ES2936254T3 - Vector de expresión para la colesterol 24-hidrolasa en la terapia de la esclerosis lateral amiotrófica - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un vector para uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica asociada, o no asociada, con demencia frontotemporal y trastornos de motoneuronas relacionados, dicho vector comprende ácido nucleico que codifica colesterol 24-hidroxilasa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Vector de expresión para la colesterol 24-hidrolasa en la terapia de la esclerosis lateral amiotrófica

La presente invención se refiere al tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica.

Antecedentes de la invención

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurológica rara que pertenece al grupo de trastornos de las neuronas motoras que involucran principalmente a las neuronas responsables de controlar el movimiento de los músculos voluntarios, como masticar, caminar y hablar (Zarei S et al. 2015). La ELA se caracteriza por el deterioro gradual y la muerte de las motoneuronas, que se extienden desde el cerebro hasta la médula espinal y los músculos de todo el cuerpo. La ELA involucra tanto a las neuronas motoras superiores (mensajes de las neuronas motoras al cerebro que se transmiten a la médula espinal) como a las neuronas motoras inferiores (núcleos motores en el cerebro) que degeneran y, en consecuencia, dejan de enviar mensajes a los músculos que se debilitan gradualmente, comienzan a contraerse y se atrofian (Rowland LP et al. 2001).

La mayoría de las personas que padecen ELA mueren dentro de los 3 a 5 años posteriores a la aparición del primer síntoma, generalmente por insuficiencia respiratoria. Solo el 10% de las personas con ELA sobreviven más de 10 años después de la aparición de los síntomas.

En la ELA se han asociado varios factores de riesgo potenciales: la edad, por lo general los síntomas aparecen entre los 55 y los 75 años, el género, la ELA es ligeramente más frecuente en los hombres, y la raza y el origen étnico, la ELA se desarrolla con más probabilidad en personas de raza blanca y no hispanoamericanos.

Sin embargo, la gran mayoría de los casos de ELA (90%) son esporádicos. En contraste, alrededor del 10% de los casos de ELA son familiares (ELAF). Para estos casos familiares se han implicado varios genes: C9ORF72, SOD1, FUS, TARDBP y más recientemente SMCR8 (Greenway et al. 2006; Kabashi et al. 2008; Kaur et al. 2016; Turner MR et al. 2017; Ticozzi et al. 2011; Valdmanis PN et al. 2008).

Con respecto a la fisiopatología de la ELA, se están considerando varios aspectos, una de las principales teorías está relacionada con el procesamiento del ARN, en particular en base al hallazgo de la inclusión de TDP-43 en la mayoría de los casos de ELA, así como genes como TARDBP y FUS como causas genéticas de la ELA. Ambos genes están implicados en el corte y empalme del pre-ARNm y en el transporte y la traducción del ARN. El pre-ARNm que contiene repeticiones C9orf72 podría secuestrar proteínas de unión al ARN nuclear y, por lo tanto, hacer que no estén disponibles para el corte y empalme correcto de otros ARNm. Otro aspecto bien reconocido de la ELA es la agregación de proteínas, incluidas SOD1, TDP43 y FUS, que se puede observar tanto en pacientes con ELA como en modelos animales. Se propone que los agregados alteren la homeostasis normal de las proteínas e induzcan el estrés celular. Además, los agregados de proteínas podrían secuestrar ARN u otras proteínas esenciales para las funciones celulares normales.

Hasta el momento, no existe una cura conocida para la ELA. Solo hay dos medicamentos aprobados por la FDA para la ELA: riluzol y edaravona. Se cree que el riluzol reduce el daño de las neuronas motoras actuando a través de la disminución de los niveles de glutamato. El riluzol prolonga la supervivencia durante algunos meses pero no revierte los daños ya presentes en las neuronas (Zoccolella et al. 2007). En cuanto a la edaravona, solo se ha demostrado que disminuye la evaluación clínica del deterioro diario (Brooks et al. 2018). Por lo tanto, existe una gran necesidad de desarrollar nuevas estrategias para el tratamiento de la ELA.

Sumario de la invención

Los inventores proponen ahora contrarrestar la ELA modulando la ruta del metabolismo del colesterol, más específicamente por medio de un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la colesterol 24-hidroxilasa que expresa la colesterol 24-hidroxilasa en las células diana.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un vector para el uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, y dicho vector comprende un ácido nucleico que codifica la colesterol 24-hidroxilasa.

En una realización, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°2. Alternativamente, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico SEQ ID N°1.

En una realización, el vector se selecciona del grupo de vectores de adenovirus, lentivirus, retrovirus, herpesvirus y virus adenoasociados (AAV), preferiblemente un vector de AAV, más preferiblemente un vector AAV9, AAV10 (AAVrh.10) o AAVPHP.eB, incluso más preferiblemente un AAVPHP.eB.

En una realización, el vector se administra directamente en el cerebro y/o la médula espinal del paciente, preferiblemente en la médula espinal y/o la corteza motora.

Otro objetivo de la invención es proporcionar una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, que comprende un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la colesterol 24-hidroxilasa.

Breve descripción de las Figuras

Figura 1. Niveles de ARNm de genes implicados en el metabolismo del colesterol a las 8 semanas en la médula espinal lumbar y niveles de 24-OH colesterol a las 15 semanas en la médula espinal de animales TN y SOD1G93A. (A) Se extrajo el ARNm de la médula espinal lumbar de ratones TN y SOD1G93A de 8 semanas de edad. Los niveles de ARNm se normalizaron respecto del gen constitutivo de actina. Los datos se representan como la media ± EEM (n = 4-5 por grupo). (B) Contenido de 24S-hidroxicolesterol en la médula espinal lumbar de ratones SOD1G93A evaluado por UPLC-HRMS. Los datos se representan como la media ± EEM (n = 7-9 por grupo). Análisis estadístico: prueba t de Student. *p<0,05, **p<0,01.

Figura 2. Evaluación de la expresión de CYP46A1-HA después de la administración intravenosa de AAVPHP.eB-CYP46A1 -HA en animales TN a las 8 semanas y análisis 3 semanas después de la inyección de una dosis baja, media o alta. Tinción con HA en la sección cervical, torácica y lumbar de la médula espinal.

Figura 3. Evaluación de la inflamación después de la administración intravenosa de AAVPHP.eB-CYP46A1-HA en animales TN a las 8 semanas y análisis 3 semanas después de la inyección de una dosis baja, media o alta. Tinción de GFAP en la sección lumbar de la médula espinal. NI: No inyectado.

Figura 4. Evaluación del comportamiento de ratones SOD1 tras la administración intravenosa de AAVPHP.eB-CYP46A1 en fase preventiva (3 semanas). (A) Seguimiento del peso, (B) Prueba de sujeción y (C). Prueba invertida. Los resultados se presentan como la media ± EEM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. El * negro corresponde al valor de p frente a los animales TN y el gris a los animales SOD1.

Figura 5. Biodistribución de AAVPHP.eB-CYP46A1 después del tratamiento preventivo en animales SOD1 y evaluación del alcance del objetivo a través de la cuantificación de los niveles de 24-OH colesterol a las 15 semanas de edad después del tratamiento preventivo. (A) Biodistribución en el sistema nervioso central y (B) órganos periféricos y (C) contenido de 24S-hidroxicolesterol en la médula espinal lumbar de ratones SOD1G93A evaluados por UPLC-HRMS. Los resultados se presentan como la media ± EEM.

Figura 6. Evaluación a las 15 semanas de edad de la expresión de CYP46A1-HA y análisis histológico de la médula espinal después de la administración intravenosa de AAVPHP.eB-CYP46A1 como un tratamiento preventivo. (A) tinción de HA en la sección cervical, torácica y lumbar de la médula espinal de animales SOD1 tratados con AAV; (B) Cotinción para HA y VachT en la sección cervical, torácica y lumbar de la médula espinal de animales TN, SOD1 y SOD1 AAV; (C) Cuantificación del número de motoneuronas; (D) Tinción Luxol en la sección lumbar de la médula espinal y (E) evaluación del porcentaje de mielina. Los resultados se presentan como la media ± EEM. *p<0,05, **p<0,01. El * negro corresponde al valor de p frente a los animales TN y el gris a los animales SOD1.

Figura 7. Mejora del fenotipo muscular en animales SOD1 tratados con AAV después del tratamiento preventivo. (A) Coloración de hemateína eosina para analizar el tamaño de las fibras en el músculo. Las áreas medias de las fibras se presentan en músculo tibial (B), gastrocnemio (D) y cuádriceps (F), así como la distribución del porcentaje de las fibras según su tamaño transversal en músculo tibial (C), gastrocnemio (E) y cuádriceps (G). Los resultados se presentan como la media ± EEM. *p<0,05, **p<0,01.

Figura 8. Preservación de las uniones neuromusculares en animales SOD1 tratados con AAV después del tratamiento preventivo. (A) Cotinción de neurofilamento (NF) y bungarotoxina (BTX) en animales TN, SOD1 y SOD1 tratados de 15 semanas de edad después de la administración intravenosa de AAVPHP.eB-CYP46A1. (B-C) Puntuación de UNM según su estado de inervación y su integridad a las 15 semanas de edad. (D) Evaluación de la formación de UNM a las 3 semanas en animales TN y SOD1 usando tinción triple para pan-NF, bungarotoxina y VachT. (E) cuantificación de UNM en base a su estado de maduración M1 a M4 a las 3 semanas de edad.

Figura 9. Análisis molecular de UNM a las 15 semanas con tratamiento preventivo. Análisis de la expresión de MuSK en músculo tibial (A) y gastrocnemio (B) y cuantificación de la expresión de nAchR en músculo tibialis (C) y gastrocnemio (D).

Figura 10. Evaluación del comportamiento de ratones SOD1 después de la administración intravenosa de AAVPHP.eB-CYP46A1 en etapa curativa (8 semanas). (A) Seguimiento del peso, (B) prueba de sujeción, (C) prueba invertida y (D) supervivencia. Los resultados se presentan como la media ± EEM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. El * negro corresponde al valor de p frente a los animales TN y el gris a los animales SOD1.

Figura 11. Biodistribución de AAVPHP.eB-CYP46A1 después del tratamiento preventivo en animales SOD1 y evaluación del alcance del objetivo a través de la cuantificación de los niveles de 24-OH colesterol a las 15 semanas de edad después del tratamiento curativo. Biodistribución en (A) sistema nervioso central y (B) órganos periféricos y (C) médula espinal lumbar del contenido de 24S-hidroxicolesterol en ratones SOD1G93A evaluados por UPLC-HRMS. Los resultados se presentan como la media ± EEM.

Figura 12. Evaluación a las 15 semanas de edad de la expresión de CYP46A1 -HA y análisis histológico de la médula espinal después de la administración intravenosa de AAVPHP.eB-CYP46A1 como tratamiento curativo. (A) Cotinción para HA y VachT en la sección lumbar de la médula espinal de animales TN, SOD1 y SOD1 AAV. (B) Cuantificación del número de motoneuronas en la sección lumbar de la médula espinal y (C) Tinción de Luxol en la sección lumbar de la médula espinal. Los resultados se presentan como la media ± EEM. *p<0,05, **p<0,01. El * negro corresponde al valor de p frente a los animales TN y el gris a los animales SOD1.

Figura 13. Corrección parcial del fenotipo muscular en animales SOD1 tratados con AAV después del tratamiento curativo. Las áreas medias de las fibras se presentan en músculo tibial (A), gastrocnemio (C) y cuádriceps (E), así como la distribución del porcentaje de las fibras según su tamaño transversal en músculo tibial (B), gastrocnemio (D) y cuádriceps (F). Los resultados se presentan como la media ± EEM. *p<0,05, **p<0,01.

Figura 14. Preservación de las uniones neuromusculares en animales SOD1 tratados con AAV después del tratamiento curativo. (A) Cotinción de neurofilamento (NF) y bungarotoxina (BTX) en animales TN, SOD1 y SOD1 tratados de 15 semanas de edad después de la administración intravenosa curativa de AAVPHP.eB-CYP46A1. (B-C) Puntuación de UNM según su estado de inervación y su integridad a las 15 semanas de edad.

Figura 15. Análisis molecular de UNM a las 15 semanas en tratamiento curativo. Análisis de la expresión de MuSK en músculo tibial (A) y gastrocnemio (B) y cuantificación de la expresión de nAchR en músculo tibial (C) y gastrocnemio (D).

Figura 16. Evaluación del comportamiento de ratones SOD1 después de la administración intravenosa de AAVPHP.eB-CYP46A1 en etapa curativa (8 semanas) a dosis alta. Prueba de sujeción. Los resultados se presentan como la media ± EEM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. El * negro corresponde al valor de p frente a los animales TN y el gris a los animales SOD1.

Figura 17. Evaluación del comportamiento de ratones C9ORF72 después de la administración intravenosa de AAVPHP.eB- CYP46A1 en etapa preventiva (4 semanas) a dosis alta. (A) Seguimiento del peso y (B) Comportamiento en la barra con muescas. Los resultados se presentan como la media ± EEM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. El * negro corresponde al valor de p frente a los animales TN y el gris a los animales C9ORF72.

Figura 18. (A) Evaluación de agregados de p62 en células después de la sobreexpresión de SMCR8 de TN o mutante y sobreexpresión de CYP46A1. (B) Cuantificación del número total de células transducidas positivas (HA) que reflejan la supervivencia neuronal en las diferentes condiciones.

Descripción detallada de la invención

Los inventores demostraron que la administración intravenosa de un vector que expresa un gen CYP46A1 en un modelo en ratón de ELA es capaz de prevenir/corregir el desarrollo del deterioro motor. Más particularmente, los inventores demostraron que la administración de un plásmido que expresa un gen CYP46A1 en neuronas estriatales primarias que modelan la patología de la esclerosis lateral amiotrófica da como resultado una disminución significativa de los agregados de p62, que es un sello distintivo de la disfunción de SMCR8 y está involucrado en la ELA a través del deterioro de la autofagia y mejora la supervivencia de las neuronas.

Sobre esta base, los inventores proporcionan un vector viral para el tratamiento de la ELA, en el que el vector expresa CYP46A1 en las células del sistema nervioso central, especialmente las motoneuronas y neuronas dentro de la corteza motora. Esta estrategia es útil en el tratamiento de cualquier trastorno de las motoneuronas que sea característico de alguna forma de ELA, principalmente a través de genes mutados comunes. En particular, los inventores proporcionan un vector viral para el tratamiento de la demencia frontotemporal (DFT) asociada a la ELA.

Esclerosis lateral amiotrófica

La presente invención se refiere específicamente al tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica. Preferiblemente, la presente invención se refiere al tratamiento de la ELA causada por factor(es) esporádico(s) y/o cuando una proteína asociada a la enfermedad (es decir, SOD1, FUS, C9ORF72, TDP43...) contiene una mutación de ganancia de función. En una realización, la presente invención se refiere al tratamiento de la ELA asociada con al menos un trastorno relacionado con las motoneuronas. Dichos trastornos de las motoneuronas relacionados se seleccionan preferiblemente de los trastornos de las motoneuronas inferiores o los trastornos de las motoneuronas superiores que incluyen paraplejia espástica. En una realización particular, la presente invención se refiere al tratamiento de la ELA asociada a la demencia frontotemporal (DFT). La DFT es una enfermedad neurodegenerativa mortal caracterizada por la degeneración neuronal en los lóbulos frontal y temporal que provoca un deterioro progresivo del lenguaje, la personalidad y el comportamiento. Al menos el 15-20% de los pacientes con ELA reciben un diagnóstico concomitante de DFT (Prudencio et al., 2015). En otra realización particular, la presente invención se refiere al tratamiento de la ELA sin demencia frontotemporal.

En el contexto de la invención, los términos "tratamiento" o "tratar" se utilizan en la presente memoria para caracterizar un método o proceso terapéutico que tiene como objetivo (1) ralentizar o detener la progresión, el agravamiento o el deterioro de los síntomas de la enfermedad o afección a la que se aplica dicho término; (2) aliviar o provocar mejoras de los síntomas del estado de enfermedad o afección a la que se aplica dicho término; y/o (3) revertir o curar la enfermedad o afección a la que se aplica dicho término.

Como se usa en la presente memoria, el término "sujeto" o "paciente" se refiere a un animal, preferiblemente a un mamífero, incluso más preferiblemente a un ser humano, incluidos los adultos y niños. Sin embargo, el término "sujeto" también puede referirse a animales no humanos, mamíferos como ratones y primates no humanos.

Secuencias de CYP46A1

Un primer objetivo de la invención se refiere a un vector para su uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, que comprende la secuencia completa del ácido nucleico que codifica la colesterol 24-hidroxilasa.

Como se usa en la presente memoria, el término "gen" se refiere a un polinucleótido que contiene al menos un marco de lectura abierto que puede codificar un polipéptido o proteína particular después de ser transcrito o traducido.

Como se usa en la presente memoria, las expresiones "secuencia codificante" o "una secuencia que codifica una proteína en particular", denotan una secuencia de ácido nucleico que se transcribe (en el caso del ^a DN) y se traduce (en el caso del ARNm) hasta un polipéptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante están determinados por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3' (carboxi). Una secuencia codificante puede incluir, pero sin limitación, ADNc de ARNm procariótico o eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN procariótico o eucariótico e incluso secuencias de ADN sintéticas.

El gen CYP46A1 codifica la colesterol 24-hidroxilasa. Esta enzima es miembro de la superfamilia de enzimas del citocromo P450. La enzima convierte el colesterol en 24S-hidroxicolesterol (24S-OH-Col) que puede cruzar dinámicamente la barrera hematoencefálica, logrando que la circulación periférica sea evacuada fuera del cuerpo (Bjorkhem et al., 1998), manteniendo así la homeostasis del colesterol. Una secuencia de ADNc para CYP46A1 se describe en el número de acceso de Genbank AF094480 (SEQ ID N°: 1). La secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID N°:2.

La invención hace uso de una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia SEQ ID N°: 1 o una variante de la misma para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica y, opcionalmente, los trastornos relacionados de las motoneuronas, como la DFT.

Las variantes incluyen, por ejemplo, variantes naturales debido a variaciones alélicas entre individuos (p. ej., polimorfismos), formas alternativas de corte y empalme, etc. El término variante también incluye las secuencias del gen CYP46A1 de otras fuentes u organismos. Las variantes son preferiblemente sustancialmente homólogas a SEQ ID N°: 1, es decir, exhiben una identidad de secuencia de nucleótidos típicamente de al menos aproximadamente el 75%, preferiblemente al menos aproximadamente el 85%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% con SEQ ID N°: 1. Las variantes de un gen CYP46A1 también incluyen las secuencias de ácido nucleico que se hibridan con una secuencia como se definió anteriormente (o una cadena complementaria de la misma) en condiciones de hibridación estrictas. Las condiciones de hibridación estrictas típicas incluyen las temperaturas superiores a 30 °C, preferentemente superiores a 35 °C, más preferentemente superiores a 42 °C, y/o una salinidad inferior a aproximadamente 500 mM, preferentemente inferior a 200 mM. El experto en la materia puede ajustar las condiciones de hibridación modificando la temperatura, la salinidad y/o la concentración de otros reactivos como SDS, SSC, etc.

Vectores no virales

En una realización, el uso del vector según la presente invención es un vector no viral. Normalmente, el vector no viral puede ser un plásmido que codifica CYP46A1. Este plásmido se puede administrar directamente o a través de un liposoma, un exosoma o una nanopartícula.

Vectores virales

Los vectores virales de administración de genes útiles en la práctica de la presente invención se pueden construir utilizando metodologías bien conocidas en la técnica de la biología molecular. Normalmente, los vectores virales que portan transgenes se ensamblan a partir de polinucleótidos que codifican el transgén, elementos reguladores adecuados y elementos necesarios para la producción de proteínas virales que median en la transducción celular.

Las expresiones "transferencia de genes" o "administración de genes" se refieren a métodos o sistemas para insertar de forma fiable ADN extraño en células huésped. Dichos métodos pueden dar como resultado la expresión transitoria del ADN transferido no integrado, la replicación extracromosómica y la expresión de replicones transferidos (p. ej., episomas) o la integración del material genético transferido en el ADN genómico de las células huésped.

Los ejemplos de vectores virales incluyen vectores de adenovirus, lentivirus, retrovirus, herpesvirus y virus adenoasociados (AAV).

Dichos virus recombinantes se pueden producir mediante métodos conocidos en la técnica, como la transfección con células de empaquetamiento o mediante la transfección transitoria con plásmidos auxiliares o virus. Los ejemplos típicos de células de empaquetamiento de virus incluyen las células PA317, células PsiCRIP, células GPenv+, células 293, etc. Los protocolos detallados para producir dichos virus recombinantes defectuosos de replicación se pueden encontrar, por ejemplo, en los documentos WO95/14785, WO96/22378, US5.882.877, US6.013.516, US4.861.719, US5.278.056 y WO94/19478.

En una realización preferida, se emplean vectores virales adenoasociados (AAV).

Por "vector AAV" se entiende un vector derivado de un serotipo de virus adenoasociado, que incluye, entre otros, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV10, como AAVrh.10, AAVPHP.eB, etc. Los vectores de AAV pueden tener uno o más de los genes de tipo natural de AAV eliminados en su totalidad o en parte, preferiblemente los genes rep y/o cap, pero conservan las secuencias ITR flanqueantes funcionales. Las secuencias ITR funcionales son necesarias para el rescate, la replicación y el empaquetamiento del virión de AAV. Por lo tanto, un vector AAV se define en la presente memoria para incluir al menos las secuencias requeridas en cis para la replicación y el empaquetamiento (p. ej., ITR funcionales) del virus. No es necesario que las ITR sean las secuencias de nucleótidos de tipo natural y pueden estar alteradas, p. ej., por la inserción, deleción o sustitución de nucleótidos, siempre que las secuencias proporcionen un rescate, replicación y empaquetamiento funcionales. Los vectores de expresión de AAV se construyen usando técnicas conocidas para proporcionar al menos como componentes unidos de forma operable en la dirección de la transcripción, elementos de control que incluyen una región de inicio de la transcripción, el ADN de interés (es decir, el gen CYP46A1) y una región de terminación de la transcripción. Se pueden incluir dos copias del ADN de interés, como una construcción autocomplementaria.

En una realización más preferida, el vector AAV es un vector AAV9, AAV10, preferiblemente AAVrh.10, AAVPHP.B o AAVPHP.eB, o un vector derivado de uno de estos serotipos. En una realización más preferida, el vector AAV es un vector AAVPHP.eB. El vector AAVPHP.eB es una variante evolucionada de AAV-PHP.B que transduce eficientemente las neuronas del SNC (Chan KY et al., 2017; documento WO2017100671). También se pueden utilizar otros vectores, como los descritos en los documentos WO2015038958 y WO2015191508.

Los elementos de control se seleccionan para que sean funcionales en una célula de mamífero. La construcción resultante que contiene los componentes unidos de forma operable está unida (5' y 3') con secuencias ITR de AAV funcionales. Por "repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociado" o "ITR de AAV" se entiende las regiones reconocidas en la técnica que se encuentran en cada extremo del genoma de AAV que funcionan juntas en cis como orígenes de la replicación del ADN y como señales de empaquetamiento para el virus. Las ITR de AAV, junto con la región codificante de rep de AAV, proporcionan la escisión y el rescate eficientes, y la integración de una secuencia de nucleótidos interpuesta entre dos ITR flanqueantes en el genoma de una célula de mamífero. Las secuencias de nucleótidos de las regiones ITR de AAV son conocidas (véase, por ejemplo, Kotin, 1994; Berns, KI "Parvoviridae and their Replication" en Fundamental Virology, 2.a edición, (B. N. Fields y D. M. Knipe, eds..) para la secuencia de AAV-2). Como se usa en la presente memoria, una "ITR de AAV" no comprende necesariamente la secuencia de nucleótidos de tipo natural, sino que puede estar alterada, p. ej., por la inserción, deleción o sustitución de nucleótidos. Además, la ITR de AAV puede derivar de cualquiera de varios serotipos de AAV, incluidos, entre otros, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, etc. Además, las ITR de 5' y 3' que flanquean una secuencia de nucleótidos seleccionada en un vector AAV no tienen que ser necesariamente idénticas o derivadas del mismo serotipo o aislamiento de AAV, siempre que funcionen según lo previsto, es decir, para permitir la escisión y el rescate de la secuencia de interés de un vector o genoma de la célula huésped, y para permitir la integración de la secuencia heteróloga en el genoma de la célula receptora cuando los productos del gen Rep de AAV están presentes en la célula.

Se prefieren particularmente los vectores derivados de los serotipos de AAV que tienen tropismo y altas eficiencias de transducción en las células del sistema nervioso central (SNC) de mamíferos, particularmente las neuronas. Davidson et al., 2000, proporciona una revisión y comparación de las eficiencias de transducción de los diferentes serotipos. En un ejemplo preferido, se ha demostrado que los vectores basados en AAV2 dirigen la expresión a largo plazo de transgenes en el SNC, preferiblemente transduciendo neuronas. En otros ejemplos no limitantes, los vectores preferidos incluyen vectores derivados de los serotipos AAV4 y AAV5, que también se ha demostrado que transducen células del SNC (Davidson et al., anteriormente mencionado). En particular, el vector puede ser un vector AAV que comprende un genoma derivado de AAV5 (en particular, las ITR son ITR de AAV5) y una cápside derivada de AAV5.

En una realización particular de la invención, el vector es un vector AAV pseudotipado. Específicamente, un vector de AAV pseudotipado comprende un genoma de AAV derivado de un primer serotipo de AAV y una cápside derivada de un segundo serotipo de AAV. Preferiblemente, el genoma del vector AAV deriva de AAV2. Además, la cápside deriva preferentemente de AAV5. Los ejemplos no limitantes específicos de vectores AAV pseudotipados incluyen un vector AAV que comprende un genoma derivado de AAV2 en una cápside derivada de AAV5, un vector AAV que comprende un genoma derivado de AAV2 en una cápside derivada de AAVrh.10, etc.

La secuencia de nucleótidos seleccionada está unida de forma operable a elementos de control que dirigen la transcripción o expresión de la misma en el sujeto in vivo. Dichos elementos de control pueden comprender secuencias de control normalmente asociadas con el gen seleccionado. En particular, tales elementos de control pueden incluir el promotor del gen CYP46A1, en particular el promotor del gen CYP46A1 humano (Ohyama Y et al., 2006).

Alternativamente, se pueden emplear secuencias de control heterólogas. Las secuencias de control heterólogas útiles generalmente incluyen las derivadas de secuencias que codifican genes virales o de mamíferos. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, el promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK), el promotor temprano de SV40, el promotor de LTR del virus del tumor mamario de ratón; promotor tardío principal de adenovirus (MLP Ad); un promotor del virus del herpes simple (HSV), un promotor del citomegalovirus (CMV) tal como la región promotora temprana inmediata (CMVIE) del CMV, el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), promotores sintéticos, promotores híbridos y similares. Además, las secuencias derivadas de genes no virales, tales como el gen de la metalotioneína murina, también tendrán uso en la presente memoria. Dichas secuencias promotoras están disponibles comercialmente, p. ej., de Stratagene (San Diego, CA). Para los fines de la presente invención, serán de uso particular tanto los promotores heterólogos como otros elementos de control, tales como promotores inducibles y específicos del SNC, potenciadores y similares.

Los ejemplos de promotores heterólogos incluyen el promotor de CMV. Los ejemplos de promotores específicos del SNC incluyen los aislados de los genes de la proteína básica de mielina (MBP), proteína ácida fibrilar glial (GFAP), sinapsinas (p. ej., promotor del gen de la sinapsina 1 humana) y enolasa específica de neuronas (NSE).

Los ejemplos de promotores inducibles incluyen elementos sensibles al ADN para ecdisona, tetraciclina, hipoxia y aufina.

El vector de expresión de AAV que alberga la molécula de ADN de interés unida por las ITR de AAV puede construirse insertando directamente la(s) secuencia(s) seleccionada(s) en un genoma de AAV del que se han eliminado los principales marcos de lectura abiertos ("ORF") del AAV. También se pueden eliminar otras partes del genoma del AAV, siempre que quede una parte suficiente de las ITR para permitir las funciones de replicación y empaquetamiento. Dichas construcciones pueden diseñarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., las patentes de EE. UU. n°s 5.173.414 y 5.139.941; las publicaciones internacionales n°s WO 92/01070 (publicada el 23 de enero de 1992) y WO 93/03769 (publicada el 4 de marzo de 1993); Lebkowski et al., 1988; Vincent et al., 1990; Carter, 1992; Muzyczka, 1992; Kotin, 1994; Shelling y Smith, 1994; y Zhou et al., 1994. Alternativamente, las ITR de AAV pueden escindirse del genoma viral o de un vector de AAV que contiene el mismo y fusionarse en 5' y 3' de una construcción de ácido nucleico seleccionada que está presente en otro vector utilizando técnicas de ligadura estándar. Los vectores AAV que contienen ITR se han descrito, p. ej., en la patente de EE. UU. n° 5.139.941. En particular, en ese documento se describen varios vectores AAV que están disponibles en la American Type Culture Collection ("ATCC") con los números de acceso 53222, 53223, 53224, 53225 y 53226. Además, se pueden producir sintéticamente genes quiméricos para incluir secuencias de ITR de AAV dispuestas en 5' y 3' de una o más secuencias de ácido nucleico seleccionadas. Pueden usarse codones preferidos para la expresión de la secuencia del gen quimérico en células del SNC de mamíferos. La secuencia quimérica completa se ensambla a partir de oligonucleótidos superpuestos preparados mediante métodos estándar (véase, por ejemplo, Edge, 1981; Nambair et al., 1984; Jay et al., 1984). Para producir viriones de rAAV, se introduce un vector de expresión de AAV en una célula huésped adecuada usando técnicas conocidas, como por transfección. Generalmente se conocen en la técnica varios métodos de transfección (véase, por ejemplo, Graham et al., 1973; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, y Chu et al., 1981). Los métodos de transfección particularmente adecuados incluyen la coprecipitación con fosfato de calcio (Graham et al., 1973), la microinyección directa en células cultivadas (Capecchi, 1980), la electroporación (Shigekawa et al., 1988), la transferencia de genes mediada por liposomas (Mannino et al., 1988), la transducción mediada por lípidos (Felgner et al., 1987) y la administración de ácidos nucleicos utilizando microproyectiles de alta velocidad (Klein et al., 1987).

Por ejemplo, un vector viral preferido, como el AAVPHP.eB, comprende, además de una secuencia de ácido nucleico que codifica la colesterol 24-hidroxilasa, el esqueleto del vector AAV con ITR derivadas de AAV-2, el promotor, como el promotor del gen PGK (fosfoglicerato quinasa) de ratón o el promotor híbrido de citomegalovirus/p-actina (CAG) que consta del potenciador del gen inmediato de citomegalovirus, el promotor, el donante de corte y empalme y el intrón del gen de la p-actina de pollo, el aceptor de corte y empalme del gen de p-globina de conejo, o cualquier promotor neuronal tal como el promotor del receptor de dopamina-1 o el receptor de dopamina-2 con o sin la forma natural o mutante del elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE).

Administración de los vectores

Se describe un método de tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, que comprende administrar un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la colesterol 24-hidroxilasa a un paciente que lo necesita. El vector puede administrarse directamente en el cerebro y/o la médula espinal del sujeto o mediante inyección intravascular, intravenosa, intranasal, intraventricular o intratecal. En una realización particular, el vector es AAVrh10 o AAVPHP.eB y se administra mediante inyección intravenosa.

En una realización particular, se describe un método para tratar la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en un sujeto, y dicho método comprende:

(a) proporcionar un vector como se definió anteriormente, que comprende un ácido nucleico que codifica la colesterol 24-hidroxilasa; y

(b) administrar el vector en el cerebro y/o la médula espinal del sujeto, por lo que dicho vector transduce células del cerebro y/o la médula espinal, y por lo que las células transducidas expresan la colesterol 24-hidroxilasa a un nivel terapéuticamente eficaz.

Ventajosamente, el vector es un vector viral, más ventajosamente un vector AAV, incluso ventajosamente un vector AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV9, AAV10 o AAVPHP.eB.

En una realización particular, el vector se administra en el cerebro, particularmente en la corteza motora y/o la médula espinal. En una realización particular, el vector se administra exclusivamente en la médula espinal.

En otra realización particular, el vector se administra por inyección intravenosa.

Los métodos de administración de vectores virales a neuronas y/o astrocitos y/u oligodendrocitos y/o microglía incluyen generalmente cualquier método adecuado para la administración de vectores a dichas células, directamente o a través de la transducción de células hematopoyéticas, de modo que se transduce al menos una parte de las células de una población celular seleccionada conectada sinápticamente. El vector puede administrarse a cualquier célula del sistema nervioso central, las células del sistema nervioso periférico o ambas. Preferiblemente, el vector se administra a las células del cerebro y/o la médula espinal. Generalmente, el vector se administra a las células del cerebro, incluidas, por ejemplo, las células de la corteza motora, la médula espinal o combinaciones de las mismas, o cualquier subpoblación adecuada de las mismas.

Para administrar el vector específicamente en una región particular y a una población particular de células del cerebro o de la médula espinal, el vector puede administrarse mediante microinyección estereotáctica. Por ejemplo, los pacientes tienen la base del marco estereotáctico fijada en su lugar (atornillada al cráneo). El cerebro con la base del marco estereotáctico (compatible con la IRM con marcas de referencia) se somete a formación de imágenes mediante IRM de alta resolución. Luego, las imágenes de resonancia magnética se transfieren a una computadora que ejecuta un programa informático estereotáctico. Se utiliza una serie de imágenes frontales, sagitales y axiales para determinar el objetivo (lugar de inyección del vector) y la trayectoria. El programa informático traduce directamente la trayectoria en coordenadas tridimensionales apropiadas para el marco estereotáctico. Se realiza una trepanación en el sitio de entrada y se coloca el aparato estereotáctico con la aguja implantada a la profundidad determinada. Luego, el vector se inyecta en los sitios seleccionados como objetivo y finalmente se mezcla con un agente de contraste. Dado que el vector se integra en las células diana, en lugar de producir partículas virales, la posterior propagación del vector es menor y principalmente una función de la difusión pasiva desde el sitio de inyección y, por supuesto, el transporte transináptico deseado, antes de la integración. El grado de difusión puede controlarse ajustando la proporción de vector respecto del vehículo líquido.

Las vías de administración adicionales también pueden comprender la aplicación local del vector bajo visualización directa, p. ej., la aplicación cortical superficial, la aplicación intranasal u otra aplicación no estereotáctica.

Las células diana de los vectores de la presente invención son células de la médula espinal (motoneuronas) y del cerebro (corteza motora) de un sujeto aquejado de ELA, preferiblemente las células neurales.

Preferiblemente, el sujeto es un ser humano, generalmente un adulto, pero puede ser un niño o un lactante. Sin embargo, la invención abarca la administración del vector a los modelos biológicos de la enfermedad. En ese caso, el modelo biológico puede ser cualquier mamífero en cualquier etapa del desarrollo en el momento de la administración, p. ej., embrionario, fetal, infantil, juvenil o adulto, y preferentemente es un adulto. Además, las células diana pueden ser esencialmente de cualquier fuente, especialmente primates no humanos y mamíferos de los órdenes Rodenta (ratones, ratas, conejos, hámsters), Carnivora (gatos, perros) y Arteriodactyla (vacas, cerdos, ovejas, cabras, caballos), así como cualquier otro sistema no humano (por ejemplo, el sistema del modelo de pez cebra).

Preferiblemente, el uso de la invención comprende la administración intracerebral, a través de inyecciones estereotácticas. Sin embargo, también se pueden adaptar otros métodos de administración conocidos según la invención. Por ejemplo, para una distribución más amplia del vector en el cerebro, puede inyectarse en el líquido cefalorraquídeo, p. ej., por punción lumbar, en la cisterna magna o punción ventricular. Para dirigir el vector al cerebro, puede inyectarse en la médula espinal o en los ganglios periféricos, o en la carne (por vía subcutánea o intramuscular) de la parte del cuerpo de interés. En ciertas situaciones, como con AAVPHP.eB, el vector se puede administrar a través de un enfoque intravascular. Por ejemplo, el vector se puede administrar por vía intraarterial (carotídea) en situaciones en las que la barrera hematoencefálica está alterada. Además, para una administración más global, el vector puede administrarse durante la "apertura" de la barrera hematoencefálica lograda mediante la infusión de soluciones hipertónicas que incluyen manitol, o la administración local por ultrasonidos.

Los vectores usados en la presente memoria pueden formularse en cualquier vehículo adecuado para la administración. Por ejemplo, pueden colocarse en una suspensión, solución o emulsión farmacéuticamente aceptable. Los medios adecuados incluyen las preparaciones salinas y liposomales. Más específicamente, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales como el aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables como el oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluidos los medios salinos y tamponados. Los vehículos intravenosos incluyen los reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer) y similares.

También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares.

También se puede usar un sistema de dispersión coloidal para la administración dirigida de genes. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen los complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas o exosomas.

Las dosis y el régimen preferidos los puede determinar un médico y dependen de la edad, el sexo, el peso del sujeto y la etapa de la enfermedad. Como ejemplo, para la administración de colesterol 24-hidroxilasa usando un vector de expresión viral, cada dosificación unitaria de vector que expresa la colesterol 24-hidroxilasa puede comprender de 2,5 a 100 pl de una composición que incluye un vector de expresión viral en un líquido farmacéuticamente aceptable y que proporciona de 1010 hasta 10l5 partículas virales que expresan la colesterol 24-hidroxilasa por ml de composición.

El vector puede usarse en el tratamiento curativo y/o en el tratamiento preventivo.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la colesterol 24-hidroxilasa para el uso en un tratamiento preventivo de la ELA.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la colesterol 24-hidroxilasa para el uso en un tratamiento curativo de la ELA.

Composición farmacéutica

Otro objetivo de la invención se refiere a una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento de la ELA, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector según la invención.

Por "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una cantidad suficiente del vector de la invención para tratar la ELA con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico.

Se entenderá que la dosificación diaria total de los compuestos y las composiciones de la presente invención la decidirá el médico que aplica el tratamiento dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administración, la vía de administración y la velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o coincidentes con el polipéptido específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, se halla en la experiencia en la técnica comenzar las dosis del compuesto a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado. Sin embargo, la dosis diaria de los productos puede variar en un amplio rango por adulto por día. La cantidad terapéuticamente eficaz del vector según la invención que se debe administrar, así como la dosificación para el tratamiento de una afección patológica con el número de partículas virales o no virales y/o las composiciones farmacéuticas de la invención, dependerá de numerosos factores, que incluyen la edad y el estado del paciente, la gravedad de la alteración o el trastorno, el método y la frecuencia de administración y el péptido particular a utilizar.

La presentación de las composiciones farmacéuticas que contienen el vector según la invención puede ser en cualquier forma que sea adecuada para la administración intramuscular, intracerebral, intranasal, intratecal, intraventricular o intravenosa. En las composiciones farmacéuticas de la presente invención para administración intramuscular, intranasal, intravenosa, intracerebral, intratecal o intraventricular, el principio activo, solo o en combinación con otro principio activo, puede administrarse en forma de administración unitaria, como una mezcla con adyuvantes farmacéuticos convencionales, a animales y seres humanos.

Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que se puede inyectar. Éstas pueden ser, en particular, soluciones salinas estériles, isotónicas (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares, o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas, que al añadirlas, dependiendo del caso, agua esterilizada o suero fisiológico, permiten la constitución de soluciones inyectables estériles.

Tras la formulación, las soluciones se administrarán de manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas farmacéuticas, como el tipo de soluciones inyectables, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármacos y similares.

También se pueden administrar dosis múltiples.

También es posible asociar el enfoque terapéutico con pequeñas moléculas que podrían activar CYP46A1, como efavirenz (Mast N et al., 2013; Mast N et al., 2017; Mast N et al., 204; Mast N et al., 2017) o fármacos antifúngicos (Mast N et al. 2013; Fourgeux et al., 2014) que, por el contrario, podrían inhibir CYP46A1 y, por lo tanto, ser una forma de detener el enfoque de la terapia génica si fuera necesario.

La invención se ilustrará adicionalmente mediante el siguiente ejemplo. Sin embargo, este ejemplo y las figuras que lo acompañan no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invención. Ejemplo

En este experimento se ha generado un modelo in vitro de ELA basado en la sobreexpresión de SMCR8 D928V, un mutante de SMCR8, que forma un complejo con C9ORF72 y WDR1 y actúa como factor de intercambio de GDP/GTP para RAB8 y RAB39b, y así controla el flujo autofágico (Sellier et al., 2016). Se ha sobreexpresado tanto el SMCR8 de TN como el SMCR8 mutante, lo que altera la autofagia al expresar siARN para SMCR8.

Materiales y métodos

Animales

Se obtuvieron dos ratones macho B6SJL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J de Jackson Laboratories (cepa 002726) y se aparearon con ratones C57BL/6 para generar la colonia.

Se obtuvieron tres ratones machos FVB/NJ-Tg(C9orf72)500Lpwr/J de Jackson Laboratories (cepa 029099) y se aparearon con ratones FVB/NJ para generar la colonia.

Los ratones se alojaron en una sala con la temperatura controlada y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se les proporcionó comida y agua a voluntad. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la directiva del Consejo de la Comunidad Europea (2010/63/EU) para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Diseño de plásmidos AAV y producción de vectores

Los vectores AAV fueron producidos y purificados por Atlantic Gene Therapies (INSERM U1089, Nantes, Francia). La producción de los vectores se ha descrito en otro lugar (Hudry E et al., 2010). Las construcciones virales para AAVPHP.eB-CYP46A1 -HA contenían el casete de expresión que consiste en el gen Cyp46a1 humano, controlado por un potenciador temprano de CMV/promotor sintético (CAG) de p-actina de pollo (CAG) rodeado por secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV2. Los títulos finales de los lotes estaban entre 1,5 y 21013 gv/ml. Genotipado

Los ratones se genotiparon de acuerdo con el procedimiento de laboratorio de Jackson (https://www2.jax.org/ protocolsdb/f?p=116:5:0::NO:S:P5_MASTER_PROTOCOL_ID,P5_JRS_CODE:24173,002726) para la línea de ratones SOD1G93A y https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:5:0::NO:5:P5_MASTER_PROTOCOL_ID,P5_JRS_ CODE:30889,029099 para la línea C9ORF72 500r.

Inyección intravenosa

Para determinar la dosis de AAVPHP.eB-CYP46A1 -HA a inyectar en el modelo de ratón con ELA, se han inyectado 3 dosis de 2,5-10” gv total (dosis baja), 51011 gv total (dosis media) y 11012 gv total (dosis alta) (n=3 por grupo) a animales C57BL6 a la edad de 8 semanas.

Para el tratamiento preventivo, se anestesiaron ratones SOD1G93A de tres semanas de edad o C9ORF72 500r de cuatro semanas de edad con isoflurano al 4% y luego se mantuvieron al 2% con un 80% de aire y un 20% de oxígeno. El animal SOD1 recibió una inyección de 2,5-10” gv totales (dosis baja) o 51011 gv totales (dosis media) (volumen de 100 gl) por vía intravenosa mediante inyección retroorbital. Los animales TN y SOD1 no inyectados recibieron una inyección de 100 gl de solución salina.

Detalle de los grupos preventivos:

• Estudio SOD1: n=10 TN; n=12 SOD1 y n=14 SOD1 AAV a 2,5-10” gv totales

• Estudio C9: n=16 TN; n=16 C9 y n=17 C9 AAV a 51011 gv totales

Para el tratamiento curativo, se anestesiaron ratones SOD1G93A de ocho semanas o C9ORF72 500r de dieciséis semanas con isoflurano al 4% y luego se mantuvieron al 2% con un 80% de aire y 20% de oxígeno. El animal SOD1 recibió una inyección de 2,5-10” gv totales (dosis baja) o 51011 gv totales (dosis media) (100 gl de volumen) por vía intravenosa mediante inyección retroorbital. Los animales TN y SOD1 no inyectados recibieron una inyección de 100 gl de solución salina.

Detalles de los grupos curativos:

- Estudio SOD1:

o n=24 TN; n=27 SOD1 y n=22 SOD1 AAV a 2,5-10” gv totales

o n=5 TN; n=5 SOD1 y n=7 SOD1 AAV a 51011 gv totales

- Estudio C9: n=14 TN; n=13 C9 y n=12 C9 AAV a 51011 gv totales

Pruebas de comportamiento

Seguimiento del peso

Todos los animales se pesaron antes de la inyección y cada semana para los animales SOD1 y cada dos semanas para los animales C9ORF72.

Prueba de sujeción

La prueba de sujeción evalúa la coordinación y es clásica para la evaluación de la ELA. Los animales se puntuaron antes de la inyección y luego cada 2 semanas desde las 6 u 8 semanas hasta las 15 semanas. Los animales se sujetan por la cola y la puntuación es uno si los ratones se retuercen, y luego se añade un punto por cada retraimiento de las patas traseras. Los resultados se presentan para cada prueba como la media ± EEM para cada grupo, y se realizaron análisis de la prueba t.

Prueba invertida

La prueba invertida evalúa la fuerza y es clásica para la evaluación de la ELA. Los animales se puntuaron antes de la inyección y luego cada 2 semanas desde las 6 u 8 semanas hasta las 15 semanas. Los animales se colocan sobre la rejilla y se invierte, se realiza inmediatamente la puntuación de las patas restantes agarradas a la rejilla (inversión corta). Los resultados se presentan para cada prueba como la media ± EEM para cada grupo, y se realizaron análisis de la prueba t.

Para el modelo C9, los ratones se expusieron aún más a la prueba invertida para obtener resultados más sólidos mediante 3 pruebas de 5 minutos cada una con 15 minutos de recuperación entre cada prueba. Para cada ensayo, se puntúa el tiempo que se mantienen agarrados y se calcula la media para cada animal.

Barra con muescas

La coordinación se evaluó mediante la prueba de la barra con muescas (puntuación del número de caídas de las extremidades superiores o inferiores) como se describió anteriormente (Piguet F et al., 2018).

Evaluación de la supervivencia

Los ratones se observaron diariamente y se sacrificaron inmediatamente si cumplían los criterios de valoración (arrastre de las patas traseras o >20% de pérdida de peso corporal).

Recogida de tejidos

Los ratones se anestesiaron con una disolución de pentobarbital (Euthasol 180 mg/kg) y se les perfundió transcardiacamente solución salina tamponada con fosfato (PBS). El cerebro, la médula espinal y los nervios ciáticos, así como los órganos periféricos (hígado, corazón, pulmón, riñón, bazo) se recogieron y se posfijaron en PFA al 4% antes de la inclusión en parafina para el examen histológico (corte de 6-10 gm con micrótomo) o se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido para el análisis biomolecular.

Los músculos de las extremidades se disecaron y se fijaron posteriormente durante la noche a 4 °C en PFA/PBS al 4%. Las muestras se enjuagaron tres veces en PBS y se crioprotegieron en sacarosa al 20%/PBS durante 48 horas. Los tejidos se incluyeron en Cryomatrix (Thermoscientific) y se cortaron (20 gm) utilizando un criostato (Leica CM3050S). Los criocortes se secaron a temperatura ambiente y se almacenaron a -20 °C.

Se disecaron los músculos gastrocnemio, tibial, cuádriceps y parte de la médula espinal y se congelaron en nitrógeno líquido.

Se trituraron los diferentes tejidos en nitrógeno líquido y se separaron para analizar la expresión de ARN o ADN. Cultivo y transfección de células estriatales primarias

Se disecaron las neuronas estriatales primarias de embriones del día 14 de ratones Swiss gestantes (Janvier) como se describió anteriormente (Charvin D et al., 2005; Deyts et al., 2009). Después de 7 días in vitro, se realizó una transfección transitoria de células estriatales con Lipofectamina™ 2000 (Invitrogen). En esta etapa, se observaron muy pocas células gliales (55%; datos no mostrados). Las células se transfectaron siguiendo 5 condiciones (CYP46A1 -HA; SMWR8 TN-HA; SMCR8 D928V-HA, SMWR8 TN-HA CYP46A1-HA; SMCR8 D928V-HA CYP46A1 HA) y las células no transfectadas se usaron como controles. Se realizaron N = 6 repeticiones para cada condición. Transfección con lipofectamina en cámaras Labtek de 8 pocillos con 100 ng de ADN para cada plásmido durante 16 h antes de la fijación celular.

Anticuerpos primarios

Los anticuerpos utilizados en los análisis inmunohistoquímicos (IHC) se enumeran en la Tabla 1, a continuación.

Tabla 1: Anticuerpos utilizados en los análisis de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica (IHC)

Inmunotinción

En las células

Se inició el procedimiento de inmunofluorescencia, mediante la fijación de las células durante 15 min en PFA. Después de tres lavados, las células se permeabilizaron en PBS/Triton X-100 al 0,3 % y luego se bloquearon en PBS/Triton X-100 al 0,1% que contenía suero de cabra normal al 5% (NGS, Gibco) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las células se incubaron con los respectivos anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Después de tres lavados, las células se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente (1:1000; Vector Laboratories Inc., CA, EE. UU.) diluido en PBS/0,1% de Triton X-100 durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados, las células se secaron y montaron en medio de montaje con DAPI.

En cortes de parafina

Músculos: los criocortes musculares se trataron con glicina 0,1 M en PBS durante 30 minutos antes del procesamiento. Después de los lavados en PBS, los cortes se permeabilizaron con PBS/0,3% de TritonX-100 durante 10 min y se saturaron con PBS/0,3% de Triton/10% de BSA durante 45 min. Los anticuerpos primarios se diluyeron en la disolución de saturación y se incubaron durante la noche a 4 °C. Después de los lavados en PBS/0,1% de Triton, los anticuerpos secundarios y la a-bungarotoxina se diluyeron en PBS/0,1% de Triton/10% de BSA y se añadieron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de los lavados en PBS/0,1% de Triton, los portaobjetos se montaron con medio de montaje acuoso fluorescente (F4680, Sigma).

Los anticuerpos primarios para la inmunofluorescencia fueron el anti Pan-Neurofilamento de ratón (1:1000; Biolegend, 837904), el anti-transportador de acetilcolina vesicular de conejo (VAChT; 1:1000; sigma, 2000559). Los anticuerpos secundarios se diluyeron 1:1000 y fueron anti-conejo de burro/AlexaFluor 594, anti-ratón/AlexaFluor Cy3 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.).

Se incubó alfa-bungarotoxina-Alexa594 (1:2000; Life Technologies, B13422) con los anticuerpos secundarios. Las imágenes se tomaron con un microscopio invertido confocal SP8 Leica DLS (Carl Zeiss, Zaventem, Bélgica). Para todas las imágenes, el brillo y el contraste se ajustaron con el programa informático ImageJ después de la adquisición para que coincidieran con la observación.

Médula espinal: Para la inmunofluorescencia, las médulas espinales se trataron con Tris 10 mM/EDTA 1 mM/Tween al 0,1%, pH 8,75 a 95 °C durante 45 min. Después de los lavados en PBS, los cortes se incubaron con la disolución de permeabilización (PBS/0,3% de TritonX-100) durante 15 min y luego con la disolución de saturación (PBS/0,1% de TritonX-100/10% de suero de caballo) durante 1 hora. Los anticuerpos primarios se diluyeron en suero de caballo al 10%/PBS/Triton X-100 al 0,1% y se incubaron con los cortes de tejido durante la noche a 4 °C. Después de los lavados en PBS/0,1% de TritonX-100, los cortes se incubaron con anticuerpos secundarios (anti-conejo de burro con Alexa 594 y anti-ratón de burro con Alexa 488, 1:1000, Life Technologies).

El marcaje inmunohistoquímico se realizó mediante el método ABC. Brevemente, los cortes de tejido se trataron con peróxido durante 30 minutos para inhibir la peroxidasa endógena. Después de los lavados en PBS, los cortes se trataron con Tris 10 mM/EDTA 1 mM/Tween al 0,1 %, pH 8,75 a 95 °C durante 45 min (solo para anti-HA). Después de los lavados en PBS, los cortes se incubaron con la disolución de bloqueo (suero de cabra al 10 % o suero de cabra en PBS/0,3% de TritonX-100) durante 1 hora. Los anticuerpos primarios se diluyeron en disolución de bloqueo y se incubaron con los cortes de tejido durante la noche a 4 °C. Después de los lavados en PBS, los cortes se incubaron secuencialmente con anticuerpos anti-conejo de cabra o anti-ratón de cabra conjugados con biotina (Vector Laboratories) durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido del complejo ABC (Vector Laboratories). Después de los lavados en PBS, se detectó la actividad de peroxidasa utilizando diaminobencidina como cromógeno (Dako, Carpinteria, CA). En algunos casos, los portaobjetos se contrastaron con hematoxilina. Los portaobjetos se montaron con Depex (VWR International).

Tinción de Luxol

La mielina de los cortes de la médula espinal se tiñó/visualizó con una tinción clásica de Luxol.

Adquisición de imágenes

Las imágenes de los portaobjetos de inmunofluorescencia se adquirieron con un macroscopio (Leica) y el programa informático LAS V3.8 (Leica), a temperatura ambiente, con un microscopio Leica DM 5000B equipado con una cámara digital Leica DFC310FX. Se tomaron fotografías como comparación en condiciones idénticas de adquisición de imágenes, y todos los ajustes de brillo y contraste se aplicaron uniformemente a todas las imágenes para el análisis de los cultivos celulares.

Para músculo y VachT, las imágenes se adquirieron con un Axioscan Zeiss con el programa informático ZEN 2.6 o Nanozoomer. Para todas las imágenes, el brillo y el contraste se ajustaron con el programa informático ImageJ después de la adquisición para que coincidieran con la observación.

Para toda la IHC y la coloración, los cortes se adquirieron utilizando el escáner de portaobjetos de Hamamatsu. Análisis de las fibras musculares

Los músculos tibial anterior (TA), gastrocnemio (gastro) y cuádriceps (quadri) se disecaron a las 15 semanas. Se fijaron en formol, se incluyeron en parafina, se cortaron (10 mm) y se tiñeron con hematoxilina/eosina. Las imágenes se adquirieron con un Axioscan Zeiss con el programa informático ZEN 2.6. El área transversal de la fibra muscular (CSA) se midió en un mínimo de 150 fibras para TA, Gastro, Quadri en cada animal (n = 4-13) utilizando el programa informático ImageJ.

Análisis de las uniones neuromusculares

La morfología de las UNM se cuantificó en un mínimo de 100 uniones de TA de 3 animales diferentes. La distribución de la placa terminal se clasificó en seis categorías: (1) placa terminal normal, (2) placa terminal modificada, (3) placa terminal fragmentada, (4) placa terminal degradada, (5) placa terminal sin orificio y (6) placa terminal ectópica. Se analizó un mínimo de 100 uniones para cada animal (n = 3-4). La maduración de la placa terminal motora se evaluó en ratones P21 según los criterios descritos anteriormente (Audouard et al.).

Cuantificación de las motoneuronas

Se cuantificó el número de motoneuronas en las secciones de la médula espinal cervical, torácica y lumbar después de la inmunohistoquímica de VAChT. El número de motoneuronas transducidas se cuantificó después de la inmunohistoquímica de HA. El recuento de las motoneuronas se realizó en los lados ventrales izquierdo y derecho de tres secciones de la médula espinal para cada ratón (n = 3).

Cuantificación de Luxol

Se midió el área total de mielina en la médula espinal lumbar usando el programa informático Fiji y se normalizó mediante el área total de la médula espinal. Se informó después el porcentaje de mielina como el 100% en TN y los resultados se informaron en comparación con los animales TN.

Extracción de ADN

Se extrajo el ADN del cerebro, la médula espinal y los órganos periféricos utilizando el protocolo de cloroformo/fenol. Extracción de ARN

Se extrajo el ARN total de una parte de la médula espinal lumbar, el músculo gastrocnemio, el tibial y el cuádriceps en ratones y la médula espinal lumbar del paciente utilizando Trizol o TriReagent (Sigma). Se transcribió un microgramo de ARN total hasta ADNc con el kit de síntesis de ADNc Transcriptor First Strand (Roche) según las instrucciones del fabricante.

q-PCR

El ADNc se amplificó con SyberGreen (Roche). Los cebadores para RT-qPCR se encuentran en la siguiente tabla. El protocolo de amplificación para todos los cebadores es un inicio en caliente (95 °C durante 5 min), 45 ciclos de amplificación (95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min) y un análisis de la curva de fusión. Los datos se analizaron utilizando el programa informático Lightcycler 480 con un factor de eficiencia para cada gen y se normalizaron respecto de la actina.

Se midió el número de copias del genoma del vector mediante qPCR en el ADN genómico extraído de DRG, médula espinal (niveles cervical, torácico y lumbar), cerebro, cerebelo y órganos periféricos utilizando el kit Light Cycler 480 SYBR Green I Master (Roche, Francia). Los resultados (número de copias del genoma del vector por célula) se expresaron como diferencias de n veces en el número de copias de la secuencia del transgén respecto de la copia del gen Adck3 como patrón interno (número de copias del genoma viral por genoma 2N).

Mediciones de colesterol y oxisterol

El análisis de colesterol y oxisterol siguió el método del "estándar de oro"25 para minimizar la formación de artefactos de autooxidación. Brevemente, las muestras de tejido estriado de ratón se pesaron y homogeneizaron con un aparato Tissue Lyser II (Qiagen) en una disolución de 500 pl que contenía hidroxitolueno butilado (BHT, 50 pg/ml) y EDTA (0,5 M). En este punto, se añadió una mezcla de patrones internos [epicoprostanol, 2H7-7-latosterol, 2H6-desmosterol, 2H6-lanosterol y 2H7-24(R/S)-hidroxicolesterol] (Avanti Polar Lipids). La hidrólisis alcalina se realizó bajo Ar usando KOH etanólico 0,35 M durante 2 h a temperatura ambiente. Después de la neutralización de la disolución con ácido fosfórico, los esteroles se extrajeron en cloroformo. La fase inferior se recogió, se secó bajo una corriente de nitrógeno y el residuo se disolvió en tolueno. Luego se separaron los oxiesteroles del colesterol y sus precursores en un cartucho de sílice Isolute de 100 mg (Biotage); el colesterol se eluyó en propan-2-ol al 0,5% en hexano seguido de los oxiesteroles en propan-2-ol al 30% en hexano. Las fracciones de esterol y oxisterol se sililaron de forma independiente con Regisil® 10% de TMCS [bis(trimetilsilil) trifluoroacetamida 10% de trimetilclorosilano] (Regis Technologies) como se describió anteriormente26. Los derivados de trimetilsililéter de los esteroles y oxiesteroles se separaron por cromatografía de gases (Hewlett-Packard serie 6890) en una columna capilar de polaridad media RTX-65 (65% difenil 35% dimetil polisiloxano, longitud de 30 m, diámetro de 0,32 mm, espesor de película de 0,25 pm; Restesk). El espectrómetro de masas (Agilent 5975 Inert XL) en serie con la cromatografía de gases se configuró para la detección de iones positivos. Los iones se produjeron en el modo de impacto de electrones a 70 eV. Fueron identificados por el fragmentograma en el modo de escaneo y cuantificados por monitorización selectiva de los iones específicos después de la normalización y calibración con los patrones internos y externos apropiados [epicoprostanol m/z 370, 2H7-7-latosterol m/z 465, 2H6-desmosterol m/z 358, 2H6-lanosterol m/z 504, 2H7-24(R/S)-hidroxicolesterol m/z 553, colesterol m/z 329, 7-latosterol m/z, 7-deshidrocolesterol m/z 325, 8-deshidrocolesterol m/z 325, desmosterol m/z 343, lanosterol m/z 393 y 24(R/S)-hidroxicolesterol m/z 413].

Análisis cuantitativo mediante inmunofluorescencia de la supervivencia neuronal

La supervivencia neuronal se evaluó mediante la cuantificación directa de células HA positivas en las diversas condiciones en 5 pocillos por condición con un aumento de 10x en el microscopio Leica.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de Student no apareada. Los resultados se expresan como la media ± EEM. Se establecieron umbrales significativos en P<0,05, P<0,01 y P<0,001, tal como se define en el texto. Todos los análisis se realizaron con el programa informático GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, EE. UU.).

Resultados

Evaluación basal de la ruta del colesterol en animales SOD1

Se han cuantificado los niveles de expresión de varios genes de la ruta del colesterol en la médula espinal lumbar de animales SOD1G93A y TN de 8 semanas (Figura 1). Se ha observado una disminución significativa de CYP46A1 y ApoE (Figura 1A) y una tendencia para SREBP1, SREBP2 y HMGCR (Figura 1A). Además, se ha realizado la medición de 24-hidroxicolesterol a las 15 semanas de edad en la médula espinal lumbar de animales SOD1G93A y TN demostrando una disminución importante (alrededor del 60% de disminución) de su contenido en los animales SOD1G93A en comparación con los animales TN (Figura 1B). Estos resultados confirman la hipótesis de que la modulación de CYP46A1 en los modelos de ELA también rescatan el fenotipo de ELA.

Validación de AAVPHP.eB como buen vector para la ELA

Los inventores investigan primero si AAVPHP.eB es un buen vector para la ELA. Para este propósito, se inyectaron a animales TN de 8 semanas de edad dosis bajas (2,51011 gv), medias (51011 gv) o altas (1 1012 gv) de AAVPHP.eB que codificaba CYP46A1-HA. Se ha destacado una buena actividad selectiva de las motoneuronas con las 3 dosis (Figura 2) sin grandes diferencias entre las dosis bajas y altas y una tasa de transducción del 50 al 60% (Figura 2).

Esta gran transducción no está asociada a ninguna respuesta inmunitaria en la médula espinal, incluso en el grupo de dosis altas según lo evaluado con GFAP (Figura 3) y la evaluación de tinción de Iba1 (datos no presentados) que no condujo a ninguna microgliosis o astrogliosis (Figura 3).

Estos resultados motivaron a continuar con la dosis baja del vector.

Prevención del fenotipo de ELA en el modelo de ratón SOD1G93A de ELA

La sobreexpresión de CYP46A1 previene las alteraciones conductuales en un modelo de ratón con ELA con tratamiento preventivo.

Los inventores investigaron si la estimulación de la ruta del metabolismo del colesterol, a través del aumento de los niveles de CYP46A1, podría mejorar la alteración motora en un modelo in vivo de ELA: el modelo de SOD1G93A. La sobreexpresión de CYP46A1 mediante la administración intravenosa preventiva de AAVPHP.eB-CYP46A1-HA en ratones de 3 semanas de edad previene claramente la alteración motora en el modelo de ratón. Primero, los ratones SOD1G93A tratados con AAV tienen una curva de crecimiento mejorada (Figura 4A). La administración preventiva de AAVPHP.eB-CYP46A1-HA corrige significativamente el deterioro motor medido por la prueba de sujeción (Figura 4B) y previene completamente la alteración medida por la prueba invertida (Figura 4C).

El estudio de biodistribución reveló alrededor de 1 copia del genoma del vector (CGV) en todos los niveles de la médula espinal y entre 2 y 4 copias en el cerebro (Figura 5A), así como una transducción muy baja de los tejidos periféricos con un máximo de 0,4 CGV en el corazón y menos de 0,1 CGV en los otros órganos periféricos (Figura 5B). El alcance del objetivo se ha validado con la cuantificación del 24-hidroxicolesterol en la médula espinal lumbar de los animales, lo que revela un aumento de 3 veces en los animales tratados en comparación con los animales TN (Figura 5C).

Este aumento del 24-OH colesterol se correlaciona perfectamente con una gran expresión de CYP46A1-HA en todos los niveles de la médula espinal, especialmente en las motoneuronas (MN) (Figura 6A), lo que también confirmó los resultados obtenidos previamente en los animales TN (Figura 2).

Se ha demostrado una preservación parcial de las MN a nivel lumbar (alrededor del 60% en comparación con el TN), evaluada mediante la cuantificación de la co-tinción con VachT y HA (Figura 6B y C), un número similar de MN en la sección torácica en comparación con el TN y sin diferencia a nivel cervical (Figura 6C). Esta preservación del 60% es suficiente para evitar la desmielinización de la médula espinal lumbar, como se demuestra con la tinción de Luxol y la cuantificación del porcentaje de mielina (Figura 6D y E). Los animales SOD1 tratados con AAV tenían un porcentaje de mielina igual al de los animales TN y significativamente mayor que el de los animales SOD1 no tratados.

El otro aspecto que los inventores querían investigar era el fenotipo muscular; de hecho, los músculos se ven muy afectados en la ELA, principalmente debido a la pérdida de inervación y de las uniones neuromusculares (UNM), consecutiva a la pérdida de las MN.

Primero demostraron una preservación significativa de la estructura muscular evaluada mediante la medición del área media de las fibras (Figura 7A). El músculo tibial del animal SOD1 tratado muestra un aumento significativo del área media de las fibras en comparación con los animales no tratados (Figura 7B), y la distribución según el área transversal de las fibras demostró claramente la preservación de las fibras de sección transversal grande (Figura 7B). Se han observado resultados similares para el músculo gastrocnemio (Figura 7D y E) y el cuádriceps (Figura 7F y 7G).

Luego, se enfocan en el fenotipo de las UNM, demostrando un mayor número de uniones inervadas en los animales tratados en comparación con los animales SOD1 no tratados (Figura 8A y B), así como una estructura mejorada de las UNM con un número notablemente mayor de UNM con placas terminales normales o placas terminales más gruesas y un número reducido de placas terminales ectópicas y fragmentadas (Figura 8C).

Este resultado es particularmente importante y tiene un significado terapéutico, porque cuando los inventores evaluaron el estado de las UNM a las 3 semanas en animales TN y SOD1G93A no tratados, las UNM revelaron que ya eran patológicas a las 3 semanas con un mayor número de uniones inmaduras en los animales SOD1 en comparación con los TN (Figura 8D y E). Esto significa que incluso cuando se inyecta AAV-CYP46A1 cuando las UNM no se han formado correctamente, aún puede mejorar significativamente el fenotipo de los animales tratados.

Para completar el estudio, los inventores también cuantificaron los niveles de expresión de MuSK, que es el receptor implicado en la unión con agrina y nAchR, el receptor de acetilcolina, ambos implicados en la estabilización de las sinapsis y el mantenimiento de las UNM, en el músculo tibial a las 15 semanas de edad. Los niveles de expresión de MuSK y nAchR mejoran en los músculos tibial y gastrocnemio (Figura 9).

La sobreexpresión de CYP46A1 alivia las alteraciones del comportamiento en un modelo de ratón con ELA después del tratamiento curativo

Basándose en el tratamiento preventivo en animales, se realizaron investigaciones para determinar si la estimulación de la ruta del metabolismo del colesterol, a través del aumento de los niveles de CYP46A1, podría mejorar la alteración motora en un modelo post-sintomático in vivo de ELA: el modelo SOD1G93A. La sobreexpresión de CYP46A1 mediante la administración intravenosa de AAVPHP.eB-CYP46A1-HA en ratones de 8 semanas alivia claramente la alteración motora en el modelo de ratón. Los ratones tienen un crecimiento mejorado en comparación con los animales no tratados (Figura 10A).

La administración curativa de AAVPHP.eB-CYP46A1 disminuye claramente la medida del deterioro motor mediante la prueba de sujeción (Figura 10B) y alivia la alteración medida mediante la prueba invertida (Figura 10C). Además, el tratamiento condujo a una mayor supervivencia de los ratones tratados en comparación con los animales no tratados, con un aumento medio de la esperanza de vida de 14 días (Figura 10D).

Los ratones se sacrificaron a las 15 semanas de edad para el análisis histológico y molecular.

El estudio de biodistribución reveló alrededor de 3-4 copias del genoma del vector (CGV) en todos los niveles de la médula espinal y entre 10 y 20 copias en el cerebro (Figura 11A), así como una transducción muy baja de los tejidos periféricos con un máximo de 0,5 CGV en el hígado y menos de 0,2 CGV en los otros órganos periféricos (Figura 11B). El alcance del objetivo se ha validado con la cuantificación del 24-hidroxicolesterol en la médula espinal lumbar de los animales, lo que revela un aumento de 1,3 veces en los animales tratados en comparación con los animales TN (Figura 11C).

Se ha demostrado una preservación parcial de las MN a nivel lumbar (alrededor del 60% respecto del TN), evaluada mediante cuantificación de la co-tinción con VachT y HA (Figura 12A y B), con resultados similares al tratamiento preventivo (Figura 6C).

Este 60% de preservación es de nuevo suficiente para evitar la desmielinización de la médula espinal lumbar, como se demuestra con la tinción de Luxol y la cuantificación del porcentaje de mielina (Figura 12C). Los animales SOD1 tratados con AAV tenían un porcentaje de mielina igual al de los animales TN y significativamente mayor que el de los animales SOD1 no tratados.

La evaluación de la estructura muscular mediante la medición del área media de las fibras (Figura 13) reveló una clara mejora del fenotipo en los animales tratados en comparación con los animales no tratados. El músculo cuádriceps del animal SOD1 tratado muestra un aumento significativo del área media de las fibras en comparación con los animales no tratados (Figura 13E y F). Se han observado resultados similares para el músculo tibial (Figura 13A y B) y el gastrocnemio (Figura 13 C y D).

Luego, se centran en el fenotipo de las UNM, demostrando un mayor número de uniones inervadas en los animales tratados en comparación con los animales SOD1 no tratados (Figura 14A y B), así como una estructura mejorada de las UNM con un número notablemente mayor de UNM con placas terminales normales y una disminución del número de placas terminales fragmentadas y no maduras (Figura 14C).

Finalmente, el efecto del tratamiento sobre los niveles de expresión tanto de MuSK como de nAchR es más leve que en el tratamiento preventivo (Figura 15), pero mejoró como en los músculos gastrocnemios (Figura 15D).

En conjunto, estos datos respaldan firmemente a CYP46A1 como un objetivo relevante en la ELA. Luego, los inventores decidieron evaluar si el aumento de la dosis de AAV-CYP46A1 podía mejorar aún más el efecto beneficioso y se inyectó un tratamiento curativo a 51011 gv a una cohorte de animales SOD1G93A. Los resultados preliminares sobre el comportamiento sugieren un fuerte efecto y una clara mejora del comportamiento medido con la puntuación de la prueba de sujeción (Figura 16). Los ratones tienen 12 semanas y se evaluará su supervivencia.

Finalmente, los inventores afirmaron que CYP46A1 podría ser un objetivo relevante tanto para las formas familiares como esporádicas de ELA, por lo que se dirige no solo a pacientes con mutación en SOD1 sino también a pacientes con mutación en C9ORF72 o pacientes con mutación en TARDP. Para ello, los inventores decidieron probar su estrategia terapéutica en otros modelos de ELA, el primero es el modelo de ratón C9ORF72 con 500 repeticiones de GGGGCC.

Los inventores administraron 51011 gv de AAV-CYP46A1-HA como tratamiento preventivo a las 4 semanas en modelos C9ORF72 y actualmente se ha realizado un seguimiento hasta las 16 semanas. No se ha observado ninguna diferencia en cuanto a la curva de crecimiento (Figura 17A). Se ha demostrado una clara mejora del rendimiento motor basándose en la prueba de barra con muescas (Figura 17B). El seguimiento de los ratones está en curso y se evaluará la supervivencia.

En general, estos datos respaldan que la sobreexpresión de CYP46A1 tiene propiedades terapéuticas, lo que promueve la mejora de la fisiología neuronal, especialmente la autofagia, en un modelo in vitro de ELA (Figura 18) y los datos sobre la administración post-sintomática del tratamiento son alentadores para el tratamiento de la ELA cuando los síntomas ya se han desarrollado.

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Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un vector para el uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), y dicho vector comprende un ácido nucleico que codifica la colesterol 24-hidroxilasa.

2. El vector para el uso en el tratamiento de la ELA según la reivindicación 1, en el que la ELA está asociada con al menos un trastorno relacionado con las neuronas motoras.

3. El vector para el uso en el tratamiento de la ELA según la reivindicación 2, en el que la ELA está asociada con la demencia frontotemporal.

4. El vector para el uso en el tratamiento de la ELA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°2.

5. El vector para el uso en el tratamiento de la ELA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la secuencia de ácido nucleico SEQ ID N°1.

6. El vector para el uso en el tratamiento de la ELA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se selecciona del grupo de vectores de adenovirus, lentivirus, retrovirus, herpesvirus y virus adenoasociados (AAV).

7. El vector para el uso en el tratamiento de la ELA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es un vector AAV.

8. El vector para el uso en el tratamiento de la ELA de la reivindicación 7, que es un vector AAV9, AAV10, tal como AAVrh.10 o AAVPHP.eB, preferiblemente un AAVPHP.eB.

9. El vector para el uso en el tratamiento de la ELA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, destinado a administrarse directamente por vía intravenosa o en el cerebro del paciente.

10. El vector para el uso en el tratamiento de la ELA de la reivindicación 9, destinado a administrarse en la médula espinal y/o la corteza motora.

11. El vector para el uso en el tratamiento de la ELA de la reivindicación 10, destinado a administrarse en las motoneuronas.

12. El vector para el uso en el tratamiento de la ELA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, destinado a administrarse mediante inyección intravascular, intravenosa, intranasal, intraventricular o intratecal.

13. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.