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ES2965958T3 - Reparación pulmonar terapéutica mediante inhalación de exosomas de esferoides pulmonares - Google Patents

Reparación pulmonar terapéutica mediante inhalación de exosomas de esferoides pulmonares Download PDF

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ES2965958T3
ES2965958T3 ES19826230T ES19826230T ES2965958T3 ES 2965958 T3 ES2965958 T3 ES 2965958T3 ES 19826230 T ES19826230 T ES 19826230T ES 19826230 T ES19826230 T ES 19826230T ES 2965958 T3 ES2965958 T3 ES 2965958T3
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cells
cell
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Phuong-Uyen Dinh
Ke Cheng
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North Carolina State University
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Abstract

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es actualmente la forma más mortal de enfermedad pulmonar intersticial idiopática en la que las lesiones pulmonares persistentes provocan la formación de tejido cicatricial. Se proporcionan métodos y composiciones para el tratamiento de afecciones pulmonares tales como fibrosis. Los medios condicionados derivados de células esferoides de pulmón (LSC-CM) y los exosomas (LSC-EXO) se utilizan para tratar diferentes modelos de lesión pulmonar. El tratamiento por inhalación con composiciones derivadas de LSC-CM y LSC-EXO puede atenuar y/o revertir la fibrosis inducida por bleomicina y sílice, restablecer la estructura alveolar normal y disminuir la acumulación de matriz extracelular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Reparación pulmonar terapéutica mediante inhalación de exosomas de esferoides pulmonares
Referencias cruzada a las solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad y los beneficios de la solicitud provisional de los Estados Unidos 62/691,811 titulada “THERAPEUTIC LUNG REPAIR BY INHALATION OF LUNG SPHEROID CELL-SECRETED FACTORS” presentada el 29 de junio de 2018.
Campo técnico
La presente descripción se relaciona generalmente con el tratamiento de una afección patológica pulmonar que responde a un secretoma derivado de células madre o una fracción del mismo.
Antecedentes
Todo el cuerpo humano y todos sus órganos están recubiertos por una capa protectora de células epiteliales. Las células epiteliales en los pulmones no solo facilitan el intercambio de oxígeno sino que también defienden contra la exposición continua a irritantes y toxinas inhalados cada día. Afortunadamente, los pulmones tienen la capacidad de experimentar una regeneración facultativa debido a las poblaciones de células madre y progenitoras residentes que son esenciales para mantener la homeostasis y la reparación del tejido en respuesta a lesiones pulmonares agudas y/o crónicas.
Sin embargo, la morbilidad y la mortalidad relacionadas con las enfermedades respiratorias están en aumento. Algunas lesiones pulmonares crónicas se han relacionado con factores ambientales o estilos de vida como el tabaquismo. La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una forma progresiva y fatal de enfermedad pulmonar intersticial, caracterizada por focos fibroblásticos, panal alveolar y fibrosis persistente y no remitente que eventualmente conduce a la destrucción de la arquitectura pulmonar y en última instancia a una insuficiencia respiratoria completa. Dado que se desconocen los mecanismos patológicos exactos y la causa de la FPI, la enfermedad tiene un mal pronóstico. Quedan pocas opciones de tratamiento para la FPI. Hasta la fecha, solo existen dos terapias aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), pirfenidona y nintedanib, pero estos tratamientos son solo paliativos y simplemente retrasan la progresión de la enfermedad. No detienen ni revierten la fibrosis que está ya establecida.
A medida que siguen evolucionando nuevas estrategias de tratamiento, las terapias basadas en células han surgido como una opción prometedora en múltiples ensayos clínicos que utilizan células madre. Aunque las células madre tienen efectos beneficiosos, sus aplicaciones clínicas enfrentan muchos desafíos que incluyen mano de obra extensiva, alto costo y problemas de seguridad. La terapia basada en células conlleva un cierto riesgo de tumorigenicidad e inmunogenicidad, junto con problemas de estabilidad celular, ya que todas las células madre y progenitoras tienen un riesgo inherente de transformación durante los cultivos celulares in vitro prolongados. Además, los productos de terapia celular necesitan conservarse y procesarse cuidadosamente antes de su aplicación clínica. La evidencia acumulada indica que la capacidad regenerativa de las células madre adultas se debe principalmente a su actividad paracrina. Por lo tanto, la utilización del secretoma de células madre o medios acondicionados (CM) de células madre en lugar de las células reales podría mitigar no solo estas limitaciones sino también retener los beneficios regenerativos de las terapias basadas en células.
Resumen
La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.
Un aspecto de la descripción abarca modalidades de una composición farmacéutica que comprende una población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares en una cantidad efectiva para modular una afección patológica pulmonar cuando se suministra a un sujeto animal o humano que lo necesita.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la afección patológica pulmonar es fibrosis pulmonar.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica puede comprender al menos uno de: un polipéptido aislado, un péptido aislado o un ácido nucleico aislado, y en donde el polipéptido aislado, péptido aislado o ácido nucleico aislado se secreta por un cultivo de células esferoides pulmonares.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica puede comprender una población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares aislados de un medio acondicionado con células esferoides pulmonares.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, el ácido nucleico puede ser un miARN.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica administrada a las vías respiratorias del sujeto animal o humano puede comprender además un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica puede ser un medio de cultivo celular acondicionado liofilizado generado mediante el cultivo de una población de células esferoides pulmonares en el mismo.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica administrada a las vías respiratorias de un sujeto animal o humano mediante el nebulizador puede ser un polvo liofilizado.
Otro aspecto de la descripción abarca modalidades de un método para producir una composición farmacéutica que comprende una población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares, el método comprende las etapas de: (a) obtener una población de células madre pulmonares aisladas de un tejido pulmonar de un sujeto animal o humano; (b) generar un medio de cultivo celular acondicionado mediante el cultivo de la población aislada de células madre en un medio de cultivo celular; y (c) retirar las células cultivadas del medio de cultivo acondicionado.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, el método puede comprender además la etapa de aislamiento del medio de cultivo celular acondicionado al menos uno de (a) un polipéptido aislado, un péptido aislado o un ácido nucleico aislado secretado por una célula esferoide pulmonar cultivada en el cultivo celular acondicionado, o (b) una población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares generadas por una población de células esferoides pulmonares cultivada en el medio de cultivo celular acondicionado.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, el método puede comprender además la etapa de liofilizar el medio de cultivo acondicionado.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, el método puede comprender además la etapa de liofilizar al menos uno de (a) al menos uno de un polipéptido aislado, un péptido aislado o un ácido nucleico aislado secretado por una célula esferoide pulmonar cultivada en el cultivo celular acondicionado, o (b) una población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares generadas por una población de células esferoides pulmonares cultivadas en el medio de cultivo celular acondicionado.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, el método del producto liofilizado del método se puede combinar con un medio farmacéuticamente aceptable.
Aún otro aspecto de la descripción abarca modalidades de un método para tratar una afección patológica de un sistema pulmonar animal o humano, en donde el método comprende administrar a una región de las vías respiratorias de un sujeto animal o humano una composición farmacéutica que comprende un medio acondicionado con células esferoides pulmonares o un agente terapéutico secretado por células esferoides pulmonares, o una población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares en una cantidad efectiva para modular una afección patológica pulmonar cuando se suministra al animal o sujeto humano que la necesita.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la afección patológica pulmonar es fibrosis pulmonar. En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica puede comprender al menos uno de: un polipéptido aislado, un péptido aislado o un ácido nucleico aislado, y en donde el polipéptido aislado, péptido aislado o ácido nucleico aislado se secreta por un cultivo de células esferoides pulmonares.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica puede comprender una población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares aislados de un medio acondicionado con células esferoides pulmonares.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, el ácido nucleico puede ser un miARN.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica administrada a las vías respiratorias del sujeto animal o humano puede comprender además un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica puede ser un medio de cultivo celular acondicionado liofilizado generado mediante el cultivo de una población de células esferoides pulmonares en el mismo.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica administrada a las vías respiratorias de un sujeto animal o humano mediante el nebulizador puede ser un polvo liofilizado.
Breve descripción de las figuras
Otros aspectos de la presente descripción se apreciarán más fácilmente al revisar la descripción detallada de sus diversas modalidades, descritas más abajo, cuando se toman junto con las figuras adjuntas.
Las Figuras 1A-1I ilustran que los medios acondicionados con células madre revierten el daño de las células epiteliales alveolares causado por la lesión crónica por Bleomicina.
La Figura 1A ilustra un esquema del procedimiento de medios acondicionados y el esquema del estudio experimental; n = 6-7 por grupo.
La Figura 1B ilustra una vista macroscópica de los pulmones explantados en el punto final del estudio.
Las Figuras 1C y 1D ilustran la tinción Túnel representativa de células apoptóticas para cada grupo de tratamiento (Figura 1C) y la cuantificación del por ciento de células Túnel positivas (Figura 1D); Escala gráfica = 100 pm *P < 0,05; cada punto representa datos de un animal; n = 6.
La Figura 1E ilustra una tinción H&E representativa. Arriba: Escala gráfica = 500 pm Parte inferior: Escala gráfica = 200 pm.
La Figura 1F ilustra una cuantificación de la fibrosis mediante la puntuación de Ashcroft; *P < 0,05; ***P < 0,001; cada punto representa datos de un animal; n = 7.
La Figura 1G ilustra fibras musculares, colágeno, núcleos y eritrocitos representativos con tinción tricrómica de Gomori. Escala gráfica = 1000 pm.
La Figura 1H ilustra una tinción con picrosirius representativa de los tipos de colágeno I y III. Escala gráfica = 50 pm. La Figura 1I ilustra la cuantificación de los niveles pulmonares de hidroxiprolina; *P < 0,05; ***P < 0,001; cada punto representa datos de un animal; n = 6.
Las figuras 2A-2G ilustran que el tratamiento por inhalación de CEP-CM promueve la reparación alveolar.
La Figura 2A ilustra la inmunotinción representativa de secciones de pulmón para el factor von Willebrand (vWF), la proproteína C surfactante (Pro-SPC) y la acuaporina 5 (AQP5). Escala gráfica = 100 pm.
Las Figuras 2B-2D ilustran la cuantificación del por ciento de intensidad de píxeles de vWF+ (Figura 2B), ProSPC+ (Figura 2C) y AQP5+ (Figura 2D). *P < 0,05; **P < 0,01; cada punto representa datos de un animal; n = 4.
Las Figuras 2E-2F ilustran el análisis de transferencia Western de actina alfa del músculo liso (aSMA) (Figura 2E), metaloproteinasa de matriz 2 (MMP2) (Figura 2F) y control de carga de GAPDH con la correspondiente cuantificación de los niveles de proteína como veces del grupo control; *P < 0,05; cada punto representa datos de un animal; n = 3. La Figura 2G ilustra una serie representativa de citocinas con cuantificación de intensidad relativa; * P < 0,05 en comparación con el control; # P < 0,05 en comparación con PBS.
Las Figuras 3A-3K ilustran la reparación pulmonar y la fibrosis en ratones después de una lesión por sílice.
La Figura 3A ilustra un esquema de un estudio experimental del estudio de fibrosis inducida por sílice en ratones A/J; n = 10 por grupo.
La Figura 3B ilustra la tinción Túnel representativa de células apoptóticas para cada grupo de tratamiento y la cuantificación del por ciento de células Túnel positivas; Escala gráfica = 50 pm; cada punto representa datos de un animal; n = 5.
La Figura 3C ilustra una tinción H&E representativa. Escala gráfica = 100 pm
La Figura 3D ilustra la cuantificación de la fibrosis mediante la puntuación de Ashcroft; *P < 0,05; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; cada punto representa datos de un animal; n = 4.
La Figura 3E ilustra la tinción tricrómica de Gomori de fibras musculares, colágeno, núcleos y eritrocitos. Escala gráfica = 100 pm.
La Figura 3F ilustra la tinción con picrosirius de colágeno tipos I y III. Escala gráfica = 100 pm.
La Figura 3G ilustra la cuantificación de los niveles pulmonares de hidroxiprolina; *P < 0,05; cada punto representa datos de un animal; n = 4.
La Figura 3H ilustra una inmunotinción representativa de secciones de pulmón para acuaporina 5 (AQP5), proproteína C surfactante (Pro-SPC) y factor von Willebrand (vWF). Escala gráfica = 50 |jm.
Las Figuras 3I-3K ilustran la cuantificación del por ciento de intensidad de píxeles de AQP5+ (Figura 3I), ProSPC+ (Figura 3J) y vWF+ (Figura 3K). *P < 0,05; cada punto representa datos de un animal; n = 4.
Las Figuras 4A-4D ilustran un análisis proteómico de CEP-CM.
La Figura 4A ilustra un diagrama de Venn de proteínas identificadas en tres CEP-CM.
La Figura 4B ilustra un gráfico circular de la ubicación subcelular de proteínas de todas las proteínas comunes en los tres CEP-CM.
La Figura 4C ilustra una abundancia relativa de 20 de las 103 proteínas extracelulares identificadas en los tres CEP-CM.
La Figura 4D ilustra un gráfico circular de ontología genética del proceso biológico asociado con las proteínas extracelulares compartidas.
Las Figuras 5A-5L ilustran el potencial terapéutico del tratamiento por inhalación de exosomas en ratas después de una lesión por Bleo.
La Figura 5A ilustra un análisis de tamaño de partículas de exosomas frescas y congeladas mediante NTA NanoSight. La Figura 5B ilustra una micrografía electrónica de transmisión (MET) representativa de CEP-EXO. Escala gráfica izquierda = 0,2 jm . Escala gráfica derecha = 50 nm.
La Figura 5C ilustra un análisis de transferencia Western de las proteínas CD63, CD81 y GAPDH en CEP y CMM-EXO.
La Figura 5D ilustra un esquema del estudio experimental del estudio de exosomas en ratas SD; n = 12 por grupo. La Figura 5E ilustra una tinción H&E representativa Arriba: Escala gráfica = 100 jm Parte inferior: Escala gráfica = 50 jm y tinción tricrómica de Gomori. Escala gráfica = 100 jm (parte inferior); fibras musculares, colágeno, núcleos y eritrocitos.
La Figura 5F ilustra una cuantificación de la fibrosis mediante la puntuación de Ashcroft; Escala gráfica = jm ***P < 0,001; ****P < 0,0001; cada punto representa datos de un animal; n = 12.
La Figura 5G ilustra una cuantificación de los niveles pulmonares de hidroxiprolina; *P < 0,05; cada punto representa datos de un animal; n = 4.
La Figura 5H ilustra una tinción con picrosirius representativa de los tipos de colágeno I y III;Escala gráfica = 50 jm . La Figura 5I ilustra un análisis de transferencia Western de metaloproteinasa 2 de matriz (MMP2), actina alfa del músculo liso (aSMA), SMAD3 y control de carga de GAPDH.
La Figura 5J ilustra una inmunotinción representativa de secciones de pulmón para acuaporina 5 (AQP5), actina alfa del músculo liso (aSMA) y factor von Willebrand (vWF). Escala gráfica = 75 jm .
La Figura 5K ilustra una cuantificación de la intensidad de píxeles de AQP5 y vWF. *P < 0,05; **P < 0,01; cada punto representa datos de un animal; n = 4.
La Figura 5L ilustra una cuantificación de la intensidad de píxeles de aSMA. *P < 0,05; cada punto representa datos de un animal; n = 4.
Las Figuras 6A-6K ilustran que el tratamiento con exosomas mejora la función pulmonar post-Bleo y el perfil de miARN de exosomas.
La Figura 6A ilustra una serie representativa de citocinas de rata que detecta 19 proteínas de rata en el suero sanguíneo. *P < 0,05 del grupo PBS; # P < 0,05 del grupo control
La Figura 6B ilustra un esquema de mediciones de la función pulmonar.
Las Figuras 6C-6G ilustran la cuantificación de mediciones de la función pulmonar; *P < 0,05; **P < 0,01. (Figura 6C) capacidad inspiratoria pulmonar; (Figura 6D); resistencia pulmonar (Figura 6E) distensibilidad pulmonar; (Figura 6F) elastancia pulmonar; (Figura 6G) área de histéresis.
La Figura 6H ilustra una relación entre el volumen espiratorio forzado (VEF) y la capacidad vital forzada (CVF). La Figura 6I ilustra un gráfico de análisis de componentes principales del contenido de microARN de exosomas de CEP y CMM.
La Figura 6J ilustra un gráfico de Volcán de miARN expresado diferencialmente de contenido de miARN de exosomas de CEP y CMM.
La Figura 6K ilustra una distribución de los 10 miARN principales en exosomas de CEP (arriba) y exosomas de CMM (parte inferior).
Las Figuras 7A-7C ilustran las proteínas encontradas en tres secretomas de células madre esferoides pulmonares cultivadas en diferentes de medio de cultivo acondicionado.
La Figura 8 ilustra las identidades de los miARN encontrados en el medio acondicionado de tres poblaciones de líneas celulares de esferoides pulmonares cultivadas.
La Figura 9 ilustra las identidades de los miARN encontrados en el medio acondicionado de dos poblaciones de líneas de células madre mesenquimales cultivadas.
La Figura 10 ilustra los cambios en el peso corporal de ratones tratados con bleomicina después del suministro del medio acondicionado con células esferoides pulmonares.
La Figura 11 ilustra la confirmación de la eficacia de la nebulización para suministrar un líquido en aerosol marcado con tinte azul de metileno a los pulmones de ratones.
La Figura 12 ilustra una serie de gráficos que muestran que el medio acondicionado o el tratamiento con exosomas no alteraron la función renal ni hepática.
La Figura 13 ilustra un análisis histológico de órganos de animales tratados en estudios tanto de Bleo como de sílice que no muestran daño o toxicidad debido a la exposición al medio de cultivo acondicionado o exosomas derivados de células esferoides pulmonares.
La Figura 14 ilustra una serie de gráficos circulares que muestran la distribución de especies de miARN en los exosomas derivados de tres poblaciones de células esferoides pulmonares.
La Figura 15 ilustra una serie de gráficos circulares que muestran la distribución de especies de miARN en los exosomas derivados de dos poblaciones de células madre mesenquimales.
Descripción detallada
Antes que la presente descripción se describa con mayor detalle, debe entenderse que esta descripción no se limita a las modalidades particulares descritas y, como tal pueden, por supuesto, variar. Se deberá entender también que la terminología usada en la presente descripción es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente descripción se limitará solamente por las reivindicaciones anexas.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dicte claramente de cualquier otra manera, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor intermedio o indicado en ese intervalo establecido, se incluye dentro de la descripción. Los límites inferior y superior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también se incluyen dentro de la descripción, sujetos a cualquier límite excluido específicamente en el intervalo indicado. Donde el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la descripción. A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción pueden también usarse en la práctica o las pruebas de la presente descripción, los materiales y métodos preferentes se describen ahora.
La cita de cualquier publicación es por su descripción anterior a la fecha de presentación y no deben interpretarse como una admisión de que la presente descripción no tiene derecho a anteceder tal publicación en virtud de la descripción anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas podrían ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.
Como serán evidentes para aquellos expertos en la técnica con la lectura de esta descripción, cada una de las modalidades individuales que se describen e ilustran en la presente descripción tienen componentes y características distintas que fácilmente pueden separarse de, o combinarse con, las características de cualquiera de otras muchas modalidades sin apartarse del alcance o espíritu de la presente descripción. Cualquier método mencionado puede realizarse en el orden de los eventos mencionados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.
Las modalidades de la presente descripción emplearán, a menos que se indique de otra forma, técnicas de medicina, química orgánica, bioquímica, biología molecular, farmacología y similares, las cuales están dentro de las habilidades en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía.
Debe señalarse que, como se usa en la descripción y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto claramente lo indique de cualquier otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a "un soporte" incluye una pluralidad de soportes. En esta descripción y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a un número de términos que se definirán de modo que tengan los siguientes significados a menos que sea evidente una intención contraria.
Como se usa en la presente descripción, los siguientes términos tienen los significados atribuidos a estos, a menos que se especifique de cualquier otra manera. En esta descripción, "comprende", "que comprende", "que contiene" y "que tiene" y similares pueden tener el significado que se les atribuye en la ley de patente de Estados Unidos y pueden significar "incluye", "que incluye" y similares; "que consiste esencialmente en" o "consiste esencialmente" o similar, cuando se aplica a métodos y composiciones abarcadas por la presente descripción se refiere a composiciones como las divulgadas en la presente descripción, pero que pueden contener grupos estructurales, componentes de composición o etapas de método adicionales (o análogos o derivados de los mismos como se discutió anteriormente). Sin embargo, dichos grupos estructurales, componentes de la composición o etapas del método adicionales, etc., no afectan materialmente las características básicas y novedosas de las composiciones o métodos, en comparación con las de las composiciones o métodos correspondientes que se describen en la presente descripción.
Antes de describir las diversas modalidades, se proporcionan las siguientes definiciones y deben usarse a menos que se indique de otra forma.
Los intervalos numéricos citados por puntos finales en la presente descripción incluyen todos los números y fracciones incluidos dentro de ese intervalo (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,90, 4 y 5). También debe entenderse que se supone que todos los números y fracciones de estos están modificados por el término "aproximadamente". "Aproximadamente", como se usa en la presente descripción, indica que un número, cantidad, tiempo, etc., no es exacto ni seguro, pero está razonablemente cerca o es casi igual al valor indicado. Por lo tanto, el término "aproximadamente" significa más o menos del 0,1 al 50 %, 5-50 %, o 10-40 %, preferiblemente 10-20 %, con mayor preferencia 10 % o 15 %, del número al que se hace referencia. Además, debe entenderse que "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que claramente el contenido lo indique de cualquier otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a una composición que comprende "un compuesto" incluye una mezcla de dos o más compuestos.
Abreviaturas
aSMA, actina alfa del músculo liso; ANGPTL2, proteína 2 similar a la angiopoyetina; AT1, células epiteliales alveolares tipo 1; AT2, células epiteliales alveolares tipo 2; AQP5, acuaporina 5; Bleo, bleomicina; C1r, componente del complemento 1r; CM, medios acondicionados; Crs, distensibilidad; DDK3, proteína 3 relacionada con Dickkopf; ADN, ácido desoxirribonucleico; ECM, matriz extracelular; Ers, elastancia; VE, vesículas extracelulares; EXO, exosomas; FDA, Administración de Alimentos y Medicamentos; VEF: volumen espiratorio forzado; FSTL1, similar a folistatina 1; CVF, capacidad vital forzada; DCE6, específica de detención del crecimiento 6; H&E, hematoxilina y eosina; CI, capacidad inspiratoria; IGFBP2, proteína 2 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina; IL, interleucina; FPI: fibrosis pulmonar idiopática; i.t., intratraqueal; CEP, células esferoides pulmonares; MCP-1, proteína quimiotáctica de monocitos 1; miR, microARN; MMP, metaloproteinasa de matriz; CMM, células madre mesenquimales; PCOLCE, potenciador 1 de procolágeno C-endopeptidasa; ProSPC, proproteína C surfactante; ARN, ácido ribonucleico; Rrs, resistencia; SERPINA1, miembro 1 de la familia E de las serpinas; SMAD3, madres contra el homólogo 3 decapentapléjico; SPARC, proteínas secretadas ácidas y ricas en cisteína; TIMP, inhibidor tisular de metaloproteinasas; vWF, factor von Willebrand;
Definiciones
Los términos "administración de" y "administrar" un compuesto o composición como se usan en la presente descripción se refieren a proporcionar una composición de la descripción al individuo que necesita el tratamiento. La composición de la presente descripción se puede administrar por vía oral, parenteral (por ejemplo, vías de administración intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, ICV, inyección o infusión intracisternal, inyección subcutánea o implante), mediante aerosol para inhalación, nasal, vaginal, rectal, sublingual o tópica y pueden formularse, solos o juntos, en formulaciones unitarias de dosificación adecuadas que contienen portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables, no tóxicos y convencionales, apropiados para cada vía de administración.
El término "alogénico" se refiere a derivar u originarse en otro sujeto o paciente. Un "trasplante alogénico" se refiere a la recolección (por ejemplo, aislamiento) y trasplante de células u órganos de un sujeto al cuerpo de otro. En algunos casos, un "trasplante alogénico" incluye células cultivadas a partir de células de otro sujeto.
El término "autólogo" se refiere a derivar u originarse en el mismo sujeto o paciente. Un "trasplante autólogo" se refiere a la recolección (por ejemplo, aislamiento) y retrasplante de las propias células u órganos de un sujeto. En algunos casos, un "trasplante autólogo" incluye células cultivadas a partir de las propias células del sujeto. Por ejemplo, en los métodos de la presente descripción, las células madre cardíacas pueden derivarse de una muestra de tejido cardíaco extirpada del corazón del paciente a tratar, cultivarse, diseñarse para fusionarse con vesículas de membrana plaquetaria de acuerdo con los métodos de la descripción y luego administrarse al mismo paciente para el tratamiento de una lesión cardiovascular en el mismo.
El término "biocompatible", como se usa en la presente descripción, se refiere a un material que no provoca ningún efecto local o sistémico indeseablein vivo.
Los términos "material biológico" y "tejido biológico", como se usan en la presente descripción se refieren a células o tejidoin vivo(por ejemplo, células o tejido de un sujeto) ein vitro(por ejemplo, células cultivadas).
El término "especie de biomolécula" como se usa en la presente descripción se refiere a cualquier molécula que puede ser de origen biológico y/o interactuar con una célula en contacto con la misma. Una especie de biomolécula de uso en las micropartículas de la descripción puede ser, pero no se limita a, una proteína, un polipéptido, un péptido, una molécula de ácido nucleico, un sacárido, un polisacárido, una citocina y similares que pueden ser, pero no se limita a, aumentar o disminuir la proliferación de la célula o línea celular, puede mantener la viabilidad y/o proliferación de la célula o línea celular, o puede iniciar un cambio en el tipo de célula a partir de un tipo de célula madre, un precursor tipo de célula o un tipo de célula progenitora.
El término "célula", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula animal o humana. Las células mesenquimales de la descripción se pueden eliminar (aislar) de un tejido y se pueden cultivar para aumentar el tamaño de la población de las células. Las células animales o humanas pueden mantenerse en un estado viable mediante cultivo por pases en serie en un medio de cultivo o criopreservadas mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las células pueden obtenerse del animal o del individuo humano que ha recibido una lesión que se desea reparar mediante la administración de las células modificadas genéticamente de la descripción o de un individuo diferente.
Las células y su vesícula extracelular, como los exosomas, que se contemplan para su uso en los métodos de la presente descripción, pueden derivarse del mismo sujeto a tratar (autólogo del sujeto) o pueden derivarse de un sujeto diferente, preferiblemente de la misma especie, (alogénico al sujeto).
Pueden usarse medios disponibles comercialmente para el crecimiento, cultivo y mantenimiento de células madre mesenquimales. Dichos medios incluyen, pero no se limitan al medio Eagle modificado por Dulbecco (MEMD). Los componentes de tales medios que son útiles para el crecimiento, cultivo y mantenimiento de células madre mesenquimales incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos, vitaminas, una fuente de carbono (natural y no natural), sales, azúcares, hidrolizados derivados de plantas, piruvato de sodio, surfactantes, amoníaco, lípidos, hormonas o factores de crecimiento, tampones, aminoácidos no naturales, precursores de azúcar, indicadores, nucleósidos y/o nucleótidos, butirato o compuestos orgánicos, DMSO, productos derivados de animales, inductores de genes, azúcares no naturales, reguladores de pH intracelular, betaína u osmoprotector, elementos traza, minerales, vitaminas no naturales. Los componentes adicionales que pueden usarse para complementar un medio de cultivo de tejidos disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, suero animal (por ejemplo, suero fetal bovino (SFB), suero fetal de ternera (SFT), suero de caballo (SC)), antibióticos (por ejemplo, incluye pero no se limita a, penicilina, estreptomicina, sulfato de neomicina, anfotericina B, blasticidina, cloranfenicol, amoxicilina, bacitracina, bleomicina, cefalosporina, clortetraciclina, zeocina y puromicina) y glutamina (por ejemplo, L-glutamina). La supervivencia y el crecimiento de las células madre mesenquimales también dependen del mantenimiento de un ambiente aeróbico, pH y temperatura apropiados. Las células madre mesenquimales se pueden mantener mediante el uso de métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Pittengery otros,(1999)Science284:143-147).
El término "terapia celular", como se usa en la presente descripción, se refiere a la introducción de nuevas células en un tejido para tratar una enfermedad y representa un método para reparar o reemplazar tejido enfermo con tejido sano.
El término "clonal" se refiere a una célula o un grupo de células que han surgido de una sola célula a través de numerosos ciclos de división celular. Las células de una población clonal son genéticamente idénticas. Una población clonal puede ser una población heterogénea de manera que las células puedan expresar un conjunto diferente de genes en un momento específico.
El término "composición" como se usa en la presente descripción se refiere a un producto que comprende los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, así como también cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de la combinación de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas. Se pretende que dicho término en relación con una composición farmacéutica abarque un producto que comprende el(los) ingrediente activo(s), y el(los) ingrediente(s) inerte(s) que constituyen el portador, así como también cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de la combinación, formación de complejos o agregación de cualesquiera de dos o más de los ingredientes, o de la disociación de uno o más de los ingredientes, o de otros tipos de reacciones o interacciones de uno o más de los ingredientes. En consecuencia, las composiciones farmacéuticas de la presente descripción abarcan cualquier composición preparada mezclando un compuesto de la presente descripción y un portador farmacéuticamente aceptable.
Cuando un compuesto de la presente descripción se usa simultáneamente con uno o más de otros fármacos, se contempla una composición farmacéutica que contiene dichos otros fármacos además del compuesto de la presente descripción. En consecuencia, las composiciones farmacéuticas de la presente descripción incluyen, además, las que contienen uno o más de otros ingredientes activos, además de un compuesto de la presente descripción. La relación en peso del compuesto de la presente descripción con respecto al segundo ingrediente activo puede variar y dependerá de la dosis efectiva de cada ingrediente. Generalmente, se usará una dosis efectiva de cada uno. Así, por ejemplo, pero sin pretender ser limitante, cuando un compuesto de la presente descripción se combina con otro agente, la relación en peso del compuesto de la presente descripción con respecto al otro agente generalmente estará en el intervalo de aproximadamente 1000:1 a aproximadamente 1:1000, preferiblemente aproximadamente 200:1 a aproximadamente 1:200. Las combinaciones de un compuesto de la presente descripción y otros ingredientes activos generalmente también estarán dentro del intervalo antes mencionado, pero en cada caso, se debe usar una dosis efectiva de cada ingrediente activo. En tales combinaciones, el compuesto de la presente descripción y otros agentes activos se pueden administrar por separado o en conjunto. Además, la administración de un elemento puede ser antes, simultáneamente, o después de la administración del(de los) otro(s) agente(s).
El término "cultivo", como se usa en la presente descripción, se refiere al cultivo de células o tejido en condiciones controladas adecuadas para la supervivencia, generalmente fuera del cuerpo (por ejemplo,ex-vivooin vitro).El término incluye "expandir", "pasar", "mantener", etc. cuando se refiere al cultivo celular del proceso de cultivo. El cultivo de células puede dar como resultado crecimiento, diferenciación y/o división celular.
El término "derivado de", como se usa en la presente descripción, se refiere a células o una muestra biológica (por ejemplo, sangre, tejido, fluidos corporales, etc.) e indica que las células o la muestra biológica se obtuvieron de la fuente indicada en algún momento. Por ejemplo, una célula derivada de un individuo puede representar una célula primaria obtenida directamente del individuo (es decir, sin modificar). En algunos casos, una célula derivada de una fuente determinada experimenta una o más rondas de división celular y/o diferenciación celular de manera que la célula original ya no existe, pero se entenderá que la célula continua (por ejemplo, células hijas de todas las generaciones) se entenderá que proceden de la misma fuente. El término incluye los obtenidos directamente de, aislados y cultivados, u obtenidos, congelados y descongelados. El término "derivado de" también puede referirse a un componente o fragmento de una célula obtenido de un tejido o célula, que incluye, pero no se limita a, una proteína, un ácido nucleico, una membrana o fragmento de una membrana y similares.
El término "desagregar" incluye separar, desalojar o disociar células o tejidos mediante el uso de la disrupción mecánica o enzimática para aislar células individuales o pequeños conglomerados de células. En algunos casos, la disrupción enzimática se puede reemplazar con una o más alternativas enzimáticas que tengan sustancialmente el mismo efecto que la enzima.
El término "cantidad efectiva" como se usa en la presente descripción se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para reducir o mejorar la gravedad y/o duración de un trastorno o uno o más síntomas del mismo, inhibir o prevenir el avance de un trastorno, causar regresión de un trastorno, inhibir o prevenir la recurrencia, desarrollo, aparición o progresión de uno o más síntomas asociados con un trastorno, detectar un trastorno o potenciar o mejorar los efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutico).
El término "célula endotelial" se refiere a una célula necesaria para la formación y desarrollo de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes (por ejemplo, angiogénesis). Típicamente, las células endoteliales son la fina capa de células que recubren la superficie interior de los vasos sanguíneos y linfáticos. Las células endoteliales están involucradas en diversos aspectos de la biología vascular, incluida la aterosclerosis, la coagulación sanguínea, la inflamación, la angiogénesis y el control de la presión arterial.
El término "exosomas" como se usa en la presente descripción se refiere a pequeñas vesículas secretadas (típicamente de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 150 nm (o la dimensión más grande donde la partícula no es esferoide)) que pueden contener, o tener presentes en su membrana, ácido nucleico, proteína, u otras biomoléculas y pueden servir como portadores de esta carga entre diversos lugares en un cuerpo o sistema biológico.
El término "exosomas", como se usa en la presente descripción, se refiere ventajosamente a vesículas extracelulares que pueden tener propiedades terapéuticas, que incluye, pero no se limita a, exosomas de células madre tales como células madre cardíacas o células madre mesenquimales.
Los exosomas pueden aislarse de una variedad de fuentes biológicas que incluyen mamíferos tales como ratones, ratas, cobayas, conejos, perros, gatos, bovinos, caballos, cabras, ovejas, primates o seres humanos. Los exosomas pueden aislarse de fluidos biológicos tales como suero, plasma, sangre total, orina, saliva, leche materna, lágrimas, sudor, líquido articular, líquido cefalorraquídeo, semen, fluido vaginal, líquido ascético y líquido amniótico. Los exosomas también pueden aislarse de muestras experimentales tales como medios tomados de células cultivadas ("medios acondicionados", medios celulares y medios de cultivo celular).
Los exosomas también pueden aislarse de muestras de tejido tales como muestras quirúrgicas, muestras de biopsia y células cultivadas. Cuando se aíslan exosomas de fuentes de tejido, puede ser necesario homogeneizar el tejido para obtener una suspensión de células individuales seguida de la lisis de las células para liberar los exosomas. Cuando se aíslan exosomas de muestras de tejido, es importante seleccionar procedimientos de homogeneización y lisis que no resulten en la disrupción de los exosomas.
Los exosomas pueden aislarse de muestras recién recolectadas o de muestras que se han almacenado congeladas o refrigeradas. Aunque no es necesario, se pueden obtener exosomas de mayor pureza si las muestras de fluido se clarifican antes de la precipitación con un polímero que excluye el volumen, para eliminar cualquier resto de la muestra. Los métodos de clarificación incluyen centrifugación, ultracentrifugación, filtración o ultrafiltración.
La información genética dentro de la vesícula extracelular, tal como un exosoma, puede transmitirse fácilmente por fusión con las membranas de las células receptoras y liberación de la información genética en la célula intracelularmente. Aunque los exosomas como clase general de compuestos representan un gran potencial terapéutico, la población general de exosomas es una combinación de varias clases de ácidos nucleicos y proteínas que tienen una constelación de efectos biológicos tanto ventajosos como perjudiciales. De hecho, existen más de 1000 tipos diferentes de exosomas.
El término "vesícula extracelular", como se usa en la presente descripción, puede referirse a una vesícula de membrana secretada por células que pueden tener un diámetro mayor que el denominado "exosoma". Las vesículas extracelulares (alternativamente denominadas "microvesícula" o "vesícula de membrana") pueden tener un diámetro (o dimensión más grande cuando la partícula no es esferoide) de entre aproximadamente 10 nm a aproximadamente 5000 nm (por ejemplo, entre aproximadamente 50 nm y 1500 nm, entre aproximadamente 75 nm y 1500 nm, entre aproximadamente 75 nm y 1250 nm, entre aproximadamente 50 nm y 1250 nm, entre aproximadamente 30 nm y 1000 nm, entre aproximadamente 50 nm y 1000 nm, entre aproximadamente 100 nm y 1000 nm, entre aproximadamente 50 nm y 750 nm, etc.). Típicamente, al menos parte de la membrana de la vesícula extracelular se obtiene directamente de una célula (también conocida como célula donante). Las vesículas extracelulares adecuadas para usar en las composiciones y métodos de la presente descripción pueden originarse de células mediante inversión de membrana, exocitosis, desprendimiento, formación de ampollas y/o gemación. Las vesículas extracelulares pueden originarse a partir de la misma población de células donantes, aunque diferentes subpoblaciones de vesículas extracelulares pueden exhibir diferentes características de superficie/lípidos. Los nombres alternativos para las vesículas extracelulares incluyen, pero no se limitan a, exosomas, ectosomas, partículas de membrana, partículas similares a exosomas y vesículas apoptóticas. En dependencia de la forma de generación (por ejemplo, inversión de membrana, exocitosis, desprendimiento o gemación), las vesículas extracelulares contempladas en la presente descripción pueden exhibir diferentes características de superficie/lípidos.
El término "formulación", como se usa en la presente descripción, se refiere a una composición que puede ser una solución madre de los componentes, o una composición, que incluye preferiblemente un diluyente tal como agua u otro portador farmacéuticamente aceptable que puede estar disponible para su distribución, incluso a un paciente o médico.
La descripción proporciona formas de dosificación, formulaciones y métodos que proporcionan ventajas y/o perfiles farmacocinéticos beneficiosos, más particularmente perfiles farmacocinéticos sostenidos. Una composición de la descripción se puede utilizar en formas de dosificación en forma pura o sustancialmente pura, en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables y también en otras formas que incluyen formas anhidras o hidratadas.
Se puede obtener un perfil farmacocinético beneficioso por la administración de una formulación o forma de dosificación adecuada para una, dos veces al día o tres veces al día, o más administraciones que comprenden una o más composiciones de la descripción presentes en una cantidad suficiente para proporcionar la concentración requerida o dosis de la composición a un entorno de uso para tratar una enfermedad descrita en la presente descripción, en particular un cáncer.
Las modalidades de la descripción se refieren a una forma de dosificación que comprende una o más composiciones de la descripción que pueden proporcionar concentraciones plasmáticas máximas de la composición de entre aproximadamente 0,001 a 2 mg/ml, 0001 a 1 mg/ml, 0,0002 a 2 mg/ml, 0,005 a 2 mg/ml, 001 a 2 mg/ml, 0,05 a 2 mg/ml, 0,001 a 0,5 mg/ml, 0,002 a 1 mg/ml, 0,005 a 1 mg/ml, 0,01 a 1 mg/ml, 005 a 1 mg/ml o de 0,1 a 1 mg/ml. La descripción también proporciona una formulación o forma de dosificación que comprende una o más composiciones de la descripción que proporciona una eliminación t-i</2>de 0,5 a 20 h, 0,5 a 15 h, 0,5 a 10 h, 0,5 a 6 h, 1 a 20 h, 1 a 15 h, 1 a 10 h o 1 a 6 h.
Un sujeto puede ser tratado con una composición de la descripción o una composición o dosificación unitaria de la misma siguiendo sustancialmente cualquier programa deseado. Se pueden administrar una o más veces al día, en particular 1 o 2 veces al día, una vez a la semana, una vez al mes o continuamente. Sin embargo, un sujeto puede tratarse con menos frecuencia, tal como cada dos días o una vez a la semana, o con mayor frecuencia. Se puede administrar una composición o un compuesto a un sujeto durante aproximadamente o al menos aproximadamente 24 horas, 2 días, 3 días, 1 semana, 2 semanas a 4 semanas, 2 semanas a 6 semanas, 2 semanas a 8 semanas, 2 semanas a 10 semanas, 2 semanas a 12 semanas, 2 semanas a 14 semanas, 2 semanas a 16 semanas, 2 semanas a 6 meses, 2 semanas a 12 meses, 2 semanas a 18 meses, 2 semanas a 24 meses o durante más de 24 meses, periódicamente o continuamente.
Se puede obtener un perfil farmacocinético beneficioso mediante la administración de una formulación o forma de dosificación adecuada para una administración por una, dos o tres veces al día, preferiblemente una administración dos veces al día que comprende una o más composiciones de la descripción presentes en una cantidad suficiente para proporcionar la dosis requerida de la composición. La dosis requerida de una composición de la descripción administrada una, dos, tres veces o más al día es aproximadamente 0,01 a 3000 mg/kg, 0,01 a 2000 mg/kg, 0,5 a 2000 mg/kg, aproximadamente 0,5 a 1000 mg/kg, 0,1 a 1000 mg/kg, 0,1 a 500 mg/kg, 0,1 a 400 mg/kg, 0,1 a 300 mg/kg, 0,1 a 200 mg/kg, 0,1 a 100 mg/kg, 0,1 a 50 mg/kg, 0,1 a 20 mg/kg, 0,1 a 10 mg/kg, 0,1 a 6 mg/kg, 0,1 a 5 mg/kg, 0,1 a 3 mg/kg, 0,1 a 2 mg/kg, 0,1 a 1 mg/kg, 1 a 1000 mg/kg, 1 a 500 mg/kg, 1 a 400 mg/kg, 1 a 300 mg/kg, 1 a 200 mg/kg, 1 a 100 mg/kg, 1 a 50 mg/kg, 1 a 20 mg/kg, 1 a 10 mg/kg, 1 a 6 mg/kg, 1 a 5 mg/kg, o 1 a 3 mg/kg, o 1 a 2,5 mg/kg, o menos de o aproximadamente 10 mg/kg, 5 mg/kg, 2,5 mg/kg, 1 mg/kg o 0,5 mg/kg dos veces al día o menos
Ciertas formas de dosificación y formulaciones pueden minimizar la variación entre los niveles máximo y mínimo en plasma y/o cerebro de las composiciones de la descripción y en particular proporcionar una cantidad terapéuticamente efectiva sostenida de las composiciones.
La descripción también contempla una formulación o forma de dosificación que comprende cantidades de una o más composiciones de la descripción que resulta en cantidades terapéuticamente efectivas de la composición durante un período de dosificación, en particular un período de dosificación de 24 h. Las cantidades terapéuticamente efectivas de una composición de la descripción están entre aproximadamente 0,1 a 1000 mg/kg, 0,1 a 500 mg/kg, 0,1 a 400 mg/kg, 0,1 a 300 mg/kg, 0,1 a 200 mg/kg, 0,1 a 100 mg/kg, 0,1 a 75 mg/kg, 0,1 a 50 mg/kg, 0,1 a 25 mg/kg, 0,1 a 20 mg/kg, 0,1 a 15 mg/kg, 0,1 a 10 mg/kg, 0,1 a 9 mg/kg, 0,1 a 8 mg/kg, 0,1 a 7 mg/kg, 0,1 a 6 mg/kg, 0,1 a 5 mg/kg, 0,1 a 4 mg/kg, 0,1 a 3 mg/kg, 0,1 a 2 mg/kg, o 0,1 a 1 mg/kg.
Un medicamento o tratamiento de la descripción puede comprender una dosis unitaria de al menos una composición de la descripción para proporcionar efectos terapéuticos. Una "dosis unitaria" o "unidad de dosificación" se refiere a una dosis unitaria, es decir, una dosis única, la cual es capaz de administrarse a un paciente, y la cual puede manipularse y empacarse fácilmente, quedando como una dosis unitaria física y químicamente estable que comprende ya sea los agentes activos como tales o una mezcla con uno o más excipientes, portadores o vehículos farmacéuticos sólidos o líquidos.
Los términos "generar", "generación" y "generador", como se usan en la presente descripción, recibirán su significado habitual y se referirán a la producción de nuevas células en un sujeto y, opcionalmente, a la diferenciación adicional en células maduras y funcionales. La generación de células puede comprender la regeneración de las células. La generación de células comprende mejorar la supervivencia, el injerto y/o la proliferación de las células.
El término "factores de crecimiento", como se usa en la presente descripción, se refiere a proteínas, péptidos u otras moléculas que tienen un efecto de crecimiento, proliferación, diferenciación o trófico sobre las células. Tales factores pueden usarse para inducir proliferación o diferenciación y pueden incluir, por ejemplo, cualquier factor trófico que permita que las células proliferen, incluyendo cualquier molécula que se enlace a un receptor en la superficie de la célula para ejercer un efecto trófico o inductor del crecimiento en la célula. Tales factores incluyen factores paracrinos secretados por células madre y los mismos pueden inducir o mantener la proliferación o diferenciación por células muy próximas a las micropartículas biomiméticas de la descripción. Los factores incluyen, pero no se limitan a, Adrenomedulina (AM); Angiopoyetina (Ang); Factor de motilidad autocrina; Proteínas morfogenéticas óseas (PMO); Familia de factores neurotróficos ciliares; Factor neurotrófico ciliar (FNTC); Factor inhibidor de la leucemia (FIL); Interleucina-6 (IL-6); Factores estimulantes de colonias; Factor estimulante de colonias de macrófagos (FEC-m); Factor estimulante de colonias de granulocitos (FEC-G); Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF); Factor de crecimiento epidérmico (F<c>E); Efrina A1; Efrina A2; Efrina A3; Efrina A4; Efrina A5; Efrina B1; Efrina B2; Efrina B3; Eritropoyetina (EPO); Factor de crecimiento de fibroblastos (FCF); Somatotropina bovina fetal (SBF); Familia de ligandos GDNF: Factor neurotrófico derivado de línea celular glial (FNDG); Neurturina; Persefina; Artemina; Factor de diferenciación de crecimiento-9 (FDC9); Factor de crecimiento de hepatocitos (FCH); Factor de crecimiento derivado de hepatoma (FCDH); Insulina; Factor de crecimiento similar a la insulina-1 (FCI-1); Factor de crecimiento similar a la insulina-2 (FCI-2); Interleucinas: IL-1; IL-2; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; Factor de crecimiento de queratinocitos (FCQ); Factor estimulante de la migración (FEM); Proteína estimulante de macrófagos (PEM); Miostatina (Gd F-8); Neuregulinas; Neuregulina 1 (NRG1); Neuregulina 2 (NRG2); Neuregulina 3 (NRG3); Neuregulina 4 (NRG4); Factor neurotrófico derivado del cerebro (FNDC); Factor de crecimiento nervioso (FCN); Neurotrofina-3 (NT-3); Neurotrofina-4 (NT-4); Factor de crecimiento placentario (FCP); Factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP); Renalasa (RNLS); Factor de crecimiento de células T (FCCT); Trombopoyetina (TPO); Factores transformadores de crecimiento; Factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a); Factor de crecimiento transformante beta (TGF-p); Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a); Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y similares.
El término "aislar" o "aislado" cuando se refiere a una célula o una molécula (por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas) indica que la célula o molécula está o ha sido separada de su entorno natural, original o previo. Por ejemplo, una célula aislada puede eliminarse de un tejido derivado de su individuo huésped, pero puede existir en presencia de otras células (por ejemplo, en cultivo) o reintroducirse en su individuo huésped.
Los términos "células progenitoras pulmonares" y "células madre pulmonares" como se usan en la presente descripción pueden referirse a una población de células progenitoras derivadas de tejido pulmonar humano o animal.
El término "células madre mesenquimales (CMM)" como se usa en la presente descripción se refiere a células progenitoras que tienen la capacidad de diferenciarse en células neuronales, adipocitos, condrocitos, osteoblastos, miocitos, tejido cardíaco y otras células endoteliales y epiteliales. (Ver por ejemplo Wang, (2004)Stem Cells22: 1330 1337; McElreavey (1991)Biochem. Soc. Trans.1: 29s; Takechi (1993)Placenta14: 235-245; Yen (2005)Stem Cells;23: 3-9). Estas células se han caracterizado para expresar, y por tanto ser positivas para, uno o más de CD13, CD29, CD44, CD49a, b, c, e, f, CD51, CD54, CD58, CD71, CD73, CD90, CD102, CD105, CD106, CDw119, CD120a, CD120b, CD123, CD124, CD126, CD127, CD140a, CD166, P75, TGF-dR, TGF-dIR, HLA-A, B, C, SSEA-3, SSEA-4, D7 y PD-L1.
Las células madre mesenquimales se pueden extraer de diversas fuentes que incluyen, pero no se limitan a, médula ósea, sangre, periostio, dermis, sangre y/o matriz del cordón umbilical (por ejemplo, gelatina de Wharton) y placenta. Se pueden encontrar ejemplos de métodos para obtener células madre mesenquimales de referencia, por ejemplo, en las patentes de EE. u U. Núm. 5,486,359.
Los términos "modular el estado proliferativo" o "modular la proliferación" como se usan en la presente descripción se refieren a la capacidad de un compuesto para alterar la velocidad de proliferación de una población de células madre o progenitoras. Un compuesto puede ser tóxico, en donde la proliferación de las células se ralentiza o se detiene, o la proliferación puede potenciarse tal como, por ejemplo, por la adición a las células de una citocina o un factor de crecimiento.
El término "multipotente" se refiere a una célula que tiene el potencial de diferenciarse en múltiples, aunque limitados, tipos de células o linajes celulares. Típicamente, estas células se consideran células no especializadas que tienen la capacidad de autorrenovarse y convertirse en células especializadas con funciones y características específicas.
El término "señalización paracrina" como se usa en la presente descripción se refiere a una forma de comunicación célula-célula en la que una célula produce una señal para inducir cambios en las células cercanas, provocando alteración en el comportamiento o la diferenciación de esas células. Las moléculas de señalización conocidas como factores paracrinos se difunden en una distancia relativamente corta (acción local), opuesto a los factores endocrinos (hormonas que viajan distancias considerablemente más largas a través del sistema circulatorio), las interacciones yuxtacrinas y la señalización autocrina. Las células que producen factores paracrinos los secretan al entorno extracelular inmediato. Luego, los factores viajan a células cercanas en las cuales el gradiente de factor recibido determina el resultado.
Aunque la señalización paracrina provoca una amplia serie de respuestas en las células inducidas, la mayoría de los factores paracrinos utilizan un conjunto relativamente estrecho de receptores y vías. Diferentes órganos del cuerpo, incluso entre diferentes especies, pueden utilizar conjuntos similares de factores paracrinos en el desarrollo diferencial. Los receptores y vías altamente conservados se pueden organizar en cuatro familias principales basadas en estructuras similares: Familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FCF), familia Hedgehog, familia Wnt y superfamilia TGF-p. La unión de un factor paracrino a su receptor respectivo inicia cascadas de transducción de señales, provocando diferentes respuestas.
Para que los factores paracrinos induzcan una respuesta en la célula receptora, esa célula debe tener los receptores adecuados disponibles en la membrana celular para recibir las señales, lo que también se conoce como competente. Adicionalmente, la célula que responde también debe tener la capacidad de ser inducida mecánicamente.
El término "composición farmacéutica" como se usa en la presente descripción se refiere a una composición que se puede administrar a un animal o paciente humano para tratar o prevenir una enfermedad o afección patológica en el paciente. Las composiciones pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Además, como se usa en la presente descripción, la frase "portador farmacéuticamente aceptable" significa cualquiera de los portadores farmacéuticamente aceptables estándar. El portador farmacéuticamente aceptable puede incluir diluyentes, adyuvantes y vehículos, así como también portadores de implantes y rellenos, diluyentes o material encapsulante sólidos o líquidos inertes y no tóxicos que no reaccionan con los ingredientes activos de la invención. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, solución salina tamponada con fosfato, solución salina fisiológica, agua y emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de estos, y aceites vegetales. Las formulaciones que contienen portadores farmacéuticamente aceptables se describen en varias fuentes que se conocen bien y están fácilmente disponibles para los expertos en la técnica. Por ejemplo, el Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin EW, Remington's Pharmaceutical Sciences, Easton Pa., Mack Publishing Company, 19a ed., 1995) describe formulaciones que pueden usarse en relación con la divulgación en cuestión. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen, por ejemplo, soluciones para inyección estériles acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos los cuales hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del destinatario previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en contenedores de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo, frascos y ámpulas selladas, y pueden almacenarse en una condición seca por congelación (liofilizada) que requiere solamente la condición del portador líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Las soluciones para inyección extemporáneas y las suspensiones pueden prepararse a partir de polvo estéril, gránulos, comprimidos, etc. Debe entenderse que, además de los ingredientes que se mencionaron particularmente con anterioridad, las formulaciones objeto de la presente descripción pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica si se tiene en cuenta el tipo de formulación en cuestión.
El término "portador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa en la presente descripción, se refiere a un medio el cual no interfiere con la efectividad o actividad de un ingrediente activo y el cual no es tóxico para los huéspedes a los que se administra y el cual está aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o incluida en la Farmacopea de Ee . UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para usar en animales, y más particularmente en humanos. Un portador, excipiente o vehículo incluye diluyentes, aglutinantes, adhesivos, lubricantes, desintegrantes, agentes de carga, agentes humectantes o emulsionantes, agentes tampón de pH y materiales diversos tales como absorbentes que pueden ser necesarios para preparar una composición particular. Ejemplos de portadores etc. incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y sus combinaciones. El uso de tales medios y agentes para una sustancia activa se conoce bien en la técnica.
El término "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" como se usa en la presente descripción, se refiere a un material que no es biológicamente o de cualquier otra manera indeseable, es decir, el material puede administrarse a un individuo en una formulación o composición sin causar efectos biológicos indeseables o interactuar de manera perjudicial con cualquiera de los componentes de la composición en la que está contenido.
El término "célula progenitora", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula que tiene la capacidad de diferenciarse en un tipo específico de célula, así como también de replicarse para generar una célula hija sustancialmente equivalente a ella misma. En algunos casos, una célula progenitora experimenta una autorrenovación limitada, de manera que no se autorreplica indefinidamente.
El término "estado proliferativo" como se usa en la presente descripción se refiere a si una población de células que incluyen, pero no se limita a, células madre mesenquimales o progenitoras, o una subpoblación de las mismas, se están dividiendo y de esta manera aumentando en número, en el estado de reposo, o si el las células no proliferan, no mueren ni sufren apoptosis.
El término "fibrosis pulmonar" se refiere a la fibrosis patológica de los pulmones, ya sea que surja de una enfermedad o de una lesión. El término abarca FPI, fibrosis pleural, fibrosis subpleural, fibrosis pulmonar, Neumonía Intersticial Habitual (NIH) y fibrosis pulmonar inducida por fármacos.
Los términos "regenerar", "regeneración" y "que regenera" como se usan en la presente descripción se refieren al proceso de crecimiento y/o desarrollo de tejido nuevo para reemplazar tejido que ha sido dañado, por ejemplo, por una infección viral, una lesión inducida químicamente u otra enfermedad. La regeneración de tejidos puede comprender la activación y/o mejora de la proliferación celular.
El término "secretoma", como se usa en la presente descripción, se refiere a polipéptidos secretados y recolectados de un medio de cultivo extracelular e incluye factores de crecimiento, quimiocinas, citocinas, moléculas de adhesión, proteasas y receptores de desprendimiento. Se predice que los genes codificadores de proteínas humanas (39 %, 19613 genes) tienen un péptido señal y/o al menos una región transmembrana que sugiere el transporte activo de la proteína correspondiente fuera de la célula (secreción) o su ubicación en una de los numerosos sistemas de membrana en la célula. Los componentes no proteicos, tales como lípidos, micro-ARN y ARN mensajero, también pueden ser secretados por las células a través de microvesículas (de 100 a más de 1000 nm de diámetro) desprendidas de la membrana plasmática y exosomas (de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 150 nm de diámetro) que se liberan a través de un evento de exocitosis endosómica. Los factores presentes en ambos orgánulos representan hasta el 42 % del secretoma y están incluidos en el secretoma colectivo. En consecuencia, los medios de cultivo celular acondicionados de la presente descripción pueden incluir algunas o todas las proteínas, ácidos nucleicos, microvesículas y exosomas secretados generados a partir de una población de células, que incluye, pero no se limita a, o ejemplos aislados de los mismos.
El término "autorrenovación" o "autorrenovar", como se usa en la presente descripción se refiere a la capacidad de una célula para dividirse a través de numerosos ciclos de división celular y generar una hija con las mismas características que la célula madre. La otra célula hija puede tener características diferentes a su célula madre. El término incluye la capacidad de una célula de generar una copia genética idéntica de sí misma (por ejemplo, un clon) mediante división celular. Por ejemplo, una célula progenitora cardíaca autorrenovadora puede dividirse para formar una célula progenitora cardíaca hija y otra célula hija comprometida con la diferenciación en un linaje cardíaco tal como una célula endotelial, de músculo liso o de cardiomiocito. En algunos casos, una célula que se autorrenueva no experimenta una división celular para siempre.
El término "célula madre", como se usa en la presente descripción, se refiere a células que tienen la capacidad de autorrenovarse y generar descendencia diferenciada. El término "células madre pluripotentes" se refiere a células madre que tienen una versatilidad de diferenciación completa, es decir, la capacidad de crecer hasta convertirse en cualquiera de los aproximadamente 260 tipos de células del cuerpo de un mamífero fetal o adulto. Por ejemplo, las células madre pluripotentes tienen el potencial de diferenciarse en tres capas germinales: endodermo (por ejemplo, vasos sanguíneos), mesodermo (por ejemplo, músculo, hueso y sangre) y ectodermo (por ejemplo, tejidos epidérmicos y sistema nervioso) y, por lo tanto, pueden dar lugar a cualquier tipo de célula fetal o adulta.
Los términos "sujeto" y "paciente" como se usa en la presente descripción incluyen humanos, mamíferos(por ejemplo,gatos, perros, caballos,etc.),células vivas y otros organismos vivos. Un organismo vivo puede ser tan simple como, por ejemplo, una única célula eucariota o tan complejo como un mamífero. Los huéspedes típicos a los que se pueden administrar las modalidades de la presente descripción serán mamíferos, particularmente primates, especialmente humanos. Para aplicaciones veterinarias, será adecuada una amplia variedad de temas,por ejemplo,ganado vacuno, ovejas, cabras, vacas, cerdos y similares; aves de corral tales como pollos, patos, gansos, pavos y similares; y animales domesticados, particularmente mascotas tales como perros y gatos. Para aplicaciones de diagnóstico o investigación, serán sujetos adecuados una amplia variedad de mamíferos, incluidos roedores(por ejemplo,ratones, ratas, hámsteres), conejos, primates y cerdos tales como lechones consanguíneos y similares. En algunas modalidades, un sistema incluye una muestra y un sujeto. El término "huésped vivo" se refiere al huésped u organismos mencionados anteriormente que están vivos y no muertos. El término "huésped vivo" se refiere a todo el huésped u organismo y no solo a una parte extirpada(por ejemplo,un hígado u otro órgano) del huésped vivo.
El término "efecto terapéutico" como se usa en la presente descripción se refiere a un efecto de una composición de la descripción, en particular una formulación o forma de dosificación, o método divulgado en la presente descripción. Un efecto terapéutico puede ser un efecto terapéutico sostenido que se correlaciona con una concentración continua de un compuesto de la descripción durante un período de dosificación, en particular un período de dosificación sostenido. Un efecto terapéutico puede ser un efecto estadísticamente significativo en términos de análisis estadístico de un efecto de un compuesto de la descripción frente a los efectos sin el compuesto.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa en la presente descripción a la cantidad o dosis de un compuesto activo de la descripción o composición que comprende el mismo, que conducirá a uno o más efectos deseados, en particular, uno o más efectos terapéuticos o perfiles farmacocinéticos beneficiosos. Una cantidad terapéuticamente efectiva de una sustancia puede variar de acuerdo con factores tales como la etapa de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del sujeto, y la capacidad de la sustancia para provocar una respuesta deseada en el sujeto. Un régimen de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica o un perfil farmacocinético óptimos. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente o la dosis se puede reducir proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica.
El término "lesión tisular" como se usa en la presente descripción se refiere a daño al tejido pulmonar de un animal o ser humano.
Los términos "tratamiento", "terapia", "mejora" y similares se refieren a cualquier reducción de la gravedad de los síntomas. Como se usa en la presente descripción, los términos "tratar" y "prevenir" no pretenden ser términos absolutos. El tratamiento puede referirse a cualquier retraso en la aparición, mejora de los síntomas, mejora en la supervivencia del paciente, reparación/regeneración del tejido cardíaco o vasos sanguíneos, aumento del tiempo o tasa de supervivencia, etc. El efecto del tratamiento se puede comparar con el de un individuo o un grupo de individuos que no reciben el tratamiento. En algunos casos, el efecto puede ocurrir en el mismo paciente antes del tratamiento o en un momento diferente durante el curso de la terapia. En algunos aspectos, la gravedad de la enfermedad, trastorno o lesión se reduce en al menos un 10 %, en comparación, por ejemplo, con el individuo antes de la administración o con un individuo de control (por ejemplo, un individuo sano o un individuo que ya no padece la enfermedad, trastorno o lesión) que no esté recibiendo tratamiento. En algunos casos, la gravedad de una enfermedad, trastorno o lesión se reduce al menos en un 20 %, 25 %, 50 %, 75 %, 80%o 90 %. En algunos casos, los síntomas o la gravedad de la enfermedad ya no son detectables mediante el uso de técnicas de diagnóstico estándar.
Descripción
Aspectos de la descripción se relacionan con métodos para tratar enfermedades pulmonares y, en particular, la fibrosis pulmonar. Los métodos comprenden administrar a un paciente una composición farmacéutica que comprende exosomas derivados de células esferoides pulmonares como se describe en la presente descripción, y en una cantidad suficiente para reducir significativamente una o más de las siguientes afecciones patológicas: edema pulmonar, una patología pulmonar asociada con fibrosis pulmonar y acumulación de hidroxiprolina o proteínas fibrogénicas como colágeno y elastina.
Se ha demostrado que las células pulmonares terapéuticas de adultos, denominadas células esferoides pulmonares (CEP), contienen una población heterogénea de células que expresan marcadores específicos epiteliales pulmonares (Epcam, AQP5, ProSPC y CCSP) y mesenquimales (CD90 y CD105). El propósito del presente estudio fue examinar los efectos terapéuticos de los medios acondicionados derivados de CEP en la fibrosis pulmonar. Se ha reportado que el secretoma de células madre mesenquimales (CMM) o los medios acondicionados reproducen los efectos terapéuticos observados en la terapia con células CMM en algunas enfermedades, como la osteoartritis, la displasia broncopulmonar y la esclerosis múltiple. Estos estudios incluyen CM derivadas de CMM como tratamiento de comparación para probar la no inferioridad y muestran que los medios acondicionados por células esferoides pulmonares (CEP-CM) promueven la reparación pulmonar en la fibrosis pulmonar, de una manera superior a su contraparte de CMM.
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una forma mortal de enfermedad pulmonar intersticial idiopática en la cual las lesiones pulmonares persistentes provocan la formación de tejido cicatricial. A medida que la fibrosis se engrosa, el tejido pulmonar se vuelve rígido y pierde la capacidad de facilitar el intercambio de gases y proporcionar a las células el oxígeno que necesitan. Actualmente, la FPI tiene pocas opciones de tratamiento y ninguna terapia efectiva aparte del trasplante de pulmón. Se presentan las modalidades de los métodos de la descripción mediante el uso de medios acondicionados derivados de células esferoides pulmonares (CEP-CM) y exosomas de células esferoides pulmonares (CEP-EXO) para tratar diferentes modelos de lesión pulmonar.
Se han desarrollado varios modelos animales para imitar las características patológicas de la FPI humana. Debido a que se desconoce la causa de la enfermedad, no existe un verdadero modelo animal de FPI. El modelo Bleo de fibrosis pulmonar inducida se usa ampliamente para el estudio de la FPI y podría decirse que es el más relevante desde el punto de vista clínico. Para soportar los efectos terapéuticos encontrados en el modelo Bleo, también se probó un modelo de fibrosis pulmonar inducida por sílice.
Tanto el modelo Bleo como el de sílice en ratón presentaron daño epitelial alveolar significativo y depósito de ECM (Figuras 1E-1I, 3C-3G y 5E-5H). En el modelo de rata se mostró una disminución significativa en la función pulmonar después de la lesión de Bleo (Figuras 6C-6I). Se ha demostrado que los CM libres de células derivados de células madre puede lograr capacidades protectoras y regenerativas similares o superiores en comparación con las propias células. Las últimas observaciones muestran que los CEP-CM fueron capaces de revertir la fibrosis causada por Bleo, y también la causada por partículas de sílice (Figuras 1-3). Sin embargo, los efectos regenerativos de los CEP-CM fueron más sólidos en el modelo Bleo que en el modelo de sílice. El tratamiento por inhalación de CEP-CM en ratones a los que se les instiló Bleo fue capaz de recuperar los pulmones dañados hasta niveles similares a los de los grupos controles en términos de disminución de las células apoptóticas, puntuación fibrótica, contenido de hidroxiprolina y recuperación significativa de las poblaciones de células AT1 y AT2 ( Figuras 1C-1I y 2A-2D).
Los efectos del tratamiento con CM en el modelo de sílice, si bien revirtieron la fibrosis en comparación con los controles no tratados (tratados con PBS), no revirtieron el daño a niveles como los observados en los grupos controles sanos. Esto podría deberse a la diferencia en los modelos animales. La lesión inducida por sílice, a diferencia de la lesión inducida por Bleo, es causada por la presencia física de partículas que se depositan en el pulmón y provocan la formación de nódulos fibróticos. El examen histológico mostró una disminución en los tejidos fibróticos que rodean los nódulos en los grupos tratados con CM en comparación con el control de PBS, pero la terapia con CM no fue suficiente para resolver los nódulos en sí (Figuras 3C, 3E y 3F). Es posible que siete días de tratamiento no fueran suficientes para revertir el daño causado por las partículas de sílice. Para ciertos tipos de lesión pulmonar donde las partículas se retienen en los pulmones causando disfunción, como la silicosis, puede ser necesario un tratamiento CM continuo más prolongado no solo para resolver la fibrosis, sino también para eliminar las partículas.
El campo de la medicina regenerativa utiliza muchos tipos diferentes de células madre para investigación y aplicaciones clínicas, pero las células madre mesenquimales siguen siendo las más usadas, en parte debido a sus capacidades inmunomoduladoras y su facilidad de aislamiento. Por lo tanto, se compararon los beneficios regenerativos de CEP-CM frente a CMM-CM. De este modo, tanto en el modelo Bleo como en el de sílice se demostró que, si bien la terapia de inhalación de MSC-CM tenía actividades regenerativas en el tratamiento de la fibrosis pulmonar, la CEP-CM era superior a la CMM-CM en todos los ámbitos (Figuras 1-3).
Se dilucidaron los mecanismos moleculares subyacentes a la reparación pulmonar mediada por CM mediante análisis proteómicos. Tales análisis revelaron una regulación negativa aSMA (un marcador de miofibroblastos) y citocinas proinflamatorias/profibróticas, posiblemente a través de la regulación positiva de la actividad de MMP2 (Figuras 2E-2G). Se ha demostrado que las actividades de las MMP desempeñan un papel diverso en la PF, lo que sugiere que en las primeras etapas de la PF inducida por Bleo, las MMP desempeñan un papel en la patogénesis de la enfermedad. Sin embargo, la actividad de MMP en la etapa tardía puede jugar un papel en el proceso de reparación.
El análisis por espectrometría de masas del secretoma de CEP reveló proteínas relacionadas con el sistema del complemento (C1 r y decorina), así como también con la vía de señalización de Wnt (DKK3) (Figura 4, Figura 7). Adicionalmente, también se identificó una gran cantidad de proteínas remodeladoras de la ECM, proangiogénicas y de proliferación celular, lo que sugiere que CEP-CM contiene proteínas capaces no solo de descomponer y revertir la fibrosis ya existente en su lugar, sino también de promover la reparación epitelial y vascular.
Los medios acondicionados no solo contienen proteínas solubles, sino también sustancias insolubles, como los exosomas. Los exosomas son un campo emergente de investigación biomédica que ha experimentado una explosión de descubrimientos e interés en las últimas dos décadas. Los efectos terapéuticos de las células madre se han atribuido a los miARN que se encuentran en los exosomas secretados. Por lo tanto, se determinó si los beneficios regenerativos observados en respuesta a CEP-CM pueden explicarse por los EXO. Los hallazgos indicaron que los CEP-EXO son capaces de reproducir parte de las capacidades regenerativas del CM del que fueron aislados (Figuras 5-6). También se demostró que los<c>EP-EXO superaron a los CMM-EXO para revertir la fibrosis pulmonar y restaurar la función pulmonar saludable. Como se esperaba, todos los grupos tratados con CM y EXO mostraron una mejora significativa en términos de disminución de las células apoptóticas, reducción de la gravedad de la fibrosis y mejora de la función pulmonar y restauración del epitelio alveolar. Sin embargo, tanto CEP-CM como CEP-EXO exhibieron mayores efectos terapéuticos en comparación con CMM-CM y -EXO. CEP-CM fue el único tratamiento capaz de revertir el daño alveolar, reduciendo la puntuación fibrótica y los niveles de hidroxiprolina a los del grupo control. En cuanto a las medidas de función pulmonar, solo CEP-EXO mostró una recuperación significativa de la resistencia respiratoria total.
El análisis de secuenciación de ARN de CEP-EXO y CMM-EXO mostró el enriquecimiento de miARN en las familias let-7 y miR99, ambos presentes entre los diez principales miARN identificados tanto en CEP-EXO como en CMM-EXO (Figura 6K). La familia let-7 de miARN fue el primer miARN descubierto y está altamente conservada en plantas y animales. Se ha descubierto que el miARN Let-7 juega un papel esencial en el desarrollo biológico, la diferenciación de células madre y la tumorigénesis. De manera similar, la familia miR99 (miR99a, miR99b y miR100) de miARN también son miARN altamente conservados que se expresan altamente en células madre y se ha descubierto que están regulados negativamente en lesiones pulmonares y cáncer. Se encuentran diferentes subtipos de miARN let-7 en tejidos, células y tipos de cáncer específicos. Let-7a, -7 c, -7g y miR100 estaban regulados negativamente en el cáncer de pulmón, y se encuentra que los cuatro tipos se encuentran entre los 10 principales tipos de miARN detectados tanto en CEP-EXO como en CMM-EXO.
También se ha descubierto que miR99a, miR100 y miR10a están modulados en respuesta al daño del ADN y en los pulmones expuestos al humo del cigarrillo. La familia miR99 de microARN, junto con miR-151a, miR-10a y miR-30a, está significativamente regulada positivamente en CEP-EXO en comparación con los otros miARN identificados. Igualmente, let-7a y -7f están significativamente regulados positivamente en CMM-EXO.
Estudios han demostrado las propiedades antifibróticas de miR-30a al revertir la proteína 1 de la vía de señalización inducible por Wnt1 (P1VSI) inducida por el factor de crecimiento transformante beta (TGF-p) e inhibir la fisión de las mitocondrias previniendo la apoptosis. P1VIS es un mediador profibrótico conocido en pacientes con FPI que ha demostrado mejorar la deposición de ECM y promover la progresión fibrótica. Aunque miR-30a y la familia de miARN let-7 y miR99 se identifican tanto en CEP como en CMM-EXO, su expresión diferencial puede explicar la diferencia en los efectos del tratamiento observados.
Para evaluar cualquier inmunogenicidad sistémica o efectos no deseados de las terapias CM y EXO inhaladas, se examinaron la expresión de citocinas sistémicas, el análisis de bioquímica sanguínea y la histología de todos los órganos principales (Figuras 2G, 6A). La histología normal del tejido en todos los órganos, junto con las funciones normales del hígado y los riñones, sugirieron que el tratamiento con CM y EXO no provocó ninguna reacción inmune local o sistémica y no causó ninguna alteración celular o tisular aberrante. Curiosamente, el análisis de la expresión de citocinas sistémicas mostró una regulación negativa de la proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1) en el suero sanguíneo de los animales tratados (Figura 6A). Se ha reportado que la citocina profibrótica MCP-1 juega un papel clave en la inflamación pulmonar y el aumento de los niveles de MCP-1 se ha relacionado con un mal pronóstico para los pacientes con FPI.
El tratamiento por inhalación, el cual en algunos casos se administró durante siete días consecutivos, puede suministrarse mediante un nebulizador por motivos de relevancia clínica. Los resultados revelaron que los tratamientos con CEP-CM y CEP-EXO podrían atenuar y revertir la fibrosis inducida por bleomicina y sílice al restablecer la estructura alveolar normal, disminuir la acumulación de matriz extracelular y la proliferación de miofibroblastos. Se ha encontrado sorprendentemente que los medios acondicionados derivados de células madre pueden promover la reparación alveolar y resolver la fibrosis pulmonar al menos parcialmente mediante el suministro a través de EXO. Además, CEP-CM y CEP-EXO mostraron beneficios terapéuticos superiores en comparación con sus homólogos derivados de células madre mesenquimales de la médula ósea. Por lo tanto, CEP-CM y CEP-EXO proporcionan opciones terapéuticas ventajosas para la fibrosis pulmonar.
En algunas modalidades de la descripción, la administración de las composiciones a un paciente que las necesita puede dar como resultado una reducción de una patología pulmonar asociada con la fibrosis pulmonar, una reducción de la acumulación de hidroxiprolina, una reducción de la expresión de proteínas fibrogénicas, en donde el sujeto en necesidad del mismo tiene al menos uno de los siguientes: una enfermedad fibrótica pulmonar primaria o secundaria. En algunas modalidades, la administración de la dosis efectiva puede dar como resultado una mejora de las pruebas de función pulmonar, incluidas las capacidades vitales forzadas o la difusión de oxígeno.
En resumen, presentamos aquí nuevos agentes terapéuticos acelulares, específicamente, CEP-CM y CEP-EXO, que han demostrado ser seguros y efectivos en el tratamiento de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina y sílice en roedores. La evidencia presentada aquí indica que el mecanismo de regeneración mediada por CM puede relacionarse con los EXO, la actividad de MMP2 y una serie de proteínas que se encuentran en el CM. Los medios acondicionados y los EXO son considerablemente menos inmunogénicos que sus células madre y la administración de estos factores puede superar las limitaciones de las células madre manteniendo efectos similares. La identificación de miR-30a y la familia de miARN miR-99 y let-7 en CM justifica investigaciones futuras, ya que se sabe que miR- 30a está regulado negativamente en pacientes con FPI, y las familias de miARN miR-99 y let-7 se sabe que también están regulados negativamente en varios cánceres, incluido el cáncer de pulmón. La fibrosis pulmonar idiopática es un trastorno respiratorio mortal con tasas crecientes de morbilidad y mortalidad; sin terapias efectivas disponibles actualmente, CEP-CM y CEP-EXO proporcionan candidatos prometedores para el desarrollo de terapias para la FPI.
Los medios acondicionados por células madre atenúan y revierten la fibrosis inducida por bleomicina y la apoptosis de fibroblastos
Para probar el impacto de CEP-CM en la reparación pulmonar y la fibrosis, se usó un modelo de inyección intratraqueal (i.t.) de bleomicina (Bleo) de dosis única alta en ratones CD1 inmunocompetentes. El peso corporal se monitoreó durante todo el estudio como una señal de carga de enfermedad. Dado que el objetivo era tratar la fibrosis y no la inflamación, se permitió pasar la fase de inflamación inicial y se estableció la fibrosis antes de iniciar el tratamiento. En el modelo Bleo, la inflamación alcanza su punto máximo alrededor del día siete después de la instilación y transita a fibrosis alrededor del día nueve; la agresión de Bleo comenzó después del décimo día de intervención (Figura 1A).
El día diez, los ratones recibieron un tratamiento de inhalación mediante el uso de un nebulizador durante siete días consecutivos con una dosis de 10 mg de proteína de medio acondicionado (CM) por kg de peso corporal o un volumen igual de PBS. Para verificar que las sustancias nebulizadas fueran capaces de alcanzar las regiones distales de los pulmones, se probó en ratones con tinte azul de metileno nebulizado. Se recogieron inmediatamente los pulmones de un grupo de animales después de un tratamiento de nebulización para examen histológico y se verificó que el tinte efectivamente llegaba al pulmón distal (Figura 11).
En un examen macroscópico inicial de los efectos terapéuticos, todos los grupos que recibieron Bleo mostraron necrosis hemorrágica (Figura 1B) que disminuyó con el tratamiento con CEP o<c>MM-CM. Dado que Bleo induce daño en el ADN como mecanismo molecular, se examinaron los efectos del tratamiento con CM sobre la apoptosis (Figuras 1C y 1D).
El tratamiento con CEP-CM condujo a una reducción de la apoptosis en el pulmón en comparación con el grupo tratado con PBS. Tanto el tratamiento con CEP-CM como con el<c>MM-CM mostraron una aparente reducción de la fibrosis al preservar las estructuras epiteliales alveolares (Figuras 1E y 1F) y reducir la deposición de colágeno (Figuras 1G-1I). El examen histológico de la fibrosis mediante tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y la puntuación de Ashcroft correspondiente reveló que solo CEP-CM pudo reducir el área fibrótica y revertir el daño epitelial alveolar a niveles saludables, como se observó en los grupos controles.
El tratamiento con inhalación de medios acondicionados por células madre aumenta la expresión de MMP2 y promueve la reparación vascular y alveolar
Los alvéolos pulmonares son estructuras terminales de las vías respiratorias distales. El epitelio alveolar comprende células epiteliales alveolares tipo 1 (AT1), que son el tipo de células especializadas en los pulmones que median en el intercambio de gases, y células epiteliales alveolares tipo 2 (AT2), que producen y liberan surfactantes pulmonares, antioxidantes, citocinas/quimiocinas, y otras moléculas importantes para la defensa de los pulmones, la respuesta a las agresiones y el mantenimiento de la homeostasis pulmonar. Por lo tanto, se examinaron los cambios en la distribución de AT1 y AT2 en respuesta al tratamiento con CM después de la lesión de Bleo para evaluar el daño epitelial y el rescate (Figura 2A). La inmunotinción del marcador AT1 acuaporina 5 (AQP5) mostró que el tratamiento con CEP-CM fue capaz de revertir el daño epitelial causado por Bleo (Figuras 2A y 2D).
Adicionalmente, el tratamiento con CEP-CM aumentó significativamente la proliferación de células AT2 positivas para proteína C surfactante (ProSPC) (Figura 2A y 2C) que sintetizan y secretan surfactante pulmonar, así como también mantienen la estructura e integridad alveolar al proliferar y diferenciarse en células AT1. Esta respuesta todavía se produjo con el tratamiento con CMM-CM, pero a un nivel más bajo y no significativamente diferente del grupo tratado con PBS. Solo el tratamiento con CEP-CM pudo aumentar la expresión de vasculaturas positivas al factor von Willebrand (vWF) en los pulmones con FP (Figura 2A y 2B).
Paralelamente, se examinó la respuesta fibrótica midiendo los niveles de proteína de actina alfa del músculo liso (aSMA) (Figura 2E), que es un marcador de la transición de fibroblastos a miofibroblastos en FPI. Ambos grupos tratados con CM mostraron una disminución drástica en la aSMA en comparación con los controles tratados con PBS. Curiosamente, la expresión de la proteína de la metaloproteinasa 2 de la matriz (MMP2) aumentó en ambos grupos tratados con CM (Figura 2F). Se usó una serie de citocinas para acceder a la expresión de citocinas sistémicas. Sólo CEP-CM pudo disminuir significativamente la expresión de IL-4 en comparación con los controles de PBS (Figura 2G).
Efectos terapéuticos de la terapia con medios acondicionados en la fibrosis pulmonar inducida por sílice
Para probar si los efectos regenerativos de CEP-CM podrían aplicarse a otros modelos de lesión pulmonar, se usó el modelo de sílice bien establecido de fibrosis pulmonar inducida.
A diferencia de Bleo, un agente bioquímico que causa daño celular directo, la instilación de finas partículas de sílice en los pulmones hace que se desarrollen nódulos fibróticos alrededor de las partículas. Nuevamente, debido a que el objetivo era tratar la fibrosis y no la inflamación que la precede en modelos animales, hubo un retraso hasta que pasó la fase de inflamación y apareció la fibrosis antes de tratar a los ratones. Para el modelo de sílice, el tratamiento se inició el día 28 después de la instilación de sílice y, al igual que en el estudio Bleo anterior, el tratamiento por inhalación de CM o solución salina se administró durante siete días consecutivos mediante un nebulizador (Figura 3A).
La presencia física de las partículas incrustadas en los pulmones ayudó a la localización y visualización de la respuesta fibrótica. No hubo diferencias significativas en ninguno de los grupos tratados con respecto a los efectos sobre las células apoptóticas (Figura 3B). Sin embargo, CEP-CM pudo disminuir significativamente la gravedad de la fibrosis en comparación con el grupo tratado con PBS (Figura 3C y 3D). El tejido fibrótico alrededor de los nódulos inducidos por sílice fue menos intenso y generalizado, pero persistió en los grupos tratados con CEP y CMM-CM, como se muestra en las Figuras 3C, 3E y 3F). El tratamiento con CM también redujo la deposición de colágeno y previno el daño epitelial alveolar en comparación con el tratamiento con PBS, aunque la deposición de colágeno aún fue significativamente mayor que la de los grupos controles sanos (Figura 3F-3G).
El examen de las células AQP5+ ATI y las células ProSPC+ AT2 reveló una disminución significativa en ambos marcadores alveolares en todos los pulmones lesionados por sílice (Figuras 3J y 3K). Sin embargo, CEP-CM fue capaz de reducir el daño epitelial alveolar en comparación con el grupo PBS al promover la expresión de células ProSPC+ AT2 y mantener la población de células AQP5+ ATI (Figuras 3I y 3J). En los nódulos fibróticos no había células ATI que expresaran AQP5, pero contenían una expresión limitada de células positivas para ProSPC y vWF (Figura 3K).
Composición de proteínas de medios acondicionados por células esferoides de pulmón.
Se definió la composición proteómica de CEP-CM. Se usó CM agrupado de tres líneas CEP de donantes diferentes y se usó análisis por cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (CL/EM/EM) para examinar su proteoma y compararlos con secretomas de células madre conocidos (Figuras 7A-7C).
Las tres líneas CEP tenían proteomas similares a pesar de que las líneas celulares derivaban de individuos de diferente sexo, raza y edad (Figura 4A). De las proteínas compartidas, el 29,6 % estaban anotadas como proteínas extracelulares con receptores de membrana conocidos para la secreción y el 47,5 % estaban anotadas como proteínas citoplasmáticas sin vías de secreción conocidas (Figura 4B).
El alto porcentaje de proteínas citoplasmáticas impulsó la verificación de si las proteínas identificadas en el CM eran verdaderamente proteínas secretadas por las células o liberadas de células muertas. De este modo, las proteínas citoplasmáticas identificadas en el CM se compararon con aquellas proteínas identificadas en células lisadas. Como se esperaba, cuando se lisaron las CEP, la mayor parte del proteoma consistía en proteínas citoplasmáticas anotadas (65 %) y solo el 5 % de proteínas extracelulares anotadas. Al comparar las proteínas citoplasmáticas detectadas en el CEP-CM con las células lisadas, solo 56 de 222 (aproximadamente el 25 %) de las proteínas clasificadas como proteínas citoplasmáticas en el CM podrían provenir de células potencialmente lisadas o muertas. Estos hallazgos sugieren que el otro 75 % aproximadamente de las proteínas anotadas como proteínas citoplasmáticas identificadas en CEP-CM son proteínas que se liberan de las células a través de un mecanismo o vía que actualmente se desconoce.
La mayoría de las 103 proteínas extracelulares comunes identificadas en los tres donantes eran factores de crecimiento y proteínas relacionadas con la matriz extracelular. Las más notables de esta lista fueron las proteínas involucradas en la señalización Wnt (inhibidor 3 de la vía de señalización WNT de dickkopf [DKK3]), el sistema del complemento (subcomponente C1r del complemento [C1r] y decorina), la angiogénesis (similar a la angiopoyetina 2 [ANGPTL2] y la proteína 1 de la matriz extracelular [ECM1]), desarrollo pulmonar (folistatina-similar a 1 [FSTL1] y nidógeno 2), proliferación celular (específica de detención del crecimiento 6 [DCE6] y proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 2 [IGFBP2]) y remodelación de la matriz extracelular (ECM) (MMP 1,2, 3, inhibidor tisular de metaloproteinasa [TIMP] 1, 2, potenciador de procolágeno C-endopeptidasa [PCOLCE], miembro 1 de la familia E de las serpinas [SERPINA1] y proteína secretada ácida y rica en cisteína [SPARC]) (Figura 4C). El análisis de ontología genética (OG) de los procesos biológicos asociados con el secretoma de CEP identificó genes importantes en el proceso de desarrollo, la respuesta al estímulo y la organización de los componentes celulares o la biogénesis (Figura 4D).
Los exosomas pueden reproducir parcialmente los efectos terapéuticos de los medios acondicionados por células madre
Se ha demostrado que los componentes terapéuticos en la CM de células madre se componen no solo de proteínas solubles sino también de vesículas extracelulares (VE), particularmente exosomas (EXO). En consecuencia, las CEP-EXO y CMM-EXO se caracterizaron por su tamaño, morfología y los marcadores exosomales comunes (CD63 y CD81) (Figura 5A-5C). Para probar los efectos funcionales de los EXO, se usó un modelo de PF inducido por Bleo en ratas SD similar al modelo de ratón presentado anteriormente (Figura 5D).
Todos los grupos tratados con CM y EXO mostraron efectos terapéuticos en términos de mantener la arquitectura pulmonar normal (Figura 5E) y disminuir la fibrosis (Figura 5f), la apoptosis pulmonar y la deposición de colágeno (Figuras 5G y 5H). En particular, solo CEP-CM y CEP-EXO disminuyeron significativamente la deposición de colágeno en comparación con el grupo tratado con PBS. Adicionalmente, solo CEP-CM disminuyó significativamente la fibrosis (puntuación de Ashcroft) a niveles similares a los del grupo control sano. Los niveles de proteína de aSMA mostraron una tendencia no significativa de disminución en los grupos de tratamiento (Figura 5I). El tratamiento con CEP-CM y CEP-EXO atenuó la lesión vascular y epitelial alveolar y redujo la respuesta fibrótica, como lo demuestra el aumento de AQP5+ y vWF+ células y disminución de aSMA+ células (Figura 5J-5K).
Efectos de la terapia CEP-CM y CEP-EXO sobre la expresión de MMP2 y MCP-1
Para examinar los posibles mecanismos moleculares implicados en la respuesta a las respuestas iniciadas por CM y EXO, se examinaron la expresión de citocinas sistémicas y los niveles de proteína tisular local de MMP2 y SMAD3. A diferencia del modelo murino Bleo, no se encontraron cambios significativos en los niveles de proteína MMP2 en el tejido pulmonar de los animales tratados (Figura 5I). Sin embargo, los niveles de proteína de SMAD3 en el tejido pulmonar de los animales tratados aumentaron significativamente en el grupo de PBS, lo que se alivió con el tratamiento con CEP-CM y CEP-EXO. Debido a que los efectos inmunomoduladores de las citocinas son sistémicos más que locales, se examinaron los niveles de citocinas en el suero sanguíneo de los animales tratados (Figura 6A). La proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1/CLL2) se reguló significativamente por la lesión de Bleo, que fue rescatada mediante el tratamiento con células madre-CM y -EXO.
Efectos de los medios acondicionados con células madre y las terapias con exosomas sobre la función pulmonar después de la fibrosis inducida por bleomicina
Se examinó el impacto clínico del tratamiento CEP-CM y CEP-EXO sobre la arquitectura pulmonar deteriorada y la fibrosis. Se realizaron múltiples pruebas de función pulmonar en paralelo con el tratamiento de inhalación para monitorear la disminución de la función pulmonar después de una lesión de Bleo y cualquier efecto de los distintos tratamientos. Las lecturas iniciales se registraron inmediatamente antes de la instilación de Bleo, las lecturas del punto medio se tomaron el día nueve después de Bleo (el día antes de que inició el tratamiento) y las mediciones finales se tomaron el día 17 después de Bleo (un día después del último tratamiento de inhalación) (Figura 6B). Como se esperaba, la capacidad inspiratoria (CI), la resistencia (Rrs), la distensibilidad (Crs), el área de histéresis y la relación entre el volumen espiratorio forzado (VEF) y la capacidad vital forzada (CVF) mostraron una disminución en las mediciones del punto medio en comparación con el valor inicial (Figuras 6C-6E, 6G, 6C-6E y 6G, respectivamente). Consistentemente, la elastancia respiratoria (ER), que es la inversa de la distensibilidad, aumentó constantemente en el análisis del punto medio (Figura 6F). En conjunto, la función pulmonar de todos los animales con Bleo se vio constantemente afectada como se esperaba, con una lesión pulmonar que resultó en una mayor rigidez del tejido y retroceso elástico (elastancia).
En el análisis final, la función pulmonar solo se rescató parcialmente mediante el tratamiento con CM y EXO. La capacidad inspiratoria y la distensibilidad respiratoria mejoraron significativamente después del tratamiento con CEP-<c>M, CEP-EXO o CMM-EXO. La resistencia respiratoria tuvo una recuperación significativa solo con el tratamiento con CEP-EXO. La elastancia, el área de histéresis y la relación VEF/CVF no tuvieron cambios significativos después del tratamiento.
Toxicidad de los medios acondicionados y las terapias con exosomas.
Además de la eficacia del tratamiento CM y EXO, también se evaluó la seguridad de los tratamientos. Se encontró que la función hepática y renal estaba dentro de un intervalo aceptable en todos los grupos de tratamiento (Figura 12). El análisis histológico de los tejidos del corazón, riñón, hígado y bazo de los animales tratados tanto en los estudios de sílice como en los de Bleo no reveló ningún daño aparente ni toxicidad (Figura 13).
MicroARN-30a, miR-99a y miR-100 están altamente enriquecidos en CEP-EXO
Los exosomas contienen una variedad de ARN, proteínas y lípidos diferentes, pero los miARN son de interés desde su descubrimiento dentro de los EXO. Se cree que los EXO utilizan miARN como mecanismo de intercambio genético entre células. Por lo tanto, se realizó una secuenciación profunda global de ARN pequeño de CEP y CMM-EXO y se analizaron las diferencias en sus poblaciones de miARN.
En conjunto, se detectaron más de 600 miARN únicos en estas muestras de CEP-EXO y CMM-EXO, lo que indica que los miARN derivados de exosomas podrían tener numerosas funciones reguladoras en estas muestras. Después de retirar los miARN menos abundantes, quedaron 142 para el análisis posterior (Figuras 6I y 6J). En total, se encontró que 42 miARN se expresaban diferencialmente entre estos dos tipos de EXO (cambio en veces de dos y valor de p ajustado <0,05). Entre los miARN con mayor regulación positiva en CEP-EXO se encontraban hsa-miR-99a-5p (cambio en veces del Iog2 1,25, valor de p ajustado 0,0005) y hsa-miR-100-5p (cambio en veces del Iog2 1,27, valor de p ajustado 0,0005) (Figura 6J). También fueron los dos miARN más abundantes en CEP-EXO y son miembros de la familia miR-99 (Figura 6K). El antifibrótico miR-30a-3p se reguló en positivo significativamente en CEP-EXO en comparación con CMM-EXO (cambio en veces del Iog22,28, valor de p ajustado 0,00002). hsa-let-7a-5p (cambio en veces del Iog2 1,09, valor de p ajustado 0,001) y has-let-7f-5p (cambio en veces del Iog2 1,28, valor de p ajustado 0,008) fueron los más regulados positivamente en la muestra CMM-EXO y son parte de la familia let-7 altamente conservada (Figuras 14 y 15).
En consecuencia, un aspecto de la descripción abarca una población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares en una cantidad efectiva para modular una afección patológica pulmonar cuando se suministra a un sujeto animal o humano que lo necesita.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la afección patológica pulmonar es fibrosis pulmonar.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica puede comprender al menos uno de: un polipéptido aislado, un péptido aislado o un ácido nucleico aislado, y en donde el polipéptido aislado, péptido aislado o ácido nucleico aislado se secreta por un cultivo de células esferoides pulmonares.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica puede comprender una población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares aislados de un medio acondicionado con células esferoides pulmonares.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, el ácido nucleico puede ser un miARN.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica administrada a las vías respiratorias del sujeto animal o humano puede comprender además un portador farmacéuticamente aceptable.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica puede ser un medio de cultivo celular acondicionado liofilizado generado mediante el cultivo de una población de células esferoides pulmonares en el mismo.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica administrada a las vías respiratorias de un sujeto animal o humano mediante el nebulizador puede ser un polvo liofilizado.
Otro aspecto de la descripción abarca modalidades de un método para producir una composición farmacéutica que comprende una población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares, el método comprende las etapas de: (a) obtener una población de células madre pulmonares aisladas de un tejido pulmonar de un sujeto animal o humano; (b) generar un medio de cultivo celular acondicionado mediante el cultivo de la población aislada de células madre en un medio de cultivo celular; y (c) retirar los exosomas del medio de cultivo acondicionado.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, el método puede comprender además la etapa de aislamiento del medio de cultivo celular acondicionado al menos uno de (a) un polipéptido aislado, un péptido aislado o un ácido nucleico aislado secretado por una célula esferoide pulmonar cultivada en el cultivo celular acondicionado, o (b) una población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares generadas por una población de células esferoides pulmonares cultivada en el medio de cultivo celular acondicionado.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, el método puede comprender además la etapa de liofilizar el medio de cultivo acondicionado.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, el método puede comprender además la etapa de liofilizar al menos uno de (a) al menos uno de un polipéptido aislado, un péptido aislado o un ácido nucleico aislado secretado por una célula esferoide pulmonar cultivada en el cultivo celular acondicionado, o (b) una población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares generadas por una población de células esferoides pulmonares cultivadas en el medio de cultivo celular acondicionado.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, el método del producto liofilizado del método se puede combinar con un medio farmacéuticamente aceptable.
Aún otro aspecto de la descripción abarca modalidades de un método para tratar una afección patológica de un sistema pulmonar animal o humano, en donde el método comprende administrar a una región de las vías respiratorias de un sujeto animal o humano una población de exosomas derivadas de células esferoides pulmonares en una cantidad efectiva para modular una condición patológica pulmonar cuando se suministra al animal o al sujeto humano que lo necesita.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la afección patológica pulmonar es fibrosis pulmonar.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica puede comprender al menos uno de: un polipéptido aislado, un péptido aislado o un ácido nucleico aislado, y en donde el polipéptido aislado, péptido aislado o ácido nucleico aislado se secreta por un cultivo de células esferoides pulmonares.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica puede comprender una población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares aislados de un medio acondicionado con células esferoides pulmonares.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, el ácido nucleico puede ser un miARN.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica administrada a las vías respiratorias del sujeto animal o humano puede comprender además un portador farmacéuticamente aceptable.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica puede ser un medio de cultivo celular acondicionado liofilizado generado mediante el cultivo de una población de células esferoides pulmonares en el mismo.
En algunas modalidades de este aspecto de la descripción, la composición farmacéutica administrada a las vías respiratorias de un sujeto animal o humano mediante el nebulizador puede ser un polvo liofilizado.
Cabe destacar que las modalidades de la presente descripción, particularmente cualquiera de las modalidades "ventajosas", son simplemente ejemplos de posibles implementaciones, simplemente expuestas para una comprensión clara de los principios de la descripción. Pueden realizarse muchas variaciones y modificaciones a la(s) modalidad(es) de la descripción sin apartarse sustancialmente del espíritu y principios de la descripción.
Los ejemplos específicos que aparecen más abajo deben considerarse simplemente ilustrativos y no limitativos del resto de la descripción de modo alguno. Sin más detalles, se considera que un experto en la técnica puede, basado en la presente descripción, utilizar la presente descripción en toda su extensión.
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una descripción y divulgación completas de cómo realizar los métodos y usar las composiciones y compuestos descritos y reivindicados en la presente descripción. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números(por ejemplo,,cantidades, temperatura, etc.), pero deberían tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones. A menos que se indique de cualquier otra manera, las partes son partes en peso, la temperatura es en °C y la presión es la atmosférica o cercana a esta. La temperatura y presión estándar se definen como 20 °C y 1 atmósfera.
Se debe señalar que las relaciones, concentraciones, cantidades, y otros datos numéricos pueden expresarse en la presente descripción en un formato de intervalo. Debe entenderse que tal formato de intervalo se usa por conveniencia y brevedad y, así, debe interpretarse de manera flexible para incluir no solamente los valores numéricos mencionados explícitamente como los límites del intervalo, sino también para incluir todos los valores numéricos individuales o subintervalos abarcados dentro de ese intervalo como si cada valor numérico y subintervalo se mencionara explícitamente. A modo de ilustración, se debe interpretar que un intervalo de concentración de “aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 5 %” incluye no solo la concentración explícitamente citada de aproximadamente 0,1 % en peso a aproximadamente 5 % en peso, sino que también incluye concentraciones individuales(por ejemplo,1 %, 2 %, 3 % y 4 %) y los subintervalos(por ejemplo,0,5 %, 1,1 %, 2,2 %, 3,3 % y 4,4 %) dentro del intervalo indicado. El término “aproximadamente” puede incluir ±1 %, ±2 %, ±3 %, ±4 %, ±5 %, ±6 %, ±7 %, ±8 %, ±9 % o ±10 %, o más del valor(es) numérico(s) que se está(n) modificando.
Ejemplos
Ejemplo 1
Cultivo de Células: Las CEP humanas se generaron a partir de muestras de pulmón completo y se expandieron como se describe en Dinhy otros,(2017)Respiratory Research.Las CEP humanas se generaron a partir de donantes de pulmón completo sanos y se expandieron como se describe en la Figura 5. Se usaron los CEP del paso 2-5 para todas las pruebasin vitroyen vivo.Las células también se analizaron mediante citometría de flujo para detectar los marcadores apropiados antes de su uso (CD90+, CD105+, CCSP+, AQP5+, ProSPC+, Epcam+, CD31-, CD34- y CD45-).
Ejemplo 2
Recolección y preparación de medios acondicionados: Se cultivaron CEP y CMM humanas para aproximadamente el 75 % de confluencia antes de que los medios que contenían suero fueran eliminados y reemplazados por medios sin suero (IMDM). Al día siguiente, las células se lavaron seis veces durante 30 minutos cada una con IMD<m>nuevo para agotar la albúmina de las células antes de dejar que el medio se acondicionara, ya que la albúmina puede interferir con algunos experimentos (especialmente el análisis CL/EM/EM). Se dejó que el medio (IMDM) se acondicionara durante tres días antes de recolectarlo y filtrarlo a través de un filtro de 0,22 pm para eliminar las células y los restos celulares. El CM filtrado se almacenó a -80 °C durante al menos 24 horas o hasta que se solidificó. Los viales de CM congelados se liofilizaron mediante el uso de un sistema de liofilización LABCONCO FreeZone de 2,5 litros durante la noche o hasta que las muestras se deshidrataron. Una vez liofilizadas las muestras, se almacenaron a -20 °C hasta su uso.
Ejemplo 3
Aislamiento y caracterización de exosomas: Se recolectaron y purificaron exosomas de CEP-CM humano mediante el uso de un método de ultrafiltración. Primero se filtró CEP-CM a través de un filtro de 0,22 pm para eliminar las células o restos celulares. Luego, el medio filtrado se colocó en un filtro de ultrafiltración MWCO de 100 kDa (Millipore) y se centrifugó a 5000 RCF durante 10-15 minutos en dependencia del volumen. Cualquier contenido del medio o proteínas pequeñas se eliminó mediante centrifugación filtrada y los exosomas restantes se suspendieron en PBS, luego se filtraron y lavaron. Antes de su uso, se analizó el tamaño adecuado de todas las muestras de exosomas mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA; NanoSight, Malvern) y morfología mediante microscopía electrónica de transmisión (MET). Adicionalmente, el aislamiento exitoso del exosoma se confirmó mediante inmunotransferencia para marcadores de exosoma conocidos (CD63 y CD81).
Ejemplo 4
Procedimientos con animales: Ratones CD1 machos de seis a ocho semanas de edad [Crl: Ratas CD1(ICR)] y CD (SD) IGS [Crl: CD(SD)] se obtuvieron del laboratorio Charles River (Massachusetts, EE. UU.) y los ratones A/J se obtuvieron del laboratorio Jackson (Maine, EE. UU.). La fibrosis pulmonar se indujo mediante una única inyección intratraqueal de 3 U/kg de solución de sulfato de bleomicina (EMD; 203401) en ratones CD1 y ratas CD (SD) y una única aspiración orofaríngea de 100 mg/kg de suspensión de sílice (MIN-U-SIL- 5) en ratones A/J. El tratamiento con nebulizador comenzó 10 días después de la agresión con bleomicina y 28 días después de la agresión con sílice. Se administró un tratamiento de inhalación con medios acondicionados, exosomas o solución salina durante aproximadamente 30 minutos/día durante siete días consecutivos mediante el uso de un nebulizador (Pari Trek S Sistema de aerosol con compresor portátil; 047F45-LCS). Los animales se sacrificaron y se recolectó sangre y tejidos para análisis histológico de proteínas y de ARN.
Ejemplo 5
Prueba de función pulmonar (PFP) en ratas: Las mediciones de la función pulmonar se realizaron en FlexiVent (SCIREQ Inc., Montreal, Canadá). Antes de las mediciones, los animales fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de solución de ketamina y xilazina (relación 2:1). Los animales fueron intubados con una cánula de calibre 14.
Ejemplo 6
Histología: La inmunotinción se realizó en portaobjetos de tejido fijados en paraformaldehído (PFA) al 4 % (Electron Microscopy Sciences; 15710) seguido de permeabilización y bloqueo con solución de bloqueo de proteína Dako (DAKO; X0909) que contiene saponina al 0,1 % (Sigma-Aldrich; 47036) antes de la tinción con anticuerpo. Las células se tiñeron con anticuerpos contra AQP5 (ab78486, Abcam), ProSPC (ab90716, Abcam), vWF (F3520, Sigma-Aldrich), aSMA (ab5694, Abcam). La tinción T unel se realizó en tejidos crioseccionados mediante el uso del kit de detección de muerte celular in situ (Diagnósticos Roche, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tricrómico de Gomori y la hematoxilina y eosina se realizaron en secciones de tejido incluidas en parafina. Se usaron secciones teñidas con hematoxilina y eosina para la puntuación de Ashcroft. La puntuación de Ashcroft se realizó al promediar la puntuación de un evaluador cegado y otro no cegado.
Ejemplo 7
Análisis proteómico: Para concentrar las muestras, se liofilizaron 15 ml del medio acondicionado. Las muestras se secaron completamente en 24 h y se resuspendieron en 1 ml de tampón de bicarbonato de amonio 100 mM (Sigma Aldrich) a pH 8,6. Para la precipitación de proteínas, se agregaron a las muestras 10 ml de acetona fría (calidad óptima, ThermoFisher Scientific), se incubaron a -20 °C durante la noche y luego se centrifugaron durante 30 minutos a 10 000 rpm para separar las proteínas precipitadas del sobrenadante. La concentración de proteína total se determinó mediante el uso del ensayo Bradford (Pierce, ThermoFisher Scientific).
Todas las muestras se cargaron por triplicado (10 j l ) en una placa de microtitulación, se midieron a una absorbancia de 595 nm mediante el uso de un lector de microplacas Tecan Genios y se estimaron las concentraciones de proteína mediante el uso de la absorbancia de referencia de la proteína estándar BSA. Las proteínas precipitadas se digirieron mediante el uso del método de preparación de muestras asistida por filtro (FASP) como se describió por Wisniewski y otros. En un filtro Vivacon de corte de peso molecular de 30 kDa (Satortorius, ThemoFisher Scientific), se agregaron aproximadamente 100 jg de proteína de cada muestra, se redujeron con ditioteritol 5 mM (ThermoFisher Scientific) a 56 °C durante 30 min y luego se alquilaron con yodoacetamida 10 mM (Sigma-Aldrich) durante 20 min en la oscuridad a temperatura ambiente. La digestión en el filtro se llevó a cabo mediante el uso de tripsina de grado de secuenciación (Promega) en una relación de tripsina a proteína de 1:100 durante la noche a 37 °C. Los péptidos se eliminaron del filtro con tampón de bicarbonato de amonio 100 mM, pH 8,6, y el solvente se evaporó mediante centrifugación al vacío antes de almacenarlo a -20 °C para su posterior procesamiento.
El análisis CL/EM/EM para todas las muestras se realizó en un cromatógrafo líquido de ultra alta presión Easy nano acoplado a un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap Elite (ThermoFisher Scientific). Las muestras se inyectaron en una columna de captura de 5 jm PepMap C18 (ThermoFisher Scientific) y luego se separaron mediante gradiente en línea en una columna New Objective Self Pack PicoFrit (empaquetada internamente con fase estacionaria Reprosil C18 de 3,0 jm (Dr. Maisch GmbH). El gradiente lineal para la separación fue 5-40 % de fase móvil B durante 90 min a un régimen de flujo de 300 nl/min, donde la fase móvil A fue 2 % de acetonitrilo/0,1 % de ácido fórmico en agua y la fase móvil B fue 0,1 % de ácido fórmico en acetonitrilo. El Orbitrap Elite operó en un modo dependiente de los datos, donde se seleccionaron los cinco precursores más intensos para su posterior fragmentación. La resolución para el escaneo precursor (m/z 400-2000) se fijó en 60000 enm/z400 con un valor objetivo de 1 x 106 iones. Los escaneos EM/EM también se adquirieron en la trampa orbital con una configuración de energía de colisión normalizada de 27 para HCD. Para la calibración de masa interna, se usó como masa de bloqueo el ion de policiclodimetilsiloxano con m/z 445,120025. Se permitió la selección de precursores monoisotópicos y se excluyeron los precursores con carga desconocida o un estado de carga de 1.
Los archivos de datos sin procesar se procesaron mediante el uso de Proteome Discoverer (1.4, ThermoFisher Scientific). Se buscaron listas de picos en una base de datos UniProt de Homo sapiens directa e inversa mediante el uso de Mascot (1.4.1.14 Matrix Science). Los parámetros usados para la identificación de péptidos trípticos fueron: Tolerancia de masa de iones precursores de 10 ppm, tolerancia de masa de fragmentos de 0,01 Da; hasta dos sitios de escisión omitidos; la carbamidometilación de Cys se estableció como una modificación fija; la oxidación de Met se estableció como una modificación variable. Se usó Scaffold (software 4.8.4 Proteome) para filtrar los datos, cuantificar péptidos/proteínas y realizar análisis estadísticos. Se requirió un mínimo de 2 péptidos por proteína con un umbral de péptidos y proteínas del 95 % para una identificación de alta confianza. Se usó el análisis proteómico Ingenuity (IPA, QIAGEN Redwood City) para la clasificación de la localización subcelular de las proteínas comunes. Las proteínas secretadas comunes enumeradas se clasificaron mediante el uso de Panther (Análisis de proteínas a través de relaciones evolutivas) y DAVID (Base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado) para explorar la función molecular, los componentes celulares y las vías.
Ejemplo 9
SDS-PAGE y transferencia Western: Las muestras se redujeron con p-mercaptoetanol y se desnaturalizaron a 90 °C durante 5 min. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel llevada a cabo por triplicado en un gel sin manchas de Tris-Glicina al 4-15 % (Bio-Rad) junto con un estándar de peso molecular (Bio-Rad, Precision Plus Protein Unstained Standards MW Ladder 161-0363). El gel se corrió a una tensión de pila de 100 V durante aproximadamente 5 minutos seguido de 200 V constantes. El gel se activó y visualizó mediante luz ultravioleta en un Bio-Rad Imager.
Se usó el sistema Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell para una transferencia húmeda. El gel SDS-PAGE se montó en el aparato con una membrana de PVDF apilada entre papeles de filtro. Después de la transferencia, la membrana se lavó tres veces en PBS-T durante 5 minutos cada vez y luego se bloqueó mediante el uso de leche al 5 % en PBS-T durante una hora. Se realizó una incubación nocturna a 4 °C del anticuerpo primario para MMP2 (ab86607, Abcam), aSMA (ab5694, Abcam), SMAD3 (MA5-14939, ThermoFisher Scientific), CD63 (nb100-77913, Novus Biologicals), CD81 (MA5-13548, ThermoFisher Scientific) y GAPDH (MA5-15738-HRP, ThermoFisher Scientific) y luego seguido de una incubación de 1 hora con los correspondientes anticuerpos secundarios conjugados con HRP.
Ejemplo 10
Construcción y secuenciación de pequeñas bibliotecas de ARN: El ARN exosomal se aisló mediante el uso de un kit de aislamiento de ARN exosomal total disponible comercialmente (kit exoRNeasy Serum Plasma de Qiagen). Una vez que se aisló el ARN exosomal, se analizó más a fondo mediante secuenciación. Nanodrop (ThermoFisher) evaluó la cantidad de ARN, las relaciones 260/280 y las relaciones 260/230. La integridad del ARN se verificó en un Bioanalyzer 2100 mediante el uso de un nanoensayo Agilent RNA 6000. Se prepararon pequeñas bibliotecas de ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante mediante el uso de un conjunto de bibliotecas de ARN pequeñas NEBNext.RTM Multiplex para Illumina (New England Biolabs). Las bibliotecas se seleccionaron por tamaño mediante el uso de un Pippen Prep (Sage Science) y se verificó la calidad mediante Bioanalyzer utilizando un kit de ADN de alta sensibilidad Agilent. Las bibliotecas se cuantificaron mediante un kit de ensayo de alta sensibilidad dsDNA QuantiT.RTM (ThermoFisher) y se secuenciaron en un Illumina NextSeq500 mediante el uso de un kit V2 de salida media.
Mapeo y análisis de expresión diferencial de miARN: Las lecturas sin procesar se demultiplexaron y se recortó la calidad mediante el uso del software de conversión estándar Illumina bcl2fastq. Mediante el uso de mirDeep2, a las lecturas se les quitaron los adaptadores y se agruparon mediante el uso de los parámetros predeterminados. Luego, las lecturas se alinearon con los ARNr humanos mediante el uso de Bowtie y las lecturas no alineadas restantes se asignaron a miRBase 22 también mediante el uso de Bowtie. Para el análisis posterior, los miARN identificados se filtraron exigiendo que un miARN tuviera al menos diez recuentos de lectura en al menos dos de las cinco muestras. El análisis de expresión diferencial entre muestras de CMM y muestras de CEP se realizó mediante el uso de los paquetes edgeR y limma R y recuentos de lectura normalizados del cuantil superior. Los miARN se consideraron expresados diferencialmente si el cambio en veces del Iog2 absoluto era mayor que 1 y si el valor de p ajustado (FDR) era menor que 0,05.
Ejemplo 11
Análisis estadístico: AW los resultados se expresan como media ± desviación estándar (DE). Se usó la prueba t de Student de dos colas para la comparación entre dos grupos. Se usó ANOVA no paramétrico unidireccional (prueba de Kruskal-Wallis) para comparar tres o más grupos con corrección adicional post hoc de Bonferroni. Las diferencias con valores de P inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativas. * Valores de p < 0,05; ** Valores de p < 0,01; *** Valores de p < 0,001; **** Valores de p < 0,0001.
Ejemplo 12
T l 1: Pr ín i n ifi x m l l f r i lm n r liv

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende una población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares en una cantidad efectiva para modular una afección patológica pulmonar cuando se suministra a un sujeto animal o humano que lo necesita, y un portador farmacéuticamente aceptable.
2. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la afección patológica pulmonar es fibrosis pulmonar.
3. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica comprende al menos uno de un polipéptido aislado, un péptido aislado o un ácido nucleico aislado,
4. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares se aísla de un medio acondicionado con células esferoides pulmonares.
5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el ácido nucleico es un miARN.
6. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica es un polvo liofilizado formulado para administración a las vías respiratorias de un sujeto animal o humano mediante un nebulizador.
7. Un método para producir una composición farmacéutica que comprende una población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares, el método comprende las etapas de:
(a) obtener una población de células madre pulmonares aisladas de un tejido pulmonar de un sujeto animal o humano;
(b) generar un medio de cultivo celular acondicionado mediante el cultivo de la población aislada de células madre en un medio de cultivo celular; y
(c) aislar la población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares del medio de cultivo acondicionado.
8. El método de la reivindicación 7, que comprende además la etapa de liofilizar el medio de cultivo acondicionado.
9. Los métodos de la reivindicación 8, en donde el producto liofilizado se combina con un medio farmacéuticamente aceptable.
10. Una composición farmacéutica para usar en el tratamiento de una afección patológica pulmonar, la composición farmacéutica comprende una población de exosomas derivados de células esferoides pulmonares, en donde la composición farmacéutica se formula para tratar una afección patológica pulmonar cuando se suministra a un sujeto animal o humano que lo necesita.
11. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la afección patológica pulmonar es fibrosis pulmonar.
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