ES2944359T3 - Procedimiento de detección de enfermedades inducidas por C. perfringens en una bandada de aves - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un método para detectar enfermedades inducidas por C. perfringens en animales, comprendiendo el método: a) recolectar material de muestra de un animal específico o de un grupo específico de animales en momentos consecutivos; b) determinar la cantidad de un primer marcador y un segundo marcador contenidos en el material de muestra; yc) determinar la proporción del primer marcador al segundo marcador contenido en el material de muestra; en el que el primer marcador comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la subespecie de C. perfringens que induce la enfermedad diana; y el segundo marcador comprende un polinucleótido que es específico para la especie C. perfringens; y en el que un aumento en la relación del primer marcador al segundo marcador en el material de muestra analizado a lo largo del tiempo es una indicación de la enfermedad objetivo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento de detección de enfermedades inducidas por C. perfringens en una bandada de aves
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar enfermedades inducidas por C. perfringens en animales. Más específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento para determinar si un animal o una población animal padece o no enfermedades inducidas por C. perfringens en estado clínico o subclínico.
Antecedentes de la invención
El Clostridium perfringens es un patógeno omnipresente que utiliza un arsenal de toxinas para provocar infecciones histotóxicas e intestinales en animales y también en seres humanos. El C. perfringens es un anaerobio Gram-positivo, en forma de bastoncillo, formador de esporas, tolerante al oxígeno. No todas las cepas de C. perfringens son virulentas. Las cepas de C. perfringens virulentas se clasifican tradicionalmente en cinco tipos de toxinas (A, B, C, D y E), basándose en la producción de cuatro toxinas principales sospechosas (alfa, beta, épsilon e iota). Dependiendo de las toxinas producidas (toxinas principales y adicionales tales como NetB, Cpb2 y otras), los síndromes/enfermedades específicos de subespecies de C. perfringens se pueden inducir en diferentes organismos huésped [Rood, J. I. (1998) "Virulence genes of Clostridium perfringens"; Annual Review of Microbiology 52: 333-360]. Las toxinas están codificadas por secuencias de polinucleótidos ubicadas en el cromosoma y/o en plásmidos de toxinas [Popoff, M. R. y P. Bouvet (2013). "Genetic characteristics of toxigenic Clostridia and toxin gene evolution" Toxicon 75: 63--89].
Como patógeno animal, el C. perfringens es responsable de varias enfermedades graves, incluida la enteritis necrótica aviar, que supone unas pérdidas de aproximadamente 6 mil millones de dólares estadounidenses/año para el sistema agrícola mundial [Wade, B., Keyburn, A.L. (2015), "The true cost of necrotic enteritis" World Poultry 31, 16-17].
La enteritis necrótica (EN) es una enfermedad entérica de las aves de corral que se describió por primera vez en 1961. La EN en pollos se manifiesta como una enterotoxemia aguda o crónica. La enfermedad aguda tiene como consecuencia niveles significativos de mortalidad debido al desarrollo de lesiones necróticas en la pared intestinal, mientras que la enfermedad crónica produce una pérdida significativa de productividad y bienestar. Los primeros estudios sobre EN sugirieron que el principal factor de virulencia involucrado en la enfermedad era la alfa-toxina (conocida como Cpa o Plc), que tiene actividad de fosfolipasa C y de esfingomielinasa [Keyburn, A. L. et al. (2006) "Alpha-toxin of Clostridium perfringens is not an essential virulence factor in necrotic enteritis in chickens", Infection and Immunity 74(11): 6496-6500]. Todas las cepas de C. perfringens albergan el gen que codifica la alfa-toxina [Rood, J. I. (1998) "Virulence genes of Clostridium perfringens", Annual Review of Microbiology 52: 333-360; Titball, R. W., et al. (1999) "The Clostridium perfringens a-toxin". Anaerobe 5 (2): 51-64]. Sin embargo, estudios recientes han mostrado que la alfa-toxina parece no ser un factor de virulencia esencial, ya que las cepas mutantes de alfa-toxina eran capaces de provocar EN, lo que cuestiona el papel de la alfa-toxina en la enfermedad en general. En estudios más recientes, se ha sugerido que la nueva toxina formadora de poros, NetS, desempeña un papel clave en el desarrollo de esta enfermedad [Keyburn, A. L. et al. (2008) "NetS, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens" PLoS Pathogens4 (2)].
Se sabe que la EN afecta a pollos de engorde, gallinas ponedoras, pavos y codornices. La forma clínica se observa con mayor frecuencia en pollos de engorde de dos a cinco semanas de edad. Por lo general, esto también se encuentra cerca del momento en que las dietas se cambian de alimento de inicio a alimento de crecimiento y cerca del periodo de transición del sistema inmunológico materno al sistema inmunológico adaptativo, respectivamente, por lo que el oportunista C. perfringens puede aprovechar este periodo de transición en el entorno intestinal y proliferar [Timbermont, L. et al. (2011) "Necrotic enteritis in broilers: An updated review on the pathogenesis." Avian Pathology 40 (4): 341-347].
Aparte de la mera asociación de los factores de virulencia de por sí con la incidencia de EN, todavía existe una gran tarea pendiente para mostrar el vínculo mecanicista entre estos factores y el establecimiento de la enfermedad en aves o de otras enfermedades inducidas por C. perfringens en otros animales (de granja).
Además, relacionar la infección por EN subclínica con cualquiera de estos factores de virulencia es extremadamente difícil de lograr, ya que las aves carecen de signos que justifiquen su examen antes del sacrificio. Por lo tanto, sigue siendo imperativa la necesidad de un procedimiento para la detección temprana de EN y, lo que es más importante, las formas subclínicas de EN. Se aplican consideraciones similares para otras enfermedades de animales inducidas por C. perfringens, en particular de animales para la producción ganadera, tales como enteritis en cerdos, caballos, potros, cabras, conejos, corderos, perros y bovinos; diarrea en cerdos; enterotoxemia en ovinos, caprinos y bovinos; enteritis necrosante en lechones, corderos, potros y terneros (neonatales); tiflocolitis en caballos; gastroenteritis hemorrágica canina mortal; enterocolitis necrosante mortal del potro; gangrena gaseosa (mionecrosis clostridial) en ovinos, bovinos, equinos y otras especies [Rood, J. I. (1998) "Virulence genes of Clostridium perfringens" Annual Review of Microbiology52: 333-360].
La enterotoxemia bovina provocada por Clostridium perfringens es un síndrome de muerte súbita con lesiones necrohemorrágicas en el intestino delgado, que afecta principalmente a terneros lactantes y terneros de engorde [Goossens, E. et al. (2014), "Clostridium perfringens strains from bovine enterotoxaemia cases are not superior in in vitro production of alpha toxin, perfringolysin O and proteolytic enzymes" BMC Veterinary Research 10; Lebrun M, Mainil JG, Linden A: "Cattle enterotoxaemia and Clostridium perfringens: description, diagnosis and prophylaxis" Vet Rec 2010, 167 (1): 13-22]. En los terneros de engorde, se ven afectadas predominantemente las razas de bovino de carne. El síndrome representa aproximadamente el 20% de la mortalidad de estos terneros, en comparación con el 4% de los terneros de raza lechera y mestizos [Pardon B, De Bleecker K, Hostens M, Callens J, Dewulf J, Deprez P: "Longitudinal study on morbidity and mortality in white veal calves in Belgium" BMC Vet Res 2012, 8:26].
Los procedimientos actuales se basan en el examen de animales individualizados y utilizan necropsia e histopatología posterior o ensayos para identificar el patógeno. Sin embargo, el seguimiento de biomarcadores de tejidos o biomarcadores sanguíneos es, debido a su naturaleza invasiva, lento y poco práctico cuando se trata de un gran número de muestras, como sucede con los animales de granja.
La solicitud de patente europea EP 3 112474 A1, recientemente publicada, describe un procedimiento para detectar EN aviar mediante el aislamiento de microvesículas de una muestra aviar y posteriormente determinar la presencia y/o el nivel de marcadores de ARN indicativos de EN. La muestra aviar puede ser un fluido corporal o un excremento corporal y el marcador indicativo de EN se selecciona de C. perfringens y secuencias huésped específicas, homólogos y fragmentos de las mismas. Sin embargo, las microvesículas deben aislarse y lisarse antes del análisis y la cuantificación de los marcadores de ARN.
Por lo tanto, existía aún la necesidad de proporcionar un procedimiento rápido, fiable y no invasivo ante mortem para determinar si una población animal padece o no enfermedades inducidas por C. perfringens que se pueda realizar a bajo coste y con un esfuerzo mínimo.
Sumario de la invención
En consecuencia, un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para detectar enfermedades inducidas por C. perfringens en una bandada de aves, comprendiendo el procedimiento
a) recolectar material de muestra de la bandada de aves en puntos temporales consecutivos;
b) determinar la cantidad de un primer marcador y un segundo marcador contenidos en el material de muestra y c) determinar la relación del primer marcador con respecto al segundo marcador contenidos en el material de muestra;
en el que el primer marcador comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para las subespecies de C. perfringens que inducen la enfermedad diana;
y el segundo marcador comprende un polinucleótido que es específico para la especie C. perfringens; y en el que un aumento en la relación del primer marcador con respecto al segundo marcador en el material de muestra analizado a lo largo del tiempo es una indicación de la enfermedad diana.
En las reivindicaciones adjuntas se divulgan formas de realización del procedimiento de la invención.
A continuación, se describen en detalle los aspectos cruciales de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
Detección de enfermedades inducidas por C. perfringens en animales
Los presentes inventores han descubierto, inesperadamente, que la relación de un primer polinucleótido marcador con respecto a un segundo polinucleótido marcador en excrementos de animales se correlaciona con la manifestación de enfermedades inducidas por la bacteria C. perfringens. Más específicamente, los presentes inventores han descubierto que un aumento en la relación de los marcadores mencionados anteriormente a lo largo del tiempo es una indicación de la enfermedad diana.
En consecuencia, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar enfermedades inducidas por C. perfringens en una bandada de aves, comprendiendo el procedimiento:
a) recolectar material de muestra de la bandada de aves en momentos determinados consecutivos;
b) determinar la cantidad de un primer marcador y un segundo marcador contenidos en el material de muestra y
c) determinar la relación del primer marcador con respecto al segundo marcador contenidos en el material de muestra;
en el que el primer marcador comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para las subespecies de C. perfringens que inducen la enfermedad diana;
y el segundo marcador comprende un polinucleótido que es específico para la especie C. perfringens; y
en el que un aumento en la relación del primer marcador con respecto al segundo marcador en el material de muestra analizado a lo largo del tiempo es una indicación de la enfermedad diana.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polinucleótidos" se refiere a ADN o ARN. En una forma de realización particularmente preferida, el término "polinucleótidos" se refiere a ADN.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "enfermedad" se refiere a cualquier condición anormal en un animal que interfiere con sus procesos fisiológicos vitales, provocada por cepas de C. perfringens patógenas. El término "enfermedad" corresponde a un aumento de los factores de patogenicidad y, por lo tanto, también incluye etapas tempranas de la enfermedad diana, así como un determinado riesgo de que se desencadene la enfermedad diana. De acuerdo con esto y tal como se usa en el contexto de la presente invención, el término "enfermedad diana" se refiere a la enfermedad específica inducida por C. perfringens (que se produce en especies animales específicas) para la que se va a analizar la muestra animal.
Marcadores
El primer marcador comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para las subespecies de C. perfringens que inducen la enfermedad diana. Es decir, el primer marcador representa una región específica y conservada que determina la virulencia y la patogenicidad de las subespecies de C. perfringens seleccionadas. En una forma de realización preferida, el primer marcador constituye un factor de virulencia para la enfermedad diana.
El primer marcador puede ser un gen marcador que codifique una toxina específica u homólogos o fragmentos del mismo o, alternativamente, una isla de patogenicidad. En el contexto de la presente invención, el término "homólogo" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con el polinucleótido o gen marcador respectivo. El término "fragmento" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que está truncada en no más de 100 u 80, preferentemente en no más de 70, especialmente en no más de 60, de la forma más preferida en no más de 50 nucleótidos en comparación con el polinucleótido o gen marcador respectivo.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "isla de patogenicidad" (PAI) se refiere a unidades genéticas discretas que portan genes que codifican uno o más factores de virulencia [Hacker et al. (1997) "Pathogenicity islands of virulent Bacteria: structure and impact on microbial evolution", Molecular Microbiology 23(6): 1089-1097]. La PAI puede contener genes para regular los genes de virulencia codificados en la PAI o puede contener genes para regular genes fuera de la PAI. Las islas de patogenicidad se incorporan en el genoma (cromosómicamente o extracromosómicamente) de la cepa de C. perfringens patógena.
El primer marcador puede estar ubicado en un plásmido de toxina de C. perfringens y/o en el cromosoma de C. perfringens.
Como ejemplo, el gen cpe puede usarse como un primer gen marcador. Dicho gen cpe se puede encontrar en una región variable del cromosoma en algunas cepas de C. perfringens y en plásmidos grandes en otras cepas [Petit et al. (1999) "Clostridium perfringens: toxinotype and genotype", Trends in Microbiology Vol. 7, N° 3, 104-110].
En una forma de realización particularmente preferida, el gen marcador está ubicado en un plásmido de toxina de C. perfringens.
Las cepas de C. perfringens pueden portar múltiples plásmidos grandes de resistencia a toxinas y antibióticos, por lo que estos plásmidos están estrechamente relacionados y comparten hasta 35 kb de secuencias casi idénticas [Wisnieswski et al. (2017) "The Tcp conjugation system of Clostridium perfringens", Plasmid 91, 28-36]. Las toxinas codificadas por plásmidos son, por ejemplo, la toxina beta, la toxina beta2, la toxina épsilon, la toxina iota, NetS y TpeL [Li, J., et al. (2013); "Toxin plasmids of Clostridium perfringens"; Microbiology and Molecular Biology Reviews 77(2): 208-233].
Las principales enfermedades asociadas a C. perfringens en animales y las toxinas clave se enumeran en la tabla siguiente [Popoff, M. R. (2014) "Clostridial pore-forming toxins: Powerful virulence factors." Anaerobe 30: 220-238; Rood, J. I. (1998) "Virulence genes of Clostridium perfringens" Annual Review of Microbiology 52: 333-360; Gohari, I. M. et al. (2015) "A novel pore-forming toxin in type A Clostridium perfringens is associated with both fatal canine
hemorrhagic gastroenteritis and fatal foal necrotizing enterocolitis" PLoS ONE 10(4); Keyburn, A. L., et al. (2008) "NetS, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens" PLoS Pathogens 4(2)]:
En consecuencia, el primer gen marcador también se puede seleccionar del grupo que consiste en cpe, toxina beta (cpb), toxina beta2 (cpb2), toxina épsilon (etx), netF y netB y homólogos y fragmentos de estos genes. Alternativamente, también pueden usarse secuencias de polinucleótidos que comprenden uno de los genes mencionados anteriormente. Preferentemente, estas secuencias de polinucleótidos se alargan no más de 100 pares de bases o no más de 80 pares de bases, preferentemente no más de 70 pares de bases o no más de 60 pares de bases, especialmente no más de 50 pares de bases o no más de 40 pares de bases y de la forma más preferida no más de 30 pares de bases en comparación con los respectivos genes marcadores.
En una forma de realización preferida, el gen netB se utiliza como primer marcador.
El segundo marcador comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la especie C. perfringens en general y representa una región conservada y específica del genoma de C. perfringens (cromosómicamente o extracromosómicamente).
El segundo marcador puede ser una secuencia de polinucleótidos o un gen marcador específico ubicado en un plásmido de C. perfringens o en el cromosoma de C. perfringens. Se prefiere particularmente un gen marcador ubicado en el cromosoma de C. perfringens.
Preferentemente, el segundo gen marcador se selecciona del grupo que consiste en los genes cpa, ADNr 16S, virR, virS, pfoA y homólogos y fragmentos de estos genes. Alternativamente, también pueden usarse secuencias de polinucleótidos que comprenden uno de los genes mencionados anteriormente.
El gen cpa es particularmente preferido como segundo marcador.
La enfermedad inducida por C. perfringens puede seleccionarse del grupo que consiste en enteritis necrótica aviar; enteritis en perros, cerdos, caballos, potros, cabras, conejos, corderos y ganado vacuno; diarrea en cerdos; enterotoxemia en ovejas, cabras y ganado vacuno; enteritis necrosante en lechones, corderos, potros y terneros (neonatal); tiflocolitis en caballos; gastroenteritis hemorrágica canina mortal; enterocolitis necrosante mortal del potro; gangrena gaseosa (mionecrosis por clostridios) en ovejas, ganado vacuno, caballos y otras spp. o en seres humanos y enteritis necrótica humana. El procedimiento anterior es particularmente adecuado para detectar enteritis necrótica aviar.
Además, el procedimiento según la presente invención es particularmente adecuado para detectar enfermedades inducidas por C. perfringens que se encuentran en estado subclínico o latente. En dichas formas subclínicas o latentes de infecciones por C. perfringens no hay presencia de signos clínicos evidentes y por lo general no hay un pico de mortalidad. En una forma de realización particularmente preferida, el procedimiento anterior se usa para detectar enteritis necrótica aviar en estado subclínico o latente.
Determinación de enfermedades inducidas por C. perfringens en animales individuales
En un aspecto relacionado de la divulgación que no forma parte de la invención, el procedimiento de la presente invención puede usarse para determinar si un animal individual padece o no una enfermedad inducida por C. perfringens. En ese caso, el material de muestra procede de un animal individual.
El animal individual puede ser, por ejemplo, una mascota o animal doméstico, un animal de granja tal como el que se encuentra en instalaciones ganaderas, un animal salvaje o un animal de zoológico. Además, los animales individuales que se transportan para su sacrificio o para su reubicación pueden examinarse utilizando el procedimiento anterior. Como ejemplo, el material de muestra procedente de un perro individual recogido en momentos determinados consecutivos puede analizarse según el procedimiento anterior para determinar si el perro padece o no gastroenteritis hemorrágica canina mortal. En este caso concreto, netF es un primer marcador adecuado y cpa es un segundo marcador adecuado.
El material de muestra se selecciona del grupo que consiste en muestras de polvo, muestras de hisopos, muestras del lecho, muestras de estiércol líquido, muestras de pelo, muestras de plumas, muestras de piel y muestras de excrementos corporales y soluciones o suspensiones de los mismos. Los excrementos corporales son los excrementos urinarios, fecales o cecales. En una forma de realización preferida, el material de muestra son heces.
En general, el término "lecho" debe entenderse como una mezcla de excrementos de animales con el material de yacija.
Tal como se utiliza en el contexto de este aspecto, el término "muestras del lecho" se refiere a excrementos de un animal individual. Además, en el contexto de esta forma de realización, el término "muestras de estiércol líquido" se refiere a una muestra de excrementos que contiene heces y orina de un animal individual.
Las muestras de animales individuales pueden tomarse directamente del animal, por ejemplo con hisopos.
Alternativamente, y especialmente en el caso de animales alojados individualmente, el material de muestra se puede recolectar del suelo del corral, la jaula o la rejilla. El material de muestra debe poder asignarse al animal investigado. Los volúmenes de muestra adecuados son, por ejemplo, de 0,05 ml a 20 ml o de 0,1 a 20 ml, en particular de 0,2 a 10 ml, preferentemente de 0,5 a 5 ml. Las masas de muestra adecuadas son, por ejemplo, de 0,05 g a 20 g o de 0,1 a 20 g, en particular de 0,2 a 10 g, preferentemente de 0,5 a 5 g.
Determinación de enfermedades inducidas por C. perfringens en poblaciones animales
El procedimiento de la invención se usa para determinar si una población animal padece o no una enfermedad inducida por C. perfringens.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "población animal" se refiere a un grupo de individuos animales que pertenecen a la misma especie. La población animal puede ser, por ejemplo, un grupo de mascotas o animales domésticos que se encuentran en la cría de animales, un grupo de animales de granja que se encuentran en producción ganadera o en cría ganadera, o un grupo de animales salvajes o animales de zoológico.
La población animal según la invención es una bandada de aves. En una forma de realización preferida, la población animal es una manada de animales tal como se encuentra en procesos de producción ganadera. En otros aspectos no cubiertos por la presente invención, la población animal o la manada de animales puede ser un rebaño de ovejas, cabras o ganado vacuno, una manada de caballos o una piara de cerdos.
El procedimiento de la presente invención es particularmente adecuado para determinar el estado de salud de una población animal mediante ensayos combinados. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "ensayo combinado" se refiere a un procedimiento de ensayo en el que el material de muestra es una muestra combinada de una población animal.
Una "muestra combinada" debe entenderse como una muestra compuesta de muestras separadas seleccionadas aleatoriamente, una muestra tomada con uno o varios hisopos de tela humedecidos o muestras combinadas compuestas por muestras separadas de muestras frescas tomadas aleatoriamente de varios sitios en el alojamiento o el espacio en el que se mantiene la población animal o la manada de animales. Las muestras combinadas reflejan la cantidad de polinucleótidos marcadores o genes marcadores de patógenos presentes en la población animal. El material de muestra se selecciona del grupo que consiste en muestras de polvo, muestras del lecho, muestras de estiércol líquido, muestras de pelo, muestras de plumas, muestras de piel, muestras de hisopos y muestras de excrementos corporales y soluciones o suspensiones de los mismos. Los excrementos corporales son excrementos urinarios, fecales o cecales. En una forma de realización preferida, el material de muestra son heces.
Tal como se utiliza en el contexto de esta forma de realización, el término "muestras del lecho" se refiere a excrementos mixtos presentes en el corral, la jaula o la rejilla. Además, en el contexto de la presente forma de realización, el término "muestras de estiércol líquido" se refiere a muestras de excrementos mixtos que contienen heces y orina.
Estas muestras del lecho pueden recolectarse, por ejemplo, de una población animal utilizando el procedimiento del cubrezapatos o utilizando pinzas para lechos en diferentes ubicaciones del corral.
Las calzas que son lo suficientemente absorbentes para absorber la humedad son particularmente adecuadas para recolectar muestras animales combinadas. Los calcetines de gasa tubulares también son aceptables.
Los volúmenes de muestra adecuados son, por ejemplo, de 0,1 a 20 ml, en particular de 0,2 a 10 ml, preferentemente de 0,5 a 5 ml. Las masas de muestra adecuadas son, por ejemplo, de 0,1 a 20 g, en particular de 0,2 a 10 g, preferentemente de 0,5 a 5 g.
La población animal es una manada de aves. La manada de aves según la invención es preferentemente de aves de corral. Las aves de corral preferidas según la invención son pollos, pavos, patos y gansos. Las aves de corral se pueden optimizar para producir ganado joven. Este tipo de aves de corral también se conoce como animales progenitores y abuelos. Por consiguiente, los animales progenitores y abuelos preferidos son los pollos de engorde progenitores (o abuelos), los patos progenitores (o abuelos), los pavos progenitores (o abuelos) y los gansos progenitores (o abuelos).
Las aves de corral según la invención también se pueden seleccionar de entre aves de corral domésticas y aves silvestres. Las aves de corral domésticas o aves silvestres preferidas son pavos reales, faisanes, perdices, pintadas, codornices, urogallos, gansos, palomas y cisnes. Otras aves de corral preferidas según la invención son avestruces y loros. Las aves de corral más preferidas según la invención son los pollos de engorde.
Para realizar el procedimiento anterior, las muestras animales se recolectan en puntos temporales consecutivos. Preferentemente, las muestras se toman semanalmente, diariamente o cada hora. Se prefiere particularmente recolectar las muestras animales en días consecutivos.
En una forma de realización particularmente preferida, el primer y el segundo marcador se detectan a nivel de ADN, es decir, los polinucleótidos son polinucleótidos de ADN.
Los polinucleótidos marcadores pueden aislarse de las muestras animales antes de la cuantificación. El aislamiento de polinucleótidos se puede realizar, por ejemplo, mediante extracción utilizando el procedimiento de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) o utilizando diversos kits comerciales de extracción de ácidos nucleicos, en los que la lisis celular se realiza mediante lisis química y/o mediante disrupción celular mecánica y el ácido nucleico se captura en matrices de sílice o en perlas magnéticas revestidas de sílice. Los kits de extracción comerciales especializados en materia fecal o material agresivo son particularmente adecuados.
Los genes marcadores pueden detectarse y/o cuantificarse mediante procedimientos comúnmente conocidos tales como secuenciación, hibridación o diversas técnicas de PCR conocidas en la técnica.
En una forma de realización alternativa, los genes marcadores contenidos en la muestra animal pueden cuantificarse directamente, por ejemplo, mediante técnicas de PCR, qPCR, secuenciación o hibridación.
La presente invención proporciona además un kit de diagnóstico que comprende un conjunto de oligonucleótidos (cebadores y sondas) para amplificar y/o cuantificar al menos un polinucleótido que codifica al menos uno de los genes marcadores. En una forma de realización preferida, el kit de diagnóstico comprende cebadores y sondas de PCR tanto para el primer marcador como para el segundo marcador. Más específicamente, el kit de diagnóstico comprende cebadores y sondas de PCR para detectar tanto el primer marcador como el segundo marcador, en el que el primer marcador comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para las subespecies de C. perfringens que inducen la enfermedad diana y el segundo marcador comprende un polinucleótido que es específico para la especie C. perfringens. El kit puede comprender además soluciones tampón, tales como tampón PCR; sales de magnesio; trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP). El kit también puede incluir elementos tales como tubos de recogida de muestras, reactivos para aislar los ácidos nucleicos y/o instrucciones para su uso.
Detección de enteritis necrótica aviar
Los solicitantes han descubierto, inesperadamente, que la aparición de enteritis necrótica (subclínica) puede determinarse mediante el seguimiento del desarrollo de la relación netB/cpa en muestras de aves a lo largo del tiempo. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar la enteritis necrótica aviar, comprendiendo el procedimiento:
a) recolectar muestras de una población aviar específica en momentos determinados consecutivos; b) determinar la cantidad de un primer marcador y un segundo marcador contenidos en el material de muestra; y c) determinar la relación del primer marcador con respecto al segundo marcador contenidos en el material de muestra;
en el que el primer marcador es netB u homólogos o fragmentos del mismo;
el segundo marcador es cpa u homólogos o fragmentos del mismo;
y
en el que un aumento en la relación entre el primer marcador y el segundo marcador en el material de muestra analizado a lo largo del tiempo es una indicación de enteritis necrótica aviar.
Como alternativa, el primer marcador también puede ser una secuencia de polinucleótidos que comprende netB y/o el segundo marcador puede ser una secuencia de polinucleótidos que comprende cpa. Preferentemente, estas secuencias de polinucleótidos se alargan no más de 100 pares de bases o no más de 80 pares de bases, preferentemente no más de 70 pares de bases o no más de 60 pares de bases, especialmente no más de 50 pares de bases o no más de 40 pares de bases y de la forma más preferida no más de 30 pares de bases en comparación con los genes netB y cpa.
El término "enteritis necrótica" se refiere a la EN tanto en estado clínico como subclínico/latente.
Por lo tanto, en una forma de realización particularmente preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar enteritis necrótica aviar, comprendiendo el procedimiento:
a) recolectar muestras de una población aviar específica en momentos determinados consecutivos;
b) determinar la cantidad de un primer marcador y un segundo marcador contenidos en el material de muestra; y c) determinar la relación del primer marcador con respecto al segundo marcador contenidos en el material de muestra;
en el que el primer marcador es netB y el segundo marcador es cpa;
y
en el que un aumento en la relación entre el primer marcador y el segundo marcador en el material de muestra analizado a lo largo del tiempo es una indicación de enteritis necrótica aviar.
Las secuencias de polinucleótidos de netB y cpa son conocidas en la técnica. Sin embargo, en aras de la claridad y la exhaustividad, la secuencia de consenso de netB se indica con SEQ ID NO. 1 y la secuencia de consenso de cpa se indica con SEQ ID NO. 2.
El gen de la toxina alfa (cpa) está presente en el cromosoma de todas las cepas de C. perfringens (patógenas y no patógenas), lo que significa que la concentración de cpa debe tener niveles similares en muestras de excrementos de animales sanos e infectados con EN e indica la presencia de C. perfringens solo en general.
El procedimiento anterior se puede utilizar para determinar si un individuo aviar padece o no enteritis necrótica (subclínica/latente) o, en una forma de realización alternativa, para determinar si una población aviar padece o no enteritis necrótica (subclínica/latente) ("ensayo combinado").
En caso de que se vaya a examinar un sujeto aviar individual, el material de muestra puede seleccionarse del grupo que consiste en muestras de polvo, muestras de hisopos, muestras del lecho, muestras de estiércol líquido, muestras de plumas y muestras de excrementos corporales y soluciones o suspensiones de los mismos. Los excrementos corporales son excrementos urinarios, fecales o cecales. En una forma de realización preferida, el material de muestra son heces.
En general, el término "lecho" debe entenderse como una mezcla de excrementos de animales con el material de yacija.
Tal como se utiliza en el contexto de esta forma de realización, el término "muestras del lecho" se refiere a los excrementos de un sujeto aviar individual. Además, en el contexto de esta forma de realización, el término "muestras
de estiércol líquido" se refiere a una muestra de excremento que contiene heces y orina de un animal individual.
Las muestras de sujetos aviares individuales se pueden tomar directamente del ave, por ejemplo con hisopos. Alternativamente, y especialmente en el caso de animales alojados individualmente, el material de muestra se puede recolectar del suelo del corral, la jaula o la rejilla. El material de muestra debe poder asignarse al animal investigado.
Los volúmenes de muestra adecuados son, por ejemplo, de 0,05 ml a 20 ml o de 0,1 a 20 ml, en particular de 0,2 a 10 ml, preferentemente de 0,5 a 5 ml. Las masas de muestra adecuadas son, por ejemplo, de 0,05 g a 20 g o de 0,1 a 20 g, en particular de 0,2 a 10 g, preferentemente de 0,5 a 5 g.
En caso de que se vaya a determinar el estado de salud de una población aviar, se examina una muestra combinada de la población aviar ("ensayo combinado"). Una "muestra combinada" debe entenderse como una muestra compuesta de muestras separadas seleccionadas aleatoriamente, una muestra tomada con uno o varios hisopos de tela humedecidos o muestras combinadas compuestas por muestras separadas de muestras frescas tomadas aleatoriamente de varios sitios en el alojamiento o el espacio en el que se mantiene la población aviar. Las muestras combinadas reflejan la cantidad de genes marcadores netB patógenos presentes en la población animal.
El material de muestra puede seleccionarse del grupo que consiste en muestras de polvo, muestras del lecho, muestras de estiércol líquido, muestras de plumas, muestras de hisopos y muestras de excrementos corporales y soluciones o suspensiones de los mismos. Los excrementos corporales son excrementos urinarios, fecales o cecales. En una forma de realización preferida, el material de muestra son heces.
Tal como se utiliza en el contexto de esta forma de realización, el término "muestras del lecho" se refiere a excrementos mixtos presentes en el corral, la jaula o la rejilla. Estas muestras del lecho pueden recolectarse, por ejemplo, de una población utilizando el procedimiento de cubrezapatos o utilizando pinzas para lechos en diferentes ubicaciones del corral. Además, en el contexto de la presente forma de realización, el término "muestras de estiércol líquido" se refiere a muestras de excrementos mixtos que contienen heces y orina.
Las calzas que son lo suficientemente absorbentes para absorber la humedad son particularmente adecuadas para recolectar muestras animales combinadas. Los calcetines de gasa tubulares también son aceptables.
La población animal es una bandada de aves. La bandada de aves según la invención es preferentemente de aves de corral. Las aves de corral preferidas según la invención son pollos, pavos, patos y gansos. Las aves de corral se pueden optimizar para producir individuos jóvenes. Este tipo de aves de corral también se conoce como animales progenitores y abuelos. Por consiguiente, los animales progenitores y abuelos preferidos son los pollos de engorde progenitores (o abuelos), los patos progenitores (o abuelos), los pavos progenitores (o abuelos) y los gansos progenitores (o abuelos).
Las aves de corral según la invención también se pueden seleccionar de entre aves de corral domésticas y aves silvestres. Las aves de corral domésticas o aves silvestres preferidas son pavos reales, faisanes, perdices, pintadas, codornices, urogallos, gansos, palomas y cisnes. Otras aves de corral preferidas según la invención son avestruces y loros. Las aves de corral más preferidas según la invención son los pollos de engorde.
Los volúmenes de muestra adecuados son, por ejemplo, de 0,1 a 20 ml, en particular de 0,2 a 10 ml, preferentemente de 0,5 a 5 ml. Las masas de muestra adecuadas son, por ejemplo, de 0,1 a 20 g, en particular de 0,2 a 10 g, preferentemente de 0,5 a 5 g.
Por lo general, las muestras deben tomarse y analizarse semanalmente, diariamente o cada hora. En una forma de realización preferida, las muestras animales se recolectan en días consecutivos. Preferentemente, la recogida de muestras y el análisis de muestras se inician antes del día 14. Por ejemplo, la recogida de muestras y el análisis de muestras se inician diariamente desde el día 1, desde el día 5, desde el día 10 o desde el día 13.
Los genes marcadores netB y cpa pueden aislarse de las muestras animales antes de la cuantificación. El aislamiento de polinucleótidos se puede realizar, por ejemplo, por medio de extracción utilizando el procedimiento de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) o mediante diversos kits comerciales de extracción de ácido nucleico, en los que la lisis celular se realiza mediante lisis química y/o disrupción celular mecánica y el ácido nucleico se captura en matrices de sílice o en perlas magnéticas revestidas de sílice. Los kits de extracción comerciales especializados en material fecal o material duro son especialmente adecuados.
Los genes marcadores pueden detectarse y/o cuantificarse mediante procedimientos comúnmente conocidos tales como secuenciación, hibridación o diversas técnicas de PCR conocidas en la técnica.
En una forma de realización alternativa, los genes marcadores contenidos en la muestra animal pueden cuantificarse directamente, por ejemplo mediante técnicas de PCR, qPCR, secuenciación o hibridación.
Las lesiones intestinales causadas por enteritis necrótica subclínica o clínica se puntuaron utilizando una escala de 0 a 6 [Keyburn et al. (2006) "Alpha toxin of Clostridium perfringens is not an essential virulence factor in necrotic enteritis in chickens", in fecí Immun. 74: 6496-6500]. Según esto, las lesiones en el intestino delgado (duodeno a íleon) se puntuaron de la forma siguiente: puntuación 0 = sin lesiones macroscópicas; 1 = mucosa intestinal congestionada; 2 = pequeña necrosis o ulceración focal (1 -5 focos); 3 = necrosis o ulceración focal (6-15 focos); 4 = necrosis o ulceración focal (16 o más focos); 5 = parches de necrosis de 2-3 cm de largo; 6 = necrosis difusa típica de casos de campo. Las puntuaciones de lesión de 5 a 6 corresponden a enteritis necrótica clínica; las puntuaciones de lesión de 1 a 4 corresponden al estado subclínico.
Los inventores han descubierto que una relación de genes marcadores netB/cpa en muestras de excrementos de aves a un nivel de 0,5 ya muestra rastros de mucosa intestinal congestionada.
En consecuencia, la presente divulgación también proporciona un procedimiento para detectar enteritis necrótica, comprendiendo el procedimiento
a) recolectar una muestra aviar
b) determinar la cantidad de genes marcadores netB y cpa en esta muestra aviar, y
c) determinar la relación de genes marcadores netB/cpa en las muestras aviares,
en el que una relación netB/cpa superior a 0,5 constituye una indicación de enteritis necrótica.
Además, la presente divulgación también proporciona nuevos cebadores y sondas de PCR adecuados para detectar y/o cuantificar los genes marcadores netB y cpa presentes en los excrementos de animales infectados con enteritis necrótica. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sonda (PCR)" se refiere a una secuencia de oligonucleótidos que aumenta la especificidad de la PCR cuantitativa.
Los cebadores y las sondas de oligonucleótidos que se describen a continuación resultaron ser particularmente eficaces. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona oligonucleótidos seleccionados del grupo que consiste en
a) oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con el polinucleótido representado en SEQ ID NO: 3;
b) oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con el polinucleótido representado en SEQ ID NO: 4;
c) oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con el polinucleótido representado en SEQ ID NO: 5;
d) oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con el polinucleótido representado en SEQ ID NO: 6;
e) oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con el polinucleótido representado en SEQ ID NO: 7;
f) oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con el polinucleótido representado en SEQ ID NO: 8;
g) oligonucleótidos que son complementarios a los oligonucleótidos según (a) a (f);
h) oligonucleótidos que comprenden uno cualquiera de los oligonucleótidos según (a) a (g) y están alargados en no más de 5 pares de bases en comparación con los oligonucleótidos según (a) a (g).
De los mismos, el polinucleótido representado en SEQ ID NO: 3 es un cebador de PCR (directo) para detectar netB. El polinucleótido representado en SEQ ID NO: 4 es un cebador de PCR (inverso) para detectar netB. El polinucleótido representado en SEQ ID NO: 5 es una sonda de PCR para detectar netB.
Además, el polinucleótido representado en la SEQ ID NO: 6 es un cebador de PCR (directo) para detectar cpa. El polinucleótido representado en SEQ ID NO: 7 es un cebador de PCR (inverso) para detectar cpa. El polinucleótido representado en SEQ ID NO: 8 es una sonda de PCR para detectar cpa.
Estos oligonucleótidos se utilizan preferentemente como cebadores y/o sondas en uno de los procedimientos descritos anteriormente para detectar enteritis necrótica.
En consecuencia, los oligonucleótidos seleccionados del grupo que consiste en
a) oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con el polinucleótido representado en SEQ ID NO: 3;
b) oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con el polinucleótido representado en SEQ ID NO: 4;
c) oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con el polinucleótido representado en SEQ ID NO: 5;
d) oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con el polinucleótido representado en SEQ ID NO: 6;
e) oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con el polinucleótido representado en SEQ ID NO: 7;
f) oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con el polinucleótido representado en SEQ ID NO: 8;
g) oligonucleótidos que son complementarios a los oligonucleótidos según (a) a (f);
h) oligonucleótidos que comprenden uno cualquiera de los oligonucleótidos según (a) a (g) y están alargados en no más de 5 pares de bases en comparación con los oligonucleótidos según (a) a (g);
se utilizan en el procedimiento descrito anteriormente como cebador de PCR y/o como sonda de PCR.
La presente divulgación también proporciona un kit de diagnóstico para determinar si una población aviar, tal como una manada de aves, padece enteritis necrótica (subclínica) o no. Dicho kit comprende un conjunto de oligonucleótidos para amplificar y/o cuantificar al menos un polinucleótido que codifica al menos uno de los genes marcadores netB y/o cpa. Preferentemente, el kit de diagnóstico comprende cebadores y sondas de PCR tanto para netB como para cpa. El kit puede comprender uno o más oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con uno o más de los polinucleótidos que se muestran en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y/o SEQ ID NO: 8; oligonucleótidos que son complementarios a los oligonucleótidos según SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, s Eq ID NO: 7 y/o SEQ ID NO: 8; oligonucleótidos que comprenden cualquiera de los oligonucleótidos mencionados anteriormente y que están alargados en no más de 5 pares de bases en comparación con los oligonucleótidos según SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y/o SEQ ID NO: 8. Preferentemente, el kit comprende al menos dos cebadores o al menos cuatro cebadores. Es particularmente preferido un kit que comprende dos cebadores y una sonda o un kit que comprende cebadores y dos sondas. El kit puede comprender además soluciones tampón, tales como tampón de PCR; sales de magnesia; trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP). El kit también puede incluir elementos tales como tubos de recogida de muestras, reactivos para aislar los ácidos nucleicos y/o instrucciones para su uso.
Además de lo anterior, los presentes inventores han descubierto inesperadamente que un mayor nivel de gen marcador netB, homólogos y fragmentos del mismo, en comparación con un control no infectado y un aumento en el nivel de netB con el tiempo, respectivamente, es una indicación de enteritis necrótica.
En consecuencia, la presente divulgación también se refiere a un procedimiento para detectar enteritis necrótica aviar, comprendiendo el procedimiento
a) recolectar muestras de excrementos de un ave específica o de una población aviar específica en puntos temporales consecutivos; y
b) realizar un seguimiento del nivel del gen marcador netB y/o homólogos y fragmentos del mismo en estas muestras;
en el que un aumento en el nivel del gen marcador constituye una indicación de enteritis necrótica aviar.
En un aspecto preferido del procedimiento mencionado anteriormente, la presente divulgación también se refiere a un procedimiento para detectar enteritis necrótica aviar, comprendiendo el procedimiento
a) recolectar muestras de excrementos de un ave específica o de una población aviar específica en puntos temporales consecutivos; y
b) realizar un seguimiento del nivel del gen marcador netB en estas muestras;
en el que un aumento en el nivel de netB constituye un indicio de enteritis necrótica aviar.
En ese sentido y de acuerdo con el entendimiento común, se debe considerar relevante un aumento de alrededor de 0,2 a 0,3 log (es decir, factor dos a cinco).
Los inventores han descubierto que una cantidad de netB de al menos 107 copias/g de heces constituye un indicio de enteritis necrótica.
En consecuencia, la presente divulgación también se refiere a un procedimiento para detectar enteritis necrótica aviar, comprendiendo el procedimiento
a) recolectar muestras de excrementos de un ave específica o de una población aviar específica en puntos temporales consecutivos; y
b) realizar un seguimiento del nivel del gen marcador netB en estas muestras;
en el que una cantidad de netB de al menos 107 copias/g de heces constituye un indicio de enteritis necrótica.
Los procedimientos anteriores son adecuados para detectar estados tanto clínicos como subclínicos/latentes de enteritis necrótica.
Sorprendentemente, los inventores también han descubierto que la cantidad del gen marcador netB se correlaciona con la magnitud de las lesiones intestinales del sujeto aviar correspondiente y, por tanto, con el grado de enteritis necrótica. En consecuencia, la presente divulgación también se refiere a un procedimiento para determinar el grado de enteritis necrótica aviar, comprendiendo el procedimiento determinar la cantidad de gen marcador netB y/o homólogos y fragmentos del mismo, en muestras de excrementos aviares, en el que la cantidad de dicho gen marcador indica el grado de enteritis necrótica.
En los procedimientos anteriores, los cebadores y sondas de oligonucleótidos descritos a continuación resultaron ser particularmente eficaces.
En consecuencia, los oligonucleótidos seleccionados del grupo que consiste en
a) oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con el polinucleótido representado en SEQ ID NO:3;
b) oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con el polinucleótido representado en SEQ ID NO: 4;
c) oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con el polinucleótido representado en SEQ ID NO: 5;
d) oligonucleótidos que son complementarios a los oligonucleótidos (a) a (c);
e) oligonucleótidos que comprenden uno cualquiera de los oligonucleótidos según (a) a (d) y están alargados en no más de 5 pares de bases en comparación con los oligonucleótidos según (a) a (d);
pueden utilizarse en uno de los procedimientos descritos anteriormente para detectar enteritis necrótica aviar como cebador de PCR y/o como sonda de PCR para detectar netB.
El polinucleótido tal como se representa en SEQ ID NO: 3 es un cebador de PCR (directo) para detectar netB. El polinucleótido representado en SEQ ID NO: 4 es un cebador de PCR (inverso) para detectar netB. El polinucleótido representado en SEQ ID NO: 5 es una sonda de PCR para detectar netB.
La presente divulgación proporciona además un kit de diagnóstico para determinar si una población aviar, tal como una bandada de aves, padece enteritis necrótica (subclínica) o no. Dicho kit comprende un conjunto de oligonucleótidos para amplificar y/o cuantificar el polinucleótido que codifica el gen marcador netB. En una forma de realización preferida, el kit comprende uno o más oligonucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferentemente al menos el 85, 90 o 95%, de la forma más preferida el 100%, con uno o más de los polinucleótidos tal como se representan en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4 y/o SEQ ID NO:5; oligonucleótidos que son complementarios a los oligonucleótidos según SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 y/o SEQ ID NO:5; oligonucleótidos que comprenden cualquiera de los oligonucleótidos mencionados anteriormente y que están alargados no más de 5 pares de bases en comparación con los oligonucleótidos según SEQ ID n O:3, SEQ ID NO:4 y/o SEQ ID NO:5. Preferentemente, el kit comprende dos cebadores. Se prefiere particularmente un kit que comprende dos cebadores y una sonda. El kit puede comprender además soluciones tampón, tales como tampón de PCR; sales de magnesio;
trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP). El kit también puede incluir elementos tales como tubos de recogida de muestras, reactivos para aislar los ácidos nucleicos y/o instrucciones para su uso.
La presente invención proporciona los procedimientos no invasivos descritos anteriormente para detectar enteritis necrótica aviar y para determinar el grado de enteritis necrótica que se pueden realizar ante mortem. Esto permite al granjero tratar eficazmente a la población aviar que padece enteritis necrótica, si es necesario, posteriormente, después de haber realizado el ensayo mencionado anteriormente. Como alternativa o adicionalmente, el agricultor también puede administrar sustancias promotoras de la salud, tales como aditivos zootécnicos para piensos.
Preferentemente, el agente terapéutico o la sustancia promotora de la salud se selecciona del grupo que consiste en agentes antibióticos, agentes probióticos, agentes prebióticos, ácidos orgánicos/grasos, bacteriófagos y enzimas bacteriolíticas.
De acuerdo con ello, la presente divulgación también se refiere a agentes antibióticos para su uso en el tratamiento de la enteritis necrótica, en los que la enteritis necrótica se detecta o se evalúa realizando uno de los procedimientos indicados anteriormente. Además, la presente divulgación se refiere al uso de agentes probióticos, agentes prebióticos, ácidos orgánicos/grasos, bacteriófagos y enzimas bacteriolíticas para mejorar el estado de salud de un animal o una población animal.
Las aplicaciones de los procedimientos según la invención son, por ejemplo, (i) ayudar en el diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades inducidas por C. perfringens, tales como enteritis necrótica aviar, (ii) realizar un seguimiento del progreso o de la recurrencia de estas enfermedades, (iii) ayudar en la evaluación de la eficacia del tratamiento para una población animal en tratamiento o para la que se contempla el tratamiento, o (iv) controlar la eficacia (terapéutica) de la vacunación contra enfermedades inducidas por C. perfringens.
Las aplicaciones de la invención en particular ayudan a evitar pérdidas en el rendimiento animal, tal como el aumento de peso y la conversión alimenticia.
A continuación, la invención se ilustra mediante ejemplos no limitantes y formas de realización de ejemplo.
Ejemplos
1. Modelo in vivo
Se utilizó un modelo subclínico in vivo para enteritis necrótica. En este modelo, se agruparon pollos de engorde Ross 308 (hembras y machos) a 27 aves por grupo. Se alimentaron con una dieta a base de trigo/centeno (43%/7,5%), con harina de soja como fuente de proteína hasta el día 16. A partir del día 17, la harina de soja se reemplazó por harina de pescado (30%) como fuente de proteína. Los días 4 y 9, se inoculó a los pollos de engorde por vía oral Poulvac Bursa Plus (Zoetis) como inmunosupresor. Los días 14 y 16, se inoculó a los pollos de engorde por vía oral una dosis diez veces mayor de Hipracox.
Las aves de 5 grupos (P.A - P.E) se desafiaron tres veces al día por vía oral con aproximadamente 4 x 108 ufc de bacterias C. perfringens (cultivo logarítmico tardío) netB-positivas, patógenas (Cp56) durante dos días consecutivos (día 18 y 19). Dos grupos de aves (P.F y P.G) se desafiaron solo una vez al día, para inducir lesiones necróticas más leves que los grupos anteriores desafiados tres veces al día.
Los pollos se desafiaron durante dos días consecutivos. Todos los animales se sacrificaron el día 20. Las lesiones intestinales en el intestino delgado (duodeno a íleon) se puntuaron de la forma siguiente: 0 = sin lesiones macroscópicas; 1 = mucosa intestinal congestionada; 2 = pequeña necrosis o ulceración focal (1-5 focos); 3 = necrosis o ulceración focal (6-15 focos); 4 = necrosis o ulceración focal (16 o más focos); 5 = parches de necrosis de 2-3 cm de largo; 6 = necrosis difusa típica de casos de campo. Las aves de control no infectadas se trataron de la misma manera exceptuando la inoculación con C. perfringens. A estas aves de control se les inoculó medio de crecimiento bacteriano estéril (caldo BHI).
Ninguna de las aves de control negativo, que recibieron medio bacteriano estéril (BHI) en lugar del cultivo de C. perfringens patógeno desarrolló enteritis necrótica. También las aves desafiadas con una cepa no patógena de C. perfringens se encontraban desprovistas de lesiones necróticas. En los otros grupos, desafiados con patógenos Cp56, la mayor parte de las aves desarrollaron enteritis necrótica, mostrando una gran cantidad de aves lesiones graves.
esumen e mo eo n vvo:
Se recolectaron muestras cloacales frescas (es decir, muestras de animales individuales) inmediatamente después de su muerte y se congelaron instantáneamente en N2 líquido antes de su almacenamiento a -80 2C.
Muestras cloacales de animales individualizados:
- Aves infectadas (diferentes puntuaciones de lesiones)
- Grupos de control no infectados
- Aves a las que se inoculó C. perfringens nefB-negativo
Se recolectaron muestras del lecho (= excrementos fecales mezclados en el corral, es decir, muestras combinadas de la manada de aves) de cada grupo utilizando el procedimiento de cubrezapatos (solo el día 19) y usando pinzas para lecho en 5 lugares diferentes del corral desde el día anterior a la inoculación (día 17) hasta el día 19.
Tipos y cantidades de muestras recolectadas:
Las muestras de cubrezapatos se recolectaron solo el día 19. Las muestras del lecho se recolectaron del día 17 hasta el día 19. Las muestras se homogeneizaron y se dividieron en tres porciones.
2. Extracción y cuantificación de ADN
Se extrajo ADN de las muestras utilizando el procedimiento CTAB. Por lo tanto, se utilizaron como material de partida 100 mg de material cloacal y 200 mg de muestra de pinza para lecho o de cubrezapatos. El ADN total se eluyó en 100 gl de agua. La concentración de ADN se determinó con un espectrofotómetro Nanodrop ND 1000 (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, Estados Unidos) y se ajustó a una concentración final de 50 ng/gl.
La qPCR se realizó usando la mezcla maestra SYBR-green 2x (Bioline, Bruselas, Bélgica) en un sistema Bio-Rad CFX-384. Cada reacción se realizó por triplicado en una mezcla de reacción total de 12 gl utilizando 2 gl de la muestra
de ADN y una concentración final de cebador qPCR 0,5 μM. Las condiciones de qPCR utilizadas fueron las mismas para ambos genes: 1 ciclo de 95 °C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s, y aumento gradual de la temperatura de 65 °C a 95 °C (a 10 s/0,5 °C). Se analizaron los datos de la curva de fusión para confirmar la especificidad de la reacción. Para la construcción de la curva patrón, se generó el producto de PCR utilizando los cebadores PCR patrón que se enumeran a continuación y el ADN de lacepa CP56 de C. perfringens. Después de la purificación (MSB Spin PCRapace, Stratec Molecular, Berlín, Alemania) y la determinación de la concentración de ADN. La concentración del patrón de ADNbc lineal se ajustó a 1 x 107 hasta 1 x 101 copias por μl, variando cada etapa en 10 veces. Los números de copias de las muestras se determinaron leyendo la serie patrón con los valores Ct de las muestras.
El límite de detección de la técnica qPCR depende de la concentración de ADN obtenida después de la extracción de CTAB y fue de aproximadamente 105 copias génicas/g de material.
Cebadores utilizados en el ensayo de PCR:
3. Ensayo conjunto: correlación de la cantidad de genes marcadores en muestras cloacales de animales individualizados
En estos ejemplos, se investigaron las muestras cloacales mencionadas anteriormente.
En el día de la necropsia, el gen de la alfa-toxina (cpa) estuvo presente en las muestras cloacales de todos los grupos (tanto aves no infectadas como infectadas) y también el gen netB estaba presente en todas las muestras cloacales.
3.1 Correlación de la cantidad de netB con la puntuación de lesión
Solo en muestras cloacales de aves desafiadas con una cepa de C. perfringens, patógena, netB positiva, la señal de netB media es superior a 107 copias/g de heces.
Este ejemplo muestra que la cantidad de gen netB en las muestras analizadas se correlaciona directamente con la puntuación de la lesión intestinal del ave analizada, es decir, con el grado de enteritis necrótica del ave infectada. La correlación entre las puntuaciones de lesión de las aves infectadas con la cepa de C. perfringens patógena y la cantidad de genes (netB/cpa) presente en las heces se calculó mediante correlación de Spearman. El valor r de Spearman puede variar de 0 a 1: r = 1 ^ correlación perfecta, r = 0 ^ sin correlación. La presencia de todos los genes analizados muestra una correlación con la gravedad de la enfermedad, siendo la correlación más alta con el gen netB.
, , , , , ,
Cálculo de Spearm an:
La correlación de Spearman proporciona una prueba matemática sobre la correlación entre la cantidad de netB en la muestra cloacal y el grado de enteritis necrótica.
3.2 Correlación de la relación netB/cpa con la puntuación de la lesión
Se investigó la relación de gen netB frente al gen cpa en las muestras cloacales de aves no infectadas (BHI), aves desafiadas con la cepa no patógena (no pat.) y aves desafiadas con la cepa de C. perfringens patógena.
Las aves mostraron diferentes grados de gravedad de la enfermedad (puntuación de 0 a puntuación de 5 a 6):
4. Ensayos combinados: control de la cantidad de genes marcadores en muestras de excrementos de la población aviar a lo largo del tiempo.
En estos ejemplos, se investigaron las muestras del lecho indicadas anteriormente.
4.1 Seguimiento de la cantidad de netB a lo largo del tiempo
Se descubrió que la cantidad de gen netB en las muestras del lecho aumentaron significativamente a partir del día siguiente al día de la inoculación (día 18) con la cepa de C. perfringens patógena:
4.2 Seguimiento de la relación netB/cpa a lo largo del tiempo
Se descubrió que la relación de gen netBcon respecto a gen cpa en las muestras del lecho recolectadas en los días 17 a 19 aumentó significativamente a partir del día siguiente al día de la inoculación (día 18) con la cepa de C. perfringens patógena:
Los experimentos anteriores muestran que un aumento en la cantidad de gen netB y en la relación de genes netBIcpa, respectivamente, en muestras combinadas de excrementos de animales recolectadas en momentos determinados consecutivos, se correlaciona con el desarrollo o la progresión de la enteritis necrótica. Con ello, se demuestra que los procedimientos de la presente invención permiten una evaluación del estado de salud de una manada de animales completa con respecto a enfermedades inducidas por C. perfringens.
Claims (12)
1. Procedimiento de detección de enfermedades inducidas por C. perfringens en una bandada de aves, comprendiendo el procedimiento:
a) recolectar material de muestra de la bandada de aves en momentos determinados consecutivos;
b) determinar la cantidad de un primer marcador y un segundo marcador contenidos en el material de muestra y c) determinar la relación del primer marcador con respecto al segundo marcador contenidos en el material de muestra;
en el que el primer marcador comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para las subespecies de C. perfringens que inducen la enfermedad diana;
y el segundo marcador comprende un polinucleótido que es específico para la especie C. perfringens; y en el que un aumento en la relación del primer marcador con respecto al segundo marcador en el material de muestra analizado a lo largo del tiempo es una indicación de la enfermedad diana.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el primer marcador es un gen marcador que codifica una toxina específica o una isla de patogenicidad.
3. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer marcador está ubicado en un plásmido de toxina de C. perfringens y el segundo marcador está ubicado en el cromosoma de C. perfringens.
4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer marcador se selecciona del grupo que consiste en cpe, toxina beta (cpb), toxina beta2 (cpb2), toxina épsilon (etx), ne tF y netB y homólogos y fragmentos de los mismos.
5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el segundo marcador es cpa.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el material de muestra es una muestra combinada seleccionada del grupo que consiste en muestras de polvo, muestras del lecho, muestras de estiércol líquido, muestras de pelo, muestras de plumas, muestras de piel y muestras de excrementos corporales y soluciones o suspensiones de los mismos.
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el material de muestra son heces combinadas.
8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la masa de la muestra es de 0,1 g a 20 g.
9. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las muestras se toman y se analizan semanalmente, diariamente o cada hora, preferentemente en días consecutivos.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los genes marcadores contenidos en el material de muestra se detectan y se cuantifican mediante PCR, preferentemente mediante qPCR.
11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la enfermedad inducida por C. perfringens se encuentra en estado subclínico o latente.
12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la enfermedad inducida por C. perfringens es enteritis necrótica, preferentemente en estado subclínico o latente.
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