ES2936067T3 - IL-22 para uso en el tratamiento de trastornos metabólicos - Google Patents

Abstract

Se describen composiciones y métodos para modular el estrés oxidativo y/o del retículo endoplásmico (OER). Más particularmente, la presente invención describe composiciones y métodos que se dirigen a los inhibidores del estrés OER a las células pancreáticas para tratar enfermedades asociadas con el estrés oxidativo y/o OER, incluidos los trastornos metabólicos tales como la diabetes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

IL-22 para uso en el tratamiento de trastornos metabólicos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere en general a agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas para modular el estrés oxidativo y/o del retículo endoplásmico (OER). Más particularmente, la presente invención proporciona agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de trastornos metabólicos tales como la diabetes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La diabetes se ha convertido rápidamente en una gran epidemia mundial. En 2011 se comunicó que 336 millones de personas en todo el mundo padecen diabetes tipo 2, y se espera que este número aumente a alrededor de 552 millones para 2030. Actualmente, la enfermedad es responsable de aproximadamente 4,6 millones de muertes cada año (Diabetes Atlas publicado por The International Diabetes Federationj. Un número tan alto de casos está creando una carga financiera insostenible para los sistemas de atención médica, con un tratamiento que superó los USD $ 465 billones de dólares en 2011, lo que representa un 11% significativo del gasto total en atención médica en adultos.

A pesar de las terapias actuales, alrededor del 40% de las personas con diabetes tipo 2 desarrollan un requisito para la administración de insulina exógena con el tiempo, lo que sugiere que estas anomalías secretoras de insulina progresan después del inicio de la enfermedad. En consecuencia, existe una necesidad evidente y clara de desarrollar terapias más eficaces para el tratamiento de la diabetes tipo 2, que mejoren la calidad y/o la cantidad de producción de insulina, para abordar esta brecha en los tratamientos actuales.

Secreción de insulina de células B pancreáticas

La secreción de insulina inducida por glucosa por las células p pancreáticas generalmente se esquematiza mediante un 'modelo de consenso' que implica la siguiente secuencia de sucesos: aceleración del metabolismo de la glucosa; cierre de canales de potasio sensibles a ATP (canales K^atp ) en la membrana plasmática; despolarización, entrada de Ca2+ a través de canales de calcio dependientes de voltaje y un aumento en la concentración de Ca2+ citosólico libre que induce la exocitosis de gránulos que contienen insulina (Henguin et al., 2009).

La resistencia a la insulina describe el estado en el que la insulina produce un efecto biológico inadecuado, provocando una disminución de la captación de glucosa muscular y adiposa inducida por la insulina y un aumento de la producción de glucosa hepática. Los sujetos que padecen diabetes tipo 2 tienen cierta reducción de las células p y muestran un aumento de la apoptosis de las células p (Butler et al., 2002). Sin embargo, el grado de reducción de células p es controvertido y los ensayos de cirugía bariátrica y restricción calórica intensa demuestran que la recuperación de la producción de insulina es posible en los diabéticos tipo II.

Los fármacos de sulfonilurea han sido una estrategia popular para el desarrollo de nuevos tratamientos para la diabetes tipo 2 durante los últimos 60 años. Esta clase de fármaco actúa uniéndose directamente al canal K^atp , e induciendo así la secreción de insulina de las células p.

Estrés del retículo endoplásmico (ER)

El ER es un importante compartimento de plegamiento de proteínas en una célula eucariota y solo es superado por el citosol, y es el sitio de síntesis de todas las proteínas secretoras y de la superficie celular. El plegamiento de proteínas en el ER es más complejo que el plegamiento de proteínas en el citosol debido a que las proteínas se modifican después de la traducción. El plegamiento en el ER debe acoplar las vías de síntesis de proteínas que operan fuera del compartimento con las vías de plegamiento asistido por el ER (ERAF) en el lumen. La expresión de una versión mutante de una proteína, o incluso de algunas proteínas de tipo nativo, infección viral, reducción de energía o nutrientes, condiciones ambientales extremas o estímulos que provocan una liberación excesiva de calcio del lumen del ER comprometen las reacciones de plegamiento de proteínas en el ER, provocando que la proteína desplegada se acumule e inicie una cascada de señales que se transmiten al citoplasma y al núcleo. Cuando la demanda de plegamiento de proteínas en el ER excede la capacidad de plegamiento del ER, se da como resultado una condición denominada "estrés del ER" (Malhotra et al., 2007). El estrés del ER también puede deberse a otras condiciones, a saber, cuando una proteína que se traduce en el citosol se pliega incorrectamente e induce el reclutamiento de la maquinaria de plegamiento, lo que conduce a un déficit de asistencia al plegamiento en el ER.

Se ha demostrado que la sobreproducción de proteínas secretoras genera estrés en el ER y es bien sabido que las células p de los islotes pancreáticos mantienen una alta tasa de producción y secreción de insulina. El estrés del ER se produce cuando el plegamiento incorrecto de proteínas aumenta más allá de los niveles de umbral, liberando un conjunto de eventos transcripcionales y de señalización conocidos colectivamente como la respuesta a proteínas desplegadas (UPR). El objetivo final de la UPR es restaurar la biosíntesis de proteínas del ER, pero, paradójicamente, una etapa inicial es la supresión de la traducción de las proteínas secretoras, tal como la insulina en la célula p, para aliviar la carga del ER. En consecuencia, el mecanismo de respuesta física, aunque protege la célula secretora, puede tener efectos fisiológicos adversos. Por ejemplo, en las células p esto sería una reducción en la producción de insulina y, por lo tanto, hiperglucemia. Tanto el estrés del ER de células p como el plegamiento incorrecto de la insulina se han reportado tanto en la diabetes tipo 2 como en la diabetes autoinmune tipo 1.

Las células p son células de larga vida que requieren un ER altamente desarrollado para producir cantidades extremadamente grandes de insulina durante un largo período de tiempo. Esta generación de insulina requiere una serie compleja de sucesos biosintéticos moleculares que se inician en el ER. La pre-pro-insulina, el precursor de la insulina madura, se transloca co-traduccionalmente en el lumen del ER, donde la secuencia señal se escinde y se genera la proinsulina. Las enzimas mecánicas en el ER catalizan la formación de tres enlaces disulfuro, para ayudar a formar su forma nativa, antes de ser transportados al aparato de Golgi y los gránulos secretores. Finalmente, en el aparato de Golgi posterior, las endoproteasas lo procesan más y el C-péptido se elimina, generando el producto final, la insulina madura.

Los contribuyentes potenciales al estrés del ER de células p en la diabetes tipo 2 incluyen el aumento de la biosíntesis de insulina, la lipotoxicidad debido a los ácidos grasos saturados libres de cadena larga (FFA) tales como el palmitato (un efecto secundario de la obesidad), el aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en el ER debido al aumento de la formación de enlaces disulfuro y por las mitocondrias debido a la glucosa alta y la acumulación progresiva de depósitos de amiloide (Cnop et al., 2012, Cunha et al., 2008).

Los mecanismos moleculares precisos que gobiernan cómo la resistencia a la insulina se interrelaciona con la disfunción de las células p actualmente no se comprenden bien, y muchas personas obesas son altamente resistentes a la insulina sin desarrollar disfunción de las células p ni diabetes. Sin embargo, la resistencia a la insulina se suma a la demanda de una mayor biosíntesis de insulina en las células p. Además, se cree que la secreción inapropiada del precursor de proinsulina por parte de las células p, que aumenta a medida que avanza la diabetes, contribuye al aumento de la resistencia a la insulina. La pérdida de la ciclicidad de la liberación de insulina del páncreas también se produce en la diabetes y contribuye a aumentar la resistencia a la insulina. Se cree que el estrés oxidativo, el estrés del ER, el depósito de amiloide en el páncreas, así como la lipotoxicidad y la glucotoxicidad, desempeñan un papel en la disfunción progresiva de las células p, y todos son provocados por una nutrición excesiva.

Tratamiento con IL-22

Huang et al. (Patente de Estados Unidos U.S. 2010/0015086) han demostrado que la inyección de IL-22 recombinante (rIL-22) puede reducir los niveles séricos totales de glucosa, triglicéridos e insulina, así como el peso corporal en ratones obesos. También han demostrado que la administración sistémica de rIL-22 puede mejorar la tolerancia a la glucosa y la sensibilidad a la insulina en ratones normales. Basándose en estas observaciones, Huang et al. proponen que la rIL-22 sería útil para tratar trastornos metabólicos incluyendo obesidad, diabetes, hiperlipidemia, hiperglucemia e hiperinsulinemia. Sin embargo, Huang et al. no describen ningún mecanismo de acción para explicar cómo rIL-22 logra estos efectos.

Los presentes inventores observan, sin embargo, que no se han publicado ensayos clínicos que apoyen el uso de la administración sistémica de rIL-22 para el tratamiento de trastornos metabólicos en humanos desde la publicación de Huang et al. y que esto puede deberse a posibles efectos secundarios de la rIL-22. Por ejemplo, altas concentraciones crónicas de IL-22 y bajas concentraciones de la proteína de unión a IL-22 que contrarrestante (Dumoutier et al., 2001), se ha demostrado que contribuyen a la hiperplasia y al desarrollo de tumores en el intestino en modelos animales (Huber et al., 2012; Kirchberger et al., 2013; Yu et al., 2013; Jiang et al., 2013). También se ha reportado que la IL-22 induce la proliferación de hepatocitos y se ha demostrado que la sobreexpresión de IL-22 en el hígado aumenta la tasa de cánceres de hígado inducidos por carcinógenos (Park et al., 2011). También se ha reportado que la IL-22 está asociada con hepatocarcinomas humanos y que los cánceres de hígado inducidos por carcinógenos se reducen en ratones knockout con IL-22 (Jiang et al., 2011). Se ha encontrado que las células T CD8 productoras de IL-22 se asocian con cánceres de piel asociados con trasplantes y posiblemente contribuyan al crecimiento o desarrollo del carcinoma de células escamosas en este entorno (Zhang et al., 2013). Como se muestra en la presente memoria, los presentes inventores también han descubierto que la administración sistémica de rIL-22 tiene el potencial de exacerbar infecciones virales en humanos.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención surge, en parte, del descubrimiento inesperado de que citocinas específicas, incluyendo la IL-22, inhiben el estrés oxidativo y del retículo endoplásmico (OER) en las células p pancreáticas, mientras que otras, incluyendo la IL-23 y la IL-24, lo aumentan activamente. En particular, los presentes inventores encontraron que el bloqueo de IL-23 o IL-24 mejora la función del ER pancreático, la biosíntesis de insulina y la tolerancia a la glucosa. Por el contrario, descubrieron que la IL-22 es un potente supresor endógeno del estrés OER de las células p en respuesta a citocinas, lípidos y agentes de plegamiento incorrecto de proteínas. De manera significativa, se descubrió que la administración de IL-22 a animales obesos modula los genes reguladores del estrés oxidativo, reduce el estrés del ER y promueve la secreción de insulina eficaz de alta calidad, que restaura la homeostasis de la glucosa antes de la restitución posterior de la sensibilidad a la insulina periférica. Basándose en estos hallazgos y sus observaciones de que la rIL-22 puede tener efectos secundarios significativos cuando se administra sistémicamente, los presentes inventores proponen que el direccionamiento de los inhibidores de estrés OER de células p tal como IL-22 directamente a las células p pancreáticas será útil para tratar enfermedades asociadas con estrés aberrante OER de células p, incluyendo la diabetes y otros trastornos metabólicos, con efectos secundarios reducidos, como se describe a continuación.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona agentes terapéuticos, que son adecuadamente útiles para reducir el estrés OER en una célula p pancreática (en lo sucesivo denominada “célula p”). El agente terapéutico comprende un polipéptido de IL-22 y un agente de direccionamiento que dirige el polipéptido de IL-22 a una célula p pancreática, en el que el agente de direccionamiento es un ligando de un receptor de células p pancreáticas, y en el que el polipéptido de IL-22 se fusiona o conjuga de otro modo, directamente o a través de un enlazador intermedio, con el agente de direccionamiento.

Adecuadamente, el agente de direccionamiento se une a una proteína de células p (por ejemplo, una proteína de la superficie de la célula p). En algunas realizaciones, la proteína de células p es un receptor de células p (por ejemplo, receptor de sulfonilurea 1 (SUR1), receptor de péptido similar al glucagón 1 (GLP-1R) o un receptor acoplado a proteína G (por ejemplo, GPR40, GPR119). El agente de direccionamiento se selecciona adecuadamente de moléculas proteicas (por ejemplo, péptidos, polipéptidos) y moléculas pequeñas.

En algunas realizaciones, el agente de direccionamiento es un ligando SUR1. El ligando SUR1 es adecuadamente un agonista de SUR1. Los ligandos representativos de SUR1 incluyen a-endosulfina, una molécula de unión a antígeno que es inmunointeractiva con SUR1, y compuestos de sulfonilurea, cuyos ejemplos ilustrativos incluyen carbutamida, acetohexamida, cloropropamida, tolbutamida, tolazamida, glipizida, gliclazida, glibenclamida, glibornurida, gliquidona, glisoxepida, glicopiramida y glimepirida.

En otras realizaciones, el agente de direccionamiento es un ligando GLP-1R. Adecuadamente, el ligando GLP-1R es un agonista de GLP-1 R. Los ejemplos no limitantes de ligandos GLP-1 R incluyen péptido similar al glucagón 1 (GLP-1), exendina-4, polipéptido inhibidor gástrico, glucagón, taspoglutida, liraglutida, una molécula de unión a antígeno que es inmunointeractiva con GLP-1 R, y ligandos de moléculas pequeñas tales como compuestos de hidroxiflavonol (por ejemplo, quercetina).

En otras realizaciones más, el agente de direccionamiento es un ligando de un receptor acoplado a proteína G (por ejemplo, GPR40 o GPR119). Los ejemplos ilustrativos de este tipo incluyen ^a M^g -837, TAK-875, LY2881835, HD0471042 y HD0471953.

En otras realizaciones más, el agente de direccionamiento es una molécula de unión a antígeno que es inmunointeractiva con una proteína de células p (por ejemplo, una proteína de superficie de células p), que puede o no estar caracterizada.

El agente de direccionamiento se une adecuadamente al inhibidor de estrés OER de células p, ya sea directa o indirectamente (por ejemplo, a través de un enlazador de intervención al extremo N-terminal o al extremo C-terminal del inhibidor de estrés OER de células p). Alternativamente, el agente de direccionamiento y el inhibidor de estrés OER de células p se unen a o se incluyen de otro modo en un vehículo de administración (porejemplo, una partícula, un dendrímero o una ciclodextrina).

En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que generalmente comprenden un agente terapéutico como se describe ampliamente anteriormente y en otra parte de la presente memoria, y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la presente invención proporciona agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas como se describe anteriormente para su uso en el tratamiento de un trastorno metabólico en un sujeto. Este uso generalmente comprende, consiste o consiste esencialmente en administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agente terapéutico como se describe ampliamente anteriormente o en otra parte de la presente memoria. Los trastornos metabólicos representativos incluyen prediabetes, diabetes (tipo I o tipo II), síndrome metabólico, obesidad, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), dislipidemia diabética, hiperlipidemia, hipertensión, hipertrigliceridemia, acidemia hipergrasa e hiperinsulinemia.

El uso puede comprender además administrar simultáneamente al sujeto al menos un agente auxiliar para tratar el trastorno metabólico. El al menos un agente auxiliar puede seleccionarse de un agente antidiabético (por ejemplo, metformina, gliburida, glimepirida, glipirida, glipizida, clorpropamida, gliclazida, acarbosa, miglitol, pioglitazona, troglitazona, dapagliflozina, rosiglitazona, insulina, GI-262570, isaglitazona, JTT-501, NN-2344, L895645, YM-440, R-119702, AJ9677, repaglinida, nateglinida, KAD1129, APR-HO39242, GW-409544, KRP297, AC2993, Exendina-4, LY307161, NN2211 o LY315902), un agente anti-obesidad (por ejemplo, Orlistat, ATL-962, AJ9677, L750355, CP331648, sibutramina, topiramato, axokina, dexanfetamina, fentermina, fenilpropanolamina, famoxina o mazindol) o un agente modulador de lípidos (por ejemplo, pravastatina, lovastatina, simvastatina, atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, nisvastatina, ZD-4522, fenofibrato, gemfibrozilo, clofibrato, implitapida, CP-529,414, avasimiba, TS-962, MD-700 o LY295427).

Los agentes terapéuticos de la presente invención son útiles para promover la secreción de insulina de una célula p, mejorar la calidad de la insulina producida a partir una célula p y/o ralentizar o reducir la degeneración de la célula p y/o promover la regeneración de la célula p, que se incluye después del trasplante de islotes pancreáticos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Las citocinas inducen el estrés del ER en las células p pancreáticas murinas. (A) fluorescencia del indicador ERAI-XBP1 en células p de insulinoma murino de MIN6N8 después de 24 horas de tratamiento con glucosa 16,6 mM (glucosa alta), H²O²10 pM, ácido palmítico 0,5 mM o citocinas 50 ng/mL, o tratamiento de 6 horas con tunicamicina 10 pg/mL (Tm) o tapsigargina 5 pM (Tg). El panel derecho muestra las curvas de dosis-respuesta para las citocinas estresantes de 2 a 64 ng/mL. (B) Células MIN6N8 expuestas a Tm, glucosa alta o citocinas como en (a) y qRT-PCR usado para evaluar el empalme del mRNA de Xbp1, transfectado con ATF6-GFP y translocación nuclear de ATF6 activado cuantificado, o un ensayo ALPHASCREEN utilizado para evaluar la fosforilación de eIF2a. (C) Producción máxima de especies reactivas de oxígeno (ROS) y óxido nítrico (NO) en células MIN6N8 tratadas como en (A) de un transcurso de tiempo de 30 min a 8 horas. (D) Las citocinas que inducen el estrés del ER activan progresivamente la respuesta de proteínas desplegadas. Se transfectaron células p murinas MIN6N8 con el indicador ERAI y se expusieron a tunicamicina (Tm, 10 pg/mL), IL-23 o IL-24 (50 ng/mL) y se evaluó la fluorescencia de GFP a intervalos regulares durante 36 horas. Control del vehículo de MIN6N8 (Con) = DMSO. Los diagramas de caja muestran la mediana/IQR/intervalo; los histogramas muestran la media ± SEM; ANOVA, prueba post-hoc de Bonferroni; *P<0,05, **P<0,01, ***P < 0,001 (de la prueba post-hoc); * vs control de vehículo no tratado.

Figura 2: IL-22 suprime el estrés del ER de células p. (A-D) Fluorescencia del indicador ERAI-XBP1 en células MIN6N8. (A) Mapa de calor de la fluorescencia del indicador ERAI en células MIN6N8 expuestas a combinaciones por parejas de citocinas, o un tratamiento de 6 horas con 10 pg/mL de tunicamicina (Tm). El recuadro muestra la respuesta a la dosis de IL-10 e IL-22 para la supresión del estrés del ER inducido por IL-23. (B,C) Las células se expusieron a ácido palmítico 0,1-0,5 mM (B) o tapsigargina (Tg) 5 pM (C) ± IL-22 durante 24 o 6 horas, respectivamente. (D, panel izquierdo) Las células se trataron con IL-22 o Tm ± inhibidores para STAT1 (FLUDARABINA) y/o STAT3 (VI S31-201) durante 6 horas. (D, panel derecho) Las células MIN6N8 se trataron con Tm ± IL-22 ± anticuerpo anti-IL-22R1 durante 6 horas y se evaluó el empalme de Xbp1. (E) Expresión de IL-22R1 determinada por inmunofluorescencia y microscopía confocal en páncreas de ratones alimentados con comida normal o una dieta rica en grasas durante 22 semanas; barra de escala = 25 pm.

Figura 3: IL-22 suprime el estrés oxidativo de las células p. (A) Las células MIN6N8 cargadas con dihidroetidio (DHE) que emite fluorescencia roja y se une al DNA después de la oxidación se expusieron a 50 ng/mL de IL-23 durante 30 min ± 50 ng/mL de IL-22 al mismo tiempo o 30 min antes de la IL -23. La tinción con DAPI (azul) se utilizó para visualizar núcleos. Micrografías confocales después de 30 min de exposición; barra de escala = 100 pm. (B,C) Concentración de ROS (B) y NO (C) en células MIN6N8 tratadas con glucosa 16,6 mM (glucosa alta), H²O² 10 pM, ácido palmítico 0,5 mM o citocinas 50 ng/mL ± IL-2250 ng/mL administrados 30 min antes o al mismo tiempo que los factores estresantes. Los datos que se muestran corresponden al momento máximo de producción en células no tratadas con IL-22 (30 min, 2 horas u 8 horas). Las reproducciones en color de la Figura 3 están disponibles previa solicitud.

Figura 4: Las citocinas inducen la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y óxido nítrico (NO) en células p. Las células p murinas MIN6N8 se expusieron a citocinas, H²O² o palmitato. Las ROS (mostrado en círculos grises) se evaluaron mediante el método DCFDA y el nitrito (NO, círculos negros) se midió mediante el ensayo de Griess. El pretratamiento con IL-22 redujo notablemente la producción de ROS (triángulos grises) y NO (triángulos negros). Hay que tener en cuenta que los ejes Y tienen diferentes escalas para diferentes factores estresantes.

Figura 5: Evaluación de genes de estrés oxidativo influenciados por IL-22. (A) Las células MIN6N8 se trataron con DMSO (control) o IL-22 y se analizaron utilizando Oxidative Stress RT2 Profiler PCR Array. Los genes regulados al alza (2 veces por encima de la línea de regulación al alza) o regulados a la baja (2 veces por debajo de la línea de regulación a la baja) se muestran arriba continuación. (B) La alteración en la expresión de los genes del estrés oxidativo se confirmó mediante qRT-PCR en células MIN6N8 tratadas con DMSO (control) o IL-22. (C) Lista de genes en la matriz que estaban y no estaban regulados por IL-22.

Figura 6: El estrés oxidativo y ER regulado por citocinas afecta la secreción de insulina de los islotes. La secreción de mRNA de sXbpl y Hspa5(A), insulina (B) y proinsulina (C) de islotes sanos cultivados durante 6 horas en tunicamicina (Tm) o tapsigargina (Tg) ± IL-22 o citocinas que inducen estrés del ER ± IL-22 y después cultivadas para otras 18 horas antes de evaluar la secreción de insulina estimulada por glucosa de la siguiente manera: los islotes se cultivaron consecutivamente durante 30 minutos cada uno con glucosa 2,8 mM, glucosa 20 mM y glucosa 20 mM GLP-1 100 nM y la secreción de insulina total (B) y proinsulina (C ) se midió por ELISA.

Figura 7: IL-22 endógena y exógena afecta a los islotes sanos e islotes de ratones obesos. (A) expresión de mRNA de genes de estrés oxidativo y del ER en islotes sanos cultivados durante 24 horas en control (IgG) o anticuerpos aIL-22R1, y en islotes de ratones con una dieta rica en grasas (HFD), después de cultivar durante 24 horas en control IgG o IL-22. (B) Secreción total de insulina en 30 min por islotes sanos y con HFD cultivados ± glucosa ("Hi glu") después del cultivo en glucosa ± IL-22, IgG o aIL-22R1.

Figura 8: Expresión génica de inflamación y estrés oxidativo en obesidad y diabetes murinas. Expresión de mRNA del gen de citoquinas y quimioquinas (A, C) y del gen regulador del estrés oxidativo (B, D) en islotes de ratones alimentados con comida normal (Con) o una dieta rica en grasas (HFD) (A, B) y deficientes en el receptor de leptina (db/db) versus compañeros de camada heterocigotos (dbh) (C, D). (E) Genes de citocinas y receptores de citoquinas relevantes para el estrés oxidativo y del ER dentro de los 100 genes más altamente regulados al alza (se muestra la clasificación) en un estudio de islotes de diabetes tipo 2 humana versus islotes sanos.

Figura 9: El direccionamiento al estrés del ER inducido por citocinas con HFDIO mejora la tolerancia a la glucosa y la hiperinsulinemia. HFDIO Experimento 1: Los ratones se alimentaron con una dieta alta en grasas (HFD) o una dieta normal (NCD) durante 16 semanas y se trataron durante las últimas 3 semanas con (A-C) IL-22, (D-F) anti-IL-24 o (G-I) anti-IL-23. Los ratones de control de NCD y HFD recibieron un anticuerpo de control IgG irrelevante. Se muestra la glucosa en sangre (A, D, G) e insulina sérica total (C, F, I) durante el ayuno, las pruebas de tolerancia a la glucosa i.p. el día 14 de tratamiento y la glucosa en sangre durante las pruebas de tolerancia a la insulina el día 16 (B, E, H). Proinsulina sérica en ayunas: proporción de insulina (J) y mRNA de sXbpl pancreático total (K) al final del tratamiento. (L) Co-tinción de insulina total y Grp78 analizada mediante microscopía confocal (paneles superiores) y tinción inmunohistoquímica de proinsulina (panel inferior) en páncreas de ratones control y tratados con IL-22. Los gráficos muestran la cuantificación de Grp78, insulina total y proinsulina en el área central rica en células p de los islotes. Barras de escala = 50 pm. Las reproducciones en color de la Figura 9 están disponibles previa solicitud.

Figura 10: La neutralización de las citocinas que inducen el estrés del ER o el tratamiento con IL-22 reduce el estrés total del ER pancreático pero no afecta la expresión del gen de la insulina en HFDIO. (A, B) Los ratones se alimentaron con una dieta rica en grasas o comida normal durante 16 semanas y se trataron durante las últimas 3 semanas con anti-IL-23, anti-IL-24 o IL-22 o un anticuerpo de control irrelevante (Con) (como se describe en la Figura 9). El estrés del ER pancreático evaluado mediante la medición de Hspa5 (Grp78) (A) y la expresión del gen de insulina (Ins2) (B) se evaluó por qRT-PCR después de 3 semanas de tratamiento. (C-E) Los ratones se alimentaron con HFD o NCD durante 22 semanas y se trataron durante los últimos 30 días con IL-22 a una concentración de 20 o 100 ng/g (como se describe en la Figura 5: HFDIO Experimento 2). La expresión de mRNA de insulina (Ins2) (C) y de MafA (D) se evaluó en islotes de ratones de control y tratados. (E) Similar a los niveles de mRNA de insulina, no se observaron cambios en la prohormona convertasa PC1 (PC3) en los ratones con HFD tratados con IL-22. (A-D) La normalización contra el gen de limpieza Gapdh, y expresión como diferencia en veces con respecto a los ratones de control de comida normal sin tratar.

Figura 11: Evaluación del estrés del ER en células a y p pancreáticas en ratones con HFDIO con y sin tratamiento con IL-22. Los ratones se alimentaron con una dieta rica en grasas durante 16 semanas y se trataron durante las últimas 3 semanas con la leyenda de anti-IL-23, anti-IL-24 o IL-22 (según la Figura 9). Se prepararon secciones de parafina de páncreas y se tiñeron conjuntamente con anticuerpos contra el marcador de estrés del ER Grp78 y el marcador de del glucagón de células a (A) o el marcador de la insulina de células p (B). A la izquierda se muestran imágenes individuales de un solo color de baja potencia y a la derecha imágenes de dos colores de baja y alta potencia. La cuantificación de Grp78 e insulina en las células p se muestra en la Figura 9. Las flechas blancas resaltan las células acinares que rodean los islotes.

Figura 12: La neutralización de las citocinas que inducen estrés en el ER o el tratamiento con IL-22 reduce la inflamación pancreática total en HFDIO. En el HFDIO Experimento 1, los ratones se alimentaron con una dieta rica en grasas durante 16 semanas y se trataron durante las últimas 3 semanas con anti-IL-23 (A), anti-IL-24 (B) o IL-22 (C) o un anticuerpo de control irrelevante (según la Figura 9). La expresión del gen de la citocina pancreática se evaluó mediante qRT-PCR con normalización frente al gen de limpieza Gapdh, y expresión como diferencia en veces con respecto a los ratones con HFDIO no tratados.

Figura 13: El consumo de alimentos alterado no explica la pérdida de peso corporal en ratones con HFDIO tratados con IL-22. El HFDIO Experimento 1 como se describe en la Figura 9. (A) Cambios de peso corporal en el HFDIO experimento 1. (B) Los resultados se presentan como alimento consumido por ratón por semana. Consumo de alimentos en las últimas 2 semanas de tratamiento durante el experimento 1. Media ± SEM.

Figura 14: La neutralización de las citocinas que inducen estrés en el ER o el tratamiento con IL-22 reduce la regulación posterior hepática de Grp78 en HFDIO. Como se describe para el HFDIO experimento 1, los ratones se alimentaron con una dieta rica en grasas o comida normal durante 16 semanas y se trataron durante las últimas 3 semanas con anti-IL-23, anti-IL-24 o IL-22 o un anticuerpo de control irrelevante (Con) (según la Figura 9). El estrés hepático del ER se evaluó por la medición del mRNA de Xbp1 -empalmado (A) y Hspa5 (Grp78) (B) por qRT-PCR después de 3 semanas de tratamiento. Normalización contra el gen de limpieza Gapdh, y expresión como diferencia en veces con respecto a los ratones de control de comida normal no tratados.

Figura 15: El tratamiento prolongado con IL-22 restaura tanto la tolerancia a la glucosa como la sensibilidad a la insulina en HFDIO. Los ratones se alimentaron con una dieta rica en grasas (HFD) o una dieta normal de comida (NCD) durante 22 semanas y se trataron durante los últimos 30 días con 20 o 100 ng/g de IL-22 dos veces por semana. Los ratones de control de NCD y de HFD recibieron un anticuerpo de control IgG irrelevante. (A) Peso corporal. (B) Concentraciones de glucosa en sangre con alimentación aleatoria durante el tratamiento. (C-E) Glucosa en sangre durante un ayuno prueba de tolerancia a la glucosa i.p. el día 25 (C) y prueba de tolerancia a la insulina el día 16 (D) y 29 (E) de tratamiento. AUC = área bajo la curva. (F) Insulina total en suero durante el ayuno prueba de tolerancia a la glucosa i.p. el día 25. (G) Redistribución de grasa en ratones obesos tratados con IL-22.

Figura 16: El tratamiento prolongado con IL-22 reduce la proinsulina sérica y la acumulación de proinsulina de los islotes en HFDIO. Los ratones se alimentaron con una dieta rica en grasas (HFD) o una dieta normal de comida (NCD) durante 22 semanas y se trataron durante los últimos 30 días con 20 o 100 ng/g de IL-22 dos veces por semana. Los ratones de control de NCD y de HFD recibieron un anticuerpo de control IgG irrelevante. (A) Proinsulina sérica en ayunas al final del tratamiento. (B) Co-tinción de insulina total (verde) y proinsulina (magenta) analizada por microscopía confocal. Las imágenes individuales de un solo color se muestran en la parte superior y las imágenes de dos colores se muestran en la parte inferior. Las reproducciones en color de la Figura 16 están disponibles previa solicitud.

Figura 17: El tratamiento extendido con IL-22 normaliza la secreción de insulina de los islotes en HFDIO. Los ratones se alimentaron con una dieta rica en grasas (HFD) o una dieta normal de comida (NCD) durante 22 semanas y se trataron durante los últimos 30 días con 20 o 100 ng/g de IL-22 dos veces por semana. Los ratones de control de NCD y de HFD recibieron un anticuerpo de control IgG irrelevante. (A, B) Secreción total de insulina (A) y proinsulina (B) de islotes de ratones de control de NCD y de HFD y tratados el día 30 cultivados durante la noche en glucosa 2,8 mM y cultivados consecutivamente durante 30 min cada uno con glucosa 2,8 mM, glucosa 20 mM y glucosa 20 mM GLP-1 100 nM. (C) Absorción de desoxiglucosa fluorescente (6-NBDG) por los adipocitos 3T3 en respuesta a 2 ng/mL de insulina recombinante (rIns) o insulina derivada de la estimulación de los islotes con glucosa más GLP-1 que se muestra en (B).

Figura 18: El tratamiento con IL-22 modula los genes del estrés oxidativo y reduce el estrés del ER y la inflamación en los islotes pancreáticos. Expresión del mRNA de estrés oxidativo (A), estrés del ER (B) y genes de citocinas y quimiocinas (C) en islotes pancreáticos de ratones que padecen de HFDIO (como se describe en la Figura 15). (D) Expresión de mRNA de Mip2 en islotes pancreáticos de ratones con dieta alta en grasas (HFD) o dieta normal (NCD) durante 20 semanas cultivadas durante 24 h en glucosa 2,8 mM ± 50 ng/mL de IL-22.

Figura 19: Expresión de IL-22R1 en tejidos humanos. Datos de dominio público de GTEx (http://www.broadinstitute.org/gtex/) que muestran la expresión del mRNA de IL22RA1 en una variedad de tejidos, con la expresión más alta en el páncreas (obsérvese escala en log¹ü).

Figura 20: Supervivencia, título viral y puntuación de lesión e inflamación pulmonar histológica en ratones infectados con neumovirus (PVM) con y sin administración de IL-22. Los ratones C57BL/6 neonatales se trataron con IL-22 de ratón recombinante (rmIL-22, 20 ng/g i.p. cada 3 días) o con un control de anticuerpos IgG irrelevante (12,5 pg/ratón i.p. cada seis días) antes de la infección con 100 unidades formadoras de placas (PFU) de neumovirus de ratón (PVM) o infección simulada (nativo) a los 7 días de edad. Los ratones se infectaron por vía intranasal y se sacrificaron 1,5 y 6 días después de la infección (DPI). (A) Supervivencia del ratón (7/9 ratones tratados con IL-22 murieron entre el día 5 y el día 6 y el experimento se detuvo el día 6). (B) Abundancia de RNA viral de PVM medido por qRT-PCR. Expresado como cambio de veces en comparación con la media del grupo nativo de DPI respectivo después de la corrección para la expresión del gen de limpieza de p-actina. (C) Puntuaciones ciegas de lesión e inflamación pulmonar de secciones teñidas con hematoxilina y eosina. Estadísticas: (A) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier (B, C) Los diagramas de caja muestran la mediana, el IQR y el rango. N = 9 ratones/grupo; ANOVA unidireccional con prueba post-hoc de Dunnett como se muestra.

Figura 21: Secciones de pulmón representativas teñidas con H&E y teñidas con PVM de ratones infectados con neumovirus (PVM) con y sin administración de IL-22. (A) Secciones de H&E que muestran inflamación en las vías respiratorias pequeñas. Las flechas resaltan las células inmunitarias en los espacios aéreos y el intersticio intraalveolar. (B) Tinción inmunohistoquímica de PVM anti-ratón de conejo.

Figura 22: IL-22 protege los islotes pancreáticos humanos del desarrollo del estrés oxidativo. Se cultivaron islotes pancreáticos humanos de un solo donante sano durante 2 horas en presencia de 50 ng/mL de IFN-y, IL-1 p, IL-23 o IL-24, o palmitato 0,5 mM, con o sin exposición a 50 ng /mL de IL-22 comenzando 30 min antes de la introducción de las citocinas o lípidos que inducen estrés (n = 3 por condición). Para probar si la IL-22 endógena afecta a la fisiología de los islotes humanos, los islotes se trataron durante 2 horas con un anticuerpo anti-IL-22R1 a 10 pg/ml.

Figura 23: La IL-22 recombinante humana y de ratón reduce el estrés del ER en células murinas y células humanas, respectivamente. (a) Las células murinas MIN6N8 se transfectaron con el indicador ERAI-sXBP1. Después de 48 h, las células se trataron con IL-22 recombinante de ratón (rm) o humana (rh) (concentraciones de 0,12-15,4 nM) en presencia de palmitato 0,5 mM durante 24 h. Los datos se presentan como la intensidad de fluorescencia. n = 4 (datos agrupados de dos experimentos individuales). (b) Se trataron células LS174T humanas con concentraciones crecientes de IL-22 recombinante humana o de ratón 2 h antes de la introducción de palmitato 0,5 mM durante 30 min. Se lisaron las células y se midió el nitrito intracelular utilizando el Ensayo de Griess. n = 4 (datos agrupados de dos experimentos individuales). Con = PBS (barra negra/línea de puntos) y palmitato solo (0,5 mM; barra roja). Los histogramas muestran la media ± s.e.m. *#P < 0,05, **##P < 0,01, ***###P < 0,001 (de la prueba post hoc); * versus control de vehículo no tratado, # versus IL-22 de especies alternativas a una concentración comparable.

Figura 24: Modulación del estrés oxidativo y del ER en células murinas MIN6N8 expuestas a palmitato, a IL-22 recombinante humana y de ratón, a proteínas de fusión de ligando IL-22-GLP-1R o al constructo scFv de IL-22-ScaB1. Las células MIN6N8 transfectadas con el indicador ERAI-sXBP1 se trataron con palmitato 0,5 mM e IL-22 recombinante de ratón (rmIL-22), IL-22 recombinante humana (rhIL-22) y las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R (MPBS-50, -51 y -52) y ScaB1 de IL-22 a concentraciones de 15,4 nM durante 24 horas. Se usaron PBS y BSA al 0,5% como controles de vehículos. Los datos muestran que la IL-22 recombinante y los fármacos biológicos no provocan estrés del ER por sí solos.

Figura 25: Protección contra el estrés oxidativo y del ER en células murinas MIN6N8 o células LS174T humanas expuestas concomitantemente a palmitato e IL-22 humana o de ratón o diferentes proteínas de fusión de ligando IL-22-GLP-1R. (A) Las células MIN6N8 transfectadas con el indicador ERAI-sXBP1 se trataron conjuntamente con palmitato 0,5 mM y concentraciones crecientes de IL-22 recombinante humana (hIL-22) y las proteínas de fusión de ligandos IL-22-GLP-1R (MPBS- 50, -51 y -52) durante 24 horas. N = 4 (datos agrupados de dos experimentos individuales). Los datos se presentan como una reducción porcentual del estrés del ER. (B) Las células LS174T se trataron con concentraciones crecientes de IL-22 recombinante de ratón (mIL-22), IL-22 recombinante humana (hIL-22) y las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R (MPBS-50, 51 y 52) durante 2 h antes de la introducción de palmitato 0,5 mM durante 30 min. Posteriormente se lisaron las células y se usó el ensayo de Griess para determinar la concentración de nitrito. N = 4 (datos agrupados de dos experimentos individuales). Los datos se presentan como la reducción porcentual del estrés oxidativo (concentración de nitrito).

Figura 26: Reducción del estrés del ER por IL-22-ScaB1. Reducción del estrés del ER por IL-22-ScaB1. Las células MIN6N8 transfectadas con el indicador ERAI-sXBP1 se trataron conjuntamente con palmitato 0,5 mM y concentraciones crecientes de IL-22 recombinante humana (hIL-22) e IL-22-ScaB1 durante 24 horas. N = 4. Los datos se presentan como la reducción porcentual del estrés del ER.

Figura 27: Eliminación de IL-22 y las proteínas de fusión de IL-22. Se inyectaron ratones con 256 ng/g de IL-22 humana o los equivalentes molares de las proteínas de fusión del ligando NN-IL-22-GLP-1R (MPBS-50, -51 ,-52). Se recogieron muestras de sangre en diferentes puntos de tiempo como se muestra.

Figura 28: Evaluación del direccionamiento específico a los islotes pancreáticos de la proteína de fusión del ligando IL-22-GLP-1R. Los tejidos que expresan el receptor de IL-22 (hígado, intestino, piel y páncreas) de ratones tratados con 256 ng/g de IL-22 recombinante humana o los equivalentes molares de las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R (MPBS-50, -51, -52) durante 30 min se tiñeron con el anticuerpo pStat3. La intensidad de la fluorescencia por área se evaluó usando el software image J en 3-4 campos de visión para cada tejido en cada ratón (n=3). Dentro de cada ratón, se calculó la densidad de fluorescencia media de múltiples campos para cada tejido y después se calculó la proporción de intensidad de tinción de los islotes pancreáticos en cada uno de los otros tejidos (a; hígado, b; intestino, c; piel). Los resultados se presentan como cambio de veces en relación con el observado con IL-22 recombinante humana (rhIL-22).

Figura 29: Evaluación del direccionamiento específico a los islotes pancreáticos de IL-22-ScaBl. Los tejidos que expresan el receptor de IL-22 (hígado, intestino, piel y páncreas) de ratones tratados con 15,4 nmoles/g de IL-22 recombinante humana o 0,96, 3,8 o 15,4 nmoles/g de la proteína de fusión IL-22-ScaB1 durante 30 min se tiñeron con el anticuerpo pStat3. La intensidad de la fluorescencia por área se evaluó usando el software image J en 3-4 campos de visión para cada tejido en cada ratón (n=3). Dentro de cada ratón, se calculó la densidad de fluorescencia media de múltiples campos para cada tejido y después se calculó la proporción de intensidad de tinción de los islotes pancreáticos en cada uno de los otros tejidos (a; hígado, b; intestino, c; piel). Los resultados se presentan como cambio de veces en relación con el observado con IL-22 recombinante humana (rhIL-22). d muestra pStat3 con IL-22 humana (15,4 nmoles/g) e IL-22-ScaB1 (15,4 nmoles/g) en el intestino, el hígado y el páncreas.

Figura 30: Estudio de eficacia de búsqueda de dosis en ratones con obesidad inducida por una dieta rica en grasas con proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R. Los ratones se alimentaron con una dieta rica en grasas (HFD) o con una dieta normal (NCD) durante 27 semanas. Los ratones con HFD se trataron con 0,06-15,4 nmoles/g de IL-22 recombinante humana (rhIL-22) o proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R (MPBS-50, -51, -52). La tolerancia a la glucosa se midió mediante una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (i.p.) (IPGTT) (a los ratones en ayunas se les administró glucosa al 40% 2 g/kg i.p. y se midió la glucosa en sangre durante 120 min).

Figura 31: Las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R son más eficaces que la rhIL-22 a dosis más bajas. Los ratones se alimentaron con una dieta rica en grasas (HFD) o con una dieta normal (NCD) durante 27 semanas. Los ratones con HFD se trataron con 0,06-15,4 nmoles/g de IL-22 recombinante humana (rhIL-22) o proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R (MPBS-50, -51, -52). La tolerancia a la glucosa se midió mediante una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (i.p.) (IPGTT) (como en la Figura 30). Los datos se presentan como la reducción media porcentual en el aumento del área bajo la curva (AUC) de IPGTT en comparación con NCD solo (a) y HFD solo (b).

Figura 32: Evaluación de la eficacia terapéutica de las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R. Los ratones se alimentaron con una dieta rica en grasas (HFD) o con una dieta normal (NCD) durante 27 semanas. Los ratones con HFD se trataron con 0,06-15,4 nmoles/g de IL-22 recombinante humana (rhIL-22) o proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R (MPBS-50, 51, 52). La tolerancia a la glucosa se midió mediante una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (i.p.) en ayunas (IPGTT) (como en la Figura 30), se obtuvieron muestras de sangre antes de la exposición y después de 15, 30, 60 y 120 min. Los datos de las dos dosis más bajas de proteínas se presentan como la reducción media porcentual en el área aumentada bajo la curva de IPGTT en ratones con HFD tratados con PBS de control.

Figura 33: Cambios en el peso corporal. Los ratones se alimentaron con una dieta rica en grasas (HFD) o con una dieta normal (NCD) durante 27 semanas. Los ratones con HFD se trataron con 0,06-15,4 nmoles/g de IL-22 recombinante humana (a; rhIL-22) o proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R (b; MPBS-50, c; -51, d; -52). Los cambios en el peso corporal se registraron los días 0, 5, 10 y 13. Los datos se presentan como porcentaje del peso corporal inicial en el día 0.

Figura 34: Secuencias de aminoácidos de constructos y partes de componentes de IL-22-ScaB1. a) La secuencia scFv de ScaB1 incluye la cadena pesada variable (VH) en gris y el negro es la cadena ligera variable o Kappa (VL o VK). El motivo de glicina-serina entre los dos dominios forma el enlazador flexible, (G4S)3, que permite que el scFv se pliegue en un resto de direccionamiento funcional. b) Secuencia final utilizada como dominio de IL22 humano. c) Secuencia que muestra el diseño del constructo de fusión inicial (scFv-IL22 de His-ScaB1 human-myc) con etiquetas laterales para ayudar en la detección.

Figura 35: PAGE gel de scFv-IL22 de His-ScaB1 humano-myc purificado. a) Ilustración del estándar de proteína teñida previamente de SeeBlue Plus2 (tecnologías Life). b) El carril 1 muestra el estándar de proteína, el carril 2 es de proteína reducida y el carril 3 es de proteína no reducida.

Figura 36: Secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R. Secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión MPBS-50, MPBS-51 y MPBS-52.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

1. Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que comúnmente entienden los expertos en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria puede usarse en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen métodos y materiales preferidos. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.

Los artículos "un" y "una" se utilizan en la presente memoria para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Por "aproximadamente" se entiende una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía tanto como el 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.

Los términos "administración concurrente" o "que se administra de manera concurrente" o "que se administra de manera conjunta" y similares se refieren a la administración de una sola composición que contiene dos o más principios activos, o la administración de cada principio activo como composiciones separadas y/o suministradas por vías separadas ya sea al mismo tiempo o simultáneamente o secuencialmente dentro de un período de tiempo lo suficientemente corto como para que el resultado efectivo sea equivalente al obtenido cuando todos estos principios activos se administran como una sola composición. Por "simultáneamente" se entiende que los agentes activos se administran sustancialmente al mismo tiempo, y deseablemente juntos en la misma formulación. Por “contemporaneamente” se entiende que los agentes activos se administran muy próximos en el tiempo, por ejemplo, un agente se administra dentro de aproximadamente un minuto a aproximadamente un día antes o después de otro. Cualquier tiempo contemporáneo es útil. Sin embargo, a menudo se dará el caso de que cuando no se administren simultáneamente, los agentes se administrarán en aproximadamente un minuto a aproximadamente ocho horas y preferiblemente en menos de aproximadamente una a aproximadamente cuatro horas. Cuando se administran al mismo tiempo, los agentes se administran adecuadamente en el mismo sitio del sujeto. El término "mismo sitio" incluye la localización exacta, pero puede estar dentro de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 15 centímetros, preferiblemente dentro de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 centímetros. El término "por separado", tal y como se utiliza en la presente memoria, significa que los agentes se administran en un intervalo, por ejemplo, en un intervalo de aproximadamente un día a varias semanas o meses. Los agentes activos pueden administrarse en cualquier orden. El término "secuencialmente", tal y como se usa en la presente memoria, significa que los agentes se administran en secuencia, por ejemplo, en un intervalo o intervalos de minutos, horas, días o semanas. Si es apropiado, los agentes activos pueden administrarse en un ciclo repetitivo regular.

Por "molécula de unión a antígeno" se entiende una molécula que tiene afinidad de unión por un antígeno diana. Se entenderá que este término se extiende a inmunoglobulinas, fragmentos de inmunoglobulina y estructuras proteicas no derivadas de inmunoglobulina que muestran actividad de unión a antígeno. Las moléculas de unión a antígeno representativas que son útiles en la práctica de la presente invención incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, así como sus fragmentos (tales como Fab, Fab', F(ab')² , Fv), anticuerpos monocatenarios (scFv) y de dominio (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos de tiburón y camélido), y proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de unión/reconocimiento de antígeno. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgG, IgA o IgM (o una subclase de los mismos), y no es necesario que el anticuerpo sea de ninguna clase en particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la región constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas se pueden dividir en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Las moléculas de unión a antígeno también abarcan anticuerpos diméricos, así como formas multivalentes de anticuerpos. En algunas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno son anticuerpos quiméricos en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico con u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos US Pat. No.4,816,567; y Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855). También se contemplan anticuerpos humanizados, que generalmente se producen mediante la transferencia de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadenas variables pesadas y ligeras de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, roedor, preferiblemente ratón) a un dominio variable humano. Los residuos típicos de los anticuerpos humanos se sustituyen luego en las regiones marco de las contrapartes no humanas. El uso de componentes de anticuerpos derivados de anticuerpos humanizados evita problemas potenciales asociados con la inmunogenicidad de regiones constantes no humanas. Las técnicas generales para clonar dominios variables de inmunoglobulina no humanos, particularmente murinos, se describen, por ejemplo, por Orlando et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833). Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados se describen, por ejemplo, por Jones et al. (1986, Nature 321:522), Carter et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285), Sandhu (1992, Crit. Rev. Biotech. 12: 437), Singer et al. (1993, J. Immun. 150: 2844), Sudhir (ed., Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc. 1995), Kelley ("Engineering Therapeutic Antibodies", in Protein Engineering: Principles and Practice Cleland et al. (eds.), pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), y por Queen et al., Patente de Estados Unidos U.S. Pat. No. 5,693,762 (1997). Los anticuerpos humanizados incluyen anticuerpos "primatizados" en los que la región de unión al antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido mediante la inmunización de monos macacos con el antígeno de interés. También se contemplan como moléculas de unión a antígenos los anticuerpos humanizados.

Los términos "célula beta", "célula p" o "célula p pancreática" se usan indistintamente en la presente memoria para referirse a células en los islotes pancreáticos que son del linaje de células que producen insulina en respuesta a la glucosa. Las células p se encuentran en los islotes de Langerhans en el páncreas.

El término "fragmento biológicamente activo", aplicado a fragmentos de una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos de referencia o de longitud completa, se refiere a un fragmento que tiene al menos aproximadamente 0,1, 0,5, 1,2, 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de la actividad de una secuencia de referencia. Adecuadamente, el fragmento biológicamente activo tiene no menos de aproximadamente 1 %, 10 %, 25 %, 50 % de una actividad del polipéptido de longitud completa del que se deriva. Incluidos dentro del alcance de la presente invención están fragmentos biológicamente activos de al menos aproximadamente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000 nucleótidos o residuos de longitud, que comprenden o codifican una actividad de un polinucleótido o polipéptido de referencia. Los fragmentos biológicamente activos representativos generalmente participan en una interacción, por ejemplo, una interacción intramolecular o intermolecular. Una interacción intermolecular puede ser una interacción de unión específica o una interacción enzimática (porejemplo, la interacción puede ser transitoria y se forma o se rompe un enlace covalente). Por ejemplo, los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de IL-22 o IL-10 de longitud completa incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente similares a o derivadas de las secuencias de aminoácidos de un precursor (supuesto) de longitud completa o un polipéptido maduro de IL-22 o IL-10. Por ejemplo, las porciones biológicamente activas de un precursor de longitud completa o un polipéptido maduro de IL-22 o IL-10 incluyen péptidos o polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos con suficiente similitud o identidad a o derivada de la secuencia de aminoácidos de un precursor de longitud completa o polipéptido maduro de IL-22 o IL-10, como por ejemplo se establece en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 y comprende al menos un dominio o motivo capaz de inhibir el estrés OER. En algunas realizaciones, las porciones biológicamente activas comprenden al menos un dominio o motivo capaz de activar el receptor de IL-22 (IL-22R) o el receptor de IL-10 (IL-10R).

A lo largo de esta especificación, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que las palabras "comprende", "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos. Por lo tanto, el uso del término "que comprende" y similares indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes. Por "que consiste en" se entiende que incluye, y se limita a, todo lo que sigue a la frase "que consiste en". Por lo tanto, la frase "que consiste en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, y que no puede haber otros elementos presentes. Por "que consiste esencialmente en" se entiende que incluye cualquier elemento enumerado después de la frase, y se limita a otros elementos que no interfieren ni contribuyen a la actividad o acción especificada en la divulgación para los elementos enumerados. Por lo tanto, la frase "que consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes dependiendo de si afectan o no la actividad o acción de los elementos enumerados.

Una "sustitución conservativa de aminoácidos" es aquella en la que el residuo de aminoácido se sustituye con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, que generalmente se pueden subclasificar de la siguiente manera:

Tabla 1

La sustitución conservativa de aminoácidos también incluye agrupaciones basadas en cadenas laterales. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxil-alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Por ejemplo, es razonable esperar que la sustitución de una leucina por una isoleucina o una valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina o una sustitución similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un efecto importante sobre las propiedades del polipéptido variante resultante. Puede determinarse fácilmente si un cambio de aminoácido da como resultado un polipéptido funcional ensayando su actividad. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 2 bajo el título de sustituciones ejemplares y preferidas. Las sustituciones de aminoácidos que caen dentro del alcance de la invención se logran, en general, seleccionando sustituciones que no difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto peptídico en el área de la sustitución, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Después de que se introducen las sustituciones, las variantes se analizan para la actividad biológica.

Tabla 2

Por "corresponde a" o "que corresponde a" se entiende una secuencia de aminoácidos que muestra una similitud o identidad de secuencia sustancial con una secuencia de aminoácidos de referencia. En general, la secuencia de aminoácidos mostrará al menos aproximadamente el 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 97, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % o incluso hasta el 100 % de similitud o identidad de secuencia con al menos una parte de la secuencia de aminoácidos de referencia

"Dislipidemia diabética" o "diabetes tipo 2 con dislipidemia" se refiere a una afección caracterizada por diabetes tipo 2, HDL-C reducido, triglicéridos séricos elevados y partículas de LDL pequeñas y densas elevadas.

Por "cantidad eficaz", en el contexto de la inhibición del estrés del ER o del tratamiento o la prevención de una enfermedad o afección, se entiende la administración de una cantidad de agente a un individuo que lo necesita, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, que sea eficaz para esa inhibición, tratamiento o prevención. La cantidad efectiva variará dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico del individuo a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad se encuentre en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse a través de ensayos de rutina.

El término "estrés del ER" se refiere al estado bioquímico y la respuesta celular asociada con (por ejemplo, causado por, correlacionado con o inducido por) el mal plegamiento de proteínas u otras alteraciones de la fisiología normal dentro del retículo endoplásmico. Estas respuestas celulares incluyen, pero no se limitan a, expresión génica, traducción/expresión de proteínas y degradación de proteínas. Varias metodologías descritas en la presente memoria incluyen etapas que implican determinar o comparar los niveles de señalización de estrés del ER. Los métodos para determinar los niveles de estrés del ER son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos para medir la señalización de estrés del ER se describen en la Publicación de Patente de Estados Unidos U.S Pat. Publication No.

20070202544. El Ejemplo 1 de la presente memoria también describe métodos ejemplares para medir el nivel de estrés del ER. Por ejemplo, se pueden medir los niveles de expresión de los genes de respuesta al estrés del ER, por ejemplo, la expresión y empalme del mRNA de Xbp-1.

El término "euglucemia" se define como la afección en la que un sujeto tiene una concentración de glucosa en sangre en ayunas dentro del intervalo normal, mayor de 70 mg/dL (3,89 mmol/L) y menor de 100 mg/dL (5,6 mmol/L).

Por "gen" se entiende una unidad de herencia que ocupa un locus específico en un cromosoma y consiste en secuencias reguladoras transcripcionales y/o traduccionales y/o una región codificante y/o secuencias no traducidas (es decir, intrones, secuencias no traducidas en 5' y 3').

Como se usa en la presente memoria, el término "acidemia hipergrasa" se refiere a una afección caracterizada por niveles elevados de ácidos grasos. Los niveles ejemplares de ácidos grasos totales considerados anormalmente elevados en un sujeto humano son de 0,72 mmol/L y superiores.

El término "hiperlipidemia" se refiere a la presencia de un nivel anormalmente elevado de lípidos en la sangre. La hiperlipidemia puede aparecer en al menos tres casos de MS (ES): (1) hipercolesterolemia, es decir, un nivel elevado de colesterol LDL (120 mg/dL y superior); (2) hipertrigliceridemia, es decir, un nivel elevado de triglicéridos; (150 mg/dL y superior) y (3) hiperlipidemia combinada, es decir, una combinación de hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia.

El término "hipertensión", tal y como se usa en la presente memoria, incluye hipertensión esencial o primaria en la que la causa no se conoce o en la que la hipertensión se debe a más de una causa, tal como cambios tanto en el corazón como en los vasos sanguíneos; e hipertensión secundaria en la que se conoce la causa. Las causas de la hipertensión secundaria incluyen, pero no se limitan a, la obesidad; enfermedad del riñón; trastornos hormonales; uso de ciertos fármacos, tales como anticonceptivos orales, corticosteroides, ciclosporina y similares. El término "hipertensión" abarca la presión arterial alta, en la que tanto los niveles de presión sistólica como diastólica están elevados >140 mmHg/>90 mmHg) y la hipertensión sistólica aislada, en la que solo la presión sistólica está elevada a más o igual a 140 mm Hg, mientras que la presión diastólica es inferior a 90 mm Hg. La presión arterial normal se puede definir como sistólica inferior a 120 mmHg y diastólica inferior a 80 mmHg.

Como se usa en la presente memoria, el término "hipertrigliceridemia" se refiere a una afección caracterizada por niveles elevados de triglicéridos. Los niveles ejemplares de triglicéridos totales que se consideran anormalmente elevados en un sujeto humano son de 150 mg/dL y superiores.

El término "hiperinsulinemia" se define como la afección en la que un sujeto con resistencia a la insulina, con o sin euglucemia, tiene una concentración de insulina en suero o plasma en ayunas o posprandial elevada por encima de la de individuos delgados normales sin resistencia a la insulina, que tienen una relación cintura-cadera <1.0 (para hombres) o <0.8 (para mujeres).

El término "polipéptido de IL-10", como se usa en la presente memoria, abarca, sin limitación, polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 % (y al menos de un 71 % a al menos un 99 % y todos los porcentajes enteros intermedios) de identidad de secuencia o similitud con la secuencia establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 4. Abarca además la variación alélica natural de los polipéptidos de IL-10 que pueden existir y ocurrir de un organismo a otro. Además, el grado y la localización de la glicosilación u otras modificaciones posteriores a la traducción pueden variar según el huésped elegido y la naturaleza del entorno celular del huésped. El término "polipéptido de IL-10" también pretende abarcar polipéptidos de IL-10 en su forma precursora, así como aquellos que han sido procesados para producir sus respectivas formas bioactivas. Abarca además polipéptidos de IL-10 que han sido modificados químicamente en relación con un polipéptido de IL-10 de referencia o de origen natural y/o que contienen una o más alteraciones de la secuencia de aminoácidos en relación con un polipéptido de IL-10 de referencia o de origen natural y/o o contienen secuencias de aminoácidos truncadas en relación con un polipéptido de IL-10 de referencia o de longitud completa o precursor natural. Estas secuencias truncadas son típicamente fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de IL-10 de referencia o de longitud completa o precursor natural. Los polipéptidos de IL-10 pueden mostrar diferentes propiedades en relación con un polipéptido de IL-10 de referencia o de origen natural, que incluyen estabilidad y una actividad específica alterada seleccionada entre estimular o inducir de otro modo la apoptosis de una célula o tejido adiposo; reducir la hiperinsulinemia en ayunas, reducir los niveles de glucosa después de un estímulo hiperglucémico; reducir la hiperinsulinemia después de un estímulo hiperglucémico, potenciar la respuesta periférica a la insulina; reducir el aumento de la adiposidad en respuesta a una dieta rica en grasas, mejorar la capacidad oxidativa de los ácidos grasos mitocondriales del tejido muscular, reducir los niveles circulantes de IL-6 y similares. El término "polipéptido de IL-10" también abarca moléculas proteínicas con una secuencia de aminoácidos ligeramente modificada, por ejemplo, polipéptidos que tienen un extremo N-terminal modificado incluyendo deleciones o adiciones de aminoácidos N-terminales, y/o polipéptidos que se han modificado químicamente con respecto a un polipéptido de IL-10 de referencia o de origen natural. Los polipéptidos de IL-10 también abarcan moléculas proteínicas que muestran sustancialmente la misma o mejor bioactividad que un polipéptido de IL-10 de referencia o de origen natural, o, alternativamente, que muestran una bioactividad sustancialmente modificada o reducida en relación con un polipéptido de IL-10 de referencia o de origen natural. También incluyen, sin limitación, polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de un polipéptido de IL-10 de referencia o de origen natural mediante la inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos y, en ejemplos ilustrativos, abarcan moléculas proteicas que muestran al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120% y 130% de la actividad específica de un polipéptido de IL-10 de referencia o de origen natural que se ha producido en la misma célula. Los polipéptidos de IL-10 que tienen una actividad biológica sustancialmente igual o mejorada en relación con un polipéptido de IL-10 de referencia o de origen natural, abarcan moléculas que muestran al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 % y 130 % de la actividad biológica específica del polipéptido de IL-10 de referencia o de origen natural que se ha producido en el mismo tipo de célula.

El término "polipéptido de IL-22", como se usa en la presente memoria, abarca, sin limitación, polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 % (y de al menos un 71 % a al menos un 99 % y todos los porcentajes enteros intermedios) de identidad de secuencia o similitud con la secuencia establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 1. Abarca además la variación alélica natural de polipéptidos de IL-22 que pueden existir y ocurrir de un organismo a otro. Además, el grado y la localización de la glicosilación u otras modificaciones posteriores a la traducción pueden variar dependiendo del huésped elegido y la naturaleza del entorno celular del huésped. El término "polipéptido de IL-22" también pretende abarcar polipéptidos de IL-22 en su forma precursora, así como aquellos que han sido procesados para producir sus respectivas formas bioactivas. Abarca además polipéptidos de IL-22 que han sido modificados químicamente en relación con un polipéptido de IL-22 de referencia o de origen natural y/o que contienen una o más alteraciones de la secuencia de aminoácidos en relación con un polipéptido de IL-22 de referencia o de origen natural y/o o contienen secuencias de aminoácidos truncadas con respecto a un polipéptido de IL-22 de longitud completa o precursor de referencia o de origen natural. Estas secuencias truncadas son típicamente fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de IL-22 de longitud completa o precursor de referencia o de origen natural. Los polipéptidos de IL-22 pueden mostrar diferentes propiedades en relación con un polipéptido de IL-22 de referencia o de origen natural, incluyendo la estabilidad y una actividad específica alterada seleccionada entre estimular o inducir de otro modo la apoptosis de una célula o tejido adiposo; reducir la hiperinsulinemia en ayunas, reducir los niveles de glucosa tras un estímulo hiperglucémico; reducir la hiperinsulinemia después de un estímulo hiperglucémico, potenciar la respuesta periférica a la insulina; reducir el aumento de la adiposidad en respuesta a una dieta rica en grasas, mejorar la capacidad oxidativa de los ácidos grasos mitocondriales del tejido muscular, reducir los niveles circulantes de IL-6 y similares. El término "polipéptido de IL-22" también abarca moléculas proteínicas con una secuencia de aminoácidos ligeramente modificada, por ejemplo, polipéptidos que tienen un extremo N-terminal modificado que incluye deleciones o adiciones de aminoácidos N-terminales, y/o polipéptidos que se han modificado químicamente con respecto a un polipéptido de IL-22 de referencia o de origen natural. Los polipéptidos de IL-22 también abarcan moléculas proteínicas que muestran sustancialmente la misma o mejor bioactividad que un polipéptido de IL-22 de referencia o de origen natural o, alternativamente, que muestran una bioactividad sustancialmente modificada o reducida en relación con un polipéptido de IL-22 de referencia o de origen natural. También incluyen, sin limitación, polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de un polipéptido de IL-22 de referencia o de origen natural mediante la inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos y, en ejemplos ilustrativos, abarcan moléculas proteínicas que muestran al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120% y 130% de la actividad específica de un polipéptido de IL-22 de referencia o de origen natural que se ha producido en la misma célula. Los polipéptidos de IL-22 que tienen una actividad biológica sustancialmente igual o mejorada en relación con un polipéptido de IL-22 de referencia o de origen natural, abarcan moléculas que muestran al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 % y 130 % de la actividad biológica específica del polipéptido de IL-22 de referencia o de origen natural que se ha producido en el mismo tipo de célula.

El término "resistencia a la insulina" se refiere a un estado en el que una cantidad normal de insulina produce una respuesta biológica anormal en relación con la respuesta biológica en un sujeto que no tiene resistencia a la insulina.

"Sensibilidad a la insulina" significa la capacidad de las células para absorber glucosa en respuesta a la acción de la insulina.

Por "enlazador" se entiende una molécula o grupo de moléculas (tal como un monómero o polímero) que conecta dos moléculas y, a menudo, sirve para colocar las dos moléculas en una configuración deseable.

"Síndrome metabólico" significa una afección caracterizada por una agrupación de factores de riesgo lipídicos y no lipídicos de origen metabólico. En determinadas realizaciones, el síndrome metabólico se identifica por la presencia de 3 cualquiera de los siguientes factores: circunferencia de cintura superior a 102 cm en hombres o superior a 88 cm en mujeres; triglicéridos séricos de al menos 150 mg/dL; HDL-C inferior a 40 mg/dL en hombres o inferior a 50 mg/dL en mujeres; presión arterial de al menos 130/85 mmHg; y glucosa en ayunas de al menos 110 mg/dL. Estos determinantes se pueden medir fácilmente en la práctica clínica (JAMA, 2001,285: 2486-2497).

Por "modular" se entiende aumentar o disminuir, ya sea directa o indirectamente, el nivel o la actividad funcional de una molécula diana. Por ejemplo, un agente puede modular indirectamente el nivel/actividad interactuando con una molécula distinta de la molécula diana. En este sentido, la modulación indirecta de un gen que codifica un polipéptido diana incluye dentro de su alcance la modulación de la expresión de una primera molécula de ácido nucleico, en donde un producto de expresión de la primera molécula de ácido nucleico modula la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido diana.

"Enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD)" significa una afección caracterizada por la acumulación de grasa en el hígado en sujetos que consumen poco o nada de alcohol. En determinadas realizaciones, NAFLD está relacionada con la resistencia a la insulina y el síndrome metabólico.

"Esteatohepatitis no alcohólica (NASH)" significa una afección caracterizada por la acumulación de grasa en el hígado, combinada con inflamación ± cicatrización en el hígado. En determinadas realizaciones, NASH resulta de un empeoramiento de la progresión de NAFLD.

El término "obesidad", como se usa en la presente memoria, incluye afecciones en las que hay un aumento de la grasa corporal más allá del requisito físico como resultado de una acumulación excesiva de tejido adiposo en el cuerpo. Generalmente, el término "obesidad" se refiere a una cantidad excesivamente alta de grasa corporal o tejido adiposo en relación con la masa corporal magra. La cantidad de grasa corporal (o adiposidad) incluye tanto la distribución de la grasa por todo el cuerpo como el tamaño de los depósitos de tejido adiposo. La distribución de la grasa corporal se puede estimar mediante medidas de pliegues cutáneos, proporciones de circunferencia de cintura-cadera o técnicas tales como imágenes por ultrasonido, tomografía computarizada o resonancia magnética. Según The Center for Disease Control and Prevention, las personas con un índice de masa corporal (BMI) de 30 o más se consideran obesas. El término obesidad incluye, pero no se limita a, las siguientes afecciones: obesidad de inicio en la edad adulta; obesidad alimentaria; obesidad endógena o metabólica; obesidad endocrina; obesidad familiar; obesidad hiperinsulinar; obesidad hiperplásica-hipertrófica; obesidad hipogonadal; obesidad hipotiroidea; obesidad de por vida; obesidad mórbida y obesidad exógena. De manera similar, el término "obesidad inducida por la dieta" (DIO) es un modelo creado para estudiar la obesidad y sus comorbilidades, tal como la diabetes tipo 2, la hipertensión, la hipercolesterolemia y la aterosclerosis. En este modelo, se alimenta a un animal (ratón, rata, perro o primate no humano) con una dieta alta en grasas y/o alta en azúcar durante varias semanas. Como resultado, se vuelve obeso y, por lo general, hiperglucémico, y desarrolla intolerancia a la glucosa.

Por "obtenido a partir de" se entiende que una muestra tal como, por ejemplo, un extracto de polinucleótido o un extracto de polipéptido se aísla o se deriva de una fuente particular.

El término "estrés oxidativo" como se usa en la presente memoria se refiere a una alteración celular caracterizada por una producción excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) y/o especies reactivas de nitrógeno (RNS) y una pérdida de eficacia de las defensas antioxidantes que conducen a estados patológicos en la célula y provoca daño celular o tisular. Los ejemplos de dicho daño incluyen pero no se limitan a la oxidación de lipoproteínas; fosfolípidos de membrana; peroxidación lipídica; daño de las proteínas, incluyendo la escisión de los enlaces de aminoácidos y la oxidación de grupos funcionales; roturas de cadenas de ácidos nucleicos; modificaciones de bases de ácidos nucleicos que conducen a mutaciones puntuales; inhibición de la síntesis de RNA y proteínas; entrecruzamiento de proteínas; deterioro del mantenimiento de los gradientes iónicos de la membrana; y reducción de los niveles celulares de ATP, lo que conduce a una disfunción celular y finalmente a la enfermedad. El oxidante (reactivo oxidante) puede ser endógeno o exógeno.

Los términos "paciente", "sujeto", "huésped" o "individuo" usados en la presente memoria de manera intercambiable, se refieren a cualquier sujeto, particularmente un sujeto vertebrado, e incluso más particularmente un sujeto mamífero, para quien se desea terapia o profilaxis. Los animales vertebrados adecuados que caen dentro del alcance de la invención incluyen, pero no se limitan a, cualquier miembro de subphylum Chordata, incluyendo los primates (por ejemplo, humanos, monos y simios, e incluye especies de monos del género macaca (por ejemplo, monos cynomologus tales como Macaca fascicularis, y/o monos Rhesus (Macaca mulata)) y babuino (Papio Ursinus), así como titíes (especies del género Callithrix), monos ardilla (especies del género Saimirí) y tamarindos (especies del género Saguinus), así como especies de simios tales como los chimpancés (Pan troglodytes)), roedores (por ejemplo, ratones, ratas, conejillos de indias), lagomorfos (porejemplo, conejos, liebres), bovinos (por ejemplo, ganado vacuno), ovinos (por ejemplo, ovejas), caprinos (por ejemplo, cabras), porcinos (por ejemplo, cerdos), equinos (por ejemplo, caballos), caninos (porejemplo, perros), felinos (porejemplo, gatos), aves (porejemplo, pollos, pavos, patos, gansos, pájaros de compañía tal como canarios, periquitos etc.), mamíferos marinos (porejemplo, delfines, ballenas), reptiles (serpientes, ranas, lagartos etc.), y peces. Un sujeto preferido es un ser humano que necesita reducir el estrés OER en una célula, por ejemplo, una célula p (por ejemplo, un ser humano que tiene o está en riesgo de tener un trastorno metabólico). Sin embargo, se entenderá que los términos antes mencionados no implican que los síntomas estén presentes.

“Prediabetes” significa una afección en la que los niveles de glucosa en sangre de un sujeto son más altos que en un sujeto con niveles de glucosa en sangre normales y más bajos pero no lo suficientemente altos para un diagnóstico de diabetes.

Por "vehículo farmacéuticamente aceptable" se entiende un relleno sólido o líquido, diluyente o sustancia encapsulante que se puede usar de manera segura en la administración tópica o sistémica a un animal, preferiblemente un mamífero, incluyendo los seres humanos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables representativos incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardadores de la absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizantes de fármacos, geles, aglutinantes, excipientes, agentes de disgregación, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, colorantes, tales como materiales y combinaciones de los mismos, como sería conocido por un experto normal en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier vehículo convencional sea incompatible con los ingredientes activos, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas.

El término "polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usa en la presente memoria, designa mRNA, RNA, cRNA, cDNA o DNA. El término normalmente se refiere a la forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de DNA monocatenario y bicatenario.

Los términos "variante de polinucleótido" y "variante" y similares se refieren a polinucleótidos que muestran una identidad de secuencia sustancial con respecto a una secuencia de polinucleótidos de referencia o polinucleótidos que se hibridan con una secuencia de referencia en condiciones estrictas que se definen más adelante. Estos términos también abarcan polinucleótidos que se distinguen de un polinucleótido de referencia por la adición, deleción o sustitución de al menos un nucleótido. Por consiguiente, los términos "variante de polinucleótido" y "variante" incluyen polinucleótidos en los que se han añadido o suprimido uno o más nucleótidos, o se han sustituido por nucleótidos diferentes. A este respecto, se entiende bien en la técnica que se pueden realizar ciertas alteraciones que incluyen mutaciones, adiciones, deleciones y sustituciones en un polinucleótido de referencia por lo que el polinucleótido alterado conserva la función o actividad biológica del polinucleótido de referencia. Los términos "variante de polinucleótido" y "variante" también incluyen variantes alélicas de origen natural.

"Polipéptido", "péptido", "proteína" y "molécula proteínica" se usan indistintamente en la presente memoria para referirse a moléculas que comprenden o consisten en un polímero de residuos de aminoácidos y variantes y análogos sintéticos de las mismas. Por lo tanto, estos términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son aminoácidos sintéticos no naturales, tal como un análogo químico de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos naturales.

Los términos "variante peptídica" y "variante polipeptídica" y similares se refieren a péptidos y polipéptidos que se distinguen de un péptido o polipéptido de referencia por la adición, deleción o sustitución de al menos un residuo de aminoácido. En ciertas realizaciones, una variante de péptido o polipéptido se distingue de un péptido o polipéptido de referencia por una o más sustituciones, que pueden ser conservadoras o no conservadoras. En ciertas realizaciones, la variante peptídica o polipeptídica comprende sustituciones conservadoras y, en este sentido, se entiende bien en la técnica que algunos aminoácidos pueden cambiarse por otros con propiedades similares en términos generales sin cambiar la naturaleza de la actividad del péptido o polipéptido. Las variantes peptídicas y polipeptídicas también abarcan péptidos y polipéptidos en los que uno o más aminoácidos se han añadido o suprimido, o se han sustituido por diferentes residuos de aminoácidos.

Por "polipéptido recombinante" se entiende un polipéptido preparado usando técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un polinucleótido recombinante.

El término "identidad de secuencia", como se usa en la presente memoria, se refiere al grado en que las secuencias son idénticas en una base de nucleótido por nucleótido o en una base de aminoácido por aminoácido en una ventana de comparación. Por lo tanto, se calcula un "porcentaje de identidad de secuencia" comparando dos secuencias alineadas de forma óptima en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, I) o el residuo de aminoácido idéntico (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) se produce en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. La presente invención contempla el uso en los métodos y sistemas de la presente invención de polipéptidos de IL-22 de longitud completa así como sus fragmentos biológicamente activos. Típicamente, los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de IL-22 de longitud completa pueden participar en una interacción, por ejemplo, una interacción intramolecular o intermolecular.

"Similitud" se refiere al número porcentual de aminoácidos que son idénticos o constituyen sustituciones conservadoras como se define en las Tablas 1 y 2 supra. La similitud se puede determinar utilizando programas de comparación de secuencias tal como GAP (Deveraux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12: 387-395). De esta manera, las secuencias de una longitud similar o sustancialmente diferente a las citadas en la presente memoria podrían compararse mediante la inserción de espacios en la alineación, siendo determinados dichos espacios, por ejemplo, por el algoritmo de comparación utilizado por GAP.

Los términos utilizados para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" tiene una longitud de al menos 12 pero frecuentemente de 15 a 18 y a menudo al menos 25 unidades de monómero, incluidos los nucleótidos y los residuos de aminoácidos. Debido a que dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, solo una parte de la secuencia de polinucleótidos completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan normalmente comparando secuencias de los dos polinucleótidos en una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, generalmente aproximadamente de 50 a 100, más generalmente aproximadamente de 100 a aproximadamente 150, en el que una secuencia se compara con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que la dos secuencias están óptimamente alineadas. La ventana de comparación puede incluir adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) de aproximadamente el 20% o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse mediante implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA) o por inspección y la mejor alineación (es decir, dando como resultado el mayor porcentaje de homología sobre la ventana de comparación) generado por uno cualquiera de los diversos métodos seleccionados. También se puede hacer referencia a la familia de programas BLAST como, por ejemplo, descrita por Altschul et al, 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389. Se puede encontrar una discusión detallada del análisis de secuencias en la Unidad 19.3 de Ausubel et al., "Curret Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994­ 1998, Chapter 15.

“Rigurosidad”, como se usa en la presente memoria, se refiere a las condiciones de temperatura y fuerza iónica, y la presencia o ausencia de ciertos disolventes orgánicos, durante los procedimientos de hibridación y lavado. Cuanto mayor sea la rigurosidad, mayor será el grado de complementariedad entre las secuencias de nucleótidos diana inmovilizadas y las secuencias de nucleótidos de la sonda que permanecen hibridadas con la diana después del lavado. Las condiciones de rigurosidad incluyen condiciones de rigurosidad baja, media, alta y muy alta, que describen ciertas condiciones para la hibridación y el lavado. Puede encontrar orientación para realizar reacciones de hibridación en Ausubel et al., (1998, supra), Sections 6.3.1-6.3.6. Los métodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y se puede usar cualquiera. Las referencias en la presente memoria a condiciones de baja rigurosidad incluyen y abarcan desde al menos aproximadamente el 1 % v/v hasta al menos aproximadamente el 15 % v/v de formamida y desde al menos aproximadamente 1 M hasta al menos aproximadamente 2 M de sal para la hibridación a 42°C, y de al menos aproximadamente 1 M a al menos aproximadamente 2 M de sal para el lavado a 42°C. Las condiciones de baja rigurosidad también pueden incluir albúmina de suero bovino (BSA) al 1 %, EDTA 1 mM, NaHPÜ4 0,5 M (pH 7,2), SDS al 7 % para la hibridación a 65°C, y (i) 2 x SSC, SDS al 0,1 %; o (ii) BSA al 0,5 %, EDTA 1 mM, NaHPÜ440 mM (pH 7,2), SDS al 5% para el lavado a temperatura ambiente. Una realización de condiciones de baja rigurosidad incluye la hibridación en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguida de dos lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % al menos a 50 °C (la temperatura de los lavados puede aumentarse a 55°C para condiciones de baja rigurosidad). Las condiciones de rigurosidad media incluyen y abarcan desde al menos aproximadamente el 16 % v/v hasta al menos aproximadamente el 30 % v/v de formamida y desde al menos aproximadamente 0,5 M hasta al menos aproximadamente 0,9 M de sal para la hibridación a 42°C, y desde al menos aproximadamente 0,1 M a al menos aproximadamente 0,2 M de sal para el lavado a 55°C. Las condiciones de rigurosidad media también pueden incluir albúmina de suero bovino (BSA) al 1 %, EDTA 1 mM, NaHPÜ40,5 M (pH 7,2), SDS al 7 % para la hibridación a 65°C, y (i) 2 x SSC, SDS al 0,1 %; o (ii) BSA al 0,5 %, EDTA 1 mM, NaHPÜ440 mM (pH 7,2), SDS al 5 % para el lavado a 60-65°C. Una realización de condiciones de rigurosidad media incluye la hibridación en 6 x SSC a aproximadamente 45°C, seguida de uno o más lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % a 60°C. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen y abarcan desde al menos aproximadamente el 31 % v/v hasta al menos aproximadamente el 50 % v/v de formamida y desde aproximadamente 0,01 M hasta aproximadamente 0,15 M de sal para la hibridación a 42°C, y desde aproximadamente 0,01 M hasta aproximadamente 0,02 M de sal para el lavado a 55°C. Las condiciones de alta rigurosidad también pueden incluir BSA al 1%, EDTA 1 mM, NaHPÜ40,5 M (pH 7,2), SDS al 7 % para la hibridación a 65°C, y (i) 0,2 x SSC, SDS al 0,1 %; o (ii) BSA al 0,5 %, EDTA 1 mM, NaHPÜ440 mM (pH 7,2), SDS al 1 % para el lavado a una temperatura superior a 65°C. Una realización de condiciones de alta rigurosidad incluye la hibridación en 6 x SSC a aproximadamente 45°C, seguida de uno o más lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % a 65°C. En ciertas realizaciones, un péptido o polipéptido está codificado por un polinucleótido que se hibrida con una secuencia de nucleótidos de referencia en condiciones muy rigurosas. Una realización de condiciones de rigurosidad muy alta incluye la hibridación de fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7 % a 65°C, seguido de uno o más lavados a 0,2 x SSC, SDS al 1 % a 65°C. Otras condiciones de rigurosidad son bien conocidas en la técnica y un destinatario experto reconocerá que se pueden manipular varios factores para optimizar la especificidad de la hibridación. La optimización de la rigurosidad de los lavados finales puede servir para asegurar un alto grado de hibridación. Para ejemplos detallados, véase Ausubel et al., supra en las páginas 2.10.1 a 2.10.16 y Sambrook et al. (1989, supra) en las secciones 1.101 a 1.104. Mientras que los lavados rigurosos se llevan a cabo típicamente a temperaturas de aproximadamente 42°C a 68°C, un experto en la técnica apreciará que otras temperaturas pueden ser adecuadas para condiciones rigurosas. La tasa máxima de hibridación generalmente se produce a aproximadamente 20°C a 25°C por debajo de la Tm para la formación de un híbrido DNA-DNA. Es bien conocido en la técnica que la Tm es la temperatura de fusión, o la temperatura a la que se disocian dos secuencias de polinucleótidos complementarias. Los métodos para estimar la Tm son bien conocidos en la técnica (véase Ausubel et al., supra en la página 2.10.8). En general, la Tm de un dúplex de DNA perfectamente emparejado se puede predecir como una aproximación mediante la fórmula:

Tm = 81.5 16.6 (logio M) + 0.41 (%G+C) - 0.63 (% formamide) -(600/length)

en donde: M es la concentración de Na+, preferiblemente en el intervalo de 0,01 molar a 0,4 molar; %G+C es la suma de las bases guanosina y citosina como un porcentaje del número total de bases, dentro del intervalo entre 30% y 75% de G+C; % formamida es el porcentaje de concentración de formamida por volumen; la longitud es el número de pares de bases en el dúplex de DNA. La Tm de un DNA dúplex disminuye aproximadamente 1°C con cada aumento del 1 % en el número de pares de bases que no coinciden aleatoriamente. El lavado se realiza generalmente a Tm -15°C para alta rigurosidad, o Tm - 30° C para rigurosidad moderada. En un ejemplo de un procedimiento de hibridación, una membrana (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa o una membrana de nailon) que contiene DNA inmovilizado se hibrida durante la noche a 42°C en un tampón de hibridación (formamida desionizada al 50%, 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt (ficoll al 0,1%, polivinilpirrolidona al 0,1% y albúmina de suero bovino al 0,1%), SDS al 0,1% y DNA de esperma de salmón desnaturalizado 200 mg/mL) que contiene una sonda marcada. Después, la membrana se somete a dos lavados secuenciales de rigurosidad media (es decir, 2 x SSC, SDS al 0,1% durante 15 min a 45°C, seguido de 2 x SSC, SDS al 0,1% durante 15 min a 50°C), seguido de dos lavados secuenciales de mayor rigurosidad (es decir, 0,2 x SSC, SDS al 0,1% durante 12 min a 55°C seguidos de 0,2 x SSC y solución de SDS al 0,1% durante 12 min a 65-68°C.

"Esteatosis" significa una afección caracterizada por la acumulación excesiva de triglicéridos en los hepatocitos.

"Esteatohepatitis" significa esteatosis con inflamación.

El término "compuesto de sulfonilurea" y las variaciones gramaticales del mismo incluyen los estereoisómeros del compuesto, las sales farmacéuticamente aceptables del compuesto, los profármacos del compuesto y las sales farmacéuticamente aceptables de los profármacos.

Como se usa en la presente memoria, el término "agente terapéutico" se refiere a un agente que comprende los elementos especificados, así como a cualquier agente que resulte, directa o indirectamente, de la combinación de los elementos especificados.

Como se usa en la presente memoria, los términos "tratamiento", "que trata" y similares, se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de cura parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en la presente memoria, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir que la enfermedad ocurra en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no ha sido diagnosticado como tenerlo; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad.

El término "diabetes tipo 1" se define como la afección en la que un sujeto tiene, en presencia de autoinmunidad hacia las células p pancreáticas o la insulina, una concentración de glucosa en sangre o glucosa en suero en ayunas superior a 125 mg/dL (6,94 mmol/mL). La presencia de autoinmunidad hacia las células p pancreáticas puede observarse mediante la detección de autoanticuerpos circulantes contra las células de los islotes [“diabetes mellitus tipo IA”], es decir, al menos uno de: GAD65 [ácido glutámico descarboxilasa-65], ICA [citoplasma de células de los islotes], IA-2 [dominio intracitoplasmático de la proteína similar a la tirosina fosfatasa IA-2], ZnT8 [transportador de Zn8] o anti­ insulina; u otros signos de autoinmunidad sin la presencia de autoanticuerpos circulantes típicos [diabetes tipo IB], es decir, como se detecta a través de una biopsia o imagen pancreática). Por lo general, existe una predisposición genética (por ejemplo, HLA, INS VNTR y PTPN22), pero no siempre es así.

La "diabetes tipo 2" o "diabetes mellitus no insulinodependiente" se refiere a un trastorno relacionado con la insulina en el que existe una disparidad relativa entre la producción de insulina endógena y los requisitos de insulina, lo que conduce a una producción de glucosa hepática elevada, niveles elevados de glucosa en sangre, secreción de insulina inadecuada y resistencia periférica a la insulina. La diabetes tipo 2 ha sido considerada como una entidad de enfermedad relativamente distinta, pero la diabetes tipo 2 es a menudo una manifestación de un trastorno subyacente mucho más amplio (Zimmet et al., 2001 Nature 414: 782-787), que puede incluir síndrome metabólico (síndrome X), diabetes (por ejemplo, diabetes tipo 2, diabetes tipo 2, diabetes gestacional, diabetes autoinmune), hiperinsulinemia, hiperglucemia, intolerancia a la glucosa (IGT), hipoglucemia, insuficiencia de células p, resistencia a la insulina, dislipidemias, ateroma, insulinoma, hipertensión, hipercoagulabilidad, microalbuminuria y obesidad y otras afecciones relacionadas con la adiposidad tales como obesidad visceral, grasa central, diabetes tipo 2 relacionada con la obesidad, aterosclerosis relacionada con la obesidad, enfermedad cardíaca, resistencia a la insulina relacionada con la obesidad, hipertensión relacionada con la obesidad, lesiones microangiopáticas resultantes de la diabetes tipo 2 relacionada con la obesidad, lesiones oculares provocadas por microangiopatía en individuos obesos con diabetes tipo U relacionada con la obesidad y lesiones renales provocadas por microangiopatía en individuos obesos con diabetes tipo 2 relacionada con la obesidad.

Los términos "de tipo nativo" y "de origen natural" se usan indistintamente para referirse a un gen o producto génico que tiene las características de ese gen o producto génico cuando se aísla de una fuente natural. Un gen o producto génico de tipo nativo (por ejemplo, un polipéptido) es el que se observa con mayor frecuencia en una población y, por lo tanto, se designa arbitrariamente como la forma "normal" o "de tipo nativo" del gen.

Como se usa en la presente memoria, subrayar o poner en cursiva el nombre de un gen indicará el gen, en contraste con su producto proteico, que se indica mediante el nombre del gen en ausencia de cualquier subrayado o cursiva. Por ejemplo, "IL-22' significará el gel IL-22 gen o polinucleótidos de IL-22 , mientras que "IL-22" indicará el producto o productos proteicos generados a partir de la transcripción y traducción y empalme alternativo del gen "IL-22'.

Cada realización descrita en la presente memoria debe aplicarse mutatis mutandis a todas y cada una de las realizaciones a menos que se indique específicamente lo contrario.

2. Inhibidores de estrés OER

2.1 Citocinas que inhiben o reducen el Estrés OER

La presente invención proporciona agentes terapéuticos que inhiben, reducen o normalizan el estrés OER en una célula p y se basa en parte en la determinación de que algunas citocinas producidas en el entorno local de los islotes pancreáticos, tal como IL-23 e IL-24 promueven o inducen el estrés OER de células p, mientras que otras tales como IL-22 lo inhiben o reducen activamente. Además, en la obesidad, las altas concentraciones de lípidos y glucosa, y las altas tasas de biosíntesis de insulina necesarias debido a la resistencia a la insulina, contribuyen al estrés OER en las células p. Por lo tanto, los presentes inventores consideran que los inhibidores del estrés OER en las células p serán útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas con estrés del ER de células p aberrante, incluyendo trastornos metabólicos tales como la diabetes.

De acuerdo con la presente invención, el inhibidor de estrés OER es un polipéptido de IL-22

Los presentes inventores han descubierto que IL-22 es un potente supresor paracrino endógeno del estrés OER en los islotes pancreáticos, y que en la hiperglucemia inducida por la obesidad la terapia con IL-22 restaura el control de la glucosa atenuando los defectos en la biosíntesis y secreción de insulina pancreática. IL-22 reduce el estrés OER en las células p pancreáticas. En particular, la IL-22 reduce el estrés inducido por lípidos, citocinas inflamatorias o ROS ambientales, por ejemplo, mediante la regulación anterior mediada por STAT1 y STAT3 de genes antioxidantes y la supresión de genes inductores de estrés oxidativo.

En consecuencia, en algunas realizaciones, el inhibidor de estrés OER es un polipéptido de IL-22 que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

(a) una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLA KEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVP FLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 2], que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la forma precursora de IL-22, o

APISSSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNF TLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAI GELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 4], que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la forma madura de IL-22; o

(b) una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 % (y de al menos un 71 % a al menos un 99 % y todos los porcentajes enteros intermedios) de similitud de secuencia o identidad de secuencia con la secuencia establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 2 o 4; o

(c) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada de:

atggccgccctgcagaaatctgtgagctctttccttatggggaccctggccaccagctgcctccttctcttggccctcttggta cagggaggagcagctgcgcccatcagctcccactgcaggcttgacaagtccaacttccagcagccctatatcaccaaccg caccttcatgctggctaaggaggctagcttggctgataacaacacagacgttcgtctcattggggagaaactgttccacgg agtcagtatgagtgagcgctgctatctgatgaagcaggtgctgaacttcacccttgaagaagtgctgttccctcaatctgat aggttccagccttatatgcaggaggtggtgcccttcctggccaggctcagcaacaggctaagcacatgtcatattgaaggt gatgacctgcatatccagaggaatgtgcaaaagctgaaggacacagtgaaaaagcttggagagagtggagagatcaa agcaattggagaactggatttgctgtttatgtctctgagaaatgcctgcatt [SEQ ID NO: 1], que corresponde a la secuencia codificante para la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2, o

gcgcccatcagctcccactgcaggcttgacaagtccaacttccagcagccctatatcaccaaccgcaccttcatgctg gctaaggaggctagcttggctgataacaacacagacgttcgtctcattggggagaaactgttccacggagtcagtatgag tgagcgctgctatctgatgaagcaggtgctgaacttcacccttgaagaagtgctgttccctcaatctgataggttccagcctt atatgcaggaggtggtgcccttcctggccaggctcagcaacaggctaagcacatgtcatattgaaggtgatgacctgcata tccagaggaatgtgcaaaagctgaaggacacagtgaaaaagcttggagagagtggagagatcaaagcaattggagaa ctggatttgctgtttatgtctctgagaaatgcctgcatt [SEQ ID NO: 3], que corresponde a la secuencia codificante para la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 4;

(d) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que comparte al menos el 70 % (y de al menos el 71 % a al menos el 99 % y todos los porcentajes enteros intermedios) de identidad de secuencia con la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1 o 3, o un complemento de las mismas; o

(e) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones de rigurosidad baja, media o alta con la secuencia establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 3, o un complemento de la misma,

en donde la secuencia de aminoácidos de (a), (b), (c), (d) o (e) tiene una o más actividades seleccionadas de: mejorar la función del ER de células p pancreáticas, mejorar la biosíntesis de insulina, aumentar la tolerancia a la glucosa, modular la expresión de genes reguladores del estrés oxidativo, reducir el estrés inducido por lípidos, glucosa, citocinas inflamatorias o ROS ambientales, por ejemplo, mediante la regulación anterior mediada por STAT1 y STAT3 de genes antioxidantes y la supresión de genes inductores de estrés oxidativo, reducir el estrés del ER, promover la secreción de insulina eficaz de alta calidad, restaurar la homeostasis de la glucosa o mejorar la sensibilidad periférica a la insulina.

Descrito pero no como parte de la invención reivindicada, el inhibidor de estrés OER es un polipéptido de IL-10 que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

(a) una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNL LLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFL PCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN [SEQ ID NO: 6],

que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la forma precursora de IL-10, o SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYL GCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKA VEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN [SEQ ID NO:8],

que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la forma madura de IL-10.

(b) una secuencia de aminoácidos que comparte al menos el 70 % (y de al menos el 71 % a al menos el 99 % y todos los porcentajes enteros intermedios) de similitud de secuencia o identidad de secuencia con la secuencia establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 6 o 8; o

(c) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada de: atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctga gaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagacttt ctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaa gccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgca tgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaa gagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagttt gacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaac [SEQ ID NO: 5], que corresponde a la secuencia codificante para la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 6, o agcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatc tccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgct ggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagc tgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacg gcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaag agaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacga aac [SEQ ID NO: 7], que corresponde a la secuencia codificante para la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8;

(d) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que comparte al menos el 70 % (y de al menos el 71 % a al menos el 99 % y todos los porcentajes enteros intermedios) de identidad de secuencia con la secuencia establecida en SEQ ID NO: 5 o 7, o un complemento de las mismas; o

(e) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones de rigurosidad baja, media o alta con la secuencia establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 5 o 7, o un complemento de la misma,

en donde la secuencia de aminoácidos de (a), (b), (c), (d) o (e) tiene una o más actividades seleccionadas de: mejorar la función del ER de células p pancreáticas, mejorar la biosíntesis de insulina, aumentar la tolerancia a la glucosa, modular la expresión de genes reguladores del estrés oxidativo, reducir el estrés inducido por lípidos, glucosa, citocinas inflamatorias o ROS ambientales, por ejemplo, mediante la regulación anterior mediada por STAT1 y STAT3 de genes antioxidantes y la supresión de genes inductores de estrés oxidativo, reducir el estrés del ER, promover la secreción de insulina eficaz de alta calidad, restaurar la homeostasis de la glucosa o mejorar la sensibilidad periférica a la insulina.

El polipéptido de IL-22 o de IL-10 puede ser un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de IL-22 o de IL-10 de longitud completa, (es decir, uno que incluye menos aminoácidos que el polipéptido de IL-22 o de IL-10 de longitud completa como se establece, por ejemplo, en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8), y muestra al menos una actividad seleccionada de: mejorar la función del ER pancreático, mejorar la biosíntesis de insulina, aumentar la tolerancia a la glucosa, inhibir la expresión de genes reguladores del estrés oxidativo, reducir el estrés inducido por lípidos, citocinas inflamatorias o ROS ambientales, por ejemplo mediante la regulación anterior mediada por STAT1 y STAT3 de genes antioxidantes y la supresión de genes inductores de estrés oxidativo, reducir el estrés del ER, promover la secreción de insulina eficaz de alta calidad, restaurar la homeostasis de la glucosa o mejorar la sensibilidad periférica a la insulina. El fragmento biológicamente activo puede comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 residuos menos en uno o ambos extremos (es decir, el extremo N-terminal y/o el extremo C-terminal) en relación con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de longitud completa. En ejemplos ilustrativos de este tipo, el fragmento biológicamente activo comprende aproximadamente de 10 a aproximadamente 145 residuos de aminoácidos (y todos los residuos de aminoácidos enteros intermedios).

2.2 Antagonistas de los inductores de estrés OER

Los presentes inventores han encontrado que IL-24, IL-23 e IL-33 son potentes inductores de estrés OER de células p y que IL-1 p, MIP-2a, IL-17A, IFN-^y e IFN-p causan estrés OER más leve en una célula p. En consecuencia, se propone que los agentes que inhiben o reducen el nivel o antagonizan la función de una cualquiera o más de estas citocinas reducirán el estrés OER en una célula p. Ejemplos ilustrativos de inhibidores del estrés OER de este tipo incluyen moléculas de unión a antígeno que son inmuno-interactivas con una citocina inductora del estrés OER seleccionada del grupo que consiste en IL-24, IL-23, IL-33, IL-1 p, MIP-2a, IL-17A, IFN-^y e IFN-p, o receptores solubles que se unen a estas citocinas.

Descrito pero no parte de la invención reivindicada, el inhibidor del estrés OER es una molécula de unión a antígeno que es inmuno-interactiva con IL-24 (también conocida como diferenciación de melanoma asociado-7, o MDA-7). Las moléculas de unión a antígeno de este tipo están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), LifeSpan Biosciences (Seattle, WA) y Proteintech Group (Chicago, IL).

Descrito pero no como parte de la invención reivindicada, el inhibidor del estrés OER es un receptor soluble que se une a IL-24, cuyos ejemplos representativos se describen en la Patente de Estados Unidos U.S. Pat. No. 7,855,269. Adecuadamente, el receptor soluble comprende un dominio extracelular de IL-20RA y un dominio extracelular de IL-20RB y en ejemplos ilustrativos de este tipo, el dominio extracelular de IL-20RA comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos:

v p c v s g g l p k p a n it f l s in m k n v l q w t p p e g l q g v k v t y t v q y f iy g q k k w l n k s e c r n in r t y c d

l s a e t s d y e h q y y a k v k a iw g t k c s k w a e s g r f y p f l e t q ig p p e v a l t t d e k s is v v l t a p e k w k r

n p e d l p v s m q q iy s n l k y n v s v l n t k s n r t w s q c v t n h t l v l t w l e p n t l y c v h v e s f v p g p p r r a q

p s e k q c a r t l k d q s s e f k a k

[SEQ ID NO: 196], y en donde el dominio extracelular de IL-20RB comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos:

DEVAILPAPQNLSVLSTNMKHLLMWSPVIAPGETVYYSVEYQGEYESLYTSHIWIPSSWCSLTEGPEC

d v t d d it a t v p y n l r v r a t l g s q t s a w s il k h p f n r n s t il t r p g m e it k d g f h l v ie l e d l g p q f e f l

v a y w r r e p g a e e h v k m v r s g g ip v h l e t m e p g a a y c v k a q t f v k a ig r y s a f s q t e c v e v q g e a ip

[SEQ ID NO: 197]. En algunas realizaciones, el receptor soluble comprende (1) un dominio extracelular de IL-20RA unido a una cadena pesada de IgGY1, que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia:

v p c v s g g l p k p a n it f l s in m k n v l q w t p p e g l q g v k v t y t v q y f iy g q k k w l n k s e c r n in r t y c d

l s a e t s d y e h q y y a k v k a iw g t k c s k w a e s g r f y p f l e t q ig p p e v a l t t d e k s is v v l t a p e k w k r NPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNRTWSQCVTNHTLVLTWLEPNTLYCVHVESFVPGPPRRAQ PSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK

[SEQ ID NO : 198], y (2) un dominio extracelular de IL-20RB unido a la cadena ligera k humana, que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia:

DEVAILPAPQNLSVLSTNMKHLLMWSPVIAPGETVYYSVEYQGEYESLYTSHIWIPSSWCSLTEGPEC DVTDDITATVPYNLRVRATLGSQTSAWSILKHPFNRNSTILTRPGMEITKDGFHLVIELEDLGPQFEFL VAYWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAAYCVKAQTFVKAIGRYSAFSQTECVEVQGEATV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [SEQ ID NO: 199].

En estas realizaciones, los polipéptidos (1) y (2) se unen y se forma un enlace disulfuro entre las cadenas pesada y ligera para formar un heterodímero.

Descrito pero no como parte de la invención reivindicada, el inhibidor de estrés OER es una molécula de unión a antígeno que es inmunointeractiva con IL-23. Se conocen numerosas moléculas de unión a antígeno de este tipo, cuyos ejemplos incluyen las proteínas de unión a antígeno IL-23 antihumana descritas en la solicitud de Patente de Estados Unidos U.S. Pat. Appl. No. 2013/0004501. Ejemplos de proteínas de unión a antígeno comprenden una región variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad CDRH1, CDRH2, CDRH3 y una región variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad CDRL1, CDRL2, CDRL3 como se define en la Tabla 3 de la Patente de Estados Unidos U.S. 2013/0004501. En una realización, la proteína de unión a antígeno comprende un domino variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 200 (QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNEYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAFDIWGQGTMVTVSS), y un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 201 (QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNTGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGSGNRPSGVPDRFSGSKSG TSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLTVL). Un ejemplo no limitante de este tipo es un anticuerpo monocatenario que comprende la secuencia:

QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNTGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGSGNRPSGVPDRFSG SKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLTVLGGGGSGGGGSGGGGSQVQL VESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNEYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAFDIWGQGTMVTVSS [SEQ ID NO;

202],

Descrito pero no como parte de la invención reivindicada, el inhibidor del estrés OER es una molécula de unión a antígeno que es inmunointeractiva con IL-23R. Se conocen varias moléculas de unión a antígeno de este tipo, cuyos ejemplos ilustrativos incluyen los compuestos de unión a IL-23R antihumanos descritos en la Patente de Estados Unidos U.S. Pat. No. 8,309,085,. Compuestos representativos de este tipo comprenden: a) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende CDRL1, CDRL2 y CDRL3, en el que: CDRL1 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 203 (LASEDIYNNLA); CDRL2 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 204 (HASSLQD); y CDRL3 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 205 (LQDSEYPPT); y b) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende CDRH1, CDRH2 y CDRH3, en el que: CDRH1 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 206 (GFDFNSYGMS); CDRH2 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 207 (DINSKSYNYATYYADSVKD); y CDRH3 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 208 (HHSDYFEY). En ejemplos ilustrativos de este tipo, el compuesto de unión a IL-23R antihumano comprende a) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 209 (DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDIYNNLAWYQQKPGKAPKLLIYHASSLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCLQDSEYPPTFGQGTKVEIKR); y b) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 210 (QVQLVESGGGVVVQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMSWVRQAPGKGLEWVADINSKSYNYATYYADSVKDRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHHSDYFEYWGQGTLVTVSS). Un ejemplo no limitante de este tipo es un anticuerpo monocatenario que comprende la secuencia:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDIYNNLAWYQQKPGKAPKLLIYHASSLQDGVPSRFSGSGS

GTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDSEYPPTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGG VVQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMSWVRQAPGKGLEWVADINSKSYNYATYYADSVKDRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHHSDYFEYWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO: 211].

3. Agentes que dirigen e l inh ib idor del estrés OER a las células p

Los presentes inventores proponen que dirigir los inhibidores del estrés OER de células p directamente a las células p será útil para tratar enfermedades asociadas con estrés OER de células p aberrante, adecuadamente con efectos fuera del objetivo reducidos. En algunas realizaciones, un inhibidor del estrés OER de células p está asociado con un agente que se une a una proteína de células p (por ejemplo, una proteína de la superficie de la célula P) que se expresa más en las células p que uno o más tipos de células en el sujeto (por ejemplo, células epidérmicas, células epiteliales intestinales o hepatocitos). A continuación se describen ejemplos no limitantes de proteínas de células p de este tipo y agentes que se unen a dichas proteínas.

3.1 Receptor del péptido sim ilar al glucagón tipo 1

El receptor del péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP-1R) está codificado por el gen GLP1R , que se expresa en gran medida en las células p y se expresa en niveles muy bajos en la piel y el hígado. T ras la activación, el GLP-1 R estimula la vía de la adenilil ciclasa, lo que da como resultado una mayor síntesis y liberación de insulina.

El agonista natural de GLP-1R es el péptido GLP-1, codificado por el gen Glucagón (GCG). El preproglucagón se escinde para producir dos péptidos GLP-1 activos GLP-17-36 y GLP-16-36.

Varios análogos de GLP-1 se encuentran actualmente en uso terapéutico para el tratamiento de la diabetes tipo 2, por ejemplo, exenatida y liraglutida. Estas moléculas promueven la secreción de insulina dependiente de la glucosa, debido a los efectos favorables sobre la función de las células p, incluyendo la supresión del estrés del ER. En consecuencia, el uso de GLP-1 y sus análogos para dirigir un inhibidor del estrés OER a una célula p tiene la capacidad de proporcionar beneficios duales mediante la activación de GLP-1 R.

El GLP-1 endógeno tiene una vida media corta debido a las acciones de la proteasa dipeptidil peptidasa-IV (DPP-4). Se conocen formas de GLP-1 relativamente resistentes a la proteasa de acción prolongada, y se pueden unir o conjugar de otro modo de forma adecuada directa o indirectamente con un inhibidor del estrés OER.

Los ejemplos no limitantes de agonistas de GLP-1R que son adecuados para su uso como agentes de direccionamiento a células p incluyen péptidos o polipéptidos que comprenden, consisten o consisten esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

(a) una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRR [SEQ ID NO: 10], que corresponde a la secuencia de aminoácidos del GLP-1 nativo,

HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG [SEQ ID NO: 12], que corresponde a la secuencia de aminoácidos de GLP^{-11 -37} ,

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR [SEQ ID NO: 14], que corresponde a la secuencia de aminoácidos de GLP-1 ^7-36,

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG [SEQ ID NO: 16], que corresponde a la secuencia de aminoácidos de GLP-1 ^7-37,

MKSIYFVAAGLFVMLVQGSWQRSLQDTEEKSSRSFSASQADPLSDPDQMNEDKRHSQGTFTS DYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIAKRHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLV KGRGRRDFPEEVAIVEELGRRHADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDRK [SEQ ID NO: 18], que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la preproteína glucagón, RSLQDTEEKSSRSFSASQADPLSDPDQMNEDKRHSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLM NTKRNRNNIAKRHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELGR RHADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDRK [SEQ ID NO: 20], que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la proproteína glucagón,

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS [SEQ ID NO: 22], que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la exendina-4, o MVATKTFALLLLSLFLAVGLGEKKEGHFSALPSLPVGSHAKVSSPQPRGPRYAEGTFISDYSI AMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQREARALELASQANRKEEEAVEPQSSPAKNPSDE DLLRDLLIQELLACLLDQTNLCRLRSR [SEQ ID NO: 24], que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la preproproteína polipeptídica inhibidora gástrica,

(b) una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 % (y al menos de un 71 % a al menos un 99 % y todos los porcentajes enteros intermedios) de similitud de secuencia o identidad de secuencia con la secuencia establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24; o

(c) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada de:

cacgatgaatttgagagacatgctgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgccaaggaattcattgcttggctggtgaaaggccgag gaaggcga [SEQ ID NO: 9], que corresponde a la secuencia codificante para la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 10, o

cacgatgaatttgagagacatgctgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgccaaggaattcattgcttggctggtgaaaggccgag ga [SEQ ID NO: 11], que corresponde a la secuencia codificante para la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 12,

catgctgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgccaaggaattcattgcttggctg gtgaaaggccga [SEQ ID NO: 13], que corresponde a la secuencia codificante para la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14,

catgctgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgccaaggaattcattgcttggctg gtgaaaggccgagga [SEQ ID NO: 15], que corresponde a la secuencia codificante para la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 16,

atgaaaagcatttactttgtggctggattatttgtaatgctggtacaaggcagctggcaacgttcccttcaagacacagaggagaaatccagatcattctcagcttccca ggcagacccactcagtgatcctgatcagatgaacgaggacaagcgccattcacagggcacattcaccagtgactacagcaagtatctggactccaggcgtgccca agattttgtgcagtggttgatgaataccaagaggaacaggaataacattgccaaacgtcacgatgaatttgagagacatgctgaagggacctttaccagtgatgtaag ttcttatttggaaggccaagctgccaaggaattcattgcttggctggtgaaaggccgaggaaggcgagatttcccagaagaggtcgccattgttgaagaacttggccg cagacatgctgatggttctttctctgatgagatgaacaccattcttgataatcttgccgccagggactttataaactggttgattcagaccaaaatcactgacaggaaa [SEQ ID NO: 17], que corresponde a la secuencia codificante para la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 18,

cgttcccttcaagacacagaggagaaatccagatcattctcagcttcccaggcagacccactcagtgatcctgatcagatgaacgaggacaagcgccattcacagg gcacattcaccagtgactacagcaagtatctggactccaggcgtgcccaagattttgtgcagtggttgatgaataccaagaggaacaggaataacattgccaaacgt cacgatgaatttgagagacatgctgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgccaaggaattcattgcttggctggtgaaaggc cgaggaaggcgagatttcccagaagaggtcgccattgttgaagaacttggccgcagacatgctgatggttctttctctgatgagatgaacaccattcttgataatcttgc cgccagggactttataaactggttgattcagaccaaaatcactgacaggaaa [SEQ ID NO: 19], que corresponde a la secuencia codificante para la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 20,

catggcgaaggcacctttaccagcgatctgagcaaacagatggaagaagaagcggtgcgcctgtttattgaatggctgaaaaacggcggcccgagcagcggcg cgccgccgccgagc [SEQ ID NO: 21], que corresponde a la secuencia codificante para la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 22, o

catggcgaaggcacctttaccagcgatctgagcaaacagatggaagaagaagcggtgcgcctgtttattgaatggctgaaaaacggcggcccgagcagcggcg cgccgccgccgagc [SEQ ID NO: 23], que corresponde a la secuencia codificante para la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 24;

(d) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que comparte al menos el 70 % (y al menos del 71 % al menos al 99 % y todos los porcentajes enteros intermedios) de identidad de secuencia con la secuencia establecida en SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 o 23, o un complemento de las mismas; o

(e) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones de rigurosidad baja, media o alta con la secuencia establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 o 23, o un complemento de las mismas,

en donde la secuencia de aminoácidos de (a), (b), (c), (d) o (e) es un agonista de GLP-1R.

En realizaciones específicas, el agonista de GLP-1 se selecciona de:

(1) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH² [SEQ ID NO: 25], que es un análogo de Exendina-4 amidada (Exenatida, BYETTA);

(2) H(2-metil)-AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK(2-metil)AR-CONH2 [SEQ ID NO: 26] (Taspoglutida);

(3) HAEGTFTSDVSSYLEGQAA-K(E-ácido palmítico)-DEFIAWLVRGRG [SEQ ID NO: 27] (liraglutida, VICTOZA); o

(4) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2 [SEQ ID NO: 28] (Lixisenatida, LYXUMIA).

(5) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRHGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRMKWVTFISLLFLFSSA YSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLF GDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHP YFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFP KAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMP ADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEF KPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLS VVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELV KHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKAD DKETCFAEEGKKLVAASQAALGL [SEQ ID NO: 29], que es un dímero de GLP-1 unido a albúmina (Albiglutida, EPERZAN TANZEUM).

(6) un análogo de GLP-1 seleccionado de HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGGG [SEQ ID NO: 30], en donde X8 se selecciona de G o V; HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLKNGGG [SEQ ID NO: 31], en donde X8 se selecciona de G o V; HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGGP [SEQ ID NO: 32], en donde X8 se selecciona de G o V; HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLKNGGP [SEQ ID NO: 33], en donde X8 se selecciona de G o V;

HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGG [SEQ ID NO: 34], en donde X8 se selecciona de G o V; o HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLKNGG [SEQ ID NO: 35], en donde X8 se selecciona de G o V, en el que el análogo de GLP-1 se une con la porción Fc de una inmunoglobulina que comprende la secuencia AESKYGPPPPPCPAPX¹⁶X¹⁷X¹⁸GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFX80STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLGX²³⁰ [SEQ ID NO: 36], en donde X¹⁶ se selecciona de P o E, X¹⁷ se selecciona de F, V o A, X¹⁸ se selecciona de L, E o A, y X²³⁰ es K o está ausente.

Alternativamente, el agonista de GLP-1R puede seleccionarse de moléculas pequeñas, cuyos ejemplos ilustrativos incluyen hidroxiflavonoles tales como 4' hidroxilflavonol, 3',4' hidroxilflavonol y quercetina.

En otras realizaciones, el agente de unión a GLP-1R es una molécula de unión a antígeno agonista que es inmunointeractiva con GLP-1 R. Las moléculas de unión a antígeno representativas de este tipo incluyen el anticuerpo monoclonal 5A10, como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos US 2006/0275288, así como fragmentos de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal 5A10 y anticuerpos humanizados o quiméricos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. El anticuerpo monoclonal 5A10 comprende:

la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera:

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYQQRSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSM EAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLEIKR [SEQ ID NO: 37]; y

la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada:

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLSHIWWDDVKRYNPALK

SRLTISRDTSYSQVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO:

38].

También se contemplan anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprenden las secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR) de cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo monoclonal 5A10, en el que las secuencias de CDR de cadena ligera comprenden CDR1 de SEQ ID NO: 39 (SASSRVTYMH); CDR2 de SEQ ID NO: 40 (DTSKLAS); y CDR3 de SEQ ID NO: 41 (QQWGNNPQYT), y las secuencias de CDR de cadena pesada comprenden CDR1 de SEQ ID NO: 42 (GFSLSTSGTGVG); CDR2 de SEQ ID NO: 43 (HIWWDDVKRYNPALKS) y CDR3 de SEQ ID NO: 44 (ILDGTGPMDY). En realizaciones específicas, estos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno comprenden secuencias de la región marco (FR) del anticuerpo humano y de la región constante con uno o más residuos de aminoácidos de la región marco sustituidos de las secuencias de la región marco correspondiente del anticuerpo 5A10 original.

En ejemplos ilustrativos de este tipo, la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo Fv de cadena sencilla (scFv) que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYQQRSGTSPKRWIYDTSKL

ASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLSHIWW DDVKRYN PALKSRLTISRDTSYSQVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDYWGQGTSVTVSS

[SEQ ID NO: 45].

3.2 Receptor de sulfonilurea

El receptor de sulfonilurea es un canal de iones de potasio rectificador de entrada que es altamente expresado por las células p. El receptor del canal de K+ sensible a ATP está compuesto por dos subunidades principales: SUR1 (codificada por el gen ABCC8) y Kir6.2 (codificado por el gen KCNJ11).

Kir6.2 también se expresa en el músculo cardíaco y esquelético. En el intestino, la expresión de Kir6.2 está restringida a células enteroendocrinas, células L y células K relativamente raras. El receptor es el objetivo de una clase ampliamente utilizada de tratamientos para la diabetes tipo 2, las sulfonilureas, por ejemplo, GLIPIZIDA, GLICLAZIDA y GLIBENCLAMIDA, que impulsan la secreción de insulina de manera independiente de la glucosa.

En particular, solo es esencial que la sulfonilurea se una al receptor de sulfonilurea, ya que se usa principalmente para dirigir el inhibidor del estrés OER a la célula p. Así, no es necesario que la sulfonilurea ejerza su actividad biológica. De hecho, según la presente invención, el inhibidor del estrés OER IL-22 se administra a un sujeto a una concentración de entre 20-100 pg/kg (1,25-6 nmoles/kg). Por otro lado, las sulfonilureas se administran a una concentración de entre 10-200 mg/kg (~30-600 pmoles/kg). Por lo tanto, la sulfonilurea en el conjugado prácticamente no tendrá actividad debido a la baja concentración.

Los ejemplos no limitantes de agonistas del receptor de sulfonilurea que son adecuados para su uso con la presente invención incluyen:

a-endosulfina:

MSQKQEEENPAEETGEEKQDTQEKEGILPERAEEAKLKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRLQKG QKYFDSGDYNMAKAKMKNKQLPSAGPDKNLVTGDHIPTPQDLPQRKSSLVTSKLAGGQV [SEQ

ID NO: 46 ];

Aminogliclazida:

Carboxigliclazida:

Amino glipizida:

Carbutamida (GLUCIDORAL):

Acetohexamida (DYMELOR):

Cloropropamida (DIABINESE):

Tolbutamida (ORINASA):

Tolazamida (TOLINASA):

Glibenclamida (DIABETA, GLYNASA, MICRONASA, DAONIL, SEMI-DAONIL, EUGLUCON, DELMIDA):

Glibornurida:

Gliquidona (GLURENORM):

Glisoxepida:

Glicopiramida (DEAMELIN-S):

y

Glimepirida (K-GLIM-1; AMARYL; GLIMPID; GLIMY):

3.3 Receptor de ácidos grasos libres 1 (FFA1)

El receptor de ácidos grasos libres 1 (FFA1), también conocido como GPR40, es un receptor acoplado a proteína G de clase A que en humanos está codificado por el gen FFAR1. Se expresa fuertemente en las células del páncreas y en menor medida en el cerebro. Esta proteína de membrana se une a los ácidos grasos libres actuando como un sensor de nutrientes para regular la homeostasis energética. Los agonistas de este receptor son útiles para reducir la HbA1 c en pacientes con diabetes tipo 2. Por consiguiente, la presente invención también contempla la conjugación de agonistas de GPR40 con un inhibidor del estrés OER. Los ejemplos no limitantes de tales agonistas incluyen:

AMG-837:

TAK-875

y

LY 2881835 (Eli Lilly and Company).

3.4 Receptor 119 acoplado a proteína G (GPR119)

GPR119 se expresa predominantemente en el páncreas y el tracto gastrointestinal en roedores y humanos, así como en el cerebro de roedores. Se ha demostrado que la activación del receptor provoca la liberación de insulina en las células p, una reducción en la ingesta de alimentos y un aumento de peso corporal en ratas. También se ha demostrado que GPR119 regula la secreción de la hormona incretina e insulina. Como resultado, se han desarrollado fármacos que actúan sobre el receptor para el tratamiento de la obesidad y la diabetes. Por lo tanto, la presente invención también contempla la conjugación de agonistas de GPR119 con un inhibidor del estrés OER. Los agonistas ilustrativos de este tipo incluyen:

Los agonistas de GPR119 alternativos se describen en X.-Y. Ye etal. (2014, Bioorg. Med. Chem. Lett. 24 (2014) 2539­ 2545).

3.5 Antígeno de superficie de células B no especificado

En algunas realizaciones, el agente de direccionamiento de células p es una molécula de unión a antígeno que es inmunointeractiva con un antígeno no especificado/no caracterizado en la superficie de las células p pancreáticas, como se describe, por ejemplo, en la Patente Mundial WO 2010/096930, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria en su totalidad. Estas moléculas de unión a antígeno se unen selectivamente a las células p pancreáticas y comprenden una secuencia variable de cadena pesada seleccionada de:

EVQLLESGGG LVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM SWVRQAPG KG LEWVSSITAEGTHTWY

ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVT [SEQ ID NO: 47 ];

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSRIKIFGSKTKFA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHSTHFDYWGQGTLVT [SEQ ID NO: 48 ];

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIHPKGYPTRYA

DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTTPFDYWGQGTLVT [SEQ ID NO: 49 ];

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSRIQFFGSHTYFA

DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHSTHFDYWGQGTLVT [SEQ ID NO: 50];

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSTGDSTSY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAADSFDYWGQGTLVT [SEQ ID NO:

51],

y una región variable de cadena ligera seleccionada de:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKR [SEQ ID NO: 52];

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRASSLQSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLQSTPRTFGQGTKVEIKR [SEQ ID NO: 53];

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMGRDPRTFGQGTKVEIKR [SEQ ID NO: 54];

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRASILQSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNRRIPRTFGQGTKVEIKR [SEQ ID NO: 55];

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNGAPTTFGQGTKVEIKR [SEQ ID NO: 56].

En realizaciones específicas, las moléculas de unión a antígeno de este tipo son anticuerpos de cadena sencilla (por ejemplo, scFv) que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTH TWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQ KLISEEDLN [SEQ ID NO: 57];

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSRIKIFGSKT

KFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHSTHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLQSTPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKL ISEEDLN [SEQ ID NO: 58];

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIHPKGYP

TRYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTTPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMGRDPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQK LISEEDLN [SEQ ID NO: 59];

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSRIQFFGSH TYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHSTHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSTDIMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRASILQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNRRIPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLI SEEDLN [SEQ ID NO: 60];

o

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSTGDS TSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAADSFDYWGQGTLVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNGAPTTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQ KLISEEDLN [SEQ ID NO: 61].

También se contemplan anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprenden las secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR) de cadena ligera y cadena pesada de las regiones variables de cadena pesada y ligera enumeradas anteriormente, en las que las secuencias de CDR de cadena pesada comprenden CDR1 de SEQ ID NO: 62 ( SYAMS); una CDR2 seleccionada de SEQ ID NO: 63 (SITAEGTHTWYADSVKG), SEQ ID NO: 64 (RIKIFGSKTKFADSVKG), SEQ ID NO: 65 (SIHPKGYPTRYADSVKG), SEQ ID NO: 66 (RIQFFGSHTYFADSVKG) o SEQ ID NO: 67 (SISSTGDSTSYADSVKG); y una CDR3 seleccionada de SEQ ID NO: 68 (TSYRFDY), SEQ ID NO: 69 (HSTHFDY), SEQ ID NO: 70 (STTPFDY) o SEQ ID NO: 71 (AADSFDY), y las secuencias de CDR de cadena ligera comprenden CDR1 de SEQ ID NO: 72 (RASQSISSYLN); una CDR2 seleccionada de SEQ ID NO: 73 (KASRLQS), SEQ ID NO: 74 (RASSLQS), SEQ ID NO: 75 (AASSLQS), SEQ ID NO: 76 (RASILQS), o SEQ ID NO: 77 (GASSLQS), y una CDR3 seleccionada de SEQ ID NO: 78 (QQKWDPPRT), SEQ ID NO: 79 (QQLQSTPRT), SEQ ID NO: 80 (QQMGRDPRT), SEQ ID NO: 81 (QQNRRIPRT) o SEQ ID NO: 82 (QQTNGAPTT).

En ejemplos ilustrativos de este tipo, el anticuerpo o los fragmentos de unión a antígeno que comprenden: secuencias de CDR de cadena pesada que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 62 (SYAMS); una CDR2 de SEQ ID NO: 63 (SITAEGTHTWYADSVKG) y una CDR3 de SEQ ID NO: 68 (TSYRFDY), y secuencias de CDR de cadena ligera que comprenden una CDR1 de SeQ ID NO: 72 (RASQSISSYLN); una CDR2 de SEQ ID NO: 73 (KASRLQS) y una CDR3 de SEQ ID NO: 78 (QQKWDPPRT);

secuencias de CDR de cadena pesada que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 62 (SYAMS); una CDR2 de SEQ ID NO: 65 (SIHPKGYPTRYADSVKG) y una CDR3 de SEQ ID NO: 69 (HSTHFDY), y secuencias de CDR de cadena ligera que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 72 (RASQSISSYLN); una CDR2 de SEQ ID NO: 74 (RASSLQS) y una CDR3 de SEQ ID NO: 79 (QQLQSTPRT);

secuencias de CDR de cadena pesada que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 62 (SYAMS); una CDR2 de SEQ ID NO: 64 (RIKIFGSKTKFADSVKG) y una CDR3 de SEQ ID NO: 70 (STTPFDY), y secuencias de CDR de cadena ligera que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 72 (RASQSISSYLN); una CDR2 de SEQ ID NO: 75 (AASSLQS) y una CDR3 de SEQ ID NO: 80 (QQMGRDPRT);

secuencias de CDR de cadena pesada que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 62 (SYAMS); una CDR2 de SEQ ID NO: 66 (RIQFFGSHTYFADSVKG) y una CDR3 de SEQ ID NO: 69 (HSTHFDY), y secuencias de CDR de cadena ligera que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 72 (RASQSISSYLN); una CDR2 de SEQ ID NO: 76 (RASILQS) y una CDR3 de SEQ ID NO: 81 (QQNRRIPRT); o

secuencias de CDR de cadena pesada que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 62 (SYAMS); una CDR2 de SEQ ID NO: 67 (SISSTGDSTSYADSVKG) y una CDR3 de SEQ ID NO: 71 (AADSFDY) y secuencias de CDR de cadena ligera que comprenden una CDR1 de S^eQ ID NO: 72 (RASQSISSYLN); una CDR2 de SEQ ID NO: 77 (GASSLQS) y una CDR3 de SEQ ID NO: 82 (QQTNGAPTT).

En realizaciones específicas, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno anteriores comprenden secuencias de la región marco (FR) y constante del anticuerpo humano con uno o más residuos de aminoácidos de la región marco sustituidos de las secuencias de la región marco correspondiente de los anticuerpos scFv originales SCA B1, SCA B2, SCA B3, SCA B4 o SCA B5, como se enseña en la Patente Mundial WO 2010/096930.

Los anticuerpos alternativos específicos de células p y los métodos para su preparación se describen, por ejemplo, en Sung et al. (Mol Cancer Ther. 2009 Aug;8(8):2276-85), Feng et al. (MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):565-70), Chen et al. (Cell Research (2009) 19: 984-995).

4. Conjugación/fusión

La presente invención contempla cualquier método adecuado para conjugar o unir agentes de unión de células p a inhibidores del estrés OER, cuyos ejemplos no limitantes incluyen:

(i) El uso de una carbodiimida u otro agente de acoplamiento adecuado para formar un enlace amida entre un grupo amino libre de un agente de unión a células p y el grupo carboxilo libre de una proteína inhibidora del estrés OER o un péptido enlazador fusionado o unido de otro modo a la proteína inhibidora del estrés OER;

(ii) El uso de una carbodiimida u otro agente de acoplamiento adecuado para formar un enlace amida entre un grupo amino libre de una proteína inhibidora del estrés OER y el grupo carboxilo libre de un agente de unión a células p o un péptido enlazador fusionado o unido de otro modo al agente de unión a células p;

(iii) El uso de MBS (éster de N-hidroxisuccinimida del ácido m-maleimidonemzoico) para unir a través del grupo tiol de una cisteína añadida al extremo C-terminal de una proteína inhibidora del estrés OER o al extremo C-terminal de un péptido enlazador unido o fusionado de otro modo con una proteína inhibidora del estrés OER, al grupo amino libre en el extremo N-terminal de la proteína de unión a células p;

(iv) El uso de MBS (éster de N-hidroxisuccinimida del ácido m-maleimidonemzoico) para unir a través del grupo tiol de una cisteína añadida al extremo C-terminal de un agente de unión a células p (adecuadamente una proteína de unión a células p) o al extremo C-terminal de un péptido enlazador unido o fusionado de otro modo a un agente de unión a células p ( adecuadamente, una proteína de unión a células p), al grupo amino libre en el extremo N-terminal de una proteína inhibidora del estrés OER;

(v) El uso de glutaraldehído para conjugar un grupo amino libre en una proteína inhibidora del estrés OER o en una proteína enlazadora fusionada o unida de otro modo a una proteína inhibidora del estrés OER y un grupo amino libre en un agente de unión a células p (adecuadamente un proteína de unión a células p) o en una proteína enlazadora fusionada o unida de otro modo a un agente de unión a células p (adecuadamente una proteína de unión a células p);

(vi) El uso de SO²Cl o triazoles para acoplar una amina de una proteína inhibidora del estrés OER a un resto que contiene aldehído de un agente de unión a células p (adecuadamente una proteína de unión a células p); o

(vii) El uso de SO²Cl o triazoles para acoplar una amina de un agente de unión a células p (adecuadamente una proteína de unión a células p) a un resto que contiene aldehído de una proteína inhibidora del estrés OER.

En ejemplos ilustrativos de conjugación de compuestos de sulfonilurea con grupos amino o carboxi a una proteína inhibidora del estrés OER, estos compuestos se pueden conjugar al extremo C- o N-terminal de la proteína, con o sin péptidos enlazadores que se extienden desde esos extremos, mediante fusión recombinante o por conjugación covalente péptido-péptido. Por ejemplo, dichos conjugados se pueden hacer a través de: (a) el uso de una carbodiimida para formar un enlace amida entre un grupo amino libre en las aminosulfonilureas y el grupo carboxilo libre en el extremo C-terminal del inhibidor del estrés Oe r o el péptido espaciador ; o (b) el uso de una carbodiimida para formar un enlace amida entre un grupo carboxilo libre en las carboxisulfonilureas y el grupo amino libre en el extremo N-terminal del inhibidor del estrés OER o el péptido espaciador. Los péptidos enlazadores podrían prepararse con varios residuos reactivos espaciados a través de los cuales conjugar múltiples compuestos de sulfonilurea.

En realizaciones específicas, los conjugados/fusiones de una proteína de unión a células p y una proteína inhibidora del estrés OER, con o sin enlazadores intervinientes, se pueden hacer mediante síntesis de péptidos o mediante expresión recombinante usando cualquier sistema de expresión procariota o eucariota adecuado (que incluye, pero no se limita, a células bacterianas, de levadura, de insecto y de mamífero), como se conoce en la técnica.

5. Constructos quiméricos

Un aspecto de la presente invención se refiere a constructos quiméricos que comprenden un polipéptido inhibidor del estrés OER que está fusionado o conjugado de otro modo, ya sea directamente o a través de un enlazador, a un agente de direccionamiento de células p proteínico. En realizaciones específicas, el inhibidor del estrés OER es un polipéptido de IL-22 y el agente de direccionamiento es un agonista proteínico de GLP-1R. Los constructos ilustrativos pueden comprender pequeños péptidos de GLP-1 y análogos de péptidos, cuyos ejemplos representativos incluyen: (a)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGRRrGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSIrAPISSHCRLDKSNFOOPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLM KQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESG EIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 83];

(b)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGRRrGGGSGGGSInAPJSSH CRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQ SDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLR NACI [SEQ ID NO: 84];

(c)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGRRrGGGGlnAPJSSF/CP/.P/C SNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRF QPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

[SEQ ID NO: 85];

(d)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGRRrGGGGGInAPISSHCP/- DKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSD RFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNA CI [SEQ ID NO: 86];

(e)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGRRrGGGKGGGGlnAPJSSH CRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQ SDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLR NACI [SEQ ID NO: 87 ];

(f)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYI_EGOAAKEFIAWI_VKGRGRRrGGGNGSGG1rv4PISSHC RLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ VLNFTLEEVLFPQS DRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRN ACI [SEQ ID NO: 88];

(g)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGRRrGGGCGGGGInAPISSH CRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQ SDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLR NACI [SEQ ID NO: 89 ];

(h)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGRRrGPNGGlnAPJSSHCP¿.P KSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSER CYLMKQ VLNFTLEEVLFPQSDRF QPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

[SEQ ID NO: 90];

y

(i)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRAP/SSP/CP/.D/CS/VFQQPY

ITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEV VPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 91 ],

en donde:

HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRR = GLP-1 nativo;

El texto subrayado es un enlazador flexible;

Texto en cursiva es polipéptido maduro de IL-22;

M es una metionina artificial para la expresión recombinante;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y

X es una etiqueta opcional (por ejemplo, FLAG^s, His6) para la purificación, o

(j)

WÁAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCY

LMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEIKAIGELDLLFMSLRNACI\GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS'\nHDEFERHAEGTFTSD\/SSYLEG QAAKEFIAWLVKGRGRR [SEQ ID NO: 92 ];

(k)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCY

LMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE

5GEf/(ArGE/-P/-/-FM5/-F/VAQTGGGSGGGS1nHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEG0AAKEFIAWLVKG RGRR [SEQ ID NO: 93 ];

(l)

MXAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCY

LMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEi/C4iGE/-P/-/-FMS/-ft/V>4arGG GGlnHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGRR [SEQ ID NO: 94 ];

(m)

MXAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE

5GE7/(A7GE/-P/-/-EM5/-/?/VAC7rGGGGGlnHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGR R [SEQ ID NO: 95 ];

(n)

MXAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCY

LMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE

5GE7/(A7GE/-P/-/-EM5/-/?/VAC7rGGGKGGGGlnHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKG RGRR [SEQ ID NO: 96 ];

(o)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCY

LMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGE7/CA7GE/.P/./.EMS/.f?/VAC7rGGGNGSGGlnHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKG RGRR [SEQ ID NO: 97 ];

(P)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCY

LMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGE7/CA7GE/.P/./.EMS/.E/VAC7rGGGCGGGGlnHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKG RGRR [SEQ ID NO: 98 ];

(q)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCY

LMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEJ/CAJGELPLLEMS/./RA/ACJrGPNGGInHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGR R [SEQ ID NO: 99 ];

y

(r)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCY

LMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEi/CAIGEZ.DZ.Z.EMS/.R/VACíHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRR [SEQ ID NO: 100],

en donde:

HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRR = GLP-1 nativo;

El texto subrayado es un enlazador flexible:

El texto en cursiva es un polipéptido maduro de IL-22;

M es una metionina artificial para la expresión recombinante;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y

X es una etiqueta opcional (por ejemplo, FLAG^s, His6) para la purificación, o

(s)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGrGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSJnAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ VLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIK AIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 101];

(t)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGrGGGGSGGGSlnAPISSHC RLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQS DRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRN AC I [SEQ ID NO: 102];

(u)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGrGGGGlnAPJSSHCR/.P/CS/V FQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ VLNFTLEEVLFPQSDRFQPY MQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

[SEQ ID NO: 103];

(v)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGrGGGGGGlrv4PJSS/-/CP¿.P KSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSER CYLMKQ VLNFTLEEVLFPQSDRF QPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

[SEQ ID NO: 104];

(w)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGrGGGGKGGGGInAPISSHC RLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQS DRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRN AC I [SEQ ID NO: 105];

(x)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGrGGGNGSGGlnAPJSSHCP LDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ VLNFTLEEVLFPQSD RFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNA CI [SEQ ID NO: 106];

(y)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGrGGGGCGGGGlnAPfSSHC RLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQS DRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRN ACI [SEQ ID NO: 107];

(z)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRGrGPNGGlrvAPJSSHCR/.P/CS NFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQP YMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

[SEQ ID NO: 108];

y

(aa)

MXHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAPISSHCRLDKSNFQQPYI

TNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVV PFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNAC [SEQ ID NO: 109],

en donde:

HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG = G LP-I^1-37;

El texto subrayado es un enlazador flexible;

El texto en cursiva es un polipéptido maduro de IL-22;

M es una metionina artificial para la expresión recombinante;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y

X es una etiqueta opcional (por ejemplo, FLAG^s, His6) para la purificación, o

(ab)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE

5GEf/(ArGE/-P/-/-FM5/-R/VAQTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS1nHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEG QAAKEFIAWLVKGRG [SEQ ID NO: 110];

(ac)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGE7/CA7GE/.P/./.FMS/.P/VAC7rGGGSGGGSlnHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKG RG [SEQ ID NO: 111];

(ad)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEr/CAJGE/.P/./.FAfS/.F/VACJrGGGGlnHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRG [SEQ ID NO: 112];

(ae)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGE7/CA7GE/.P/./.FMS/.F/VAC7rGGGGGlnHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRG [SEQ ID NO: 113];

(a f)

MXAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE

5GEi/(AZ'GE/-D/-/-/rM5/-£/\MCiTGGGKGGGGlnHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEG0AAKEFIAWLVKG RG [SEQ ID NO: 114];

(ag)

MXAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGE7/CA7GE/.D/./.FMS/.R/VAC7rGGGNGSGGlnHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKG RG [SEQ ID NO: 115];

(ah)

MXAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGE7/CA7GE/.D/./.EMS/.R/VAC7rGGGCGGGG1nHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKG RG [SEQ ID NO: 116];

(ai)

MXAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEi/C4iGE¿-P¿-¿-EMS¿-£/\MCirGPNGGlnHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRG [SEQ ID NO: 117];

y

(aj)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGE//CA/GEZ.DZ.Z.EMSZ.R/VAC/HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG [SEQ ID NO: 118],

en donde:

HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG = G LP-I^1-37;

El texto subrayado es un enlazador flexible:

El texto en cursiva es un polipéptido maduro de IL-22;

M es una metionina artificial para la expresión recombinante;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y

X es una etiqueta opcional (por ejemplo, FLAGs, His6) para la purificación, o

(ak)

MXHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRrGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSlnA PISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEE VLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLL FMSLRNACI [SEQ ID NO: 119];

(a l)

MXHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRrGGGSGGGS1rv4PISSHCft¿-P/CS/VFO QPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYM QEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 120];

(am)

MXHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRrGGGGGlnAPJSSHCP/.P/CS/VFOOP YITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEV VPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 121];

(an)

MXHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRrGGGGGlnAPJSSHCP/.P/CS/VFOOPY 777VP TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ VLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEV VPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 122];

(ao)

MXHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRrGGGGKGGGGlnAPJSSHCP/.P/CS/V FQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ VLNFTLEEVLFPQSDRFQPY MQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

[SEQ ID NO: 123];

(ap)

MXHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRrGGGNGSGGlnAPJSSHCP¿.P/CS/VF QQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ VLNFTLEEVLFPQSDRFQPY MQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

[SEQ ID NO: 124];

(aq)

MXHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRIGGGCGGGGLAP7SSHCP/.D/CS/VF

QQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ VLNFTLEEVLFPQSDRFQPY MQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

[SEQ ID NO: 125];

(ar)

MXHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGRrGPNGGlnAPJSSHCP/.P/CS/VFOOPYr 77VF TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ VLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEW PFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 126];

y

(as)

MXHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRAPISSHCP/.D/CS/VFQQPYITTVPTFM.

AKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLS NRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 127], en donde:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR = GLP-ly-se;

El texto subrayado es un enlazador flexible;

El texto en cursiva es un polipéptido maduro de IL-22;

M es una metionina artificial para la expresión recombinante;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y

X es una etiqueta opcional (por ejemplo, FLAG^s, His6) para la purificación, o

(at)

MXHAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSER

CYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKL GESGEf/C4iGE/-P/-/-FMS/-ft/\MarGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS1nHAEGTFTSDVSSYLEGOAA KEFIAWLVKGR [SEQ ID NO: 128];

(au)

MXAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE

5GE7/CArGE/-P/-/-EM5/-/?/VACiTGGGSGGGS1nHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGR. [SEQ ID NO: 129];

(av)

MXAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE

5GE7/(A7GE/-P/-/-EM5/-/?/VAC7rGGGGlnHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGR [SEQ ID NO: 130];

(aw)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEI/C4iGE¿-P¿-¿-EMS¿-£/\MCirGGGGGlnHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGR [SEQ ID NO: 131];

(ax)

MXAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE

5GE7/(A7GE/-P/-/-EM5/-/?/VAC7rGGGKGGGGlnHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGR [SEQ ID NO: 132];

(ay)

MXAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE

5GE7/(A7GE/-P/-/-EM5/-/?/VAC7rGGGNGSGGlnHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGR [SEQ ID NO: 133];

(az)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEIK>UGE¿P¿¿FMS¿ft/VdCirGGGCGGGG1nHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGR [SEQ

ID NO: 134];

(aaa)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSER

CYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKL GESGEJ/C4JGfiLP¿¿FMS¿/?/V/tCJrGPNGGlnHAEGTFTSDVSSYLEGOAAKEFIAWLVKGR [SEQ ID

NO: 135];

y

(aab)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSER

CYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKL GESGEZK/4/GEZ-DZ.Z.FMSZ-F/V/4C/HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR [SEQ ID NO:

136],

en donde:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR = GLP-I^7-36;

El texto subrayado es un enlazador flexible:

El texto en cursiva es un polipéptido maduro de IL-22;

M es una metionina artificial para la expresión recombinante;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y

X es una etiqueta opcional (por ejemplo, FLAGs, His6) para la purificación.

En otras realizaciones, los constructos quiméricos comprenden análogos peptídicos de GLP-1 alternativos sustituidos por los análogos peptídicos definidos anteriormente, cuyos ejemplos ilustrativos incluyen:

(1) HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG [SEQ ID NO: 16], que corresponde a la secuencia de aminoácidos de GLP-1 ⁷-³⁷ ,

(2) MKSIYFVAAGLFVMLVQGSWQRSLQDTEEKSSRSFSASQADPLSDPDQMNEDKRHSQGT FTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIAKRHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWL VKGRGRRDFPEEVAIVEELGRRHADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDRK [SEQ ID NO: 18], que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la preproteína glucagón,

(3) RSLQDTEEKSSRSFSASQADPLSDPDQMNEDKRHSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQW LMNTKRNRNNIAKRHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELGR RHADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDRK [SEQ ID NO: 20], que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la proproteína glucagón,

(4) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS [SEQ ID NO: 22], que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la exendina-4,

(5) MVATKTFALLLLSLFLAVGLGEKKEGHFSALPSLPVGSHAKVSSPQPRGPRYAEGTFISD YSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQREARALELASQANRKEEEAVEPQSSPAKNPSD EDLLRDLLIQELLACLLDQTNLCRLRSR [SEQ ID NO: 24], que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la preproproteína del polipéptido inhibidor gástrico, y

(6) un análogo de GLP-1 seleccionado de HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGGG [SEQ ID NO: 30], en donde X8 se selecciona de G o V; HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLKNGGG [SEQ ID NO: 31], en donde X8 se selecciona de G o V; HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGGP [SEQ ID NO: 32], en donde X8 se selecciona de G o V; HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLKNGGP [SEQ ID NO: 33], en donde X8 se selecciona de G o V; HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGG [SEQ ID NO: 34], en donde X8 se selecciona de G o V; o HXbEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLKNGG [SEQ ID NO: 35], en donde Xa se selecciona de G o V, en el que el análogo de GLP-1 se fusiona con la porción Fc de una inmunoglobulina que comprende la secuencia AESKYGPPPPPCPAPXi6Xi7XibGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFXboSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLT c l v k g f y p s d ia v e w e s n g q p e n n y k t t p p v l d s d g s f f l y s r l t v d k s r w q e g n v f s c s v m h e a l h n h y t q k s l s LSLGX23o [SEQ ID NO: 36], en donde Xi6 se selecciona de P o E, X¹⁷ se selecciona de F, V o A, X ib se selecciona de L, E o A, y X²³⁰ es K o está ausente.

En otras realizaciones, el agente de direccionamiento de GLP-1 R del constructo quimérico es una molécula de unión a antígeno y los constructos no limitantes de este tipo incluyen:

(i)

MXQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYQQRSGTSPKRWIYDTSKLASG

VPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLSHIWWDDV KRYNPALKSRLTISRDTSYSOVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDYWGOGTSVTVSSrGGGG SGGGGSGGGGSGGGGS~\J\PISSHCRLDKSNFOOPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFH GVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKL KDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 137];

(ii)

MXQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYQQRSGTSPKRWIYDTSKLAS

GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLSHIWWDD VKRYNPALKSRLTISRDTSYSOVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDYWGOGTSVTVSSrGGG SGGGSJnAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMK QVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEI KAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 138];

(iii)

MXQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYQQRSGTSPKRWIYDTSKLAS

GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLSHIWWDD VKRYNPALKSRLTISRDTSYSOVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDYWGOGTSVTVSSrGGG GlnAPISSHCRLDKSNFOQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNF TLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGE LDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 139];

(iv)

MXQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYQQRSGTSPKRWIYDTSKLAS

GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLSHIWWDD VKRYNPALKSRLTISRDTSYSOVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDYWGOGTSVTVSSrGGG

GG1 rAPISSHCRLDKSNFOOPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ VLN FTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIG ELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 140];

(v)

MXQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYQQRSGTSPKRWIYDTSKLAS

GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLSHIWWDD VKRYNPALKSRLTISRDTSYSOVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDYWGQGTSVTVSSrGGG GKGGGGJnAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLM KQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESG EIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 141];

(vi)

MXQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYQQRSGTSPKRWIYDTSKLAS

GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLSHIWWDD VKRYNPALKSRLTISRDTSYSOVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDYWGOGTSVTVSSrGGG N G SGG1 nAPISSHCRLDKSNFOOPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCYLMK QVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEI KAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 142];

(vii)

MXQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYQQRSGTSPKRWIYDTSKLAS

GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLSHIWWDD VKRYNPALKSRLTISRDTSYSOVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDYWGOGTSVTVSSrGGG CGGGG1 rAPISSHCRLDKSNFOOPYITNRTFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCYLMK QVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEI KAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 143];

(viii)

MXQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYQQRSGTSPKRWIYDTSKLA

SGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLSHIWWD DVKRYNPALKSRLTISRDTSYSOVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDYWGOGTSVTVSSrGP N GG1 nAPISSHCRLDKSNFOOPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHG VSMSERCYLMKO VL NFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAI GELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 144];

y

(ix)

MXQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYQQRSGTSPKRWIYDTSKLAS

GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLSHIWWDD VKRYNPALKSRLTISRDTSYSQVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDYWGQGTSVTVSSAPJSS HCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFP QSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSL RNACI [SEQ ID NO: 145],

en donde:

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYQQRSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARF SGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLSHIWWDDVKRYNP ALKSRLTISRDTSYSQVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO: 45] = scFv del agonista de GLP-1R;

El texto subrayado es un enlazador flexible;

El texto en cursiva es un polipéptido maduro de IL-22;

M es una metionina artificial para la expresión recombinante;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y

X es una etiqueta opcional (por ejemplo, FLAG^s, His6) para la purificación, o

(x)

MXHAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEIKAIGELDLLFMSLRNA CJTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSlnOIVLTOSPAIM S AS PGEKVTMT CSASSRVTYMHWYQQRSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQ QWGNNPQYTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFS GFSLSTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLSHIWWDDVKRYNPALKSRLTISRDTSYSQVFLRIASVDTAD TATYYCARILDGTGPMDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO: 146];

(xi)

MXAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE

5GEi/ÍAiGELPLLFM5L/?/VAarGGGSGGGSln0IVLT0SPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWY QQRSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGG GTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVG WIRQPSGKGLEWLSHIWWDDVKRYNPALKSRLTISRDTSYSQVFLRIASVDTADTATYYCARILDGT GPMDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO: 147];

(xii)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE S GEIKAIGELDLLFMSLRNA C7£GGGGJnQI V LTQSPAIMSASPGE K VTM TC S AS S RVTYM H WY QQ RS GTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLE IKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQP SGKGLEWLSHIWWDDVKRYNPALKSRLTISRDTSYSQVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDY WGQGTSVTVSS [SEQ ID NO: 148];

(xiii)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIECDDLHIQRNVQKLKDTVKKLCE SGEi/CAiGE¿-P¿-¿-EMS¿-/?/VACirGGGGGlnOIVLTOSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYOO RSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTR LEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIR QPSGKGLEWLSHIWWDDVKRYNPALKSRLTISRDTSYSQVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPM DYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO: 149];

(xiv)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSER

CYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKL GE5GE7/CA7GEZ-P/-/-EM5/-R/VACiTGGGKGGGGlnOIVLTOSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMH WYQQRSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTF GGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTG VGWIRQPSGKGLEWLSHIWWDDVKRYNPALKSRLTISRDTSYSQVFLRIASVDTADTATYYCARILD GTGPMDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO: 150];

(xv)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEIKAIGELDLLFMSLRNA CiTGGGNGSGGlnQIVLTQS PAIM S AS PG E KVTMTC SASSRVTYM H WY QQRSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGG GTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVG WIRQPSGKGLEWLSHIWWDDVKRYNPALKSRLTISRDTSYSQVFLRIASVDTADTATYYCARILDGT GPMDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO: 151];

(xvii)

MXAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSER

CYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKL GESGE7’/047GE/.P/./.EA7S/-R/VAC/rGGGCGGGGlnOIVLTOSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMH WYQQRSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTF GGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTG VGWIRQPSGKGLEWLSHIWWDDVKRYNPALKSRLTISRDTSYSQVFLRIASVDTADTATYYCARILD GTGPM DYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO: 152];

(xviii)

^XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSER

CYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKL GESGEJ/CAJGE¿.P¿.¿.EMS¿. /^VACJrGPNGGlnOIVLTOSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYO QRSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGT RLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWI RQPSGKGLEWLSHIWWDDVKRYNPALKSRLTISRDTSYSQVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGP MDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO: 153];

y

(xix)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSER

CYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKL GESGEi/C4iGEZ.DZ±mSZ.K/U4CTQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYQQRSGTSP KRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLEIKRG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQPSGKG LEWLSHIWWDDVKRYNPALKSRLTISRDTSYSQVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDYWGQ GTSVTVSS [SEQ ID NO: 154],

en donde:

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYQQRSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARF SGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLSHIWWDDVKRYNP ALKSRLTISRDTSYSQVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO: 45] = scFv del agonista de GLP-1R,

El texto subrayado es un enlazador flexible;

El texto en cursiva es un polipéptido maduro de IL-22;

M es una metionina artificial para la expresión recombinante;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y

X es una etiqueta opcional (por ejemplo, FLAGs, His6) para la purificación.

En otras realizaciones, el inhibidor del estrés OER es un polipéptido de IL-22 y el agente de direccionamiento es una molécula de unión a antígeno que es inmunointeractiva con una proteína de unión de la superficie de células p como se enseña, por ejemplo, en en la Patente mundial WO 2010/096930. Los ejemplos no limitantes de constructos de este tipo incluyen:

(i)

MAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAE

GTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASR LQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGA AEOKLlSEEDLN\GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS}rA PISSHCRLDKSNFOOPYITNRTFMLAKEASL ADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTC HIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 155];

(ii)

MAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITA

EGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEQKLI SEEDLNl GGGSGGGS~\nAPISSHCRLDKSNFOOPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGE KLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRN VQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 156];

(iii)

MAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITA

EGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKllSEEDm G G G G ]nAPISSHCRLDKSNFOOPYITNR TFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFH GVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKL KDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 157];

(iv)

MAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITA

EGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKllSEEDmGGGGG]nAPISSHCRLDKSNFOOPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLF HGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQK LKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 158];

(v)

MAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITA

EGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLlSEEDLWGGGGKGGGG]nAPISSHCRLDKSNFOOPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIG EKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQR NVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 159];

(vi)

MAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITA

EGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLlSEEDmGGGNGSGG]nAPISSHCRLDKSNFOOPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGE KLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRN VQKLKD TVKKL GES GEIKAI GELDLLFMSLRNA CI [SEQ ID NO: 160];

(vii)

MAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLlSEEDLWGGGCGGGG]nAPISSHCRLDKSNFOOPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGE KLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRN VQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 161];

(viii)

MAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLISEEDLNl GPNGG~\nAPISSHCRLDKSNFOOPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFH GVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKL KDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 162];

y

(ix)

MAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITA

EGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEQKLISEEDLNAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLA DNNTD VRLIGEKLFHGVSMSER CYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKL GESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI [SEQ ID NO: 163],

en donde:

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDP PRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 57] = scFv específico de células P;

El texto subrayado es un enlazador flexible;

El texto en cursiva es un polipéptido maduro de IL-22;

M es una metionina artificial para la expresión recombinante; y

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, o

(x)

MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYL

MKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGES GEIKAIGELDLLFMSLRNACnGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS~\nA\AAE\/OLLESGGG\-\/OPGGSLR LSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 164];

(xi)

MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYL

MKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGES GEIKflIGELPLLFMSí-flyVflCirGGGSGGGSInAMAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYA MSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK TSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISS YLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTF GQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 165];

(xii)

MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCY

LMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEi/C4iGE/-P/-/-FMS/-£/\MarGGGGlnAMAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMS WVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSY RFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLN WYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQ GTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 166];

(xiii)

MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCY

LMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEi/C4iGE/-P/-/-EMS/-£/VACirGGGGGlnAMAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMS WVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSY RFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLN WYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQ GTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 167];

(xiv)

MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCY

LMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE

5GE17(ArGE¿-D¿-¿-FAf5¿-R/VAClTGGGKGGGG1nAMAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSY AMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA KTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIS SYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRT FGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 168];

(xv)

MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCY

LMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEi/CAIGE¿-P¿-¿-EMS¿-£/\MCirGGGNGSGGlnAMAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSY AMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA KTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIS SYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRT FGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 169];

(xvii)

MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE

5GE7/CArGE/-D/-/-FM5/-F/VAQTGGGCGGGGlnAMAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSY AMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA KTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIS SYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRT FGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 170];

(x v iii)

MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE

5GEi/(AZ'GE/-D/-/-/rft/5/-£/\MCiTGPNGGlnAMAEV0LLESGGGLV0PGGSLRLSCAASGFTFSSYAMS WVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSY RFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLN WYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQ GTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 171];

y

(xix)

MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCY

LMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGE7/CAÍGEZ.DZ.Z.EMSZ.K/VAC7QIAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQA PGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYW GQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQ KPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEI KRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 172],

en donde:

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDP PRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQ KLISEEDLN [SEQ ID NO: 57] = scFv específico de células p,

El texto subrayado es un enlazador flexible;

El texto en cursiva es un polipéptido maduro de IL-22;

M es una metionina artificial para la expresión recombinante; y

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;

En otras realizaciones, los constructos quiméricos comprenden scFv específico de células p alternativo sustituido por el scFv definido anteriormente, cuyos ejemplos ilustrativos incluyen:

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSRIKIFGSKT

KFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHSTHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLQSTPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKL ISEEDLN [SEQ ID NO: 58];

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIHPKGYP

TRYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTTPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMGRDPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQK LISEEDLN [SEQ ID NO: 59];

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSRIQFFGSH TYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHSTHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSTDIMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRASILQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNRRIPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLI SEEDLN [SEQ ID NO: 60];

y

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSTGDS TSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAADSFDYWGQGTLVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNGAPTTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQ KLISEEDLN [SEQ ID NO: 61].

En otras realizaciones, el inhibidor del estrés OER es un polipéptido de IL-22 y el agente de direccionamiento es un agonista proteico de SUR1 tal como a-endosulfina. Los constructos ilustrativos de este tipo incluyen:

(1)

MSQKQEEENPAEETGEEKQDTQEKEGILPERAEEAKLKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRL

OKGOKYFDSGDYNMAKAKMKNKOLPSAGPDKNLVTGDHIPTPODLPORKSSLVTSKLAGGOVrGG GGSGGGGSGGGGSGGGGS~\nAPISSHCRLDKSNFOOPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKL FHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQ KLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIX [SEQ ID NO: 173];

(2)

MSQKQEEENPAEETGEEKQDTQEKEGILPERAEEAKLKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRL

OKGOKYFDSGDYNMAKAKMKNKOLPSAGPDKNLVTGDHIPTPODLPORKSSLVTSKLAGGOVrGG GSGGGS~\nAPISSHCRLDKSNFOOPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLM KQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESG EIKAIGELDLLFMSLRNACIX [SEQ ID NO: 174];

(3)

MSQKQEEENPAEETGEEKQDTQEKEGILPERAEEAKLKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRL

QKGQKYFDSGDYNMAKAKMKNKQLPSAGPDKNLVTGDHIPTPQDLPQRKSSLVTSKLAGGQVfGG

GG1 nAPISSHCRLDKSNFOOPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ VLN FTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIG ELDLLFMSLRNACIX [SEQ ID NO: 175];

(4)

MSQKQEEENPAEETGEEKQDTQEKEGILPERAEEAKLKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRL

OKGOKYFDSGDYNMAKAKMKNKOLPSAGPDKNLVTGDHIPTPODLPORKSSLVTSKLAGGOVrGG

GGG1 nAPISSHCRLDKSNFOOPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ VL NFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAI GELDLLFMSLRNACIX [SEQ ID NO: 176];

(5)

MSQKQEEENPAEETGEEKQDTQEKEGILPERAEEAKLKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRL

OKGOKYFDSGDYNMAKAKMKNKOLPSAGPDKNLVTGDHIPTPODLPORKSSLVTSKLAGGOVrGG GKGGGGJnAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLM KQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESG EIKAIGELDLLFMSLRNACIX [SEQ ID NO: 177];

(6)

MSQKQEEENPAEETGEEKQDTQEKEGILPERAEEAKLKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRL

OKGOKYFDSGDYNMAKAKMKNKOLPSAGPDKNLVTGDHIPTPODLPORKSSLVTSKLAGGOVrGG GNGSGG1 nAPISSHCRLDKSNFOOPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCYLM KQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESG EIKAIGELDLLFMSLRNACIX [SEQ ID NO: 178];

(7)

MSQKQEEENPAEETGEEKQDTQEKEGILPERAEEAKLKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRL

OKGOKYFDSGDYNMAKAKMKNKOLPSAGPDKNLVTGDHIPTPODLPORKSSLVTSKLAGGOVrGG GCGGGGL APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLM KQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESG EIKAI GELDLLFMSLRNA C IX [SEQ ID NO: 179];

(8)

MSQKQEEENPAEETGEEKQDTQEKEGILPERAEEAKLKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRL

OKGOKYFDSGDYNMAKAKMKNKOLPSAGPDKNLVTGDHIPTPODLPORKSSLVTSKLAGGOVrGP

N GG1 nAPISSHCRLDKSNFOOPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHG VSMSERCYLMKO VL NFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAI GELDLLFMSLRNA C IX [SEQ ID NO: 180];

y

(9)

MSQKQEEENPAEETGEEKQDTQEKEGILPERAEEAKLKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRL

QKGQKYFDSGDYNMAKAKMKNKQLPSAGPDKNLVTGDHIPTPQDLPQRKSSLVTSKLAGGQVAPIS SHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLF PQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRN VQKLKD TVKKL GES GEIKAIGELDLLFMS LRNACIX [SEQ ID NO: 181],

en donde:

MSQKQEEENPAEETGEEKQDTQEKEGILPERAEEAKLKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRLQKGQKYFDSGDYNMAKA KMKNKQLPSAGPDKNLVTGDHIPTPQDLPQRKSSLVTSKLAGGQV [SEQ ID NO: 46] = a-endosulfina;

El texto subrayado es un enlazador flexible;

El texto en cursiva es un polipéptido maduro de IL-22;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y

X es una etiqueta opcional (p. ej., FLAGS, His6) para la purificación, o

(10)

M XHAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSER

CYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKL GESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI\GGGGSGGGGSGGGGSGGGG~\nSOKOEEENPAEETGEEKODT QEKEGILPERAEEAKLKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRLQKGQKYFDSGDYNMAKAKMKNKQLPSAGP DKNLVTGDHIPTPQDLPQRKSSLVTSKLAGGQV [SEQ ID NO: 182];

(11)

MXAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEIKAIGELDLLFMSLRNACI\GG GSGG GS^SOKOEEENPAEETGEEKODTOEKEGllPERAEEAK LKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRLQKGQKYFDSGDYNMAKAKMKNKQLPSAGPDKNLVTGDHIPTPQ DLPQRKSSLVTSKLAGGQV [SEQ ID NO: 183];

(12)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEIKAIGELDLLFMSLRNACI\GGGG~\nSOKOEEENPAEETGEEKODTOEKEGILPERAEEAKLKAKY PSLGQKPGGSDFLMKRLQKGQKYFDSGDYNMAKAKMKNKQLPSAGPDKNLVTGDHIPTPQDLPQR KSSLVTSKLAGGQV [SEQ ID NO: 184];

(13)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEIKAIGELDLLFMSLRNACI\GGGGG~\nSOKOEEENPAEETGEEKODTOEKEGILPERAEEAKLKAK YPSLGQKPGGSDFLMKRLQKGQKYFDSGDYNMAKAKMKNKQLPSAGPDKNLVTGDHIPTPQDLPQ RKSSLVTSKLAGGQV [SEQ ID NO: 185];

(14)

MXAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEIKAIGELDLLFMSLRNACnGGGKGGGG~\nSOKOEEEUPAEETGEEKODJOEKEGlLPERAEEAK LKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRLQKGQKYFDSGDYNMAKAKMKNKQLPSAGPDKNLVTGDHIPTPQ DLPQRKSSLVTSKLAGGQV [SEQ ID NO: 186];

(15)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEIKAIGELDLLFMSLRNACnGGGNGSGG^SOKOEEENPAEETGEEKODTOEKEGILPERAEEAK LKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRLQKGQKYFDSGDYNMAKAKMKNKQLPSAGPDKNLVTGDHIPTPQ DLPQRKSSLVTSKLAGGQV [SEQ ID NO: 187];

(16)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEIKAIGELDLLFMSLRNACI\GGGCGGGG~\nSOKOEEENPAEETGEEKODTOEKEGILPERAEEAK LKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRLQKGQKYFDSGDYNMAKAKMKNKQLPSAGPDKNLVTGDHIPTPQ DLPQRKSSLVTSKLAGGQV [SEQ ID NO: 188];

(17)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEIKAIGELDLLFMSLRNACnGPNGG~\nSOKOEEENPAEETGEEKODTOEKEGl\-PERAEEAKLKAK YPSLGQKPGGSDFLMKRLQKGQKYFDSGDYNMAKAKMKNKQLPSAGPDKNLVTGDHIPTPQDLPQ RKSSLVTSKLAGGQV [SEQ ID NO: 189];

y

(18)

M XAPISSHCRLDKSNFQQPYITNR TFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERC

YLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEWPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEIKAIGELDLLFMSLRNACISQKQEEENPAEETGEEKQDTQEKEG1LPERAEEAKLKAKYPSLGQK PGGSDFLMKRLQKGQKYFDSGDYNMAKAKMKNKQLPSAGPDKNLVTGDHIPTPQDLPQRKSSLVT SKLAGGQV [SEQ ID NO: 190],

en donde:

SQKQEEENPAEETGEEKQDTQEKEGILPERAEEAKLKAKYPSLGQKPGGSDFLMKRLQKGQKYFDSGDYNMAKAK MKNKQLPSAGPDKNLVTGDHIPTPQDLPQRKSSLVTSKLAGGQV [SEQ ID NO: 191] = a-endosulfina sin metionina inicial;

El texto subrayado es un enlazador flexible;

El texto en cursiva es un polipéptido maduro de IL-22;

M es una metionina artificial para la expresión recombinante;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y

X es una etiqueta opcional (p. ej., FLAGS, His6) para la purificación.

Descrito pero no como parte de la invención reivindicada, el inhibidor del estrés OER es parte de un receptor soluble que se une a IL-24 y el agente de direccionamiento es una molécula de unión a antígeno que es inmuno-interactiva con una proteína de unión de la superficie de la célula p como se enseña, por ejemplo, en la Patente Mundial WO 2010/096930. Los ejemplos no limitantes de constructos de este tipo incluyen:

(A)

M X VPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVL Q WTPPEGL QG VKVTYTVQ YFIYGQKKWLNKS

ECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPPEVALTTDEKSISV VL TAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNR TWSQCVTNHTL VL TWLEPNTL YCVHVE SFVPGPPRRAQPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP

KNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVFSC SVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK\GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS^mAEVOLLESGGGLVOPGG SLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSAS VGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPED FATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 212];

(B)

M X VPCVSGGLPKPANITFLSINMKN VL Q WTPPE GLQG VKVTYTVQ YFIYGQKKWLNKS

ECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPPEVALTTDEKSISV VL TAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNR TWSQCVTNHTL VL TWLEPNTL YCVHVE SFVPGPPRRAQPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGAL TSGVHTFPA VLQSSGL YSLSS WTVPSSSL GTQ TYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDEL T KNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKlGGGSGGGS^mAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ SISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDP PRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 213];

(C)

MXVPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLQWTPPEGLQGVKVTYTVQYFIYGQKKWLNKS

ECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPPEVALTTDEKSISV VL TAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNR TWSQCVTNHTL VL TWLEPNTL YCVHVE SFVPGPPRRAQPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGAL TSGVHTFPA VLQSSGL YSLSS WTVPSSSL GTQ TYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDEL T KNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVFSC SVWHEALH/VHrrQ/CSLSLSPG/CIGGGGlnAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM SWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTS YRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYL NWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFG QGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 214];

(D)

MXVPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLQWTPPEGLQGVKVTYTVQYFIYGQKKWLNKS

ECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPPEVALTTDEKSISV VL TAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNR TWSQCVTNHTL VL TWLEPNTL YCVHVE SFVPGPPRRAQPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDEL T KNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVFSC SVWHEALH/VHrrQ/CSLSLSPG/CIGGGGGlnAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYA MSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK TSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISS YLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTF GQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 215];

(E)

MXVPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLQWTPPEGLQGVKVTYTVQYFIYGQKKWLNKS

ECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPPEVALTTDEKSISV VL TAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNR TWSQCVTNHTL VL TWLEPNTL YCVHVE SFVPGPPRRA QPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKD YFPEPVTVS WNSGAL TSGVHTFPA VLQSSGL YSLSS WTVPSSSL GTQ TYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDEL T KNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVFSC

S'/MHE4¿H/VHrrO/<'SLS¿.SPG/<'rGGGKGGGGlnAMAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ SISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDP PRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 216];

(F)

MXVPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLQWTPPEGLQGVKVTYTVQYFIYGQKKWLNKS

ECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPPEVALTTDEKSISV VL TAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNR TWSQCVTNHTL VL TWLEPNTL YCVHVE SFVPGPPRRAQPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGAL TSGVHTFPA VLQSSGL YSLSS WTVPSSSL GTQ TYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVFSC SVWHEALH/VHrrQ/CSLSLSPG/CIGGGNGSGGlnAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ SISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDP PRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 217];

(G)

M X VPCVSGGLPKPANITFLSINMKN VL Q WTPPE GLQG VKVTYTVQ YFIYGQKK WLNKS

ECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPPEVALTTDEKSISV VL TAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNR TWSQCVTNHTL VL TWLEPNTL YCVHVE SFVPGPPRRAQPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGAL TSGVHTFPA VLQSSGL YSLSS WTVPSSSL GTQ TYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDEL T KNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVFSC SVWHEALH/VHrrQ/CSLSLSPG/CIGGGCGGGGlnAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ SISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDP PRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 218];

(H)

M X VPCVSGGLPKPANITFLSINMKN VL Q WTPPE GLQG VKVTYTVQ YFIYGQKK WLNKS

ECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPPEVALTTDEKSISV VL TAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNR TWSQCVTNHTL VL TWLEPNTL YCVHVE SFVPGPPRRAQPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGAL TSGVHTFPA VLQSSGL YSLSS WTVPSSSL GTQ TYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDEL T KNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVFSC

S'/MHE4¿H/VHrrO/<'SLS¿.SPG/<'rGPNGGlnAMAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM SWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTS YRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYL NWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFG QGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 219];

(I)

MXVPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLQWTPPEGLQGVKVTYTVQYFIYGQKKWLNKSE

CRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPPEVALTTDEKSISW L TAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNR TWSQCVTNHTL VL TWLEPNTL YCVHVESF VPGPPRRA QPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCL VKDYFPEPVTVS WN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC PPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYR WSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDEL TKN Q VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVFSCSV MHEALH/VHYTQ/CS/.S/.SPG/CAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG KGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQ GTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPG KAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRA AAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 220];

en donde:

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDP PRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQ KLISEEDLN [SEQ ID NO: 57] = scFv específico de células p

El texto subrayado es un enlazador flexible;

El texto en cursiva corresponde a un dominio extracelular de IL-20RA unido a la cadena pesada de IgGY1;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;

X es una etiqueta opcional (por ejemplo, FLAGS, His6) para la purificación, y

en donde el constructo se pone en contacto con un domino extracelular de IL-20RB unido a la cadena ligera k human, que comprende la secuencia:

DEVAILPAPQNLSVLSTNMKHLLMWSPVIAPGETVYYSVEYQGEYESLYTSHIWIPSSWCSLTEGPECDVTDDITATVP YNLRVRATLGSQTSAWSILKHPFNRNSTILTRPGMEITKDGFHLVIELEDLGPQFEFLVAYWRREPGAEEHVKMVRSG GIPVHLETMEPGAAYCVKAQTFVKAIGRYSAFSQTECVEVQGEATVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [SEQ ID NO: 199] para formar un heterodímero que se une a IL-24, o

(J)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLISEEDLNrGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSln VPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVL Q WTPP EGLQGVKVTYTVQYFIYGQKKWLNKSECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAE SGRFYPFLETQIGPPEVALTTDEKSISWLTAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNRT WSQCVTNHTL VL TWLEPNTL YCVHVESFVPGPPRRA QPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDEL TKNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 221];

(K)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLISEEDLWGGGSGGGSlnVPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLOWTPPEGLOGVKVTYTVOY FIYGQKKWLNKSECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPP EVALTTDEKSISWLTAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNRTWSQCVTNHTLVLTW LEPNTL YCVHVESFVPGPPRRA QPSEKQCAR TLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCL V KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQ YNSTYR W SVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ V YTLPPSRDEL TKNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 222 ];

(L)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLISEEDLWGGGGlnVPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLOWTPPEGLOGVKVTYTVOYFIYG QKKWLNKSECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPPEVAL TTDEKSISWLTAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNRTWSQCVTNHTLVLTWLEPN TLYCVHVESFVPGPPRRAQPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYR W SVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDEL TKNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 223];

(M)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEQKLISEEDLN[GGGGGJnVPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLQWTPPEGLQGVKVTYTVQYFIY GQKKWLNKSECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPPEV AL TTDEKSISWL TAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNR TWSQCVTNHTL VL TWLE PNTLYCVHVESFVPGPPRRAQPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQ YNSTYR VVSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VY TLPPSRDEL TKNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 224];

(N)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLISEEDLWGGGKGGGGlnVPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLOWTPPEGLOGVKVTYTVO YFIYGQKKWLNKSECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGP PEVALTTDEKSISWLTAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNRTWSQCVTNHTLVLT WLEPNTLYCVHVESFVPGPPRRAQPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL G GPS VFLFPPKPKD TLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKFN WYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP Q VYTLPPSRDEL TKNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKL TVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 225];

(O)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLlSEEDLN\GGGNGSGG~\nVPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLOWTPPEGLOGVKVTYTVOY FIYGQKKWLNKSECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPP EVAL TTDEKSISW L TAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNR TWSQCVTNHTL VL TW LEPNTL YCVHVESFVPGPPRRA QPSEKQCAR TLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCL V KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQ YNSTYR W SVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ V YTLPPSRDEL TKNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 226];

(P)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLISEEDLW GGGCGGGG^VPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLOWTPPEGLOGVKVTYTVO YFIYGQKKWLNKSECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGP PEVALTTDEKSISWLTAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNRTWSQCVTNHTLVLT WLEPNTLYCVHVESFVPGPPRRAQPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL G GPS VFLFPPKPKD TLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKFN WYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP Q VYTLPPSRDEL TKNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKL TVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 227];

(Q)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLISEEDLWGPNGGlnVPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLOWTPPEGLOGVKVTYTVOYFIYG QKKWLNKSECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPPEVAL TTDEKSISWLTAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNRTWSQCVTNHTLVLTWLEPN TLYCVHVESFVPGPPRRAQPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQ YNSTYR W SVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDEL TKNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 228];

(R)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEQKLISEEDLNVPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLQWTPPEGLQGVKVTYTVQYFIYGQKKWLN KSECRNINR TYCDLSAETSDYEHQ YYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPPEVALTTDEKSI SWLTAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNRTWSQCVTNHTLVLTWLEPNTLYCVH VESFVPGPPRRA QPSEKQCAR TLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKD YFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDEL T KNQ VSL TCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 229];

en donde:

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDP PRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQ KLISEEDLN [SEQ ID NO: 57] = scFv específico de células p

El texto subrayado es un enlazador flexible;

El texto en cursiva corresponde a un dominio extracelular de IL-20RA unido a la cadena pesada de IgGY1;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;

X es una etiqueta opcional (por ejemplo, FLAGS, His6) para la purificación, y

En donde el constructo se pone en contacto con un dominio extracelular de IL-20RB unido a la cadena ligera k humana, que comprende la secuencia:

DEVAILPAPQNLSVLSTNMKHLLMWSPVIAPGETVYYSVEYQGEYESLYTSHIWIPSSWCSLTEGPECDVTDDITATVP YNLRVRATLGSQTSAWSILKHPFNRNSTILTRPGMEITKDGFHLVIELEDLGPQFEFLVAYWRREPGAEEHVKMVRSG GIPVHLETMEPGAAYCVKAQTFVKAIGRYSAFSQTECVEVQGEATVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [SEQ ID NO: 199] para formar un heterodímero que se une a IL-24, o

(S)

M XDEVAILPAPQNLSVLSTNMKHLLM WSPVIAPGETVYYSVEYQGEYESL YTSHIWIPS

S WCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLR VRA TLGSQTSA WSILKHPFNRNSTIL TRPGMEITKDGFHL VI ELEDLGPQFEFLVAYWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAAYCVKAQTFVKAIGRYSAFSQT ECVEVQGEATVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE ODSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC\GGGGSGGGGSGGGGS GGGGSlnAMAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVROAPGKGLEWVSSITAEGT HTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAE QKLISEEDLN [SEQ ID NO: 230];

(T)

M XDEVAILPAPQNLSVLSTNMKHLLM WSPVIAPGETVYYSVEYQGEYESL YTSHIWIPS

S WCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLR VRA TLGSQTSA WSILKHPFNRNSTIL TRPGMEITKDGFHL VI ELEDLGPQFEFLVAYWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAAYCVKAQTFVKAIGRYSAFSQT ECVEVQGEATVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTL TLSKAD YEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[GGGSGGGS}ñA M AE VQL LESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ

ID NO: 231];

(U)

M XDEVAILPAPQNLSVLSTNMKHLLM WSPVIAPGETVYYSVEYQGEYESL YTSHIWIPS

S WCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLR VRA TL GSQ TSA WSILKHPFNRNSTIL TRPGMEITKDGFHL VI ELEDLGPQFEFLVAYWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAAYCVKAQTFVKAIGRYSAFSQT ECVEVQGEATVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE ODSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGECl GGGG~\nAMAEVOLLESG GGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMT QSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 232];

(V)

M XDEVAILPAPQNLSVLSTNMKHLLM WSPVIAPGETVYYSVEYQGEYESL YTSHIWIPS

S WCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLR VRA TL GSQ TSA WSILKHPFNRNSTIL TRPGMEITKDGFHL VI ELEDLGPQFEFLVAYWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAAYCVKAQTFVKAIGRYSAFSQT ECVEVQGEATVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE ODSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGECl GGGGG~\nAMAEVOLLES GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQM TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 233];

(W)

MXDEVAILPAPQNLSVLSTNMKHLLMWSPVIAPGETVYYSVEYQGEYESLYTSHIWIPS

S WCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLR VRA TL GSQ TSA WSILKHPFNRNSTIL TRPGMEITKDGFHL VI ELEDLGPQFEFLVAYWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAAYCVKAQTFVKAIGRYSAFSQT ECVEVQGEATVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTL TLSKAD YEKHKVYA CEVTHOGLSSPVTKSFNRGEQGGGKGGGGInA M AE VQL LESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 234];

(X)

MXDEVAILPAPQNLSVLSTNMKHLLMWSPVIAPGETVYYSVEYQGEYESLYTSHIWIPS

S WCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLR VRA TLGSQTSA WSILKHPFNRNSTIL TRPGMEITKDGFHL VI ELEDLGPQFEFLVAYWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAAYCVKAQTFVKAIGRYSAFSQT ECVEVQGEATVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDS TYSLSSTL TLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNR GECTGGGNGSGGlnA M A E VQ L LESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 235];

(Y)

M XDEVAILPAPQNLSVLSTNMKHLLM WSPVIAPGETVYYSVEYQGEYESL YTSHIWIPS

S WCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLR VRA TL GSQ TSA WSILKHPFNRNSTIL TRPGMEITKDGFHL VI ELEDLGPQFEFLVAYWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAAYCVKAQTFVKAIGRYSAFSQT ECVEVQGEATVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTL TLSKAD YEKHKVYA CEVTHOGLSSPVTKSFNRGEQ GGGCGGGG]nA M AE VQL LESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDI QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 236];

(Z)

MXDEVAILPAPQNLSVLSTNMKHLLM WSPVIAPGETVYYSVEYQGEYESL YTSHIWIPS

S WCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLR VRA TLGSQTSA WSILKHPFNRNSTIL TRPGMEITKDGFHL VI ELEDLGPQFEFLVAYWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAAYCVKAQTFVKAIGRYSAFSQT ECVEVQGEATVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE ODSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEQGPNGGInAMAEVOLLES GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQM TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 237];

(AA)

MXDEVAILPAPQNLSVLSTNMKHLLM WSPVIAPGETVYYSVEYQGEYESLYTSHIWIP

SSWCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLRVRA TLGSQTSA WSILKHPFNRNSTIL TRPGMEITKDGFHL V IELEDL GPQFEFL VA YWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAA YCVKA Q TFVKAI GR YSAFSQ TECVEVQGEATVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE

GGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 238]; en donde:

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDP PRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQ KLISEEDLN [SEQ ID NO: 57] = scFv específico de células p

El texto subrayado es un enlazador flexible;

El texto en cursiva corresponde a un dominio extracelular de IL-20RB unido a la cadena ligera k humana;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;

X es una etiqueta opcional (por ejemplo, FLAGS, His6) para la purificación, y

en donde el constructo se pone en contacto con un dominio extracelular de IL-20RA unido a la cadena pesada de IgGY1, que comprende la secuencia:

VPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLQWTPPEGLQGVKVTYTVQYFIYGQKKWLNKSECRNINRTYCDLSAETSDYEHQ YYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPPEVALTTDEKSISVVLTAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSV LNTKSNRTWSQCVTNHTLVLTWLEPNTLYCVHVESFVPGPPRRAQPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK [SEQ ID NO: 198] para formar un heterodímero que se une a IL- 24, o

(AB)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSI

TAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKA SRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH GAAEOKLISEEDLWGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSWEVAILPAPONLSVLSTNMKHLLMWSPVI APGETVYYSVEYQGEYESL YTSHIWIPSS WCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLR VRA TLGSQTSA WSI LKHPFNRNSTIL TRPGMEITKDGFHL VIELEDLGPQFEFL VA YWRREPGAEEHVKM VRSGGIPVHLET MEPGAAYCVKAQTFVKAIGRYSAFSQTECVEVQGEATVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY PREAKVQ WKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKAD YEKHKVYA CEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC [SEQ ID NO: 239];

(AC)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSI

TAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKA SRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH GAAEOKLISEEDLWGGGSGGGSWEVAILPAPONLSVLSTNMKHLLMWSPVIAPGETVYYSVEYOG EYESL YTSHIWIPSS WCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLR VRA TL GSQTSA WSILKHPFNRNSTIL TR PGMEITKDGFHLVIELEDLGPQFEFLVAYWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAAYCVKAQT FVKAIGR YSAFS Q TECVEVQGEA TVAAPS VFIFPPSDEQLKS GTAS WCLLNNFYPREAKVQ WKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [SEQ

ID NO: 240];

(AD)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSI

TAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKA SRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH GAAEOKLISEEDLW GGGGlrDEVAILPAPONLSVLSTNMKHLLMWSPVIAPGETVYYSVEYOGEYES L YTSHIWIPSS WCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLR VRA TL GSQ TSA WSILKHPFNRNSTIL TRPGME ITKDGFHL VIELEDL GPQFEFL VA YWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAA YCVKA Q TFVKAI GRYSAFSQTECVEVQGEATVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [SEQ ID NO: 241];

(AE)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSI

TAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKA SRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH GAAEOKLISEEDLWGGGGGlnDEVAILPAPONLSVLSTNMKHLLMWSPVIAPGETVYYSVEYOGEYE SL YTSHI WIPSS WCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLR VRA TL GSQ TSA WSILKHPFNRNSTIL TRPGM EITKDGFHLVIELEDLGPQFEFLVAYWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAAYCVKAQTFVKA IGRYSAFSQTECVEVQGEATVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [SEQ ID NO: 242 ];

(AF)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSI

TAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKA SRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH GAAEOKLl5EEDLWGGGKGGGG]rDEVAILPAPONLSVLSTNMKHLLMWSPVIAPGETVYYSVEYO GEYESL YTSHI WIPSS WCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLR VRA TL GSQ TSA WSILKHPFNRNSTIL T RPGMEITKDGFHLVIELEDLGPQFEFLVAYWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAAYCVKAQ TFVKAI GR YSAFSQ TECVEVQGEA TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[SEQ ID NO: 243];

(AG)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSI

TAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKA SRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH GAAEQKL15EEDLN[GGGNG5GGJnDEVAILPAPQNLSVLSTNMKHLLMWSPVIAPGETVYYSVEYQ GEYESL YTSHIWIPSS WCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLR VRA TL GSQ TSA WSILKHPFNRNSTIL T RPGMEITKDGFHL VIELEDL GPQFEFL VA YWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAA YCVKA Q TFVKAIGR YSAFSQ TECVEVQGEA TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[SEQ ID NO: 244];

(AH)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSI

TAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKA SRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH GAAEOKLISEEDLWGGGCGGGGlnDEVAILPAPONLSVLSTNMKHLLMWSPVIAPGETVYYSVEYO GEYESL YTSHIWIPSS WCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLR VRA TL GSQTSA WSILKHPFNRNSTIL T RPGMEITKDGFHLVIELEDLGPQFEFLVAYWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAAYCVKAQ TFVKAIGR YSAFSQ TECVEVQGEA TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[SEQ ID NO: 245];

(AI)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSI

TAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKA SRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH GAAEOKLlSEEDLN\GPNGG~\nDEVAILPAPONLSVLSTNMKHLLMWSPVIAPGETVYYSVEYOGEYE SLYTSHIWIPSSWCSLTEGPECDVTDDITATVPYNLRVRATLGSQTSAWSILKHPFNRNSTILTRPGM EITKDGFHLVIELEDLGPQFEFLVAYWRREPGAEEHVKMVRSGGIPVHLETMEPGAAYCVKAQTFVKA IGRYSAFSQTECVEVQGEATVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [SEQ ID NO: 246 ];

(AJ)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSI

TAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKA SRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH GAAEQKL15EEDLNDEVAILPAPQNLSVLSTNMKHLLMWSPVIAPGETVYYSVEYQGEYESLYTSHIW IPSS WCSL TEGPECD VTDDITA TVPYNLR VRA TL GSQ TSA WSILKHPFNRNSTIL TRPGMEITKDGFH L VIELEDL GPQFEFL VA YWRREPGAEEHVKM VRSGGIP VHLETMEPGAA YCVKA Q TFVKAIGR YSAFS Q TECVEVQGEA TVAAPS VFIFPPSDEQLKS GTAS WCLLNNFYPREAKVQ WKVDNAL QS GNS QESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [SEQ ID NO: 247]; en donde:

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDP PRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQ KLISEEDLN [SEQ ID NO: 57] = scFv específico de células p

El texto subrayado es un enlazador flexible;

El texto en cursiva corresponde a un dominio extracelular de IL-20RB unido a la cadena ligera ^k humana;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;

X es una etiqueta opcional (por ejemplo, FLAGS, His6) para la purificación, y

en donde el constructo se pone en contacto con un dominio extracelular de IL-20RA unido a la cadena pesada de IgGY1, que comprende la secuencia:

VPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLQWTPPEGLQGVKVTYTVQYFIYGQKKWLNKSECRNINRTYCDLSAETSDYEHQ YYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPPEVALTTDEKSISVVLTAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSV LNTKSNRTWSQCVTNHTLVLTWLEPNTLYCVHVESFVPGPPRRAQPSEKQCARTLKDQSSEASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK [SEQ ID NO: 198] para formar un heterodímero que se une a IL- 24.

Descrito pero no parte de la invención reivindicada, el inhibidor del estrés OER es una molécula de unión a antígeno que es inmuno-interactiva con IL-23 y el agente de direccionamiento es una molécula de unión a antígeno que es inmuno-interactiva con una proteína de unión de la superficie de la célula p como se enseña, por ejemplo, en la Patente Mundial WO 2010/096930. Los ejemplos no limitantes de constructos de este tipo incluyen:

(A)

M XQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNTGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGSGN

RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLTVLGGGGSGGGG SGGGGSQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNE YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAFDIWGQGTMVTVSS

QAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFD YWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWY QQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTK VEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 248];

(B)

M XQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNTGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGSGN

RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLTVLGGGGSGGGG SGGGGSQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNE YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAFDIWGQGTMVTVSS

rGGGSGGGSlnAMAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVROAPGKGLEWVSSIT AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 249];

(C)

MXQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNTGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGSGN

RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLTVLGGGGSGGGG SGGGGSQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNE YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAFDIWGQGTMVTVSS

rGGGGlnAMAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVROAPGKGLEWVSSITAEGT HTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAE QKLISEEDLN [SEQ ID NO: 250 ];

(D)

WXQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNTGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGSGN

RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLTVLGGGGSGGGG SGGGGSQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNE YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAFDIWGQGTMVTVSS

rGGGGGlnAMAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVROAPGKGLEWVSSITAEG THTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGG SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTUCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAA EQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 251];

(E)

M XQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNTGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGSGN

RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLTVLGGGGSGGGG SGGGGSQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNE YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAFDIWGQGTMVTVSS

rGGGKGGGGInAMAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVROAPGKGLEWVSSIT AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 252];

(F)

M XQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNTGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGSGN

RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLTVLGGGGSGGGG SGGGGSQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNE YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAFDIWGQGTMVTVSS

rGGGNGSGGlnAMAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVROAPGKGLEWVSSIT AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 253];

(G)

M XQSVL TQPPSVSGAPGQR VTISCTGSSSNTGAGYD VHWYQQVPGTAPKLLIYGSGN

RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLTVLGGGGSGGGG SGGGGSQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNE YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAFDIWGQGTMVTVSS

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 254];

(H)

MXQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNTGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGSGN

RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLTVLGGGGSGGGG SGGGGSQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNE YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAFDIWGQGTMVTVSS

rGPNGGInAMAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVROAPGKGLEWVSSITAEG THTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGG SGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAA EQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 255];

(I)

M XQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNTGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGSGNR

PSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLTVLGGGGSGGGGS GGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNEY YADS VKGRFTISRDNSKNTL YL QMNSLRAED TA VYYCARDR G YTSS WYPDAFDIWGQGTM VTVSSA MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGG GGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDL

N [SEQ ID NO: 256];

en donde:

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDP PRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 57] = scFv específico de células p

El texto subrayado es un enlazador flexible;

El texto en cursiva es scFv anti-IL23;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y

X es una etiqueta opcional (por ejemplo, FLAGS, His6) para la purificación, o

(J)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG

AGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGSGNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSS LSGWVFGGGTRLTVLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGM HWVRQAPGKGLEWVA VIWYDGSNEYYADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTA VYYCARD RGYTSSWYPDAFDIWGQGTMVTVSS [SEQ ID NO: 257];

(K)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLlSEEDLWGGGSGGGS]nOSVLTOPPSVSGAPGORVTISCTGSSSNTGAGYDVHWYOOVP GTAPKLLIYGSGNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLT VLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLE WVAVIWYDGSNEYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAF DIWGQGTMVTVSS [SEQ ID NO: 258];

(L)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLlSEEDLWGGGG]nOSVLTOPPSVSGAPGORVTISCTGSSSNTGAGYDVHWYOOVPGTAP KLLIYGSGNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLTVLG GGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA VIWYDGSNEYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAFDIWG QGTMVTVSS [SEQ ID NO: 259];

(M)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEQKLlSEEDLN\GGGGG~\nOSVLTOPPSVSGAPGORVTISCTGSSSNTGAGYDVHWYOOVPGTA PKLLIYGSGNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLTVLG GGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA VIWYDGSNEYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAFDIWG QGTMVTVSS [SEQ ID NO: 260];

(N)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG

GTAPKLLIYGSGNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLT VLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLE WVAVIWYDGSNEYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAF DIWGQGTMVTVSS [SEQ ID NO: 261];

(O)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLISEEDLWGGGNGSGG^OSVLTOPPSVSGAPGORVTISCTGSSSNTGAGYDVHWYOOVP GTAPKLLIYGSGNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLT VL GGGGSGGGGSGGGGSQ VQL VESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMH WVRQAPGKGLE WVAVIWYDGSNEYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAF DIWGQGTMVTVSS [SEQ ID NO: 262];

(P)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLl5EEDLWGGGCGGGG]rOSVLTOPPSVSGAPGORVTISCTGSSSNTGAGYDVHWYOOVP GTAPKLLIYGSGNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLT VLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLE WVAVIWYDGSNEYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAF DIWGQGTMVTVSS [SEQ ID NO: 263];

(Q)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLISEEDLNrGPNGGlnOSW. TQPPSVSGAPGQR VTISCTGSSSNTGAGYD VH WYQQ VPGTAP KLLIYGSGNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLTVLG GGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA VIWYDGSNEYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAFDIWG QGTMVTVSS [SEQ ID NO: 264];

(R)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG

NRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLTVLGGGGSGGG GSGGGGSQ VQL VESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMH WVRQAPGKGLEWVA VIWYDGSN EYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYTSSWYPDAFDIWGQGTMVTVS

S [SEQ ID NO: 265];

en donde:

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDP PRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 57] = p scFv específico de células p

El texto subrayado es un enlazador flexible;

El texto en cursiva es scFv anti-IL23;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y

X es una etiqueta opcional (por ejemplo, FLAGS, His6) para la purificación.

Descrito pero no como parte de la invención reivindicada, el inhibidor del estrés OER es una molécula de unión a antígeno que es inmuno-interactiva con IL-23R y el agente de direccionamiento es una molécula de unión a antígeno que es inmuno-interactiva con una proteína de unión de la superficie de la célula p como se enseña, por ejemplo, en la Patente Mundial WO 2010/096930. Los ejemplos no limitantes de constructos de este tipo incluyen:

(a)

MXDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDIYNNLAWYQQKPGKAPKLLIYHASSLQD

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDSEYPPTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGG SQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMSWVRQAPGKGLEWVADINSKSYNYATYYAD SVKDRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTA VYYCARHHSDYFEYWGQGTL VTVSS l GGGGSGGGG SGGGGSGGGGSlnAMAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVROAPGKGLEWVS SITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVS SGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI YKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHH HHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 266];

(b)

MXDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDIYNNLAWYQQKPGKAPKLLIYHASSLQD

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDSEYPPTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGG SQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMSWVRQAPGKGLEWVADINSKSYNYATYYAD SVKDRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTA VYYCARHHSDYFEYWGQGTL VTVSS[GGGSGGGS}n AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSG GGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEE DLN [SEQ ID NO: 267];

(c)

MXDIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCLASEDIYNNLA WYQQKPGKAPKLLIYHASSLQDG

VPSRF5GSGSGTDFTL TI SSL QPEDFA TYYCL QDSEYPPTFGQGTKVEIKR GGGGSGGGGSGGGGS Q VQL VESGGGVVQPGRSLRLS CAASGFDFNSYGMS WVRQAPGKGLEWVADINSKSYNYA TYYADS VKDRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTA VYYCARHHSDYFEYWGOGTL VTVSS\GGGG 1 nAM AEV QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGST DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN

[SEQ ID NO: 268 ];

(d)

M XDIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCLASEDIYNNLA WYQQKPGKAPKLLIYHASSLQD

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDSEYPPTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGG SQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMSWVRQAPGKGLEWVADINSKSYNYATYYAD SVKDRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTA VYYCARHHSDYFEYWGOGTL VTVSSÍGGGGG1 nAM A EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVK GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGG STDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN

[SEQ ID NO: 269];

(e)

M XDIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCLASEDIYNNLA WYQQKPGKAPKLLIYHASSLQD

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDSEYPPTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGG SQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMSWVRQAPGKGLEWVADINSKSYNYATYYAD SVKDRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTA VYYCARHHSDYFEYWGOGTL VTVSS l GGGKGGGG1 n AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSG GGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEE DLN [SEQ ID NO: 270];

(f)

MXDIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCLASEDIYNNLA WYQQKPGKAPKLLIYHASSL QDG

VPSRFSGSGSGTDFTL TI SSL QPEDFA TYYCL QDSEYPPTFGQGTKVEIKR GGGGSGGGGSGGGGS Q VQL VESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMS WVRQAPGKGLEWVADINSKSYNYA TYYADS VKDRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTA VYYCARHHSDYFEYWGOGTL VTVSSLGGGNGSGGJnA MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGG GGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDL

N [SEQ ID NO: 271];

(g)

MXDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDIYNNLAWYQQKPGKAPKLLIYHASSLQD

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDSEYPPTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGG SQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMSWVRQAPGKGLEWVADINSKSYNYATYYAD SVKDRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTA VYYCARHHSDYFEYWGOGTL VTVSS \GGGCGGGG1 „

SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSG GGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEE DLN [SEQ ID NO: 272];

(h)

M XDIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCLASEDIYNNLA WYQQKPGKAPKLLIYHASSLQD

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDSEYPPTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGG SQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMSWVRQAPGKGLEWVADINSKSYNYATYYAD SVKDRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTA VYYCARHHSDYFEYWGOGTL WVSSÍGPNGG 1 nAMAE VQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN

[SEQ ID NO: 273];

(i)

MXDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDIYNNLAWYQQKPGKAPKLLIYHASSLQDG

VPSRFSGSGSGTDFTL TI SSL QPEDFA TYYCL QDSEYPPTFGQGTKVEIKR GGGGSGGGGSGGGGS Q VQL VESGGGWQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMS WVRQAPGKGLEWVADINSKSYNYA TYYADS VKDRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTA VYYCARHHSDYFEYWGOGTL WVSSAM AEVQLLESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQ SPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID

NO: 274 ];

en donde:

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDP PRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 57] = scFv específica de células p

El texto subrayado es un enlazador flexible;

El texto en cursiva es scFv anti-IL23R;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y

X es una etiqueta opcional (por ejemplo, FLAGS, His6) para la purificación, o

(j)

MXAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIT

AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG

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(k)

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AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLlSEEDLWGGGSGGGS]nDIOMTOSPSSLSASVGDR VTITCLASEDIYNNLA WYQQKPGKA PKLLIYHASSLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDSEYPPTFGQGTKVEIKRGGG GSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMSWVRQAPGKGLEWVADI NSKSYNYATYYADSVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHHSDYFEYWGQGTLVTV SS [SEQ ID NO: 276];

(l)

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[SEQ ID NO: 277];

(m)

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AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLlSEEDLWGGGGG]nDIOMTOSPSSLSASVGDR VTITCLASEDIYNNLA WYQQKPGKAPKLL IYHASSLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDSEYPPTFGQGTKVEIKRGGGGSG GGGSGGGGSQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMSWVRQAPGKGLEWVADINSKS YNYATYYADSVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHHSDYFEYWGQGTLVTVSS

[SEQ ID NO: 278];

(n)

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AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEQKL15EEDLN[GGGKGGGGJnDIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCLASEDIYNNLA WYQQKPGKA PKLLIYHASSLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDSEYPPTFGQGTKVEIKRGGG GSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMSWVRQAPGKGLEWVADI NSKSYNYATYYADSVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHHSDYFEYWGQGTLVTV SS [SEQ ID NO: 279 ];

(o)

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AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKll5EEDm G G G NG 5G G ]rDIOMTOSPSSLSASVGDR VTITCLASEDIYNNLA WYQQKPGKA PKLLIYHASSLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDSEYPPTFGQGTKVEIKRGGG GSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMSWVRQAPGKGLEWVADI NSKSYNYATYYADSVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHHSDYFEYWGQGTLVTV SS [SEQ ID NO: 280 ];

(P)

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AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLl5EEDLWGGGCGGGG]nDIOMTOSPSSLSASVGDR VTITCLASEDIYNNLA WYQQKPGKA PKLLIYHASSLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDSEYPPTFGQGTKVEIKRGGG GSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMSWVRQAPGKGLEWVADI NSKSYNYATYYADSVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHHSDYFEYWGQGTLVTV SS [SEQ ID NO: 281 ];

(q)

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AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEOKLlSEEDLN\GPNGG~\nDIOMTOSPSSLSASVGDR VTITCLASEDIYNNLA WYQQKPGKAPKLL IYHASSL QDGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSL QPEDFA TYYCLQDSEYPPTFGQGTKVEIKRGGGGSG GGGSGGGGSQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMSWVRQAPGKGLEWVADINSKS YNYATYYADSVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHHSDYFEYWGQGTLVTVSS

[SEQ ID NO: 282];

(r)

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AEGTHTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKAS RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDPPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHG AAEQKUSEEDINDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEDIYNNLAWYQQKPGKAPKLLIYHASSLQ DGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDSEYPPTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGG GSQ VQL VESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFDFNSYGMS WVRQAPGKGLEWVADINSKSYNYA TYYA DSVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHHSDYFEYWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:

283];

en donde:

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITAEGTHTWYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSYRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKWDP PRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLN [SEQ ID NO: 57] = scFv específica de células p

El texto subrayado es un enlazador flexible;

El texto en cursiva es scFv anti-IL23R;

n = 1 o más, adecuadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y

X es una etiqueta opcional (por ejemplo, FLAGS, His6) para la purificación.

Descrito pero no como parte de la invención reivindicada, en los constructos de anti-IL-24 e IL-23 definidos anteriormente, los constructos quiméricos comprenden scFv específica de célula p alternativa sustituida por la scFv definida anteriormente, cuyos ejemplos ilustrativos incluyen:

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSRIKIFGSKT

KFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHSTHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLQSTPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKL ISEEDLN [SEQ ID NO: 58];

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIHPKGYP

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AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSRIQFFGSH TYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHSTHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSTDIMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRASILQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNRRIPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLI SEEDLN [SEQ ID NO: 60 ];

y

AMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSTGDS TSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAADSFDYWGQGTLVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNGAPTTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQ KLISEEDLN [SEQ ID NO: 61].

6. Realizaciones de vehículos de sum inistro

La presente invención contempla el uso de vehículos de suministro para la administración dirigida de un inhibidor del estrés OER a una célula p. El vehículo de suministro comprenderá generalmente un agente de direccionamiento a células p y un inhibidor del estrés OER.

En algunas realizaciones, el vehículo de suministro es una partícula polimérica. Las partículas poliméricas se pueden formar a partir de cualquier polímero, copolímero o mezcla biocompatible y deseablemente biodegradable. Los polímeros se pueden adaptar para optimizar diferentes características de la partícula, incluyendo i) interacciones entre los agentes bioactivos (es decir, agente de direccionamiento a células p e inhibidor del estrés OER) y proteínas o receptores diana en la célula p y el polímero para proporcionar la estabilización de los agentes bioactivos y la retención de la actividad tras el suministro; ii) características de la superficie y capacidades de direccionamiento mediante modificación química; y iii) porosidad de las partículas.

Se pueden usar polímeros que erosionan la superficie tales como polianhídridos para formar las partículas. Por ejemplo, pueden usarse polianhídridos tales como anhídrido de poli[(p-carboxifenoxi)-hexano] (PCPH). Los polianhídridos biodegradables se describen en la Patente de Estados Unidos U.S. Pat. No. 4,857,311.

En otras realizaciones, se pueden usar polímeros de erosión en masa tales como los basados en poliésteres incluyendo poli(hidroxiácidos) o poli(ésteres). Por ejemplo, se pueden usar ácido poliglicólico (PGA), ácido poliláctico (PLA) o copolímeros de los mismos para formar las partículas. El poliéster también puede tener un grupo cargado o funcionalizable, tal como un aminoácido. En ejemplos ilustrativos, las partículas con propiedades de liberación controlada pueden estar formadas por poli(ácido D,L-láctico) y/o poli(ácido D,L-láctico-co-glicólico) ("PLGA").

Otros polímeros incluyen poli(alquilcianoacrilatos), poliamidas, policarbonatos, polialquilenos tales como polietileno, polipropileno, poli(etilenglicol), poli(óxido de etileno), poli(tereftalato de etileno), compuestos de polivinilo tales como polivinilalcoholes, poliviniléteres y polivinil ésteres, polímeros de ácidos acrílico y metacrílico, celulosas y otros polisacáridos, y péptidos o proteínas, o copolímeros o mezclas de los mismos. Los polímeros pueden seleccionarse o modificarse para que tengan la estabilidad y las tasas de degradación apropiadas in vivo para diferentes aplicaciones de suministro controlado de fármacos.

En algunas realizaciones, las partículas se forman a partir de polímeros funcionalizados tales como copolímeros de injerto de poliéster, como se describe en Hrkach et al. (1995, Macromolecules, 28:4736-4739; y "Poly(L-Lactic acidco-amino acid) Graft Copolymers: A Class of Functional Biodegradable Biomaterials” in Hydrogels and Biodegradable Polymers for Bioapplications, ACS Symposium Series No. 627, Raphael M. Ottenbrite et al., Eds., American Chemical Society, Chapter 8, pp. 93-101, 1996.)

Se pueden usar materiales distintos de los polímeros biodegradables para formar las partículas. Los materiales adecuados incluyen varios polímeros no biodegradables y varios excipientes. Las partículas también pueden estar formadas por el(los) agente(s) bioactivo(s) y el tensioactivo solos.

Las partículas poliméricas se pueden preparar usando la emulsión simple o doble por evaporación de solventes, secado por aspersión, extracción de solventes, evaporación de solventes, separación de fases, coacervación simple y compleja, polimerización interfacial y otros métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Las partículas pueden fabricarse usando métodos para fabricar microesferas o microcápsulas conocidos en la técnica, siempre que las condiciones estén optimizadas para formar partículas con el diámetro deseado.

Los métodos desarrollados para hacer microesferas para el suministro de agentes bioactivos se describen en la bibliografía, por ejemplo, como se describe en Doubrow, M., Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy", CRC Press, Boca Raton, 1992. Los métodos también se describen en Mathiowitz and Langer (1987, J. Controlled Release 5, 13-22); Mathiowitz et al. (1987, Reactive Polymers 6, 275-283); y Mathiowitz et al. (1988, J. Appl. Polymer Sci. 35, 755-774) así como en las Patentes de Estados Unidos U.S. Pat. No. 5,213,812, U.S. Pat. No.

5,417,986, U.S. Pat. No. 5,360,610, y U.S. Pat. No. 5,384,133. La selección del método depende de la selección del polímero, el tamaño, la morfología externa y la cristalinidad que se desee, como se describe, por ejemplo, por Mathiowitz et al. (1990, Scanning Microscopy 4: 329-340; 1992, J. Appl. Polymer Sci. 45, 125-134); y Benita et al. (1984, J. Pharm. Sci. 73, 1721-1724).

En la evaporación de solventes, descrita por ejemplo, en Mathiowitz et al., (1990), Benita; y la Patente de Estados Unidos U.S. Pat. No. 4,272,398 to Jaffe, el polímero se disuelve en un disolvente orgánico volátil, tal como el cloruro de metileno. Se pueden utilizar varias concentraciones de polímero diferentes, por ejemplo, entre 0,005 y 2,0 g/mL. Los agentes bioactivos, ya sea en forma soluble o dispersados como partículas finas, se añaden a la solución de polímero y la mezcla se suspende en una fase acuosa que contiene un agente tensioactivo tal como el alcohol polivinílico. La fase acuosa puede ser, por ejemplo, una concentración de alcohol polivinílico al 1% p/v en agua destilada. La emulsión resultante se agita hasta que se evapora la mayor parte del disolvente orgánico, dejando microesferas sólidas, que pueden lavarse con agua y secarse durante la noche en un liofilizador. Mediante este método se pueden obtener microesferas de diferentes tamaños (entre 0,1 y 1000 gm) y morfologías.

La eliminación de solventes se diseñó principalmente para su uso con polímeros menos estables, tales como los polianhídridos. En este método, el agente se dispersa o disuelve en una solución de un polímero seleccionado en un solvente orgánico volátil como el cloruro de metileno. Después, la mezcla se suspende en aceite, tal como aceite de silicona, mediante agitación, para formar una emulsión. Dentro de las 24 horas, el solvente se difunde en la fase oleosa y las gotas de emulsión se endurecen en microesferas de polímero sólidas. A diferencia del método de microencapsulación por fusión en caliente descrito, por ejemplo, en Mathiowitz et al. (1987, Reactive Polymers, 6:275), este método se puede usar para preparar microesferas a partir de polímeros con puntos de fusión altos y una amplia gama de pesos moleculares. Con este procedimiento se pueden obtener microesferas que tengan un diámetro por ejemplo entre una y 300 micras.

Con algunos sistemas poliméricos, las partículas poliméricas preparadas usando una técnica de emulsión simple o doble, varían en tamaño dependiendo del tamaño de las gotas. Si las gotas en las emulsiones de agua en aceite no tienen un tamaño pequeño adecuado para formar partículas con el intervalo de tamaño deseado, se pueden preparar gotas más pequeñas, por ejemplo, mediante sonicación u homogeneización de la emulsión, o mediante la adición de tensioactivos.

Si las partículas preparadas por uno cualquiera de los métodos anteriores tienen un intervalo de tamaño fuera del intervalo deseado, las partículas pueden clasificarse por tamaño, por ejemplo, usando un tamiz y, opcionalmente, separarse adicionalmente según la densidad usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.

Las partículas poliméricas se pueden preparar mediante secado por aspersión. Métodos de secado por aspersión, como el descrito en la Patente PCT WO 96/09814 por Sutton and Johnson, describen la preparación de micropartículas esféricas suaves de un material soluble en agua con al menos el 90% de las partículas que poseen un tamaño medio entre 1 y 10 gm.

En algunas realizaciones, las partículas son liposomas. Los liposomas se pueden producir mediante métodos estándar tales como los descritos por Kim et al. (1983, Biochim. Biophys. Acta 728, 339-348); Liu et al. (1992, Biochim. Biophys. Acta 1104, 95-101); Lee et al. (1992, Biochim. Biophys. Acta. 1103, 185-197), Brey et al. (Solicitud de Patente de Estados Unidos U.S. Pat. Appl. Pub. 20020041861), Hass et al. (Solicitud de Patente de Estados Unidos U.S. Pat. Appl. Pub. 20050232984), Kisak et al. (Solicitud de Patente de Estados Unidos U.S. Pat. Appl. Pub. 20050260260) y Smyth-Templeton et al. (Solicitud de Patente de Estados Unidos U.S. Pat. Appl. Pub. 20060204566). Además, se puede hacer referencia a Copland et al. (2005, Immunol. Cell Biol. 83: 95-105) que revisan formulaciones de partículas a base de lípidos para el suministro de antígenos, y a Bramwell et al. (2005, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 22(2):151-214; 2006, J Pharm Pharmacol. 58(6):717-728) que revisan los sistemas de suministro de partículas para vacunas, incluyendo los métodos para la preparación de liposomas cargados de proteínas. Muchas formulaciones de liposomas que utilizan una variedad de diferentes componentes lipídicos se han utilizado en varios cultivos celulares in vitro y experimentos con animales. Se han identificado los parámetros que determinan las propiedades liposomales y se reportan en la bibliografía, por ejemplo, por Lee et al. (1992, Biochim. Biophys. Acta. 1103, 185-197); Liu et al. (1992, Biochim. Biophys. Acta, 1104, 95-101); y Wang et al. (1989, Biochem. 28, 9508-951).

En algunas realizaciones, se utilizan métodos preparativos basados en la hidratación de una película de lípidos secos, en los que los lípidos de elección (y cualquier bioactivo orgánico soluble), disueltos en un disolvente orgánico, se mezclan y se secan en el fondo de un recipiente de vidrio bajo vacío. La película de lípidos se rehidrata utilizando una solución tamponada acuosa que contiene bioactivos solubles en agua para encapsularlos mediante agitación suave. Las vesículas lipídicas hidratadas pueden después procesarse más por extrusión, someterse a una serie de ciclos de congelación y descongelación o deshidratarse y después rehidratarse para promover la encapsulación de bioactivos. Después, los liposomas pueden lavarse mediante centrifugación o cargarse en una columna de exclusión por tamaño para eliminar el bioactivo no atrapado de la formulación de liposomas y almacenarse a 4°C. El método básico para la preparación de liposomas se describe con más detalle en Thierry et al. (1992, Nuc. Acids Res. 20:5691 -5698).

En otras realizaciones, el agente de suministro es una ciclodextrina. Las ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos que tienen una cavidad hidrofóbica central y múltiples grupos hidroxilo en la superficie exterior. Moléculas bioactivas (por ejemplo, agentes de direccionamiento de células p e inhibidores del estrés OER) se pueden conjugar con las moléculas de ciclodextrina a través de estos grupos hidroxilo mediante métodos conocidos en la técnica. Por lo tanto, las ciclodextrinas ya se han utilizado para el transporte de oligonucleótidos antisentido en líneas de células T humanas (Antisense Res Dev, 5:185-192, 1995) y también se han utilizado in vivo para el transporte intracelular y para la liberación o administración intracelular de secuencias de CpG inmunogénicas (Biochem Pharmacol, 52:1537-1544, 1996). Una amplia variedad de formulaciones de ciclodextrinas se dan en el artículo de revisión de Davis y Brewster (Nature Reviews Drug Discovery 3:1023-1035, 2004).

En otras realizaciones más, el vehículo de suministro es un dendrímero. Los dendrímeros comprenden una categoría de materiales ramificados con diversas funciones que se pueden construir con estructuras arquitectónicas y químicas definidas. Cuando está adornado con moléculas bioactivas (por ejemplo, agente de direccionamiento de células p e inhibidor del estrés OER) a través de grupos químicos periféricos, los conjugados de dendrímero se pueden convertir en nanomateriales que poseen propiedades de unión con los receptores afines. Se conocen numerosos métodos en la técnica para adornar dendrímeros con moléculas bioactivas y se puede hacer referencia a este respecto en Liu et al. (2012, Interface focus 2(3):307-24) para una revisión ilustrativa.

7. Composiciones

Según la presente invención, los agentes terapéuticos descritos en la presente memoria pueden mejorar la función del ER de las células p pancreáticas, mejorar la biosíntesis de insulina, aumentar la tolerancia a la glucosa, modular la expresión de genes reguladores del estrés oxidativo, reducir el estrés inducido por lípidos, glucosa, citocinas inflamatorias o ROS ambientales, por ejemplo, mediante la regulación anterior mediada por STAT1 y STAT3 de los genes antioxidantes y la supresión de los genes que inducen el estrés oxidativo, reducir el estrés del E^r , promover la secreción de insulina eficaz de alta calidad, restaurar la homeostasis de la glucosa y/o mejorar la sensibilidad a la insulina periférica. En consecuencia, se propone que estos agentes terapéuticos serán útiles para el tratamiento de trastornos metabólicos, incluyendo prediabetes, diabetes (tipo I o tipo II), síndrome metabólico, obesidad, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), dislipidemia diabética, hiperlipidemia, hipertensión, hipertrigliceridemia, acidemia hipergrasa e hiperinsulinemia.

Los agentes terapéuticos descritos en la presente memoria, se pueden administrar a un paciente solos o en composiciones farmacéuticas en las que se mezclan con un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. La elección del vehículo dependerá generalmente de si los agentes terapéuticos se van a administrar en forma sólida, líquida o de aerosol, y si necesitan ser estériles para dichas vías de administración como la inyección. Los agentes terapéuticos se pueden administrar por vía intravenosa, intradérmica, transdérmica, intratecal, intraarterial, intraperitoneal, intranasal, intravaginal, intrarrectal, tópica, intramuscular, subcutánea, mucosa, oral, tópica, local, por inhalación (por ejemplo, inhalación de aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada bañando las células diana directamente, mediante un catéter, mediante un lavado, en cremas, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas), o por otro método o cualquier combinación de los anteriores como sería conocido por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18 th Ed. Mack Printing Company, 1990). En realizaciones específicas, los agentes terapéuticos se administran sistémicamente, adecuadamente mediante inyección.

Los agentes terapéuticos pueden formularse en una composición en forma de base libre, neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, aquellas formadas con los grupos amino libres de una composición proteínica, o que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o hierro; o bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como las formuladas para administraciones parenterales tales como soluciones inyectables o aerosoles para administración a los pulmones, o formuladas para administraciones alimentarias tales como cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en la presente invención incluyen composiciones en las que los agentes terapéuticos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr su propósito previsto. Para cualquier agente terapéutico utilizado en los métodos de tratamiento de la presente invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración circulante que incluya la IC50 como se determina en el cultivo celular (por ejemplo, la concentración de un agente de prueba, que alcanza la mitad de la inhibición máxima del estrés OER de células p o de un polipéptido inductor del estrés OER de células p (por ejemplo, IL-23, IL-24, etc.). Dicha información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichos fármacos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que muestran grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivos celulares y estudios en animales se pueden usar para formular un intervalo de dosificación para uso en humanos. La dosificación de dichos compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden ser elegidas por el médico individual en vista de la condición del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p1).

En general, la dosis de agente terapéutico administrada a un paciente debe ser suficiente para lograr una respuesta beneficiosa en el paciente a lo largo del tiempo, tal como una mejora en la función del ER de células p pancreáticas, una mejora en la biosíntesis de insulina, un aumento de la tolerancia a la glucosa, una modulación beneficiosa de la expresión de genes reguladores del estrés oxidativo, reducción del estrés inducido por lípidos, glucosa, citocinas inflamatorias o ROS ambientales, por ejemplo, mediante la regulación anterior mediada por STAT1 y STAT3 de genes antioxidantes y la supresión de genes inductores de estrés oxidativo, reducción del estrés del ER, aumento de la secreción de insulina eficaz de alta calidad, restauración de la homeostasis de la glucosa y/o aumento de la sensibilidad a la insulina periférica. La cantidad de fármaco(s) a administrar puede depender del sujeto a tratar incluyendo la edad, sexo, peso y estado general de salud del mismo. A este respecto, las cantidades precisas del fármaco o fármacos a administrar dependerán del criterio del médico. Para determinar la cantidad eficaz del fármaco que se administrará en la modulación de la diabetes tipo 2, el médico puede evaluar los niveles tisulares o celulares de una citocina moduladora del estrés, los niveles de glucosa, los niveles de HbA1c, los niveles de insulina, la presión arterial, los niveles de lipoproteína de alta densidad (HDL), niveles de triglicéridos, niveles de ácido úrico, pérdida de peso etc. En cualquier caso, los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las dosis adecuadas de los fármacos de la invención.

La cantidad de dosificación y el intervalo pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles plasmáticos del agente activo que sean suficientes para estimular o mantener la inhibición o reducción del estrés OER de células p. La dosificación usual para pacientes para la administración sistémica varía de 0,1 a 2000 mg/día, comúnmente de 1 a 250 mg/día y típicamente de 10 a 150 mg/día. Expresado en términos del peso corporal del paciente, las dosis habituales varían de 0,02 a 25 mg/kg/día, comúnmente de 0,02 a 3 mg/kg/día, típicamente de 0,2 a 1,5 mg/kg/día. Expresado en términos de áreas de superficie corporal del paciente, las dosis habituales varían de 0,5 a 1200 mg/m2/día, comúnmente de 0,5 a 150 mg/m2/día, típicamente de 5 a 100 mg/m2/día.

A la luz de la abundancia del receptor de IL-22 en la superficie celular de una célula p, en realizaciones en las que el inhibidor del estrés OER es IL-22, la composición farmacéutica se administra a un sujeto a una concentración de entre alrededor de 0,02 a alrededor de 0,1 mg/kg/día (1,25-6 nmoles/kg/día). Esto es sustancialmente inferior a las dosis habituales de dichos agentes terapéuticos y, por lo tanto, los efectos secundarios negativos asociados con la administración de IL-22, o los efectos secundarios imprevistos del agente de direccionamiento, no aparecerían con esta dosis baja.

En algunas realizaciones, la eficacia terapéutica se establece o controla por determinación el estrés del ER. A este respecto, los marcadores de estrés del ER y los métodos para medirlos se han identificado previamente y son conocidos en la técnica (véase, Iwawaki et al., 2004). Por ejemplo, el análisis del empalme de mRNA de Xbp1 , la translocación nuclear de ATF6, la fosforilación de eIF2a y el ensayo de Griess son todos ensayos adecuados para determinar el estrés del ER (véase, Cunha et al., 2008). Estos marcadores de estrés del ER pueden medirse utilizando cualquier técnica conocida en la técnica para medir los niveles de mRNA, los niveles de proteína, la actividad de la proteína o el estado de fosforilación. Las técnicas ejemplares para medir los marcadores del estrés del ER incluyen análisis de transferencia western, ELISA, análisis de transferencia Northern, inmunoensayos, análisis de PCR cuantitativo y ensayo de actividad enzimática (para una descripción más detallada de estas técnicas, véase, Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. By Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)). Los niveles de marcadores del estrés del ER pueden determinarse a partir de cualquier célula del cuerpo del sujeto. En ciertas realizaciones, las células son células de una célula p pancreática. Las células se pueden obtener de cualquier manera, incluyendo la biopsia o la escisión quirúrgica. El estrés oxidativo se puede medir mediante ensayos químicos que evalúan la presencia especies de oxígeno reactivo o de nitrógeno reactivo tales como, pero no limitado a, O²-, H²O² , NO, OH y ONOO-, o metabolitos de los mismos. Estos ensayos se pueden aplicar a células p cultivadas, islotes pancreáticos cultivados o muestras de tejido, incluyendo secciones histológicas. Otra forma de determinar la especificidad tisular de los inhibidores del estrés OER que incorporan, por ejemplo, IL-22 o IL-10 es determinar los cambios relativos en la fosforilación de STAT1 y STAT3 en las células p pancreáticas frente a otro tipo de células que expresan IL-22R1 en el epitelio intestinal, epitelio respiratorio, epitelio cutáneo e hígado. El direccionamiento exitoso al inhibidor del estrés OER estará acompañado por un aumento en la proporción de fosforilación de STAT1/3 entre las células p y los otros tipos de células que expresan IL-22R1 frente a la IL-22 nativa.

Siguiendo, por ejemplo, la progresión de una enfermedad asociada con el estrés OER, o la eficacia de la presente invención en la terapia, se pueden determinar los niveles de uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis marcadores del estrés OER. En ciertas realizaciones, se determina el nivel de solo un marcador del estrés OER. En otras realizaciones, se determinan los niveles de al menos dos marcadores del estrés OER. En aún otras realizaciones, se determinan los niveles de al menos tres marcadores del estrés OER.

En algunas realizaciones, los agentes terapéuticos de la presente invención se administran simultáneamente con uno o más agentes auxiliares o tratamientos que son conocidos o aprobados para el tratamiento de un trastorno metabólico. Por ejemplo, a un individuo que es obeso se le puede administrar una composición de la invención además de otra terapia para la obesidad. Las terapias adicionales para la obesidad incluyen terapia dietética, terapia física (ejercicio), terapia con fármacos, cirugía y terapia conductual, por ejemplo. Las terapias farmacológicas contra la obesidad ejemplares incluyen, por ejemplo, Xenical Orlistat®, fentermina, sibutramina (Meridia®), ATL-962, AJ9677, L750355, CP331648, topiramato, axokina, dexanfetamina, fenilpropanolamina, famoxina o mazindol. Las cirugías ejemplares incluyen la liposucción y el bypass gástrico, por ejemplo.

Para personas con diabetes, por ejemplo, compuestos adicionales ejemplares para la terapia incluyen uno o más de los siguientes: metformina, gliburida, glimepirida, gliburida, glipirida, glipizida, clorpropamida, gliclazida, acarbosa, miglitol, pioglitazona, troglitazona, dapagliflozina, rosiglitazona, sitagliptina, Avandaryl (rosiglitazona glimepirida), Avandamet (rosiglitazona y metformina), Duetact (pioglitazona y glimepirida), Glucovance (gliburida/metformina), Metaglip (glipizida metformina), insulina, GI-262570, isaglitazona, taspoglutida, albiglutida, JTT- 501, NN-2344, L895645, YM-440, R-119702, AJ9677, repaglinida, nateglinida, KAD1129, APR-HO39242, GW-409544, KRP297, AC2993, Exendina-4, liraglutida, LY307161, NN2211 o LY315902, Vildagliptin, inhibidor de la glucosidasa, inhibidores del co-transportador de sodio-glucosa tipo 2 (SGLT2) tal como la canaglifozina y la pramlintida. Otras terapias para la diabetes incluyen una mejora en la dieta y el ejercicio.

Para personas con niveles elevados de triglicéridos o ácidos grasos, los compuestos adicionales ejemplares para la terapia incluyen uno o más agentes moduladores de lípidos tal como, pero no limitado a, pravastatina, lovastatina, simvastatina, atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, nisvastatina, ZD-4522, fenofibrato, gemfibrozilo, clofibrato, implitapida, C^p -529,414, avasimiba, TS-962, MD-700 o LY295427.

8. Usos terapéuticos

La presente invención proporciona agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas como se describió anteriormente para su uso en la mejora de la función del ER de células p pancreáticas, la mejora de la biosíntesis de insulina, el aumento de la tolerancia a la glucosa, la modulación de la expresión de genes reguladores del estrés oxidativo, la reducción del estrés inducido por lípidos, glucosa, citocinas inflamatorias o ROS ambientales, por ejemplo, mediante la regulación anterior mediada por STAT1 y STAT3 de genes antioxidantes y/o la supresión de genes inductores del estrés oxidativo, la reducción del estrés del ER, la promoción de la secreción de insulina eficaz de alta calidad, la restauración de la homeostasis de la glucosa y/o la mejora de la sensibilidad periférica a la insulina.

Por lo tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas como se describe anteriormente para su uso en la mejora de la función del ER de células p pancreáticas en una célula p, que comprende poner en contacto la célula p con una cantidad de un agente terapéutico que mejora la función del ER de células p pancreáticas como se ha descrito ampliamente anteriormente y en otras partes de la presente memoria.

En algunas realizaciones, la invención proporciona agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas como se describe anteriormente para su uso en la mejora de la biosíntesis de insulina en una célula p, que comprende poner en contacto la célula p con una cantidad de un agente terapéutico que mejora la biosíntesis de insulina como se describe ampliamente anteriormente y en otros lugares de la presente memoria.

En algunas realizaciones, la invención proporciona agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas como se describe anteriormente para su uso en la modulación de la expresión de los genes reguladores del estrés oxidativo, que comprende poner en contacto la célula p con una cantidad de un agente terapéutico que modula la expresión del gen regulador del estrés oxidativo como se describe ampliamente anteriormente y en otras partes de la presente memoria.

En algunas realizaciones, la invención proporciona agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas como se describe anteriormente para su uso en la reducción del estrés inducido por lípidos, glucosa, citocinas inflamatorias o ROS ambientales, por ejemplo, mediante la regulación anterior mediada por STAT1 y STAT3 de genes antioxidantes y/o la supresión de genes inductores del estrés oxidativo en una célula p, que comprende poner en contacto la célula p con una cantidad de un agente terapéutico como se describe ampliamente anteriormente y en otras partes de la presente memoria, que es efectivo para reducir ese estrés.

En algunas realizaciones, la invención proporciona agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas como se describió anteriormente para su uso en la reducción del estrés del ER en una célula p, que comprende poner en contacto la célula p con una cantidad de un agente terapéutico que reduce el estrés del ER como se describe ampliamente anteriormente y en otra parte de la presente memoria.

En algunas realizaciones, la invención proporciona agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas como se describió anteriormente para su uso en el incremento de la tolerancia a la glucosa en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de un agente terapéutico que aumenta la tolerancia a la glucosa como se describe ampliamente anteriormente y en otra parte de la presente memoria.

En algunas realizaciones, la invención proporciona agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas como se describió anteriormente para su uso en la promoción de la secreción de insulina de alta calidad de una célula p, que comprende poner en contacto la célula p con una cantidad de un agente terapéutico como se describe ampliamente anteriormente y en otra parte de la presente memoria, que es eficaz para promover esa secreción.

En algunas realizaciones, la invención proporciona agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas como se describió anteriormente para su uso en el incremento de la tolerancia a la glucosa en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de un agente terapéutico que aumenta la tolerancia a la glucosa como se describe ampliamente anteriormente y en otra parte de la presente memoria.

En algunas realizaciones, la invención proporciona agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas como se describió anteriormente para su uso en la restauración de la homeostasis de la glucosa en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de un agente terapéutico que restaura la homeostasis de la glucosa como se describe ampliamente anteriormente y en otra parte de la presente memoria.

En algunas realizaciones, la invención proporciona agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas como se describió anteriormente para su uso en la mejora de la sensibilidad a la insulina en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de un agente terapéutico que mejore la sensibilidad a la insulina como se describe ampliamente anteriormente y en otra parte de la presente memoria.

En algunas realizaciones, la invención proporciona agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas como se describió anteriormente para su uso en la estimulación o mejora de la pérdida de peso en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de un agente terapéutico que estimula o mejora la pérdida de peso como se describe ampliamente anteriormente y en otra parte de la presente memoria.

Según la presente invención, se propone que estos agentes terapéuticos serán útiles para tratar trastornos metabólicos, incluyendo prediabetes, diabetes (tipo I o tipo II), síndrome metabólico, obesidad, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), dislipidemia diabética, hiperlipidemia, hipertensión, hipertrigliceridemia, acidemia hipergrasa e hiperinsulinemia. Por consiguiente, la presente invención proporciona agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas como se describió anteriormente para su uso en el tratamiento de un trastorno metabólico en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agente terapéutico como se describe ampliamente anteriormente y en otra parte de la presente memoria.

En particular, a un individuo se le puede dar una o más composiciones de la presente invención y se evalúa al individuo para una mejora en al menos un síntoma del trastorno metabólico. Por ejemplo, en realizaciones particulares cuando el trastorno metabólico es la obesidad, se puede determinar una mejora en la obesidad durante y/o después del tratamiento con una o más composiciones de la invención. Una mejora en la obesidad puede medirse por cualquier medio estándar, pero la mejora en la obesidad se mide mediante la medición del peso, la medición del índice de masa corporal (BMI) y/o la medición del tamaño de las partes del cuerpo (tal como la medición de la cintura), por ejemplo. Los métodos ejemplares para calcular el BMI incluyen dividir el peso corporal de una persona en kilogramos por su altura en metros al cuadrado (peso [kg] altura [m]2). Por ejemplo, para los caucásicos, un BMI de 30 o más se considera obesidad y un BMI entre 25 y 29,9 se considera sobrepeso.

Un individuo con diabetes se puede probar para una mejora después de la administración al individuo de la terapia de la invención. En una realización específica, el control de la diabetes se realiza mediante un análisis de sangre. Por ejemplo, el análisis de sangre puede medir la química de A1C. Cuanto mayor sea el nivel de azúcar en la sangre, mayor será el nivel de A1C. La American Diabetic Association recomienda que los diabéticos mantengan una A1C de menos del 7,0 % para reducir las complicaciones asociadas con la diabetes. (La American Association of Clinical Endocrinologists recomienda un 6,5 % o menos).

En algunos casos, se miden el colesterol (incluyendo el colesterol HDL y/o LDL) y/o los triglicéridos, por ejemplo, por medios estándar en la técnica. En casos específicos, se realiza un perfil de lipoproteínas en ayunas, por ejemplo, por medios estándar en la técnica.

Con el fin de que la invención pueda entenderse fácilmente y llevarse a la práctica, ahora se describirán realizaciones preferidas particulares por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1

IDENTIFICACIÓN DE CITOCINAS QUE IMPULSAN EL ESTRÉS DEL ER

La deficiencia específica de células p de un factor de transcripción de respuesta a proteínas desplegadas (UPR) crítico, Xbp1, disminuye la secreción de insulina, altera el procesamiento de proinsulina y aumenta la proinsulina sérica, lo que da como resultado hiperglucemia e intolerancia a la glucosa, fenocopiando la T2D. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que el estrés del ER inducido por la inflamación sustenta la disfunción de las células p en T2D y afecta la calidad y la cantidad de insulina secretada. El plegamiento incorrecto de proteínas activa la endorribonucleasa IRE-1 que empalma específicamente el mRNA del Xbp1 , y por lo tanto el emplame-Xbpl es una medida directa del estrés en UPR y ER.

El cribado de un panel de citocinas proinflamatorias utilizando el indicador ERAI de empalme Xbp1 transfectado en células p MIN6N8 murinas, identificó varias citocinas como inductoras del estrés del ER. Específicamente, se determinó que IL-23, IL-24 e IL-33 son potentes inductores del estrés del ER, con una menor respuesta de estrés inducido por IL-1 p, MIP-2a, IL-17A e IFN-^y e IFN-p ( Figura 1A).

Se demostró usando inhibidores farmacológicos que cada una de estas citocinas induce estrés del ER por distintos mecanismos. IL-23 actúa a través de STAT3, IL-24 a través de STAT1 e IL-33 a través de STAT1 y NF^kB. Todas las citocinas que inducen estrés en el ER desencadenan la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y/u óxido nítrico (NO) (Figura 1C). Los inhibidores farmacológicos mostraron que las diversas citocinas inducían el estrés del ER a través del estrés oxidativo con una inhibición casi completa del estrés del ER con una combinación de GSH, SOD1 y L-NMMA. El estrés del ER se generó mediante la activación posterior de una variedad de factores de transcripción, por ejemplo, IL-23 a través de STAT3, IL-24 a través de STAT1 e IL-33 requiere tanto STAT5 como NFkB (Véase, a continuación la Tabla 3). Por lo tanto, múltiples citocinas inducen estrés del ER clásico en células p mediante la inducción del estrés oxidativo que implica tanto especies de oxígeno reactivas como de nitrógeno reactivas.

Tabla 3

Aunque no se había considerado anteriormente que estas citocinas estuvieran implicadas en la fisiopatología pancreática en la T2D, la expresión de todos los genes de citocinas estresantes del ER aumenta en el páncreas de ratones obesos con una dieta alta en grasas (HFD), como se muestra en la Figura 2. IL -24 e IL-33 se encuentran entre los 20 genes más altamente regulados en la diabetes tipo 2 humana, lo que demuestra su relevancia para la enfermedad humana.

El aumento del estrés del ER pancreático en ratones diabéticos obesos coincide con el aumento de la proinsulina sérica, como se muestra en las Figuras 1E-H. La localización de la chaperona del estrés del ER, Grp78, mostró que la mayor parte del estrés del ER se produce en las células p y a altamente secretoras (véase, Figura 1I), y se acompaña de una disminución en el contenido de insulina de las células p. Además, se observó una recolocación de algunas células a desde la periferia hacia el centro de los islotes.

Materiales y métodos

EVALUACIONES IN VITRO DEL ESTRÉS DEL ER/OXIDATIVO

Las células MIN6N8 se mantienen en línea con los protocolos estándar. Las células se transfectan con el plásmido del indicador ERAI (F-XBP1ADBD-Venus), o el plásmido ATF6-GFP (ADGENE), utilizando LIPFECTAMINE 2000 según las instrucciones del fabricante.

Las células MIN6N8 que comprenden el plásmido del indicador ERAI muestran una fluorescencia insignificante en ausencia de un factor estresante del ER. En la inducción de estrés del ER, el empalme delmRNA delXBP2 por IRE1a da como resultado la traducción de Venus, pero no una forma activa de XBP1. Se midió la fluorescencia (excitación: 485 nm; emisión: 520 nm) utilizando el lector de placas POLARstar Omega y las células se trataron 48 h después de la transfección. Los resultados se normalizan con la expresión de Gapdh como veces de células de control tratadas con vehículo (Con).

La activación de ATF6 se evaluó de la siguiente manera: el área en píxeles por milímetro cuadrado teñida conjuntamente con ATF6 y DAPI (azul y verde), y la tinción total de ATF6 (verde) se determinó en 5 campos de visión para cada sección (n = 6 para cada condición) usando el software IMAGEJ versión 1.45s. Los datos se presentan como el porcentaje de co-fluorescencia de ATF6 y DAPI con respecto a la fluorescencia total de ATF6. La fosforilación de Ser-51 de eiF2 a se determinó mediante un ensayo AlphaScreen según las instrucciones del fabricante (PERKIN-ELMER). El método del reactivo de Griess se realizó según las instrucciones del fabricante (MOLECULAR PROBES) para evaluar los niveles intracelulares de óxido nítrico. Se utilizó el ensayo de diacetato de 5-(y-6-)-carboxi-2,7-diclorofluoresceína (DCFDA) para determinar los niveles intracelulares de H²O² como se describió anteriormente (Sakon et al., 2003). Las células se trataron con glucosa o citocinas recombinantes a las concentraciones indicadas en las leyendas de las figuras, o con tapsigargina 5 pM (SIGMA-ALDRICH) o tunicamicina 10 pM (SIGMA-ALDRICH) o palmitato 0,1-0,5 mM (SIGMA-ALDRICH) para los tiempos indicados en las leyendas. ROS se inhibieron usando la sonda fluorescente permeable a las células de dihidroetidio (DHE) (SIGMA-ALDRICH). Las células MIN6N8 sembradas a 2 x 106/mL se incubaron con DHE 3 pM y posteriormente se trataron con DMSO (control), IL-2350 ng/mL durante 30 minutos ± 50 mg/mL de IL-22 al mismo tiempo o 30 minutos antes que IL-23.

Para inhibir los factores de transcripción se utilizaron los siguientes inhibidores específicos (y concentraciones):

Tabla 4

ENSA YO DE CITOCINAS PARA DETERMINAR EL IMPACTO EN EL ESTRÉS DEL ER

Las células MIN6N8 se expusieron a un panel de citocinas para determinar el efecto de cada citocina sobre el estrés del ER. El estrés del ER se midió utilizando el método descrito anteriormente. Específicamente, las células se expusieron a un tratamiento de 24 horas de uno cualquiera de glucosa 1,6 mM (glucosa alta), H²O²10 pM, ácido palmítico 0,5 mM o citocinas 50 ng/mL; o un tratamiento de 6 horas con tunicamicina 10 pg/mL o tapsigargina 5 pM. La tunicamicina se elimina después de 6 horas ya que el tratamiento prolongado indujo la muerte celular.

ENSA YO DE CITOCINAS PARA DETERMINAR EL IMPACTO EN EL ESTRÉS DEL ER

Las células MIN6N8 se expusieron a un panel de citocinas para determinar el efecto de cada citocina sobre el estrés del ER. El estrés del ER se midió utilizando el método descrito anteriormente. Específicamente, las células se expusieron a un tratamiento de 24 horas de uno cualquiera de glucosa 1,6 mM (glucosa alta), H²O²10 pM , ácido palmítico 0,5 mM o citocinas 50 ng/mL; o un tratamiento de 6 horas con tunicamicina 10 pg/mL o tapsigargina 5 pM. La tunicamicina se elimina después de 6 horas ya que el tratamiento prolongado indujo la muerte celular.

PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL (QRT-PCR)

Las muestras de tejido se congelaron instantáneamente y se homogeneizaron en TRIZOL usando FASTPREP (MP BIOMEDICAL). El RNA se aisló usando el kit de aislamiento High Pure RNA (ROCHE), seguido de la síntesis de cDNA usando iScript (BIORAD) que contenía oligo(dT) y hexámeros aleatorios. Se usó Q^pC^r SYBR Green (INVITROGEN) para la PCR cuantitativa usando un HT7900 (ABI SYSTEMS). RoX se utilizó como referencia de normalización. Los resultados se analizaron utilizando el software SDS (versión 2.3) (ABI SYSTEMS). Las eficiencias de los cebadores se determinaron usando diluciones de cDNA y diluciones de cebadores para los genes de interés. Todos los datos se normalizaron frente al gen de limpieza, Gapdh, y se expresaron como una diferencia de veces con respecto a la media de las muestras de control relevantes.

Los cebadores para el análisis de PCR fueron los siguientes:

sXBP-1:

directa - 5' CTGAGTCCGCAGCAGGTG 3' [SEQ ID NO: 192];

inversa - 5' TGCCCAACAGGATATCAGACT 3' [SEQ ID NO: 193];

GRP78:

directa - 5'CACAGTGGTGCCTACCAAGA 3' [SEQ ID NO: 194];

inversa - 5' TGATTGTCTTTTGTCAGGGGT 3' [SEQ ID NO: 195].

Matriz de estrés oxidativo: Se comparó el cDNA de células MIN6N8 tratadas con DMSO o IL-2250 ng/mL usando la RT2 Profiler PCR Array del estrés oxidativo (QIAGEN, PAMM-065Z). Los datos se analizaron usando el software de análisis de datos de RT2 Profiler PCR Array.

CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

El RNA total se extrajo de tejidos animales mediante homogeneización en TRIzol y se separó mediante separación de fases con cloroformo. El RNA se purificó utilizando el kit de aislamiento High Pure RNA (ROCHE) según las instrucciones del fabricante, incluyendo el tratamiento con DNASE. La pureza de extracción se evaluó mediante NANODROP, asegurando el valor de A^260/280 esperado para el RNA entre 1,8 y 2,0. La transcripción inversa se realizó en 1 gg de RNA usando una mezcla de reacción 5x ISCRIPT y transcriptasa inversa de ISCRIPT (BIORAD). Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) para cuantificar la expresión de la homología de Src del gen PVM (SH), usando secuencias de cebadores que abarcan exones específicos y amplificados con la polimerasa SYBR Premix Ex TAQ II (TAKARA). Toda la expresión génica se cuantificó por duplicado utilizando un sistema de PCR en tiempo real Viia 7 (APPLIED BIOSYSTEMS) y los cambios relativos en veces se calcularon utilizando el método 2-ññCt , en comparación con la media de ratones nativos no infectados después de la normalización del gen de limpieza de p-actina ACTB.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Se potenciaron los experimentos in vitro para ver un tamaño del efecto de desviación estándar de 2,0 en una variedad de medidas de resultado primarias. El análisis estadístico se realizó utilizando GRAPHPAD PRISM versión 5.01 (GRAPHPAD SOFTWARE, INC). Las diferencias entre los grupos se evaluaron utilizando pruebas paramétricas después de la confirmación de una distribución normal mediante gráficos de probabilidad (ANOVA de una vía con post-test o, en su caso, una prueba t de Student de dos colas, como se describe en las leyendas de las figuras individuales).

EJEMPLO 2

IDENTIFICACIÓN DE CITOCINAS QUE INHIBEN EL ESTRÉS DEL ER Y/O EL ESTRÉS OXIDATIVO

La exposición de las células p a combinaciones de citocinas por pares reveló que la IL-22 y la IL-10 inhiben el estrés del ER, detectado por el gen indicador ERAI para el empalme del mRNA de Xbp1, iniciado por citocinas o el inhibidor de la N-glicosilación, tunicamicina (véase, Figura 2A). IL-22 es el supresor más potente con una eficacia tan baja como alrededor de 5 ng/mL en células p de MIN6.

La IL-22 también inhibe el estrés del ER inducido con el ácido graso libre (FFA), el ácido palmítico (véase Figura 2B), que induce el estrés oxidativo y del ER de las células p. Sin embargo, la IL-22 sola no parece activar la UPR cuando se induce el estrés del ER con tapsigargina, que altera el Ca2+ del ER, IL-22 aumenta la activación de UPR (véase, Figura 2C). Se requiere el inhibidor de los factores de transcripción tanto STAT1 como STAT3 para bloquear la supresión mediada por IL-22 o el inhibidor del estrés del ER (véase Figura 2D).

El páncreas tiene la expresión tisular más alta del receptor de IL-22 (IL-22R1), particularmente en las células p y a, y la inhibición de IL-22 del estrés del ER de células p está completamente inhibida por un anticuerpo de IL-22R1 (véase, Figura 2D).

Se planteó la hipótesis de que la IL-22 prevenía el estrés del ER inducido por citocinas al inhibir el estrés oxidativo. La oxidación inducida por IL-23 del colorante fluorescente dihidroetidio (DHE), que se activa por O² , progresivamente durante 30 minutos y la exposición concomitante a IL-22 redujo el grado de oxidación y el número de células afectadas. En particular, una exposición previa de 30 minutos a IL-22 evitó por completo la oxidación de DHE (véase Figura 3A). IL-22 reprime la producción/acumulación de ROS y NO en células p expuestas a citocinas inflamatorias, FFA, tunicamicina o H²O² , y disminuyó la producción basal de NO en células no estresadas (véanse las Figuras 3B, C y la Figura 4).

Dado que la IL-22 actúa a través de factores de transcripción, los cambios en la expresión de los genes de la vía del estrés oxidativo en células p no estresadas tratadas con IL-22 se evaluaron utilizando una matriz de RT-PCR (véase Figura 5A). Los resultados confirmaron los genes candidatos por qRT-PCR (véase, Figura 5B). IL-22 regula posteriormente tres genes clave que inducen el estrés oxidativo: Nos2 (óxido nítrico sintasa-2/iNos, cataliza la producción de NO), Hsp90ab1 (proteína de choque térmico implicada en la producción de peroxinitrito), y Fth1 (cadena pesada de ferritina 1, un vehículo de Fe3+).

Al mismo tiempo, la IL-22 regulaba con anterioridad los genes antioxidantes gpx5 (glutatión peroxidasa-5), Prdx5 (peroxirredoxina-5), y Sod2 (superóxido dismutasa-2), las ciclooxigenasas Ptgsly Ptgs2 (COX-1 y COX-2), y Cyba (el componente regulador p22phox de la NADPH-oxidasa). Por lo tanto, la IL-22 reguló múltiples genes implicados en la vía del estrés oxidativo, lo que explica su capacidad para suprimir tanto el estrés oxidativo como el del ER.

Materiales y métodos

Los experimentos para evaluar estrés del ER y/o el estrés oxidativo, y los métodos de qRT-PCT y/o la cuantificación de la expresión génica se realizaron como se describe en el Ejemplo 1. El empalme de Xbp1 se evalúa mediante qRT-PCR, con normalización contra gapdh, y la expresión se presentó como veces de las células de control tratadas con vehículo.

NORMALIZACIÓN DEL ESTRÉS DEL ER MEDIANTE COTRATAMIENTO O PRETRATAMIENTO CON IL-22

Para determinar si la IL-22 fue suficiente para prevenir el aumento del estrés oxidativo causado por factores estresantes conocidos, por ejemplo, dihidroetidio (DHE), se expusieron células MIN6N8 a 50 ng/mL de IL-23 durante 30 minutos ± 50 ng/mL de IL-22 al mismo tiempo, o 30 minutos antes del tratamiento con IL-23. La generación de superóxido se midió usando DHE, que emite fluorescencia roja y se une al DNA después de la oxidación. Se utilizaron imágenes de lapso de tiempo (3 fotogramas/min durante 30 minutos) para determinar la formación de superóxido (conversión de DHE/fluorescencia) en las células después del tratamiento. Se capturó la fluorescencia de DAPI para visualizar los núcleos.

La concentración de ROS y NO en células MIN6N8 tratadas con glucosa 16,6 mM (glucosa alta), H²O²10 pM, ácido palmítico 0,5 mM o 50 ng/mL de citocinas ± 50 ng/mL de IL-22 al mismo tiempo o 30 minutos antes del tratamiento estresante.

EJEMPLO 3

EL ESTRÉS DEL ER AGUDO Y CRÓNICO INDUCIDO Y LA SUPRESIÓN DE LA SECRECIÓN DE INSULINA ES PREVENIDA POR IL-22

ESTRÉS AGUDO DEL ER

En islotes murinos sanos, el tratamiento con tunicamicina, tapsigargina, IL-1 p, IL-23 e IL-24 induce el mRNA del empalme de Xbpl y Hspa5 (Grp78, chaperona del ER regulada anteriormente durante el estrés del ER) (Figura 6A). Estos agentes de estrés del ER redujeron la secreción de insulina por parte de los islotes en respuesta tanto a la glucosa como a la glucosa más GLP-1, mientras que aumentaba la secreción inapropiada de proinsulina (Figuras 6B,C). El co-tratamiento con IL-22 suprime el estrés oxidativo agudo de los islotes provocado por el estrés del ER y restaura la secreción de insulina apropiada estimulada por la glucosa y la glucosa más GLP-1 (Figuras 6B,C).

OBESIDAD INDUCIDA POR DIETA ALTA EN GRASA (HFDIO)

En islotes murinos sanos el tratamiento ex-vivo con el anticuerpo bloqueador de IL-22R1 aumentó el estrés del ER, disminuyó la expresión del gen antioxidante, aumentó Nos2 (Figura 7A), y disminuyó GSIS (Figura 7B). Los islotes de ratones con obesidad inducida por una dieta alta en grasas (HFDIO) mostraron estrés del ER y disminuyó la regulación anterior de los genes antioxidantes Nos2 (Figura 7A). El cultivo con IL-22 redujo el estrés del Er , aumentó la expresión de genes antioxidantes y disminuyó Nos2 (Figura 7A).

En contraste con el estrés agudo del ER, los islotes de HFDIO, que están adaptados al estrés crónico del ER, mostraron un aumento de GSIS. La hipersecreción de insulina se acentuó con el cultivo en el anticuerpo de IL-22R1 y volvió a los niveles de los islotes no obesos después del cultivo en IL-22 (Figura 7B). Los islotes de HFDIO, pero no los islotes sanos, secretaron proinsulina, incluso en condiciones de glucosa baja, y la secreción de proinsulina cesó después del tratamiento con IL-22 (Figura 7B).

Estos experimentos demuestran que la señalización de IL-22-IL-22R1 es necesaria para la función normal de los islotes, y que la IL-22 exógena suprime el estrés crónico del ER en los islotes de HFDIO, lo que reduce el GSIS a niveles normales mientras bloquea la liberación de proinsulina.

EXPERIMENTOS DEL ESTRÉS AGUDO DEL ER

Los islotes sanos se cultivaron con 10 gg/mL de tunicamicina o 5 pM de tapsigargina ± IL-22 durante 6 horas. Como alternativa, los islotes se cultivaron en presencia de citocinas inductoras de estrés del ER ± IL-22 durante 24 horas. Después, los cultivos se cultivaron consecutivamente durante 30 minutos en glucosa 2,8 mM, glucosa 20 mM o una combinación de glucosa 20 mM y GLP-1 100 nM.

EXPERIMENTOS DE OBESIDAD INDUCIDA POR UNA DIETA RICA EN GRASAS (HFDIO)

Todos los ratones se alojaron en jaulas esterilizadas con tapa de filtro en una instalación limpia convencional. Se alimentaron ratones macho C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad ad libitum con una dieta rica en grasas que contiene el 46 % de la energía disponible como grasas saturadas, 34 % de carbohidratos, 20 % de proteínas (Speciality feeds, SF04-027). O con comida normal que contenga menos del 10 % de grasas saturadas (GOLDMIX, 126575). Las jaulas de ratones se asignaron al azar a los grupos experimentales mediante sorteo aleatorio. Los investigadores no fueron ciegos al tratamiento porque no se realizaron evaluaciones subjetivas.

MEDICIONES DE INSULINA Y PROINSULINA

La insulina total y la proinsulina se midieron en el sobrenadante de cultivos de islotes o en el suero de ratones usando kits ELISA obtenidos comercialmente de MILLIPORE y MERCODIA, respectivamente. La concentración molar de insulina se determinó restando la concentración molar de proinsulina de la insulina total molar, y después se calculó la relación sérica proinsulina:insulina.

EJEMPLO 4

CITOCINAS MODULADORAS DEL ESTRÉS DEL ER EN CÉLULAS B PANCREÁTICAS DIABÉTICAS

Aunque se encontró que las citocinas son los factores estresantes más potentes del ER de células p, IL-23, IL-24 e IL-33, no se han implicado previamente en la patogénesis de la T2D, su mRNA aumentó significativamente en las células p pancreáticas de ratones con HFDIO (Figura 8A). De manera similar, este también fue el caso en las células p recolectadas de ratones con diabetes debido a la deficiencia del receptor de leptina (Figura 8C). Los genes prooxidantes y los genes antioxidantes regulados por IL-22 aumentaron en las células p de ambos modelos murinos, lo que indica estrés oxidativo y una respuesta antioxidante consiguiente (Figuras 8B,D).

El análisis de un gran estudio de transcriptoma que comparó los islotes sanos humanos con los de un paciente con diabetes tipo 2 reveló que IL-24 e IL-33 son los genes de citocinas moduladores del estrés del ER más altamente regulados anteriormente en la diabetes tipo 2 humana. Esto demuestra la relevancia clínica de las citocinas identificadas (Tabla 5).

Tabla 5

Materiales y métodos

MODELO DE DEFICIENCIA DE LEPTINA DE DIABETES

Ratones macho diabéticos db/db C57BL/KsJ (Lepr+/+) y no diabéticos db/h C57BL/KsJ (Lepr+/-) de veinte semanas se sacrificaron y se extrajo sangre mediante punción cardíaca. Los ratones db/db desarrollan graves defectos metabólicos en el contexto de la diabetes tipo 2 (hipertensión, hiperlipidemia, obesidad, alteraciones de la insulina). Se excluyó del análisis un pequeño número de animales que murieron por razones no relacionadas con el tratamiento en estos experimentos a largo plazo. Todos los experimentos fueron aprobados por the University of Queensland Animal Experimentation Ethics Committee o the Alfred Medical Research and Education Precinct Animal Ethics Committee, y se realizaron según las pautas establecidas por the National Health and Medical Research Council of Australia.

EJEMPLO 5

LA NEUTRALIZACIÓN DE CITOCNAS INDUCTORAS DE ESTRÉS DEL ER O LA ADMINISTRACIÓN DE IL-22 MEJORA EL CONTROL GLUCÉMICO EN RATONES OBESOS

Los hallazgos in vitro sugirieron que neutralizar las citocinas estresantes del ER, o administrar IL-22, reduciría el estrés oxidativo y del ER del páncreas y mejoraría la biosíntesis de insulina en la obesidad. En ratones alimentados con HFD durante 15 semanas, dos semanas de administración de IL-22, o neutralización de anticuerpos de IL-23 o IL-24, revirtieron sustancialmente la intolerancia a la glucosa medida por una prueba de tolerancia a la glucosa i.p. (IPGTT), siendo la IL-22 la más eficaz (Figura 9A,D,G). El área bajo la curva (AUC glucosa) para la IPGTT fue 2,5 veces mayor en ratones con HFDIO y el aumento se redujo en un 42, 50 y 82 % con el tratamiento con anti-IL-23, anti-IL-24 e IL-22 , respectivamente. Podría ocurrir una mejor tolerancia a la glucosa a través de la mejora de la sensibilidad a la insulina. Sin embargo, las pruebas de tolerancia a la insulina (ITTs) demostraron que los ratones tratados tenían la resistencia a la insulina no resuelta (Figuras 9B, E, H). Las concentraciones de insulina total en suero en ayunas fueron 2,8 veces mayores en HFDIO en comparación con los ratones no obesos (Figuras 9C, F, I y Tabla 6). Las tres terapias redujeron las concentraciones de insulina total en ayunas y la AUC de la insulina, sin embargo, las AUCs fueron mayores que en los ratones alimentados con comida normal, lo que concuerda con la necesidad de más insulina para tratar la resistencia persistente a la insulina (Figuras 9C, F, I). Anti-IL-23 y, más eficazmente, IL-22 redujeron la proporción de proinsulina:insulina en suero en ayunas (Figura 9J), con IL-22 reduciendo la proinsulina sérica en un 92% (Tabla 6).

Tabla 6

Las mejoras en el control de la glucemia fueron paralelas a la disminución del estrés del ER pancreático total (Figuras 9K y 10A). La inmunotinción reveló que Grp78, que se acumula con proteínas mal plegadas, era 11,2 veces mayor en la región de células p de los islotes de HFDIO y se redujo en un 75 % después del tratamiento con IL-22 (Figura 9L y Figura 11). Las reservas de insulina de las células p disminuyeron en un 53 % en los islotes de HFDIO y volvieron a los niveles en ratones no obesos después del tratamiento con IL-22 (Figura 9L); mientras que la proinsulina aumentó 10,4 veces en HFDIO y disminuyó un 64% después del tratamiento con IL-22 (Figura 9L y Figura 11). Hubo pocos cambios en el factor de transcripción mafA , que impulsa la expresión del gen secretor de células p o la expresión del mRNA de la insulina (In2) en HFDIO o con tratamiento (Figura 10B-D). A pesar de la acumulación de proinsulina, no hubo cambios en la expresión de la prohormona convertasa que procesa la proinsulina en insulina (Figura 10E). Sin embargo, la inflamación pancreática se redujo mediante la neutralización de citocinas y los tratamientos con IL-22 (Figura 12).

Curiosamente, los ratones tratados con IL-22, pero no los ratones tratados con anticuerpos neutralizantes de IL-23 o IL-24, perdieron peso progresivamente durante el tratamiento sin cambiar el consumo de alimentos (Figura 13). Los ratones alimentados con comida normal tratados no mostraron ningún cambio significativo en el peso o las mediciones metabólicas, aunque hubo tendencias hacia concentraciones más bajas de glucosa e insulina en sangre en ayunas (Tabla 2) y una mejor tolerancia a la glucosa con IL-22 (Figura 13). La IL-22 también afecta a los hepatocitos, y en la obesidad se produce estrés del ER hepático. Mientras que el empalme de Xbp1 hepático solo aumentó ligeramente en HFDIO, Hspa5 estaba altamente regulada anteriormente y disminuyó sustancialmente después del tratamiento con anti-IL-23 y anti-IL-24 e IL-22 (Figura 14).

Materiales y métodos

HISTOLOGÍA, MICROSCOPIA DE INMUNOFLUORESCENCIA Y CUANTIFICACIÓN HISTOLÓGICA

Experimento 1 HFDIO : A partir de las 13-16 semanas de la dieta, los ratones se trataron con 20 ng/g de IL-22 recombinante murina i.p. dos veces a la semana (R&D SYSTEMS), 3 pg/g de anti-IL-23 a la semana (ELI-LILLY), 0,1 mg/ratón de anti-IL-24 a la semana (PROTEIN TECH) o 0,5 mg/ratón de anticuerpo de control del isotipo irrelevante, se sacrificaron y muestrearon.

Experimento 2 HFDIO : A partir de las 18-22 semanas de dieta, los ratones se trataron (durante 30 días) con 20 o 100 ng/g de IL-22 murina recombinante i.p. dos veces por semana (R&D SYSTEMS) o 0,1 mg/ratón de anticuerpo de control de isotipo irrelevante, se sacrificaron y muestrearon.

Se realizaron pruebas de tolerancia a la glucosa en ayunas i.p. (2 g/kg de glucosa) y pruebas de tolerancia a la insulina (0,25 U/kg de insulina; Humalog, Lilly) en los tiempos indicados en las leyendas de las figuras.

El tejido pancreático se fijó en formalina tamponada neutra al 10% y se procesó usando técnicas histológicas estándar. Se utilizaron métodos estándar de tinción inmunohistoquímica e inmunofluorescente para determinar la presencia de Grp78, insulina, glucagón, IL-22R1, proinsulina y ATF6-GFP.

El área en píxeles/mm2 se determinó para Grp78 e insulina (inmunofluorescencia) y proinsulina (inmunohistoquímica) en el núcleo del área rica en células p de 3-4 islotes por ratón (n = 6-10 ratones) usando el software IMAGEJ versión 1.45s. La imagen de células vivas en células MIN6N8 se llevó a cabo a 37°C en 5% de CO² en una cámara utilizando un microscopio OLYMPUS XCELLENCE RT.

EJEMPLO 6

LA TERAPIA PROLONGADA CON IL-22 RESTAURA LA SENSIBILIDAD A LA INSULINA DESPUÉS DE LA RESTITUCIÓN DEL CONTROL GLUCÉMICO

Para evaluar la terapia de dosis más largas y más altas en ratones con la enfermedad más avanzada, se administró IL-22 a 20 ng/g (la primera dosis del experimento) o 100 ng/g durante los últimos 30 días de una HFD de 22 semanas. El peso corporal disminuyó progresivamente a partir de una semana de tratamiento con IL-22 (Figura 15A), acompañado de cambios en la distribución del tejido adiposo con aumento de la grasa epididimal y parda (Figura 15G). Demostrando una restauración rápida del control glucémico, la concentración de glucosa en sangre alimentada al azar disminuyó a los niveles observados en ratones alimentados con comida normal dentro de los 7 días con ambas dosis de IL-22 (Figura 15B). Un IPGTT en el día 25 de la terapia mostró un control glucémico indistinguible del control de ratones no obesos (Figura 15C). En el día 16 de terapia, un ITT no mostró o mostró una mejoría modesta en la resistencia a la insulina (Figura 15D), sin embargo, en el día 29 la resistencia a la insulina había disminuido con ambas dosis de IL-22 (Figura 15E).

La medición de la insulina total en suero durante el día 25 IPGTT mostró la supresión completa de la hiperinsulinemia en ayunas y la normalización de GSIS (Figura 15F). Estas mejoras estuvieron acompañadas por la normalización de la proporción de proinsulina:insulina sérica, con una disminución de la proinsulina sérica del 97% por 100 ng/g de IL-22 (Figura 16A, Tabla 6). La mejora dependiente de la dosis en la proinsulina sérica se reflejó en disminuciones en la tinción de proinsulina y aumentos en la tinción de islotes con insulina total (Figura 16B).

Materiales y métodos

Los experimentos se realizaron como se describe en los ejemplos anteriores, siendo la intervención Experimento 2 HFDIO.

EJEMPLO 7

ISLOTES DE RATONES TRATADOS CON IL-22 MUESTRAN SECRECIÓN NORMALIZADA DE INSULINA DE ALTA CALIDAD

El cultivo de islotes de ratones obesos ex-vivo tratados con IL-22 durante 30 días demostró la corrección de la hipersecreción de insulina en respuesta a la glucosa (Figura 17A), replicando el resultado de la exposición ex-vivo a IL-22 en islotes HFD. Cuando se expuso a glucosa/GLP-1, HFD, HFD más IL-22 e islotes no obesos secretaron cantidades iguales de insulina total (Figura 17A). Sin embargo, mientras que los islotes no obesos no secretaron proinsulina detectable, los islotes de HFD secretaron proinsulina, y esto se redujo de manera dependiente de la dosis por el tratamiento in vivo con IL-22 (Figura 17B). Así, ambos tratamientos ex-vivo e in vivo con IL-22 redujeron la secreción de insulina total y proinsulina por islotes de ratones en una HFD, consistente con la mejora de la hiperinsulinemia sérica y se observó proinsulina sérica reducida in vivo.

Para evaluar la calidad funcional de la insulina se comparó la capacidad de la insulina secretada por los islotes en respuesta a glucosa/GLP-1 para estimular la absorción de desoxi-glucosa fluorescente (6-NBDG) por células 3T3 diferenciadas en adipocitos. La insulina secretada por islotes de HFDIO ex-vivo mostró una reducción del 70% en la estimulación de la absorción de 6-NBDG de los adipocitos en comparación con la insulina secretada por los islotes de ratones alimentados con comida normal. Por el contrario, sólo hubo una reducción del 11 % en la absorción de 6-NBDG por parte de los adipocitos con la insulina secretada por los islotes de los ratones tratados con 100 ng/g de IL-22 (Figura 17C). Por lo tanto, la terapia con IL-22 in vivo mejoró la eficacia de la insulina secretada.

Materiales y métodos

EXPERIMENTOS DE ABSORCIÓN DE GLUCOSA

Las células 3T3 se diferenciaron en adipocitos como se describió anteriormente, y todos los experimentos se llevaron a cabo el día 8 después de la diferenciación. Se sembraron 1x104 células en una placa negra de 96 pocillos y se cultivaron en medio de glucosa 2,8 mM libre de suero antes de la adición de insulina. Las células se trataron durante 1 hora con 2 ng/mL de insulina recombinante o insulina total de las secreciones de los islotes a 37 °C, como se describe en las leyendas de las figuras. Posteriormente, las células se incubaron con 6-(N-(7-nitrobenx-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino)-6-desoxiglucosa (6-NBDG) (MOLECULAR PROBES) durante 20 min antes de que las células se lavaran con PBS y se determinó la absorción de glucosa utilizando un lector de placas POLARstar Omega.

EJEMPLO 8

EFECTO DEL TRATAMIENTO CON IL-22 SOBRE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES REGULADORES DEL ESTRÉS OXIDATIVO Y LA REDUCCIÓN DEL ESTRÉS DEL ER Y LA INFLAMACIÓN

Los islotes de ratones con HFDIO mostraron una regulación anterior de los genes antioxidantes y Nos2, y la terapia con IL-22 aumentó aún más la expresión de genes antioxidantes y suprimió Nos2 (Figura 18A), emulando cuando las células p y los islotes se trataron con IL-22 in vitro. El estrés del ER disminuyó en islotes de ratones con HFDIO tratados con ambas dosis de IL-22, con empalme de Xbp1 indistinguible de los islotes de alimentación normal con 100 ng/g de IL-22 (Figura 18B). Aunque en el primer experimento se demostró que la IL-22 suprimía la inflamación pancreática total, una pregunta pendiente era si la supresión del estrés del E^r por parte de la IL-22 reducía la inflamación dentro de los islotes. La expresión de múltiples citocinas y quimiocinas disminuyó en islotes de HFDIO de ratones tratados con IL-22 in vivo, siendo la dosis más alta generalmente más eficaz (Figura 18C). El mRNA de MIP2a se redujo sustancialmente en los islotes de HFDIO cultivados en IL-22 (Figura 18D), en paralelo a la disminución del estrés del ER (Figura 18D). Estas observaciones son consistentes con la terapia con IL-22 en ratones obesos que interrumpe el ciclo del estrés e inflamación del ER de los islotes.

EJEMPLO 9

EFECTO DEL TRATAMIENTO CON IL-22 SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO EN ISLOTES HUMANOS CULTIVADOS IN VITRO

Basándose en estos resultados, se plantea la hipótesis de que las citocinas inflamatorias que inducen el estrés del ER en las células secretoras lo hacen como parte de las respuestas inmunitarias rápidas a la infección viral. El estrés agudo del ER induce un bloqueo mediado por PERK en la traducción de proteínas, lo que reduciría eficazmente la replicación viral. En consecuencia, dado que la IL-22 previene el estrés oxidativo y del ER inducido por citocinas en las células secretoras, incluyendo las células epiteliales bronquiales humanas primarias, se plantea la hipótesis de que la IL-22 administrada de manera exógena aumentaría la replicación viral en las células epiteliales respiratorias.

Para probar esta hipótesis, los ratones se infectaron con pneumovirus (PVM), un virus respiratorio murino similar al virus respiratorio sincitial (RSV) que infecta el pulmón humano. A ratones C57BL/6 neonatales de cinco días de edad se les administró IL-22 de ratón recombinante (rmIL-22) o un tratamiento simulado de IgG1 irrelevante. A los 7 días de edad, los ratones se infectaron con 100 PFU de PVM (i.n.) y se sacrificaron 1,5 y 6 días después de la infección. Se tomaron muestras de ratones de control nativos infectados con simulación los días 1, 5 y 6. Se extrajo tejido pulmonar y se dividió en lóbulos para el análisis histológico y la cuantificación del mRNA. El experimento se detuvo el día 6 ya que 7/9 ratones del grupo de tratamiento con rmIL-22 murieron entre los días 5 y 6 y los 2 restantes mostraron signos de sufrimiento (Figura 20A). La expresión del gen PVM medida por PCR (para cuantificar el número viral) aumentó 2,2 veces en ratones tratados con IL-22 a los 5 días después de la infección (Figura 20B). En consonancia con el aumento de la replicación viral, la lesión pulmonar también fue mayor 5 días después de la infección en los ratones tratados con IL-22, que también mostraron una puntuación de lesión pulmonar 1,7 veces mayor (Figura 20C). Además, había grandes áreas de infiltración de leucocitos en las vías respiratorias pequeñas, muy probablemente neutrófilos en los ratones tratados con IL-22 en el día 5 después de la infección (Figura 21 A). La detección inmunohistoquímica de PVM tanto en los ratones infectados de control como en los ratones infectados tratados con IL-22 mostró que PVM estaba localizado en las células epiteliales y apoyó los títulos virales más altos medidos por PCR (Figura 21B). Por lo tanto, la IL-22 administrada sistémicamente tiene el potencial de exacerbar la gravedad de algunas infecciones virales en humanos.

Junto con los riesgos asociados con la actividad funcional de la IL-22 en tejidos distintos del páncreas, dirigir directamente la IL-22 a las células p pancreáticas disminuirá la exposición a la IL-22 en la piel, el intestino y el hígado y, por lo tanto, reducirá el riesgo de efectos adversos.

Materiales y métodos

ENTORNO DE ADMINISTRACIÓN DURANTE LA INFECCIÓN VIRAL MURINA

A ratones C57BL/6 neonatales de cinco días de edad se les administraron inyecciones intraperitoneales (i.p.) de IL-22 de ratón recombinante (rmIL-22) (20 ng/g cada tres días) [R&D Systems, #582-ML/CF], o un control de tratamiento simulado de IgG1 irrelevante (12,5 pg/ratón, semanalmente) [Lilly Pharmaceuticals, LSN2404993]. A los 7 días de edad, los ratones anestesiados con isoflurano se infectaron con 100 PFU de PVM (i.n.) y se sacrificaron en 1, 5 y 6 DPI mediante sobredosis de pentobarbital de sodio (N = 2-9 ratones/grupo). Los ratones se sacrificaron el día 6 en lugar del día 7, ya que 7/9 ratones del grupo de tratamiento con rmIL-22 murieron entre los días 5 y 6 y los 2 restantes mostraron signos de sufrimiento. Se tomaron muestras de controles con infección simulada (control nativo) los días 1, 5 y 6. Se extrajo tejido pulmonar y se dividió en lóbulos para inmunohistoquímica (lóbulo izquierdo fijado en formalina al 10 % y embebido en parafina, lóbulo superior congelado en OCT (TISSUE TEK)), cuantificación del mRNA (congelación instantánea del lóbulo inferior) y cuantificación de proteínas (congelación instantánea de los lóbulos medio y post-cava).

EVALUACIÓN DE LA LESIÓN E INFLAMACIÓN PULMONAR

Los lóbulos izquierdos embebidos en parafina se seccionaron en portaobjetos Superfrost plus. Las secciones se desparafinizaron utilizando SolV21C (MURABAN) y se hidrataron usando soluciones graduadas de etanol. Las secciones se tiñeron para determinar la lesión pulmonar usando tinción con hematoxilina (SIGMA ALDRICH) y eosina (SIGMA ALDRICH) (H&E) y se montaron en cubreobjetos con Pertex (MEDITE). Se ideó un sistema de puntuación para la inflamación y la lesión pulmonar. Este sistema de puntuación evaluó la inflamación en los pequeños espacios aéreos, el intersticial peribronquiolar, el intersticial alveolar y la lesión en el epitelio de las vías respiratorias. El grado de lesión e inflamación pulmonar se puntuó a ciegas.

Las células infectadas por PVM se visualizaron mediante inmunohistoquímica utilizando anticuerpo PVM anti-ratón de conejo (policlonal a 1:8000) (ALPHA DIAGNOSTIC, PVMNP14-S). Las secciones se desparafinizaron usando xileno y se hidrataron usando etanol. La recuperación del antígeno se logró hirviendo en tampón de citrato (pH 6) durante 20 min. Luego se bloquearon las secciones con H²O² al 3%/PBS y KPL al 10%/PBS con 0,05% de Tween. El anticuerpo primario se incubó en KPL al 10 %/PBS con Tween al 0,05 % durante la noche a 4°C, se lavó y luego se incubó durante 45 min en IgG anti-conejo de burro 1:200 (JACKSON), anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante antes de reaccionar con diaminobencidina (DAKO) durante 3 min. A continuación, las secciones se contrastaron con hematoxilina, se deshidrataron en una serie graduada de etanol y se montaron en cubreobjetos con Pertex. La infección por PVM se cuantificó contando el número de células infectadas en 4-5 bronquiolos por ratón y se expresó como el número de células infectadas por longitud de epitelio bronquiolar. Todas las secciones se visualizaron en un microscopio de escáner de portaobjetos VS120-L100 (OLYM PUS) y se analizaron utilizando OlyVIA v2.4 (OLYMPUS) e IMAGEJ v1.45s.

EJEMPLO 10

EFECTO DEL TRATAMIENTO CON IL-22 SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO EN ISLOTES HUMANOS CULTIVADOS IN VITRO

Los islotes humanos expresan altos niveles de IL-22R1. Para demostrar que las citocinas inductoras o reductoras del estrés del ER tendrían efectos similares en los islotes humanos, se obtuvieron islotes pancreáticos humanos de un único donante de órganos y se cultivaron durante 2 horas en presencia de citocinas inductoras del estrés del ER o palmitato FFA, con o sin exposición previa de 30 min a IL-22. La IL-22 protegió a los islotes humanos de la producción de ROS y NO inducido por IFN-y, iL-1 p, IL-23, IL-24 y palmitato (Figura 22). En los islotes humanos, la iL-1 p indujo una mayor producción de ROS que la IL-23 y la IL-24, mientras que la IL-24, y en menor medida la IL-23, indujeron una mayor producción de NO que la IL-1 p (Figura 22). Es importante destacar que solo 2 horas de exposición a un anticuerpo bloqueador del receptor de IL-22 dieron como resultado una producción alta de ROS y NO (Figura 22), lo que demuestra que la señalización endógena de IL-22 es un componente importante de la fisiología normal de los islotes en humanos, como lo fue en ratones. Estos resultados muestran que el efecto principal de la IL-22 en las células p de ratón que dieron lugar a respuestas favorables a la terapia con IL-22 en ratones diabéticos, se replica en células humanas, lo que respalda la aplicabilidad de la terapia con IL-22 dirigida al páncreas en diabetes humanas.

Materiales y métodos

CULTIVO DE LOS ISLOTES HUMANOS

Se recuperaron islotes humanos de donantes de órganos y se colocaron en cultivo durante la noche en DMEM con glucosa 2,8 mM y FCS al 10%. Después, los islotes se lavaron y transfirieron a DMEM sin suero durante 6 h antes de los experimentos para evaluar la inducción del estrés oxidativo. A continuación, los islotes se cultivaron durante 2-24 horas en presencia de 50 ng/mL de IFNy, IL-1 p, IL-23 o IL-24, o palmitato de ácidos grasos libres a 0,5 mM, con o sin exposición a 50 ng/ mL de IL-22 comenzando 30 min antes de la introducción de las citocinas o lípidos que inducen el estrés. Para probar si la IL-22 endógena afecta a la fisiología de los islotes humanos, los islotes se trataron durante 2­ 24 horas con un anticuerpo anti-IL-22R1 (receptor) a 10 pg/mL. ROS y nitrito se midieron usando los ensayos DCFDA y Greiss como se describió anteriormente para islotes murinos, y se usó RT-PCR cuantitativa para evaluar la expresión génica.

COMPENDIO DE LOS EJEMPLOS

La evidencia experimental presentada en la presente memoria demuestra que la IL-22 es un potente supresor paracrino endógeno del estrés oxidativo y del ER en los islotes pancreáticos, y que en la hiperglucemia inducida por la obesidad la terapia con IL-22 restaura el control de la glucosa al atenuar los defectos en la biosíntesis y secreción de insulina pancreática. La IL-22 previene el estrés oxidativo y del ER en las células p pancreáticas, independientemente de si el estrés es inducido por lípidos, citocinas inflamatorias o ROS ambientales, a través de la regulación anterior mediada por STAT1 y STAT3 de genes antioxidantes y la supresión de los genes inductores del estrés oxidativo. En ratones obesos, la administración de IL-22 tuvo múltiples consecuencias fisiológicas altamente deseables, incluyendo la restauración de la tolerancia a la glucosa, la resolución de la hiperinsulinemia y la hiperproinsulinemia, la restitución de la sensibilidad a la insulina, la disminución del peso corporal y la redistribución de la grasa a depósitos saludables. Estos hallazgos demuestran que en la diabetes, la terapia con IL-22 controlará la hiperglucemia y preservará las células p, y que el direccionamiento de la IL-22 a una célula p proporcionará una terapia eficaz y evitará los posibles efectos adversos de la terapia sistémica no dirigida con IL-22. .

Aunque la expresión del elemento único del heterodímero del receptor de IL-22, IL-22R1, se expresa más altamente en el páncreas, también se observa una alta expresión en la piel, el intestino y el hígado (la expresión génica humana de GTex se muestra en la Figura 19). Sin embargo, en los experimentos descritos anteriormente, con la administración de hasta 100 pg/kg de IL-22 durante un máximo de 30 días, no se observó patología en la piel, el intestino o el hígado. Sin embargo, varias líneas de evidencia sugieren que la terapia crónica con altas dosis de IL-22 conduciría a patología en estos tejidos.

Se encuentran altas concentraciones de IL-22 en la piel durante la inflamación en la psoriasis y el antagonismo de IL-22 alivia la patología psoriásica. Las altas concentraciones de IL-22 en la piel impulsan la proliferación y se suman al desarrollo de lesiones psoriásicas, en parte mediante la regulación anterior de las serina proteasas. Se ha encontrado que las células T CD8 productoras de IL-22 están asociadas con cánceres de piel asociados con trasplantes y posiblemente contribuyan al crecimiento o desarrollo del carcinoma de células escamosas en este entorno.

En general, se cree que la IL-22 es una citocina protectora en el intestino, que refuerza la defensa de la mucosa y estimula la proliferación en el intestino durante la reparación de heridas después de un daño infeccioso. Sin embargo, se ha demostrado que las altas concentraciones crónicas de IL-22 y las bajas concentraciones de la proteína de unión a IL-22 contrarestante contribuyen a la hiperplasia y al desarrollo de tumores en el intestino en modelos animales.

Los presentes inventores encontraron que la IL-22 suprimió el estrés del ER en el hígado, y otros han reportado efectos favorables de la IL-22 en modelos de ratón de lesión hepática aguda inducida por alcohol, lesión por isquemiareperfusión, enfermedad del hígado graso, lesión hepática inducida por toxinas y en la hepatitis viral. Sin embargo, se ha reportado que la IL-22 induce la proliferación de hepatocitos y cuando se sobreexpresa IL-22 bajo el promotor de albúmina en el hígado en ratones, hubo un aumento en las tasas de cánceres de hígado inducidos por carcinógenos. La IL-22 se encuentra asociada con hepatocarcinomas humanos, y los cánceres de hígado inducidos por carcinógenos se reducen en IL-22-/- de ratón.

EJEMPLO 11

EVALUACIÓN IN VITRO DE LA EFICACIA DE LA IL-22 EN HUMANO VS EN RATÓN PARA SUPRIMIR EL ESTRÉS OXIDATIVO Y DEL ER

El experimento que utiliza las células murinas MIN6N8 presentadas en la Figura 23A demuestra que la IL-22 recombinante humana reduce el estrés del ER en las células murinas; sin embargo, se requirió ~16 veces más de IL-22 recombinante humana para tener el mismo efecto que la IL-22 recombinante de ratón. De manera similar, usando las células LS174T humanas, se requirieron concentraciones ~64 veces más altas de IL-22 recombinante de ratón para tener el mismo efecto que la IL-22 recombinante humana en la supresión del estrés oxidativo (medido por la producción de nitrito, Figura 23B).

Conclusiones: La IL-22 humana y de ratón tienen una identidad de aminoácidos del 79 % y estos experimentos muestran que tienen una eficacia reducida contra el receptor de la IL-22 de las especies alternativas. Es factible usar IL-22 humana en experimentos in vitro con células murinas y en experimentos in vivo en ratones, pero es probable que se requieran concentraciones considerablemente más altas de citocina para tener el mismo efecto que la IL-22 murina. Factores adicionales que deben ser considerados en los experimentos in vivo incluyen: (a) la IL-22 humana también puede tener una afinidad reducida por la proteína de unión a IL-22 soluble (IL-22RA2) y esto puede reducir la inactivación y aumentar eficacia in vivo; (b) el uso prolongado de IL-22 humana en ratones puede inducir una respuesta de anticuerpos que dé como resultado una eliminación más rápida y una actividad disminuida.

EJEMPLO 12

EVALUACIÓN IN VITRO DE LA PROTECCIÓN DEL ESTRÉS OXIDATIVO Y DEL ER POR EL CONSTRUCTO scFV DE IL-22-IL-22-ScaB1 HUMANO EN RELACIÓN CON IL-22

La Figura 24 muestra el estrés del ER en células MIN6N8 expuestas a palmitato, o a la IL-22 humana y de ratón recombinante y cada una de las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R y un constructo de anticuerpo de cadena sencilla de IL-22 que dirige a un antígeno de las células p (IL-22-ScaB1) a las concentraciones más altas utilizadas en los experimentos paralelos. Como era de esperar, el palmitato indujo el estrés del ER pero la IL-22 de ratón recombinante, la iL-22 humana, las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R, MPBS-50, MPBS-51 y MPBS-52 (véase Figura 36) y la proteína de fusión IL-22-ScaB1 (véase, Figura 34) no provocaron el estrés en el ER.

La Figura 25A muestra la protección frente al estrés del ER en células p MIN6N8 murinas expuestas concomitantemente a palmitato e IL-22 humana o las proteínas de fusión del ligando 3 IL-22-GLP-1R. MBPS-50 inhibió el estrés del ER de manera dependiente de la dosis con una eficacia similar a una concentración molar equivalente de IL-22 humana. MPBS-51 no suprimió eficazmente el estrés del ER en ninguna de las concentraciones probadas. MPBS-52 suprimió eficazmente el estrés del ER, pero mostró una curva de titulación algo inusual con menor eficacia que la IL-22 humana en concentraciones altas y mayor eficacia en concentraciones más bajas.

La Figura 25b muestra la protección del estrés oxidativo en células de colon LS174T humanas expuestas concomitantemente a palmitato e IL-22 murina, IL-22 humana o las proteínas de fusión del ligando 3 NN-IL-22-GLP-1R. MBPS-50 inhibió el estrés oxidativo (producción de nitrito), pero solo hacia el extremo más alto del intervalo de concentración utilizado, siendo menos eficaz que las concentraciones molares equivalentes de IL-22 humana. MPBS-51 no suprimió eficazmente el estrés oxidativo en ninguna de las concentraciones probadas y, de hecho, pareció aumentar la producción de nitrito inducida por palmitato en el extremo más bajo del intervalo de concentración. MPBS-52 suprimió eficazmente el estrés oxidativo con una eficacia similar a las concentraciones molares equivalentes de IL-22 humana.

La Figura 26 muestra una reducción en el estrés del ER en células MIN6N8 expuestas a palmitato concomitantemente con IL-22 humana o la proteína de fusión de IL-22-ScaB1.

Conclusiones: Las proteínas de fusión MPBS-50 y MPBS-52 han conservado la eficacia in vitro para la supresión del estrés del ER y oxidativo, demostrada tanto en células murinas como humanas. Curiosamente, MPBS-50 fue más eficaz que MPBS-52 en las células p murinas, mientras que MPBS-52 fue más eficaz en las células de colon humano. Por el contrario, MPBS-51 aparece inactivo in vitro. IL-22-ScaB1 redujo el estrés del ER inducido por palmitato pero tuvo una potencia <50 % en comparación con la IL-22 humana nativa.

EJEMPLO 13

EVALUACIÓN IN VIVO DE LA ELIMINACIÓN DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN IL-22

La Figura 27 muestra las concentraciones de IL-22 humana y de ratón recombinante, y las proteínas de fusión de ligando 3 IL-22-GLP-1R en suero durante las primeras 2 horas después de la administración. Como se documentó previamente, la IL-22 de ratón se elimina casi por completo dentro de los 60 minutos de la administración (no se muestra). La IL-22 humana se eliminó un poco más lentamente y las 3 proteínas de fusión dieron patrones de eliminación ligeramente diferentes. MPBS-50 se eliminó con una cinética similar a la de la IL-22 humana recombinante, mientras que MPBS-51 y MPB-52 mostraron una concentración máxima más baja y algo más prolongada/posterior.

EJEMPLO 14

EVALUACIÓN IN VIVO DE LA ACTIVACIÓN RELATIVA DE STAT3 POR FUSIONES DEL LIGANDO IL-22-GLP-1R HUMANO EN ISLOTES PANCREÁTICOS VS. OTROS TEJIDOS OBJETIVO (HÍGADO, PIEL, INTESTINO)

La Figura 28 muestra la fluorescencia relativa de STAT3 (determinada por área de tejido) en islotes pancreáticos frente a hígado, intestino y piel 30 minutos después de la administración de cada forma de IL-22 humana. Los resultados se expresan como cambio en veces en las proporciones de tejido en relación con la administración de IL-22 humana. La proporción de MPBS-50 y -51 no fue mayor que la de la IL-22 humana nativa en el hígado o el intestino, pero mostró aumentos medios de 45 y 113 veces en la fosforilación de STAT3 en los islotes frente a la piel en comparación con la IL-22 nativa. Curiosamente, aunque no observamos ningún efecto de MPBS-51 en la reducción del estrés del ER/oxidativo in vitro, indujo la fosforilación de STAT3 en el páncreas, así como en el hígado y el intestino, lo que sugiere que está activado in vivo, posiblemente a través de la escisión mediada por la proteasa DPPIV. En contraste con MPBS-50 y MPBS-51, MPBS-52 mostró un direccionamiento sustancialmente mayor a los islotes pancreáticos, en relación con el hígado (396 veces), el intestino (338 veces) y la piel (4840 veces). Estos hallazgos proporcionan una prueba del principio de que el direccionamiento de GLP-1R puede mejorar la actividad de IL-22 en los islotes pancreáticos en relación con los tejidos diana de IL-22 que pueden mostrar efectos adversos no deseados.

Conclusiones: Las tres proteínas de fusión mejoraron el direccionamiento a los islotes versus a la piel y la administración de MPBS-52 dio como resultado un aumento muy sustancial de la fosforilación de STAT3 en los islotes versus al hígado, la piel y el intestino. Estos datos proporcionan una prueba inicial del principio de que las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R se pueden usar para mejorar el direccionamiento de IL-22 a los islotes pancreáticos con resultados terapéuticos potencialmente mejorados.

EJEMPLO 15

EVALUACIÓN IN VIVO DE LA ACTIVACIÓN RELATIVA DE STAT3 POR EL CONSTRUCTO scFV DE IL-22-ScaB1 HUMANO EN ISLOTES PANCREÁTICOS VS. OTROS TEJIDOS OBJETIVO (HÍGADO, PIEL, INTESTINO)

La Figura 29 muestra la fluorescencia relativa de STAT3 (determinada por área de tejido) en islotes pancreáticos frente a hígado, intestino y piel 30 min después de la administración de IL-22 humana a las dosis más altas de 15,4 nmoles/g y concentraciones crecientes de IL-22-ScaB1 (0,96-15,4 nmoles/g). Los resultados se expresan como cambio en veces en las proporciones de tejido en relación con la administración de IL-22 humana. La proporción de IL-22-ScaB1 a 0,96 nmoles/g no fue mayor que la de IL-22 humana nativa en la concentración más alta en el hígado, la piel o el intestino. Sin embargo, con las dos dosis más altas, IL-22-ScaB1 mostró un aumento sustancial del direccionamiento a los islotes pancreáticos, se observó a 15,4 nmoles/g un aumento en relación con el hígado de 120 veces, en el intestino de 420 veces y en la piel de 110 veces. Estos hallazgos proporcionan una prueba del principio de que el direccionamiento (mediante múltiples métodos) puede mejorar la actividad de la IL-22 en los islotes pancreáticos en relación con los tejidos diana de la IL-22 que pueden mostrar efectos adversos no deseados.

Conclusiones: Las proteínas IL-22-ScaB1 mejoraron el direccionamiento a los islotes versus otros tejidos que expresan IL-22RA1, tal como el hígado, la piel y el intestino. Estos datos proporcionan una prueba inicial del principio de que la fusión de IL-22 con proteínas de anticuerpos se puede utilizar para mejorar el direccionamiento de IL-22 a los islotes pancreáticos con resultados terapéuticos potencialmente mejorados.

EJEMPLO 16

ESTUDIO DE EFICACIA DE BÚSQUEDA DE DOSIS EN RATONES CON OBESIDAD INDUCIDA POR UNA DIETA RICA EN GRASA CON PROTEÍNAS DE FUSIÓN DEL LIGANDO IL-22-GLP-1R

Esta etapa de prueba implicó una terapia de dos semanas en un intervalo de cinco dosis (0,06-15,4 nmoles/g) de IL-22 humana y las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R en ratones que habían estado con una dieta rica en grasas (HFD) durante 27 semanas. Después de dos semanas, se evaluó el control glucémico mediante una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT; todas las dosis comparadas con HFD se muestran en la Figura 30). La Figura 31B muestra que las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R son más potentes a una dosis más baja reduciendo la AUC de la IPGTT en comparación con la IL-22 nativa, y reducen la AUC de la IPGTT de manera efectiva a la observada en la dieta de comida normal (valor de 1). Las dosis de IL-22 o de las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R > 0,96 nmoles/g produjeron una reducción media en el aumento del área bajo la curva (AUC) de la IPGTT de los ratones de control con HFD frente a los alimentados con comida normal de > 50% (Figura 31B).

Por debajo de esta dosis, las tres proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R permanecieron activas mientras que la eficacia de la IL-22 humana disminuyó sustancialmente (véase la Figura 32). La mayor eficacia de las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R es coherente con la mejora del direccionamiento de la IL-22 a los islotes pancreáticos (Figura 28). También se evaluaron los cambios en el peso corporal durante el tratamiento, lo que reveló tendencias hacia una mayor pérdida de peso corporal con las dosis más altas de las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R, mientras que hubo pocos cambios en el peso corporal con la IL-22 humana (Figura 33) . Estos hallazgos proporcionan una prueba alentadora del principio de la mayor eficacia de las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R frente a la IL-22 nativa para restaurar el control glucémico en la obesidad/diabetes.

Material y Métodos para los Ejemplos 11 a 16

PRODUCCIÓN DE scFv-IL22 DE HIS-ScaB1 HUMANA-MYC (REFERIDO COMO IL-22-ScaB1)

Diseño de secuencias de proteínas de fusión:

El primer requisito para el desarrollo de una proteína de fusión capaz de dirigirse específicamente a las células p pancreáticas fue seleccionar un resto de direccionamiento para conectarse a la secuencia de IL-22 humana. El fragmento variable de cadena sencilla (scFv) de ScaB1 se identificó como un medio potencial para facilitar el direccionamiento. Las secuencias de DNA para el scFv se obtuvieron de la Patente Mundial WO 2010/096930. La secuencia codificante se modificó ligeramente para eliminar partes que eran innecesarias, tal como sitios de enzimas de restricción adicionales, extensiones de enlace, péptidos y artefactos señal (por ejemplo, -AAA en el extremo C-terminal de la secuencia en la Patente Mundial WO 2010/096930) en relación con el uso del método original en el desarrollo del scFv (véase, Figura 34A).

Las secuencias de IL-22 humana se identificaron utilizando las bases de datos de NCBI y Uniprot: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?Cmd=DetailsSearch&Term=50616; y http://www.uniprot.org/uniprot/Q9GZX6. La secuencia de IL-22 humana final utilizada excluyó el péptido señal incluido en todos los recursos en línea, ya que su presencia daría como resultado la escisión de la proteína de fusión durante la expresión en mamíferos (Figura 34B). Después, las secuencias se conectaron por medio de un único conector G4S para formar una proteína de fusión scFvcitocina con una etiqueta N-terminal 6xHis y C-terminal myc para ayudar en la detección de proteínas durante el desarrollo del producto (Figura 34C).

La secuencia de codificación de la proteína de fusión inicial se optimizó mediante la eliminación de codones que podrían causar efectos no deseados, tales como cortes adicionales en la secuencia al realizar digestiones de enzimas de restricción de rutina con fines de clonación. La secuencia de DNA diseñada se optimizó para la expresión en células de ovario de hámster chino (Cricetulus griseus) e incluía una secuencia líder 5' (MGWSCIILFLVATATGVHS [SEQ ID NO:293]) del sistema MAB Xpress publicado y una secuencia Kozak para el inicio de la traducción.

Biología Molecular:

La proteína de fusión se ordenó a través de GeneArt usando su servicio personalizado de síntesis de genes y posteriormente se sub-clonó en pcDNA 3.1 (+) usando los sitios de restricción HinIII y Xbal (New England Biolabs, NEB). Las colonias se cultivaron en placas de agar LB utilizando la resistencia a la ampicilina como presión selectiva para las colonias pcDNA3.1 (+) positivas. La presencia de la secuencia de DNA de la proteína de fusión insertada se confirmó a través de la PCR de colonias de rutina y la posterior secuenciación de Sanger usando cebadores T7-directos (TAATACGACTCACTATAGGG [SEQ ID NO:294]) y BGH-inversos (TAGAAGGCACAGTCGAGGC [SEQ ID NO:295]) que tienen sitios 5' y 3' al sitio de inserción en el esqueleto del vector. La alineación de secuencias realizada utilizando la herramienta en línea Clustal Omega confirmó la presencia de la secuencia de la proteína de fusión. La expresión de E. coli a gran escala se completó después (selección de ampicilina) para producir suficiente DNA para purificar (Macherey-Nagel, NucleoBond® kit Xtra Midi) y usar para la expresión en mamíferos en células CHO adaptadas en suspensión.

Expresión de mamíferos:

Las técnicas asépticas se mantuvieron durante los protocolos de cultivo celular y se completaron en cabinas de bioseguridad Clase II, limpiadas de forma rutinaria con etanol al 80 % (V/V) y esterilizadas con UV. Los medios se prepararon en las cabinas y se calentaron a 37°C en un baño de agua localizado fuera de la cabina pero aún dentro de un área dedicada a la producción de proteína de calidad a gran escala. La expresión transitoria de la proteína de fusión se realizó mediante transfección mediada por PEI, mediante la cual el DNA y PEI se diluyen en OptiProSFM, se mezclan y se añaden a las células CHO adaptadas en suspensión en medios CD-CHO químicamente definidos (Gibco, Life Technologies) suplementados con Glutamax 8 mM. Las células transfectadas se mantuvieron inicialmente a 37°C, 7,5 % de CO2 y 130 rpm. Después de un tiempo de incubación de 5 horas, se añadió un alimento compuesto por CD-CHO Glutamax 8 mM, 0,4 % (v:v) de agente antiaglomerante (ACA), 7,5 % (v:v) de cada alimento A y alimento B (Gibco, Life Technologies) a las células en la cabina de bioseguridad para diluir los cultivos 1:2 (v:v) en matraces con agitación de 1 L (Corning), como se describió previamente en Codamo et al. (2011).

Purificación de proteínas:

Los sobrenadantes de cultivo se recogieron 10 días después de la transfección mediante centrifugación y después se filtraron utilizando un filtro de tapa de botella de 0,22 gm (Corning). El pH se ajustó a 7,3 y el sobrenadante se almacenó a 4°C hasta que se pudo completar la purificación. Como el scFv incluía una cadena variable kappa del subgrupo I (VK), esto proporcionó los medios para purificar la proteína de fusión utilizando columnas de proteína L HiTrap pre­ empaquetadas (GE Healthcare Life Sciences) en lugar del proceso más lento de cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC) que se une a las etiquetas His para la purificación. El protocolo incluía NaOH 15 mM para esterilización y limpieza, 1 x PBS de Dulbecco (Life Technologies) como tampón de lavado y procesamiento y Glicina 0,1 M pH 3,0 para la elución de proteínas. La proteína eluida se desalinizó posteriormente en 1x PBS de Dulbecco utilizando una columna de desalinización HiPrep (GE Healthcare Life Sciences). Después de la purificación, el producto purificado se procesó en condiciones reducidas y no reducidas en un NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Protein Gel junto con el marcador de proteína preteñido con SeeBlue Plus2 (Life Technologies). Los resultados mostraron que el protocolo de purificación fue efectivo para producir cantidades de calidad de proteína de fusión pura sin contaminantes visibles (Figura 35). Aún deben completarse más experimentos analíticos para determinar la calidad del rendimiento final.

Proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R:

Estas proteínas de fusión fueron fabricadas por Novo Nordisk A/S (Bagsvaerd, Dinamarca) y sus secuencias se proporcionan en la Figura 36.

Experimentos in v itro :

Cultivo celular: Las células murinas MIN6N8 resultaron negativas para micoplasma. Las células se cultivaron de forma rutinaria en DMEM libre de rojo de fenol (Life Technologies) que contenía glucosa 25 mM (3,4 g/L de bicarbonato de sodio, 50 U/mL de penicilina y estreptomicina, 71,5 gM de p-mercaptoetanol y 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor) y se transfirieron a DMEM como anteriormente con glucosa 5,5 mM 48 h antes de la experimentación. Se cultivaron células LS174T humanas en DMEM que contenía suero bovino fetal inactivado con calor al 10 %, 50 U ml-1 de penicilina y estreptomicina.

Medición del estrés del ER: las células MIN6N8 se transfectaron con el plásmido del indicador ERAI (F-XBP1ADBD-venus, usando Lipofectamine 2000 según las instrucciones del fabricante. Para ERAI hubo una fluorescencia insignificante en ausencia de factores estresantes del ER, pero tras la inducción del estrés del ER, el empalme de mRNA de XBP1 por IRE1a dio como resultado la traducción de Venus pero no una forma activa de XBP1. Se midió la fluorescencia (excitación: 485nm; emisión: 520nm) utilizando un lector de placas POLARstar Omega y las células se trataron 48 h después de la transfección. Las células 48 h después de la trasfección se expusieron a palmitato 0,5 mM para inducir estrés del ER y se trataron concomitantemente con IL-22 humana o de ratón en un intervalo de concentraciones (0,12-15,4 nM). Después de 24 h, se midió la fluorescencia del indicador ERAI-sXBP1 GFP.

Medición del estrés oxidativo: las células se expusieron a palmitato 0,5 mM para inducir el estrés del ER y se trataron concomitantemente con IL-22 humana o de ratón en un intervalo de concentraciones (0,12-15,4 nM) durante 2 h. El kit de reactivos de Griess para la determinación de nitrito se realizó según las instrucciones del fabricante (Molecular Probes) para evaluar los niveles intracelulares de nitrito (el metabolito estable del óxido nítrico) usando lisados de células p preparados en tampón RIPA (NaCl 150 mM, 1% de NP40, desoxicolato de sodio al 0,5 %, SDS al 0,1 %, Tris 50 mM, pH 7,5).

Experimentos con animales in v ivo :

Direccionamiento a IL-22 al páncreas: C57BL/6 macho no obeso de 6-8 semanas de edad. Cada proteína de fusión de ligando IL-22-GLP-1R o hIL-22 se administró i.p. a 256 ng/g de IL-22 y los equivalentes molares de las proteínas de fusión individuales (n = 3 por régimen). Se administró IL-22-ScaB1 a 15,4 nmoles/g, 3,8 nmoles/g y 0,96 nmoles/g. Los ratones de control recibieron una única inyección i.p. de PBS de control.

Para evaluar la eliminación de IL-22 y de las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R, se recogieron muestras de sangre antes de la inyección y a los 15, 30, 45, 60, 90 y 120 min. Las concentraciones séricas de IL-22 y de las proteínas de fusión del ligando IL-22-GLP-1R se determinaron utilizando un ELISA de doble determinante de IL-22 humana (Biolegend; 434505) frente a una curva estándar para las proteínas de fusión individuales.

Para evaluar la activación in vivo de la vía de señalización del receptor de IL-22, después de 30 min se sacrificaron los ratones y se congelaron rápidamente los siguientes tejidos y se prepararon secciones para cada ratón: páncreas, piel (oreja, cola), colon (enrollado) e hígado. Las secciones se tiñeron mediante inmunofluorescencia para STAT3 fosforilado utilizando el anticuerpo Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7).

Prueba de tolerancia a la g lucosa intraperitoneal:

Se alimentó a ratones macho C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad con una dieta rica en grasas que contenía el 46 % de la energía disponible como grasa saturada, 34 % de carbohidratos, 20 % de proteínas (Speciality feeds, SF04-027) durante 27 semanas y se les trató de la siguiente manera:

La proteína de fusión del ligando IL-22-GLP-1R o la IL-22 sola se administraron dos veces por semana i.p. a las siguientes dosis: 1,4, 16, 64 y 256 ng/g de IL-22 (0,12-15,4 nmoles/g) y los equivalentes molares de las proteínas de fusión IL-22-GLP-1 (n = 3 por régimen, excepto para la dosis más baja donde n = 2); los ratones de control recibieron solo el control de PBS. Se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT) en ayunas (2 g kg-1 de glucosa) el día 14 cuando finalizó el experimento (los tejidos no se guardaron para análisis). El peso corporal se registró los días 0, 5, 10 y 13.

La cita de cualquier referencia en la presente memoria no debe interpretarse como una admisión de que dicha referencia está disponible como "técnica anterior" para la presente solicitud.

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Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1 Un agente terapéutico que comprende un polipéptido de IL-22 y un agente de direccionamiento que dirige el polipéptido de IL-22 a una célula p pancreática, en el que el agente de direccionamiento es un ligando de un receptor de células p pancreáticas, y en el que el polipéptido de IL-22 está fusionado o conjugado de otro modo, directamente o a través de un enlazador intermedio, con el agente de direccionamiento.
2. 2. El agente terapéutico de la reivindicación 1, en el que el ligando es un péptido.
3. 3. El agente terapéutico de la reivindicación 1, en el que el receptor de células p pancreáticas es un receptor del péptido 1 similar al glucagón (GLP-1).
4. 4. El agente terapéutico de la reivindicación 3, en el que el ligando se selecciona de:

   (a) una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24;

   (b) una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia establecida en una cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24; o

   (c) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 o 23;

   (d) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que comparte al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia establecida en SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 o 23, o un complemento de la misma; o

   (e) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones de alta rigurosidad con un complemento de la secuencia establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 o 23,

   en donde la secuencia de aminoácidos de (a), (b), (c), (d) o (e) es un agonista de GLP-1 R.
5. 5. El agente terapéutico de la reivindicación 3, en el que el ligando comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 25 a 36.
6. 6. El agente terapéutico de la reivindicación 1, en el que el ligando es una molécula de unión a antígeno que es inmunointeractiva con el receptor de células p pancreáticas.
7. 7. El agente terapéutico de la reivindicación 6, en el que el ligando es una molécula de unión a antígeno agonista.
8. 8. El agente terapéutico de la reivindicación 7, en el que la molécula de unión a antígeno agonista es el anticuerpo monoclonal 5A10 o sus fragmentos de unión a antígeno o anticuerpos humanizados o quiméricos del anticuerpo monoclonal 5A10 o sus fragmentos de unión a antígeno.
9. 9. El agente terapéutico de la reivindicación 8, en el que la molécula de unión a antígeno agonista comprende: la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera como se establece en SEQ ID NO: 37; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada como se establece en SEQ ID NO: 38.
10. 10. El agente terapéutico de la reivindicación 8, en el que la molécula de unión a antígeno agonista comprende (i) las secuencias de la región determinante de la complementariedad (CDR) de cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo monoclonal 5A10, en el que las secuencias de CDR de cadena ligera comprenden CDR1 de SEQ ID NO: 39; C^d R2 de SEQ ID NO: 40; y C^d R3 de SEQ ID NO: 41, y las secuencias de CDR de cadena pesada comprenden CDR1 de SEQ ID NO: 42; CDR2 de SEQ ID NO: 43 y CDR3 de SEQ ID NO: 44.
11. 11. El agente terapéutico de la reivindicación 1, en el que el ligando es una molécula de unión a antígeno que se une selectivamente a las células p pancreáticas y comprende una secuencia variable de cadena pesada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 47 a 51, y una región variable de cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 52 a 56,

    en donde opcionalmente

    (a) la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo de cadena sencilla que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 57 a 61, o

    (b) la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende secuencias de CDR de cadena pesada que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 62; una CDR2 seleccionada de una cualquiera de SEQ iD NO: 63 a 67; y una CDR3 seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 68 a 71, y las secuencias de CDR de cadena ligera que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 72; una CDR2 seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 73 a 77, y una CDR3 seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 78 a 82, en donde opcionalmente el anticuerpo o los fragmentos de unión a antígeno comprenden:

    secuencias de CDR de cadena pesada que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 62; una CDR2 de SEQ ID NO: 63 y una CDR3 de SEQ ID NO: 68, y secuencias de CDR de cadena ligera que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 72; una CDR2 de SEQ ID NO: 73 y una CDR3 de SEQ ID NO: 78; o

    secuencias de CDR de cadena pesada que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 62; una CDR2 de SEQ ID NO: 65 y una CDR3 de SEQ ID NO: 69, y secuencias de CDR de cadena ligera que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 72; una CDR2 de SEQ ID NO: 74 y una CDR3 de SEQ ID NO: 79; o

    secuencias de CDR de cadena pesada que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 62; una CDR2 de SEQ ID NO: 64 y una CDR3 de SEQ ID NO: 70, y secuencias de CDR de cadena ligera que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 72; una CDR2 de SEQ ID NO: 75 y una CDR3 de SEQ ID NO: 80; o

    secuencias de CDR de cadena pesada que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 62; una CDR2 de SEQ ID NO: 66 y una CDR3 de SEQ ID NO: 69, y secuencias de CDR de cadena ligera que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 72; una CDR2 de SEQ ID NO: 76 y una CDR3 de SEQ ID NO: 81; o

    secuencias de CDR de cadena pesada que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 62; una CDR2 de SEQ ID NO: 67 y una CDR3 de SEQ ID NO: 71, y secuencias de CDR de cadena ligera que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 72; una CDR2 de SEQ ID NO: 77 y una CDR3 de SEQ ID NO: 82.
12. 12. El agente terapéutico de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en una cualquiera de las SEQ ID NO: 83 a 190 y 285 a 288.
13. 13. El agente terapéutico de la reivindicación 1, en el que el ligando es un anticuerpo monocatenario que comprende secuencias de CDR de cadena pesada que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 62, una CDR2 de SEQ ID NO: 63 y una CDR3 de SEQ ID NO: 68; y secuencias de CDR de cadena ligera que comprenden una CDR1 de SEQ ID NO: 72, una CDR2 de SEQ ID NO: 73 y una CDR3 de SEQ ID NO: 78, y en el que el agente de direccionamiento está conjugado con el extremo C-terminal del polipéptido de IL-22.
14. 14. Una composición farmacéutica que comprende el agente terapéutico de una cualquiera de las reivindicaciones 1­ 12 y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
15. 15. El agente terapéutico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o la composición farmacéutica de la reivindicación 14, para su uso en el tratamiento de un trastorno metabólico, en el que opcionalmente,

    (a) el trastorno metabólico se selecciona de prediabetes, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, síndrome metabólico, obesidad, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), dislipidemia diabética, hiperlipidemia, hipertensión, hipertrigliceridemia, acidemia hipergrasa e hiperinsulinemia, o

    (b) el trastorno metabólico es la diabetes tipo 2.