pET-SUMO que codifica el gen VPo del HRV16.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación de las secuencias conservadas

Este ejemplo describe la metodología desarrollada por los inventores para identificar las secuencias conservadas de poliproteínas de rinovirus adecuadas como antígenos que inducen una respuesta inmunitaria de reacción cruzada cuando se administran a un mamífero.

Material y métodos

El diseño se basó esencialmente en la conservación de la secuencia lineal entre los HRVs. Fue posible encontrar dentro de cada grupo de rinovirus, en particular rinovirus de tipo A y rinovirus de tipo B, dos regiones que se identificaron como antígenos candidatos: VPo (VP4 VP2) y el dominio C-terminal de la ARN polimerasa. También se diseñó una proteína de fusión que incluía la parte más conservada de estas dos regiones, intentando minimizar el número de antígenos a utilizar en la vacuna.

Se seleccionaron algunas cepas de HRV para evaluar la respuesta inmunitaria de los antígenos candidatos en ratones. Se seleccionaron como representativas de los diferentes grupos de rinovirus, como representativas de los diferentes serotipos existentes en un grupo dado de rinovirus, y como representativas del diferente uso del receptor por el rinovirus, para evaluar el grado de reactividad cruzada de la respuesta inmunitaria.

Las características de los serotipos seleccionados se indican en la tabla 1 a continuación:

Tabla 1: Características de los serotipos usados

Todas las secuencias se recuperaron de la base de datos Genbank del National Center for Biotechnology Information (NCBI) el 23 de agosto de 2007 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). En ese momento se recuperaron todas las secuencias poliproteicas completas disponibles.

Todas las secuencias se alinearon utilizando el algoritmo MUSCLE (Edgar (2004) Nucleic Acids Res. 32:1792-7). Se elaboró un árbol filogenético utilizando el método de máxima verosimilitud de la aplicación Seaview (Galtier et al. (1996) ComputAppl Biosci. 12:543-8). Se calcularon los valores Bootstrap para evaluar la solidez de los nodos. Se generó una secuencia de consenso global a partir de los alineamientos utilizando la aplicación Jalview (Clamp et al. (2004) Bioinformatics 20:426-7). Se calculó la frecuencia de variación en cada posición de aminoácido para determinar el nivel de conservación a lo largo de toda la poliproteína. Se elaboró un diseño secundario con el objetivo de minimizar el tamaño y el número de antígenos candidatos a utilizar en el proyecto. Se utilizaron las estructuras 3D disponibles de las proteínas estructurales (VP) y de la polimerasa 3d (P3D) para definir la posición de fusión más adecuada entre VP y P3D, teniendo en cuenta tanto el nivel de conservación como la conformación estructural de las dos subunidades.

Se lanzaron alineaciones de secuencias para todas las poliproteínas completas disponibles de HRV-A, HRV-B y HRV-A y -B juntas.

Se extrajeron secuencias de consenso global de cada alineamiento y se calculó la frecuencia de aparición de cada aminoácido principal. Los resultados se presentaron como una secuencia lineal del consenso global en la que se indicaba la frecuencia de cada posición y se coloreaba según su frecuencia. Esa representación proporcionó una manera fácil de visualizar las regiones más conservadas a lo largo de las poliproteínas de consenso.

El objetivo del presente estudio era identificar los dominios más conservados entre los rinovirus humanos para seleccionar las subregiones que se subclonarían para la expresión recombinante. Dado que sólo se persigue una respuesta reactiva cruzada de células T, cualquier parte de la poliproteína puede considerarse igualmente.

Como los péptidos de células T deben tener al menos 8 aminoácidos (aa) de longitud (para respuestas CD8), las regiones seleccionadas deben presentar tramos de identidad de al menos la misma longitud. Los péptidos CD4 tienen una longitud de 15 aa.

Partiendo en primer lugar de la alineación global de secuencias que incluía los virus de tipo A y de tipo B, los presentes inventores demostraron que los dominios variables y conservados eran casi los mismos en los dos tipos de virus. En consecuencia, las regiones seleccionadas estaban situadas en las mismas regiones en ambos tipos de virus.

Resultados

Secuencias de aminoácidos conservadas de tipo A

HRV-A VPo- La primera región seleccionada fue la parte N-terminal de la poliproteína "grande". Los aminoácidos [1-191] y los aminoácidos [243-297] de la secuencia de aminoácidos de la poliproteína "grande" parecían especialmente bien conservados entre los rinovirus de tipo A. Dado que la poliproteína VPo (que incluye VP4 y VP2), que consiste en la secuencia de aminoácidos [1-339], incluye estos dos dominios, se seleccionó el dominio que codifica VPo como primer antígeno candidato.

HRV-A3'pol- El extremo C-terminal de la poliproteína "grande" también mostró grandes porciones de secuencias muy bien conservadas entre los rinovirus de tipo A. Los últimos 363 aminoácidos fueron retenidos como un segundo candidato a antígeno recombinante. Consistían en la parte C-terminal de la ARN polimerasa del virus.

Antígeno de fusión HRV-A VP-Pol- Con el objetivo de reducir el número de antígenos, se elaboró un segundo diseño como fusión entre candidatos VPo y 3'pol. Ambas partes se acortaron para mantener un tamaño global del antígeno fácil de expresar, y la unión entre las dos partes se diseñó para preservar el plegamiento independiente de las dos regiones a fusionar.

La proteína VP4 se incluyó por completo en el nuevo diseño. La secuencia de VP2 se acortó por su parte C-terminal. Considerando la estructura 3D, la parte seleccionada de VP2 corresponde a un dominio relativamente independiente del resto de las VPs, evitando así restricciones de plegamiento tan importantes que podrían potencialmente perjudicar con la expresión y/o plegamiento recombinante. También se seleccionó la parada en un bucle flexible para facilitar la fusión con el dominio 3'pol que se añadiría en el C-terminal de la secuencia VP.

La secuencia VP4-2 diseñada representaba los primeros 135 aminoácidos N-terminales de la poliproteína VPo. Exactamente la misma región podría ser seleccionada para HRVs de tipo B.

En cuanto al dominio 3'pol, se utilizó el mismo enfoque. Se identificaron las estructuras 3D disponibles de HRV-1B (tipo A) y HRV-14 (tipo B). En cuanto a los VPs, las estructuras 3D del dominio 3'pol de HRV-1B y HRV-14 eran similares, y condujeron al diseño de péptidos correspondientes a la misma región en la ARN polimerasa de ambos serotipos.

A partir del diseño inicial, la parte C-terminal seleccionada de 3'pol se truncó a partir de su N-terminal. Teniendo en cuenta tanto la estructura 3D como el nivel de conservación, se seleccionaron los últimos 105 aminoácidos C-terminales.

HRV-A (1B, 16, 29) Secuencias utilizadas para clonación y expresión adicional- Prácticamente, las secuencias correspondientes a cada diseño se recuperaron de las cepas diana. Se añadieron secuencias adicionales para construir el marco de lectura abierto adecuado incluyendo todos los elementos requeridos en el sistema de expresión recombinante seleccionado (metionina N-terminal, codón de parada cuando era necesario, etiqueta y SUMO).

Las secuencias expresadas se enumeran en la Tabla 2 a continuación. Las secuencias clonadas reales se sintetizaron artificialmente introduciendo varias modificaciones en las secuencias de nucleótidos, como la optimización del uso de codones para la expresión recombinante enEscherichia coli.

Tabla 2: Secuencias expresadas

Secuencias de aminoácidos conservadas de tipo B

HRV-B VPo- Como se observó para la alineación del HRV tipo A, la región N-terminal de la poliproteína "grande" del HRV-B también está muy bien conservada. Siguiendo la misma estrategia, se seleccionó la secuencia VPo completa como primer candidato a antígeno del HRV-B.

HRV-B 3'pol- Como se observó para los HRV de tipo A, el extremo C-terminal de la poliproteína "grande" mostró grandes porciones de secuencias muy bien conservadas. Los últimos 365 aminoácidos fueron retenidos como un segundo candidato a antígeno recombinante. Consisten en la parte C-terminal de la ARN polimerasa del virus.

Antígeno de fusión HRV-B VP-Pol- De forma similar al diseño del antígeno de fusión HRV-A VP-Pol, ambas partes de los candidatos VPo y 3'pol se acortaron para mantener un tamaño de antígeno global fácil de expresar, y la unión entre las dos partes se diseñó para preservar el plegamiento independiente de las dos regiones a fusionar.

La secuencia VP4-2 diseñada representaba los primeros 135 aminoácidos N-terminales de la poliproteína VPo y se seleccionaron los últimos 105 aminoácidos C-terminales de 3'pol.

HRV-B (14)Secuencias utilizadas para clonación y expresión adicionales - La cepa B seleccionada en el presente estudio fue HRV-14.

Las secuencias que deben expresarse se enumeran a continuación en la Tabla 3.

Tabla 3: Secuencias expresadas

Ejemplo 2: Expresión y purificación de los antígenos conservados

Este ejemplo describe el protocolo utilizado para expresar y purificar los antígenos diseñados en el Ejemplo 1. Clonación y expresión

Se ha aplicado la misma estrategia de clonación para todas las proteínas recombinantes. En resumen, cada secuencia de nucleótidos respectiva se optimizó para la expresión enE. coliy se sintetizó (Geneart). También se diseñaron varios antígenos para ser expresados como un péptido recombinante fusionado a la etiqueta SUMO: el gen sintético clonado en marco con la secuencia SUMO en el sitio de clonación T/A del vector pET-SUMO se expresó a continuación utilizando el sistema de expresión pET-SUMO de Invitrogen.

A modo de ejemplo, el péptido VPo de HRV16 se expresó mediante BL21ADE3E. colitransfectada por el plásmido pET-SUMO que codifica el gen VPo de HRV-16. La condición óptima de crecimiento para la expresión de la proteína recombinante se obtuvo a 25°C bajo agitación (220 rpm) con el Sistema de Autoinducción Overnight Express 1 de Novagen (Figura 29).

Para la inmunización con ADN, cada secuencia de nucleótidos respectiva descrita en las tablas 2 y 3 se clonó en el plásmido pcDNA3.1 comercializado por Invitrogen. La expresión de la proteína se comprobó mediante transfección en células CHO y se analizó mediante transferencia blot utilizando un anticuerpo anti-histidina antes de la inyección en ratones.

Purificación

A pesar de la presencia de la etiqueta SUMO situada en el N-terminal, los diferentes péptidos recombinantes se expresaron en las fracciones insolubles como cuerpos de inclusión. Su purificación se realizó según las recomendaciones del fabricante (Invitrogen) adaptadas para péptidos insolubles.

En resumen, los péptidos fusionados con SUMO extraídos con tampón Tris/NaCl que contenía 8M de urea se cargaron en una columna de sefarosa de níquel (Pharmacia) para cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC). La purificación se realizó aplicando un gradiente de imidazol a la columna. Los péptidos recombinantes eluidos en las fracciones de 250 mM de imidazol se dializaron posteriormente contra un tampón de digestión (Tris 20 mM, NaCl 150 mM pH 8.0 que contenía 2M de urea) con el fin de escindir la fracción SUMO por la proteasa SUMO ULP-1.

La HRV 16 VPO obtenida después de la digestión por la proteasa SUMO ULP-1 se aplicó a una segunda columna de sefarosa de níquel para eliminar la fracción SUMO, la proteína no escindida y la etiqueta His que contenía la proteasa.

La VPo HRV 16 escindida obtenida tras el segundo paso de purificación se dializó adicionalmente contra tampón Tris/NaCl (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Arginina 0.5 M, pH 8.0) compatible con la experimentación animal.

El grado de pureza del péptido aislado medido por seguimiento en SDS-PAGE fue de aproximadamente 90%.

Ejemplo 3: Inmunogenicidad de los antígenos diseñados en ratones

Este ejemplo demuestra la inmunogenicidad de los péptidos y péptidos de fusión de la invención en ratones. Materiales y métodos

Vacunación

Ratones C57BL/6 de 7 semanas de edad fueron inmunizados por vía subcutánea (SC) en el cinturón escapular en el Día 0 y 21.

Cada ratón recibió 10 |jg de proteína HRV16 VP0 (VP16) en un volumen total de 200 j l en presencia o ausencia de adyuvante IFA/CpG (10 jg CpG 1826 (MWG Eurofins, Ebersberg, Alemania) 100 j l de adyuvante de Freund incompleto (IFA) por dosis inyectada).

Se utilizó como control negativo el tampón proteico (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Arginina 0.5 M pH 8.0) en presencia o ausencia de adyuvante IFA/CpG y se administró en grupos control de ratones de acuerdo con el mismo procedimiento.

Procesamiento de muestras

La sangre y los bazos se recolectaron el día 49 en viales Vacutainer (BD Vacutainer SST II Plus plastic serum tube BD, Le Pont-De-Claix, France), se mantuvieron toda la noche a 4°C y se centrifugaron 20 min a 1660 g para separar el suero de las células. Los sueros se conservaron a -20°C.

Los bazos se recolectaron en condiciones estériles después del sacrificio.

Transferencias Western

Las respuestas Anti-VPo de HRV16 IgG se analizaron por Transferencia Western a partir de sueros agrupados. La proteína VPo de HRV16 se mezcló con un tampón de desnaturalización que contenía Tampón de Muestra NUPAGE LDS a 2X (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 mM de Ditiotreitol (DTT) (SIGMA, St. Louis, MO) y agua; y se mantuvo durante 20 min a 95°C.

Se cargaron 2 jg de proteína en un gel de poliacrilamida SDS (NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 pocillos (Invitrogen), en Tampón de Ejecución de NuPAGE MES SDS (Invitrogen)). La migración se realizó durante 30 min a 200 V. Como marcador se utilizó SeeBluePlus2 Pre-Stained Standard (Invitrogen) de peso molecular.

La proteína se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) mediante transferencia semiseca en un tampón de transferencia NuPAGE (Invitrogen) durante 1 h a 65 mA y voltaje constante. Los sitios inespecíficos se bloquearon con solución salina tamponada con fosfato (PBS, Eurobio, Courtaboeuf, Francia), 0.05% de Tween 20 (VWR Prolabo Fontenay-sous-Bois, Francia) y 5% de leche desnatada en polvo (DIFCO, Becton Dickinson, Sparks, EE.UU.), 1 h a temperatura ambiente bajo agitación suave. La membrana de nitrocelulosa se incubó con sueros de ratón mezclados diluidos 1:200 en PBS-Tween 0.05% durante 1 h bajo agitación. Se añadió IgG antiratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson ImmunoResearch, Suffolk, Reino Unido) diluida 1:2000 en PBS-Tween 0.05% durante 1 h bajo agitación.

Las membranas se lavaron 3 veces (5 min) con PBS Tween 0.05% entre cada incubación.

La revelación colorimétrica se realizó con sustrato HRP, 4-cloro-1-naftol Opti-4CN (Bio-Rad) y se adquirió en GBox (Syngene).

ELISA

Las respuestas Anti-VPo de HRV16 IgG1 e IgG2a (o respuestas IgG2c en ratones C57Bl/6) se midieron por ELISA.

Se recubrieron microplacas Dynex de 96 pocillos (Dynex Technologies, Berlín, Alemania) con 100 ng por pocillo de VP16 en tampón carbonato de sodio 0.05 M, pH 9.6 (SIGMA, Saint Louis, MO), durante una noche a 4°C. Los sitios no específicos se bloquearon con 150 pl por pocillo de PBS pH 7.1, 0.05 % Tween 20, 1% de leche desnatada en polvo (DIFCO) 1 h a 37°C.

Los sueros diluidos en PBS-Tween 0.05 %, leche 1%, se dispensaron a 1:100 o 1:1000 en el primer pocillo de las placas, seguido de diluciones al doble en los siguientes pocillos.

Tras 1h30 de incubación a 37°C, las placas se lavaron 3 veces con PBS-Tween 0.05 %..

Las IgG1 e IgG2a VPo-específicas de HRV16 se detectaron utilizando IgG1-HRP de cabra anti-ratón, absorbida humana (Southern Biotech, Birmingham, AL) e IgG2a- o 2c-HRP de cabra anti-ratón, absorbida humana, (Southern Biotech, Birmingham, AL) diluidas 1:4000 en PBS-Tween 0.05 %, leche 1%, 1h30 a 37°C.

Las placas se lavaron y se incubaron con TetraMethylBenzidine TMB (Tebu-bio laboratories, Le Perray-en-Yvelines, Francia) 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente. La reacción colorimétrica se detuvo con 100 pl por pocillo de HCl 1M (VWR Prolabo Fontenay-sous-Bois, Francia) y se midió a 450 y 650 nm en un lector de placas Versamax (Molecular Devices).

Los valores en blanco (valores medios de los controles negativos) se restaron de los datos crudos (densidad óptica [OD] 450-650 nm).

Los títulos se calcularon con la función de tendencia y se expresaron en unidades ELISA arbitrarias (EU), que corresponden a la inversa de la dilución del suero que da una OD de 1.0.

Grupos de péptidos utilizados para la estimulación de esplenocitos

Se estimularon los esplenocitos con grupos de péptidos para monitorizar la secreción de citoquinas mediante ensayos CBA o ELISPOTs. Los péptidos corresponden a los dominios de reactividad cruzada identificados de HRV1B y HRV14.

Los péptidos fueron sintetizados y purificados por JPT (Berlín, Alemania). Los péptidos eran 15meros solapados sobre 11 aminoácidos. Cada péptido se solubilizó en DMSO (PIERCE, Thermo Fisher Scientific, Rockford, EE.UU.). La concentración de DMSO tuvo que ajustarse de forma que el porcentaje final de DMSO en los cultivos celulares fuera siempre inferior al 1% para evitar la toxicidad del DMSO en las células. Se constituyeron grupos de aproximadamente 40 péptidos que se mantuvieron congelados a -80°C hasta su utilización.

A continuación se presenta el contenido de los grupos de péptidos respectivos:

El grupo C estaba compuesto por péptidos de 15meros (péptidos 1 a 40), solapados sobre 11 aminoácidos, que cubrían los aminoácidos 1 a 171 de la proteína HRV1B VP0 de secuencia SEQ ID NO: 17, a una concentración de 50 pg/ml/péptido.

El grupo D estaba compuesto por péptidos de 15meros (péptidos 41 a 81), solapados sobre 11 aminoácidos, que cubrían los aminoácidos 172 a 332 de la proteína HRV1B VPo de secuencia SEQ ID NO: 17, a una concentración de 48.8 pg/ml/péptido.

El grupo A estaba compuesto por péptidos de 15meros (péptidos 1 a 44), solapados sobre 11 aminoácidos, que cubrían los aminoácidos 1 a 187 del péptido HRV1B 3'pol de secuencia SEQ ID NO: 18, a una concentración de 45.5 pg/ml/péptido.

El grupo B estaba compuesto por péptidos de 15meros (péptidos 45 a 89), solapados sobre 11 aminoácidos, que cubrían los aminoácidos 188 a 365 del péptido HRV1B 3'pol de secuencia SEQ ID NO: 18, a una concentración de 44.4 pg/ml/péptido.

El grupo E estaba compuesto por péptidos de 15meros (péptidos 41 a 80), solapados sobre 11 aminoácidos, que cubrían los aminoácidos 1 a 171 de la proteína HRV14 VP0 de secuencia SEQ ID NO: 8, a una concentración de 500 pg/ml/péptido.

El grupo F estaba compuesto por péptidos de 15meros (péptidos 123 a 164), solapados sobre 11 aminoácidos, que cubrían los aminoácidos 186 a 363 del péptido HRV14 3'pol de secuencia SEQ ID NO: 14, a una concentración de 476.2 pg/ml/péptido.

Medición de citoquinas mediante Matriz de Perlas Citométricas (CBA)

Los bazos se homogeneizaron manualmente con un émbolo de jeringa a través de un colador celular (BD Biosciences, San Jose, CA) y se trataron con tampón de lisis de glóbulos rojos Hybri Max (SIGMA, Saint Louis, MO) para lisar los glóbulos rojos. Las células se lavaron 2 veces con medio RpMI 1640 con HEPES (Gibco, Paisley, Reino Unido), suplementado con un 2% de suero de ternera fetal descomplementado (FCS) (HYCLONE Hyclone, Logan, UT), 50 pM de 2-mercaptoetanol (Gibco), 2 mM de L-Glutamina (Gibco) y 100 unidades/mL de Penicilina-Estreptomicina (Gibco). Las células se contaron en un Multisizer y se resuspendieron en medio completo con medio RPMI 1640 (Gibco), suplementado con un 10% de FCS descomplementado (HYCLONE), 50 pM de 2-mercaptoetanol (Gibco), 2 mM de L-Glutamina (Gibco) y 100 unidades/mL de Penicilina-Esteptomicina (Gibco). Se distribuyeron 4*105 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano (BD Biosciences, San Jose, CA) y se estimularon con los grupos de péptidos correspondientes a los diferentes antígenos HRV1B o HRV14 probados: HRV1B 3'Pol, HRV14 3'Pol, HRV1B VP0 y HRV14 VP0. Se utilizaron grupos de péptidos a 1 pg/ml para cada péptido. La concanavalina A (SIGMA) se utilizó a 2.5 pg/mL como control de estimulación positivo.

Después de 3 días de estimulación a 37°C, 5% CO2, se recolectaron los sobrenadantes y se congelaron a -80°C hasta su análisis.

Las concentraciones de IL-2, IL-4, IL-5, TNF-a e IFN-y se midieron utilizando el kit de citoquinas Th1/Th2 de ratón de matriz de perlas citométrica (CBA) (BD Biosciences, San Diego, CA). Las muestras se analizaron utilizando FACS Facscalibur (Becton Dickinson). Los datos se analizaron con el software FCAP Array (Becton Dickinson).

ELISPOTs de citoquinas

Los esplenocitos se recolectaron y prepararon como se ha descrito anteriormente.

Se distribuyeron 2*105 células por pocillo y se estimularon con los grupos de péptidos descritos anteriormente, y con IL-2 murina a 20 U/ml en placas de 96 pocillos multiscreenHTS HA éster de celulosa, 0.45 pM (Millipore, Bedford, MA). Se utilizó concanavalina A (SIGMA) a 2.5 pg/mL como control de estimulación positivo. Las placas se recubrieron previamente durante la noche a 4 °C con anticuerpo IFN-y anti-ratón de rata (BD Pharmingen, San Diego, CA) o con anticuerpo IL-5 anti-ratón de rata (BD Pharmingen) a 1 pg por pocillo en PBS 1X estéril, y se bloquearon 1 h a 37 °C en medio completo. La estimulación de los esplenocitos se realizó 18 h a 37°C, 5% de CO2.

Las placas se lavaron 3 veces con PBS 1X y luego 3 veces con PBS-Tween 0.05%. Se distribuyeron anticuerpos anti-ratón IFN-<y>o IL-5 biotinilados de rata (BD PharMingen) a 100 ng por pocillo en PBS-Tween 0.05%, 2 h a 20°C, en la oscuridad.

Las placas se lavaron 3 veces con PBS-Tween 0.05% y se incubaron con estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (Southern Biotech) en PBS-Tween 0.05%, 1 h a 20°C, en la oscuridad.

A continuación, las placas se lavaron 3 veces con PBS Tween 0.05%, y luego 3 veces con PBS 1X.

Se añadió solución de sustrato (3-amino-9-etilcarbazol, AEC) 15 min a 20°C en la oscuridad para revelar las manchas. La reacción se detuvo con agua. La solución de sustrato AEC se preparó mezclando 9 ml de agua destilada, 1 ml de tampón acetato, 0.250 ml de AEC (SIGMA) y 5 pl de H2O2, filtrando después la solución a 0.22 pm. Cada mancha correspondiente a una célula secretora de IFN-y o IL-5 se enumeró con un lector ELISPOT automático. Se restaron los valores de fondo de los controles negativos. Los resultados se expresaron como número de manchas de IFN-y o IL-5 por 106 esplenocitos.

Resultados

Respuesta de anticuerpos contra VP0 de HRV16

Los inventores evaluaron primero la inmunogenicidad de la proteína VPo de HRV16 administrada por vía subcutánea. El análisis de las respuestas de anticuerpos mediante Transferencia Western mostró que la IgG específica de la VPo de HRV16 era detectable en el suero 28 días después de la inmunización. En ratones tratados únicamente con la proteína VPo, se detectaron IgG1 e IgG2c específicas de VPo, isotipos de IgG asociados a Th2 y Th1 respectivamente.

Con la hipótesis de que una respuesta inmunitaria orientada a Th1 podría ser beneficiosa para el resultado de la infección por rinovirus, los inventores intentaron inducir una respuesta sesgada Th1 a VPo de HRV16 utilizando una combinación de adyuvantes de Freund incompleto (IFA) y CpG (IFA/CpG). La adición de IFA/CpG al inmunógeno cambió la respuesta de anticuerpos hacia una respuesta IgG2c sustancialmente más prominente.

Respuestas celulares contra VPo de HRV16

Habiendo establecido que la VPo de HRV16 es inmunogénica en ratones, los inventores evaluaron a continuación la respuesta de las células T a la inmunización midiendo la producción de citoquinas por los esplenocitos en respuesta a la estimulación con péptidos VPo (o polimerasa de control).

La estimulación con péptidos de polimerasa viral de control no indujo la producción de citoquinas. Tanto en los ensayos ELISPOT (Figura 1) como en los de matriz de perlas citométricas (Figura 2), la estimulación con el grupo de péptidos VPo indujo la producción de IL-5, o tanto de IL-5 como de IFN-<y>respectivamente, en células de ratones inmunizados con proteína VPo sola, lo que indica una respuesta orientada Th2 o mixta Th1/Th2. La adición del adyuvante IFA/CpG al inmunógeno provocó una supresión casi completa de la IL-5 y un aumento sustancial de las respuestas IFN-<y>. Es importante señalar que los esplenocitos de ratones inmunizados con la proteína VPo del HRV16 del grupo mayor produjeron citoquinas cuando se les estimuló con un conjunto de péptidos VPo de una cepa heteróloga (HRVlB) de la misma especie (rinovirus de Tipo A) pero perteneciente al grupo menor y con un conjunto de péptidos VPo de una cepa (HRV14) perteneciente a otra especie (rinovirus de Ttipo B), lo que indica una reactividad de serotipos cruzados y entre grupos.

Por lo tanto, este ejemplo demuestra que la inmunización induce una respuesta inmunitaria específica del péptido y de serotipo cruzado.

Ejemplo 4: Resultado de desafíos con HRV en ratones inmunizados

Este ejemplo demuestra la potencia de las composiciones inmunogénicas de la invención para proteger contra la infección por rinovirus en ratones desafiados con rinovirus.

Materiales y métodos

Producción de rinovirus

Los serotipos 1B y 29 de rinovirus (HRV) (ATCC ref VR-1366 y VR-1139) se propagaron en células HeLa H1 (ATCC ref CRL-1958) que son altamente permisivas a la infección por rinovirus. Las células se infectaron durante 1 h a temperatura ambiente con agitación y se incubaron a 37°C hasta que se observó aproximadamente un 90% de efecto citopático (CPE). A continuación, se lavaron las células recolectadas, se resuspendieron en PBS estéril y se lisaron por congelación-descongelación repetida. Los restos celulares se precipitaron por centrifugación. El virus se precipitó con NaCl 0.5 M y polietilenglicol 6000 al 7% (p/v) (Fluka, Alemania). Tras nuevos lavados con PBS y filtración con un filtro de jeringa de 0.2 pM, el virus se concentró utilizando dispositivos de filtración ultracentrífuga Amicon (Millipore, EE.UU.).

Las reservas de HRV se obtuvieron originalmente de la American Type Tissue Culture Collection (ATCC) y se neutralizaron periódicamente con antisueros de referencia ATCC para confirmar el serotipo.

Se generó una preparación de lisado HeLa purificado como control para los ensayos ELISA de unión a virus. La purificación se realizó utilizando el mismo protocolo descrito para las reservas de RV, pero a partir de células HeLa H1 no infectadas.

El virus se tituló en células HeLa de Ohio (catálogo de la Health Protection Agency del Reino Unido ref 84121901) antes de su uso y se calculó la dosis infecciosa en cultivo tisular 50% (DICT50) utilizando el método de Spearman-Karber.

Protocolos in vivo

Ratones- Se adquirieron ratones C57BL/6 hembra de tipo salvaje (w/t), libres de patógenos específicos, de Harlan o Charles River UK y se alojaron en jaulas ventiladas individualmente.

Estudios de inmunización e infección en ratones C57BL/6 - En los días 0 y 21 w/t se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía subcutánea con 100 pl de emulsión que contenía 10 pg de proteína VPo de HRV16, 10 pl de oligonucleótido CpG (100 pM ODN 1826; Invivogen, EE.UU.), y 40 pl de adyuvante de Freund incompleto (IFA) (Sigma-Aldrich) en PBS estéril (laboratorios PAA), o adyuvante IFA/CpG solo, o PBS solo. En el día 51, los ratones fueron desafiados intranasalmente con 5*106 TCID50 de HRV1B o HRV29, o desafiados de manera simulada con 50 pl de PBS. Los protocolos llevados a cabo en los distintos grupos de ratones se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4: Protocolos

Los ratones fueron sacrificados mediante anestesia terminal con pentobarbitona en varios puntos temporales durante los 14 días siguientes al desafío intranasal. En un experimento inicial, se "inmunizó" a los ratones con PBS como control (grupo RV-PBS en la tabla 4) para evaluar los efectos del tratamiento adyuvante solo (RV-adyuvante en la tabla 4). No se observaron diferencias en los resultados entre los grupos RV-adyuvante y RV-PBS en ninguno de los análisis de punto final. Por lo tanto, el grupo RV-PBS no se incluyó en los estudios posteriores y no se muestran datos de este grupo de ratones.

Recolección y procesamiento de tejidos

Lavado broncoalveolar (BAL) - Se lavaron los pulmones a través de la tráquea con 1.5 ml de líquido BAL (PBS, 55 mM de EDTA disódico (Gibco), 12 mM de clorhidrato de lidocaína monohidrato (Sigma-Aldrich)) y se separaron las células por centrifugación de acuerdo con el método descrito por Bartlett & Walton (2008) Nature Medicine 14:199-204.

Los glóbulos rojos se lisaron utilizando el tampón ACK (0.15 M NH4 Cl, 1.0 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA en dH2O) y las células se almacenaron en medio RPMI 1640 (laboratorios PAA) (conteniendo 10% FCS, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina (P/S)).

Células de tejido pulmonar para ensayos de citometría de flujo - Se incorporó tejido pulmonar en un tampón de digestión (medio RPMI 1640, P/S, 1 mg/ml de colagenasa tipo XI (Sigma-Aldrich), 80 U/ml de DNasa pancreática bovina tipo I (Sigma-Aldrich)), se homogeneizó en crudo utilizando el disociador de tejidos gentleMACS (Miltenyi Biotech) y se incubó a 37°C durante 45 min. Tras la homogeneización para generar una suspensión unicelular, los glóbulos rojos se lisaron mediante la adición de tampón ACK. A continuación, las células se filtraron a través de un colador celular de 100 pm, se lavaron con PBS y se resuspendieron en medio RPMI 1640 suplementado con un 10% de FCS, P/S.

Tejido pulmonar para la extracción de ARN - Se extirpó un pequeño lóbulo superior del pulmón derecho y se almacenó en tampón de estabilización de ARN "RNA later" (Qiagen) a -80°C.

Sangre - Se recogió sangre de las arterias carótidas en tubos de separación de suero "microtainer" (BD biosciences). El suero se separó por centrifugación y se almacenó a -80°C hasta su análisis.

Ensayo de cytospin de células BAL

Las células BAL se centrifugaron en portaobjetos utilizando el sistema cytospin 3 (Shandon, EE.UU.) y se tiñeron con el kit Reastain Quick-diff (Reagena, Finlandia). Se contaron al menos 300 células por portaobjetos sin tener en cuenta las condiciones experimentales.

Citometría de flujo

Tinción de marcadores de superficie - La tinción de marcadores de superficie de linfocitos de pulmón y BAL se realizó utilizando protocolos estándar. En resumen, 1-10 * 105 células de pulmón o BAL se tiñeron con "kit de tinción de células muertas reparable vivo/muerto" (Invitrogen) durante 30 min a 4°C. A continuación, se lavaron las células y se incubaron con 5 pg/ml de anti-CD16/CD32 de ratón para bloquear la unión no específica a los receptores de FC. Se utilizaron anticuerpos conjugados directamente con fluorocromos específicos para CD3 (CD3-Pacific Blue; clon 500A2), CD4 (CD4-APC; clon RM4-5), CD8 (CD8-PE; clon 53-6.7), CD69 (CD69-FITC; clon H1.2F3), CD62L (CD62L-PE; clon MEL-14), CD44 (CD44-FITC; clon IM7) marcadores de células T, todos ellos adquiridos a BD biosciences, y las células se incubaron durante 30 minutos adicionales a 4°C. Tras varios lavados, las células se fijaron y se sometieron a incubación. Tras varios lavados, las células se fijaron con formaldehído al 2% durante 20 min a temperatura ambiente, se lavaron de nuevo, se resuspendieron en PBS 1% BSA y se almacenaron a 4°C.

Tinción intracelular de citoquinas - Para la tinción intracelular de citoquinas, las células pulmonares se tiñeron para detectar células muertas y marcadores de superficie, y se fijaron como se describe. Tras el lavado, las células se permeabilizaron con saponina al 0.5% (p/v) (Fluka) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron directamente anticuerpos anticitoquinas conjugados con fluorocromo en PBS al 0.5 % de saponina y las células se incubaron durante otros 30 min a 4°C. Las células se lavaron de nuevo, se resuspendieron en PBS al 1% de BSA y los datos se adquirieron inmediatamente.

Adquisición de datos- Los datos de citometría de flujo se adquirieron utilizando citómetros CyanADP (Dako, EE.UU.) o FACSCanto (BD biosciences) y se analizaron utilizando el software Summit v4.3 (Dako, EE.UU.).

Ensayo de inmunoprecipitación enlazado a enzima (ELISPOT)

IFN-ye IL-4- Las placas ELISPOT de 96 pocillos Multiscreen HA (Millipore) se recubrieron durante la noche a 4°C con 5 |jg/ml de anticuerpo purificado anti-ratón IFN-y o IL-4 (ambos BD biosciences) en PBS. Al día siguiente, se lavaron las placas y se bloquearon con medio RPMI 1640 suplementado con 10% FCS, P/S durante 3 h a 37°C. Se añadieron a cada pocillo 5*104 o 1*105 células pulmonares en 100 j l de medio RPMI 1640 suplementado con un 10% de FCS, P/S, seguido de 100 j l de medio que contenía diversos estímulos, tal como se describe en la tabla 5.

Tabla 5: Estímulos ELISPOT

Las placas se incubaron durante 3 días a 37°C. A continuación, las placas se lavaron con PBS 0.05% Tween 20 (PBS-T; Sigma-Aldrich) y posteriormente con agua estéril para lisar las células. A continuación se añadieron anticuerpos secundarios biotinilados, a 2 jg/m l en PBS 0.5% BSA, y se incubaron durante 2 h a 37°C. Tras los lavados, las placas se incubaron con Extravidina fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich) durante 45 min a temperatura ambiente y se lavaron con PBS-T seguido de PBS estéril. Se añadió el sustrato NBT/BCIP (Sigma-Aldrich) y se incubó durante 5 minutos más. Las reacciones se detuvieron mediante un lavado exhaustivo con agua del grifo.

Adquisición de datos - Todos los datos ELISPOT se adquirieron utilizando un lector EliSpot versión 3.5 de AID (AID GmbH, Alemania).

Inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA)

Citoquinas - Todas las proteínas citoquinas y quimioquinas se analizaron utilizando protocolos y reactivos de los kits Duoset ELISA (R&D systems) y Nunc Maxisorp Immunoplates (Thermo-Fisher). Todas las muestras se midieron por duplicado y los niveles de proteína se cuantificaron por comparación con una curva estándar de 8 puntos de proteína recombinante.

Inmunoglobulinas específicas del RV - Las IgG e IgA específicas del RV se midieron mediante ensayos internos. Para todos los ensayos, se recubrieron placas Nunc Maxisorp Immunoplates (Thermo-Fisher) con inóculo purificado de RV o lisado de control de HeLa a una concentración de proteína de 5 jg/m l y se incubaron durante la noche a 4°C. A continuación, las placas se lavaron con PBS y se bloquearon añadiendo PBS que contenía 0.05% de Tween 20 y 5% de leche en polvo (PBST-leche). A continuación, se añadieron suero o BAL diluidos en PBS al 5% de leche y las placas se incubaron durante toda la noche a 4°C. Cada dilución se analizó por duplicado. Las placas se lavaron con PBST y las inmunoglobulinas unidas se detectaron utilizando IgG1, IgG2a o IgA anti-ratón de rata biotiniladas (todas de BD biosciences) diluidas 1/1000 antes de añadir estreptavidinaperoxidasa (Invitrogen, Paisley UK). Por último, se añadió sustrato TMB (Invitrogen) y se detuvieron las reacciones añadiendo un volumen igual de H2SO4.

Para el análisis de IgA en BAL, se permitió que las muestras se mezclaran con perlas de sefarosa de proteína G (Sigma-Aldrich) durante la noche a 4°C. Tras la centrifugación para eliminar las perlas de sefarosa y la IgG unida, se retuvo la fracción no unida que contenía IgA y se utilizó en experimentos ELISA. El agotamiento de IgG en las muestras se confirmó mostrando la pérdida de unión a HRV mediante ELISA.

En todos los ensayos, la unión del anticuerpo a un control de lisado de HeLa se evaluó en la misma placa que la unión al inóculo de virus. Los valores del lisado de HeLa se restaron durante el análisis para mostrar la unión de anticuerpos específicos del virus.

Adquisición de datos - En todos los ensayos ELISA se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de placas Spectramax Plus y se analizó con el software Softmax Pro v5.2 (Molecular Devices).

Ensayos de neutralización

La neutralización de los serotipos del HRV se midió en células HeLa infectadas. Se mezclaron los sueros de un grupo de tratamiento y un punto temporal determinados después del desafío y se hicieron diluciones seriadas en medio DMEM suplementado con un 4% de FCS, P/S. Se introdujeron 50 pl de las diluciones seriadas que se iban a analizar (por duplicado) en pocillos de placas de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos, antes de añadir 50 pl de la cepa purificada de HRV en medio DMEM. El título apropiado del serotipo del HRV introducido en los pocillos se definió como la dilución de la cepa del HRV que produjo un efecto citopático (CPE) del 90% en 3 días. Las placas se incubaron a temperatura ambiente con agitación para formar complejos anticuerpo-antígeno. Después de 1 h, se añadieron 1.5 * 105 células HeLa de Ohio a cada pocillo y las placas se siguieron incubando durante 48-96 h a 37°C.

La CPE de HRV se midió mediante un ensayo de viabilidad celular con violeta cristal. Las placas se lavaron con PBS y se añadieron 100 pl de solución de violeta cristal al 0.1 % a cada pocillo y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se lavaron las placas con H2O destilada y se secaron al aire. Se añadieron 100 pl/pocillo de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1% y las placas se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 15 min o hasta que se hubiera disuelto todo el violeta cristal. La densidad óptica se midió a 560 nm.

PCR cuantitativa Taqman

Extracción de ARN - El tejido pulmonar se colocó en tampón RLT (Qiagen, EE.UU.) y se homogeneizó utilizando un homogeneizador rotor-estator. A continuación, se extrajo el ARN utilizando reactivos y protocolos del RNeasy Mini Kit (Qiagen), incluido el paso de digestión con DNasa en columna.

Transcripción inversa: el ADNc se generó en reacciones de 20 pl utilizando el kit Omniscript RT (Qiagen) y cebadores hexámeros aleatorios (Promega, EE.UU.). Todas las reacciones comprendían 1 pM de cebadores aleatorios, 0.5 mM (cada uno) de dNTPs y 0.2 U/pl de transcriptasa inversa. Las reacciones se realizaron a 37 °C durante 1 h.

PCR - Las reacciones de PCR cuantitativa (qPCR) se llevaron a cabo utilizando Quantitect Probe PCR Mastermix (Qiagen) y cebadores y sondas marcadas con FAM/TAMRA específicas para el gen de interés, el ARN ribosómico 18S o la región no traducida 5' del RV. Los cebadores y las sondas se describen en la tabla 6.

Tabla 6: Cebadores y sondas Taqman qPCR

Las condiciones de los ciclos fueron las siguientes: 2 min a 50°C, 10 min a 95°C y 45 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 minuto. Para el ensayo 18S, el ADNc se diluyó 1 en 100 en agua libre de nucleasas antes de añadirlo a la reacción.

Las reacciones se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real rápido 7500 (ABI).

Resultados

Tras los experimentos de inmunogenicidad, se evaluó el efecto de la inmunización con la proteína VPo de HRV16 adyuvada con IFA/CpG sobre la enfermedad inducida por HRV en el modelo de infección de ratones. Estos experimentos se llevaron a cabo para determinar si la inmunización previa podía inducir una respuesta Th1/Tc1 en las vías respiratorias de ratones infectados similar a la encontrada sistémicamente y para determinar el efecto de esto sobre los marcadores de enfermedad y la carga vírica.

La inmunización mejora la respuesta de las células T de las vías respiratorias a la infección con una cepa heteróloga de RV

Los inventores evaluaron el impacto de la inmunización con VPo de HRV16 en presencia de IFA/CpG sobre las respuestas inmunitarias observadas tras la provocación intranasal con un serotipo heterólogo de HRV (HRV1B).

La tinción diferencial de los leucocitos del lavado broncoalveolar (BAL) mediante el ensayo de citospin mostró que la inmunización aumentó significativamente la magnitud de la respuesta de los linfocitos a la infección en comparación con los ratones tratados con adyuvante e infectados (grupo RV-Adyuvante) (Figura 3).

Para caracterizar aún más esta respuesta linfocitaria, se analizaron las células T en el BAL y el pulmón mediante citometría de flujo. El número de células T CD4+ aumentó tanto en el BAL como en el pulmón, y el número de células T CD8+ aumentó en el BAL de ratones inmunizados e infectados (grupo RV-inmunizado) frente a ratones tratados con adyuvante e infectados (grupo RV-adyuvante) el día 6 post-infección (Figura 4). Esta respuesta estaba dominada por células T CD4+. En los ratones infectados, la inmunización también aumentó significativamente la proporción de células T del BAL y del pulmón que expresaban el marcador de activación temprana CD69 (Figura 5). También se observaron mayores niveles de la quimioquina de células T CXCL10 en el BAL en ratones inmunizados e infectados frente a ratones tratados con adyuvante e infectados (Figura 6).

La inmunización induce respuestas pulmonares Th1 específicas de antígeno frente a la infección

Los inventores también examinaron el efecto de la inmunización en la polaridad y especificidad de antígeno de las respuestas de células T después de un desafío heterólogo con el serotipo HRV1B. La inmunización aumentó significativamente los niveles de ARNm de citoquinas Th1 (IFN-<y>) y Th2 (IL-4) en el tejido pulmonar de ratones desafiados con HRV1B (Figura 7). En consonancia con el uso de adyuvantes promotores de Th1, esta respuesta estuvo dominada por IFN-y en el grupo de ratones RV-inmunizado. A nivel proteico, la IL-4 fue indetectable en el BAL de todos los grupos, mientras que el aumento de IFN-<y>se detectó a las 24 y 48 h post infección sólo en los ratones inmunizados y desafiados (grupo RV-inmunizado) (Figura 8).

Dado que la inmunización generó células específicas VP0 de reactividad cruzada en el bazo, los inventores determinaron si las células de memoria de reactividad cruzada eran reclutadas a las vías respiratorias después de la infección midiendo la producción de IFN-y por células pulmonares estimuladas con diferentes estímulos mediante ensayos ELISPOT. La frecuencia de células pulmonares productoras de IFN-<y>fue mayor en los ratones inmunizados y desafiados con RV (grupo RV-inmunizado) (Figura 9). La estimulación con la misma proteína que la utilizada para la inmunización (VP0 de HRV16), con un serotipo heterólogo vivo (HRV1B) o con grupos de péptidos heterólogos VPo de HRV1B o HRV14 indujo respuestas de IFN-y similares. Con la excepción de la estimulación con VPo de HRV16 en células de ratón tratadas con RV-adyuvante, la frecuencia de células productoras de IFN-<y>no fue significativa por encima de los controles no estimulados en otros grupos de tratamiento. Por lo tanto, la inmunización con VPo de HRV16 indujo respuestas cruzadas Th1/Tc1 en el pulmón en respuesta al desafío con HRV1B de una magnitud significativamente mayor que con la infección por HRV sola.

La inmunización aumenta la respuesta de las células T a la infección por un serotipo del HRV más distantemente relacionado

HRV16 y HRV1B pertenecen a diferentes grupos de unión a receptores, pero están altamente relacionados a nivel de aminoácidos dentro de VP0. Para determinar si la inmunización induce respuestas de reacción cruzada más amplias entre los rinovirus de tipo A, los inventores determinaron los efectos sobre las respuestas al desafío con el serotipo más distantemente relacionado, HRV29.

El análisis de células BAL mediante ensayo de cytospin reveló un mayor número de linfocitos en los ratones RV-inmunizado frente a los tratados con RV-adyuvante (Figura 10). El número total y activado de células T CD4+ en el tejido pulmonar (Figura 11) y BAL (Figura 12) también aumentó significativamente en comparación con los tratamientos de infección o inmunización solos. Cuando se estimularon los leucocitos pulmonares con antígenos del HRV en ensayos ELISPOT, la frecuencia de células productoras de IFN-y fue significativamente mayor tras la estimulación con el serotipo de desafío (HRV29) en ratones RV-inmunizado frente a ratones tratados con RV-adyuvante (Figura 13). Se observaron aumentos similares tras la estimulación con grupos de péptidos heterólogos HRV1B y HRV14 derivados de VPo, lo que indica de nuevo la presencia de respuestas inmunitarias mediadas por células de serotipos cruzados. También se demostró mediante citometría de flujo intracelular un aumento significativo de células T CD8+ productoras de IFN-y en los pulmones de ratones infectados e inmunizados (1 día después de la infección), seguido de un aumento de células T CD4+ productoras de IFN-<y>(6 días después de la infección), mientras que no se observó nada significativo en los otros grupos de ratones (grupos RV-adyuvante o PBS-inmunizado) (Figura 14). Esto sugiere que la respuesta inmunitaria mediada por células inducida por la composición de la invención está dominada por una respuesta Th1, pero también está implicada en menor medida una respuesta inmunitaria Tc1.

La inmunización mejora la generación de células T de memoria efectoras pulmonares

Las células T CD4+ activadas persistieron en los pulmones de los ratones inmunizados y desafiados en el día 14 post-infección (Figura 11). Para determinar si esto representaba una mayor generación de células T de memoria locales, los inventores analizaron mediante citometría de flujo la expresión de marcadores de memoria en las células T CD4+ pulmonares. La proporción de células T CD4+ que expresaban el fenotipo CD44+CD62Lbajo (marcador de memoria efector) fue significativamente mayor en el grupo de ratones RV-inmunizado en comparación con los otros grupos (grupos RV-adyuvante o PBS-inmunizado). Por otro lado, la proporción de células T CD4+ de pulmón que expresaban un fenotipo de memoria central, CD44+CD62Lalto, no aumentó en el grupo de ratones RV-inmunizado (Figuras 15 y 16).

La inmunización aumenta las respuestas de anticuerpos neutralizantes frente a la infección por virus heterólogos

Los inventores también estudiaron el efecto de la inmunización en la generación de respuestas inmunitarias humorales midiendo la capacidad de las inmunoglobulinas del suero y del BAL para unirse y neutralizar la actividad del rinovirus.

Los ensayos de unión ELISA mostraron que la inmunización con VPo de HRV16 en ausencia de desafío indujo anticuerpos de unión cruzada HRV29 y HRV1B observados en el suero pero no en el BAL (Figuras 17-20).

Cuando fue seguida por un desafío con HRV1B o HRV29, la inmunización generó una respuesta de anticuerpos de reactividad cruzada más rápida y mayor observada tanto en el suero como en el BAL.

Mientras que la inmunización con VPo de HRV16 sin un desafío por rinovirus no indujo anticuerpos neutralizantes, se observó una inducción más rápida y mayor de anticuerpos neutralizantes cuando la inmunización con VPo de HRV16 fue seguida de un desafío por rinovirus. La inducción de anticuerpos neutralizantes contra la cepa/serotipo del rinovirus infectante se observó de forma consistente en el grupo de ratones inmunizados (RV-inmunizado), mientras que se observó de forma inconsistente en el grupo de ratones tratados con adyuvante (RV-adyuvante). Además, la producción de anticuerpos neutralizantes fue más lenta y de menor magnitud en el grupo RV-adyuvante. (Véanse las figuras 21 y 22). Los títulos de anticuerpos neutralizantes en cada grupo de ratones (RV-inmunizado y RV-adyuvante) se midieron en un ensayo de neutralizaciónin vitroen células Hela de Ohio utilizando la misma cepa de rinovirus que la utilizada en la prueba de desafío (tabla 7).

Tabla 7: Valores ID50

Como se menciona en la tabla 7, la dilución inversa media de los sueros del grupo inmunizado con HRV1B que produce una reducción del 50% del CPE en las células de Ohio hela es de 1328 frente a 160.2 en el grupo con adyuvante HRV1B.

Colectivamente, estos datos indican que la inmunización con VPo de HRV16 en presencia de IFA/CpG es capaz de aumentar sustancialmente las respuestas de anticuerpos neutralizantes a la infección con virus heterólogos.

La inmunización acelera la eliminación del virus

Finalmente, los inventores determinaron si las respuestas de anticuerpos Th1 y neutralizantes inducidas por la inmunización conferían algún beneficio en el control de la replicación del virus. Cuando los ratones inmunizados fueron desafiados con HRV1B o HRV29 (RV-inmunizado), la eliminación del virus del pulmón se observó en el día 4 y en el día 6 después del desafío, respectivamente, y se aceleró en gran medida en comparación con la observada en el grupo tratado con adyuvante (RV-adyuvante) (véanse las Figuras 23 y 24).

Ejemplo 5: Inmunogenicidad de las proteínas 3'pol y VP-Pol en ratones

Ratones C56BL/6 o BalB/cByJ de 7 semanas de edad fueron inmunizados con los últimos 105 aminoácidos de la ARN polimerasa de HRV16 (3'Pol RV16) o con la proteína de fusión que comprende los primeros 135 aminoácidos de VPo de HRV1B acoplados a los últimos 105 aminoácidos de la ARN polimerasa de HRV1B (VP-Pol RV1B) de acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 3.

Los resultados mostrados en las Figuras 25 a 27 muestran que la adición de IFA/CpG al inmunógeno cambió la respuesta inmune celular hacia una respuesta inmune celular Th1. Como se muestra para VPo de HRV16 en los ejemplos anteriores, la respuesta inmunitaria mediada por células observada es una respuesta inmunitaria mediada por células de reacción cruzada específica. En el caso de la inmunización con 3'Pol RV16, sólo se indujeron respuestas de IFN-y contra el grupo de péptidos B de 3'Pol (este grupo de péptidos abarca los últimos 105 aminoácidos del extremo C-terminal de la proteína ARN polimerasa) de serotipos heterólogos de rinovirus (HRV1B y HRV14). En el caso de la inmunización con VP-Pol RV1B, sólo se indujeron respuestas de IFN-<y>contra el grupo de péptidos B de 3'Pol (este grupo de péptidos abarca los últimos 105 aminoácidos del extremo C-terminal de la proteína ARN polimerasa) y el grupo de péptidos C de VP0 (este grupo de péptidos abarca los primeros 135 aminoácidos de VP0) de HRV1B.

Ejemplo 6: Inmunización con constructos de ADN

Ratones C56BL/6 o BalB/cByJ de 7 semanas de edad recibieron por vía intramuscular en las patas en los días 0 y 21 100 |jg del plásmido pcDNA3.1 que codifica los últimos 105 aminoácidos de la ARN polimerasa de HRV14 (3'Pol DNA RV14) o la secuencia de aminoácidos VPo de HRV16 (VP0 ADN RV16). Los esplenocitos se recolectaron el día 28, se estimularon con diferentes grupos de péptidos y se analizaron sus respuestas al IFN-y.

Los resultados presentados en la Figura 28 muestran que la inmunización de ADN con plásmidos que codifican los últimos 105 aminoácidos de la ARN polimerasa de un rinovirus o la proteína VPo de un rinovirus son capaces de inducir una respuesta inmune mediada por células de reacción cruzada específica.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica que comprende:

(a) un péptido aislado consistente en una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la SEQ ID No: 6, o un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho péptido, colocado bajo el control de los elementos necesarios para su expresión en una célula de mamífero; y

(b) un adyuvante Th1.

2. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el péptido aislado consiste en SEQ ID No: 6.

3. La composición inmunogénica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el adyuvante Th1 comprende un agonista TLR9, tal como un oligonucleótido CpG.

4. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, para uso en un mamífero para inducir una respuesta inmunitaria específica mediada por células con reacción cruzada contra al menos dos serotipos de rinovirus; preferiblemente, en la que los al menos dos serotipos de rinovirus pertenecen a los rinovirus de tipo A y/o B.

5. La composición inmunogénica para uso de acuerdo con la reivindicación 4, en la que dicha respuesta inmunitaria mediada por células está orientada a Th1, o en la que dicha respuesta inmunitaria mediada por células se potencia después de la infección por un rinovirus; preferiblemente en la que se induce además una respuesta de anticuerpos neutralizantes específicos cuando dicho mamífero está infectado por un rinovirus.

6. Composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para uso en un mamífero para inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes específica cuando dicho mamífero está infectado por un rinovirus.

7. Una composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para uso en un mamífero para acortar o prevenir una infección por un rinovirus y/o para reducir o prevenir los síntomas clínicos asociados con una infección por un rinovirus.

8. Composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para uso como vacuna.