ES2972406T3 - Vectores del virus oncolítico del herpes simple que expresan moléculas estimuladoras del sistema inmunitario - Google Patents

Abstract

Se proporciona un vector HSV que comprende un casete de expresión para una o más de las subunidades alfa del receptor IL12, IL15 y hIL15. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Vectores del virus oncolítico del herpes simple que expresan moléculas estimuladoras del sistema inmunitario

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general a vectores oncolíticos del virus del herpes simple (oHSV) que expresan moléculas que estimulan el sistema inmunológico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los virus oncolíticos (OVs) han sido un arsenal terapéutico para destruir específicamente las células cancerosas mediante la oncólisis, que es un mecanismo de destrucción caracterizado por la lisis de las células cancerosas durante el curso de la replicación lítica del virus. Además de la destrucción celular directa por parte del virus. Entre los diversos OVs, los OVs basados en el virus del herpes simple tipo 1 ("HSV-1") son los más avanzados, por ejemplo, la FDA de U.S. ha aprobado un OV basado en el virus del herpes (T-Vec) para el tratamiento del melanoma. Los ejemplos representativos de vectores HSV incluyen los descritos en los documentos de Patente US Patent Nos. 7,223,593, 7,537,924, 7,063,835, 7,063,851,7,118,755, 8,277,818, y 8,680,068.

La presente invención supera las deficiencias de los virus oncolíticos comerciales actuales y proporciona además beneficios inesperados adicionales. Cualquier referencia a métodos de tratamiento a lo largo de la solicitud debe interpretarse como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

COMPENDIO

La invención se define en las reivindicaciones. En pocas palabras, la divulgación se refiere a un vector oncolítico de HSV que comprende uno o más casetes de expresión para IL12, IL15 y/o una subunidad alfa del receptor de IL15. En una realización, uno o más casetes de expresión expresan todos de IL12, IL15 y la subunidad alfa del receptor de IL15. En realizaciones preferidas, el casete de expresión expresa IL12 murina o humana, IL15 murina o humana y la subunidad alfa del receptor de IL15 murino o humano. En otras realizaciones más, el casete de expresión expresa IL12, hIL15, murina o humana, y la subunidad alfa del receptor h15 y murino.

En una realización, el casete de expresión expresa todos de IL12, IL15 y la subunidad alfa del receptor de IL15. En una realización, el casete de expresión comprende mlL12, hIL15 y la subunidad alfa del receptor de hIL15. En otras realizaciones, el casete de expresión comprende hIL12, hIL15 y la subunidad alfa del receptor de hIL15. En determinadas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido 2A autoescindible está situada en el marco entre las secuencias codificantes mlL12, hIL15 y la subunidad alfa del receptor de hIL15. En otras realizaciones, el vector HSV codifica un péptido 2A autoescindible. En otras realizaciones, la una o más secuencias de IRES se localizan entre las secuencias codificantes para IL12, hIL15 y la subunidad alfa del receptor de hIL15 murina o humana. En realizaciones, la hIL15 y la subunidad alfa del receptor de hIL15 se co-expresan usando una secuencia de IRES, y en determinadas realizaciones, hIL15 y la subunidad alfa del receptor de hIL15 se expresan mediante un promotor bidireccional, que puede ser bi-CMV en algunas realizaciones. En otras realizaciones más, cada una de hIL15 y la subunidad alfa del receptor de hIL15 está seguida por una secuencia de ácido nucleico que codifica Lys5 o Glu5. En determinadas realizaciones, la subunidad alfa del receptor hIL15 se selecciona del grupo que consiste en la variante 1, la variante 2, la variante 3 y la variante 4.

El vector puede comprender además un casete de expresión para uno o más péptidos bloqueantes de PD-L1, puede comprender además una secuencia que codifica un enlazador peptídico o una o más secuencias de IRES (o ambas) entre múltiples péptidos bloqueantes de PD-L1. En algunas realizaciones, el vector HSV puede comprender además una secuencia que codifica un dominio Fc unido al extremo 3' del péptido bloqueante de PD-L1. En otras realizaciones más, los péptidos bloqueantes de PD-L1 se insertan entre los genes virales UL3 y UL4.

En determinadas realizaciones, el casete de expresión se inserta en la región de repetición terminal del genoma de HSV. En realizaciones, el vector HSV comprende además un elemento potenciador de NFkB y OCT4/SOX2 en las regiones reguladoras ICP4 o ICP27. El vector HSV puede tener una eliminación de los genes de ICP34.5. En otras realizaciones, el gen de ICP34.5 está regulado por una 3'UTR que contiene secuencias objetivo de miRNAs que están infraexpresadas en células tumorales.

El casete de expresión puede comprender al menos un promotor de CMV bidireccional. Puede comprender al menos un promotor celular.

En algunas realizaciones, el casete de expresión para mlL12/hlL15/la subunidad alfa del receptor de hlL15 se inserta en la región de repetición terminal donde la secuencia viral original se sustituye por el casete.

El vector HSV puede ser HSV-1 o HSV-2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las características ejemplares de la presente divulgación, su naturaleza y diversas ventajas serán evidentes a partir de los dibujos adjuntos y la siguiente descripción detallada de diversas realizaciones. Se describen realizaciones no limitantes y no exhaustivas con referencia a los dibujos adjuntos, en donde etiquetas o números de referencia similares se refieren a partes similares en las diversas vistas, a menos que se especifique lo contrario. Los tamaños y posiciones relativas de los elementos en los dibujos no están necesariamente dibujados a escala. Por ejemplo, las formas de varios elementos se seleccionan, amplían y colocan para mejorar la legibilidad del dibujo. Las formas particulares de los elementos dibujados se han seleccionado para facilitar su reconocimiento en los dibujos. Una o más realizaciones se describen a continuación con referencia a los dibujos adjuntos en donde:

Las Figuras 1A y 1B son esquemas de vectores oHSV ejemplares.

La Figura 2 muestra un esquema de la región de ICP34.5 modificada (SEQ ID NO: 572) para el virus hVG161. La Figura 3 muestra un esquema de una región promotora de UL54 modificada (SEQ ID NO: 573) para el virus hVG161.

La Figura 4 muestra un esquema del genoma viral de hVG161 con una inserción de un bloqueante de PD-L1 (SEQ ID NO: 574).

La Figura 5 muestra un esquema de la región de TR modificada con hVG161 (SEQ ID NO: 575).

Las Figuras 6A-6C muestran los datos de ELISA y transferencia de Western para la expresión de IL-12 después de la infección de células con hVG161.

Las Figuras 7A-7C muestran los datos de ELISA y de transferencia Western para la expresión de IL-15 después de la infección de células con hVG161.

Las Figuras 8A-8C muestran los datos de ELISA y transferencia de Western para la expresión de IgG4 después de la infección de células con hVG161.

Las Figuras 9A-9C son (A) un esquema de un constructo ejemplar en donde el promotor bi-CMV dirige la expresión del dominio Sushi de IL-15Ra e IL-15, y (B-C) una secuencia y esquema de DNA (SEQ ID No: 557).

Las Figuras 10A-10C son (A) un esquema de un constructo ejemplar en donde el promotor bi-CMV dirige la expresión de IL-15 y la variante 4 de IL-15Ra 4, y (B-C) una secuencia y esquema de DNA (SEQ ID No: 558).

Las Figuras 11A-11C son (A) un esquema de un constructo ejemplar en donde el promotor bi-CMV dirige la expresión de IL-15-K5 y dominio Sushi-E5 de IL-15Ra, y (B-C) una secuencia y esquema de DNA (SEQ ID No. : 559).

Las Figuras 12A-12D son (A) un esquema de un constructo ejemplar en donde el promotor bi-CMV dirige la expresión de IL-15-K5 y variante 4-E5 de IL-15Ra, y (B-D) una secuencia y esquema de DNA (SEQ ID No. : 560).

Las Figuras 13A-13D son (A) un esquema de un constructo ejemplar en donde el promotor EF1 a controla la expresión del dominio Sushi de IL-15-IRES-IL-15Ra, y (B-D) una secuencia y esquema de D<n>A (SEQ ID No: 561).

Las Figuras 14A-14D son (A) un esquema de un constructo ejemplar en donde el promotor EF1 a controla la expresión de la variante 4 de IL-15-IRES-IL-15Ra, y (B-D) una secuencia y esquema de DNA (SEQ ID No: 562).

Las Figuras 15A-15D son (A) un esquema de un constructo ejemplar en donde el promotor EF1 a controla la expresión del dominio Sushi E5 de IL-15K5-IRES-IL-15Ra, y (B-D) una secuencia y esquema de DNA (SEQ ID No: 563). Las Figuras 16A-16D son (A) un esquema de un constructo ejemplar en donde el promotor EF1 a controla la expresión de la variante 4E5 de IL-15K5-IRES-IL-15Ra, y (B-D) una secuencia y esquema de DNA (SEQ ID No: 564).

Las Figuras 17A-17E son (A) un esquema de un constructo ejemplar en donde el promotor CMV controla la expresión del dominio Sushi de IL-12-p2A-IL-15-p2A-IL-15Ra, y (B-E) una secuencia y esquema de DNA (SEQ ID No: 565). Las Figuras 18A-18E son (A) un esquema de un constructo ejemplar en donde el promotor CMV controla la expresión de la variante 1 de IL-12-p2A-IL-15-p2A-IL-15Ra, y (B-E) una secuencia y esquema de DNA (SEQ ID No: 566). Las Figuras 19A-19D son (A) un esquema de un constructo ejemplar en donde el promotor CMV controla la expresión del dominio Sushi E5 de IL-12-p2A-IL-15K5-p2A-IL-15Ra, y (B-D) una secuencia y esquema de DNA (SEQ ID No: 567).

Las Figuras 20A-20D son (A) un esquema de un constructo ejemplar en donde el promotor CMV controla la expresión de la variante 1-E5 de IL-12-p2A-IL-15K5-p2A-IL-15Ra, y (B-D) una secuencia y esquema de DNA (SEQ ID No: 568).

La Figura 21 es un gráfico que muestra el porcentaje de inhibición de la unión de PD-L1 a PD-1 mediante péptidos bloqueantes.

Las Figuras 22A-22D muestran el efecto de los péptidos inhibidores de PD-L1 sobre la citotoxicidad de las células objetivo por las células mononucleares de sangre periférica humana estimuladas con anti-CD3.

Las Figuras 23A y 24B muestran los efectos de IL-12 sola, IL-15Ra sola e IL-12 y 1L-15Ra juntos sobre la producción de IFNy y TNFa en células mononucleares de sangre periférica humana.

Las Figuras 24A y 24B muestran los efectos de IL-12 e IL-15Ra sobre la citotoxicidad de células tumorales U87 y MDA-MB-231 por células mononucleares de sangre periférica.

Las Figuras 25A-25E muestran los resultados de infección celular con VG161-PLBh y VG161-15h.

Las Figuras 26A-26D muestran resultados de ensayos in vitro para diversos constructos. Las Figuras 15A-15B muestran los resultados de la transfección celular con plásmido IL-TF-Fc que lleva IL-12, IL-15 y bloqueante de PD-L1. Las Figuras 15C-15D muestran los resultados de la infección celular con una variedad de virus mutantes incluyendo hVG161.

Las Figuras 27A-27E muestran los resultados de ensayos de viabilidad celular para hVG161 y HSV-345 en líneas de células tumorales humanas y línea de células Vero.

Las Figuras 28A-28J muestran los resultados de ensayos in vitro para diversos constructos. Las Figuras 28A-28E muestran los resultados de ensayos de viabilidad celular para mVG161 y HSV-345 en líneas de células tumorales de ratón y línea de células Vero; las Figuras 28F-28J muestran la caracterización de la expresión transgénica después de la infección con mVG161 o VG001 de células tumorales de ratón CT26.

Las Figuras 29A-29E muestran resultados de la caracterización in vitro de la expresión transgénica después de la infección con hVG161 o VG001 de diversas líneas celulares.

Las Figuras 30A-30G muestran los resultados de ensayos para evaluar la capacidad de hVG161 para destruir una variedad de células cancerosas humanas in vitro.

Las Figuras 31A-31G muestran los resultados de ensayos in vivo para los constructos mVG161 y hVG161.

Las Figuras 32A-32C muestran las curvas de crecimiento para diferentes virus en tres líneas celulares humanas diferentes.

Las Figuras 33A-33D muestran las curvas de crecimiento de mVG161 y HSV-345 en líneas de células tumorales de ratón y línea de células Vero.

Las Figuras 34A-34E muestran las curvas de crecimiento de hVG161 y HSV-345 en líneas de células tumorales humanas y línea de células Vero.

Las Figuras 35A-35D muestran los efectos de las modificaciones del virus.

Las Figuras 36A-36D proporcionan los datos de eficaciain vitro.

Las Figuras 37A y 37B proporcionan datosin vivo.

Las Figuras 38A-38C proporcionan datos sobre el efecto de VG161m en la respuesta inmune.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención se define en las reivindicaciones. La presente divulgación puede entenderse más fácilmente haciendo referencia a la siguiente descripción detallada de realizaciones preferidas de la invención y los Ejemplos incluidos en la presente memoria.

COMPENDIO DE LA DIVULGACIÓN

La presente invención puede entenderse más fácilmente haciendo referencia a la siguiente descripción detallada de realizaciones preferidas de la invención y los Ejemplos incluidos en la presente memoria. Brevemente, la presente divulgación proporciona vectores oncolíticos del virus del herpes simple tipo 1 o 2 que expresan moléculas inmunoestimulantes. Los vectores representativos comprenden uno o más casetes de expresión que codifican IL-12, IL-15 e IL-15Ra. Determinados vectores codifican IL-12 murina o humana, IL-15 murina o humana e IL-15Ra murina o humana. En determinadas realizaciones, los vectores codifican IL-12, hIL15 y la subunidad alfa del receptor hIL15 murino o humano. En otras realizaciones, los vectores codifican hIL-12, HIL15 y la subunidad alfa del receptor HIL15. Las tres proteínas pueden expresarse en uno, dos o tres transcritos. Cuando se expresa en el mismo transcrito, se produce un procesamiento postranscripcional que da como resultado la expresión de las proteínas individuales. En tal caso, las regiones codificantes están separadas por secuencias de IRES o secuencias que codifican péptidos 2A autoescindibles. Las regiones codificantes pueden expresarse mediante un promotor bidireccional. El vector HSV expresa opcionalmente uno o más péptidos PD-L1 que pueden secretarse.

A. Vector oHSV

Un virus oncolítico es un virus que lisará células cancerosas (oncólisis), preferiblemente de manera selectiva. Los virus que se replican selectivamente en células en división sobre células que no se dividen son a menudo oncolíticos. Los virus oncolíticos adecuados para su uso en la presente memoria incluyen los virus del herpes simple 1 y 2.

Los virus del herpes simple (HSV) 1 y 2 son miembros de la familia Herpesviridae que infectan a los humanos. El genoma del HSV contiene dos regiones únicas, que se denominan regiones únicas largas (U<l>) y únicas cortas (U<s>). Cada una de estas regiones está flanqueada por un par de secuencias de repetición terminales invertidas. Hay aproximadamente 75 marcos de lectura abiertos conocidos. El genoma viral se ha diseñado para desarrollar virus oncolíticos para su uso, por ejemplo, en la terapia contra el cáncer. La replicación selectiva del tumor del HSV puede conferirse mediante la mutación del gen ICP34.5 de HSV (también denominadoy34.5). HSV contiene dos copias de ICP34.5. Se sabe que los mutantes que inactivan una o ambas copias del gen ICP34.5 carecen de neurovirulencia, es decir, son avirulentos/no neurovirulentos y son oncolíticos.

El HSV oncolítico adecuado puede derivarse de HSV-1 o HSV-2, incluyendo cualquier cepa de laboratorio o aislado clínico. En algunas realizaciones, el oHSV puede ser o puede derivarse de una de las cepas de laboratorio cepa 17 de HSV-1, cepa F de HSV-1 o cepa HG52 de HSV-2. En otras realizaciones, puede ser de o derivar de la cepa JS-1 que no es de laboratorio. Otros virus HSV-1 adecuados incluyen HrrR3 (Goldsten and Weller, J. Virol. 62, 196-205, 1988), G2O7 (Mineta et al. Nature Medicine. 1(9):938-943, 1995; Kooby et al. The FASEB Journal, 13(11):1325-1334, 1999); G47Delta (Todo et al. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001; 98(11):6396-6401); HSV 1716 (Mace et al. Head & Neck, 2008; 30(8):1045-1051; Harrow et al. Gene Therapy. 2004; 11 (22):1648-1658); HF10 (Nakao et al. Cancer Gene Therapy. 2011; 18(3):167-175); NV1020 (Fong et al. Molecular Therapy, 2009; 17(2):389-394); T-VEC (Andtbacka et al. Journal of Clinical Oncology, 2015: 33(25):2780-8); J100 (Gastón et al. PloS one, 2013; 8(11):e81768); M002 (Parker et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000; 97(5):2208-2213); NV1042(Passer et al. Cancer Gene Therapy. 2013; 20(1 ):17-24); G2O7-IL2 (Carew et al. Molecular Therapy, 2001; 4(3):250-256); rQNestin34.5 (Kambara et al. Cancer Research, 2005; 65(7):2832-2839); G47A-mIL-18 (Fukuhara et al. Cancer Research, 2005; 65(23):10663-10668); y aquellos vectores que se describen en la solicitudes de Patente PCT applications PCT/US2017/030308 titulada "HSV Vectors with Enhanced Replication in Cancer Cells", y PCT/US2017/018539 titulada "Compositions and Methods of Using Stat1/3 Inhibitors with Oncolytic Herpes Virus".

El vector oHSV puede tener modificaciones, mutaciones o eliminaciones de al menos un geny34.5. El vector carece de genesy34.5 intactos. En algunas realizaciones, ambos genes se eliminan, mutan o modifican. En otras realizaciones, uno está eliminado y el otro está mutado o modificado. Cualquiera de los genesy34.5 nativos puede eliminarse. En una realización, se elimina la repetición terminal, que comprende el geny34.5 y el gen ICP4. Las mutaciones, tales como las alteraciones, inserciones y eliminaciones de nucleótidos hacen que el gen sea inexpresable o el producto inactivo. El geny34.5 puede modificarse con secuencias objetivo de miRNA en su 3'UTR. Las secuencias objetivo se unen a miRNA que se expresan a niveles más bajos en las células tumorales que en sus homógogos normales. En algunas realizaciones, los genesy34.5 modificados o mutados se construyenin vitroy se insertan en el vector oHSV como sustitutos del gen(s) viral(es). Cuando el geny34.5 modificado o mutado es un sustituto de solo un geny34.5, se elimina el otroy34.5. El geny34.5 puede comprender cambios adicionales, tales como tener un promotor exógeno.

El oHSV puede tener mutaciones adicionales, que pueden incluir mutaciones incapacitantes (por ejemplo, eliminaciones, sustituciones, inserciones), que pueden afectar la virulencia del virus o su capacidad de replicarse. Por ejemplo, se pueden realizar mutaciones en uno cualquiera o más de ICP6, ICPO, ICP4, ICP27, ICP47, ICP 24, ICP56. Preferiblemente, una mutación en uno de estos genes (opcionalmente en ambas copias del gen cuando sea apropiado) conduce a una incapacidad (o reducción de la capacidad) del HSV para expresar el polipéptido funcional correspondiente. En algunas realizaciones, el promotor de un gen viral puede sustituirse con un promotor que sea selectivamente activo en células objetivo o inducible tras la administración de un inductor o inducible tras un suceso celular o entorno particular. En realizaciones particulares, un promotor específico de tumor impulsa la expresión de genes virales esenciales para la replicación del HSV. En determinadas realizaciones, la expresión de ICP4 o ICP27 o ambos está controlada por un promotor exógeno, por ejemplo, un promotor específico del tumor. Los promotores específicos de tumores ejemplares incluyen survivina o telomerasa; otros promotores específicos de tumores adecuados pueden ser específicos de un único tipo de tumor y son conocidos en la técnica. Otros elementos pueden estar presentes. En algunos casos, está presente un potenciador tal como el potenciador NF-kB/OCT4/SOX2, por ejemplo en las regiones reguladoras de ICP4 o ICP27 o ambas. Además, la 5'UTR puede ser exógena, tal como una 5'UTR de genes de factores de crecimiento tales como el FGF.

El oHSV también puede tener genes y secuencias de nucleótidos que no son de origen del HSV. Por ejemplo, una secuencia que codifica un profármaco, una secuencia que codifica una citocina u otro factor inmunoestimulante, un promotor específico del tumor, un promotor inducible, un potenciador, una secuencia homóloga a una célula huésped, entre otros, pueden estar en el genoma de oHSV. Secuencias ejemplares codifican IL12, IL15, OX40L, un bloqueante de PD-L1 o un bloqueante de PD-1. Para las secuencias que codifican un producto, están unidas operativamente a una secuencia promotora y otras secuencias reguladoras (por ejemplo, potenciador, secuencia señal de poliadenilación) necesarias o deseables para la expresión.

La región reguladora de los genes virales puede modificarse para comprender elementos de respuesta que afecten a la expresión. Los elementos de respuesta ejemplares incluyen elementos de respuesta para NF-kB, Oct-3/4-SOX2, potenciadores, silenciadores, elementos de respuesta de cAMP, secuencias de unión potenciadoras de CAAT y aislantes. También se pueden incluir otros elementos de respuesta. Un promotor viral puede sustituirse con un promotor diferente. La elección del promotor dependerá de una serie de factores, tales como el uso propuesto del vector HSV, el tratamiento del paciente, el estado o condición de la enfermedad y la facilidad de aplicar un inductor (para un promotor inducible). Para el tratamiento del cáncer, generalmente cuando se sustituye un promotor será con un promotor específico de la célula, específico del tejido o específico del tumor. Se conocen en la técnica promotores específicos de tumores, específicos de células y específicos de tejidos. También se pueden modificar otros elementos genéticos. Por ejemplo, la 5’UTR del gen viral puede sustituirse por una UTR exógena.

B. Moléculas inmunoestimulantes

El vector oHSV comprende secuencias de ácido nucleico que codifican una o más moléculas inmunoestimulantes (por ejemplo, IL-12, IL-15 e IL-15Ra). Las secuencias de aminoácidos de IL-12, IL-15 e IL-15Ra ejemplares se presentan en el Listado de secuencias (SEQ ID NOs: 1-6). Cualquier secuencia de DNA que codifique la secuencia de aminoácidos es adecuada, aunque generalmente se elegirán codones para la expresión preferencial en las especies en cuestión programadas para recibir el oHSV.

1. IL-12

La interleucina 12 (IL-12) es producida principalmente por células dendríticas, macrófagos y monocitos en respuesta a bacterias (por ejemplo, lipopolisacáridos), patógenos o células T activadas. La IL-12 puede inducir la producción de IFN gamma, la proliferación celular y activar las células asesinas naturales y las células T. También es fundamental para la diferenciación de células T en células Th1. La IL-12 también puede suprimir el crecimiento tumoral. La IL-12 murina es igualmente activa tanto para células murinas como humanas, y cualquiera de ellas es adecuada para su uso en el vector oHSV.

La IL-12 biológicamente activa es una molécula heterodimérica compuesta por una subunidad de 35 kDa (p35) y una de 40 kDa (p40) que están unidas covalentemente por un puente disulfuro. Es necesaria la expresión simultánea de las dos subunidades para producir el heterodímero. En el vector oHSV, la expresión de IL-12 se puede lograr de diversas formas. Las dos subunidades pueden expresarse en constructos separados, cada uno con un promotor, o expresarse en un constructo a partir de un promotor bidireccional, o expresarse a partir de un constructo con elementos tales como IRES o péptidos autoescindibles entre las regiones codificantes. Alternativamente, las subunidades se pueden expresar como una cadena única. Por ejemplo, se puede producir una proteína de fusión de IL-12 monocatenaria funcional uniendo las regiones codificantes para p40 y p35 con enlazadores, normalmente compuestos de Ser o Gly o una combinación de Ser y Gly, tal como Ser5, (Gly4Ser)3 o GlysSer (por ejemplo, Lieschke et al. Nature Biotechnology 15:35, 1997; Lode et al. P<n>AS 95:2475, 1998; véase también el documento de Patente WO 2015/095249 para un constructo de fusión alternativo). La secuencia y longitud de los enlazadores generalmente se eligen para permitir la máxima flexibilidad de los dominios (Chen et al, Adv Drug Deliv Rev. 65: 1357, 2013). Se puede utilizar un programa informático para elegir la secuencia del enlazador. Uno de dichos programas se llama LINKER (Crasto and Feng, Protein Eng Design & Selection 13:309). Una IL-12 monocatenaria ejemplar tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Se pueden realizar sustituciones, inserciones y eliminaciones de aminoácidos siempre que la IL-12 conserve su función.

2. IL-15

IL-15 es una citocina que regula la activación y proliferación de las células asesinas naturales y de las células T y puede tener otras actividades biológicas. Existen al menos dos isoformas que se diferencian en la secuencia del péptido señal y tienen secuencias de proteínas maduras idénticas. La secuencia de la isoforma con el péptido señal más largo (a veces denominado LSP-IL15) tiene el número de acceso de GenBank (NCBI) NP 000576, y el que tiene el péptido señal más corto (a veces denominado SSP-IL15) tiene el número de acceso NP 751915. Cualquiera de las isoformas es adecuada para su uso en el vector oHSV. Las inserciones, eliminaciones y sustituciones de aminoácidos, tales como las que se encuentran en los polimorfismos, pueden estar presentes siempre que la proteína se una a la IL-15.

En algunas realizaciones, IL-15 e IL-15Ra tienen cada una un péptido C-terminal que son bobinas enrolladas que se dimerizarán selectivamente. Se han enseñado varios péptidos adecuados (véase, por ejemplo, Tripet et al. Protein Engineering 9:1029, 1996; Aronsson et al, Sci Rep 5:14063, 2015). Normalmente, la secuencia de aminoácidos de las bobinas enrolladas tiene una repetición heptada de residuos hidrofóbicos (h) y polares (p) en un patrónhpphppp. Dos bobinas enrolladas ejemplares son la bobina K (KVSALKE, SEQ ID NO. 7) y la bobina E (EVSALEK, SEQ ID NO. 8). Generalmente se utilizan de 3 a 6 copias en tándem. En algunas realizaciones de la presente memoria, se utilizan 5 copias en tándem de cada una. K5 (KVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE, SEQ ID NO. 9) y E5 (EVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK, SEQ ID NO. 10). La bobina K y la bobina E se diseñaron para tener cargas opuestas, así IL-15 se fusiona con una bobina enrollada e IL-15Ra se fusiona con una bobina enrollada con carga opuesta. Un dominio Sushi ejemplar fusionado con E5 se muestra en SEQ ID NO: 12, una variante 4 de IL-15Ra ejemplar fusionada con E5 se muestra en SEQ ID NO: 13, una variante 1 de IL-15Ra ejemplar fusionada con E5 se muestra en SEQ ID NO: 14, y una IL-15 ejemplar fusionada a K5 se muestra en SEQ ID NO: 15.

3. Subunidad IL-15Ra

La subunidad alfa del receptor de interleucina-15 (IL-15Ra) es una de las tres subunidades del complejo que se une a la IL-15. La subunidad alfa se une a la IL-15 con alta afinidad y puede unirse a ella independientemente de las otras subunidades. Existen al menos cuatro variantes (isoformas), en la presente memoria denominadas variante 1 (NP 002180.1) (SEQ ID NO: 3); variante 2 (NP 751950.2) (SEQ ID NO: 4); variante 3 (NP 001230468.1) (SEQ ID NO: 5); y variante 4 (NP_001243694) (SEQ ID NO: 6). La subunidad alfa contiene un dominio Sushi (también conocido como proteína de control del complemento (CCP), repeticiones de consenso cortas (SCRs) o repeticiones SUSHI) que es la región más corta que conserva la actividad de unión a IL-15. Un dominio Sushi típico tiene aproximadamente de 60 a 70 aminoácidos y contiene cuatro cisteínas que forman dos enlaces disulfuro y es un motivo común en las interacciones proteína-proteína. El dominio Sushi de IL-15Ra abarca del residuo 31 al aproximadamente 95 (en referencia a la variante 1) (SEQ ID NO: 11). Se conoce la localización del dominio Sushi en las demás variantes. La sustitución de aminoácidos de cualquiera de las cisteínas en sIL-15Ra elimina su capacidad para inhibir la inflamación aguda y la respuesta de las células T a antígenos alogénicos in vivo (Wei et al. J Immunol. 167:277, 2001).

El vector oHSV comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica IL-15Ra, una variante de IL-15Ra o un dominio Sushi. Generalmente, la proteína se expresa con un péptido líder y, en algunas realizaciones, el péptido líder es de IL-15Ra. Se conocen en la técnica otros péptidos líderes. Pueden estar presentes sustituciones de aminoácidos siempre que la proteína se una a la IL-15. Se conocen sustituciones naturales, polimorfismos.

4. Péptido bloqueante de PD-L1

El ligando 1 de muerte programada (PD-L1) desempeña un papel en la supresión del sistema inmunológico, probablemente como un efecto de la unión del receptor de PD-1. Se ha demostrado que bloquear la interacción proteína-proteína mejora la terapia contra el cáncer.

El vector oHSV puede expresar péptidos bloqueantes de PD-L1. Los péptidos adecuados incluyen TAHPSPSPRSAGQF (SEQ ID NO: 16), EYRMSPSNQT (SEQ ID NO: 17), YYRMSPSNQT (SEQ ID NO: 18), TRYPSPSPKPEGRF (SEQ ID NO: 19) y WNRLSPSNQT (SEQ ID NO: 20). Otros péptidos adecuados incluyen aquellos de la Tabla 4 (SEQ ID NO: 21-500). Generalmente, los péptidos bloqueantes se expresan con una secuencia líder. Las secuencias líderes son bien conocidas en la técnica. Incluyen la secuencia líder de la cadena kappa de inmunoglobulina (METDTLLLWVLLLWVPGSTG; SEQ ID NO: 501) y la secuencia líder de IL-2 (MYRMQLLSCIALSLALVTNS; SEQ ID NO: 502). Cuando está presente más de un péptido bloqueante, normalmente los péptidos estarán separados por un péptido enlazador que confiere flexibilidad. Los enlazadores normalmente son ricos en Gly, Ser o Gly/Ser. Se muestran ejemplos de enlazadores adecuados en (SEQ ID NO: 503-519) (véase también, Chichili et al. Protein Science 22: 153, 2013). Puede haber una copia de un péptido, o dos copias, o tres copias o más. Suele haber varias copias en tandem y pueden tener un enlazador entre las copias. Los constructos de péptidos bloqueantes también pueden comprender una secuencia Fc en el extremo C-terminal del péptido, o una secuencia Fc de inmunoglobulina con o sin la región bisagra. Si bien cualquiera de las regiones Fc es adecuada, en general, la Fc será de una de las subclases de IgG, por ejemplo, IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana e IgG4 humana o sus homólogos murinos.

C. Organización de elementos

Las moléculas IL-12, IL-15 e IL-15Ra pueden estar en una variedad de configuraciones diferentes en el vector oHSV. Por ejemplo, cada una de las moléculas puede expresarse individualmente a partir de una región promotora/reguladora separada o co-expresarse a partir de una o dos regiones promotoras/reguladoras separadas.

En determinadas realizaciones, dos o tres de las moléculas se expresan en un único transcrito a partir de un promotor y sus secuencias codificantes están separadas por secuencias de IRES (sitio de entrada al ribosoma interno). Las regiones IRES atraen un complejo de iniciación de la traducción ribosómica eucariótica y, por lo tanto, permiten el inicio de la traducción en medio de un mRNA e independientemente de la estructura de tapa 5'-terminal comúnmente utilizada. Las secuencias de IRES adecuadas son bien conocidas y muchas se pueden encontrar en la base de datos de IRESite de secuencias de IRES verificadas experimentalmente (véase, por ejemplo, http://iresite.org/IRESite web.php?page=browse_plasmids; entrada el 26 de mayo de 2016).

En diversas realizaciones, los tres genes están presentes en cualquier orden y separados por una o más secuencias de IRES. Las secuencias de IRES pueden ser idénticas o no. Pueden estar presentes secuencias adicionales en la unión gen/IRES o en una unión IRES/IRES.

En determinadas realizaciones, dos o tres de las moléculas se expresan en un único transcrito a partir de un promotor y sus secuencias codificantes están separadas por uno o más péptidos 2A autoescindibles. Estos péptidos son cortos (aproximadamente 18-22 aminoácidos) y se insertan en un marco entre secuencias codificantes. Durante la traducción, los ribosomas omiten la síntesis del enlace peptídico glicilo-prolilo en el extremo C-terminal de un péptido 2A, lo que lleva a la escisión entre un péptido 2A y su proteína inmediatamente posterior. Como resultado, producen niveles equimolares de múltiples productos genéticos a partir del mismo mRNA. La "escisión" se produce entre los residuos de gli-pro en el extremo C-terminal, lo que significa que al cistrón anterior se le añadirán residuos adicionales a su extremo C-terminal, mientras que el cistrón posterior comenzará con una prolina. Se muestran secuencias de péptidos p2A ejemplares en las SEQ ID NO: 520-535.

Otro medio para efectuar la co-expresión de las moléculas es utilizar un promotor bidireccional. Los promotores bidireccionales son una característica común del genoma humano (Trinklein et al. Genome Res 14:62, 2004). Un promotor bidireccional inicia la transcripción en ambas direcciones y normalmente contiene elementos compartidos que regulan ambos genes. Además de los promotores bidireccionales naturales, se han sintetizado promotores que son bidireccionales. Uno de dichos promotores es bi-CMV. pBl-CMV1 es un vector de expresión bidireccional de mamíferos que permite la expresión constitutiva de dos proteínas de interés. La expresión de proteínas está impulsada por uno de los dos promotores mínimos de citomegalovirus humanos constitutivamente activos, PminCMV1 y PminCMV2 en orientaciones opuestas. Una secuencia de DNA ejemplar de un promotor de CMV bidireccional es SEQ ID NO. 536.

El promotor bidireccional (por ejemplo, promotor bi-CMV) se utiliza principalmente para lograr la co-expresión de hIL15 e IL-15Ra (o el dominio Sushi). Cuando dos moléculas se co-expresan usando secuencias de IRES o p2A, generalmente serán hIL15 e IL-15Ra (o el dominio Sushi). En estos casos, los péptidos bloqueantes de IL-12 y PD-L1 pueden co-expresarse usando un promotor bidireccional o como un transcrito multicistrónico con secuencias de IRES o p2A, o pueden expresarse individualmente a partir de sus propios promotores/regiones reguladoras.

Pueden usarse otros promotores. Son adecuados promotores celulares, promotores virales y similares. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles o específicos de célula/tejido. Muchos promotores son bien conocidos. Un promotor particular que puede resultar útil es el promotor constitutivo EF-1 a.

Las secuencias se ensamblan en uno o más casetes de expresión. Los Ejemplos proporcionan versiones ejemplares de algunos casetes de expresión. El casete de expresión puede insertarse en el genoma del HSV en cualquier localización que no altere funciones críticas (por ejemplo, replicación). En determinadas realizaciones, el casete se inserta en la región de repetición interna o terminal después de eliminar primero la repetición. Otras áreas adecuadas para la inserción incluyen entre genes virales, tales como, por ejemplo, los genes virales UL3 y UL4, los genes UL50 y UL51, y entre US1 y US2.

En determinadas realizaciones, un casete que expresa péptidos bloqueantes de PD-L1 se inserta entre genes virales (por ejemplo, UL3 y UL4, UL50 y UL51 y/o US1 y US2). En otras realizaciones, se inserta un casete que expresa IL-12, IL-15 e IL-15Ra en lugar de la región de repetición terminal y se inserta un casete que expresa péptidos de PD-L1 entre los genes UL3 y UL4.

D. Composiciones terapéuticas

Se proporcionan composiciones terapéuticas que pueden usarse para prevenir, tratar o mejorar los efectos de una enfermedad, tal como, por ejemplo, el cáncer. Más particularmente, se proporcionan composiciones terapéuticas que comprenden al menos un virus oncolítico como se describe en la presente memoria. Los ejemplos representativos incluyen un oHSV que tiene un casete de expresión para una o más de IL12, IL15 y/o la subunidad alfa del receptor de IL-15. En una realización, el casete de expresión expresa toda IL12, IL15 y la subunidad alfa del receptor de IL-15. En realizaciones preferidas, el casete de expresión comprende IL12, hIL15 y la unidad alfa del receptor de hIL15 murino o humano.

En determinadas realizaciones, las composiciones comprenderán además un vehículo farmacéuticamente aceptable. La frase "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende abarcar cualquier vehículo, diluyente o excipiente que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica del virus oncolítico y que no sea tóxico para el sujeto al que se administra (véase en general Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1,2005 y en The United States PharmacopE1A: The National Formulary (USP 40 - NF 35 y Suplementos).

En el caso de un virus oncolítico como se describe en la presente memoria, los ejemplos no limitantes de vehículos farmacéuticos adecuados incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones (tales como emulsiones de aceite/agua), diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles y otros. Vehículos farmacéuticamente aceptables adicionales incluyen geles, materiales de matriz bioadsorbibles, elementos de implantación que contienen el virus oncolítico o cualquier otro vehículo, medio o material de administración o dispensación adecuado. Dichos vehículos pueden formularse mediante métodos convencionales y pueden administrarse al sujeto en una dosis eficaz. Excipientes farmacéuticamente aceptables adicionales incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina, polietilenglicol, ácido hialurónico y etanol. También se pueden incluir en ellos sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales (tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares) y sales de ácidos orgánicos (tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares). Dichos vehículos, diluyentes y excipientes farmacéuticamente aceptables (de calidad farmacéutica) que pueden usarse para administrar el oHSV a una célula cancerosa objetivo preferiblemente no inducirán una respuesta inmune en el individuo (sujeto) que recibe la composición (y preferiblemente se administrarán sin toxicidad excesiva).

Las composiciones proporcionadas en la presente memoria se pueden proporcionar en una variedad de concentraciones. Por ejemplo, se pueden proporcionar dosis de virus oncolítico que oscilan de aproximadamente 106 a aproximadamente 109 pfu. En realizaciones adicionales, la forma de dosificación puede variar de aproximadamente 106 a aproximadamente 108 pfu/ml, inyectándose hasta 4 ml en un paciente con lesiones grandes (por ejemplo, > 5 cm) y cantidades más pequeñas (por ejemplo, hasta 0,1 ml) en pacientes con lesiones pequeñas (por ejemplo, < 0,5 cm) cada 2 - 3 semanas, de tratamiento.

En determinadas realizaciones de la invención, se pueden utilizar dosis más bajas que las estándar. Por lo tanto, en ciertas realizaciones se pueden administrar a un paciente menos de aproximadamente 106 pfu/ml (inyectándose hasta 4 ml a un paciente cada 2 a 3 semanas).

Las composiciones se pueden almacenar a una temperatura que conduzca a una vida útil estable, e incluye temperatura ambiente (aproximadamente 20°C), 4°C, -20°C, -80°C y en N2 líquido. Debido a que las composiciones destinadas a su usoin vivogeneralmente no tienen conservantes, el almacenamiento generalmente se realizará a temperaturas más frías. Las composiciones pueden almacenarse secas (por ejemplo, liofilizadas) o en forma líquida.

E. Administración

Además de las composiciones descritas en la presente memoria, se proporcionan diversos métodos para usar dichas composiciones para tratar o mejorar el cáncer, que comprenden la etapa de administrar una dosis o cantidad eficaz de un vector HSV como se describe en la presente memoria a un sujeto.

Los términos "dosis eficaz" y "cantidad eficaz" se refieren a cantidades del virus oncolítico que son suficientes para efectuar el tratamiento de un cáncer objetivo, por ejemplo, cantidades que son eficaces para reducir el tamaño o la carga de un tumor objetivo, o de otro modo impedir la tasa de crecimiento de las células tumorales objetivo. Más particularmente, dichos términos se refieren a cantidades de virus oncolítico que son eficaces, en las dosis y períodos de tratamiento necesarios, para lograr un resultado deseado. Por ejemplo, en el contexto del tratamiento de un cáncer, una cantidad eficaz de las composiciones descritas en la presente memoria es una cantidad que induce la remisión, reduce la carga tumoral y/o previene la propagación del tumor o el crecimiento del cáncer. Las cantidades eficaces pueden variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del sujeto, así como la formulación farmacéutica, la vía de administración y similares, pero, no obstante, un experto en la técnica puede determinarlas de forma rutinaria.

Las composiciones terapéuticas se administran a un sujeto diagnosticado con cáncer o del que se sospecha que tiene cáncer. Los sujetos pueden ser animales humanos o no humanos.

Las composiciones se usan para tratar el cáncer. Los términos "tratar" o "que tratan" o "tratamiento", tal y como se usan en la presente memoria, significan un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados pueden incluir, pero no se limitan a, alivio o mejora de uno o más síntomas o afecciones, disminución de la extensión de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, no empeoramiento) de la enfermedad, prevención de la propagación de la enfermedad, retraso o desaceleración de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, disminución de la recurrencia de la enfermedad y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. Los términos "que trata" y "tratamiento" también pueden significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.

Las formas representativas de cáncer incluyen carcinomas, leucemias, linfomas, mielomas y sarcomas. Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cáncer de vías biliares, cáncer de cerebro (por ejemplo, glioblastoma), mama, cuello uterino, colorrectal, del sistema nervioso central CNS (por ejemplo, neuroma acústico, astrocitoma, craneofaringioma, ependimoma, glioblastoma, hemangioblastoma, meduloblastoma, menangioma, neuroblastoma, oligodendroglioma, pinealoma y retinoblastoma), revestimiento endometrial, células hematopoyéticas (por ejemplo, leucemia y linfomas), riñón, laringe, pulmón, hígado, cavidad oral, ovarios, páncreas, próstata, piel (por ejemplo, melanoma y carcinoma de células escamosas) y tiroides. Los cánceres pueden comprender tumores sólidos (por ejemplo, sarcomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma y sarcoma osteogénico), ser difuso (por ejemplo, leucemia), o alguna combinación de estos (por ejemplo, un cáncer metastásico que tiene tanto tumores sólidos como células cancerosas diseminadas o difusas). Los cánceres también pueden ser resistentes al tratamiento convencional (por ejemplo, quimioterapia convencional y/o radioterapia).

También se pueden tratar tumores benignos y otras afecciones de proliferación de células no deseadas.

El oHSV como se describe en la presente memoria puede administrarse mediante una vía que es, por ejemplo, oral, tópica, parenteral, sistémica, intravenosa, intramuscular, intraocular, intratecal, intratumoral, subcutánea o transdérmica. En determinadas realizaciones, el virus oncolítico puede administrarse mediante una cánula, mediante un catéter o mediante inyección directa. El sitio de administración puede ser intratumoral o en un sitio distante del tumor. La vía de administración dependerá a menudo del tipo de cáncer al que se dirige.

El régimen de dosificación óptimo o apropiado del virus oncolítico es fácilmente determinable dentro de los conocimientos de la técnica, por el médico tratante basándose en los datos del paciente, las observaciones del paciente y diversos factores clínicos, incluyendo, por ejemplo, el tamaño del sujeto, el área superficial corporal, la edad, género y el virus oncolítico particular que se va a administrar, el momento y la vía de administración, el tipo de cáncer que se está tratando, la salud general del paciente y otras terapias farmacológicas a las que se está sometiendo al paciente. Según determinadas realizaciones, el tratamiento de un sujeto que utiliza el virus oncolítico descrito en la presente memoria se puede combinar con tipos adicionales de terapia, tal como quimioterapia utilizando, por ejemplo, un agente quimioterapéutico tal como etopósido, ifosfamida, adriamicina, vincristina, doxiciclina y otros.

El oHSV puede formularse como medicamentos y composiciones farmacéuticas para su uso clínico y puede combinarse con un vehículo, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La formulación dependerá, al menos en parte, de la vía de administración. Las formulaciones adecuadas pueden comprender el virus y el inhibidor en un medio estéril. Las formulaciones pueden ser formas fluidas, en gel, en pasta o sólidas. Las formulaciones pueden proporcionarse a un sujeto o a un profesional médico.

Preferiblemente se administra una cantidad terapéuticamente eficaz. Esta es una cantidad que es suficiente para mostrar beneficio al sujeto. La cantidad real administrada y el tiempo de administración dependerán al menos en parte de la naturaleza del cáncer, la condición del sujeto, el sitio de administración y otros factores.

En otras realizaciones más de la invención, el virus oncolítico se puede administrar por vía intratumoral o después de la resección quirúrgica de un tumor.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

EJEMPLOS

Todos los constructos se generan utilizando técnicas recombinantes estándar, incluyendo la síntesis química.

EJEMPLO 1

ESQUEMA DE VECTORES oHSV EJEMPLARES

Las Figuras 1A y 1B proporcionan un esquema ejemplar de vectores oHSV representativos.

EJEMPLO 2

CONSTRUCTOS EJEMPLARES

En este ejemplo, se presentan varios constructos y sus secuencias.

hVG161 comprende una región ICP34.5 modificada (Figura 2; SEQ ID NO.572), una región reguladora del promotor UL54 modificada (Figura 3; SEQ ID NO. 573), una inserción de un bloqueante de PD-L1 dentro de la región intergénica entre UL3 y UL4 (Figura 4; SEQ ID No. 574), y una región de repetición terminal (TR) modificada que lleva un casete de expresión que codifica IL-12, IL-15 y la subunidad alfa del receptor de IL-15 (Figura 5; SEC ID No. 575). Estos cuatro virus también tienen una región ICP 34.5 modificada y parcialmente eliminada.

mVG161 es una versión de ratón funcionalmente idéntica de hVG161, excepto que mVG161 lleva una versión de ratón de IL-12 y un bloqueante de PD-L1 de ratón en la misma localización en el genoma viral donde hVG161 lleva una IL-12 humana y un bloqueante de PD-L1 humano.

EJEMPLO 3

ABREVIATURAS UTILIZADAS EN EJEMPLOS POSTERIORESTF-Fc: péptido bloqueante (TF) de PD-L1 fusionado a Fc y utilizado para la construcción de VG161.

IL-TF-Fc: plásmido que lleva IL-12, IL-15 y un bloqueante de PD-L1.

HSV-345: virus con ICP34.5 eliminado.

OS-ICP27 2-11: virus con ICP34.5 eliminado con un sitio de unión Oct4/Sox2 y un promotor de supervivencia (OS) insertado dentro de la región reguladora del promotor de ICP27 (OS-ICP27) que no se utilizó para la construcción de VG161.

OS-ICP27 5-7: virus con ICP34.5 eliminado y con mutación de OS-ICP27 que no se utilizó para la construcción de VG161.

NO-ICP27 1-4-4 (también conocido como NO-ICP27-145): virus con ICP34.5 eliminado con un elemento de respuesta NF-kB y un sitio de unión (NO) Oct4/Sox2 insertado dentro de la región reguladora del promotor de ICP27 (NO-ICP27) en una localización 145 pb anterior del sitio de inicio de la transcripción de ICP27 y que se utilizó para la construcción de VG161.

NO-ICP275-2-2 (también conocido como NO-ICP27-99): virus con ICP34.5 eliminado con un elemento de respuesta NF-kB y un sitio de unión (NO) Oct4/Sox2 insertado dentro de la región reguladora del promotor de ICP27 (NO-ICP27) en una localización 99 pb anterior del sitio de inicio de la transcripción de ICP27 y que no se utilizó para la construcción de VG161.

VG001 (también conocido como VG160): virus principal que se usó para la construcción de VG161 (mutante NO-ICP27 1-4-4 que lleva un promotor exógeno y poli(A) que flanquea un MCS vacío dentro de una región de repetición terminal eliminada del genoma viral que posteriormente se utiliza para la inserción del casete de expresión IL-12/IL-15).

VG001 -15h (también conocido como VG161 -15h): VG001 que lleva IL-15 humana.

VG001-1215h (también conocido como VG161-1215h): VG001 que lleva IL-12 humana e IL-15 humana.

VG001-PLBh (también conocido como VG161-PLBh): VG001 que lleva un bloqueante de PD-L1 humano insertado dentro de la región intergénica entre UL3 y UL4.

8-8-15RA1 -PDL1b: VG001 que lleva IL-15 humana y un bloqueante de PD-L1 humano.

VG161-1215PLBm (también conocido como mVG161): VG001 que lleva IL-12 de ratón, IL-15 humana y un bloqueante de PD-L1 de ratón.

VG161-1215PLBh (también conocido como hVG161 o VG161): VG001 que lleva IL-12 humana, IL-15 humana y un bloqueante de PD-L1 humana.

EJEMPLO 4

EXPRESIÓN DE IL-12 DESPUÉS DE LA INFECCIÓN DE CÉLULAS POR hVG161

En este ejemplo, se muestran datos de la transferencia Western y ELISA de la expresión de II-12.

La Figura 6A muestra los resultados de la transferencia de Western después de la infección por el virus VG161-1215PLBh. Se infectaron células tumorales H460 con el virus VG161 -1215PLB o VG001 (MOI = 1) durante 24 horas. Se prepararon lisados celulares, se procesaron en gel de SDS-PAGE al 12 % y se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se transfirió con un anticuerpo anti-IL-12 humano seguido de un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRP y la imagen se detectó y analizó utilizando el sistema Bio-Rad ImageLab.

Las Figuras 6B-6C muestran que la producción de IL-12 humana está regulada positivamente después de la infección por el virus VG161-1215PLBh. Se infectaron células tumorales LS174T o H460 con el virus VG161-1215PLB o VG001 (MOI = 1) durante 48 horas. Los sobrenadantes de células infectadas se recogieron y se unieron a una placa de fondo plano Immuno Maxisorp de 96 pocillos recubierta con anticuerpo de captura anti-IL-12 humana. La unión se detectó mediante un anticuerpo anti-IL-12 humano biotinilado, avidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) y el sustrato 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB). Las mediciones de absorbancia se recogieron a 450 nm mediante un lector de placas. La concentración de IL-12 humana en sobrenadantes cultivados se calculó basándose en la curva estándar de IL-12 humana.

EJEMPLO 5

EXPRESIÓN DE IL-15 DESPUÉS DE LA INFECCIÓN DE CÉLULAS POR HVG161

En este ejemplo, se muestran los datos de la transferencia de Western y ELISA de la expresión de IL-15.

La Figura 7A muestra los resultados de la transferencia de Western después de la infección por el virus VG161-1215PLBh. Se infectaron células tumorales H460 con el virus VG161 -1215PLB o VG001 (MOI = 1) durante 24 horas. Se prepararon lisados celulares, se procesaron en gel de SDS-PAGE al 12 % y se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se transfirió con un anticuerpo anti-IL-15 humano seguido de un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRP y la imagen se detectó y analizó utilizando el sistema Bio-Rad ImageLab.

Las Figuras 7B-7C muestran que la producción de IL-15 humana está regulada positivamente después de la infección por el virus VG161-1215PLBh. Se infectaron células tumorales LS174T o H460 con el virus VG161-1215PLB o VG001 (MOI = 1) durante 48 horas. Los sobrenadantes de células infectadas se recogieron y se unieron a una placa de fondo plano Immuno Maxisorp de 96 pocillos recubierta con anticuerpo de captura anti-IL-15 humana. La unión se detectó mediante un anticuerpo anti-IL-15 humano biotinilado, avidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) y sustrato 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB). Las mediciones de absorbancia se recogieron a 450 nm mediante un lector de placas. La concentración de IL-15 humana en sobrenadantes cultivados se calculó basándose en la curva estándar de IL-15 humana.

EJEMPLO 6

EXPRESIÓN DE IGG4 DESPUÉS DE LA INFECCIÓN DE CÉLULAS POR HVG161

En este ejemplo, se muestran los datos de la transferencia de Western y ELISA de la expresión de IgG4.

La Figura 8A muestra los resultados de la transferencia de Western después de la infección por el virus VG161-1215PLBh. Se infectaron células tumorales H460 con el virus VG161 -1215PLB o VG001 (MOI = 1) durante 24 horas. Se prepararon lisados celulares, se procesaron en gel de SDS-PAGE al 12 % y se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se transfirió con anticuerpo anti-IgG humana conjugado con HRP y la imagen se detectó y analizó utilizando el sistema Bio-Rad ImageLab.

Las Figuras 8B-8C muestran que la producción del bloqueante de PD-L1 humano (fusionado con el dominio Fc humano) está regulada positivamente después de la infección por el virus VG161-1215PLBh. Se infectaron células<tumorales LS174T o H>460<con el virus Vg 161 -1215PLB o VG001 (MOI = 1) durante 48 horas. Los sobrenadantes de>células infectadas se recogieron y se unieron a una placa de fondo plano Immuno Maxisorp de 96 pocillos recubierta con anticuerpo de captura anti-IgG4 humana. La unión se detectó mediante un anticuerpo anti-IgG4 humano biotinilado, avidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) y sustrato 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB). Las mediciones de absorbancia se recogieron a 450 nm mediante un lector de placas. La concentración de IgG4 humana en los sobrenadantes cultivados se calculó basándose en la curva estándar de IgG4 humana.

EJEMPLO 7

Constructos que comprenden péptidos bloqueantes de PD-L1

Los péptidos bloqueantes de PD-L1 se generan con una secuencia líder de cadena k de Ig (SEQ ID NO: 501). Cuando dos o más péptidos bloqueantes están en el mismo constructo, se unen con una secuencia rica en Gly-Ser (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 503). Se prepararon los siguientes constructos.

TF solo:

METDTLLLWVLLLWVPGSTGTAHPSPSPRSAGQF (SEQ ID NO: 537);

ET+FT:

METDTLLLWVLLLWVPGSTGEYRMSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTAHPSPSPRSAGQF (SEQID NO:

538);

YT+TF:

METDTLLLWVLLLWVPGSTGYYRMSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTAHPSPSPRSAGQF (SEQ ID NO: 539);

TF de ratón:

METDTLLLWVLLLWVPGSTGTRYPSPSPKPEGRF (SEQ ID NO: 540);

WT+TF de ratón:

METDTLLLWVLLLWVPGSTGWNRLSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTRYPSPSPKPEGRF (SEQ ID NO:

541).

TF+ET triple:

METDTLLLWVLLLWVPGSTGTAHPSPSPRSAGQFTAHPSPSPRSAGQFTAHPSPSPRSAGQFGGGGSGG

GGSGGGGSEYRMSPSNQTEYRMSPSNQTEYRMSPSNQT (SEQ ID NO: 542)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGEYRMSPSNQTEYRMSPSNQTEYRMSPSNQTGGGGSG

GGGSGGGGSTAHPSPSPRSAGQFTAHPSPSPRSAGQFTAHPSPSPRSAGQF (SEQ ID NO: 543).

Otros constructos se prepararon usando una secuencia señal de IL-2 (MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 502), y la región Fc de IgG4 humana (con región bisagra) (SEQ ID NO: 544) o la región Fc de IgG1 murina (con región bisagra) (SEQ ID NO: 545) Los constructos son:

TF solo:

MYRMQLLSCIALSLALVTNSTAHPSPSPRSAGQFISAMVRSPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 546)

ET+FT:

MYRMQLLSCIALSLALVTNSEYRMSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTAHPSPSPRSAG

QFISAMVRSPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVFI NAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLFIODWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 547)

YT+TF:

MYRMQLLSCIALSLALVTNSYYRMSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTAFIPSPSPRSAG

QFISAMVRSPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 548)

TF de ratón:

MYRMQLLSCIALSLALVTNSTRYPSPSPKPEGRFISAMVRSGCKPCICTVPEVSSVFIFPPK PKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGK EFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAE NYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID NO:

549)

WT+TF de ratón:

MYRMQLLSCIALSLALVTNSWNRLSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTRYPSPSPKPEGR

FISAMVRSGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQ PREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDK VSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEG LHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID NO: 550).

EJEMPLO 8

Constructos que comprenden IL-15 e IL-15Ra bajo el control de un promotor de CMV bidireccional

En este ejemplo, se generan una variedad de constructos para co-expresar IL-15 e IL-15Ra bajo el control de un promotor de CMV bidireccional.

En el constructo 1, el promotor bi-CMV dirige la expresión del dominio Sushi de IL-15Ra e IL-15 (Figura 9, SEQ ID No.

557) .

En el constructo 2, el promotor bi-CMV dirige la expresión de IL-15 y la variante 4 de IL-15Ra (Figura 10, SEQ ID No.

558) .

En el constructo 3, el promotor bi-CMV dirige la expresión de IL-15-K5 y del dominio Sushi-E5 de IL-15Ra. (Figura 11, SEQ ID No. 559).

En el constructo 4, el promotor bi-CMV dirige la expresión de IL-15-K5 y la variante 4-E5 de IL-15Ra (Figura 12, SEQ ID No. 560).

EJEMPLO 9

Constructos que comprenden los genes de IL-15 e IL-15Ra bajo el control de un promotor EF1a

En este ejemplo, se generan una variedad de constructos para expresar IL-15 e IL-15Ra en un transcrito multicistrónico bajo el control de un promotor EF1a (SEQ ID NO: 551). IL-15 e IL-15Ra están unidas mediante una secuencia de IRES ejemplar (SEQ ID NO: 552).

En el constructo 1, el promotor EF1a controla la expresión del dominio Sushi de IL-15-IRES-IL-15Ra. (Figura 13, SEQ ID No. 561.)

En el constructo 2, el promotor EF1a controla la expresión de la variante 4 de IL-15-IRES-IL-15Ra (Figura 14, SEQ ID No. 562).

En el constructo 3, el promotor EF1a controla la expresión del dominio Sushi E5 de IL-15K5-IRES-IL-15Ra. (Figura 15, SEQ ID No. 563.)

En el constructo 4, el promotor EF1a controla la expresión de la variante 4E5 de IL-15K5-IRES-IL-15Ra. (Figura 16, SEQ ID No. 564.)

EJEMPLO 10

Constructos que comprenden genes de IL-12, IL-15 e IL-15Ra bajo el control de un promotor de CMVEn este ejemplo, se generan una variedad de constructos para expresar IL-12, IL-15 e IL-15Ra en un transcrito multicistrónico bajo el control de un promotor de CMV. IL-12, IL-15 e IL-15Ra están unidos mediante una secuencia de p2A ejemplar (SEQ ID NO: 554).

En el constructo 1, el promotor de CMV (SEQ ID NO: 553) controla la expresión del dominio Sushi de IL-12-p2A-IL-15-p2A-IL-15Ra. (Figura 17, SEQ ID Nos. 565, 569.)

En el constructo 2, el promotor de CMV controla la expresión de la variante 1 de IL-12-p2A-IL-15-p2AIL-15Ra (Figura 180, SEQ ID Nos. 566, 570).

En el constructo 3, el promotor de CMV controla la expresión del dominio Sushi E5 de IL-12-p2A-IL-15K5-p2A-IL-15Ra. (Figura 19, SEQ ID Nos. 567, 571.)

En el constructo 4, el promotor de CMV controla la expresión de la variante 1E5 de IL-12-p2A-IL-15K5-IRES-IL-15Ra. (Figura 20, SEQ ID Nos. 568, 572.)

EJEMPLO 11

Constructos que comprenden el bloqueante de PD-L1 insertado entre UL3 y UL4

En este ejemplo, se genera un constructo para expresar el péptido bloqueante de PD-L1 dentro de la región intergénica entre U<l>3 y U<l>4 entre las bases 829 y 830. En SEQ ID NO: 556, bases 1-675: secuencia codificante de UL3; bases 676-829: región entre UL3 y UL4 y anterior al casete bloqueante de PD-L1; bases 830-833: región entre UL3 y UL4 y posterior al casete bloqueante de PD-L1; bases 834-1433: secuencia codificante de UL4.

EJEMPLO 12

Inhibición de la unión de PD-L1 humano a PD-1 mediante péptidos bloqueantes

Una placa de fondo plano de 96 pocillos se recubrió con una proteína PD-L1 Fc humana recombinante a 4°C durante la noche. Después de recubrir la placa durante la noche, se añadieron diferentes bloqueantes de PD-L1 a cada pocillo de la placa y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas antes de la adición de la proteína PD-1 Fc humana recombinante. Posteriormente se añadieron a cada pocillo anticuerpo anti-IgG humano biotinilado y estreptavidina-HRP, y se detectó la unión de PD-1 humano a PD-L1 mediante la adición de sustrato TMB. El desarrollo del color se midió mediante un lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm. El porcentaje de inhibición se calculó comparándolo con el control sin péptido sintetizado. La Figura 21 muestra el porcentaje de inhibición por los péptidos ET, ET+TF, YT, YT+TF, TW, TW+TF, WT, WT+TF y TF a dos concentraciones diferentes (3 y 10 pM). A 10 pM, la inhibición osciló entre aproximadamente el 22 % y aproximadamente el 48 %.

EJEMPLO 13

El bloqueo de la unión de PD-L1 mediante péptidos bloqueantes mejora la citotoxicidad contra las células tumorales

Se estimularon células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) con anticuerpo anti-CD3 más IL-2 humana durante 24 horas y posteriormente se incubaron con diferentes bloqueantes de PD-L1 sintetizados y células objetivo marcadas con calceína-AM durante 4 horas. Los sobrenadantes de cultivos celulares se recogieron después de 4 horas de incubación y se midió la fluorescencia de calceína-AM liberada mediante un lector de microplacas. El porcentaje de citotoxicidad se calculó basándose en la siguiente fórmula: [(lectura de muestra - liberación mínima) / (Liberación máxima - liberación mínima)] x 100.

Las Figuras 22A-22D muestran resultados para cuatro células tumorales diferentes: células H460, U87, LS147T y MDA-MB-231. El aumento de la citotoxicidad fue estadísticamente significativo para todos los péptidos excepto para TF en algunas células tumorales.

EJEMPLO 14

Efecto sinérgico de IL-12 e IL-15 sobre la producción de citocinas.

Las PBMCs humanas se incubaron con medio de control, IL-12 sola, IL-15RA sola o IL-12, IL-15 e IL-15Ra1 combinadas más anticuerpo neutralizante anti-IL-12 o anti-IL-15 durante 48 horas. Se recogieron sobrenadantes de cultivos celulares para medir la producción de IFNy y TNFa humanos mediante ELISA.

Las Figuras 23A y 23B muestran resultados de la producción de citocinas. La combinación de IL-12 e IL-15Ra1 provocó un aumento estadísticamente significativo de las citocinas IFNy y TNFa humanas. La producción se inhibió con anticuerpo anti-IL-12.

EJEMPLO 15

Efecto sinérgico de IL-12 e IL-15 sobre la citotoxicidad contra células tumorales.

Se co-incubaron PBMCs humanas con células objetivo tumorales y medio de control, IL-12 sola, IL-15RA sola o IL-12, IL-15 e IL-15RA1 combinadas más anticuerpos anti-IL-12 o anti-IL-15 neutralizantes durante 24 horas. Se recogieron sobrenadantes de cultivos celulares para medir la citotoxicidad mediante el ensayo de LDH. El porcentaje de citotoxicidad se calculó basándose en la siguiente fórmula: [(lectura de muestra - liberación mínima) / (Liberación máxima - liberación mínima)] x 100.

Las Figuras 24A y 24B muestran que IL-12 e IL-15 juntas aumentaron la citotoxicidad de una manera estadísticamente significativa. En la línea celular MDA-MB-231, la adición de anticuerpos anti-IL-12 o IL-15 redujo significativamente el efecto.

EJEMPLO 16

EFICACIA IN VITRO DE LOS VIRUS VG161-PLBH Y VG161-15H

En este ejemplo, se sembraron 3 x 104 células tumorales H460 o LS174T en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se cultivaron a 37°C durante la noche. Al día siguiente, las células sembradas se infectaron con el virus principal VG001, VG161 -PLBh o VG161 -15h (MOI = 1) durante 24 horas y se evaluaron las producciones de IL-12 humana, IL-15 humana e IgG4 humana (Figuras 25A-C). Posteriormente se añadieron 3x105 PBMCs humanas al cultivo y se incubaron conjuntamente durante 24 horas para evaluar la citotoxicidad mediante el ensayo de LDH (Figura 25D) o 48 horas para la producción de IFNg humana mediante ELISA (Figura 25E). Para el ensayo de citotoxicidad, el porcentaje de citotoxicidad se calculó basándose en la siguiente fórmula: [(lectura real - liberación mínima) / (Liberación máxima - liberación mínima)] x 100%. El sobrenadante recogido de las células tumorales incubadas sólo con medio se utilizó como liberación mínima, y el sobrenadante recogido de las células tumorales incubadas con tampón de lisis se utilizó como liberación máxima.

EJEMPLO 17

EFICACIA IN VITRO DE DIVERSOS CONSTRUCTOS

Las Figuras 26A-26D muestran los resultados de ensayos in vitro para diversos constructos.

Las Figuras 26A-26B muestran los resultados de transfección celular con el plásmido IL-TF-Fc que lleva IL-12, IL-15 y un bloqueante de PD-L1. En las Figuras 26A-26B, se transfectaron diferentes líneas de células tumorales con DNA del plásmido IL-TF-Fc durante 24 horas y posteriormente se añadieron PBMCs humanas al cultivo. Los sobrenadantes celulares se recogieron después de 24 horas para la cuantificación de la citotoxicidad mediante el ensayo de LDH (Figura 26A), y después de 48 horas para la detección de la producción de IFNg humana mediante el ensayo ELISA (Figura 26B).

Las Figuras 26C-26D muestran los resultados de infección celular con una variedad de virus mutantes incluyendo hVG161. IL12, IL15 y el bloqueante de PD-L1 codificados viralmente mejoran sinérgicamente la producción de IFNg y la citotoxicidad. Se sembraron células tumorales H460 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se cultivaron a 37°C durante la noche. Al día siguiente, las células sembradas se infectaron con los virus indicados a MOI = 1 durante 24 horas. Posteriormente se añadieron PBMCs humanas al cultivo y se incubaron conjuntamente durante 24 horas para evaluar la citotoxicidad mediante el ensayo de LDH (Figura 26C) o 48 horas para la producción de IFNg humana mediante ELISA (Figura 26D). Para el ensayo de citotoxicidad, el porcentaje de citotoxicidad se calculó basándose en la siguiente fórmula: [(lectura real - liberación mínima) / (Liberación máxima - liberación mínima)] x 100%. El sobrenadante recogido de las células tumorales incubadas sólo con medio se utilizó como liberación mínima, y el sobrenadante recogido de las células tumorales incubadas con tampón de lisis se utilizó como liberación máxima.

En las Figuras 27A-27E, se infectó un panel de 9 líneas de células tumorales humanas diferentes (más células Vero) con los virus VG161 -1212PLBh (VG161 h) y HSV-345 en MOI 0, 0,04, 0,2, 1 y 5. La viabilidad celular fue cuantificado mediante el ensayo MTT a las 48 horas después de la infección.

Las Figuras 28A-28J muestran los resultados de ensayos in vitro para diversos constructos. Las Figuras 28A-28E muestran los resultados de ensayos de viabilidad celular para mVG161 y HSV-345 en líneas de células tumorales de ratón y línea celular Vero; las Figuras 28F-28J muestran la caracterización de la expresión transgénica después de la infección con mVG161 o VG001 de células tumorales de ratón CT26.

En las Figuras 28A-28E, se infectó un panel de 6 líneas de células tumorales de ratón diferentes (más células Vero) con los virus VG161m y HSV-345 a m O i 0, 0,04, 0,2, 1 y 5. La viabilidad celular se cuantificó usando el ensayo MTT a 48 horas después de la infección.

En las figuras 28F-28J, se sembraron 3 x 104 células tumorales CT26 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se cultivaron a 37°C durante la noche. Al día siguiente, las células sembradas se infectaron con el virus principal VG001 o el virus VG161-1215PLBm (MOI = 1) durante 24 horas y se evaluó la producción de IL-12 de ratón, IL-15 humana e IgG de ratón. Posteriormente se añadieron 3x105 esplenocitos de ratón Balb/c al cultivo y se incubaron conjuntamente durante 24 horas para evaluar la citotoxicidad mediante el ensayo de LDH o 48 horas para la producción de IFNg de ratón mediante ELISA. Para el ensayo de citotoxicidad, el porcentaje de citotoxicidad se calculó basándose en la siguiente fórmula: [(lectura real - liberación mínima) / (Liberación máxima - liberación mínima)] x 100%. El sobrenadante recogido de células tumorales incubadas sólo con medio se utilizó como liberación mínima, y el sobrenadante recogido de células tumorales incubadas con tampón de lisis se utilizó como liberación máxima.

En las figuras 29A-29E, se sembraron 3 x 104 células tumorales H460, LS174T o UMUC3 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se cultivaron a 37°C durante la noche. Al día siguiente, las células sembradas se infectaron con el virus principal VG001 y el virus VG161-1215h (MOI = 1) durante 24 horas y se evaluaron las producciones de IL-12 humana, IL-15 humana e IgG4 humana (18R). Posteriormente se añadieron 3x105 PBMCs humanas al cultivo y se incubaron conjuntamente durante 24 horas para evaluar la citotoxicidad mediante el ensayo de LDH (18S) o 48 horas para la producción de IFNy humana mediante ELISA (18T). Para el ensayo de citotoxicidad, el porcentaje de citotoxicidad se calculó basándose en la siguiente fórmula: [(lectura real - liberación mínima) / (Liberación máxima -liberación mínima)] x 100%. El sobrenadante recogido de células tumorales incubadas sólo con medio se utilizó como liberación mínima, y el sobrenadante recogido de células tumorales incubadas con tampón de lisis se utilizó como liberación máxima.

En las Figuras 30A-30G, se evaluó el efecto antitumoral del virus VG161-1215PLBh (hVG161) en una variedad de células cancerosas humanas que incluyen U87, MCF7, H460, LNCaP, LS174T, MDA y PC3 a las 72 h después de la infección y MOls que varían de 0 a 5. El porcentaje de supervivencia celular se cuantificó mediante el ensayo MTT. El virus VG161 -1215PLBh muestra una sólida capacidad de destrucción celular en todas las líneas de células tumorales humanas analizadas.

EJEMPLO 18

EFICACIA IN VIVO DE LOS CONSTRUCTOS VIRALES DE VG161

En las Figuras 31A-31B, a ratones BALB/c que portaban tumores de linfoma de células B murinos A20 se les inyectó 5 veces por vía intratumoral con un total de 1 x 10A7 PFU/ratón del virus VG161-1215PLBm (mVG161) o del virus principal VG001 o con PBS (vehículo de control). Las mediciones del tamaño del tumor se realizaron en los momentos indicados después de la inyección. Los ratones tratados con VG161-1215PLBm mostraron una reducción significativa (P <0,05) en el volumen del tumor en comparación con los ratones tratados con PBS.

En las Figuras 31C-31D, a ratones BALB/c que portaban tumores de carcinoma de colon murino CT26 se les inyectó 5 veces por vía intratumoral con un total de 5 x 10A6 PFU/ratón del virus VG161-1215PLBm (mVG161) o del virus principal VG001 o con PBS (vehículo de control). Las mediciones del tamaño del tumor se realizaron en los momentos indicados después de la inyección. Los ratones tratados con VG161-1215PLBm mostraron una reducción significativa (P <0,05) en el volumen del tumor en comparación con los ratones tratados con PBS.

En las Figuras 31E-31G, se evaluó el tratamiento con oHSV de tumores de próstata humanos con xenoinjertos en ratones. A doce ratones se les implantaron con células tumorales de próstata humana LNCaP en el flanco inferior derecho. A los 35 días después de la implantación, a un grupo de 6 animales seleccionados al azar se les inyectó dos veces por vía intratumoral un total de 5 x 10A7 PFU/ratón del virus VG161-1215PLBh (hVG161), mientras que los 6 animales restantes sirvieron como vehículo de control y se les inyectó dos veces con un volumen equivalente de PBS. Las mediciones del tamaño del tumor se realizaron utilizando dos métodos diferentes. Las mediciones del calibrador se expresan como veces del cambio en el volumen del tumor en un momento dado en comparación con el volumen del tumor en el momento de la inyección del virus o PBS (Figura 31E). Los ratones portadores de tumores tratados con el virus VG161 -1215PLBh mostraron una fuerte contracción del tumor durante el transcurso del estudio con una reducción de más del 50% en el tamaño del tumor al final de los 15 días, mientras que los ratones tratados con vehículo mostraron aumentos de aproximadamente 3 veces en el volumen del tumor durante el mismo lapso de tiempo. El crecimiento del tumor también se controló utilizando un sistema de imágenes bioluminiscentes de animales completos (IVIS Imaging System; Xenogen, Mountain View, CA). Las intensidades de las señales se cuantificaron como la suma de todos los fotones detectados por segundo (Figura 31F). Las imágenes cuantitativas del crecimiento del tumor utilizando el sistema IVIS muestran una reducción aún más espectacular en el tamaño del tumor en los animales tratados con oHSV en comparación con los controles tratados con PBS, con una fluorescencia que cae a niveles indetectables 50 días después de la implantación del tumor (Figura 32G; dos vehículos de control en la izquierda y dos ratones tratados con oHSV en la derecha).

EJEMPLO 19

REPLICACIÓN DE HVG161 EN LÍNEAS CELULARES

La curva de crecimiento y los datos de citotoxicidad en las Figuras 32A-C, Figuras 33A-D y Figuras 34A-E muestran que los virus hVG161 se replican tan bien como el virus HSV-345 parental. Estos datos también muestran que los virus no crecen tan bien en líneas de células tumorales de ratón en comparación con líneas de células humanas, pero se sabe que el HSV-1 crece mal en células de ratón.

EJEMPLO 20

Evaluación de modificaciones de virus.

Las PBMCs humanas se estimularon con medio solo, IL-12 recombinante sola, IL-15 recombinante sola o IL-12 más diferentes formas del complejo IL-15/IL-15RA1 con o sin anticuerpo neutralizante anti-IL-12 (6 mg/ml) o anti-IL-15 (0,5 mg/ml) durante 48 horas. Posteriormente se recogieron los sobrenadantes cultivados para la producción de IFNg humana y TNFa humana usando ensayos ELISA como se muestra en las Figuras 35 A y 35 B.

Para evaluar la citotoxicidad contra las células tumorales, se incubaron conjuntamente células tumorales marcadas con calceína-AM con PBMCs humanas estimuladas durante 24 horas. Se recogieron los sobrenadantes para medir la fluorescencia liberada. El sobrenadante recolectado de células tumorales marcadas con calceína incubadas solo con medio se usó como liberación mínima, y el sobrenadante recolectado de células tumorales marcadas con calceína incubadas con tampón de lisis se usó como liberación máxima. El porcentaje de citotoxicidad se calculó basándose en la fórmula: [(lectura real - liberación mínima) / (Liberación máxima - liberación mínima)] x 100%. El resultado de citotoxicidad para las células tumorales U87 se muestra en la Figura 35C y las células tumorales MDA-MB-231 se muestran en la Figura 35D.

EJEMPLO 21

Datos de eficacia in vitro

Se estimularon células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) con medio solo, IL-12 recombinante sola, IL-15 recombinante sola o complejo IL-12 más IL-15/IL-15RA1 con o sin anticuerpo neutralizante anti-IL-12 (6 mg/ml) o anti-IL-15 (0,5 mg/ml) durante 48 horas. Posteriormente se recogieron los sobrenadantes cultivados para la producción de IFNg humana y TNFa humana usando ensayos ELISA como se muestra en las Figuras 36A y B.

Para evaluar la citotoxicidad contra células tumorales, 1 x 104 células tumorales marcadas con calceína-AM se incubaron conjuntamente con 1 x 105 PBMCs humanas estimuladas durante 24 horas. Se recogieron los sobrenadantes para medir la fluorescencia liberada. El sobrenadante recolectado de las células tumorales marcadas con calceína incubadas solo con medio se usó como liberación mínima, y el sobrenadante recolectado de las células tumorales marcadas con calceína incubadas con tampón de lisis se usó como liberación máxima. El porcentaje de citotoxicidad se calculó basándose en la fórmula: [(lectura real - liberación mínima) / (Liberación máxima - liberación mínima)] x 100%. Los resultados de citotoxicidad para las células tumorales U87 se muestran en la Figura 36C y los resultados para las células tumorales MDA-MB-231 se muestran en la Figura 36D.

EJEMPLO 22

Las células tumorales infectadas con VG161h producen IL-12 humana, IL-15/IL15Ra humana e IgG4 humana.

Brevemente, se implantaron células LNCaP en ratones nude y se les inyectó un vehículo, el virus ICP27- o VG161h. Se recogieron muestras de suero y tumor 120 horas después de la inyección y se evaluaron mediante ELISA las producciones de IL-12 humana, IL-15/IL-15Ra humana e IgG4 humana. Los resultados se muestran en la Figura 37 A.

Se implantaron células Fadu en ratones nude y se les inyectó el vehículo, el virus VG160 o VG161h. Se recogieron muestras de tumores 24 horas después de la inyección y se evaluaron mediante ELISA las producciones de IL-12 humana, IL-15/IL-15Ra humana e IgG4 humana. Los resultados se muestran en la Figura 37B.

EJEMPLO 23

Efecto de VG161m en la respuesta inmune.

Se implantaron células de cáncer de colon CT26 en ratones balb/c y recibieron una inyección de PBS, virus VG160 o VG161m. Se recogieron muestras de tumores 24 horas después de la inyección y se evaluó mediante citometría de flujo el porcentaje de células T CD8+, células T CD4+ o células NK. Los resultados se muestran en las Figuras 38A-C.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un vector oncolítico HSV que comprende uno o más casetes de expresión para IL12, IL15 y una subunidad alfa del receptor IL15.

2. El vector HSV de la reivindicación 1, en donde una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido 2A autoexcindible se sitúan en un marco entre secuencias codificantes para IL12, IL15 y una subunidad alfa del receptor IL15.

3. El vector HSV de la reivindicación 2, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido 2A autoescindible seleccionado del grupo que consiste en VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP, QCTNYALLKLAGDVESNPGP, ATNF-SLLKQAGDVEENPGP, HYAGYFADLLIHDIETNPGP, GIFN-AHYAGYFADLLIHDIETNPGP, KAVRGYHADYYKQRLIHDVEMNPGP, GATNF-SLLKLAGDVELNPGP, EGRGSLLTCGDVEENPGP, AARQMLLLLSGDVETNPGP, FLRKRTQLLMSGDVESNPGP, GSWTDILLLLSGDVETNPGP, TRAEUEDELIRAGIESNPGP, AKFQIDKILISGDVELNPGP, SKFQIDKILISGDIELNPGP, SSIIRTKMLVSGDVEENPGP y CDAQRQKLLLSGDIEQNPGP.

4. El vector HSV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde una o más secuencias de IRES están situadas entre las secuencias codificantes para IL12, IL15 y/o una subunidad alfa del receptor IL15.

5. El vector HSV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la IL15 y una subunidad alfa del receptor IL15 se expresan mediante un promotor bidireccional.

6. El vector HSV de la reivindicación 5, en donde el promotor bidireccional es bi-CMV.

7. El vector HSV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la subunidad alfa del receptor IL15 se selecciona del grupo que consiste en la variante 1, la variante 2, la variante 3 y la variante 4.

8. El vector HSV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además un casete de expresión para uno o más péptidos bloqueantes de PD-L1.

9. El vector HSV de la reivindicación 8, que comprende además una secuencia que codifica un enlazador peptídico entre múltiples péptidos bloqueantes de PD-L1.

10. El vector HSV de la reivindicación 8, que comprende además una secuencia que codifica un dominio Fc unido al extremo 3' del péptido bloqueante de PD-L1.

11. El vector HSV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el casete de expresión se inserta en una región de repetición interna, una región de repetición terminal, entre los genes US1 y US2, los genes virales UL3 y UL4, o los genes UL50 y UL51.

12. El vector HSV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además un NFkB y un elemento potenciador de OCT4/SOX2 en las regiones reguladoras ICP4 o ICP27.

y/o en donde los genes ICP34.5 están eliminados,

y/o en donde el casete de expresión comprende al menos un promotor celular,

y/o en donde el HSV es HSV-1 o HSV-2,

y/o en donde el gen ICP34.5 está regulado por una 3'UTR que contiene secuencias objetivo de miRNAs que están infraexpresadas en células tumorales.

13. Una composición farmacéutica que comprende un vector HSV según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Un vector HSV según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una composición farmacéutica según la reivindicación 13 para su uso en un método de tratamiento del cáncer, que comprende administrar a un paciente el vector HSV o la composición farmacéutica.

15. El vector HSV o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 14, en donde dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinomas, leucemias, linfomas, mielomas y sarcomas.