ES2938734T3 - Procedimiento para la fabricación de análogos de GLP-1 - Google Patents
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Abstract
La presente invención proporciona un proceso para la fabricación de análogos de GLP-1 con alto rendimiento y pureza por condensación de fragmentos en fase sólida. En particular, describe una síntesis convergente por condensación de un fragmento A de pseudoprolina C-terminal con un fragmento B unido a un soporte sólido, seguida de desprotección y escisión del soporte y purificación final para producir el péptido deseado. La invención proporciona además productos intermedios útiles en el proceso de fabricación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la fabricación de análogos de GLP-1
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la síntesis de péptidos. En particular, se refiere a procedimientos para la fabricación de análogos de GLP-1. Más en particular, la presente invención se refiere a un procedimiento para la fabricación de liraglutida y semaglutida mediante condensación de fragmentos peptídicos.
Antecedentes de la invención
El péptido similar al glucagón-1 (GLP-1) es una hormona peptídica que se produce de manera natural con una de las actividades insulinotrópicas más potentes. GLP-1 forma parte de un péptido más largo producido y procesado para dar GLP-1 en el páncreas y el intestino. Los agonistas del receptor del péptido similar al glucagón-1 (GLP-1), o análogos de GLP-1, son un grupo relativamente nuevo de fármacos inyectables para el tratamiento de la diabetes tipo 2. Una de sus ventajas con respecto a los secretagogos de insulina más antiguos, tales como las sulfonilureas o las meglitinidas, es que tienen un menor riesgo de provocar hipoglucemia.
La liraglutida y la semaglutida son ambos péptidos altamente similares de 30 aminoácidos de longitud, que difieren sólo en el aminoácido en la posición 2 (aa2 , que es alanina, Ala, en liraglutida y ácido a -aminoisobutírico, Aib, en semaglutida) y en la cadena lateral unida a la lisina en la posición 20 (Lys20), es decir, el resto de unión a albúmina lipófilo. Unido al grupo s-amino de tal lisina, la liraglutida tiene un ácido palmítico espaciado con Glu (indicado como Pal-Glu), mientras que la semaglutida porta un ácido glutámico-octadecanoico acilado más un espaciador adicional. La liraglutida y la semaglutida se representan mediante el uso del “código de tres letras” para aminoácidos/péptidos, según lo siguiente:
1 5 10 15 20
His-Xi-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-25 30 31
Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly
en el que la numeración de residuos de aminoácido comienza con 1, lo que indica histidina N-terminal, y acaba con 31, lo que indica glicina C-terminal,
y en el que
en liraglutida (SEQ ID NO: 1)
X1 es Ala y
X2 es N-(1-oxohexadecil)-L-y-glutamilo (también indicado como Pal-Glu), representado aquí a continuación
y
en semaglutida (SEQ ID NO: 2)
X1 es Aib (ácido a -aminoisobutírico) y
X2 es N-(17-carboxi-1 -oxoheptadecil)-L-y-glutamil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetilo, representado aquí a continuación
y en el que X2 se une al grupo s-amino de Lys20 a través del enlace amida cuando se indica por Alternativamente, los dos péptidos anteriores, o cualquier fragmento de los mismos, se representan a lo largo de la presente solicitud mediante el uso del “código de una letra” para aminoácidos/péptidos, según la fórmula I:
HX1EGTFTSDVSSYLEGQAAK(X2)EFIAWLVRGRG (I)
en el que X1 y X2 son tal como se definieron anteriormente, respectivamente.
En una opción adicional, los dos péptidos anteriores, o cualquier fragmento de los mismos, se representan a lo largo de la presente solicitud mediante el uso de su estructura química.
A continuación en el presente documento, también se harán referencia a los fragmentos por sus posiciones correspondientes en la secuencia mencionada anteriormente. Por ejemplo, un “fragmento (1-16)” se refiere a la secuencia peptídica que consiste en los aminoácidos presentes en la secuencia anterior en las posiciones 1 a 16. La preparación de análogos de GLP-1 se ha descrito en varias solicitudes de patente. Se siguieron enfoques tanto basados en SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) secuencial como basados en fragmentos. Cabe señalar que la estructura ramificada de liraglutida y semaglutida y su baja solubilidad acuosa impiden drásticamente su síntesis y purificación.
En una síntesis de péptidos basada en fragmentos, el grupo carboxílico C-terminal de uno de los dos fragmentos que reaccionan debe activarse antes del acoplamiento. Sin embargo, la activación de los grupos carboxílicos C-terminales de los fragmentos peptídicos puede conducir a la formación de éster activado y oxazolona, que pueden racemizarse fácilmente en las condiciones básicas durante el acoplamiento (N. L. Benoiton. Chemistry of Peptide Synthesis. Tailor and Francis Group. 2006). Por tanto, los péptidos en bruto así obtenidos contienen impurezas correspondientes al producto isomerizado. Dado que las impurezas isoméricas tienen tiempos de retención muy similares a los del péptido diana requerido, es muy difícil separar estas impurezas de dicho péptido. Una forma de abordar este problema fue dividir la secuencia peptídica de los análogos de GLP-1 en posiciones Gly4 y/o Gly16 y acoplar los fragmentos en una etapa final (tal como se da a conocer, por ejemplo, en los documentos CN104004083 y WO2016046753).
Sin embargo, la solubilidad extremadamente baja del fragmento protegido (1-16) en los disolventes comúnmente usados en la síntesis de péptidos hace que el acoplamiento final con el fragmento (1-16) fragmento (17-31) de esquema sea muy difícil, especialmente cuando el fragmento C-terminal (es decir, el fragmento (17-31)) se inmoviliza sobre un soporte sólido.
Además, los péptidos largos como la liraglutida y la semaglutida son propensos a la agregación intermolecular de las cadenas peptídicas. Este problema, junto con el plegamiento de péptidos intramolecular, es particularmente grave durante la síntesis de péptidos, disminuyendo la eficiencia de los acoplamientos y desprotecciones de aminoácidos, dando lugar a la formación de muchos productos secundarios o incluso a la imposibilidad de obtener el péptido diana. El documento WO 2017/127007 da a conocer un procedimiento para la preparación de liraglutida, en el que un fragmento protegido que comprende un dipéptido de pseudoprolina interno se acopla a un fragmento de liraglutida protegido.
Por tanto, sigue existiendo la necesidad de desarrollar un procedimiento eficaz, simple e industrialmente viable para preparar liraglutida y semaglutida. Por tanto, es muy deseable un procedimiento mejorado para superar los problemas de síntesis no resueltos por la técnica anterior y para proporcionar ambos péptidos con alto rendimiento y con un perfil de impurezas favorable.
En el presente documento se describe una síntesis en fase sólida nueva y mejorada de liraglutida y semaglutida que hace uso de un enfoque convergente que implica una etapa final de acoplamiento de fragmentos, en la que el fragmento A N-terminal tiene una pseudoprolina en el sitio reactivo C-terminal, según el esquema general 1:
fragmento A - pseudoprolina -COOH N H ?-fragmento B - soporte sólido
péptido final
En particular, se diseña una estrategia en la que el fragmento de pseudoprolina N-terminal protegido (o fragmento A) se prepara mediante SPPS y luego se escinde del soporte sólido, mientras se mantienen las protecciones de cadenas laterales y el grupo a -amino, y el fragmento C-terminal soportado sobre el sólido (o fragmento B) se prepara mediante SPPS o CSPPS (SPPS convergente) y sólo se desprotege su grupo a -amino antes del acoplamiento del fragmento final. El péptido secuenciado completo finalmente se escinde del soporte sólido y se desprotege, y opcionalmente se purifica para obtener liraglutida o semaglutida pura, respectivamente. Sorprendentemente, se encontró que el uso de pseudoprolina en el extremo C-terminal en el presente enfoque basado en fragmentos reduce eficazmente la formación de impurezas de modo que el péptido en bruto obtenido pueda purificarse más fácilmente para dar el péptido final con un alto rendimiento total.
Objeto de la invención
Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento en fase sólida mejorado para la preparación de análogos de g LP-1, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, que dé como resultado péptidos en bruto con un alto rendimiento y un buen perfil de impurezas, facilitando la purificación final.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento eficaz, simple e industrialmente viable para preparar liraglutida y semaglutida.
Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un procedimiento para preparar liraglutida y semaglutida con mayor rendimiento y pureza que los logrados en el estado de la técnica.
Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar productos intermedios peptídicos útiles para la síntesis de liraglutida o semaglutida, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un método convergente para la preparación de algunos análogos de GLP-1 en síntesis en fase sólida, que comprende la etapa final de acoplar un primer fragmento peptídico N-terminal protegido caracterizado por tener una pseudoprolina en el sitio reactivo C-terminal (fragmento A de pseudoprolina N-terminal protegido), con un segundo fragmento peptídico C-terminal protegido (fragmento B) unido a un soporte sólido.
El fragmento A tiene un sitio reactivo de pseudoprolina C-terminal y está protegido en su grupo a -amino N-terminal. El fragmento A está protegido preferiblemente en sus cadenas laterales de aminoácidos.
El fragmento A se selecciona del grupo que consiste en:
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(y z’zpro),
denominado fragmento A (1-8) o SEQ ID NO: 3,
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(^ zzpro),
denominado fragmento A (1-11) o SEQ ID NO: 4,
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser(^ zzpro),
denominado fragmento A (1-12) o SEQ ID NO: 5,
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr(^ zzpro),
denominado fragmento A (1-7) o SEQ ID NO: 6,
y
His-Xi-Glu-Gly-Thr(^z’zpro), denominado fragmento A (1-5) o SEQ ID NO: 7,
en los que X1 es Ala para liraglutida y Aib para semaglutida, y
en los que aa(^zzpro) indica que el aminoácido C-terminal (aa), preferiblemente Ser o Thr, está protegido con pseudoprolina, según la siguiente fórmula:
en la que
Y es hidrógeno para Ser y metilo (Me) para Thr,
Z es hidrógeno o metilo (Me), y
R1 es la cadena lateral del aminoácido al lado del aminoácido protegido con pseudoprolina.
La anotación de número de fragmento entre paréntesis, por ejemplo, (1-8), simplemente indica la posición del fragmento con respecto a la secuencia peptídica completa.
Por tanto, por ejemplo, aa-Ser(^Me'Mepro) indica:
en la que R1 es la cadena lateral de aa, y
Thr-Ser(^zzpro) en el fragmento A (1-8) tal como se definió anteriormente indica:
en la que Z es tal como se definió anteriormente.
La estereoquímica no se define en las estructuras anteriores por simplicidad. Siempre se usan L-aminoácidos si no se indica lo contrario.
El fragmento B está unido a una resina, o soporte sólido, en su aminoácido C-terminal, es decir, glicina 31 (Gly31). El soporte sólido se selecciona preferiblemente de resina de Wang, resina de cloruro de 2-clorotritilo (CTC), resina de cloruro de tritilo, resina de m Bh y de 4-MeO-MBH. El soporte sólido se selecciona más preferiblemente de resina de Wang, resina de cloruro de 2-clorotritilo (CTC) y resina de cloruro de tritilo. El fragmento B está protegido preferiblemente en sus cadenas laterales de aminoácidos, incluyendo el resto X2 de Lys20.
El fragmento B se selecciona del grupo que consiste en
Asp-Val-Ser-Ser-Try-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina, denominado fragmento B (9-31) o SEQ ID NO: 8,
Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina, denominado fragmento B (12-31) o SEQ ID NO: 9,
Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina, denominado fragmento B (13-31) o SEQ ID NO: 10,
Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina, denominado fragmento B (8-31) o s Eq ID NO: 11,
y
Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Glyresina, denominado fragmento B (6-31) o SeQ ID NO: 12,
en los que
X2 es N-(1-oxohexadecil)-L-y-glutamilo (Pal-Glu) para liraglutida, y
X2 es N-(17-carboxi-1-oxoheptadecil)-L-y-glutamil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetilo para semaglutida, opcionalmente protegida.
Se acoplan el fragmento A y el fragmento B, de modo que se obtiene la secuencia completa o bien de liraglutida o bien de semaglutida. El péptido de 30 aa obtenido, preferiblemente con cadena lateral protegida, se desprotege y/o escinde luego del soporte sólido para obtener el péptido en bruto. Tal péptido en bruto se purifica opcionalmente para obtener liraglutida o semaglutida pura. El método de la presente invención proporciona liraglutida y semaglutida con un alto rendimiento y una alta pureza.
Además, la presente invención proporciona los fragmentos intermedios A y B y métodos para su preparación.
Descripción detallada de la invención
La presente invención da a conocer un nuevo método para preparar un análogo de GLP-1 con alto rendimiento y pureza. En particular, consiste en un enfoque convergente sobre la fase sólida. Más en particular, el acoplamiento final involucra un fragmento peptídico (fragmento A) caracterizado por tener una pseudoprolina en el sitio reactivo C-terminal.
Las pseudoprolinas fueron desarrolladas por Mutter en 1992 (T. Haack, M. Mutter, Serine derived oxazolidines as secondary structure disrupting, solubilizing building blocks in peptide synthesis, Tetrahedron Lett. 1992, 33, 1589 1592). Sorprendentemente, se ha descubierto que el uso de pseudoprolina en el extremo C-terminal en el presente enfoque basado en fragmentos reduce eficazmente la cantidad de impurezas formadas, lo que lleva al procedimiento mejorado que es objeto de la presente invención. Tal método reduce sustancialmente la formación de impurezas de modo que el péptido en bruto obtenido puede purificarse fácilmente para dar el péptido final con un alto rendimiento total.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona los fragmentos peptídicos A y B requeridos y el método para prepararlos. Tal síntesis se realiza mediante SPPS convencional o mediante CSPPs , ambos mediante el uso de un sistema de reactivos de acoplamiento.
El término “fragmento peptídico” o “fragmento” describe un péptido con una secuencia de aminoácidos parcial, con referencia a la secuencia de liraglutida o semaglutida. Puede unirse opcionalmente a una resina en su aminoácido C-terminal. Un fragmento peptídico puede estar protegido o no protegido. Un fragmento peptídico puede tener una pseudoprolina en su extremo C-terminal o en una posición interna en la secuencia de aminoácidos.
El término “fragmento peptídico protegido” o “fragmento protegido” describe un fragmento peptídico que puede portar independientemente grupos protectores en sus cadenas laterales de aminoácidos, o grupos laterales, y/o en su grupo a -amino.
Un fragmento, o fragmento peptídico, también puede indicarse con una secuencia de aminoácidos específica, como aa1-aa2-...-aan
en la que aaX es el código de tres letras del aminoácido en la posición x, y en la que no está definida la presencia o no de grupos protectores, o bien en las cadenas laterales o bien en el grupo a -amino. Se conoce en la técnica la necesidad de proteger las cadenas laterales de los aminoácidos durante la síntesis de péptidos en determinadas condiciones y se han descrito diversas estrategias para identificar estrategias de protección adecuadas.
Si en esta descripción para una secuencia de aminoácidos específica (fragmento) los grupos protectores de las cadenas laterales se mencionan específicamente entre paréntesis que acompañan al código de tres letras del aminoácido, se entiende que los aminoácidos restantes que se representan con un código de tres letras simple están desprotegidos.
Cuando el fragmento se indica con
aa1-aa2-...-aan-OH
se pretende que el aminoácido C-terminal aan tenga un ácido carboxílico libre.
Cuando el fragmento se indica con
H-aa1-aa2-...-aan
se pretende que el aminoácido N-terminal aa1 tenga un grupo a -amino libre.
Cuando el fragmento se indica con
aa1-aa2-...-aan(^z,zpro)-OH
se pretende que el aminoácido C-terminal aan esté protegido con pseudoprolina y tenga un ácido carboxílico libre, según la siguiente estructura:
en la que R1 es la cadena lateral de aa(n-1), y aan(^zzpro)-OH puede ser
Ser(^ zzpro)-OH, en la que Y es hidrógeno, y Z es hidrógeno o Me, o
Thr(^zzpro)-OH, en la que Y es Me, y Z es hidrógeno o Me.
Pseudoprolinas, como dipéptidos con a -amino protegido, están disponibles comercialmente. Por ejemplo, los siguientes dipéptidos de pseudoprolina se usan para llevar a cabo la presente invención:
P-Thr(fBu)-ser(v zzpro)8-OH
P-Val-Ser(^zzpro)11-OH
P-Ser-Ser(^zzpro)12-OH
P-Phe-Thr(^zzpro)7-OH
P-Gly-Thr(^ zzpro)5-OH
en los que P es un grupo protector de a -amino, y Z es tal como se definió anteriormente.
Preferiblemente, los dipéptidos de pseudoprolina usados para llevar a cabo la presente invención se seleccionan del grupo que consiste en:
Fmoc-Thr(fBu)-Ser(V Me'Mepro)8-OH
Fmoc-Thr(tBu)-Ser(y HHpro)8-OH
Fmoc-Val-Ser(y Me’Mepro)11-OH
Fmoc-Val-Ser(^ HHpro)11-OH
Fmoc-Ser(tBu)-Ser(y MeMepro)12-OH
Fmoc-Ser(tBu)-Ser(y HHpro)12-OH
Fmoc-Phe-Thr(y MeMepro)7-OH
Fmoc-Phe-Thr(y HHpro)7-OH
Fmoc-Gly-Thr(^ MeMepro)5-OH y
Fmoc-Gly-Thr(y HHpro)5-OH
La introducción de pseudoprolinas en una secuencia peptídica puede realizarse en fase sólida en condiciones de acoplamiento convencionales. Una vez que el péptido se escinde de la resina por acidólisis, la pseudoprolina se hidroliza, proporcionando los dos aminoácidos nativos correspondientes.
El término “resina” o “soporte sólido” describe un polímero insoluble funcionalizado al que puede unirse un aminoácido o un fragmento peptídico y que es adecuado para la elongación de aminoácidos hasta que se obtiene la secuencia deseada completa.
La SPPS puede definirse como un procedimiento en el que un péptido anclado por su aminoácido C-terminal a una resina se ensambla mediante la adición secuencial de los aminoácidos opcionalmente protegidos que constituyen su secuencia. Comprende cargar un primer aminoácido, o péptido, o dipéptido de pseudoprolina con a -amino protegido tal como se definió anteriormente, en una resina y es seguido por la repetición de una secuencia de etapas denominada ciclo, o etapa de elongación, que consiste en la escisión del grupo protector de a -amino y el acoplamiento del aminoácido protegido subsiguiente.
La formación de un enlace peptídico entre dos aminoácidos, o entre un aminoácido y un fragmento peptídico, o entre dos fragmentos peptídicos, puede implicar dos etapas. En primer lugar, la activación del grupo carboxilo libre durante un tiempo que oscila entre 5 minutos y 2 horas, luego el ataque nucleofílico del grupo amino en el grupo carboxílico activado.
El ciclo puede repetirse secuencialmente hasta que se logre la secuencia deseada del péptido.
Finalmente, se desprotege el péptido y/o se escinde de la resina.
Como referencia para SPPS, véase, por ejemplo, Knud J. Jensen et al. (eds.), Peptide Synthesis and Applications, Methods in Molecular Biology, vol. 1047, Springer Science, 2013.
En un aspecto preferido de la presente invención, se usa una resina sensible a los ácidos. Más preferiblemente, se selecciona de resina de Wang, resina de cloruro de 2-clorotritilo (CTC), resina de cloruro de tritilo, resina de MBH y de 4-MeO-BH. Más preferiblemente, la resina se selecciona de resina de Wang, resina de cloruro de 2-clorotritilo (CTC) y resina de cloruro de tritilo.
Incluso más preferiblemente, se usan las resinas de Wang y MBH para la preparación del fragmento B y, por tanto, están involucradas en el acoplamiento del fragmento A con el fragmento B. Incluso más preferiblemente, se usa la resina de Wang para la preparación del fragmento B y, por tanto, está involucrada en el acoplamiento del fragmento A con el fragmento B.
Preferiblemente, se usa la resina de CTC para la preparación del fragmento A, y el fragmento A se escinde de la resina antes de acoplarse con el fragmento B.
En un aspecto preferido de la presente invención, la carga del primer aminoácido C-terminal en la resina de Wang se lleva a cabo después de hinchar la resina en un disolvente adecuado, preferiblemente DMF, filtrar la resina y añadir a la resina la disolución del aminoácido protegido con un agente activador, tal como una carbodiimida, en presencia de una base, tal como dimetilaminopiridina (DMAP). En caso de usar una resina de cloruro de tritilo, y en particular la resina de CTC, después de hinchar la resina en un disolvente adecuado, preferiblemente DCM, y filtrar la resina, se
añade una disolución del aminoácido protegido con una base orgánica, preferiblemente diisopropiletilamina (DIEA). En un aspecto preferido adicional de la presente invención, para la preparación del fragmento A, la primera etapa es la carga del dipéptido de pseudoprolina adecuado en la resina de CTC, después de hinchar la resina en un disolvente adecuado, preferiblemente DCM.
En un aspecto preferido de la presente invención, después de cargar en la resina el primer aminoácido C-terminal o el dipéptido de pseudoprolina, se realiza una etapa adicional para bloquear los sitios sin reaccionar para evitar secuencias truncadas y cualquier reacción secundaria. Tal etapa a menudo se denomina “tapado”.
El tapado se logra mediante un breve tratamiento de la resina cargada con un gran exceso de un reactivo sin impedimentos altamente reactivo, que se elige según los sitios sin reaccionar que va a taparse. Cuando se usa una resina de Wang, los sitios sin reaccionar son grupos hidroxilo, que preferiblemente se tapan mediante tratamiento con un derivado ácido, tal como un anhídrido, en un medio básico, por ejemplo, con una mezcla de DMF/DIEA/Ac2O, preferiblemente con una composición 17/2/1 v/v/v o con una composición 5/2/1 v/v/v, o con una disolución en DMF al 10% de Ac2O.
Cuando se usa una resina de CTC, los sitios sin reaccionar son cloros, que preferiblemente se tapan mediante tratamiento con un alcohol en un medio básico, por ejemplo, con una mezcla de DCM/DIEA/MeOH, preferiblemente con una composición 17/2/1 v/v/v. Luego, después de lavar con DCM, la resina se trata adicionalmente con mezcla de DCM/DIEA/Ac2O, preferiblemente con una composición 17/2/1 v/v/v, para tapar los grupos hidroxilo posiblemente resultantes de la hidrólisis de cloro.
Como alternativa a la carga del primer aminoácido C-terminal, se usan resinas precargadas en la preparación de fragmentos peptídicos. Estas son resinas de Wang/CTC comercialmente disponibles con L- o D-aminoácidos protegidos con Fmoc unidos. Por consiguiente, por ejemplo, la resina Fmoc-Gly de Wang se usa preferiblemente para la síntesis del fragmento B, y la resina Fmoc-pseudoprolina puede usarse para la síntesis del fragmento A. En un aspecto preferido de la presente invención, la carga del primer aminoácido C-terminal en la resina se determina espectrofotométricamente, tal como se describe, por ejemplo, en Knud J. Jensen et al. (eds.), Peptide Synthesis and Applications, Methods in Molecular Biology, vol. 1047, Springer Science, 2013.
En un aspecto preferido de la presente invención, cada aminoácido puede protegerse en su grupo a -amino y/o en sus grupos funcionales de cadena lateral.
Preferiblemente, el grupo protector de los grupos a -amino de los aminoácidos que se usa para la SPPS es del tipo carbamato. Los grupos protectores más preferidos son el grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), que puede eliminarse en condiciones básicas, y el grupo terc-butiloxicarbonilo (Boc), que puede eliminarse en condiciones ácidas.
Los grupos funcionales de la cadena lateral de los aminoácidos se protegen opcionalmente con grupos que son generalmente estables durante las etapas de acoplamiento y durante la eliminación del grupo protector de a -amino, y que, a su vez, pueden retirarse en condiciones adecuadas. Tales condiciones adecuadas son generalmente opuestas a las condiciones en las que se desprotegen los grupos a -amino. Los grupos protectores de los grupos funcionales de la cadena lateral de los aminoácidos que se usan en la presente divulgación pueden eliminarse generalmente en condiciones ácidas opuestas a las condiciones básicas generalmente usadas para desproteger los grupos protectores Fmoc.
En un aspecto preferido de la presente invención, tales grupos protectores de cadena lateral se especifican por aminoácido individual que se produce en la secuencia de análogo de GLP-1 relevante, tal como sigue:
el grupo arginina (Arg) guanidinio se protege preferiblemente mediante un grupo protector seleccionado del grupo que consiste en metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo (Mtr), 2,2,5,7,8-pentametilcromanil-6-sulfonilo (Pmc) y 2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofuran-5-sulfonilo (Pbf), todos eliminables en condiciones ácidas; más preferiblemente, se usa el grupo Pbf;
el grupo hidroxilo de serina (Ser), treonina (Thr) o tirosina (Tyr) se protege preferiblemente mediante un grupo seleccionado del grupo que consiste en tritilo (Trt), terc-butildimetilsililo (TBDMS) y terc-butilo (tBu); más preferiblemente, se usa el grupo tBu;
el grupo carboxílico de ácido glutámico (Glu) o aspártico (Asp) se protege preferiblemente mediante un grupo seleccionado del grupo que consiste en 2-fenilisopropilo (2-Phi-Pr), éster tBu, éster bencílico (OBzl), éster alílico (OAII); más preferiblemente, se usa el éster tBu;
el nitrógeno de indol de triptófano (Trp) se protege preferiblemente mediante un grupo seleccionado del grupo que consiste en terc-butiloxicarbonilo (Boc), formilo (For); más preferiblemente, se usa el grupo terc-butiloxicarbonilo (Boc);
el nitrógeno de imidazol de histidina (His) se protege preferiblemente mediante un grupo seleccionado del grupo que consiste en ferc-butiloxicarbonilo (Boc), monometoxitritilo (Mmt), 3-metoxibenciloximetilo (MBom), 2-clorotritilo (Clt), tritilo (Trt); más preferiblemente, se usa el grupo tritilo (Trt).
Se usan generalmente L-aminoácidos protegidos comercialmente disponibles. En cuanto a la introducción del resto de unión a albúmina lipófilo X2 en Lys20, en la preparación de liraglutida se usa el Fmoc-Lys(Pal-Glu-OfBu)-OH disponible comercialmente representado aquí a continuación:
En la preparación de semaglutida, se usa el derivado de lisina protegido representado aquí a continuación:
Tal derivado está disponible comercialmente, y su preparación también se describe, por ejemplo, en el documento CN104356224. Tal derivado también se indica como Fmoc-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-OH, en la que AEEA representa 2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetilo.
Los grupos protectores de ésteres tBu de los bloques de construcción del resto X2 son todos eliminables en condiciones ácidas y, por tanto, se escinden al final del procedimiento de preparación.
En un aspecto preferido de la presente invención, las etapas de acoplamiento se realizan en presencia de un reactivo de acoplamiento.
Preferiblemente, el reactivo de acoplamiento se selecciona del grupo que consiste en N-hidroxisuccinimida (NHS), N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC), N,N’-diciclohexilcarbodiimida (DCC), hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfonio (PyBOP), hexafluorofosfato de 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU), hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU) y etildimetilaminopropilocarbodiimida (EDC). Más preferiblemente, la reacción se lleva a cabo en presencia de N,N’-diisopropilcarbodiimida.
En un aspecto preferido de la presente invención, las etapas de acoplamiento se realizan también en presencia de un aditivo. La presencia de un aditivo, cuando se usa en la reacción de acoplamiento, reduce la pérdida de configuración en el residuo de ácido carboxílico, aumenta las tasas de acoplamiento y reduce el riesgo de racemización.
Preferiblemente, el aditivo se selecciona del grupo que consiste en 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), N-óxido de 2-hidroxipiridina, N-hidroxisuccinimida (NHS), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt), endo-N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxamida, 5-(hidroxiimino)1,3-dimetilpirimidina-2,4,6-(1H,3H,5H)-triona (Oxyma-B) y 2-ciano-2-hidroxiiminoacetato de etilo (OxymaPure). Más preferiblemente, el aditivo se selecciona del grupo que consiste en 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), N-óxido de 2-hidroxipiridina, N-hidroxisuccinimida (NHS), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt), endo-N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxamida, y 2-ciano-2-hidroxiimino-acetato de etilo (OxymaPure). Incluso más preferiblemente, la reacción se lleva a cabo en presencia de 2-ciano-2-hidroxiimino-acetato.
En un aspecto preferido, las etapas de acoplamiento se realizan en presencia de un detergente. Los detergentes preferidos para el acoplamiento de fragmentos según la síntesis descrita son detergentes no iónicos, por ejemplo, Triton X-100 (también denominado TX-100 o terc-octilfenil éter de polietilenglicol) o Tween 20, y lo más preferiblemente Triton X-100. Por ejemplo, se usa TX-100 como disolución al 1% en DMF:DCM 50:50 v/v.
En un aspecto preferido de la presente invención, las etapas de acoplamiento se realizan en un disolvente seleccionado del grupo que consiste en DMF, DCM, t Hf , NMP, DMA o mezclas de los mismos. Más preferiblemente, el acoplamiento se lleva a cabo en DMF cuando se usa una resina de Wang, y se lleva a cabo en DCM cuando se usa una resina de CTC.
En un aspecto preferido de la presente invención, las etapas de acoplamiento se llevan a cabo a una temperatura que puede variar en el intervalo de 10-70°C. Preferiblemente, la temperatura varía en el intervalo de desde temperatura ambiente (es decir, 20°C) hasta 50°C, más preferiblemente la temperatura varía en el intervalo de 35-45°C, incluso más preferiblemente la etapa de acoplamiento se lleva a cabo a 40°C.
En un aspecto preferido de la presente invención, los grupos protectores de a -amino se escinden en condiciones básicas. En particular, el grupo protector Fmoc se escinde mediante tratamiento con una amina secundaria adecuada seleccionada del grupo que consiste en piperidina, pirrolidina, piperazina y DBU, preferiblemente piperidina. Más preferiblemente, se lleva a cabo desprotección de Fmoc usando una disolución al 20% de piperidina en DMF.
En otro aspecto preferido de la presente invención, los grupos protectores de a -amino se escinden en condiciones ácidas. En particular, el grupo protector Boc se escinde mediante tratamiento con una disolución ácida fuerte, por ejemplo, con ácido trifluoroacético (TFA), ácido clorhídrico (HCI) o ácido fosfórico (H3PO4). Más preferiblemente, se lleva a cabo desprotección de Boc durante la escisión del péptido o fragmento peptídico de la resina mediante tratamiento con una mezcla basada en TFA, que se selecciona según el tipo de resina. Por ejemplo, se usa una mezcla de TFA/agua/fenol/TIS (v/v/v/v 88/5/5/2) para una resina de Wang, en la que TIS es un eliminador, tal como también se describe a continuación.
En un aspecto preferido de la presente invención, una vez que el fragmento peptídico o péptido final deseado se ha obtenido según SPPS o CSPPS tal como se describió anteriormente y se une a su soporte sólido, se realiza la desprotección y/o escisión final de tal soporte sólido. Preferiblemente, tal etapa se realiza usando una mezcla específica individualizada para la resina usada, en condiciones ácidas o ligeramente ácidas.
Cuando se usa una resina de CTC, la etapa de escisión se realiza preferiblemente mediante tratamiento usando una mezcla de HFIP:DCM (30:70 v/v) o disolución de TFA al 1-2% v/v en DCM. En particular, cuando se usa una resina de CTC en la preparación del fragmento A u otro fragmento, tal escisión no elimina el grupo protector de a -amino ni los grupos protectores de cadena lateral, dando, por tanto, un fragmento completamente protegido, listo para reaccionar en su ácido carboxílico C-terminal libre.
Cuando se usa una resina de Wang, el tratamiento con una mezcla de escisión, que comprende TFA y eliminadores, proporciona tanto la desprotección de cadenas laterales, incluyendo desprotección del resto X2, como la escisión de la resina. En particular, cuando se usa una resina de Wang en la preparación del fragmento B, la escisión final produce el análogo de GLP-1 en bruto. Los eliminadores son sustancias, tales como, por ejemplo, anisol, tioanisol, triisopropilsilano (TIS), 1,2-etanoditiol y fenol, que pueden minimizar la modificación o destrucción de las cadenas laterales sensibles desprotegidas, tales como las de los residuos de arginina, en el entorno de escisión. Tal paso de escisión/desprotección se realiza preferiblemente usando una mezcla de TFA/tioanisol/anisol/dodecanotiol, por ejemplo, con una composición v/v/v/v 90/5/2/3, o una mezcla de TFA/agua/fenol/TIS, por ejemplo, con v/v/v/v 88/5/5/2.
En un aspecto preferido de la presente invención, el péptido en bruto obtenido mediante escisión de la resina ya sea un fragmento o un análogo de GLP-1 final, se purifica para aumentar su pureza.
Para este fin, se carga una disolución del péptido en una columna de HPLC con una fase estacionaria adecuada, preferiblemente sílice modificada C18 o C8, y se hace pasar a través de la columna una fase móvil acuosa que comprende un disolvente orgánico, preferiblemente acetonitrilo o metanol. Se aplica un gradiente de la fase móvil, si es necesario. El péptido con la pureza deseada se recoge y, opcionalmente, se liofiliza.
Por consiguiente, la presente invención proporciona un método convergente para la preparación de liraglutida o semaglutida en síntesis en fase sólida, en el que el método comprende el acoplamiento final de al menos un fragmento A de pseudoprolina N-terminal protegido con un fragmento B C-terminal protegido, seguido de desprotección simultánea o secuencial y escisión a partir del soporte sólido, y opcionalmente purificación final por cromatografía.
La presente invención proporciona además fragmentos intermedios A y B y métodos para su preparación.
En un aspecto, el fragmento A es un fragmento N-terminal del péptido análogo de GLP-1 deseado, que tiene una pseudoprolina en el sitio reactivo C-terminal. En un aspecto preferido, el fragmento A está protegido en su grupo a -amino, incluso más preferiblemente con un grupo Boc. En otro aspecto preferido, el fragmento A está protegido en sus grupos funcionales de cadena lateral con grupos protectores adecuados.
El fragmento A se selecciona del grupo que consiste en:
His-Xi-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(vzzpro), denominado fragmento A (1-8),
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(^z’zpro), denominado fragmento A (1-11),
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser(^zzpro), denominado fragmento A (1-12),
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr(^zzpro), denominado fragmento A (1-7),
y
His-X1-Glu-Gly-Thr(^zzpro), denominado fragmento A (1-5)
en los que X1 es Ala para liraglutida y Aib para semaglutida, y
en los que (^zzpro) indica la pseudoprolina usada, y tiene el significado tal como se definió anteriormente. Preferiblemente, el fragmento A se selecciona del grupo que consiste en
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(^MeMepro),
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(^MeMepro),
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser(^MeMepro),
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr(^MeMepro)
y
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr(yMe,Mepro),
en los que X1 y (^MeMepro) son tal como se definieron anteriormente.
Más preferiblemente, para la preparación de liraglutida, el fragmento A se selecciona del grupo que consiste en: Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(yMeMepro)8-OH,
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OfBu)-Gly-Thr(f-Bu)-Phe-Thr(f-Bu)-Ser(f-Bu)-Asp(Of'Bu)-Val-Ser(njMe'Mepro)11-OH,
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OfBu)-Gly-Thr(f-Bu)-Phe-Thr(f-Bu)-Ser(f-Bu)-Asp(Of'Bu)-Val-Ser(f-Bu)-Ser(njMe'Mepro)12-OH,
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(^MeMepro)7-OH,
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(^MeMepro)5-OH,
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(fBu)-Ser(yMeMepro)8-OH,
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(f-Bu)-Phe-Thr(f-Bu)-Ser(f-Bu)-Asp(Of'Bu)-Val-Ser(njMe'Mepro)11-OH,
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(Oí'Bu)-Gly-Thr(í'Bu)-Phe-Thr(í'Bu)-Ser(í'Bu)-Asp(OfBu)-\/al-Ser(í'Bu)-Ser(njMe'Mepro)12-OH,
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(^MeMepro)7-OH, y
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(^MeMepro)5-OH.
Incluso más preferiblemente, el fragmento A es
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(fBu)-Ser(^ Me’Mepro)8-OH, también denominado fragmento 4, que es una forma especificada del fragmento A (1-8).
En otra realización, en la que se pretende la preparación de semaglutida, el fragmento A es preferiblemente Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(y MeMepro)
e incluso más preferiblemente
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(^ MeMepro)8-OH, también denominado fragmento 7, que es una forma especificada del fragmento A (1-8).
El fragmento A se prepara o bien mediante SPPS por etapas o bien mediante LPPS. Por ejemplo, el fragmento A se prepara en fase sólida comenzando con la carga en una resina del dipéptido de pseudoprolina C-terminal adecuado, por ejemplo, Fmoc-Thr(tBu)-Ser(^ MeMepro)8-OH, y el posterior alargamiento de la cadena peptídica acoplando los aminoácidos de secuencia uno a uno, alternando etapas de acoplamiento y de desprotección del grupo a -amino. Preferiblemente, se usa SPPS de Fmoc por etapas en una resina de CTC en la preparación del fragmento A, y la síntesis se completa usando un último aminoácido protegido con Boc, es decir, Boc-His(Trt)-OH. Una vez se ha completado su secuencia, el fragmento A se escinde del soporte sólido mientras conserva tanto el grupo a -amino como los grupos protectores de cadena lateral.
Como ejemplos para la preparación del fragmento A, la preparación del fragmento 4 y del fragmento 7 se describen en los ejemplos de la presente divulgación.
De manera análoga, todos los fragmentos A definidos anteriormente se preparan de manera similar.
En otra realización, el fragmento B es un fragmento C-terminal del péptido de análogo de GLP-1 deseado, unido a un soporte sólido, que es preferiblemente una resina de Wang. En otras realizaciones preferidas, el soporte sólido es una resina de MBH.
El fragmento B se selecciona del grupo que consiste en
Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2 )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina de Wang,
Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2 )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina de Wang,
Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2 )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina de Wang,
Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2 )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu--Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina de Wang,
y
Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2 )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly- resina de Wang, en los que
X2 es N-(1-oxohexadecil)-L-y-glutamilo (Pal-Glu) para la síntesis de liraglutida, y
X2 es N-(17-carboxi-1-oxoheptadecil)-L-y-glutamil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetilo para la síntesis de semaglutida.
Preferiblemente, para la preparación de liraglutida, el fragmento B se selecciona del grupo que consiste en
H-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(fBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NínBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-res¡na de Wang,
también denominado fragmento 3,
H-Ser(tBu)-Tyr(íBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OíBu)-Phe-Ile-Ala-Trp([\rBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resinadeWang,
H-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N,nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-res¡na de Wang, H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(íBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N/í’Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang
y
H-Phe-Thr(fBu)-Ser(tBu)-Asp(0fBu)9-Val-Ser(íBu)-Ser(tBu)-Tyr(fBu)-Leu-G lu(0tBu)-G ly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N"IBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg( Pbf)-Gly31-resinade Wang.
Incluso más preferiblemente, para la preparación de liraglutida, el fragmento B es:
H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang,
también denominado fragmento 3, que es una forma especificada del fragmento B (9-31).
En otra realización en la que se pretende la preparación de semaglutida, el fragmento B es preferiblemente Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys[(ROOC-(CH2)i6-CO-yGlu-OR0-AEEA-AEEA]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina,
en el que R y R', iguales o diferentes, son grupos protectores de ácido carboxílico, preferiblemente ésteres; más preferiblemente el fragmento B es
H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NmBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de MBH, también denominado fragmento 6, que es una forma especificada del fragmento B (9-31).
El fragmento B se prepara o bien mediante SPPS por etapas o mediante CSPPS, o bien mediante LPPS. Por ejemplo, el fragmento B se prepara en fase sólida comenzando con la carga en la resina del aminoácido C-terminal protegido, es decir Gly31, y el posterior alargamiento de la cadena peptídica acoplando los aminoácidos de secuencia uno a uno, alternando etapas de acoplamiento y de desprotección de grupo a -amino. Alternativamente, el fragmento B se prepara mediante CSPPS acoplando dos o más fragmentos peptídicos.
En una realización preferida de la presente invención, la preparación del fragmento B comprende acoplar el fragmento C N-terminal adecuado al fragmento D C-terminal, según el esquema 2:
fragmento C-COOH NF^-fragmento D-soporte sólido
NH^-fragmento B - soporte sólido
El fragmento D está unido a un soporte sólido a través de Gly31 y está protegido preferiblemente en sus cadenas laterales de aminoácidos. En una realización preferida de la presente invención, el fragmento D es
Gln17-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly31-resina, también denominado fragmento D (17 31) o SEQ ID NO: 13.
El fragmento C es un fragmento adecuado seleccionado del grupo que consiste en:
Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, denominado fragmento C (9-16) o SEQ ID NO: 14,
Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, denominado fragmento C (12-16) o SEQ ID NO: 15,
Tyr-Leu-Glu-Gly, denominado fragmento C (13-16) o SEQ ID NO: 16,
Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, denominado fragmento C (8-16) o SEQ ID NO: 17,
y
Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, denominado fragmento C (6-16) o SEQ ID NO: 18.
El fragmento C tiene una glicina C-terminal que se hace reaccionar de manera conveniente para formar el enlace amida requerido en las condiciones comentadas anteriormente. El fragmento C también está preferiblemente protegido en sus cadenas laterales de aminoácidos y en su grupo a -amino.
El fragmento C se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en:
Fmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH,
Fmoc-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH,
Fmoc-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH,
Fmoc-Ser(fBu)-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH
y
Fmoc-Phe-Thr(fBu)-ser(fBu)-Asp(OfBu)9-Val-ser(fBu)-ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH.
Lo más preferiblemente, el fragmento C es
Fmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH, también denominado fragmento 2.
Tal fragmento C se usa convenientemente para la preparación de tanto liraglutida como semaglutida, tal como se describirá en los ejemplos de la presente divulgación.
En una realización más preferida de la presente invención
Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina de Wang se obtiene mediante una estrategia de acoplamiento de fragmento C (9-16) fragmento D (17-31), preferiblemente acoplando
Asp9-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly16-OH
con
H-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly31resina
en la que
X2 es N-(1-oxohexadecil)-L-y-glutamilo para la síntesis de liraglutida, y
X2 es N-(17-carboxi-1-oxoheptadecil)-L-y-glutamil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetilo para la síntesis de semaglutida;
y en la que la resina preferiblemente es una resina de Wang.
En una realización incluso más preferida, si se pretende la preparación de liraglutida, se obtiene el fragmento 3 preferido (es decir, H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang) mediante una estrategia de acoplamiento de fragmento C (9-16) fragmento D (17-31), preferiblemente acoplando
Fmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OfBu)-Gly16-OH (fragmento 2) con
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu-(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NmBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang, fragmento 1, un fragmento especificado D (17-31).
Luego, el fragmento B con a -amino protegido (9-31) así obtenido se trata para escindir el grupo Fmoc en condiciones básicas tal como se describió anteriormente para proporcionar el fragmento 3 tal como se definió.
En otra realización preferida, si se pretende la preparación de semaglutida, se obtiene el fragmento 6 preferido (es decir, H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de MBH) mediante una estrategia de acoplamiento de fragmento C (9-16) fragmento D (17-31), preferiblemente acoplando Fmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OfBu)-Gly16-OH (fragmento 2)
con
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NmBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-O-resina de MBH, fragmento 5, un fragmento especificado D (17-31).
Luego, el fragmento B con a -amino protegido (9-31) así obtenido se trata para escindir el grupo Fmoc en condiciones básicas tal como se describió anteriormente para proporcionar el fragmento 6 tal como se definió anteriormente.
Como ejemplo para la preparación del fragmento B, la preparación del fragmento 3 y del fragmento 6 se describen en los ejemplos de la presente divulgación, incluyendo la preparación del fragmento 1, fragmento 5 y fragmento 2. De manera análoga, todos los fragmentos B definidos anteriormente se preparan acoplando un fragmento C adecuado y un fragmento D adecuado tal como se definió anteriormente.
La realización más preferida del método para preparar liraglutida es un método según la reivindicación 1 en el que: el fragmento A es His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(y zzpro), denominado fragmento A (1-8), más preferiblemente Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(^ MeMepro)8-OH, también denominado fragmento 4; y el fragmento B es Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina, denominado fragmento B (9-31),
más preferiblemente H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OfBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang, también denominado fragmento 3.
Lo más preferido en esta configuración es que el fragmento C sea Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, denominado fragmento C (9-16), más preferiblemente Fmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH, también denominado fragmento 2; y
el fragmento D sea Gln17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly31-resina, también denominado fragmento D (17-31),
más preferiblemente H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu-(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang, también denominado fragmento 1.
La realización más preferida del método para preparar semaglutida es un método según la reivindicación 1 en el que,
el fragmento A es His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(y zzpro), denominado fragmento A (1-8), más preferiblemente Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(fBu)-Ser(^ MeMepro)8-OH, también denominado fragmento 7; y el fragmento B es Asp-Val-ser-ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys[(ROOC-(CH2)16-CO-yGlu-OR')-AEEA-AEEA]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina, denominado fragmento B (9-31),
más preferiblemente H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de MBH, también denominado fragmento 6.
Lo más preferido en esta configuración es que el fragmento C sea Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, denominado fragmento C (9-16), más preferiblemente Fmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH, también denominado fragmento 2; y
el fragmento D sea Gln17-Ala-Ala-Lys[(ROOC-(CH2)16-CO-yGlu-OR')-AEEA-AEEA]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly31-resina, también denominado fragmento D (17-31), en el que R y R', iguales o diferentes, son grupos protectores de ácido carboxílico, preferiblemente ésteres,
más preferiblemente H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N,nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-O-resina de MBH, fragmento 5.
El método convergente basado en fragmentos para la preparación de análogos de GLP-1 descrito anteriormente proporciona el péptido final unido a la resina deseado, que se trata para una etapa de desprotección simultánea o secuencial y/o escisión para obtener el péptido en bruto, que opcionalmente se purifica adicionalmente.
Abreviaturas
SPPS Síntesis de péptidos en fase sólida
LPPS Síntesis de péptidos en fase líquida
CSPPS Síntesis convergente de péptidos en fase sólida
CTC Cloruro de 2-cloro-tritilo
MBH 4-Metilbenzhidrilo
4-MeO-BH 4-Metoxibenzhidrilo
AEEA 2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetilo
Fmoc 9-Fluorenilmetoxicarbonilo
Boc Tere-butiloxicarbonilo
Trt Tritil(trifenilmetilo)
tBu Tere-butilo
Pbf 2,2,4,6,7-Pentametil-dihidrobenzofuran-5-sulfonilo
eq. Equivalente
h Hora/s
min Minuto/s
HPLC Cromatografía de líquidos de alto rendimiento
DIEA/DIPEA N,N-Diisopropiletilamina
DBU 1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
DMAP 4-Dimetilaminopiridina
TFA Ácido trifluoroacético
TIS Triisopropilsilano
Ac2O Anhídrido acético
DMF N,N-Dimetilformamida
DMA N,N-Dimetilacetamida
DCM Diclorometano
THF Tetrahidrofurano
NMP N-Metil-2-pirrolidinona
MTBE Metil-ferc-butil éter
DIPE Diisopropil éter
MeOH Metanol
HFIP Hexafluoro-2-propanol
TBDMS Terc-butil-dimetil-sililo
DIC N,N'-Diisopropilcarbodiimida
DCC N,N'-Diciclohexilcarbodiimida
EDC N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida
HOBt 1-Hidroxibenzotriazol
HOAt 1-Hidroxi-7-azabenzotriazol
NHS N-Hidroxisuccinimida
TBTU Tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
HBTU Hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
HATU Hexafluorofosfato de 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1 -il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
PyBOP Hexafluorofosfato de (benzotriazol-1 -iloxi)tripirrolidinofosfonio
OxymaPure 2-ciano-2-hidroxiimino-acetato de etilo
Oxyma-B 5-(Hidroxiimino)1,3-dimetilpirimidina-2,4,6-(1 H,3H,5H)-triona
TX-100 Triton X-100, también denominado terc-octilfenil éter de polietilenglicol
Ejemplos
Se proporcionan parámetros experimentales detallados adecuados para la preparación de liraglutida y semaglutida según la presente invención mediante los siguientes ejemplos, que se pretende que sean ilustrativos y no limitativos de todas las posibles realizaciones de la invención.
Ejemplo 1
Preparación de liraglutida
Etapa 1. Preparación del fragmento 1, un fragmento D (17-31),
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang
La síntesis del fragmento peptídico 1 se llevó a cabo a temperatura ambiente mediante SPPS de Fmoc por etapas usando 0,25 g de resina de Wang (0,75 mmol/g). Después de hinchar la resina en 2 ml de DMF, se añadieron Fmoc-Gly-OH, DIC y DMAP (4, 2 y 0,1 eq. Respectivamente, referidos a la carga de la resina) en DMF. Después de 1 h, los grupos hidroxilo sin reaccionar de la resina se taparon mediante tratamiento con mezcla de DMF/DIPEA/Ac2O (v/v/v 5/2/1) durante 30 minutos. Se realizó desprotección de Fmoc con disolución al 20% de piperidina en DMF (2 * 2 ml, 5 min y 15 min) y se lavó la resina con DMF (4 * 2 ml). Se comprobó el grado de sustitución mediante medición de la adsorción UV de la disolución recogida después de la desprotección de Fmoc y se encontró que era de 0,53 mmol/g. Se preactivaron aminoácidos protegidos con Fmoc (exceso de cuatro veces con respecto a la carga de la resina) con la mezcla de DIC (4 eq) y 2-ciano-2-(hidroxiimino)acetato de etilo (OxymaPure, 4 eq) y posteriormente se acoplaron con la resina en 60 min. La finalización del acoplamiento se monitorizó mediante prueba de ninhidrina. En caso de reacción incompleta se repitió el acoplamiento. Para la introducción de Fmoc-Lys(Pal-Glu-OfBu)-OH en la secuencia peptídica se llevó a cabo doble acoplamiento usando 3 eq. Y 1,5 eq. De dipéptido palmitoilado (9 h y 5 h, respectivamente). Al final de cada acoplamiento, se acilaron las cadenas peptídicas sin reaccionar con anhídrido acético (10 eq) en presencia de DIPEA (10 eq.). Se llevaron a cabo desprotecciones de Fmoc intermedio usando disolución al 20% de piperidina en DMF (2 * 2 ml, 5 min y 15 min) con posterior lavado de la resina con DMF (4 * 2 ml). Después de la finalización de la síntesis se lavó la resina con DCM y se secó.
Etapa 2. Preparación del fragmento 2, un fragmento C (9-16),
Fmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OfBu)-Gly16-OH
La síntesis del fragmento peptídico se llevó a cabo mediante SPPS por etapas usando resina de cloruro de 2-clorotritilo (resina de CTC) (0,25 g, 1,6 mmol/g). Después de hinchar la resina usando 3 ml de DCM, se añadieron Fmoc-Gly-OH y DIEA (0,8 y 3 eq., con respecto a la carga de la resina) en DCM. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora y se eliminó el disolvente por filtración. Los sitios sin reaccionar de la resina se taparon usando una mezcla de DCM/DIPEA/MeOH (v/v/v 17/2/1) durante 30 minutos. Después de lavar con DCM (3 * 5 ml) se trató la resina con una mezcla de DCM/DIPEA/Ac2O (v/v 5/2/1) durante 30 minutos. Se comprobó la carga de la resina mediante medición de la adsorción UV de la disolución después de la desprotección de Fmoc y se encontró que era
de 1,08 mmol/g. Luego se preactivaron Fmoc-Glu(OfBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(fBu)-OH, Fmoc-Ser(fBu)-OH, Fmoc-Ser(fBu)-OH, Fmoc-Val-OH y Fmoc-Asp(OfBu)-OH (exceso de tres veces con respecto a la carga de la resina) mediante DIC (exceso de tres veces) y OxymaPure (exceso de tres veces) y se acoplaron consecutivamente a la resina en 60 min. Se llevaron a cabo desprotecciones de Fmoc intermedio usando disolución al 20% de piperidina en DMF (2 x 2 ml, 5 min y 15 min) con posterior lavado de la resina con DMF (4 * 2 ml). Después de la finalización de la síntesis se lavó la resina con DCM. Se escindió el péptido protegido de la resina mediante el tratamiento con 1 ml de TFA al 1% en DCM durante 2 min y se filtró la disolución en 2 ml de disolución al 10% de piridina en metanol. El procedimiento se repitió 4 veces. Luego se lavó la resina con DCM (3 * 2 ml), metanol (3 * 2 ml) y se concentraron las disoluciones combinadas hasta el 5% del volumen. Se precipitó el octapéptido protegido mediante adición de agua bajo un baño helado, se filtró, se lavó varias veces con agua y se secó. Rendimiento: 330 mg (90%), pureza por HPLC 91%
Etapa 3-a. Condensación de los fragmentos 1 y 2: preparación del fragmento 3, un fragmento B (9-31),
H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-T rp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang
Se hinchó el fragmento peptídico 1 obtenido en la etapa 1 en 2 ml de DMF. Se disolvió el fragmento 2 protegido (180 mg, 0,13 mmol, 1 eq.) en 7 ml de DMF, se preactivó con DIC (16 mg, 0,13 mmol), OxymaPure (40 mg, 0,27 mmol) y se acopló con el fragmento 1. Se agitó la reacción a 40°C y se monitorizó con HPLC. Se añadió otro 1 eq. De fragmento peptídico preactivado 2 (180 mg, 0,13 mmol) a 40°C y se agitó para completar la condensación. Se lavó entonces la resina con DMF (2 * 2 ml) y se tapó la función amino sin reaccionar residual con disolución al 10% de Ac2O en DMF (2 ml, 30 min).
Por último, el grupo protector Fmoc se eliminó con disolución al 20% de piperidina en DMF (2 * 2 ml, 5 min y 15 min) con posterior lavado de la resina con DMF (3 * 2 ml).
Etapa 3-b. Condensación de los fragmentos 1 y 2 en presencia de un detergente: preparación del fragmento 3, un fragmento B (9-31),
H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OfBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-T rp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang
Se hinchó el fragmento peptídico 1 obtenido en la etapa 1 en 2 ml de una mezcla de DMF:DCM 50:50 v/v Triton X-100 al 1% (TX-100). Se disolvió el fragmento 2 protegido (267 mg, 0,195 mmol, 1,5 eq.) en 5,3 ml de DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 al 1%, se preactivó con DIC (24,6 mg, 0,195 mmol), OxymaPure (27,7 mg, 0,195 mmol) y se acopló con el fragmento 1. Se agitó la reacción a 40°C y se monitorizó mediante HPLC. Se lavó entonces la resina con 2 ml de DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 al 1% y con DMF (2 * 2 ml). Se tapó la función amino sin reaccionar residual con disolución al 10% de Ac2O en DMF (2 ml, 30 min).
Por último, el grupo protector Fmoc se eliminó con disolución al 20% de piperidina en DMF (2 * 2 ml, 5 min y 15 min) con posterior lavado de la resina con DMF (3 * 2 ml).
Etapa 4. Preparación del fragmento 4, un fragmento A (1-8),
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(fBu)-Ser(v MeMepro)8-OH
Se preparó el fragmento peptídico 4 de manera similar tal como se describe en la etapa 2. En primer lugar, la unión de Fmoc-Thr(fBu)-Ser(^ MeMepro)8-OH (0,8 eq.) a la resina de CTC (0,25 g, 1,6 mmol/g) en presencia de DIEA (3 eq) en DCM se llevó a cabo para dar la carga de 0,96 mmol/g. Luego se acoplaron consecutivamente Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(fBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OfBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, y Boc-His(Trt)-OH (exceso de tres veces con respecto con la carga de la resina) a la resina en 6 0 min después de la preactivación con DIC (3 eq) y OxymaPure (3 eq.). La primera desprotección de Fmoc se llevó a cabo usando una disolución al 20% de piperidina en Dm F (3 x 2 ml, 3 min) con posterior lavado de la resina con DMF (4 x 2 ml). Para la desprotección de Fmoc de los otros aminoácidos, se realizaron dos tratamientos con disolución al 20% de piperidina en DMF (5 min y 15 min). Se escindió el octapéptido protegido de la resina usando el mismo procedimiento que se describió previamente (véase la etapa 2). Rendimiento: 270 mg (80%), pureza por HPLC 87%
Etapa 5-a. Condensación de los fragmentos 3 y 4: preparación de liraglutida (1-31)
Se hinchó el fragmento 3 soportado sobre resina de peptidilo desprotegido con Fmoc obtenido en la etapa 3 (3-a o 3-b) en 2 ml de DMF. Se disolvió el fragmento 4 protegido (272 mg, 0,20 mmol, 1,5 eq.) en 7 ml de DMF, se preactivó con DIC (16 mg, 0,13 mmol), OxymaPure (40 mg, 0,27 mmol) y se acopló con el fragmento 3. Se agitó la reacción a 40°C y se monitorizó con HPLC. Se añadieron otros 1,5 eq. De fragmento 3 preactivado (270 mg, 0,20 mmol) y se agitaron a 40°C para completar la condensación. Se lavó entonces la resina con DMF (2 x 2 ml) y se tapó la función amino sin reaccionar residual con disolución al 10% de Ac2O en DMF (2 ml, 30 min). Entonces la resina se lavó finalmente dos veces con DCM (2 ml) y se secó.
Etapa 5-b. Condensación de los fragmentos 3 y 4 en presencia de un detergente: preparación de liraglutida (1-31) Se hinchó el fragmento 3 soportado sobre resina desprotegido con Fmoc obtenido en la etapa 3 (3-a o 3-b) en 2 ml de una mezcla de DMF:Dc M 50:50 v/v TX-100 al 1%. Se disolvió el fragmento 4 protegido (270 mg, 0,195 mmol, 1,5 eq.) en 2,7 ml de DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 al 1%, se preactivó con DIC (25 mg, 0,195 mmol), OxymaPure (28 mg, 0,195 mmol) y se acopló con el fragmento 3. Se agitó la reacción a 40°C y se monitorizó con HPLC. Se lavó entonces la resina con 2 ml de DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 al 1% y con DMF (2 x 2 ml). Se tapó la función amino sin reaccionar residual con disolución al 10% de Ac2O en DMF (2 ml, 30 min). Luego la resina se lavó finalmente dos veces con DCM (2 ml) y se secó.
Etapa 6. Escisión y purificación de liraglutida
Se suspendió la resina de peptidilo seca obtenida en la etapa 5-a en 2 ml de la mezcla de TFA/agua/fenol/TIS (v/v/v/v 88/5/5/2) y se agitó durante 4 h. Luego se filtró la resina y se lavó con 1 ml de TFA. Se recogieron las disoluciones y el péptido en bruto se precipitó en 5 ml de MTBE. Se lavó el precipitado varias veces con MTBE y se secó para obtener liraglutida en bruto con un rendimiento global de 375 mg (75%) y una pureza por HPLC del 81%. Se purificó la liraglutida en bruto con fase móvil A de TFA al 0,1%/agua y fase móvil B de TFA al 0,1%/acetonitrilo. Se recogieron las fracciones con pureza mayor del 99,0% y se liofilizaron para dar liraglutida purificada. Pureza por HPLC: 99,4%, rendimiento 112 mg (30%).
Ejemplo 2
Preparación de semaglutida
Etapa 1. Preparación del fragmento 5, un fragmento D (17-31)
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-YGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NínBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-O-resina de MBH
La síntesis del fragmento peptídico 5 se llevó a cabo a temperatura ambiente usando 0,5 g de H-Gly-O-resina de MBH (carga de 0,60 mmol/g). Se hinchó la resina en 3 ml de DMF y se usó para SPPS de Fmoc por etapas. Se preactivaron aminoácidos protegidos con Fmoc (exceso de dos veces con respecto a la carga de la resina) con la mezcla de DIC (2 eq.) y OxymaPure (2 eq.) durante 3 min y se acoplaron consecutivamente con la resina en 90 min. Los acoplamientos de Arg, Val, Trp, Ala24, Phe y Gln se repitieron con 1 eq. de la mezcla de acoplamiento durante 60 min. La introducción de la cadena lateral lipidada en la secuencia peptídica se llevó a cabo usando 1,5 eq. de Fmoc-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-OH, que se preactivó con 1,5 eq. de DIC y 1,5 eq. de OxymaPure y se acopló en 6 h a 40°C. La finalización del acoplamiento se monitorizó mediante prueba de ninhidrina. Al final de cada acoplamiento, se acetilaron las cadenas peptídicas sin reaccionar con anhídrido acético (3 eq.) en DMF y se lavaron con DMF (3 * 5 ml). Se llevaron a cabo desprotecciones de Fmoc intermedio usando disolución al 20% de piperidina en DMF (2 * 5 ml, 10 min) con posterior lavado de la resina con DMF (4 * 5 ml). Después de la finalización de la síntesis se lavó la resina con DCM y se secó.
Etapa 2. Preparación del fragmento 2, un fragmento C (9-16),
Fmoc-Asp(OtBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH Véase la etapa 2 del ejemplo 1.
Etapa 3. Condensación de los fragmentos 5 y 2 en presencia de un detergente: preparación del fragmento 6, un fragmento B (9-31),
H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OfBu)-Phe-Ne-Ala-Trp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de MBH
Se hinchó resina desprotegida con Fmoc con fragmento peptídico 5 obtenido en la etapa 1 en 4 ml de una mezcla de DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 al 1% a 40°C. La disolución del fragmento peptídico 2 protegido (765 mg, 0,56 mmol, 2 eq.) en 7 ml de la mezcla de DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 al 1% se preactivó con DIC (16 mg, 0,56 mmol) y OxymaPure (88 mg, 0,56 mmol) a 40°C durante 15 min, luego se añadió a la resina y la mezcla de reacción se agitó durante 3,5 h a 40°C. La finalización del acoplamiento se monitorizó mediante prueba de ninhidrina. Se acetilaron las cadenas peptídicas sin reaccionar con 3 eq. de anhídrido acético en DMF y luego se lavó la resina peptídica con DMF (3 * 5 ml). Al final, el grupo protector Fmoc se eliminó con disolución al 20% de piperidina en DMF (2 * 5 ml, 10 min) con posterior lavado de la resina con DMF (4 * 5 ml).
Etapa 4. Preparación del fragmento 7, un fragmento A (1-8),
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(^MeMepro)8-OH
La síntesis del fragmento peptídico 7 se llevó a cabo usando 1 g de resina de CTC (carga de 1,6 mmol/g). Después de hinchar la resina en 10 ml de DCM, se añadió una disolución de Fmoc-Thr(fBu)-Ser(^MeMepro)8-OH y DIEA (0,8 y 3 eq., con respecto a la carga de la resina) en 5 ml de DCM. La mezcla de reacción se agitó durante 16 horas y se eliminó el disolvente por filtración. Los sitios sin reaccionar de la resina se taparon usando una disolución de MeOH (3 eq.) y DIEA (3 eq.) en 5 ml de DCM durante 15 minutos. Después de lavar con DCM (2 x 10 ml) se trató la resina con una disolución de anhídrido acético (3 eq.) y DIEA (3 eq.) en 10 ml de DCM durante 15 minutos, se lavó con DMF (3 x 10 ml), DCM (3 x 10 ml) y se secó. Se comprobó la carga de la resina mediante medición de la adsorción UV de la disolución después de la desprotección de Fmoc y se encontró que era de 1,3 mmol/g. Luego se preactivaron Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(fBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OfBu)-OH, Fmoc-Ala-OH y Boc-His(Trt)-OH (2 eq.) mediante 2 eq. de DIC y 2 eq. de OxymaPure durante 3 min y se acoplaron consecutivamente con la resina en 90 min. En el caso de His, Oxyma-B reemplazó OxymaPure y se redujo el tiempo de preactivación hasta 1 min a 0°C. Se llevaron a cabo desprotecciones de Fmoc intermedio usando disolución al 20% de piperidina en DMF (2 x 10 ml, 10 min) con posterior lavado de la resina con DMF (4 x 10 ml). Después de la finalización de la síntesis se lavó la resina con DCM (2 x 10 ml) y se secó. Se escindió el péptido protegido de la resina mediante tratamiento con 3 ml de TFA al 1,5% en DCM durante 2 min y se filtró la disolución en 3 ml de disolución al 10% de piridina en metanol. El procedimiento se repitió 4 veces y se concentraron las disoluciones combinadas hasta el 30% del volumen. El péptido protegido se precipitó mediante adición de agua bajo un baño helado, se filtró, se lavó varias veces con agua y se secó. Rendimiento: 960 mg (77%).
Etapa 5. Condensación de los fragmentos 6 y 7: preparación de semaglutida (1-31)
Se hinchó el fragmento 6 soportado sobre resina de peptidilo desprotegido con Fmoc obtenido en la etapa 3 en 2 ml de la mezcla de DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 al 1% a 40°C. Se preactivó la disolución del fragmento peptídico 7 protegido (780 mg, 0,56 mmol, 2 eq.) en 7 ml de la mezcla de DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 al 1% con DIC (16 mg, 0,56 mmol) y OxymaPure (88 mg, 0,56 mmol) a 40°C durante 15 min. Luego la mezcla de acoplamiento se añadió a la resina y la mezcla de reacción se agitó durante 3,5 h a 40°C. La finalización del acoplamiento se monitorizó mediante prueba de ninhidrina. Se acetilaron las cadenas peptídicas sin reaccionar con 3 eq. de anhídrido acético en DMF y se lavó la resina peptídica con DMF (3 x 5 ml), DCM (2 x 5 ml) y se secó.
Etapa 6. Escisión y purificación de semaglutida
Se suspendió la resina de peptidilo seca obtenida en la etapa 5 en 5 ml de la mezcla de TFA/agua/fenol/TIS (v/v/v/v 88/5/5/2) y se agito durante 1 h a 0°C y 3 h a TA. Luego se filtró la resina y se lavó con 1 ml de TFA. Se recogieron las disoluciones y el péptido en bruto se precipitó en 25 ml de DIPE. Se lavó el precipitado varias veces con DIPE y se secó para obtener semaglutida en bruto con un rendimiento global de 0,7 g (61%) y una pureza por HPLC del 74%. Se purificó la semaglutida en bruto con fase móvil A de TFA al 0,1%/agua y fase móvil B de TFA al 0,1%/acetonitrilo. Las fracciones con pureza mayor del 99,0% se recogieron y se liofilizaron para dar semaglutida purificada. Pureza por HPLC: 99,1%, rendimiento 196 mg (28%).
Claims (1)
- REIVINDICACIONESProcedimiento en fase sólida basado en fragmentos para la preparación de un análogo de GLP-1 de fórmula IHX1EGTFTSDVSSYLEGQAAK(X2)EFIAWLVRGRG (I)en la queX1 es Ala y X2 es N-(1-oxohexadecil)-L-y-glutamilo,oX1 es ácido a -aminoisobutírico (Aib) y X2 es N-(17-carboxi-1-oxoheptadecil)-L-y-glutamil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetilo,en el que el procedimiento comprende una etapa de acoplamiento final entre un fragmento A N-terminal y un fragmento B C-terminal y en el que el fragmento A N-terminal tiene una pseudoprolina en el sitio reactivo C-terminal.Procedimiento según la reivindicación 1,en el que el fragmento A se selecciona del grupo que consiste enHis-Xi-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(^zzpro)His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(v z,zpro)His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser(v z,zpro)His-Xi-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr(^z zpro), yHis-Xi-Glu-Gly-Thr(^zzpro)en las que X1 es Ala o Aib, yen las que (^ z,zpro) indica que Ser, o Thr, está protegido con pseudoprolina, según la fórmula:
en la queY es hidrógeno para Ser y Me para Thr,Z es hidrógeno o Me, yR1 es la cadena lateral del aminoácido al lado del aminoácido protegido con pseudoprolina.Procedimiento según la reivindicación 2,en el que el fragmento A se selecciona del grupo que consiste enBoc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(^MeMepro),Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(^MeMepro),Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser(VMe,Mepro),Boc-His-Xi -Glu-Gly-Thr-Phe-Thr(^ Me’Mepro)yBoc-His-X1-Glu-Gly-Thr(y Me'Mepro)en las que X1 y (^ MeMepro) son tal como se definen en la reivindicación 2,y en el que el fragmento A está acoplado a un fragmento peptídico protegido B unido a una resina, seleccionado del grupo que consiste enAsp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala--Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina,Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala--Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina,Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala--Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina,Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala--Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resinayPhe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala--Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina,en las queX2 es tal como se define en la reivindicación 1.Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la preparación del fragmento B comprende acoplar un fragmento C con un fragmento D, en el queel fragmento C se selecciona del grupo que consiste enAsp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly,Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly,Tyr-Leu-Glu-Gly,Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, yPhe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly,y en el que fragmento D esGln17-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly31-resinaen la queX2 es tal como se define en la reivindicación 1.Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que X1 es Ala y X2 es N-(1-oxohexadecil)-L-y-glutamilo.Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que X1 es Aib y X2 es N-(17 carboxi-1-oxoheptadecil)-L-y-glutamil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetilo.Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el fragmento C se selecciona del grupo que consiste en Fmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH,Fmoc-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH,Fmoc-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH,Fmoc-Ser(fBu)-Asp(OtBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH yFmoc-Phe-Thr(fBu)-Ser(fBu)-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH, y en el que fragmento D esH-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NmBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang, oH-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu(OfBu)-Phe-Ne-Ala-Trp(NmBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-O-resina de MBH.Procedimiento según la reivindicación 7, en el queel fragmento C esFmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OHy el fragmento D esH-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NmBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang, oH-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-Glu(OfBu)-Phe-Ne-Ala-Trp(NmBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-O-resina de MBH.Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el fragmento A esBoc-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(V MeMepro) oBoc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(V MeMepro)y el fragmento B esAsp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala--Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Glyresina, oAsp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys[(ROOC-(CH2)16-CO-yGlu-OR')-AEEA-AEEA]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina, respectivamenteen las que R y R', iguales o diferentes, son grupos protectores de ácido carboxílico.Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el fragmento A esBoc-His(Trt)1-Ala-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(fBu)-Ser(v MeMepro)8-OH o Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(fBu)-Ser(y MeMepro)8-OH,y el fragmento B esH-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N /nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang, oH-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N mBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de MBH, respectivamente.11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la preparación del fragmento B comprende acoplar Fmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OfBu)-Gly16-OH conH-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang, oH-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OtBu)-Phe-Ne-Ala-Trp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de MBH, respectivamente.12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el acoplamiento de fragmentos se lleva a cabo en presencia de N,N'-diisopropilcarbodiimida y 2-ciano-2-hidroxiimino-acetato de etilo.13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el acoplamiento de fragmentos se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de 10-70°C, más preferiblemente de 20-50°C, incluso más preferiblemente en el intervalo de 35-45°C.14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el acoplamiento de fragmentos se lleva a cabo en presencia de un detergente, preferiblemente Triton X-100.15. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el procedimiento comprende además desprotección y escisión del péptido de la resina.
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