ES2952613T3

ES2952613T3 - Sistema de sustitución de tejidos diseñado

Info

Publication number: ES2952613T3
Application number: ES16746019T
Authority: ES
Inventors: Aziz Ghahary; Ryan Hartwell
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: University of British Columbia
Priority date: 2015-02-06
Filing date: 2016-02-03
Publication date: 2023-11-02
Anticipated expiration: 2036-02-03
Also published as: EP3253417A1; AU2016214910B2; US20180258960A9; US20190010963A9; EP3253417B1; WO2016123693A1; AU2016214910A1; US20180031005A1; JP2018504242A; US10865811B2; EP3253417A4; JP6937696B2; CA2974209A1

Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos de preparación y uso para un sistema sustituto de tejido diseñado que comprende colágeno, glucosaminoglicano e hidrogel en una matriz reticulada. Las composiciones pueden liofilizarse y reconstituirse adicionalmente con un fluido fisiológico antes de su uso en métodos, tales como en el tratamiento de heridas, ingeniería de tejidos y trasplante de células. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema de sustitución de tejidos diseñado

Campo técnico

La presente invención se refiere a la curación de heridas, la ingeniería de tejidos, el trasplante de células y la ciencia de los polímeros. En particular, la invención se refiere a composiciones de sustitución de tejidos y matriz, procedimientos de uso y procedimientos de fabricación de las mismas. La presente invención proporciona además procedimientos de uso que incluyen procedimientos de curación de heridas y trasplante de células. Antecedentes

El cuidado de heridas trasciende la edad, el género, la nacionalidad y otros datos demográficos, y es un segmento costoso del cuidado de la salud, valorado en $16 mil millones de dólares en todo el mundo. A pesar del hecho de que los productos actuales para el cuidado de heridas son altamente innovadores, la cicatrización complicada de heridas aún puede conducir a hospitalizaciones y amputaciones prolongadas y recurrentes. Las principales enfermedades como la obesidad y la diabetes, junto con el envejecimiento de la población, se encuentran entre las fuerzas impulsoras detrás de la prevalencia de heridas complicadas. La cascada de curación normal de las heridas agudas consiste en la coagulación, la reepitelización y luego la remodelación del tejido recién formado. Las heridas complicadas, como las heridas crónicas (úlceras) o las quemaduras, pueden permanecer abiertas debido a déficits de cicatrización celular y/o fisiológica. Cuanto más tiempo permanezca abierta una herida, mayor será la posibilidad de infección y carga biológica (biopelículas) y, a menudo, mayor será el riesgo de cicatrización. La industria del cuidado avanzado de heridas tiene, por estas razones, un tremendo interés en desarrollar apósitos biológicos para heridas más eficaces. Una estrategia para la reparación y regeneración de tejidos es el uso de andamios biomiméticos que fomentan el crecimiento y desarrollo de un tejido para restaurar su arquitectura normal. Un problema importante con los andamios sólidos (láminas) es su incapacidad para adaptarse a heridas de formas y tamaños irregulares. Donde los materiales inyectables pueden ser útiles, los materiales actualmente disponibles en el mercado son débiles en comparación con el tejido circundante. No obstante, la gelificación in situ de matrices extracelulares puede mejorar el rendimiento del trasplante de células y otros procedimientos quirúrgicos.

Numerosos avances en las ciencias de los polímeros han proporcionado muchas opciones para futuros desarrollos (por ejemplo, 7799767, 7226611, 6833408, 6818018, 6136334, 5147344, 4664857, 4565784, WO2000/061660, WO1999/053968, EJ. Suuronen et al. Toxicological Sciences (2004) y B. Sarti, M. Scandola Biomaterials (1995) y Remi Parenteau-Bareil et al. Materials (2010)). Además, R. Hartwell et al. describen un compuesto de hidrogel-colágeno que mejoró las características (Acta Biomaterialia (2011)). Hosseini-Tabatabaei et al. 2013 Canadian Journal of Diabetes vol. 37, no. 1, págs. 27-35 divulga que la incorporación de islotes en un andamio líquido aumenta la viabilidad y la función de los islotes. Kamoun et al. 2014 Arabian Journal of Chemistry vol. 8 no. 1, págs. 1-14 es una revisión de hidrogeles de poli(alcohol vinílico) reticulados para aplicaciones de apósitos para heridas. Hartwell et al. 2016 Biomedical Materials vol. 11, no. 3, pág. 35103 divulga que los hidrogeles de polietilenglicol con injerto de alcohol polivinílico mejoran la utilidad y la biofuncionalidad de los biomateriales de colágeno inyectables.

Sin embargo, existe una necesidad significativa y actualmente no satisfecha de estrategias, productos y enfoques mejorados para el cuidado de heridas.

Sumario

La presente invención se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que ciertas composiciones que comprenden colágeno, glicosaminoglicano, hidrogel y uno o más agentes de reticulación, son capaces de formar una matriz resistente, térmica y enzimáticamente estable, adecuada para una variedad de usos. Algunas realizaciones de la invención se basan además en el descubrimiento fortuito de que dichas composiciones se pueden preparar en forma de polvo seco que se puede reconstituir con un disolvente adecuado, incluido un fluido fisiológico (por ejemplo, suero sanguíneo o plasma), para formar una matriz fuerte y térmicamente estable. Las realizaciones de la invención se basan además en el descubrimiento de que tales composiciones pueden encontrar una utilidad particular como agentes terapéuticos para el tratamiento de heridas y trasplante de células en general. Las realizaciones de la invención se basan además en el hallazgo fortuito de que las células responden favorablemente a parte de la composición descrita en la presente memoria descriptiva, que es claramente diferente de las composiciones previamente conocidas de colágeno y glicosaminoglicano solos. La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

En una primera realización, se proporciona una composición, que incluye: (a) colágeno, en la que el colágeno está en una concentración de entre 3 y 10 mg/ml; (b) glicosaminoglicano, en la que la relación de glicosaminoglicano a colágeno es una relación en peso de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 8:1; (c) un agente de reticulación biocompatible de molécula pequeña de colágeno y glicosaminoglicano; (d) un hidrogel, en la que el hidrogel es 0,3%-1,2% p/vol de la composición final; y (e) un agente de reticulación de hidrogel biocompatible de molécula pequeña.

El hidrogel se forma a partir de polímeros de hidrogel y los polímeros de hidrogel se seleccionan de uno o más de: alcohol polivinílico (PVA); alcohol polivinílico tiolado; polímeros en bloque de alcohol polivinílico que contienen polietilenglicol (PVA-PEG); polivinilpirrolidona (PVP); y un copolímero del mismo de uno cualquiera de dos o más de los polímeros anteriores.

El agente de reticulación de colágeno y glicosaminoglicano se selecciona de uno o más de los siguientes: glutaraldehído, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC), EDC (1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida):NHS (N-hidroxisuccinimida), EDC (1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida):sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida), diisocianato de hexametileno y Genipina.

La composición se prepara de tal manera que el colágeno, el glicosaminoglicano y el hidrogel forman una matriz reticulada como se describe en la presente memoria descriptiva, pero luego se liofiliza y se pulveriza posteriormente. La liofilización puede resultar beneficiosa para aumentar la estabilidad de la composición y también permite la reconstitución con el disolvente más adecuado para el uso particular.

En una realización adicional, se proporciona un procedimiento para la preparación de una composición, incluyendo el procedimiento: (a) mezclar colágeno con glicosaminoglicano, en el que la relación de glicosaminoglicano a colágeno puede ser una relación en peso de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 8:1; (b) reticulación de colágeno y glicosaminoglicano; (c) añadir un hidrogel al colágeno reticulado y glicosaminoglicano, en el que el hidrogel puede ser del 0,3% al 1,0% p/vol de la composición final; y (d) reticular el hidrogel, en el que el procedimiento además comprende liofilizar la composición y pulverizar la composición liofilizada;

en el que el hidrogel se forma a partir de polímeros de hidrogel y los polímeros de hidrogel se seleccionan de uno o más de: alcohol polivinílico (PVA); alcohol polivinílico tiolado; polímeros en bloque de alcohol polivinílico que contienen polietilenglicol (PVA-PEG); polivinilpirrolidona (PVP); y un copolímero del mismo de uno cualquiera de dos o más de los polímeros anteriores;

y en el que el agente de reticulación de colágeno y glicosaminoglicano se selecciona de uno o más de los siguientes: glutaraldehído, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC), EDC (1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida):NHS (N-hidroxisuccinimida), EDC (1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida):sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida), diisocianato de hexametileno y Genipina.

En una realización adicional, se proporciona un procedimiento para la preparación de una composición, incluyendo el procedimiento: a) reticulación de colágeno y condroitina-6-sulfato a pH casi neutro; b) añadir hidrogel polimérico a base de alcohol polivinílico; c) añadir borato y ácido ascórbico; d) congelar la mezcla de c); e) secar la mezcla congelada; y f) triturar el producto liofilizado hasta obtener un polvo.

En la presente memoria descriptiva también se divulga, pero no se reivindica, un paquete comercial que incluye: (a) una composición descrita en la presente memoria descriptiva; y (b) un recipiente.

En otra realización, se proporciona una composición descrita en la presente memoria descriptiva para su uso en el tratamiento de heridas.

En una realización adicional, se proporciona un procedimiento de cultivo de células, que incluye la mezcla de células con lo descrito en la presente memoria descriptiva.

En la presente memoria descriptiva también se divulga, pero no se reivindica, un procedimiento de injerto de piel, incluyendo el procedimiento: (a) aplicar un injerto de piel en malla; y (b) rellenar los interocitos del injerto de piel en malla con la composición o composición reconstituida descrita en la presente memoria descriptiva.

Las composiciones también pueden contener trazas de dextrano cuando se usan para estabilizar la reacción de reticulación del glutaraldehído, como un azúcar no reducible que también puede proporcionar equilibrio osmótico. Los hidrogeles sin borato/sin PVA pueden funcionar con un porcentaje en peso mayor, pero a medida que el porcentaje en peso del hidrogel de PVA/borato aumenta por encima del 0,1%, puede volverse más difícil de manejar. Las concentraciones de hasta el 1% p/v funcionan bastante bien, pero pueden haber ralentizado el crecimiento celular. Un intervalo adecuado puede ser del 0,01-0,5%. Además de los glicosaminoglicanos, se pueden usar polisacáridos no ramificados, pero no se recomiendan los polisacáridos no sulfatados (por ejemplo, ácido hialurónico). Además, el quitosano y el hialuronano no deben usarse.

El colágeno puede ser principalmente colágeno fibrilar. El colágeno fibrilar se puede seleccionar de uno o más de los colágenos Tipo I, II, III, V y XI. El colágeno fibrilar puede ser colágeno Tipo I. El colágeno puede estar en una concentración de entre 3-10 mg/ml. La relación de glicosaminoglicano a colágeno puede ser una relación en peso de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 8:1. La relación de glicosaminoglicano a colágeno puede ser una relación en peso de 6:1. El glicosaminoglicano puede ser un glicosaminoglicano sulfatado. El glicosaminoglicano se puede seleccionar de uno o más de los siguientes: sulfato de dermatán, sulfato de queratán, sulfato de heparán y heparina. El glicosaminoglicano puede ser condroitina-6-sulfato.

El hidrogel puede ser del 0,4% al 0,8% p/vol de la composición final. El hidrogel puede ser del 0,4% al 0,7% p/vol de la composición final. El hidrogel puede ser del 0,4% al 0,6% p/vol de la composición final. El hidrogel puede ser del 0,5% al 0,6% p/vol de la composición final. El hidrogel puede ser del 0,4% al 0,5% p/vol de la composición final.

El agente de reticulación de hidrogel biocompatible de molécula pequeña puede ser 0,01% (p/v) - 0,0001% (p/v) de la composición final. El agente de reticulación de hidrogel biocompatible de molécula pequeña puede ser 0,01% (p/v) - 0,1% (p/v) de la composición final. El agente de reticulación de hidrogel biocompatible de molécula pequeña puede ser borato de sodio decahidratado. El agente de reticulación de hidrogel biocompatible de molécula pequeña puede ser borato de sodio decahidratado.

La composición puede incluir además un disolvente. El disolvente puede ser un fluido fisiológico. El fluido fisiológico puede ser sangre, suero o plasma.

La matriz formada por gelificación de la composición tiene una resistencia a la tracción de entre 0,2 - 2,0 MPa. La matriz formada por gelificación de la composición tiene una resistencia a la tracción de entre 1,45 - 2,0 MPa. La composición descrita en la presente memoria descriptiva, en la que la fibrilogénesis comienza entre 13 y 16 minutos después de la adición del disolvente. La composición descrita en la presente memoria descriptiva, en la que la gelificación del polvo se produce entre 25° y 40 °C. La composición descrita en la presente memoria descriptiva, en la que la gelificación del polvo se produce entre 25° y 37 °C. La composición descrita en la presente memoria descriptiva, en la que la gelificación del polvo se produce entre 30° y 37 °C. La composición descrita en la presente memoria descriptiva, en la que la gelificación del polvo se produce a 37 °C.

La reticulación de colágeno y glicosaminoglicano puede ser por tratamiento deshidrotérmico (DHT), irradiación ultravioleta (UV) o reticulación enzimática.

El procedimiento incluye la liofilización de la composición. El procedimiento además incluye pulverizar la composición liofilizada. El procedimiento puede incluir además la reconstitución del polvo en un disolvente. El disolvente puede ser un fluido fisiológico o agua. El fluido fisiológico puede ser sangre, suero o plasma.

El procedimiento puede incluir además la adición de un disolvente acuoso biológico o no biológico al polvo para formar una composición reconstituida. El procedimiento puede incluir además el ajuste de la viscosidad de la composición reconstituida. El procedimiento puede incluir además el ajuste de la viscosidad con un agente de adelgazamiento por cizallamiento. El agente de adelgazamiento por cizallamiento puede ser goma guar. El ajuste de la viscosidad se puede realizar con un agente espesante por cizallamiento. El agente espesante por cizallamiento puede ser dextrano. El procedimiento puede incluir además la adición de células a la composición reconstituida. Las células pueden ser células autólogas, alogénicas o xenogénicas.

El paquete comercial (que no forma parte de la invención reivindicada) puede incluir además uno o más de: (a) un disolvente; (b) una jeringa; (c) una aguja; y (d) una película delgada de PDMS. La película delgada de PDMS se puede usar como apósito, pero también se pueden incluir apósitos alternativos en el paquete comercial. El paquete comercial (que no forma parte de la invención reivindicada) puede incluir además una jeringa con una válvula mezcladora.

Las células pueden seleccionarse de uno o más de: adipocitos; células regenerativas adultas; células de Schwann; células parentales neuronales derivadas de la piel; DRC; y ASC.

Las composiciones descritas en la presente memoria descriptiva también se han evaluado frente a matrigel en un modelo de ratón con heridas que no cicatrizan, y se ha encontrado que promueve la cicatrización de heridas más rápido que matrigel.

Determinadas realizaciones tienen hidrogeles de PVA al 0,4%-1,2% p/vol de la composición final. Determinadas realizaciones tienen hidrogeles de PVA al 0,8%-1,0% p/vol de la composición final en las que se usa el copolímero en bloque PVA-PEG. Otras realizaciones tienen hidrogeles de PVA al 0,4%-0,6% p/vol de la composición final que, por casualidad, mostraron que era posible una solución viscosa que gelificaría a una temperatura inferior a 37 °C. Además, esta concentración era más adecuada para mantener células viables.

Además, se demostró que las realizaciones en las que el PVA (pH 7,0) PVA era del 10% (p/v) y comprende una mezcla (50/50) de PVA de alto peso molecular (125 kD - 200 kD) que está hidrolizado en un 99% y PVA de peso molecular promedio (40 kD-100 kD) que está hidrolizado solo en un 88% (“% hidrolizado” se refiere al porcentaje de grupos acetato hidrolizados en alcoholes) (10% HMW/MMW 50/5099% hid/88%) se prefirió en determinadas realizaciones.

Determinadas realizaciones tienen hidrogeles de alcohol polivinílico (PVA) y variantes de los mismos (por ejemplo, alcohol polivinílico tiolado; se encontró que los polímeros en bloque de alcohol polivinílico que contienen polietilenglicol (PVA-PEG); o un copolímero del mismo) se beneficiaron del uso de borato de sodio decahidratado como el agente de reticulación biocompatible de molécula pequeña del hidrogel. Se puede utilizar una concentración de borato de sodio decahidratado (pH 8) entre 0,02% (p/v) y 0,0001% (p/v) de la composición final. Además, se encontró fortuitamente que una concentración de borato de sodio decahidratado (pH 8) entre 0,01% (p/v) y 0,0001% (p/v) de la composición final proporcionaba un gel más estable que los geles de PVA con concentraciones más altas de borato. Algunos geles, con concentraciones de borato superiores al 0,03%, cuando el contenido de PVA es relativamente alto pueden gelificarse prematuramente, los intervalos óptimos (es decir, 0,02% (p/v)-0,0001% (p/v) de la composición final) facilitan la manipulación del gel durante la fabricación (por ejemplo, proporcionarían una mezcla más uniforme). En experimentos con los hidrogeles de PVA, se observó que la adición de PVA y la mezcla en el andamio de colágeno-glicosaminoglicano antes de añadir borato es favorable, ya que produce una formación de hidrogel similar a la interpenetración que luego se compleja o reticula con borato en y alrededor del colágeno (o por observación, una mezcla de colágeno más viscosa y homogénea).

Se descubrió fortuitamente que la adición de uno o más agentes de reticulación después de la fabricación de la matriz de colágeno-GAG-hidrogel agregaba propiedades adhesivas a la matriz de gel. En particular, se ha encontrado que la adición de Genepina (3,5-5,0 μM) y/o transglutaminasa (1-3U) es útil a este respecto.

Algunas realizaciones se basan además en el descubrimiento fortuito de que las composiciones descritas en la presente memoria descriptiva pueden liofilizarse adicionalmente después de la formación de la matriz. Se descubrió que la composición liofilizada podía además pulverizarse. Sorprendentemente, se encontró que las composiciones en polvo liofilizadas tienen una estabilidad mejorada, lo que tiene beneficios para la facilidad de uso y empaquetado. Además, la composición liofilizada en polvo no solo podría reconstituirse con agua, sino también con la sangre entera, el suero o el plasma de un paciente antes de su uso en la cicatrización de heridas, etc. Afortunadamente, la composición liofilizada en polvo una vez reconstituida todavía formaba geles usando agua, sangre entera, suero y plasma. Además, el uso de sangre o componentes sanguíneos puede proporcionar un disolvente rico en nutrientes para beneficiar el proceso de cicatrización de heridas.

En la presente memoria descriptiva se proporcionan nuevos sistemas multicomponente de sustitución de tejidos, que incluyen composiciones y procedimientos de uso, cuyas realizaciones tienen ventajas sobre los productos disponibles para el cuidado de heridas.

En determinados aspectos, se proporciona una composición de sustitución de tejidos diseñada que comprende colágeno, glicosaminoglicano, un hidrogel y uno o más agentes de reticulación de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas. En determinadas realizaciones, la composición de sustitución de tejidos diseñada comprende una mezcla de colágeno tipo I, glicosaminoglicano sulfatado, hidrogeles de borato de alcohol polivinílico, glicerol y ácido ascórbico. En determinadas realizaciones, el glicosaminoglicano es ácido hialurónico. En determinadas realizaciones, el hidrogel es alcohol polivinílico, acetato de polivinilo, alcohol polivinílico tiolado o un copolímero de los mismos. En determinadas realizaciones, uno o más agentes de reticulación se seleccionan de los siguientes: glutaraldehído, EDC:NHS, borato. En determinadas realizaciones, la composición existe en forma seca. En otras realizaciones, la composición existe en forma polimerizada. En otras realizaciones, la composición además comprende un disolvente de modo que la composición existe principalmente en forma líquida, sin polimerizar. En determinadas realizaciones, la forma líquida se puede transformar en una forma polimerizada calentando la composición. En determinadas realizaciones, la forma seca se puede reconstituir mediante la adición de un disolvente adecuado. El disolvente adecuado puede ser un fluido fisiológico, por ejemplo, sangre, suero, plasma y similares, o el disolvente adecuado puede ser un fluido no fisiológico, por ejemplo, agua.

En determinados aspectos, se proporciona una composición para su uso en un procedimiento de tratamiento de una herida en un sujeto que requiere tal tratamiento, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto la composición de sustitución de tejidos diseñada descrita en la presente memoria descriptiva. En determinadas realizaciones, la herida puede ser el resultado de, pero no se limita a, lesión, quemaduras, procedimientos quirúrgicos, infección y úlceras.

En determinados aspectos, se proporciona un procedimiento de preparación de una composición de sustitución de tejidos diseñada, que comprende mezclar colágeno, glicosaminoglicano, un hidrogel y uno o más agentes de reticulación en un disolvente adecuado, de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas. En determinadas realizaciones, la composición mezclada permanecerá en forma no polimerizada hasta que se caliente por encima de la temperatura ambiente. Posteriormente, la composición se liofiliza y se pulveriza para eliminar el disolvente, lo que permite la preparación de una forma seca. La composición puede reconstituirse posteriormente de nuevo en forma líquida, utilizando un disolvente adecuado tal como un fluido fisiológico o agua. En determinadas realizaciones: 1) el colágeno y el glicosaminoglicano se mezclan primero con uno o más agentes de reticulación para permitir algo de reticulación entre estos componentes; 2) los polímeros de hidrogel se añaden al colágenoglicosaminoglicano y luego se mezclan con uno o más agentes de reticulación, como borato, para permitir algo de reticulación de estos componentes; y 3) las mezclas de la etapa 1) y 2) se mezclan en un disolvente adecuado. A continuación, la composición se puede polimerizar mediante calentamiento.

Descripción de los dibujos

La FIGURA 1 muestra un diagrama de flujo del proceso para la fabricación del andamio de colágeno reconstituible, en el que las etapas 1 a 8 describen el proceso mediante el cual se puede fabricar el andamio, liofilizarlo, luego reconstituirlo con agua u otro medio acuoso y aplicarlo fácilmente al lecho de una herida o a un recipiente de cultivo celular.

La FIGURA 2 muestra gráficos del efecto de la concentración del agente de reticulación en la cinética de formación de fibrillas y la turbidez, en la que las soluciones de colágeno (3 mg/ml) se fabricaron en ausencia (Col) o en presencia de agente de reticulación de glutaraldehído y las soluciones de colágeno se mantuvieron en hielo hasta que se colocaron en un espectrofotómetro TECAN™ a 37 °C para medir la turbidez como indicador de la formación de fibrillas (gelificación) a 313 nm, con el Panel (A) representando los perfiles cinéticos de formación de fibrillas de colágeno de tres condiciones descritas en la TABLA 1 y el Panel (B) representan una tercera condición con colágeno solo como control (col), en la que la concentración de glutaraldehído es la misma que C1 en el panel A (0,002% en peso) y el tiempo de incubación es proporcional al volumen de reacción y la solución “60min Voleq” tiene una concentración de colágeno de reacción de 1,5 mg/ml, mientras que las otras dos soluciones contienen 3 mg/ml de colágeno. La FIGURA 3 muestra un diagrama de Arrhenius para la fibrilación de colágeno en función de la concentración de hidrogel de borato de PVA, en el que se prepararon variantes de andamio de colágeno no reticulado como se describe en los materiales y procedimientos, que contenían 0-1,0% p/v de alcohol polivinílico (PVA) (50% en peso, 99% hidrolizado y 50% en peso, 88% hidrolizado). Usando la Ecuación (Nemeth y Martin, 1988) se observa una reducción en la energía de activación para la fibrilogénesis de colágeno a 313 nm a medida que aumenta la concentración de PVA.

La FIGURA 4 muestra gráficos del efecto de las variantes de PVA en la fibrilogénesis de colágeno antes y después de la liofilización/reconstitución, en la que las soluciones de colágeno de (3 mg/ml) solas (col) o reticuladas y combinadas con hidrogeles o tensioactivos de la siguiente manera: (xcol) reticulada sin ningún aditivo, (50/50) 50% de PVA88/ 50% de PVA99, (K99) 50% de Kollicoat™ / 50% de PVA99, (K88) 50% de Kollicoat™/ 50% de PVA88, (tritonx100) TritonX-100™, (tw80) Tween 80™, en la que el Panel (A) representa el cambio en t1/2 max para la fibrilogénesis de colágeno con la adición de agente de reticulación, tensioactivo y combinación de hidrogel de PVA y el Panel (B) representa la fibrilogénesis de liofilizado y soluciones de colágeno reconstituidas emparejadas con el Panel (A) y que denotan los cambios en t1/2 max, con la excepción de k99, k88 y 50/50.

La FIGURA 5 muestra gráficos de barras que cuantifican la cinética de gelificación de la solución de colágeno y las propiedades mecánicas antes y después de la liofilización (secado por congelación), en la que el Panel (A) muestra la cuantificación del tiempo de gelificación del andamio (fibrilación) como lo indica t1/2max, en la que los andamios se prepararon como se describe en materiales y procedimientos y el Panel (B) muestra la resistencia mecánica uniaxial (módulo de Young, E) de las variantes de andamio (barra agrupada con (*) denota una significación estadística de p<0,001 y (**) p<0,05).

La FIGURA 6 muestra las mediciones del ángulo de contacto de películas de colágeno gelificadas secas, investigándose el efecto del aditivo sobre la hidrofilicidad/hidrofobicidad de la superficie (humectabilidad de la superficie) a través de cálculos del ángulo de contacto. Las variantes se prepararon como se describe en los materiales y procedimientos. El Panel (A) muestra imágenes de microfotografía de una sola gota de agua en la superficie del andamio de colágeno y el Panel (B) muestra un gráfico de barras de los ángulos de contacto calculados para las variantes del andamio, en el que se encontró la significación estadística de p<0,05 entre todos los tratamientos, con la excepción de K88, K99, TritonX100 como se indica con la barra “b”. Se observó significación estadística entre el grupo “b” y todos los demás tratamientos.

La FIGURA 7 muestra la viabilidad celular y la migración celular por variantes de andamios de colágeno, con el Panel (A) que muestra un gráfico de barras de la viabilidad de los fibroblastos primarios cultivados en variantes de andamios de colágeno después de 24 horas, en el que se utilizaron proporciones vivas/muertas para calcular el porcentaje de células viables, utilizando etanol al 70% como control muerto y el Panel (B) que muestra un gráfico de barras de la migración celular, en la que se hicieron punzones de 4 mm en andamios y luego se rellenaron con una variante de andamio acelular, por lo que las células se contaron a medida que migraban del andamio antiguo al nuevo durante un período de diez días (los números de células representan el número total de células contadas por variante de andamio en el punto de tiempo indicado).

La FIGURA 8 muestra la morfología de los fibroblastos y la arquitectura del andamio de colágeno en variantes, en las que se escanean micrografías electrónicas de variantes de andamio de colágeno liofilizado: colágeno (col), andamio de colágeno reticulado (xcol) sin aditivos, andamio de colágeno reticulado (Tw80) con aditivo Tween 80™ y andamio de colágeno reticulado (K99) con aditivos Kollicoat™/PVA99 (barra de escala del panel izquierdo: 100 μm y barra de escala del panel derecho: 20 μm).

La FIGURA 9 muestra los resultados postquirúrgicos del día 10 del andamio biohíbrido aplicado en heridas de ratón que no cicatrizan (entablilladas), en la que se reconstituyó un andamio biohíbrido acelular y se aplicó a la herida superior y la herida inferior se dejó sin tratar. Todas las heridas se cubrieron con apósitos oclusivos a base de silicona y la apariencia clínica de reepitelización en las heridas tratadas con biohíbrido, mientras que las heridas no tratadas permanecen sin cicatrizar con costra. Los paneles superior e inferior de la derecha muestran evidencia histológica de formación neoepidérmica completa y remanencia de tejido de granulación en las heridas tratadas con biohíbrido, en comparación con la patología crónica de la herida observada en las heridas no tratadas (falta de epidermis e hiperplasia de masteosis pseudoepitelial).

La FIGURA 10 muestra en el Panel (A) la aplicación de una composición rociada del andamio reconstituido sobre una herida de espesor parcial en piel de cerdo, en la que el andamio forma un andamio de gel de capa delgada después del rociado y en el Panel (B) un gráfico de barras de la viabilidad de las células primarias de la piel después del rociado en comparación con las células sembradas en la superficie de cultivo que no muestran diferencias en la viabilidad.

Descripción detallada

Se entenderá que cualquier término no definido específicamente en la presente memoria descriptiva tiene los significados comúnmente asociados con ellos como se entiende dentro de la técnica de la invención.

Definiciones

El término “colágeno”, como se usa en la presente memoria descriptiva, es una proteína estructural que se encuentra comúnmente en tejidos animales fibrosos y abarca principalmente colágenos fibrilares (por ejemplo, Tipo I, II, III, V, XI), pero también puede incluir colágenos no fibrilares, es decir, Tipo IV, VI, VII, VIII, IX, X, IX, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII y XIX. El más comúnmente usado en la presente memoria descriptiva fue Colágeno Tipo I.

El término “glicosaminoglicano” (GAG), como se usa en la presente memoria descriptiva, pretende abarcar glicosaminoglicano sulfatado. Por ejemplo, sulfato de condroitina; sulfato de dermatán, sulfato de queratán, sulfato de heparán, heparina. Los miembros de la familia de los glicosaminoglicanos varían en el tipo de unidad de hexosamina, hexosa o ácido hexurónico que contienen (por ejemplo, ácido glucurónico, ácido idurónico, galactosa, galactosamina, glucosamina) y también varían en la geometría del enlace glicosídico.

El término “agente de reticulación biocompatible de molécula pequeña de colágeno y glicosaminoglicano” pretende abarcar cualquier agente de reticulación adecuado de colágeno y glicosaminoglicano. Por ejemplo, puede incluir uno o más de: glutaraldehído, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC), EDC (1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida):NHS (N-hidroxisuccinimida), EDC (1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida):sulfo-NHS (N-hidroxisulfoxuccinimida)], hexametileno diisocianato y Genipina.

El término “agente de reticulación de colágeno y glicosaminoglicano de molécula no pequeña” pretende abarcar cualquier agente de reticulación de colágeno y glicosaminoglicano de molécula no pequeña adecuado. Por ejemplo, tratamiento dehidrotermal (DHT), irradiación ultravioleta (UV) y reticulación enzimática (por ejemplo, Transglutaminasa). Las técnicas químicas utilizadas para la reticulación del colágeno-glicosaminoglicano son diversas. El uso de aldehídos como el formaldehído y el glutaraldehído está bien caracterizado. El glutaraldehído es el procedimiento químico más utilizado para reticular biomateriales a base de colágeno. Alternativamente, también se pueden usar miembros de la familia de las carbodiimidas para mejorar la resistencia mecánica y enzimática de un andamio de colágeno. Además, estos productos químicos también se pueden usar para reticular el colágeno con alguna nanoestructura de oro o en combinación con epoxi. Los isocianatos, por ejemplo, el hexametilendiisocianato, son conocidos por reticular andamios de colágeno. El Parche Reparador de Colágeno Zimmer™ disponible en el mercado utiliza una técnica patentada de reticulación de isocianato. Genipina, un agente de reticulación químico derivado de una fuente vegetal y se puede usar opcionalmente en lugar de o además del glutaraldehído en las presentes composiciones.

Además, los agentes de reticulación enzimáticos como la transglutaminasa se pueden utilizar para mejorar la resistencia a la tracción y la resistencia enzimática de las matrices a base de colágeno. El término “dextrano”, como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a un glucano ramificado complejo (es decir, un polisacárido formado por muchas moléculas de glucosa) y puede estar compuesto por cadenas de longitud variable (de 3 a 2000 kilodaltons) que sirve para estabilizar la reacción de reticulación del glutaraldehído (especialmente los pesos moleculares más altos), como un azúcar no reducible que también puede proporcionar equilibrio osmótico. Dependiendo de los componentes de la reacción y las condiciones de la reacción, con la falta de dextrano, el glutaraldehído puede reaccionar mucho más rápido de lo deseado. Después del uso de dextrano, pueden quedar trazas en la composición. Una mezcla típica de glutaraldehído y dextrano puede ser de 6 ml de glutaraldehído (25%) y 94 ml de dextrano (20%).

El término “hidrogel”, como se usa en la presente memoria descriptiva, pretende abarcar un hidrogel formado por polímeros de alcohol polivinílico, acetato de polivinilo, alcohol polivinílico tiolado, polímeros en bloque de alcohol polivinílico que contienen polietilenglicol (PVA-PEG), o un copolímero del mismo, que también incluye variantes de copolímeros y formas parcialmente modificadas (p. ej., PVacetato, PVP y tiolado). En determinadas realizaciones como “alcohol polivinílico, acetato de polivinilo, alcohol polivinílico tiolado o un copolímero de los mismos.

El término “hidrogel de borato de alcohol polivinílico”, como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a un hidrogel de PVA en el que se usa borato para reticular los polímeros de PVA.

El término “PVA 10% HMW/MMW 50/50 99% hid/88%” como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a una solución de PVA que es 10% (p/v) y comprende una mezcla (50/50) de PVA de alto peso molecular (125 kD - 200 kD) que es 99% hidrolizado y PvA de peso molecular promedio (40 kD -100 kD) que es solo 88% hidrolizado. (“% hidrolizado” se refiere al porcentaje de grupos acetato hidrolizados en alcoholes)

El término “agente de reticulación biocompatible de molécula pequeña del hidrogel” o “agente de reticulación de hidrogel biocompatible de molécula pequeña” pretende abarcar cualquier molécula pequeña adecuada que sea capaz de unir los polímeros de hidrogel entre sí. Por ejemplo, para un hidrogel de PVA, es preferible el decahidrato de borato de sodio u otra fuente de borato. Como alternativa al borato, se puede usar otro catión divalente.

El término “liofilizado”, “liofilización” pretende abarcar una criodesecación, que es un proceso de deshidratación en el que el artículo que se liofiliza se seca por congelación. Hay esencialmente tres categorías de liofilizadores: el liofilizador múltiple, el liofilizador rotativo y el liofilizador estilo bandeja.

El término “reconstitución” o “reconstituido” como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a la adición de un disolvente adecuado a la composición liofilizada o a la composición en polvo liofilizada. El disolvente puede seleccionarse entre agua, sangre, suero, plasma, medios (por ejemplo, medios celulares) o un tampón adecuado. El fluido fisiológico (por ejemplo, sangre, suero o plasma) se puede tomar del sujeto al que se administra la composición para mejorar la compatibilidad. El disolvente puede incluir opcionalmente uno o más componentes adicionales, como nutrientes, factores de crecimiento, fármacos, células, etc. Un peso de reconstitución adecuado puede estar entre 70 mg/ml y 110 mg/ml de polvo o composición liofilizada.

El término “andamio biohíbrido”, como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a la composición, composición reconstituida o composición en polvo reconstituida en forma de gel. El andamio biohíbrido puede incluir opcionalmente uno o más componentes adicionales, como nutrientes, factores de crecimiento, fármacos, células, etc., según sea necesario para la aplicación particular.

El término “herida”, como se usa en la presente memoria descriptiva, abarca rupturas en la piel, quemaduras, procedimientos quirúrgicos, infección, úlceras (por ejemplo, úlceras por presión o úlceras diabéticas). Las composiciones descritas en la presente memoria descriptiva son adecuadas para la curación de heridas, incluidas las heridas crónicas, en las que el andamio se puede preparar al lado de la cama. Además, las composiciones descritas en la presente memoria descriptiva se pueden usar como material de relleno de las fenestraciones en un injerto de piel en malla. Los experimentos realizados por los inventores muestran una mejora en la tasa de curación y el resultado de la curación. Las composiciones descritas en la presente memoria descriptiva se pueden usar en aplicaciones de impresión 3D.

Una estrategia para la reparación y regeneración de tejidos es el uso de andamios biomiméticos que fomentan el crecimiento y desarrollo de un tejido para restaurar su arquitectura normal. Con o sin células, la gelificación de matrices extracelulares puede mejorar el trasplante de células y otros procedimientos quirúrgicos. Como se describe en la presente memoria descriptiva, la formación de un sistema multicomponente de sustitución de tejidos puede incluir la composición descrita en la presente memoria descriptiva. En determinadas realizaciones, el sistema de sustitución de tejidos puede formarse in situ y, en determinadas realizaciones, es inyectable. En otras realizaciones, el sistema de sustitución de tejidos puede formarse parcial o completamente ex vivo antes de la aplicación. En determinadas realizaciones, el sistema de sustitución de tejidos comprende una composición seca que puede reconstituirse in situ o ex vivo.

El componente principal del sistema de sustitución de tejidos es un andamio biohíbrido. El sistema de sustitución de tejidos puede incluir opcionalmente componentes adicionales, como nutrientes, factores de crecimiento o fármacos. El sistema también puede comprender opcionalmente células que expresan indoleamina 2,3 dioxigenasa (IDO) para trasplante celular. El sistema de sustitución de tejidos descrito en la presente memoria descriptiva puede ser útil para el tratamiento de heridas cutáneas (crónicas y agudas), pero también puede ser relevante para su uso en otras áreas de la ingeniería de tejidos y el trasplante de células.

Las composiciones tal como se describen en la presente memoria descriptiva pueden comprender un componente de matriz que se prepara combinando una matriz de colágeno-glicosaminoglicano reticulada con un sistema de hidrogel sintético. La matriz se puede almacenar como un polvo liofilizado. Cuando se hidrata, la red polimérica interpenetrante solubilizada que resulta forma un andamio de gel cuando se calienta, debido en parte a la rápida formación de fibrillas y la extensa formación de enlaces de hidrógeno. Una vez formados, los andamios biohíbridos asumen de manera natural una arquitectura similar a la de la dermis nativa que es capaz de mitigar la contractura celular, la degradación enzimática y la proliferación celular. En determinadas realizaciones, la composición puede estar presente en forma de polvo seco. La composición de polvo seco puede solubilizarse y, por lo tanto, reconstituirse con un fluido fisiológico, por ejemplo, sangre entera, suero o plasma, en un esfuerzo por crear un entorno enriquecido en factor de crecimiento. Alternativamente, la composición de polvo seco se puede reconstituir con otros disolventes adecuados, como agua destilada. En determinadas realizaciones, la composición de polvo seco se reconstituye in situ. En otras realizaciones, la composición de polvo seco se reconstituye ex vivo. En otras realizaciones, la composición de polvo seco se reconstituye in vitro, por ejemplo, en un tubo u otro recipiente. En varias realizaciones, la composición puede estar presente en una forma no seca, por ejemplo, como un fluido solubilizado o como un gel parcial o completamente polimerizado.

Físicamente, los sistemas sustitutos de tejido descritos en la presente solicitud, comprenden composiciones descritas en la presente memoria descriptiva, que son térmicamente más estables que los simples geles inyectables de colágeno reticulado, con mayor resistencia mecánica. Esto es evidente por la calorimetría diferencial de barrido, que demuestra que los polímeros dentro de la red de hidrogel mejoran la estabilidad térmica de los haces de colágeno. Los polímeros en el hidrogel son anfipáticos y, por lo tanto, pueden formar complejos, como lo haría un tensioactivo, con el colágeno que contiene, que mejoran la estabilidad. Cuando se combinan con células que expresan la enzima IDO, los andamios dérmicos celulares se pueden fabricar in situ en minutos, lo que es significativamente ventajoso sobre los sistemas sustitutos dérmicos existentes.

En determinadas realizaciones, la composición descrita en la presente memoria descriptiva puede comprender los siguientes componentes: colágeno, glicosaminoglicano, un hidrogel y uno o más agentes de reticulación. En determinadas realizaciones, el colágeno comprende colágeno de Tipo I que está presente en una concentración de entre 3,0 y 10,0 mg/ml. En otras realizaciones, el colágeno además comprende otros tipos de colágeno (pero no limitados a) Tipo II, II, IV, V, y están presentes en una concentración final entre 0,5 y 4,0 mg/ml. En determinadas realizaciones, el glicosaminoglicano está presente en una relación de 1:6 p/p de glicosaminoglicano:colágeno. En determinadas realizaciones, el glicosaminoglicano es sulfato de condroitina en una relación de 1:6 del peso del colágeno, pero también puede emplear sulfato de dermatina en una relación de 1:6 o ácido hialurónico al 0,5-1% p/vol (concentración final). En determinadas realizaciones, el hidrogel es alcohol polivinílico (PVA), acetato de polivinilo, alcohol polivinílico-copolietilenglicol, alcohol polivinílico tiolado o cualquier otro copolímero de los mismos. En determinadas realizaciones, el hidrogel está presente en una concentración de 0,1-1% p/v de la composición final. En determinadas realizaciones, el hidrogel además comprende ascorbato en una concentración de 50-150 μM y/o glicerol en una concentración de 0,01-0,1% p/v de la composición final. En determinadas realizaciones, uno o más agentes de reticulación comprenden glutaraldehído y/o etil(dimetilaminopropil)-carbodiimida:N-hidroxisuccinimida (EDC:NHS) específicamente en una solución de dextrano de alto peso molecular (pH 7,5-8), que es adecuada para reticular colágeno. En otras realizaciones, uno o más agentes de reticulación comprenden borato de sodio a una concentración de 0,1-1% p/v de la composición final, preferentemente a 1:4 p/p del poliol, que es adecuado para reticular hidrogel.

Como se describió anteriormente, las composiciones descritas en la presente memoria descriptiva incluyen realizaciones en las que los diferentes componentes de la composición se mezclan como componentes secos o liofilizados de tal manera que los componentes existen en forma no polimerizada. En otras realizaciones, la composición existe en forma polimerizada. La forma polimerizada de la composición se puede crear mezclando soluciones líquidas que contienen componentes individuales, con la reacción química resultante creando la composición polimerizada. En otras realizaciones, la forma polimerizada de la composición de andamio biohíbrido puede crearse mediante la reconstitución de la composición seca o liofilizada, en la que la solubilización de la composición seca que comprende colágeno, glicosaminoglicano, hidrogel y uno o más componentes agentes de reticulación provoca la formación de la forma polimerizada de la composición, produciéndose dicha polimerización como resultado de la reticulación del colágeno, glicosaminoglicano y componentes de hidrogel provocada por uno o más agentes de reticulación presentes en la composición. El uno o más agentes de reticulación facilitan la reticulación (o polimerización) de los componentes de colágeno, glicosaminoglicano e hidrogel al entrar en contacto con una cantidad suficiente de un disolvente adecuado, por ejemplo, un fluido fisiológico, agua u otro disolvente adecuado.

En determinadas realizaciones, la composición se proporciona en una forma parcialmente reticulada, en la que el colágeno y el glicosaminoglicano se reticulan previamente utilizando un agente de reticulación adecuado como glutaraldehído y/o EDC:NHS, y el hidrogel se reticula previamente utilizando un agente de reticulación adecuado como borato de sodio. En esta forma parcialmente reticulada, en la que no hay una reticulación significativa del componente colágeno:glicosaminoglicano con el componente hidrogel, la composición permanece en una forma viscosa, esencialmente líquida, adecuada para su aplicación, por ejemplo, en una herida. El calentamiento de la composición permitirá entonces una reticulación adicional (o polimerización) entre el componente de colágeno:glicosaminoglicano y el componente de hidrogel, catalizada por uno o más reactivos de reticulación, y la composición adoptará un gel más sólido.

En determinadas realizaciones, la composición se prepara mezclando componentes poliméricos no reticulados, colágeno, glicosaminoglicano y polioles dentro de una composición tampón concentrada 10* de 1/3 de HEPES, 1/3 de PBS y 1/3 de DMEM o una variación del mismo fluido de reanimación enriquecido con vitaminas, nutrientes, glucosa y minerales. Siguiendo todos los procedimientos de reticulación, y antes de la liofilización, se agrega ácido ascórbico a la mezcla en el intervalo de 1-1000 μM.

En determinadas realizaciones, la composición está presente en forma seca y comprende componentes liofilizados en cantidades suficientes para permitir que la composición polimerizada reconstituida tenga cualidades deseables específicas, tras la adición de una cantidad suficiente de un disolvente adecuado. En otras realizaciones, la composición está presente en forma polimerizada que exhibe ciertas propiedades físicas ventajosas. En determinadas realizaciones, la composición reconstituida o polimerizada puede ser resistente a la degradación enzimática por colagenasa. En determinadas realizaciones, la composición reconstituida o polimerizada puede presentar una resistencia a la tracción de 0,2-2,0 MPa, más comúnmente de 1,45-2,0. En determinadas realizaciones, la composición seca puede formar fibras de colágeno dentro de los 13 a 16 minutos posteriores a la adición de una cantidad suficiente de un disolvente adecuado. En determinadas realizaciones, la composición reconstituida o polimerizada es capaz de regular la proliferación celular, promover la proliferación celular lineal y resistir la contracción de la matriz mediada por células.

Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, “forma seca” significa esencialmente libre de disolvente, de modo que no hay suficiente disolvente presente en la composición para provocar la reticulación química de los componentes individuales. Se entiende que la forma seca de la composición aún puede contener cantidades diminutas o trazas de disolvente, sin embargo, estas cantidades son lo suficientemente pequeñas como para que no produzcan una cantidad significativa de reticulación química de la composición. Los componentes individuales pueden mezclarse y luego la composición mezclada puede secarse, o alternativamente, los componentes individuales pueden secarse primero y luego mezclarse. El secado se puede realizar por cualquier número de medios conocidos en la técnica, por ejemplo, liofilización, secado por congelación y similares. En determinadas realizaciones, la forma seca de la composición biohíbrida logrará la gelificación tras la adición de cantidades suficientes de un disolvente adecuado, cuando se exponga a temperaturas entre 25 y 40 °C, preferentemente entre 25 y 37 °C, más preferentemente entre 30 y 37 °C y lo más preferentemente a 37 °C.

En diversas realizaciones, el sistema de sustitución de tejidos diseñados puede incluir la composición descrita en la presente memoria descriptiva y puede ser útil para el tratamiento de heridas en un sujeto que requiera dicho tratamiento. Una herida que puede estar presente en un sujeto puede derivar de una variedad de causas, que incluyen, pero no se limitan a lesión, quemaduras, procedimientos quirúrgicos, infección, úlceras por presión, úlceras diabéticas, trauma quirúrgico y no quirúrgico. El sistema de sustitución de tejidos diseñados descrito en la presente memoria descriptiva es ventajoso para dicho tratamiento porque puede administrarse como un líquido viscoso, lo que permite que la composición cubra y rellene los contornos complejos e irregulares de la herida, después de lo cual puede convertirse en un gel sólido continuo. Las composiciones se pueden administrar por inyección, por ejemplo, usando una jeringa. En otras realizaciones, las composiciones pueden administrarse en forma de polvo seco y reconstituirse in situ, lo que permite la formación rápida de andamios dérmicos celulares en cuestión de minutos. El polvo se puede solubilizar con sangre entera, suero o plasma de un paciente en un esfuerzo por crear un entorno enriquecido con factor de crecimiento o simplemente se puede mezclar con agua destilada. Una vez formados, estos andamios asumen naturalmente una arquitectura que es similar a la de la dermis nativa y permiten la migración de células, proteínas de la matriz y otros factores importantes a la arquitectura del andamio para facilitar una mejor cicatrización.

Cuando el tiempo apremia, el beneficio de un sustituto de piel listo para el paciente puede aprovecharse por completo. El sistema de sustitución de tejidos diseñados que comprende una composición como se describe en la presente memoria descriptiva puede fabricarse con o sin células al lado de la cama y usarse para llenar el lecho de una herida e integrarse completamente con la superficie de la herida. La estabilidad de la forma de polvo liofilizado de la composición es superior a los materiales hidratados existentes, como hidrogeles y sustitutos celulares de la piel, y la capacidad de reconstituir el polvo en un andamio que puede amoldarse al sitio de la herida (con o sin células) confiere una mayor utilidad sobre los sustitutos de la piel disponibles en el mercado.

Procedimientos de preparación de la composición

(A) Procedimiento de 9 etapas

1) Reticulación de colágeno y condroitina-6-sulfato a pH casi neutro.

2) Adición de hidrogel polimérico a base de alcohol polivinílico.

3) Adición de borato y ácido ascórbico.

4) Congelación de la combinación anterior de las etapas 1-3.

5) Secado por congelación/liofilización.

6) Triturar el producto liofilizado seco hasta obtener un polvo.

7) Resuspender el polvo en disolvente acuoso, biológico o no biológico.

8) Opcionalmente, ajustar la viscosidad con un agente biológicamente inerte, como un agente de adelgazamiento por cizallamiento, como la goma guar o un espesante por cizallamiento, como el agente dextrano.

9) Opcionalmente combinar el polvo resuspendido en células autólogas, alogénicas o xenogénicas.

(B) Procedimiento alternativo de preparación de la composición de colágeno

Condiciones Finales de Almacenamiento de líquido: 4 °C y minimizar la exposición a la luz.

Como un polvo: Recipiente hermético, 22 °C y minimizar la exposición a la luz.

Materiales:

Puntas: P1000, P200, P10

Tijeras

Tubos TC

Tubos de microcentrífuga de 1,7 ml

ddH₂O

Tampón de colágeno 10*

Glutaraldehído al 50% (-20 °C)

NaOH 1N (filtrado estéril)

Sulfato de condroitina al 20%

Colágeno (6 mg/ml o superior -Advanced Biomatrix)

Dextrano al 20%

Glicina al 20%

PVA al 5% y 10%

Solución de borato al 0,2% p/p

Ascorbato 10mM

1* DMEM (medios completos)

Preparación de reactivos:

Tampón de colágeno 10*

10 ml de 10* DMEM (pH 7,5)

10 ml de 10* HEPES (pH 7,5)

9 ml de 10* PBS (pH 7,0)

1 ml de antibiótico/antifúngico

Sulfato de condroitina al 20%

1 g de sulfato de condroitina (cartílago de tiburón - SIGMA™)

5 ml de 1* PBS

Agitar en vórtice repetidamente y calentar a 37 °C para ayudar a la disolución. Filtrar si es posible utilizando un filtro de 0,4 |jm.

Dextrano al 20%

1 g de dextrano (SIGMA™)

5ml de 1*DMEM (sin FBS y antibiótico)

Glicina al 20%

4 g de glicina

20 ml de 1* DMEM sin FBS y antibiótico

Ajustar el pH a 7,5 y almacenarlo a temperatura ambiente.

PVA-99 al 10%

5g de PVA-88% LMW hidrolizado/ 5g PVA-99% HMW hidrolizado

100ml de ddH2O

1. Caliente el agua a 80 °C con una mezcladora de techo.

2. Agregue lentamente el HMW 99% hasta que se disuelva.

3. Agregue lentamente el LMW 88% hasta que se disuelva.

Kollicoat™ IR al 15%

15g de Kollicoat™ IR / 100ml de ddH2O

1. Caliente el agua a 80 °C con una mezcladora de techo.

2. Agregue lentamente Kollicoat™ IR y mezcle hasta que se disuelva.

Mezcle PVA al 10% con Kollicoat™ al 15% en partes iguales (50 ml/50 ml) y luego agregue 2 ml de glicerol. Diluya a la solución de trabajo (5%) usando tampón de colágeno 10*.

Borato 25 mM (borato al 0,2% p/p)

1. Pesar 200 mg de tetraborohidrato de sodio “borato”

2. Agregue borato a 10ml de 1* DMEM (sin suplementos)

3. Mezcle bien. El pH debe estar entre 8-9.

4. Diluir 1:10 para una concentración de trabajo de 6,25 mM (o 25 mM de borato)

5. Almacenar a 4 °C y preparar de nuevo si se presenta precipitado.

Ácido ascórbico 10 mM en agua destilada/desionizada (hacer un filtro recién esterilizado)

Volumen total Volumen total 5,0000

Colágeno 9,9mg/ml (vol total * 3) - 9,9 1,5152

Tampón 10x vol total - 10 0,5000

NaOH 1N col * 0,01 0,0152

GAG al 20% ((col*9) *5 ) - 200 0,3409

Glut al 1,5% 0,0002 * vol total - 0,015 0,0667

Glicina al 20% 5 * glut 0,3333

PVA al 5% (vol total * 0,006) - 0,05 0,6000

Ascorbato 10mM (0,0001 * vol total) - 0,01 0,0500

Borato 0,5mM (vol total * 0,0005) - 0,02 0,1250

Volúmen de Células vol total-(vol rxn) 1,4538

Volúmen vacío (%) 29%

Procedimiento

1. Prepare un vaso de precipitados limpio (con etanol al 70%) de 250 ml con hielo en el BSC.

2. Coloque tubos de 2 a 15 ml en el hielo.

3. Use un p1000 y agregue colágeno a uno de los tubos. Cuando haya terminado, expulse la punta en el tubo vacío sobre hielo.

4. Con una punta p1000 limpia, agregue tampón de colágeno al colágeno.

5. Mezcle el tampón y el colágeno usando la punta de colágeno almacenada en hielo en el tubo de 15 ml. Antes de mezclar, expulse el colágeno restante y luego corte la punta de la punta para crear una punta de baja viscosidad.

6. Usando un p10, agregue NaOH 1N a la solución para neutralizar el colágeno a pH 6,8-7,5 (color melocotón). Agregue un máximo de solo 15 j l a la vez. Mezcle bien en el medio usando la punta cortada p1000.

7. Una vez neutralizado, agregue GAG (Condroitina-6-sulfato) usando una punta p1000. Deseche la punta después de su uso. Mezclar con la punta cortada p1000.

LUCES APAGADAS (EN LA OSCURIDAD)

8. Apague las luces. En un tubo de microcentrífuga añadir 94 j l de solución de dextrano.

9. Añadir 6 j l de glutaraldehído al tubo con dextrano. Invertir y agitar con los dedos una vez. Agregue rápidamente la solución de trabajo de glutaraldehído a la mezcla de colágeno. Mezclar bien (2 min aproximadamente) utilizando la punta de pipeta cortada. Evita las burbujas. El pH es importante. El pH de reticulación ideal es 7,5-8. (Nota: si es demasiado ácido, el glutatión no se reticulará).

10. Incubar en hielo en la oscuridad durante 22 min.

11. Después de 1 hora, agregue la solución de glicina y mezcle bien. Esto neutraliza el glutaraldehído. 12. Incube durante un mínimo de 1 hora en hielo o de noche a 4 °C en la oscuridad.

LUCES ENCENDIDAS

13. Agregue Ascorbato a Gel de Colágeno y mezcle bien.

14. Diluya PVA (10%) a una concentración de trabajo de 5% usando tampón de colágeno.

15. Agregue la solución de trabajo de PVA al gel de colágeno y mezcle bien (aproximadamente 1-2 minutos). Evite crear burbujas.

16. Agregue el tampón de borato al gel de colágeno y mezcle bien.

17. Almacene el gel de colágeno resultante (ahora la matriz de colágeno reticulada de hidrogel IPN completa) a 4 °C. (Consulte las condiciones de almacenamiento).

LIOFILIZACIÓN

18. Calcule el volumen real de la mezcla de reacción observando las marcas en el tubo de 15 ml. Pese el tubo. Registre las medicions (volumen y peso).

19. Coloque el tubo de lado en el congelador a -80 °C durante 12 horas.

20. Después de 12 horas, encienda el liofilizador (Ver manual).

21. Coloque los tubos en el liofilizador durante 36h/ 10ml de líquido.

22. Después de la liofilización, pese el polvo y calcule el volumen de reconstitución (promedio 60 - 70 mg/ml).

(C) Composición alternativa

Una composición alternativa puede tener entre 3 y 5 mg/ml de colágeno; una relación 6:1 de sulfato de condroitina (en 1x PBS): colágeno; Glutaraldehído (con adición posterior de glicina, en la que la glicina se agrega para neutralizar el glutaraldehído); 0,4%-0,6% en peso de PVA (pH 7,0) 10% HMW/MMW 50/50 99% hid/88%; 0,01% (p/v)- 0,0001% (p/v) borato de sodio decahidratado (pH 8); 100 μm ascorbato de sodio (pH 7,0); Genepina 3,5-5 μM (agente de reticulación de 2°); y 1-3 U de transglutaminasa (todas las concentraciones son para el producto final).

Efecto de la concentración de agente de reticulación, PVA y tiempo en la formación de fibrillas: para optimizar la formulación del gel con respecto a los cambios en la concentración de colágeno madre, se investigó el efecto tanto de la concentración de glutaraldehído como del tiempo de incubación de la reticulación sobre el cambio en la tasa de formación de fibrillas. En primer lugar, cuando un cambio en la concentración de glutaraldehído era proporcional a un cambio en la concentración de colágeno almacenado (en la que anteriormente se utilizaban 6 mg/ml; Hartwell et al., 2011), la reacción de reticulación daría como resultado la solidificación del gel en hielo. Como tal, se encontró que aumentar la concentración de en realidad disminuiría la tasa de gelificación, en lugar de aumentarla como podría predecirse (FIGURA 2A; condición C1). Además, las concentraciones más altas de agente de reticulación dieron como resultado una absorbancia inicial más alta a 313 nm. Este patrón continuó dentro de las muestras del mismo volumen de reacción, que contenían menos agente de reticulación de glutaraldehído (C2). El colágeno solo, sin agente de reticulación, exhibió la absorbancia inicial más baja y la absorbancia final más alta, junto con la formación de fibrillas más rápida, como se muestra en la FIGURA 2A. De nuevo, t1/2max disminuyó ligeramente con la duración de la incubación dentro de los grupos de reacción de volumen igualado (FIGURA 2A). Era evidente que una mayor concentración de glutaraldehído en la reacción también correspondía a una reducción en t1/2max que era proporcional al tiempo de incubación. Esta reducción en el tiempo de gelificación correspondería en última instancia tanto a una reducción en el tiempo de formulación como en el tiempo de solidificación del gel como mezcla de trabajo. Curiosamente, cuando se ajustó el tiempo de incubación para la concentración de reserva de colágeno utilizada en el recipiente de reacción (FIGURA 2B), se pudo controlar la cinética de la reacción. Este resultado demostró que la concentración final óptima de agente de reticulación es 0,02% p/v y que el tiempo de incubación de reticulación debe ajustarse en proporción a la concentración de reserva (concentración del recipiente de reacción) de colágeno.

El efecto de la adición de hidrogel de alcohol polivinílico a las mezclas de gel demostró un aumento en la tasa de formación de fibrillas cuando la concentración de PVA aumenta de 0 a 1,0% p/v, lo que corresponde a una reducción significativa en la energía de activación (FIGURA 3). Como se muestra en la TABLA 3, la adición de 1% p/v de PVA resultó en una reducción de más del 50% en la energía de activación requerida para la formación de fibrillas.

TABLA 3. Efecto de los geles de alcohol polivinílico-borato sobre la energía de activación de la fibrilación de colágeno.

El ligero aumento en la tasa de gelificación también se asoció con una disminución en el tiempo total de gelificación. Sin embargo, este cambio no fue significativo en los presentes ensayos. Hacia la formulación de un andamio que pudiera moldearse dentro del lecho de una herida, o en el intervalo de trabajo de 30 °C-37 °C para el suministro y el trasplante de células, se exploraron mezclas de gel que contenían diferentes concentraciones de hidrogel de PVA. Los resultados demostraron que los hidrogeles de PVA-(borato) podrían de hecho alterar la cinética de formación de fibrillas del colágeno bovino Tipo I, a fin de permitir la gelificación a 30 °C. Donde las pruebas típicas de probeta invertida pueden demostrar gelificación a estas temperaturas más bajas, la evaluación de la turbidez a longitudes de onda de 313 nm elimina la posibilidad de que el sistema de hidrogel de PVA presente artefactos.

La adición de hidrogel de PVA conserva la gelificación y las propiedades mecánicas de las mezclas de gel después de la liofilización: como un intento de aumentar la estabilidad de la mezcla de gel (para fines de transporte y almacenamiento), las mezclas se liofilizaron, se trituraron hasta obtener un polvo y luego se reconstituyeron. Las mezclas liofilizadas se reconstituyeron con agua desionizada y destilada, sin necesidad de neutralizar el pH. Los sistemas de hidrogel de PVA que se crearon usando un copolímero de PVA-PEG (Kollicoat™) se reconstituyeron más fácilmente. Las variantes de andamio de colágeno que no estaban reticuladas y no contenían PVA exhibieron tiempos de gelificación significativamente más largos en comparación con la mezcla de andamios no liofilizados correspondiente (52,6 min ± 1,52 v. 36 min ± 1,73) (FIGURAS 4 y 5). Los andamios solo reticulados (xcol) pudieron formar fibrillas, pero con un tiempo de gelificación significativamente más largo que antes de la liofilización. Las mezclas líquidas de variantes de andamio que contenían hidrogeles de PVA exhibieron absorbancias iniciales que eran ligeramente más altas que antes de la liofilización, pero formaron fibrillas en un período de tiempo estadísticamente similar (FIGURAS 4 y 5). Las muestras de Kollicoat™, sobre todo K99, estuvieron entre las de gelificación más rápida (15,7 min ± 1,16) y exhibieron el cambio de turbidez más pequeño (de t=0 a tmax de absorbancia), lo que sugiere que el PVA-PEG debe haber tenido un efecto protector sobre la estructura del colágeno en forma de polvo y nuevamente cuando se reconstituye. Como se muestra en las FIGURAS 4 y 5, los andamios de hidrogel de PVA exhibieron una reducción significativa en el tiempo de gelificación en comparación con las variantes col, xcol, TW80™ y Tritonx100™. La mayor reducción en el tiempo de gelificación se observó en los andamios que contenían los hidrogeles de PVA-PEG (2,02 veces). En comparación con estudios previos que examinaron el efecto de los tensioactivos en la cinética de gelificación del colágeno (Fathima y Dhathathreyan, 2009; Li, 2009), Tween 20™, Tween 80™ y Triton-x100™ se combinaron dentro de mezclas de gel en sus respectivas concentraciones de micelas centrales. (Nota: el efecto de Tween 20™ fue comparable al de Tritonx100™ y, por lo tanto, se omitió con fines de claridad de la figura). Como se muestra en las FIGURAS 4 y 5, todos los tensioactivos aumentaron la tasa de gelificación (reduciendo t1/2max) de las muestras preliofilizadas y postliofilizadas, pero en una medida significativamente menor que la mayoría de los PVA.

Los sistemas de PVA-PEG e hidrogel de PVA exhiben un efecto similar al de un tensioactivo en las mezclas de gel de colágeno: una función principal de los tensioactivos es mejorar la hidrofilicidad de una superficie hidrófoba. La adición de Tween 20™, Tween 80™ y Triton-x100™ a las mezclas de gel de colágeno redujo significativamente el ángulo de contacto acuoso de una gota de agua asentada sobre una película fina moldeada de una mezcla de gel de 108° (Colágeno:GAG) a 51, 75° para TritonX100 y Tween 80 respectivamente (FIGURA 6). Además, hubo diferencias en el ángulo de contacto de acuerdo con el tipo de PVA que se utilizó. Curiosamente, al omitir el borato (PVAnb) del sistema, el ángulo de contacto aumentó significativamente de (52° a 72°). Las mezclas de gel solo reticuladas demostraron el ángulo de contacto más bajo, lo que sugiere la superficie más hidrófila formada por todas las mezclas de gel (37°). PVA99, PVAnb y Tween 80™ fueron relativamente similares a 75°, 76° y 75° respectivamente. Mientras que las mezclas Kollicoat™ 99 y 88 fueron las siguientes más hidrófilas con ángulos de contacto de 58° y 53° respectivamente. Como era de esperar, los PVA más hidrófobos tenían un mayor efecto similar al tensioactivo y, por lo tanto, una mayor reducción en el ángulo de contacto en comparación con los PVA de peso molecular similar.

Viabilidad celular y migración celular: las células cultivadas en variantes de mezcla de gel se cultivaron durante 24 horas dentro de andamios antes de la tinción. Se encontró que todas las variantes de andamio no eran tóxicas in vitro (FIGURA 7). Se crearon redes de colágeno pobladas de fibroblastos similares para evaluar la migración. Se tomó una biopsia con punción del centro del andamio y luego se llenó con un gel acelular emparejado. No hubo una diferencia significativa en la migración celular entre todos los andamios, con la excepción de los andamios Colágeno:GAG no reticulados que exhibieron la mayor tasa de migración celular durante un período de diez días (FIGURA 7B). El día 10, se encontraron significativamente más células migradas en las variantes k99 y xcol en comparación con PVA50/50 (FIGURA 7B).

Morfología de fibroblastos y arquitectura de andamio: la FIGURA 8 representa la morfología de los fibroblastos cultivados dentro de cinco variantes de andamio diferentes. Como se encontró en estudios previos, las células cultivadas dentro de un andamio de colágeno no reticulado exhiben una amplia propagación de extensiones de lamelapodios y filapodios, de formación de fibras de estrés (actina filamentosa) con tinción de faloidina-488; no se muestran micrografías (Kim et al., 2014; Mattila y Lappalainen, 2008). Se observó una notable disposición de fibras paralelas y una apariencia dendrítica reducida, coherente con menos filopodios, en fibroblastos cultivados dentro de una variante de andamio que contenía un hidrogel Kollicoat™ al 50% en peso/PVA99 al 50% en peso (0,4% en peso). Los andamios que contenían tensioactivo exhibieron una apariencia similar a la dendrítica con extensiones similares a filopodios estrechos y cuerpos celulares más pequeños que sugieren estrés celular y posible adhesión deficiente a pesar de que las células permanecen viables (FIGURA 7). Las imágenes transversales del microscopio electrónico de barrido (FIGURA 8) recapitularon nuestros hallazgos en el trabajo anterior, donde las estructuras de poros más grandes y las fibras de colágeno más delgadas son evidentes en el andamio no reticulado (col) en comparación con otras variantes de andamios reticulados. Curiosamente, el tratamiento con tensioactivos con tween80™ (tw80) muestra fibras de colágeno más gruesas, con un poro más pequeño y una vía vacía más tortuosa a través del andamio.

Materiales y procedimientos

Materiales: Colágeno fibroso-bovino Tipo I (Advanced Biomatrix™, EE. UU.), alcohol polivinílico (PVA) 88% y 99% hidrolizado (Alfa Aesar™, EE. u U.), Kollicoat IR™ (polietilenglicol (PEG)-PVA) (Sigma Aldrich, Oakville, Canadá), tetraborato de sodio-decahidratado (borato) (Sigma Aldrich, Oakville, Canadá), glutaraldehído (25% v/v, Sigma Aldrich, Oakville, Canadá), medio esencial modificado de Dulbecco (10x, Life Technologies™, Canadá), condroitina-6-sulfato (GAG) (Sigma Aldrich, Oakville, Canadá), Dextrano™ (40.000Da, Sigma Aldrich, Oakville, Canadá), ácido ascórbico (Sigma Aldrich, Oakville, Canadá), Tween20 (Sigma Aldrich, Oakville, Canadá), Tween80™ (Sigma Aldrich, Oakville, Canadá), dodecil sulfato de sodio (Sigma Aldrich, Oakville, Canadá), (kit de ensayo de viabilidad vivo/muerto (Molecular Probes™, Invitrogen™, Canadá), Phalloidin-488 Alexa Fluor™ (Invitrogen™, Canadá )

Fabricación de andamios híbridos de colágeno y polímero: se combinó colágeno fibroso-bovino Tipo I en HCl 1 N con un tampón de colágeno (10* DMEM, 10* PBS, 10* HEPES y 1* antibiótico, pH 7,5) y se ajustó el pH usando NaOH 1 N como se muestra en la FIGURA 1. Una vez neutralizado, se agregó condroitina-6-sulfato a los andamios (1:6, colágeno:C₆S). Los controles no reticulados se combinaron con los reactivos de hidrogel restantes o DMEM (1x). Los geles reticulados se mezclaron a fondo con una mezcla de dextrano (40.000 Da)glutaraldehído de alto peso molecular (0,02% v/v o como se indica en la TABLA 1) y se dejó incubar en hielo en la oscuridad. Los tiempos de incubación variaron de acuerdo con la concentración y el objeto experimental, como se describe en la TABLA 1. Para optimizar los efectos de la reticulación, las mezclas de gel se expusieron a concentraciones de glutaraldehído que eran proporcionales al volumen de reacción (c1) o a la cantidad de colágeno (c2) (FIGURA 2A) o proporcionales al tiempo de incubación (FIGURA 2B). Se seleccionaron diferentes períodos de tiempo para cada una de las dos condiciones de tratamiento de modo que la exposición fuera similar.

TABLA 1 Condiciones de reticulación para las variantes de andamio representadas en la FIGURA 2

La TABLA 2 describe la composición de las variantes utilizadas en todas las demás investigaciones que siguieron el mismo procedimiento de reticulación que se encuentra en la variante de la TABLA 3 “Figura 2B 21min". Después de la incubación, los geles híbridos poliméricos se combinaron con cantidades respectivas de copolímero PVA o PVA-PEG y agente gelificante (decahidrato de tetraborohidrato de sodio, 0,04-05% p/v) en una relación de 1:4 de molécula de borato a grupo funcional hidroxilo. Todas las mezclas de gel se llevaron a un volumen final con DMEM 1x y ácido ascórbico (100 |^j M). Las mezclas de gel se almacenaron a 4 °C hasta que se moldearon o se congelaron a -80 °C para la liofilización. Los andamios seleccionados se liofilizaron (secaron por congelación) durante 36 horas, luego se trituraron hasta obtener un polvo usando un mortero y se reconstituyeron a su concentración original usando agua destilada y desionizada.

TABLA 2. Composición de las variantes de andamios.

Efectos del agente de reticulación, alcohol polivinílico y copolímero sobre la cinética de gelificación: Las mezclas de gel se dividieron en alícuotas (150 jl/pocillo) en una placa de 96 pocillos en hielo. La cinética de gelificación se capturó utilizando un lector de placas calentado (Tecan™, EE. UU.) con un conjunto de filtros polarizados uv/vis de 313 nm y Magellan Software™. El lector de placas primero se calentó a la temperatura adecuada (30, 32, 34, 37 °C) y las mediciones se capturaron a intervalos de 1 o 2 minutos. Se usaron tres lotes (por triplicado) de variantes de gel para cada análisis (n=3) a menos que se indique lo contrario. La turbidez es el mejor indicador de la fibrilogénesis del colágeno y más indicativo de la gelificación cuando se combina con hidrogeles translúcidos como el PVA y el PEG (Valli et al., 1986; Li, 2009; Panitch et al., 2011; Hartwell et al., 2011). El tiempo de gelificación está representado por el tiempo a la mitad de la absorbancia máxima a 313 nm.

El tiempo de retraso es el tiempo desde el inicio de la gelificación hasta el tiempo a la mitad del máximo. La pendiente de la curva dA/dt indica la tasa de fibrilogénesis. Usando la ecuación de Arrhenius (1), la energía de activación se puede calcular usando la cinética de primer orden de las variantes de gel a diferentes temperaturas representadas como lnk frente a 1/T, donde k es la constante de velocidad y T es la temperatura en Kelvin. La constante de velocidad para una reacción de primer orden se puede derivar del tiempo de gelificación (t1/2) utilizando la ecuación (Terketaub, 1998).

(i) lnk=lnA'1!a/T

(2) k=ln(2)/t1/2

Usando principios similares, también se puede determinar el cambio en la tasa de fibrilogénesis (dA/dt) con respecto a los polímeros mediante la comparación de la pendiente de la curva en la región lineal.

Resistencia mecánica: los geles se colocaron en portaobjetos de cámara rectangular de 5 pocillos (400 μl cada uno) y se incubaron durante 24 horas a 37 °C. El ensayo de tracción se realizó usando un KES-G1 Micro-Tensile Tester™ (Kato Tech™, Japón), con una celda de carga de 1 kg. Antes de la carga, los geles se secaron para eliminar el exceso de líquido usando KimWipes™ (Kimberly Clark, EE. UU.) y se pesaron. Luego se usaron dos piezas de KimWipe™ para asegurar firmemente el gel en el portamuestras. A continuación, los geles se estiraron hasta romperse a una velocidad de deformación de 0,02 cm/s. La resistencia a la tracción se calculó dividiendo la carga de rotura (g) por la anchura de la muestra (mm) y la densidad del área (gm 2) de los geles polimerizados. Para fines estadísticos, se evaluaron tres lotes de gel.

Arquitectura del andamio: se colocaron andamios de colágeno (100 jl) en placas de 96 pocillos durante 24 horas, seguido de fijación en solución de formalina al 4% durante 24 horas a 4 °C. Después de la fijación, los geles se deshidrataron dos veces durante 12 horas en etanol al 70% y luego se congelaron a -80 °C antes de la liofilización. A continuación, los andamios liofilizados se pesaron y evaluaron en un calorímetro diferencial de barrido Q1000™ (TA Instruments, EE. UU.) a 5 °C/min dentro de un intervalo de 20 °C a 100 °C. Las muestras SEM primero se recubrieron con oro antes de cargarlas dentro del vacío de un Hitachi S4700 SEM™ (Hitachi™, Japón).

Ángulo de contacto: las mezclas de gel se formularon como se describe y luego se moldearon en películas delgadas sobre portaobjetos de vidrio a 37 °C y luego se dejaron secar en una campana de flujo laminar durante 24 horas. Usando una herramienta de ángulo de contacto (KSV Instruments™), se calculó el ángulo de contacto de una gota de agua en la superficie de la película delgada usando Attention Theta Software V4.1™.

Viabilidad celular: La viabilidad se evaluó mediante el ensayo de toxicidad Vivo/Muerto. Las células (primarias o de línea celular) se cultivaron en andamios durante 24 horas. Después de 24 horas, los andamios que contenían células se lavaron 3 veces con PBS 1x (pH 7,0) y una mezcla de homodímero de etidio y calceína-AM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 30 min, los andamios se lavaron 3 veces con 1x PBS y se visualizaron usando un microscopio fluorescente Zeiss Axiovert™ 200M y software Axiovision™. Los recuentos de células se obtuvieron usando el software Image J™ (Institutos Nacionales de Salud, EE. UU.). Adhesión y migración celular: se evaluó la unión y propagación celular usando faloidina-Alexa-fluor 488™ para la tinción de actina en fibroblastos cultivados dentro de andamios de colágeno 24 y 48 horas después de la colada. Brevemente, se crearon geles y se combinaron con células de acuerdo con la evaluación de la viabilidad celular. La evaluación de la migración celular consistió en crear biopsias con sacabocados de 4 mm en el centro de los geles y luego llenar el orificio con gel descelularizado. Las imágenes se capturaron durante un período de 10 días y las células migratorias se designaron como aquellas que cruzaron al nuevo gel desde el margen del anterior. Las imágenes se capturaron usando un microscopio fluorescente Zeiss Axiovert™ 200M y el software Axiovision™.

Estadísticas: El número de repeticiones representa diferentes lotes de geles. Los resultados experimentales se evaluaron mediante análisis de varianza (ANOVA) con una prueba de Tukey post-hoc. Los cálculos de error para la regresión lineal representan el error estándar medio del ajuste para un valor R2 dado de muestras por triplicado. La significación estadística se estimó con un valor alfa de 0,05 (p<0,05). Las mediciones se reportaron como media ± desviación estándar.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y no pretenden ser limitativos como tal.

Ejemplo 1. Desarrollo de sustituto de tejido diseñado

Un sustituto de piel lista para el paciente podría ser la respuesta a numerosas necesidades del mercado no satisfechas en el cuidado de heridas. Para facilitar la fabricación de piel lista para el paciente, con una logística sostenible, el sustituto de piel debe formarse dentro de la herida. Esto no solo reducirá los costos del producto, sino que la matriz también encajará perfectamente dentro de la herida y se integrará completamente con el lecho de la herida, mejorando la tasa de injerto. Dado que hay muchos procedimientos para diseñar una matriz extracelular, la vía preferida requerirá una modificación mínima de la norma fisiológica. Nuestro fundamento en el diseño de un andamio que pudiera satisfacer estas necesidades condujo a la creación de un gel biohíbrido que contenía tanto hidrogel como colágeno. Los primeros resultados demostraron que se podía añadir un hidrogel compuesto por borato de PVA a una red de GAG-colágeno reticulado soluble para acelerar la formación de fibrillas (y la gelificación) a 37 °C. La rigidez del colágeno y el alcohol polivinílico mejoraron la resistencia mecánica de los andamios gelificados y redujeron la susceptibilidad a la contractura. Además, se demostró que los andamios gelificados exhiben una proliferación celular reducida en comparación con colágeno-GAG simple (andamios reticulados/no reticulados). Cuando se utilizó para el trasplante de fibroblastos in vivo, el gel demostró su eficacia como sustituto de tejido, como se observó tanto en el injerto de piel en ratones, ratas y conejos como en el trasplante de islotes en ratones. La neovascularización se produce a un ritmo mayor en las heridas tratadas con la piel que se forma in situ (con y sin células no rechazables). La inervación del tejido también mejoró durante un período de 30 días y las células del cordón cultivadas pudieron crecer y organizarse en redes lineales dentro del andamio. Único en este andamio es que las células se alinean en una disposición polarizada (lineal) similar a la que se encuentra en un tendón o una córnea.

Ejemplo 2. Desarrollo de formulación mejorada, incluida la forma liofilizada seca

Anteriormente demostramos que la combinación de un hidrogel de PVA-borato y un andamio de colágeno-GAG dio como resultado una matriz extracelular superior en comparación con un gel de colágeno-GAG reticulado simple. El gel compuesto resultante muestra una velocidad de gelificación más rápida, una contractura reducida y una mayor resistencia a la tracción. La biocompatibilidad se evaluó mediante una tinción viva/muerta que demostró que los fibroblastos, los queratinocitos, las células epiteliales y las células inmortalizadas (HaCats) siguen siendo viables y proliferan a un ritmo reducido en comparación con otros andamios y la superficie de la placa de cultivo. Desde el descubrimiento original, hemos refinado la formulación para producir un gel que se pueda ensamblar y almacenar como una sola parte. La ventaja de un gel de una sola parte es que se puede usar cualquier jeringa simple para aplicar el gel, la desventaja es que se produce una separación de fases con el tiempo. En segundo lugar, el sistema de gel sin colar era insuficientemente tixotrópico. Para superar estos problemas, se realizaron dos cambios en la formulación. Los primeros cambios exploraron el concepto de espesar el sistema de gel sin moldear aumentando la concentración de colágeno y evaluando un intervalo de concentraciones de PVA/borato. Como resultado, ahora hemos identificado una gama de concentraciones que son óptimas y evitamos la separación de fases. En segundo lugar, descubrimos que la resina de gel se puede liofilizar y reconstituir. Por lo general, cuando el colágeno reticulado y el PVA se secan y se descomponen en polvo, no se reconstituyen fácilmente. Nuestros resultados preliminares demostraron que el polvo podía reconstituirse usando agua destilada, sangre entera, suero y plasma simplemente agitando en un vórtice a temperatura ambiente. La resina resultante puede almacenarse refrigerada o usarse inmediatamente para formar un andamio gelificado. Aunque hemos proporcionado evidencia de que: 1) nuestro sustituto de piel es menos contractual en comparación con el gel no reticulado, 2) es resistente a la digestión por las proteasas que normalmente se encuentran en el medio de la herida, como la colagenasa, 3) se puede congelar/secar y reconstituir, lo que lo hace atractivo para la comercialización, 4) tiene una vida útil prolongada, sus propiedades físicas y biológicas no se han comparado con algunos productos similares disponibles en el mercado.

Ejemplo 3. Uso de sustituto de tejido diseñado para el tratamiento de heridas

Las heridas crónicas comprenden el segmento más grande en el cuidado de heridas. Con más de 250 millones de personas afectadas por diabetes cada año, la úlcera diabética sigue siendo una de las más comunes y difíciles de tratar de todas las heridas de este segmento. El modo actual de aplicación es por inyección, utilizando una jeringa. Primero se calienta la jeringa para iniciar la gelificación (desnaturalización de las fibrillas y enlace de hidrógeno). Aunque el sistema de jeringa permite una fácil aplicación, puede haber un modo de administración más eficiente, por ejemplo, usando una jeringa calentada o usando una pistola de aire caliente (37 °C) después de la aplicación. Después de la aplicación, se venda la herida. Por ejemplo, el apósito para heridas puede emplear el uso de láminas de silicona, pulverización sobre uretano, nanofibras de PLGa , Meptiel™, Tegaderm™ u otros apósitos para heridas convencionales. El sustituto de tejido diseñado puede administrarse en una variedad de formas, que incluyen, entre otras: 1) aplicación seca, 2) hidratación con agua destilada, 3) hidratación con sangre entera, 4) hidratación con suero y 5) hidratación con plasma. Avanzando hacia una estrategia de tratamiento exitosa para la herida diabética, y como una demostración de la utilidad de las composiciones descritas en la presente memoria descriptiva en el cuidado de heridas en pacientes que requieren dicho cuidado, incluidos los pacientes humanos, el sistema de sustitución de tejidos diseñados descrito en la presente memoria descriptiva se demuestra para el tratamiento de heridas generadas en ratones diabéticos.

Previamente, hemos encontrado que las heridas en ratones diabéticos no obesos presentan una cicatrización retardada, similar a la de los seres humanos. Se coloca un inserto en cada herida para evitar la contractura. Las heridas se cubren con un apósito Tegaderm™ y se aplica una segunda aplicación del sustituto de piel 24 horas después de la cirugía. Los animales se sacrifican una vez que se completa el cierre de la herida (10-15 días aproximadamente). La diabetes se controla mediante inyecciones de insulina a diario para mantener los niveles de glucosa en sangre por debajo de 20 mM.

Ejemplo 4. Inclusión de células transfectadas establemente que expresan IDO como factor inmunomodulador

El vector adenoasociado es un vehículo aprobado para la terapia génica que, cuando se transporta el gen de la indoleamina 2,3 dioxigenasa, se puede usar para producir una célula inmunomoduladora. En nuestro trabajo anterior, hemos demostrado que los fibroblastos y queratinocitos que expresan IDO se pueden utilizar para crear sustitutos de piel sólidos de dos capas que confieren resistencia al rechazo por macrófagos y células T CD4+ y CD8+. Con los avances en la terapia génica y la familiarización de los organismos reguladores con estos avances, se espera que el beneficio de una línea celular que exprese IDO pronto pueda materializarse clínicamente en el campo del trasplante de células. Por lo tanto, las heridas pueden tratarse y evaluarse como se describe en el Ejemplo 3. La adición de células IDO al sistema de sustitución de tejidos diseñados mejorará aún más el resultado de curación y la tasa de cierre de la herida, como lo demuestran nuestros datos anteriores. Ejemplo 5. Aplicación de andamio biohíbrido por procedimiento de aplicación por pulverización

La versatilidad del andamio biohíbrido en forma de sol para seguir siendo una mezcla homogénea antes de la gelificación brinda la oportunidad de utilizar el sistema como 1) un vehículo de administración de células y un andamio delgado para la capa, mediante la aplicación de capas de células epiteliales sobre una gran superficie, como una quemadura; y/o 2) para su uso en la mejora de células de siembra en aplicaciones de bioimpresión 3D. Además, las células de la piel siguen siendo viables después de que se formó un andamio de capa delgada usando la aplicación por pulverización del andamio biohíbrido reconstituido que comprende una composición descrita en la presente memoria descriptiva (FIGURA 10).

Ejemplo 6. La aplicación del biohíbrido en heridas de oreja de conejo de espesor completo con y sin trasplante de células mejora la cicatrización hipertrófica y el resultado de cicatrización.

Se aplicaron andamios biohíbridos, tanto sin células (acelulares) como con células que expresan IDO (descritos en el Ejemplo 4) a heridas de oreja de conejo de espesor total (6 mm), que normalmente experimentan cicatrización hipertrófica incluso cuando se tratan. En el día 20 posterior a la cirugía, las heridas tratadas con andamio biohíbrido reconstituido mostraron un cierre completo, mientras que las heridas no tratadas y las tratadas con trasplantes xenogénicos sin IDO no lo hicieron. Para el día 35, todas las heridas se habían curado por completo. Los xenotrasplantes sin IDO y los controles no tratados exhibieron una cicatrización hipertrófica significativa (alta celularidad, índice de elevación de la cicatrización) e infiltración de células inmunitarias (CD3+). El andamio biohíbrido acelular y los andamios de células que expresan IDO no mostraron ningún signo de cicatrización. Los andamios biohíbridos pudieron permitir el trasplante exitoso de células que expresan IDO, que permanecieron viables durante la duración del estudio. Además, los andamios biohíbridos permitieron la neovascularización y la neoinervación.

Ejemplo 7. Prueba de andamios reconstituidos K99.

La fabricación de andamios es una faceta central de la ingeniería de tejidos. Las modalidades que avanzan hacia el trasplante de células han impulsado la demanda de materiales blandos que puedan adaptarse a los tejidos circundantes y exhibir propiedades mecánicas específicas del tejido (resistencia, viscosidad, elasticidad, etc.) y características físicas (tamaño de poro, química de la superficie, temperatura de transición del gel) (Turner R. et al. Transplantation (2010); Al-Abboodi A. et al. Advanced healthcare materials (2014); Balakrishnan B. et al. Biomaterials (2005); Meng X. et al. Journal of biomedical materials research Part A (2013); Prestwich GD. Organogenesis (2008). Los polímeros biocompatibles sintéticos o los biomateriales modificados se eligen a menudo para la creación de andamios e hidrogeles inyectables. Aunque el colágeno tipo I también se puede usar como material inyectable, su temperatura (y tiempo) de gelificación retrasan su utilidad como un andamio de formación in situ. Para evitar este problema, se puede modificar químicamente a través de la reticulación para para crear un material más viscoso que también evitaría la degradación rápida debido a los agentes de reticulación químicos. Excellagen™ e Integra Flowable™ son dos productos inyectables comercializados actualmente para uso como relleno dérmico y modalidad de curación de heridas, respectivamente. Tanto Excellagen™ como Integra Flowable™ son nuevos en el mercado, aunque los materiales blandos no pueden formar estructuras sólidas intactas (geles) in situ. Además, la mayoría de las preparaciones de andamios de colágeno para la investigación de ingeniería de tejidos y usos clínicos requieren primero la neutralización de una solución de colágeno antes de su uso. La utilidad de un andamio de colágeno reconstituible es que, a diferencia de una suspensión de gel, además de formarse in situ, también tendría propiedades mecánicas similares a las de los andamios sólidos preformados, como sujetar suturas o servir como interfaz entre un implante y el tejido. La utilidad clínica de los andamios reconstituidos con K99 como se describe en la presente memoria descriptiva se probó después de la reconstitución con agua destilada y desionizada, suero y sangre entera. Se probó la viscosidad del andamio K99 reconstituido dentro de un catéter intravenoso BD™ de 16G y la capacidad de sujeción de suturas en un andamio K99 reconstituido y gelificado (datos no mostrados). Se encontró que los andamios poliméricos reconstituidos descritos en la presente memoria descriptiva mostraron propiedades mecánicas y físicas beneficiosas en comparación con las alternativas disponibles. Por ejemplo, el andamio K99 reconstituido como se describe en la presente memoria descriptiva mostró una resistencia y elasticidad adecuadas para sujetar múltiples suturas.

Referencias

Al-Abboodi A. et al. "Injectable 3D Hydrogel Scaffold with Tailorable Porosity Post-Implantation (Andamio de hidrogel 3D inyectable con posimplantación de porosidad adaptable)" Advanced healthcare materials (2014) 3(5):725-36.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición liofilizada y en polvo, comprendiendo la composición:

(a) colágeno, en el que el colágeno está en una concentración de entre 3 y 10 mg/ml antes de la liofilización;

(b) glicosaminoglicano, en el que la relación de glicosaminoglicano a colágeno es una relación en peso de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 8:1;

(c) un agente de reticulación biocompatible de molécula pequeña de colágeno y glicosaminoglicano; (d) un hidrogel, en el que el hidrogel es 0,3%-1,2% p/vol de la composición final antes de la liofilización; y

(e) un agente de reticulación de hidrogel biocompatible de molécula pequeña;

en la que el hidrogel se forma a partir de polímeros de hidrogel y los polímeros de hidrogel se seleccionan de uno o más de: alcohol polivinílico (PVA); alcohol polivinílico tiolado; polímeros en bloque de alcohol polivinílico que contienen polietilenglicol (PVA-PEG); polivinilpirrolidona (PVP); y un copolímero del mismo de uno cualquiera de dos o más de los polímeros anteriores;

y en la que el agente de reticulación de colágeno y glicosaminoglicano se selecciona de uno o más de los siguientes: glutaraldehído, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC), EDC (1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida):NHS (N-hidroxisuccinimida), EDC (1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida):sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida), diisocianato de hexametileno y Genipina.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que el colágeno es principalmente colágeno fibrilar.

3. La composición de la reivindicación 2, en la que el colágeno fibrilar se selecciona de uno o más de los colágenos Tipo I, II, III, V y XI.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la relación de glicosaminoglicano a colágeno es una relación en peso de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 8:1 o tiene una relación en peso de 6:1.

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el glicosaminoglicano es:

(a) un glicosaminoglicano sulfatado;

(b) seleccionado de uno o más de los siguientes: sulfato de dermatán, sulfato de queratán, sulfato de heparán y heparina; o

(c) condroitina 6-sulfato.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el hidrogel es: 0,3%-1,0% p/vol de la composición final; 0,4%-0,8% p/vol de la composición final; 0,4%-0,7% p/vol de la composición final; o 0,4%-0,6% p/vol de la composición final.

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el agente de reticulación de hidrogel biocompatible de molécula pequeña es: 0,01% (p/v) - 0,0001% (p/v) de la composición final; o 0,01% (p/v)- 0,1% (p/v) de la composición final.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el agente de reticulación de hidrogel biocompatible de molécula pequeña es borato de sodio decahidratado.

9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la gelificación de la composición forma una matriz que tiene: una resistencia a la tracción de entre 0,2 y 2,0 MPa; o una resistencia a la tracción de entre 1,45 y 2,0 MPa.

10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que la gelificación de la composición liofilizada ocurre: entre 25°-40 °C; entre 25°-37 °C; entre 30°-37 °C; o a 37 °C.

11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la composición se prepara mezclando componentes poliméricos no reticulados, colágeno, glicosaminoglicanos y polioles dentro de una composición tampón concentrada 10* de 1/3 de HEPES, 1/3 de PBS y 1/3 de DMEM o una variación del mismo fluido enriquecido con vitaminas, nutrientes, glucosa y minerales.

12. Una composición reconstituida, que comprende la composición liofilizada y en polvo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes reconstituida en un fluido fisiológico, en la que el fluido fisiológico es preferentemente sangre, suero o plasma.

13. Un procedimiento para la preparación de una composición, comprendiendo el procedimiento:

(a) mezclar colágeno con glicosaminoglicano, en el que la relación de glicosaminoglicano a colágeno es una relación en peso de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 8:1;

(b) reticulación de colágeno y glicosaminoglicano;

(c) añadir un hidrogel al colágeno reticulado y glicosaminoglicano, en el que el hidrogel es 0,3%-1,0% p/vol de la composición final; y

(d) reticular el hidrogel;

en el que el procedimiento además comprende liofilizar la composición y pulverizar la composición liofilizada;

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la reticulación de colágeno y glicosaminoglicano es por tratamiento deshidrotérmico (DHT), irradiación ultravioleta (UV) o reticulación enzimática; o en el que la reticulación de colágeno y glicosaminoglicano es mediante un agente de reticulación de molécula pequeña de colágeno y glicosaminoglicano.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13-14, en el que el procedimiento además comprende reconstituir el polvo en un disolvente.

16. Una composición de una cualquiera o más de las reivindicaciones 1-12 para su uso en el tratamiento de heridas.

17. Un procedimiento no in vivo de cultivo de células, que comprende la mezcla de células con una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que las células se seleccionan de uno o más de: adipocitos;

células regenerativas adultas; células de Schwann; células parentales neuronales derivadas de la piel; DRC; y ASC.

19. El procedimiento de preparación de una composición de la reivindicación 15, en el que el disolvente es agua, medio celular, un tampón adecuado o un fluido fisiológico, en el que el fluido fisiológico es preferentemente sangre, suero o plasma.

20. El procedimiento para la preparación de una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 13-15, que además comprende mezclar componentes poliméricos no reticulados, colágeno, glicosaminoglicano y polioles dentro de una composición tampón concentrada 10* de 1/3 de HEPES, 1/3 de PBS y 1/3 de DMEM o una variación del mismo fluido enriquecido con vitaminas, nutrientes, glucosa y minerales.