ES2935639T3

ES2935639T3 - Proceso de molienda

Info

Publication number: ES2935639T3
Application number: ES16868043T
Authority: ES
Inventors: Yi Cao; James Lavigne; Bernardo Vidal; Thomas Patrick Gibbons; Chee-Leong Soong; Brian R Scott; Randall Scott Deinhammer; Zhen Long; Michael John Akerman; Xinyu Shen; Yu Zhang
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2015-11-26
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2023-03-08
Anticipated expiration: 2036-11-25
Also published as: CN108368527B; EP3380628B1; MX2018006206A; US20210017297A1; US11649298B2; US11987649B2; WO2017088820A1; CN108368527A; BR112018010770A8; US10836837B2; HUE061031T2; US20190002592A1; EP3380628A4; BR112018010770A2; EP3380628A1; US20230235094A1

Abstract

Un proceso para tratar los granos de cultivo consta de las etapas de a) remojar los granos en agua para producir granos remojados; b) moler los granos remojados; c) tratar los granos remojados en presencia de una cantidad eficaz de polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa o un polipéptido GH43 que tiene actividad arabinofuranosidasa, donde el paso c) se realiza antes, durante o después del paso b). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso de molienda

Referencia a una lista de secuencias

Esta solicitud contiene una lista de secuencias en un soporte de lectura informático, que se incorpora a la presente a modo de referencia.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso mejorado de tratamiento de granos de cultivo para proporcionar un producto de almidón de alta calidad adecuado para la conversión de almidón en mono y oligosacáridos, etanol, edulcorantes, etc. Además, la invención también se refiere a una composición enzimática que comprende una o más actividades enzimáticas adecuadas para el proceso de la invención y al uso de la composición de la invención. Descripción de la Técnica Relacionada

Antes del almidón, que es un constituyente importante en los granos de la mayoría de los cultivos, tales como maíz, trigo, arroz, frijol de sorgo, cebada o cáscaras de frutas, puede usarse para la conversión de almidón en sacáridos, tales como dextrosa, fructosa; alcoholes, tales como etanol; y edulcorantes, el almidón debe estar disponible y tratarse de una manera que proporcione un almidón de alta pureza. Si el almidón contiene más de del 0.5% de impurezas, incluidas las proteínas, no es adecuado como material de partida para los procesos de conversión de almidón. Para proporcionar dicho producto de almidón puro y de alta calidad partiendo de los granos de los cultivos, los granos a menudo se muelen, como se describirá más adelante.

A menudo se usa molienda húmeda para separar los granos de maíz en sus cuatro componentes básicos: almidón, germen, fibra y proteína.

Típicamente, los procesos de molienda en húmedo comprenden cuatro etapas básicas. En primer lugar, los granos se empapan o se impregnan durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas para comenzar a romper los enlaces de almidón y proteína. La siguiente etapa en el proceso implica una molienda gruesa para romper el pericarpio y separar el germen del resto del grano. La suspensión restante que consiste en fibra, almidón y proteína se tritura finamente y se tamiza para separar la fibra del almidón y la proteína. El almidón se separa de la suspensión restante en hidrociclones. Luego, el almidón se puede convertir en jarabe o alcohol, o se puede secar y vender como almidón de maíz o modificarse química o físicamente para producir almidón de maíz modificado.

El uso de enzimas se ha sugerido para la etapa de remojo de los procesos de molienda en húmedo. El producto enzimático comercial Steepzyme® (disponible en Novozymes A/S) se ha mostrado adecuado para la primera etapa en procesos de molienda en húmedo, es decir, la etapa de remojo donde los granos de maíz se empapan en agua.

Más recientemente, se ha desarrollado la "molienda enzimática", un proceso de molienda en húmedo modificado que usa proteasas para reducir significativamente el tiempo de procesamiento total durante la molienda en húmedo de maíz y elimina la necesidad de anhídrido de azufre como agente de procesamiento. Johnston et al., CerealChem, 81, pág. 626-632 (2004).

El documento US 6,566,125 describe un método para obtener almidón de maíz que implica empapar los granos de maíz en agua para producir granos de maíz empapados, moler los granos de maíz empapados para producir una suspensión de maíz molido, e incubar la suspensión de maíz triturado con enzima (por ejemplo, proteasa).

El documento US 5,066,218 describe un método para moler granos, especialmente maíz, que comprende limpiar el grano, remojar el grano en agua para ablandarlo, y luego moler el grano con una enzima celulasa.

El documento WO 2002/000731 describe un proceso de tratamiento de granos de cultivo, que comprende empapar los granos en agua durante 1 -12 horas, moler en húmedo los granos empapados y tratar los granos con una o más enzimas que incluyen una proteasa ácida.

El documento WO 2002/000911 describe un proceso de separación de gluten de almidón, que comprende someter el almidón de molienda a una proteasa ácida.

El documento WO 2002/002644 describe un proceso de lavado de una suspensión de almidón obtenida a partir de la etapa de separación de gluten de almidón de un proceso de molienda, que comprende lavar la suspensión de almidón con una solución acuosa que comprende una cantidad eficaz de proteasa ácida.

Sigue existiendo la necesidad de mejorar los procesos para proporcionar almidón adecuados para la conversión en monosacáridos y oligosacáridos, etanol, edulcorantes, etc.

Compendio de la invención

La invención proporciona un proceso para tratar granos de cultivo, que comprende las etapas de

a) empapar granos en agua para producir granos empapados;

b) moler los granos empapados y

c) tratar los granos empapados en presencia de una cantidad eficaz de un polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa y un polipéptido G10 que tienen actividad xilanasa;

en donde la etapa c) se realiza después de la etapa b) en la etapa de lavado de la fibra.

Definiciones

Polipéptido de actividad auxiliar 9: La expresión "polipéptido de actividad auxiliar 9" o "polipéptido AA9" se refiere a un polipéptido clasificado como polisacárido lítico monooxigenasa (Quinlan et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 208: 15079-15084; Phillips et al., 2011, ACS Chem. Biol. 6: 1399-1406; Lin et al., 2012, Structure 20: 1051-1061). Anteriormente, los polipéptidos AA9 se habían clasificado en la familia 61 de las glucósido-hidrolasas (GH61) según Henrissat, 1991, Biochem. J. 280: 309-316, y Henrissat y Bairoch, 1996, Biochem. J. 316: 695-696.

Los polipéptidos AA9 estimulan la hidrólisis de un material celulósico por parte de una enzima que tenga actividad celulolítica. Se puede determinar la actividad estimuladora de la celulolisis midiendo el incremento de azúcares reductores o el incremento de glucosa y celobiosa total procedente de la hidrólisis de un material celulósico por parte de una enzima celulolítica en las siguientes condiciones: 1 -50 mg de proteína total/g de celulosa en el rastrojo de maíz pretratado (PCS), donde la proteína total está compuesta por el 50-99.5% p/p de proteína enzimática celulolítica y el 0.5-50% p/p de proteína de un polipéptido AA9 durante 1-7 días a una temperatura adecuada, tal como 40 °C-80 °C, por ejemplo, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75°C, o 80 °C, y un pH adecuado, tal como 4-9, por ejemplo, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, o 9.0, en comparación con una hidrólisis de control con igual carga de proteína total sin actividad potenciadora celulolítica (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulosa en PCS).

La actividad potenciadora del polipéptido AA9 puede determinarse usando una mezcla de CELLUCLAST® 1.5L (Novozymes A/S, Bagsv^rd, Dinamarca) y beta-glucosidasa como fuente de la actividad celulolítica, donde la betaglucosidasa está presente en un peso de al menos el 2-5% de proteína de la carga de proteína de celulasa. En un aspecto, la p-glucosidasa es una p-glucosidasa de Aspergillus oryzae (por ejemplo, producida de manera recombinante en Aspergillus oryzae según el documento WO 02/095014). En otro aspecto, la p-glucosidasa es una pglucosidasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, producida de manera recombinante en Aspergillus oryzae tal como se describe en el documento WO 02/095014).

La actividad potenciadora del polipéptido AA9 también puede determinarse incubando un polipéptido AA9 con celulosa hinchada de ácido fosfórico al 0.5% (PASC), acetato sódico 100 mM a pH 5, MnSO41 mM, ácido gálico al 0,1%, 0.025 mg/ml de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus, y TRITON® X-100 al 0.01% (4- (1,1,3,3-tetrametilbutil)fenilpolietilenglicol) durante 24-96 horas a 40 °C seguido de la determinación de la glucosa liberada del PASC.

La actividad estimuladora del polipéptido AA9 también se puede determinar de acuerdo con el documento WO 2013/028928 para composiciones a temperatura elevada.

Los polipéptidos AA9 estimulan la hidrólisis de un material celulósico catalizada por una enzima que tiene actividad celulolítica reduciendo la cantidad de enzima celulolítica requerida para alcanzar el mismo grado de hidrólisis preferentemente de al menos 1.01 veces, por ejemplo, de al menos 1.05 veces, al menos 1.10 veces, al menos 1.25 veces, al menos 1.5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o al menos 20 veces.

El polipéptido AA9 también puede usarse en presencia de un catión de metal divalente de activación soluble de acuerdo con los documentos WO 2008/151043 o WO 2012/122518, por ejemplo, manganeso o cobre.

El polipéptido AA9 puede usarse en presencia de un compuesto dioxi, un compuesto bicíclico, un compuesto heterocíclico, un compuesto que contiene nitrógeno, un compuesto de quinona, un compuesto que contiene azufre o un licor obtenido de un material celulósico o hemicelulósico pretratado tal como rastrojo de maíz pretratado (documentos WO 2012/021394, WO 2012/021395, WO 2012/021396, WO 2012/021399, WO 2012/021400, WO 2012/021401, WO 2012/021408, y WO 2012/021410).

Variante alélica: El término "variante alélica'' se refiere a dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica aparece de manera natural debido a una mutación y puede generar polimorfismo en las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

Arabinofuranosidasa: El término "arabinofuranosidasa" se refiere a alfa-L-arabinofuranósido-arabinofuranohidrolasa (EC 3.2.1.55) que cataliza la hidrólisis de los residuos de alfa-L-arabinofuranósido no reductores terminales en alfa-L-arabinósidos. La enzima actúa sobre alfa-L-arabinofuranósidos, alfa-L-arabinanos que contienen uniones (1,3) y/o (1,2) y/o (1,5), arabinoxilanos, y arabinogalactanos. A la alfa-L-arabinofuranosidasa también se la conoce como arabinosidasa, alfa-arabinosidasa, alfa-L-arabinosidasa, alfa-arabinofuranosidasa, polisacárido alfa-L-arabinofuranosidasa, alfa-L-arabinofuranosido-hidrolasa, L-arabinosidasa o alfa-L-arabinanasa. La actividad arabinofuranosidasa puede determinarse usando 5 mg de arabinoxilano de trigo de viscosidad media (Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, Co. Wicklow, Irlanda) por ml de acetato de sodio 100 mM, pH 5, en un volumen total de 200 |jl durante 30 minutos a 40 °C seguido por análisis de arabinosa mediante cromatografía en columna HPX-87H AMINEX® (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE.UU.).

La arabinofuranosidasa de la presente invención tiene al menos un 50% de la actividad de arabinofuranosidasa de uno o más de los polipéptidos seleccionados de la lista que consiste en la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 21, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 33, la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 51, la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID NO: 69. En una realización preferida, la arabinofuranosidasa de la presente invención tiene al menos un 70% de la actividad de arabinofuranosidasa de uno o más de los polipéptidos seleccionados de la lista que consiste en la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 21, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 33, la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 51, la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 117 y la SEQ ID NO: 118. En una realización más preferida, la arabinofuranosidasa de la presente invención tiene al menos un 80% de la actividad de arabinofuranosidasa de uno o más de los polipéptidos seleccionados de la lista que consiste en la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 21, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 33, la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 51, la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 117 y la SEQ ID NO: 118. En una realización incluso más preferida, la arabinofuranosidasa de la presente invención tiene al menos un 90% de la actividad de arabinofuranosidasa de uno o más de los polipéptidos seleccionados de la lista que consiste en la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 21, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 33, la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 51, la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 117 y la SEQ ID NO: 118. En una realización mucho más preferida, la arabinofuranosidasa de la presente invención tiene al menos un 95% de la actividad de arabinofuranosidasa de uno o más de los polipéptidos seleccionados de la lista que consiste en la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 21, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 33, la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 51, la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 117 y la SEQ ID NO: 118.

Material que contiene arabinoxilano: El término "material que contiene arabinoxilano" se refiere a cualquier material que contiene arabinoxilano. Arabinoxilano es una hemicelulosa encontrada tanto en las paredes celulares primarias como secundarias de plantas, incluyendo maderas y granos de cereal, que consiste en copolímeros de dos azúcares pentosa, arabinosa y xilosa. La cadena de arabinoxilano contiene un gran número de unidades de xilosa con unión 1,4. Muchas unidades de xilosa se sustituyen con residuos de arabinosa 2-, 3- ó 2,3-sustituidos.

Ejemplos de material que contiene arabinoxilano son forraje, forraje basto, semillas y granos (o bien enteros o preparados mediante molienda, trituración, etc., a partir de p. ej. maíz, avena, centeno, cebada, trigo), árboles o maderas duras (tal como álamo, sauce, eucalipto, palmera, arce, abedul), bambú, cultivos energéticos herbáceos y/o leñosos, cultivos forrajeros y alimentos agrícolas, productos de pienso para animales, peladuras de mandioca, vainas de cacao, caña azucarera, remolacha azucarera, pulpa de algarrobo, pulpa de verdura o fruta, residuos de madera, corteza, virutas, serrín, pulpa de madera, líquido de pulpación, papel de desecho, cartón, residuos de madera de construcción y demolición, sólidos o lodo de aguas residuales industrial o municipal, estiércol, subproducto de procedimientos de fermentación y/o preparación por infusión, granos de destilería húmedos, granos de destilería secados, grano ya procesado, vinaza y bagazo.

Forraje tal como se define en la presente también incluye forraje basto. Forraje es material vegetal reciente tal como heno y ensilado de plantas de forraje, hierba y otras plantas de forraje, hierba y otras plantas de forraje, algas, granos germinados y legumbres, o cualquier combinación de los mismos. Ejemplos de plantas de forraje son alfalfa, loto corniculado, Brassica (p. ej. col rizada, colza (canola), colinabo (nabicol), nabo), trébol (p. ej. Trifolium hybridum, trébol rojo, trébol subterráneo, trébol blanco), hierba (p. ej. Cynodon dactylon, Bromus, Arrhenatherum elatius, Festuca, Danthonia decumbens, Poa, Miscanthus, Dactylis, Lolium, pasto varilla, Phleum pratense), maíz, cáñamo, mijo, cebada, avena, centeno, sorgo, soja y trigo y verduras tales como remolachas. Cultivos adecuados para el ensilaje son las hierbas, tréboles, alfalfa, algarroba, avena, centeno y maíz habituales. El forraje incluye además residuos de cultivo de producción de granos (tal como rastrojos de maíz; paja de trigo, cebada, avena, centeno y otros granos); residuos de verduras como partes superiores de remolacha; residuos de la producción de semillas oleaginosas como tallos y hojas de soya, colza y otras legumbres; y fracciones del refino de granos para consumo humano o animal o de la producción de combustibles u otras industrias.

Forraje basto por lo general es material vegetal seco con altos niveles de fibra, tal como fibra, salvado, cáscaras de semillas y granos y residuos de cultivo (tal como rastrojos, copra, paja, paja fina, residuos de remolacha azucarera).

Las fuentes preferidas de materiales que contienen arabinoxilano son forraje, forraje basto, semillas y granos, caña azucarera, remolacha azucarera y pulpa de madera.

p-glucosidasa: El término "p-glucosidasa" se refiere a una p-D-glucósido-glucohidrolasa (E.C. 3.2.1.21) que cataliza la hidrólisis de los residuos de p-D-glucosa no reductores terminales con la liberación de p-D-glucosa. La actividad pglucosidasa se puede terminar utilizando como sustrato p-nitrofenil-p-D-glucopiranósido de acuerdo con el procedimiento de Venturi et al., 2002, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Una unidad de p-glucosidasa se define como 1.0 gmol del anión p-nitrofenolato producido por minuto a 25 °C y pH 4.8 a partir de p-nitrofenil-p-D-glucopiranósido 1 mM como sustrato en citrato de sodio 50 mM que contiene un 0.01% de TWEEN® 20.

p-xilosidasa: El término "p-xilosidasa" se refiere a una p-D-xilósido-xilohidrolasa (E.C. 3.2.1.37) que cataliza la exohidrólisis de p-(1^4)-xilooligosacáridos cortos para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos del extremo no reductor. La actividad p-xilosidasa se puede determinar utilizando como sustrato p-nitrofenil-p-D-xilósido en citrato de sodio 100 mM que contiene un 0.01% de TWEEN® 20 a pH 5, 40 °C. Se define una unidad de p-xilosidasa como 1.0 gmol del anión p-nitrofenolato producido por minuto a 40 °C, pH 5 a partir de p-nitrofenil-p-D-xilósido 1 mM en citrato de sodio 100 mM que contiene un 0.01% de TWEEN® 20.

ADNc: El término "ADNc" se refiere a una molécula de ADN que se puede preparar mediante transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm maduro, que ya ha experimentado corte y empalme, obtenido de una célula eucariota o procariota. El ADNc carece de las secuencias intrónicas que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de una serie de pasos, que incluyen el corte y empalme, antes de aparecer como un ARNm maduro que ya ha experimentado corte y empalme.

Celobiohidrolasa: El término "celobiohidrolasa" se refiere a la 1,4-p-D-glucano-celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.91 y E.C.

3.2.1.176) que cataliza la hidrólisis de uniones 1,4-p-D-glucosídicas en celulosa, celooligosacáridos o cualquier polímero que contenga glucosa con un enlace p-1,4, para liberar celobiosa a partir del extremo reductor (celobiohidrolasa I) o no reductor (celobiohidrolasa II) de la cadena (Teeri, 1997, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). La actividad de la celobiohidrolasa se puede determinar de acuerdo con los procedimientos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh y Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288; y Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581.

Enzima celulolítico o celulasa: El término "enzima celulolítica" o "celulasa" significa una o más (por ejemplo, varias) enzimas que hidrolizan un material celulósico. Tales enzimas incluyen una o más endoglucanasas, una o más celobiohidrolasas, una o más p-glucosidasas o combinaciones de estas. Las dos estrategias básicas para medir la actividad enzimática celulolítica incluyen: (1) medir la actividad enzimática celulolítica total y (2) medir las actividades enzimática celulolíticas individuales (endoglucanasas, celobiohidrolasas y p-glucosidasas) tal como se reseña en Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. La actividad enzimática celulolítica total se puede medir utilizando sustratos insolubles, incluidos el papel de filtro N.° 1 de Whatman, celulosa microcristalina, celulosa bacteriana, celulosa de algas, algodón, lignocelulosa pretratada, etc. El ensayo de actividad celulolítica total más común es el ensayo del papel de filtro utilizando papel de filtro N.° 1 de Whatman como sustrato. El ensayo se estableció por la International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Pure Appl. Chem. 59: 257 68).

Se puede determinar la actividad enzimática celulolítica midiendo el incremento de la producción/liberación de azúcares durante la hidrólisis de un material celulósico por parte de una o más enzimas celulolíticas en las siguientes condiciones: 1-50 mg de proteína enzimática celulolítica/g de celulosa en el rastrojo de maíz pretratado (PCS) (u otro material celulósico pretratado) durante 3-7 días a una temperatura adecuada tal como 40 °C-80 °C, por ejemplo, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, o 80 °C, y un pH adecuado, tal como 4-9, por ejemplo, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, o 9.0, en comparación con una hidrólisis de control sin adición de proteína enzimática celulolítica. Las condiciones típicas son reacciones de 1 mL, PCS lavado o sin lavar, un 5% de sólidos insolubles (peso seco), acetato de sodio 50 mM a pH 5, MnSÜ41 mM, 50 °C, 55 °C o 60 °C, 72 h, análisis de azúcar mediante una columna cromatográfica AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU.).

Material celulósico: La expresión "material celulósico" se refiere a cualquier material que contiene celulosa. La celulosa es un homopolímero de anhidrocelobiosa y, por lo tanto, un beta-(1-4)-D-glucano lineal, mientras que las hemicelulosas incluyen una diversidad de compuestos, tales como xilanos, xiloglucanos, arabinoxilanos y mananos en estructuras ramificadas complejas con un espectro de sustituyentes. Aunque generalmente es polimorfa, la celulosa se detecta en el tejido vegetal principalmente como una matriz cristalina insoluble de cadenas de glucano paralelas. Las hemicelulosas normalmente establecen enlaces de hidrógeno con la celulosa, así como con otras hemicelulosas, lo que ayuda a estabilizar la matriz de la pared celular.

Secuencia codificante: El término “secuencia codificante” se refiere a un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente mediante un marco de lectura abierta que comienza con un codón de iniciación como ATG, GTG o TTG y termina con un codón de terminación como TAA, ^tA^go TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de estos.

Secuencias de control: El término "secuencias de control" significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o exógena (es decir, de un gen diferente), respecto al polinucleótido que codifica el polipéptido o pueden ser nativas o exógenas entre sí. Las secuencias de control de este tipo incluyen, sin carácter limitante, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia propeptídica, un promotor, una secuencia de un péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencias de control pueden estar provistas de conectores a fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica un polipéptido.

Granos de cultivo: El término "granos de cultivo" incluye granos de, por ejemplo, maíz, arroz, cebada, frijol de sorgo, cáscaras de frutas y trigo. Los granos de maíz son ejemplares. Se conoce una diversidad de granos de maíz, incluyendo, por ejemplo, maíz dentiforme, maíz de pedernal, maíz de vaina, maíz rayado, maíz dulce, maíz ceroso y similares. En una realización, el grano de maíz es un grano de maíz dentiforme amarillo. El grano de maíz dentiforme amarillo tiene una cubierta exterior conocida como "Pericarpio" que protege el germen en los granos. Resiste el agua y el vapor de agua y es indeseable para los insectos y microorganismos. La única área de los granos no cubierta por el "pericarpio" es la "punta del núcleo", que es el punto de unión del grano a la mazorca.

Sólidos secos: El término "sólidos secos" es el total de sólidos de una suspensión en porcentaje sobre una base de peso seco.

Endoglucanasa: El término “endoglucanasa” se refiere a una 4-(1,3;1,4)-p-D-glucano-4-glucanohidrolasa (E.C.

3.2.1.4), que cataliza la endohidrólisis de las uniones 1,4-p-D-glucosídicas en la celulosa, derivados de celulosa (tales como carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa), liquenina, enlaces p-1,4 en glucanos p-1,3-1,4 mixtos tales como los p-D-glucanos o xiloglucanos de cereales y otros materiales vegetales que contienen componentes celulósicos. La actividad endoglucanasa se puede determinar midiendo la reducción en la viscosidad del sustrato o el incremento en los extremos reductores determinado mediante un ensayo de azúcares reductores (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). La actividad de endoglucanasa también puede determinarse usando carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato de acuerdo con el procedimiento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268, a pH 5 y 40 °C.

Expresión: El término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción de un polipéptido que incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional, y secreción.

Vector de expresión: El término "vector de expresión" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y está unida operativamente a secuencias de control que contemplan su expresión.

Fragmento: El término "fragmento" significa un polipéptido que tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos ausentes del extremo amino y/o carboxilo de un polipéptido maduro, donde el fragmento tiene actividad enzimática. En un aspecto, un fragmento con tiene al menos un 85%, por ejemplo, al menos un 90% o al menos un 95% de los residuos de aminoácidos del polipéptido maduro de una enzima.

Germen: El "Germen" es la única parte viva del grano de maíz. Contiene la información genética esencial, enzimas, vitaminas y minerales para que el grano se convierta en una planta de maíz. En el maíz dentiforme amarillo, aproximadamente el 25 por ciento del germen es aceite de maíz. El endospermo cubierto o rodeado por el germen comprende aproximadamente el 82 por ciento del peso seco del grano y es la fuente de energía (almidón) y proteína para la semilla en germinación. Hay dos tipos de endospermo, blando y duro. En el endosperma duro, el almidón se empaqueta herméticamente. En el endosperma blando, el almidón está suelto.

Moler o molienda: El término "molienda" se refiere a cualquier proceso que rompa el pericarpio y abra el grano de la cosecha.

Enzima hemicelulolítica o hemicelulasa: El término "enzima hemicelulolítica" o "hemicelulasa" significa una o más (por ejemplo, varias) enzimas que hidrolizan un material hemicelulósico. Remítase, por ejemplo, a Shallom y Shoham, 2003, Current Opinión In Microbiology 6(3): 219-228). Las hemicelulasas son componentes clave en la degradación de la biomasa vegetal. Los ejemplos de hemicelulasas incluyen, pero sin limitación, una acetilmanano esterasa, una acetilxilano esterasa, una arabinanasa, una arabinofuranosidasa, una esterasa de ácido cumárico, una feruloil esterasa, una galactosidasa, una glucuronidasa, una glucuronoil esterasa, una mananasa, una manosidasa, una xilanasa, y una xilosidasa. Los sustratos para estas enzimas, hemicelulosas, son un grupo heterogéneo de polisacáridos lineales y ramificados que se unen mediante enlaces de hidrógeno a las microfibrillas de celulosa en la pared celular vegetal, reticulándolas en una red robusta. Las hemicelulosas también se unen covalentemente a la lignina, y forman junto con la celulosa una estructura sumamente compleja. La organización y estructura variables de la hemicelulosa requieren la acción concertada de muchas enzimas para su degradación completa. Los módulos catalíticos de las hemicelulasas son bien glucósido-hidrolasas (GH) que hidrolizan enlaces glucosídicos, o bien carbohidrato-esterasas (CE) que hidrolizan uniones de tipo éster de los grupos laterales con acetato o ácido ferúlico. Estos módulos catalíticos, en función de la homología de su secuencia primaria, se pueden distribuir entre las familias GH y CE. Algunas familias, con un plegamiento similar, se pueden agrupar además en clanes, marcados alfabéticamente (por ejemplo, GH-A). Una clasificación más informativa y actualizada de estas y otras enzimas activas sobre carbohidratos está disponible en la base de datos de Enzimas Activas sobre Carbohidratos (CAZy, por sus siglas en inglés). Las actividades enzimáticas hemicelulolíticas se pueden medir de acuerdo con Ghose y Bisaria, 1987, Pure & AppI. Chem. 59: 1739-1752, a una temperatura adecuada, tal como 40 °C-80 °C, por ejemplo, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, o 80 °C, y un pH adecuado tal como 4-9, por ejemplo, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, o 9.0.

Xilano altamente ramificado: El término "xilano altamente ramificado" significa que se sustituyen más del 50% de las unidades de xilosilo en el esqueleto de arabinoxilano. Esto se calcula preferiblemente a partir del análisis de unión tal como se realiza en Huismann et al. Carbohydrate Polymers, 2000, 42:269-279.

Célula hospedadora: La expresión "célula hospedadora" se refiere a cualquier tipo de célula que es susceptible de transformación, transfección, transducción o similares con un constructo de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. La expresión "célula hospedadora" abarca cualquier descendencia de una célula progenitora que no sea idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que puedan producirse durante la replicación.

Aislado: El término "aislado" se refiere a una sustancia en una forma o entorno que no se encuentra en la naturaleza. Los ejemplos no limitativos de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia que no esté presente de manera natural, (2) cualquier sustancia, incluyendo, sin carácter limitante, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que se haya separado, al menos en parte, de uno o más o de todos los constituyentes que se producen de manera natural con los que está asociado en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por intervención humana con respecto a la sustancia que se encuentra en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada incrementando la cantidad de la sustancia con respecto a otros componentes con los que está asociada de manera natural (por ejemplo, producción recombinante en una célula huésped; copias múltiples de un gen que codifica la sustancia; y el uso de un promotor más potente que el promotor asociado de manera natural con el gen que codifica la sustancia).

Molido: El término "molido" se refiere al material vegetal que se ha descompuesto en partículas más pequeñas, por ejemplo, mediante trituración, fraccionamiento, molienda, pulverización, etc.

Polipéptido maduro: La expresión "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final después de la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como procesamiento N-terminal, truncamiento C-terminal, glucosilación, fosforilación, etc.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 302 de SEQ ID NO: 8 y los aminoácidos -26 a -1 de la SEQ ID NO: 2 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 302 de la SEQ ID NO: 9.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 303 de SEQ ID NO: 11 y los aminoácidos -26 a -1 de la SEQ ID NO: 11 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 303 de la SEQ ID NO: 12.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 382 de SEQ ID NO: 14 y los aminoácidos -21 a -1 de la SEQ ID NO: 15 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 382 de la SEQ ID NO: 15.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 378 de SEQ ID NO: 17 y los aminoácidos -17 a -1 de la SEQ ID NO: 17 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 378 de la SEQ ID NO: 18.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 311 de SEQ ID NO: 20 y los aminoácidos -20 a -1 de SEQ ID NO: 20 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 311 de la SEQ ID NO: 21.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 302 de SEQ ID NO: 23 y los aminoácidos -29 a -1 de la SEQ ID NO: 23 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 302 de la SEQ ID NO: 24.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 309 de SEQ ID NO: 26 y los aminoácidos -16 a -1 de la SEQ ID NO: 26 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 309 de la SEQ ID NO: 27.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 438 de SEQ ID NO: 29 y los aminoácidos -36 a -1 de la SEQ ID NO: 29 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 438 de la SEQ ID NO: 30. En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 446 de SEQ ID NO: 32 y los aminoácidos -27 a -1 de la SEQ ID NO: 32 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 446 de la SEQ ID NO: 33.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 438 de SEQ ID NO: 35 y los aminoácidos -36 a -1 de la SEQ ID NO: 35 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 438 de la SEQ ID NO: 36. En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 446 de SEQ ID NO: 38 y los aminoácidos -27 a -1 de la SEQ ID NO: 38 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 446 de la SEQ ID NO: 39.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 318 de SEQ ID NO: 41 y los aminoácidos -18 a -1 de la SEQ ID NO: 41 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 318 de la SEQ ID NO: 42. En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 326 de SEQ ID NO: 44 y los aminoácidos -18 a -1 de la SEQ ID NO: 44 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 326 de la SEQ ID NO: 45.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 302 de SEQ ID NO: 47 y los aminoácidos -25 a -1 de la SEQ ID NO: 47 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 302 de la SEQ ID NO: 48. En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 311 de SEQ ID NO: 50 y los aminoácidos -25 a -1 de la SEQ ID NO: 50 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 311 de la SEQ ID NO: 51.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 364 de SEQ ID NO: 53 y los aminoácidos -24 a -1 de la SEQ ID NO: 53 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 364 de la SEQ ID NO: 54. En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 373 de SEQ ID NO: 56 y los aminoácidos -24 a -1 de la SEQ ID NO: 56 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 373 de la SEQ ID NO: 57.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 436 de SEQ ID NO: 59 y los aminoácidos -31 a -1 de la SEQ ID NO: 59 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 436 de la SEQ ID NO: 60. En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 444 de SEQ ID NO: 62 y los aminoácidos -27 a -1 de la SEQ ID NO: 62 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 444 de la SEQ ID NO: 63.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 302 de SEQ ID NO: 65 y los aminoácidos -19 a -1 de la SEQ ID NO: 65 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 302 de la SEQ ID NO: 66. En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 311 de SEQ ID NO: 68 y los aminoácidos -19 a -1 de la SEQ ID NO: 68 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 311 de la SEQ ID NO: 69.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 183 de SEQ ID NO: 77 y los aminoácidos -27 a -1 de la SEQ ID NO: 77 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 302 de la SEQ ID NO: 78. En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 181 de SEQ ID NO: 80 y los aminoácidos -27 a -1 de la SEQ ID NO: 80 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 181 de la SEQ ID NO: 81.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 299 de SEQ ID NO: 83 y los aminoácidos -42 a -1 de la SEQ ID NO: 83 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 299 de la SEQ ID NO: 84. En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 307 de SEQ ID NO: 86 y los aminoácidos -27 a -1 de la SEQ ID NO: 86 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 307 de la SEQ ID NO: 87.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 306 de SEQ ID NO: 117 y los aminoácidos -26 a -1 de la SEQ ID NO: 117 son un péptido señal.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 306 de SEQ ID NO: 118 y los aminoácidos -26 a -1 de la SEQ ID NO: 118 son un péptido señal.

En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 300 de SEQ ID NO: 119 y los aminoácidos -19 a -1 de la SEQ ID NO: 119 son un péptido señal.

En un aspecto, el polipéptido maduro de una celobiohidrolasa I está constituido por los aminoácidos 26 a 532 de SEQ ID NO: 96 basándose en el programa SignalP 3.0 (Bendtsen et al., 2004, J. Mol. Biol. 340: 783-795) que predice que los aminoácidos 1 a 25 de SEQ ID NO: 96 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro de una celobiohidrolasa II está constituido por los aminoácidos 19 a 464 de SEQ ID NO: 98 basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los aminoácidos 1 a 18 de SEQ ID NO: 98 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro de una beta-glucosidasa está constituido por los aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 100 basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 100 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro de un polipéptido AA9 está constituido por los aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 102 basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los aminoácidos 1 a 25 de SEQ ID NO: 102 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro de una xilanasa GH10 está constituido por los aminoácidos 21 a 405 de SEQ ID NO: 104 basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los aminoácidos 1 a 20 de SEQ ID NO: 104 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro de una xilanasa GH10 está constituido por los aminoácidos 20 a 398 de SEQ ID NO: 106 basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 106 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro de una beta-xilosidasa está constituido por los aminoácidos 22 a 796 de SEQ ID NO: 108 basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 108 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro de una endoglucanasa I está constituido por los aminoácidos 23 a 459 de SEQ ID NO: 110 basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los aminoácidos 1 a 22 de SEQ ID NO: 110 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro de una endoglucanasa II está constituido por los aminoácidos 22 a 418 de SEQ ID NO: 112 basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 112 son un péptido señal. En un aspecto, el polipéptido maduro de una celobiohidrolasa I de A. fumigatus está constituido por los aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID ⁿO: 114 basándose en el programa SignalP 3.0 (Bendtsen et al., 2004, J. Mol. Biol. 340: 783-795) que predice que los aminoácidos 1 a 26 de SEQ ID NO: 114 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro de una celobiohidrolasa II de A. fumigatus está constituido por los aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 116 basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 116 son un péptido señal.

Existe constancia en la técnica de que una célula hospedadora puede producir una mezcla de dos o más polipéptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) expresado por el mismo polinucleótido. También existe constancia en la técnica de que diferentes células huésped procesan los polipéptidos de manera diferente y, por lo tanto, una célula huésped que exprese un polinucleótido puede producir un polipéptido maduro diferente (por ejemplo, que tiene un aminoácido diferente en el extremo C y/o el extremo N) en comparación con otra célula huésped que exprese el mismo polinucleótido.

Secuencia que codifica un polipéptido maduro: La expresión "secuencia que codifica el polipéptido maduro" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro. En un aspecto, la secuencia que codifica un polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos 79 a 987 de la SEQ ID NO: 10 y los nucleótidos 1 a 78 de la SEQ ID NO: 10 codifica un péptido señal.

En un aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro es la secuencia conjunta de nucleótidos 49 a 70 y nucleótidos 123 a 1027 de SEQ ID NO: 25 o la secuencia de ADNc de los mismos y los nucleótidos 1 a 48 dela SEQ ID NO: 25 codifican un péptido señal.

En un aspecto, la secuencia que codifica un polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos 109 a 1422 de la SEQ ID NO: 28 y los nucleótidos 1 a 108 de la SEQ ID NO: 28 codifica un péptido señal.

En un aspecto, la secuencia que codifica un polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos 82 a 1419 de la SEQ ID NO: 31 y los nucleótidos 1 a 81 de la SEQ ID NO: 31 codifica un péptido señal.

En un aspecto, la secuencia que codifica un polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos 109 a 1422 de la SEQ ID NO: 34 y los nucleótidos 1 a 108 de la S^eQ ID NO: 34 codifica un péptido señal.

En un aspecto, la secuencia que codifica un polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos 82 a 1419 de la SEQ ID No : 37 y los nucleótidos 1 a 81 de la SEQ Id NO: 37 codifica un péptido señal.

En un aspecto, la secuencia que codifica un polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos 76 a 981 de la SEQ ID NO: 46 y los nucleótidos 1 a 75 de la S^eQ ID NO: 46 codifica un péptido señal.

En un aspecto, la secuencia que codifica un polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos 76 a 1008 de la SEQ ID NO: 49 y los nucleótidos 1 a 75 de la SEQ Id NO: 49 codifica un péptido señal.

En un aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro es la secuencia conjunta de nucleótidos 73 a 318, nucleótidos 470 a 1298 y nucleótidos 1392 a 1408 de SEQ ID NO: 52 y los nucleótidos 1 a 72 de la SEQ ID NO: 52 codifica un péptido señal.

En un aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro es la secuencia conjunta de nucleótidos 73 a 318, nucleótidos 470 a 1298 y nucleótidos 1392 a 1435 de SEQ ID NO: 55 y los nucleótidos 1 a 72 de la SEQ ID NO: 55 codifica un péptido señal.

En un aspecto, la secuencia que codifica un polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos 94 a 1401 de la SEQ ID NO: 58 y los nucleótidos 1 a 93 de la SEQ Id NO: 58 codifica un péptido señal.

En un aspecto, la secuencia que codifica un polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos 82 a 1413 de la SEQ ID NO: 61 y los nucleótidos 1 a 81 de la SEQ Id NO: 61 codifica un péptido señal.

En un aspecto, la secuencia que codifica el polipéptido maduro es la secuencia conjunta de nucleótidos 58 a 330, nucleótidos 403 a 655, nucleótidos 795 a 948 y nucleótidos 1100 a 1325 de la SEQ ID NO: 64 y los nucleótidos 1 a 57 de la SEQ ID NO: 64 codifica un péptido señal.

En un aspecto, la secuencia que codifica el polipéptido maduro es la secuencia conjunta de nucleótidos 58 a 330, nucleótidos 403 a 655, nucleótidos 795 a 948 y nucleótidos 1100 a 1352 de la SEQ ID NO: 67 y los nucleótidos 1 a 57 de la SEQ ID NO: 67 codifica un péptido señal.

En un aspecto, la secuencia que codifica un polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos 127 a 1023 de la SEQ ID NO: 83 y los nucleótidos 1 a 126 de la S^eQ ID NO: 83 codifica un péptido señal.

En un aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro de una celobiohidrolasa I está constituida por los nucleótidos 76 a 1727 de SEQ ID NO: 95 o la secuencia de ADNc de los mismos basándose en el programa SignalP 3.0 (Bendtsen et al., 2004, anteriormente) que predice que los nucleótidos 1 a 75 de SEQ ID NO: 95 codifican un péptido señal. En otro aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro de una celobiohidrolasa II está constituida por los nucleótidos 55 a 1895 de SEQ ID NO: 97 o la secuencia de ADNc de los mismos basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los nucleótidos 1 a 54 de SEQ ID NO: 97 codifican un péptido señal. En otro aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro de a beta-glucosidasa está constituida por los nucleótidos 58 a 3057 de SEQ ID NO: 99 o la secuencia de ADNc de los mismos basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los nucleótidos 1 a 57 de SEQ ID NO: 99 codifican un péptido señal. En otro aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro de un polipéptido AA9 está constituida por los nucleótidos 76 a 832 de SEQ ID NO: 101 o la secuencia de ADNc de los mismos basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los nucleótidos 1 a 75 de SEQ ID NO: 101 codifican un péptido señal. En otro aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro de una xilanasa GH10 está constituida por los nucleótidos 124 a 1517 de SEQ ID NO: 103 o la secuencia de ADNc de los mismos basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los nucleótidos 1 a 123 de SEQ ID NO: 103 codifican un péptido señal. En otro aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro de una xilanasa GH10 está constituida por los nucleótidos 58 a 1194 de SEQ ID NO: 105 basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los nucleótidos 1 a 57 de SEQ ID NO: 105 codifican un péptido señal. En otro aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro de una beta-xilosidasa está constituida por los nucleótidos 64 a 2388 de SEQ ID NO: 107 basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los nucleótidos 1 a 63 de SEQ ID NO: 107 codifican un péptido señal. En otro aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro de una endoglucanasa I está constituida por los nucleótidos 67 a 1504 de SEQ ID NO: 109 o la secuencia de ADNc de los mismos basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los nucleótidos 1 a 66 de SEQ ID NO: 109 codifican un péptido señal. En otro aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro de una endoglucanasa II está constituida por los nucleótidos 64 a 1504 de SEQ ID NO: 111 basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los nucleótidos 1 a 63 de SEQ ID NO: 111 codifican un péptido señal. En un aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro de una celobiohidrolasa I de A. fumigatusestá constituida por los nucleótidos 79 a 1596 de SEQ ID NO: 113 basándose en el programa SignalP 3.0 (Bendtsen et al., 2004, anteriormente) que predice que los nucleótidos 1 a 78 de SEQ ID NO: 113 codifican un péptido señal. En otro aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro de una celobiohidrolasa II de A. fumigatus está constituida por los nucleótidos 58 a 1700 de SEQ ID NO: 115 o la secuencia de ADNc de los mismos basándose en el programa SignalP 3.0 que predice que los nucleótidos 1 a 57 de SEQ ID NO: 115 codifican un péptido señal.

Constructo de ácido nucleico: La expresión "constructo de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea mono- o bicatenaria, que se aísla a partir de un gen con un origen natural o se modifica para que contenga segmentos de ácidos nucleicos de un modo que, de otro modo, no existiría en la naturaleza o que es sintético, que comprende una o más secuencias de control.

Oligosacárido: El término "oligosacárido" es un compuesto que tiene de 2 a 10 unidades de monosacáridos.

Unido operativamente: La expresión “unido operativamente” se refiere a una configuración en la que se coloca una secuencia de control en una posición adecuada con respecto a la secuencia codificante de un polinucleótido de modo que la secuencia de control dirija la expresión de la secuencia codificante.

Proteasa: El término "enzima proteolítica" o "proteasa" se refiere a una o más (por ejemplo, varias) enzimas que descomponen el enlace amida de una proteína por hidrólisis de los enlaces peptídicos que unen los aminoácidos entre sí en una cadena polipeptídica. Una proteasa puede incluir, por ejemplo, una metaloproteasa, una serina proteasa de tipo tripsina, una serina proteasa de tipo subtilisina, y proteasa aspártica.

Identidad de secuencia: El grado de relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el parámetro "identidad secuencial".

Para los fines de la presente invención, el grado de identidad de la secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) según se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 3.0.0 o versiones posteriores. Se utilizó la versión 6.1.0. Los parámetros opcionales utilizados son una penalización por la apertura de un hueco de 10, una penalización por la extensión de un hueco de 0.5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). El resultado marcado según Needle como "identidad más larga" (obtenido usando la opción -no corto) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula del siguiente modo:

(Restos Idénticos x 100)/(Longitud del Alineamiento - Número Total de Huecos en el Alineamiento)

A los efectos de la presente invención, el grado de identidad secuencial entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, mencionado anteriormente) según se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite”, Rice et al., 2000, mencionado anteriormente), preferentemente la versión 3.0.0 o versiones posteriores. Se utilizó la versión 6.1.0. Los parámetros opcionales utilizados son una penalización por la apertura de un hueco de 10, una penalización por la extensión de un hueco de 0.5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado marcado según Needle como "identidad más larga" (obtenido usando la opción -no corto) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula del siguiente modo:

(Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(Longitud de la alineación - Número total de huecos en la alineación)

Almidón: El término "almidón" se refiere a cualquier material compuesto por polisacáridos complejos de plantas, compuesto por unidades de glucosa que se encuentra ampliamente en los tejidos vegetales en forma de gránulos de almacenamiento, que consiste en amilosa y amilopectina, y representado como (C6H10O5)n, donde n es cualquier número.

Remojar o remojo: El término "remojo" significa empapar el grano de la cosecha con agua y opcionalmente SO2.

Condiciones de rigurosidad: Las diferentes condiciones de rigurosidad se definen de la siguiente manera.

La expresión “condiciones de rigurosidad muy bajas” se refiere, para sondas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, a la prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y un 25% de formamida, siguiendo los procedimientos estándar de transferencia de Southern durante 12-24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, usando 2.0X SSC, SDS al 0.2% a 60 °C.

La expresión "condiciones de rigurosidad baja" se refiere, para sondas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, a la prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y un 25% de formamida, siguiendo los procedimientos estándar de transferencia de Southern durante 12-24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, usando 1.0X SSC, SDS al 0.2% a 60 °C.

La expresión "condiciones de rigurosidad media" se refiere, para sondas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, a la prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y un 35% de formamida, siguiendo los procedimientos estándar de transferencia de Southern durante 12-24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, usando 1.0X SSC, SDS al 0.2% a 65 °C.

La expresión “condiciones de rigurosidad media-alta” se refiere, para sondas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, a la prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y un 35% de formamida, siguiendo los procedimientos estándar de transferencia de Southern durante 12-24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, usando 1.0X SSC y SDS al 0.2% a 70 °C.

La expresión "condiciones de rigurosidad alta" se refiere, para sondas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, a la prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y un 50% de formamida, siguiendo los procedimientos estándar de transferencia de Southern durante 12-24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 0.5X SSC y un 0.2% de SDS a 70 °C.

La expresión “condiciones de rigurosidad muy alta” se refiere, para sondas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, a la prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y un 50% de formamida, siguiendo los procedimientos estándar de transferencia de Southern durante 12-24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, usando 0.5X SSC, SDS al 0.2% a 75 °C.

Subsecuencia: El término "subsecuencia" significa un polinucleótido que tiene uno o más (p. ej., varios) nucleótidos ausentes del extremo 5' y/o 3' de una secuencia que codifica un polipéptido maduro; en donde la subsecuencia codifica un fragmento que tiene actividad arabinofuranosidasa o xilanasa.

Polipéptido sustancialmente puro: La expresión "polipéptido sustancialmente puro" se refiere a un preparado que contiene como máximo el 10%, como máximo el 8%, como máximo el 6%, como máximo el 5%, como máximo el 4%, como máximo el 3%, como máximo el 2%, como máximo el 1% y como máximo el 0.5% en peso de otro material polipeptídico con el que está asociado de manera natural o recombinante. Preferiblemente, el polipéptido tiene una pureza de al menos un 92%, por ejemplo, una pureza de al menos un 94%, una pureza de al menos un 95%, una pureza de al menos un 96%, una pureza de al menos un 97%, una pureza de al menos un 98%, al menos un 99%, una pureza de al menos un 99.5%, y una pureza de un 100% en peso del material polipeptídico total presente en la preparación. Los polipéptidos de la presente invención se encuentran preferiblemente en una forma sustancialmente pura. Esto puede conseguirse, por ejemplo, preparando el polipéptido mediante métodos recombinantes bien conocidos o mediante métodos de purificación clásicos.

Variante: El término "variante" significa un polipéptido que tiene actividad xilanasa o arabinofuranosidasa que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción de uno o más (varios) residuos de aminoácidos en una o más (varias) posiciones. Una sustitución se refiere al reemplazo de un aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una deleción se refiere a la eliminación de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción se refiere a una adición de 1-3 aminoácidos adyacentes a un aminoácido que ocupa una posición.

Beneficio de molienda en húmedo: El término "beneficio de molienda en húmedo" significa uno o más de rendimiento y/o pureza de almidón mejorados, calidad y/o rendimiento de gluten mejorados, mejor fibra, gluten o filtración de agua de remojo, deshidratación y evaporación, una separación de germen más fácil y/o una mejor filtración post sacarificación, y el ahorro de energía de proceso de los mismos.

Actividad de degradación de xilano o actividad xilanolítica: La expresión "actividad de degradación de xilano" o "actividad xilanolítica" se refiere a una actividad biológica que hidroliza el material que contiene xilano. Las dos estrategias básicas para medir la actividad xilanolítica incluyen: (1) medir la actividad xilanolítica total y (2) medir las actividades xilanolíticas individuales (por ejemplo, endoxilanasas, p-xilosidasas, arabinofuranosidasas, aglucuronidasas, acetilxilano esterasas, feruloíl-esterasas y a-glucuronil-esterasas). Los avances recientes en los ensayos con las enzimas xilanolíticas se resumen en varias publicaciones incluidas Biely y Puchard, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova y Biely, 2006, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; Herrmann et al., 1997, Biochemical Journal 321: 375-381.

La actividad de degradación de xilano total se puede medir determinando los azúcares reductores formados a partir de varios tipos de xilano, incluidos, por ejemplo, xilanos de espelta de avena, madera de haya y madera de alerce, o por la determinación fotométrica de fragmentos de xilano teñidos liberados a partir de varios xilanos teñidos de manera covalente. Un ensayo de actividad xilanolítica total común se basa en la producción de azúcares reductores a partir del 4-O-metilglucuronoxilano polimérico tal como se ha descrito en Bailey et al., 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270. La actividad xilanasa también se puede determinar con un 0.2% de AZCL-arabinoxilano como sustrato en TRITON® X-100 al 0.01% y fosfato de sodio 200 mM, pH 6 a 37 °C. Una unidad de actividad xilanasa se define como 1.0 gmol de azurina producido por minuto a 37 °C, pH 6 a partir de un 0.2% de AZCL-arabinoxilano como sustrato en fosfato de sodio 200 mM, pH 6.

La actividad de degradación del xilano se determina midiendo el incremento en la hidrólisis de xilano de madera de abedul (Sigma Chemical Co., Inc., S. Luis, MO, EE. UU.) por parte de la enzima o las enzimas que degradan xilano en las siguientes condiciones clásicas: Reacciones de 1 ml, 5 mg/ml de sustrato (sólidos totales), 5 mg de proteína xilanolítica/g de sustrato, acetato de sodio 50 mM a pH 5, 50 °C, 24 horas, análisis de azúcar usando un ensayo de hidrazida del ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) como se describe por Lever, 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279.

Xilanasa: El término "xilanasa" se refiere a la 1,4-p-D-xilan-xilohidrolasa (E.C. 3.2.1.8) que cataliza la endohidrólisis de uniones 1,4-beta-D-xilosídicas en xilanos. La actividad xilanasa se puede determinar con un 0.2% de AZCL-arabinoxilano como sustrato en TRITON® X-100 al 0.01% y fosfato de sodio 200 mM, pH 6 a 37 °C. Una unidad de actividad xilanasa se define como 1.0 gmol de azurina producido por minuto a 37 °C, pH 6 a partir de un 0.2% de AZCL-arabinoxilano como sustrato en fosfato de sodio 200 mM, pH 6.

Nomenclatura

Para los fines de la presente invención, la nomenclatura [Y/F] significa que el aminoácido en esta posición puede ser una tirosina (Try, Y) o una fenilalanina (Phe, F). Asimismo la nomenclatura [V/G/A/I] significa que el aminoácido en esta posición puede ser una valina (Val, V), glicina (Gly, G), alanina (Ala, A) o isoleucina (Ile, I), y así sucesivamente para otras combinaciones tal como se describe en la presente. A menos que se limite adicionalmente de otro modo, el aminoácido X se define de manera que puede ser cualquiera de los 20 aminoácidos naturales.

Descripción detallada de la invención

Por consiguiente, es un objeto de la invención proporcionar procedimientos mejorados de tratamiento de granos de cultivo para proporcionar almidón de alta calidad.

En una realización, las composiciones enzimáticas útiles en los procesos de la invención proporcionan beneficios que incluyen, mejorar el rendimiento y/o pureza del almidón, mejorar la calidad y/o el rendimiento del gluten, mejorar la fibra, el gluten o la filtración de agua de remojo, deshidratación y evaporación, separación del germen más fácil y/o una mejor filtración posterior a la sacarificación, y ahorro de energía de proceso de los mismos.

Además, los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que las enzimas útiles de acuerdo con la invención proporcionan reducción en la masa de fibra y menor contenido de proteína de la fibra debido a una mejor separación tanto de las fracciones de almidón como de proteína de la fracción de fibra. Separar el almidón y el gluten de la fibra es valioso para la industria porque la fibra es el producto menos valioso del proceso de molienda en húmedo, y es deseable almidón y proteína de mayor pureza.

Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que la sustitución de parte de la actividad de proteasa en una composición enzimática puede proporcionar una mejora sobre una composición por lo demás similar que contiene predominantemente actividad de proteasa sola. Esto puede proporcionar un beneficio a la industria, por ejemplo, sobre la base del coste y la facilidad de uso.

El proceso de molienda

Los granos se muelen para abrir la estructura y permitir un procesamiento adicional y para separar los granos en los cuatro componentes principales: almidón, germen, fibra y proteína.

En una realización, se usa un proceso de molienda en húmedo. La molienda en húmedo proporciona una muy buena separación de germen y harina (gránulos de almidón y proteína) y a menudo se aplica en lugares donde hay una producción paralela de jarabes.

Los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que la calidad del producto final de almidón puede mejorarse tratando los granos de cultivo en los procesos como se describe en el presente documento.

Los procesos de la invención dan como resultado, en comparación con procesos tradicionales, una calidad de almidón superior, ya que el producto de almidón final es más puro y/o se obtiene un rendimiento más alto y/o se usa menos tiempo de proceso. Otra ventaja puede ser que la cantidad de productos químicos, tales como SO2 y NaHSO3, que han de utilizarse, puede reducirse o incluso eliminarse por completo.

Molienda en húmedo

El almidón se forma en las células vegetales en forma de gránulos minúsculos insolubles en agua. Cuando se introducen en agua fría, los gránulos de almidón pueden absorber una pequeña cantidad del líquido e hincharse. A temperaturas de hasta aproximadamente 50 °C a 75 °C, el hinchado puede ser reversible. Sin embargo, con temperaturas más altas comienza un hinchado irreversible denominado "gelatinización". El almidón granular a procesar de acuerdo con la presente invención puede ser un material que contiene almidón en bruto que comprende granos enteros (por ejemplo, molidos) que incluyen fracciones diferentes de almidón, tales como residuos de germen y fibras. Se puede reducir el tamaño de partícula de la materia prima, tal como los granos enteros, por ejemplo, moliendo en húmedo, con el fin de abrir la estructura y permitir un procesamiento adicional. La molienda húmeda proporciona una buena separación del germen y la harina (gránulos de almidón y proteína) y a menudo se aplica en lugares donde el hidrolizado de almidón se usa en la producción de, por ejemplo, jarabes.

En una realización, el tamaño de partícula se reduce hasta entre 0.05-3.0 mm, preferentemente 0.1-0.5 mm, o de un modo tal que al menos un 30%, preferentemente al menos un 50%, más preferentemente al menos un 70%, aún más preferentemente al menos un 90% del material que contiene almidón pase a través de un tamiz con una malla de 0.05 3.0 mm, preferentemente una malla de 0.1-0.5 mm.

Más particularmente, la degradación de los granos de maíz y otros granos de cultivo en almidón adecuada para la conversión de almidón en mono y oligosacáridos, etanol, edulcorantes, etc., consiste esencialmente en cuatro etapas:

1. Remojo y separación del germen,

2. Lavado y secado de fibras,

3. Separación del gluten del almidón, y

4. Lavado del almidón.

1. Remojo y separación del germen

Los granos de maíz se ablandan sumergiéndolos en agua durante entre aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas, preferiblemente de 30 minutos a aproximadamente 15 horas, tal como de 1 hora a 6 horas aproximadamente a una temperatura de aproximadamente 50 °C, tal como entre aproximadamente 45 °C a 60 °C. Durante el remojo, los granos absorben agua, aumentando sus niveles de humedad del 15 por ciento al 45 por ciento y más del doble de su tamaño. La adición opcional de, por ejemplo, el 0.1 por ciento de dióxido de azufre (SO2) y/o NaHSO3 en el agua evita el crecimiento excesivo de bacterias en el entorno cálido. A medida que el maíz se hincha y se ablanda, la leve acidez del agua de remojo comienza a soltar los enlaces de gluten dentro del maíz y liberar el almidón. Después de que los granos de maíz estén empapados, se rompen para liberar el germen. El germen contiene el valioso aceite de maíz. El germen se separa de la mezcla de densidad más pesada de almidón, cáscaras y fibras esencialmente "haciendo flotar" el segmento de germen libre de otras sustancias en condiciones muy controladas. Este método sirve para eliminar cualquier efecto adverso de las trazas de aceite de maíz en las etapas de procesamiento posteriores.

En una realización de la invención, los granos se sumergen en agua durante 2-10 horas, preferiblemente aproximadamente 3-5 horas a una temperatura en el intervalo entre 40 y 60 °C, preferiblemente aproximadamente a 50 2C.

En una realización, se puede añadir el 0.01-1%, preferiblemente el 0.05-0.3%, especialmente el 0.1% de SO2 y/o NaHSO3 durante la inmersión.

2. Lavado y secado de fibras

Para obtener la máxima recuperación de almidón, manteniendo al mismo tiempo cualquier fibra en el producto final a un mínimo absoluto, es necesario lavar el almidón libre de la fibra durante el procesamiento. La fibra se recoge, se suspende y se tamiza para recuperar cualquier almidón o proteína residual.

3. Separación del gluten del almidón

La suspensión de gluten del almidón de la etapa de lavado de la fibra, denominada almidón de molienda, se separa en almidón y gluten. El gluten tiene una baja densidad en comparación con el almidón. Pasando el almidón de molienda a través de una centrífuga, el gluten se desprende fácilmente.

4. Lavado del almidón

La suspensión de almidón de la etapa de separación del almidón contiene parte de proteína insoluble y gran parte de los solubles. Deben retirarse antes de que se pueda fabricar un almidón de alta calidad (almidón de alta pureza). El almidón, con solo el uno o dos por ciento de proteína restante, se diluye, se lava de 8 a 14 veces, se vuelve a diluir y se lava de nuevo en hidrociclones para eliminar la última traza de proteína y producir almidón de alta calidad, típicamente más del 99.5% de pureza.

Productos

La molienda en húmedo se puede usar para producir, sin limitación, licor de maíz, pienso de gluten de maíz, germen, aceite de maíz, harina de gluten de maíz, almidón de maíz, almidón de maíz modificado, jarabes tales como jarabe de maíz, y etanol de maíz.

Polipéptidos que tienen actividad arabinofuranosidasa

Las realizaciones preferidas del aspecto de la invención relacionadas con el polipéptido GH62 que tiene actividad de arabinofuranosidasa se describen a continuación en el presente documento. Los detalles adicionales de los polipéptidos GH62 preferidos que tienen actividad arabinofuranosidasa se encuentran en el documento PCT/CN2015/071015 presentado el 19 de enero de 2015.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 8 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En otra realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 11 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 12 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En otra realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 14 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 15 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En otra realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 17 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 18 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En otra realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 20 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 21 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En otra realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 23 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 24 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En otra realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 26 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 27 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En otra realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 29 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 30 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En otra realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 35 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 36 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En otra realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 41 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 42 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En otra realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 47 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 48 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En otra realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 53 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 54 de al menos un 80%, de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100%.

En otra realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 59 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 60 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En otra realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 65 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 66 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 117 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 118 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

Fuentes de polipéptidos

Un polipéptido que tiene actividad arabinofuranosidasa o xilanasa de la presente invención puede obtenerse de microorganismos de cualquier género. A los efectos de la presente invención, la expresión "obtenido a partir de", tal como se utiliza en la presente en relación con una fuente determinada, significará que el polipéptido codificado por un polinucleótido es producido por la fuente o por una cepa en la cual se ha insertado el polinucleótido procedente de la fuente. En un aspecto, el polipéptido obtenido a partir de una fuente determinada se secreta extracelularmente. El polipéptido puede ser un polipéptido fúngico. En una realización, el polipéptido es de un hongo del orden Eurotiales, o de la familia Aspergillaceae, o del género Penicillium o de la especie Penicillium aurantiogriseum, Penicillium oxalicum o Penicillium capsulatum.

En una realización, el polipéptido es de un hongo del orden Eurotiales, o de la familia Aspergillaceae, o del género Aspergillus o de la especie Aspergillus clavatus o Aspergillus wentii o Aspergillus niger.

En una realización, el polipéptido es de un hongo del orden Eurotiales, o de la familia Aspergillaceae, o del género Neosartorya o de la especie Neosartorya fischeri.

En una realización, el polipéptido es de un hongo del orden Eurotiales, o de la familia Trichocomaceae, o del género Talaromyces o de la especie Talaromyces pinophilus.

En una realización, el polipéptido es de un hongo del orden Ustilaginales, o de la familia Ustilaginaceae, o del género Ustilago o de la especie Ustilago maydis.

En una realización, el polipéptido es de un hongo del filo Ascomycota, o del género Acrophialophora o de la especie Acrophialophora fusispora.

El polipéptido puede ser un polipéptido bacteriano. En una realización, el polipéptido es de una bacteria del orden Actinomycetales, o de la familia Streptomycetaceae, o del género Streptomyces o de la especie Streptomyces nitrosporeus o Streptomyces beijiangensis.

En una realización, el polipéptido es de una bacteria del orden Actinomycetales, o de la familia Streptosporangiaceae, o del género Streptosporangium o de la especie Streptosporangium sp-60756.

Se entenderá que para las especies mencionadas anteriormente, la invención abarca tanto los estados perfectos como los imperfectos y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de la especie con el que se los conoce. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados.

El público puede acceder fácilmente a cepas de estas especies en una serie de colecciones de cultivos, tales como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

El polipéptido puede identificarse y obtenerse de otras fuentes que incluyen microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, suelo, abono, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, suelo, abono, agua, etc.) utilizando las sondas mencionadas anteriormente. En la técnica son muy conocidas las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente a partir de hábitats naturales. Un polinucleótido que codifica el polipéptido entonces puede obtenerse examinando de manera similar una biblioteca de ADN genómico o ADNc de otro microorganismo o una muestra de ADN mezclada. Una vez que el polinucleótido que codifica un polipéptido ha sido detectado con la sonda o las sondas, el polinucleótido puede aislarse o clonarse utilizando técnicas que son conocidas por los expertos en la técnica (véase por ejemplo, Sambrook et al., 1989, mencionado anteriormente).

Composiciones enzimáticas

Preferiblemente, las composiciones están enriquecidas en los polipéptidos útiles de acuerdo con la invención. El término "enriquecido" indica que la actividad enzimática de la composición se ha aumentado, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de al menos 1.1, tal como al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 2.0, al menos 3.0, al menos 4.0, al menos 5.0, al menos 10. En una realización, la composición comprende los polipéptidos del primer aspecto de la invención y uno o más agentes de formulación, tal como se describe en la sección de ‘agente de formulación' a continuación.

Las composiciones pueden comprender un polipéptido de la presente invención como el componente enzimático principal, por ejemplo, una composición monocomponente. Una composición de este tipo puede comprender además un agente de formulación, tal como se describe en la sección de ‘agente de formulación' a continuación. Alternativamente, las composiciones pueden comprender múltiples actividades enzimáticas, tal como una o más (p. ej., varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste en fitasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa, glucoronidasa, lisofosfolipasa, amilasa, beta-glucanasa, arabinofuranosidasa, beta-xilosidasa, endo-1,4-beta-xilanasa, acetil-xilano esterasa, feruloilo esterasa, celulasa, celobiohidrolasa, beta-glucosidasa, pululanasa, o cualquier mezcla de las mismas. Se contemplan particularmente actividades celulolíticas adicionales, como se detalla a continuación.

Cuando se contempla actividad arabinofuranosidasa y xilanasa, en la actualidad se contempla que la xilanasa se use en una o más de las siguientes cantidades (intervalos de dosificación): 0.01-200; 0.05-100; 0.1-50; 0.2-20; 0.1-1; 0.2 2; 0.5-5; o 1-10 siendo todos estos intervalos en mg de proteína xilanasa por kg de sustrato (ppm). En la actualidad, se contempla que la arabinofuranosidasa se administre en una o más de las siguientes cantidades (intervalos de dosificación): 0.01-200; 0.05-100; 0.1-50; 0.2-20; 0.1-1; 0.2-2; 0.5-5; o 1-10 siendo todos estos intervalos en mg de proteína arabinofuranosidasa por kg de sustrato (ppm). Además se contempla que la razón de la xilanasa GH10 o GH11 con respecto a arabinofuranosidasa GH62 esté en el intervalo de 100:1 a 1:100 de xilanasa:arabinofuranosidasa tal como los intervalos de 50:1 a 1:50, de 50:1 a 1:10, de 25:1 a 1:5, de 10:1 a 1:2 o tal como de 10:1 a 1:50, de 5:1 a 1:25, de 2:1 a 1:10 de xilanasa:arabinofuranosidasa.

Agente de formulación

La enzima de la invención puede formularse como un líquido o un sólido. Para una formulación líquida, el agente de formulación puede comprender un poliol (tal como por ejemplo glicerol, etilenglicol o propilenglicol), una sal (tal como por ejemplo cloruro de sodio, benzoato de sodio, sorbato de potasio) o un azúcar o derivado de azúcar (tal como por ejemplo dextrina, glucosa, sacarosa, y sorbitol). Por tanto en una realización, la composición es una composición líquida que comprende el polipéptido de la invención y uno o más agentes de formulación seleccionados de la lista que consiste en glicerol, etilenglicol, 1,2-propilenglicol, 1,3-propilenglicol, cloruro de sodio, benzoato de sodio, sorbato de potasio, dextrina, glucosa, sacarosa, y sorbitol.

Para una formulación sólida, la formulación puede encontrarse por ejemplo como un gránulo, polvo secado por pulverización o aglomerado. El agente de formulación puede comprender una sal (sales orgánicas o inorgánicas de zinc, sodio, potasio o calcio tales como por ejemplo acetato de calcio, benzoato de calcio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, sorbato de calcio, sulfato de calcio, acetato de potasio, benzoato de potasio, carbonato de potasio, cloruro de potasio, citrato de potasio, sorbato de potasio, sulfato de potasio, acetato de sodio, benzoato de sodio, carbonato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, sulfato de sodio, acetato de zinc, benzoato de zinc, carbonato de zinc, cloruro de zinc, citrato de zinc, sorbato de zinc, sulfato de zinc), almidón o un azúcar o derivado de azúcar (tal como por ejemplo sacarosa, dextrina, glucosa, lactosa, sorbitol).

En una realización, la composición sólida está en forma granulada. El gránulo puede tener una estructura de matriz en la que los componentes se mezclan de manera homogénea. Sin embargo, el gránulo típicamente comprende una partícula núcleo y uno o más recubrimientos, que son típicamente recubrimientos de sal y/o cera. La partícula central puede ser o bien una mezcla homogénea de xilanasa de la invención opcionalmente combinada con una o más enzimas adicionales y opcionalmente junto con una o más sales o bien una partícula inerte con la xilanasa de la invención opcionalmente combinada con una o más enzimas adicionales aplicadas a la misma.

En una realización, el material de las partículas centrales se seleccionan del grupo que consiste en sales inorgánicas (tal como acetato de calcio, benzoato de calcio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, sorbato de calcio, sulfato de calcio, acetato de potasio, benzoato de potasio, carbonato de potasio, cloruro de potasio, citrato de potasio, sorbato de potasio, sulfato de potasio, acetato de sodio, benzoato de sodio, carbonato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, sulfato de sodio, acetato de zinc, benzoato de zinc, carbonato de zinc, cloruro de zinc, citrato de zinc, sorbato de zinc, sulfato de zinc), almidón o un azúcar o derivado de azúcar (tal como p. ej. sacarosa, dextrina, glucosa, lactosa, sorbitol), azúcar o derivado de azúcar (tal como p. ej. sacarosa, dextrina, glucosa, lactosa, sorbitol), moléculas orgánicas pequeñas, almidón, harina, celulosa y minerales.

El recubrimiento de sal tiene típicamente un espesor de al menos 1 pm y puede ser una sal particular o una mezcla de sales, tal como Na²SÜ⁴, K²SO⁴, MgSÜ⁴y/o citrato de sodio. Otros ejemplos son aquellos descritos en, por ejemplo, los documentos WO 2008/017659, WO 2006/034710, WO 1997/05245, WO 1998/54980, WO 1998/55599, WO 2000/70034 o recubrimiento de polímero tal como se describe en el documento WO 2001/00042.

En otra realización, la composición es una composición sólida que comprende la xilanasa de la invención y uno o más agentes de formulación seleccionados de la lista que consiste en cloruro de sodio, benzoato de sodio, sorbato de potasio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, sulfato de magnesio, tiosulfato de sodio, carbonato de calcio, citrato de sodio, dextrina, glucosa, sacarosa, sorbitol, lactosa, almidón y celulosa. En una realización preferida, el agente de formulación se selecciona de uno o más de los siguientes compuestos: sulfato de sodio, dextrina, celulosa, tiosulfato de sodio y carbonato de calcio. En una realización preferida, la composición sólida está en forma granulada. En una realización, la composición sólida está en forma granulada y comprende una partícula central, una capa de enzima que comprende la xilanasa de la invención y un recubrimiento de sal.

En una realización adicional, el agente de formulación se selecciona de uno o más de los siguientes compuestos: glicerol, etilenglicol, 1,2-propilenglicol o 1,3-propilenglicol, cloruro de sodio, benzoato de sodio, sorbato de potasio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, sulfato de magnesio, tiosulfato de sodio, carbonato de calcio, citrato de sodio, dextrina, glucosa, sacarosa, sorbitol, lactosa, almidón y celulosa. En una realización preferida, el agente de formulación se selecciona de uno o más de los siguientes compuestos: 1,2-propilenglicol, 1,3-propilenglicol, sulfato de sodio, dextrina, celulosa, tiosulfato de sodio y carbonato de calcio.

Material a base de plantas de la subfamilia Panicoideae

En una realización, el material a base de plantas de la subfamilia Panicoideae es de la tribu Andropogoneae tal como el rango Andropogon o Andropterum o Apluda o Apocopis o Arthraxon o Bothriochloa o Capillipedium o Chionachne o Chrysopogon o Coelorachis o Coix o Cymbopogon o Dichanthium o Diheteropogon o Dimeria o Elionurus o Eremochloa o Euclasta o Eulalia o Germainia o Hemarthria o Heteropholis o Heteropogon o Hyparrhenia o Hyperthelia o Imperata o Ischaemum o Iseilema o Kerriochloa o Microstegium o Miscanthidium o Miscanthus o Mnesithea o Ophiuros o Oxyrhachis o Phacelurus o Pholiurus o Pogonatherum o Polytoca o Polytrias o Pseudopogonatherum o Pseudosorghum o Rhytachne o Rottboellia o Saccharum o Sarga o Schizachyrium o Sehima o Sorghastrum o Sorghum o Spodiopogon o Thaumastochloa o Thelepogon o Themeda o Trachypogon o Triarrhena o Tripsacum o Urelytrum o Vetiveria o Vossia o Xerochloa o Zea.

En una realización preferida, el material a base de plantas de la subfamilia Panicoideae es del rango Zea, tal como las especies Zea diploperennis, Zea luxurians, Zea mays, Zea nicaraguensis o Zea perennis.

En una realización preferida, el material a base de plantas de la subfamilia Panicoideae es del rango Sorghum, tal como la especie Sorghum amplum, Sorghum angustum, Sorghum arundinaceum, Sorghum australiense, Sorghum bicolor, Sorghum brachypodum, Sorghum bulbosum, Sorghum ecarinatum, Sorghum exstans, Sorghum grande, Sorghum halepense, Sorghum hybrid cultivar, Sorghum interjectum, Sorghum intrans, Sorghum laxiflorum, Sorghum leiocladum, Sorghum macrospermum, Sorghum matarankense, Sorghum nitidum, Sorghum plumosum, Sorghum propinquum, Sorghum purpureosericeum, Sorghum stipoideum, Sorghum sudanense, Sorghum timorense, Sorghum versicolor, Sorghum sp. ’Silk’o Sorghum sp. como se define en el documento WO2007/002267.

En otra realización, el material a base de plantas de la subfamilia Panicoideae es de la tribu Paniceae tal como el rango Acritochaete, Acroceras, Alexfloydia, Alloteropsis, Amphicarpum, Ancistrachne, Anthephora, Brachiaria, Calyptochloa, Cenchrus, Chaetium, Chaetopoa, Chamaeraphis, Chlorocalymma, Cleistochloa, Cyphochlaena, Cyrtococcum, Dichanthelium, Digitaria, Dissochondrus, Echinochloa, Entolasia, Eriochloa, Homopholis, Hygrochloa, Hylebates, Ixophorus, Lasiacis, Leucophrys, Louisiella, Megaloprotachne, Megathyrsus, Melinis, Microcalamus, Moorochloa, Neurachne, Odontelytrum, Oplismenus, Ottochloa, Panicum, Paractaenum, Paraneurachne, Paratheria, Parodiophyllochloa, Paspalidium, Pennisetum, Plagiosetum, Poecilostachys, Pseudechinolaena, Pseudochaetochloa, Pseudoraphis, Rupichloa, Sacciolepis, Scutachne, Setaria, Setariopsis, Snowdenia, Spinifex, Stenotaphrum, Stereochlaena, Thrasya, Thuarea, Thyridolepis, Tricholaena, unclassified Paniceae, Uranthoecium, Urochloa, Walwhalleya, Whiteochloa, Yakirra, Yvesia, Zuloagaea o Zygochloa.

En una realización preferida, el material a base de plantas de la subfamilia Panicoideae es del rango Panicum, tal como la especie Panicum adenophorum, Panicum aff. aquaticum JKT-2012, Panicum amarum, Panicum antidotale, Panicum aquaticum, Panicum arctum, Panicum arundinariae, Panicum atrosanguineum, Panicum auricomum, Panicum auritum, Panicum bartlettii, Panicum bergii, Panicum bisulcatum, Panicum boliviense, Panicum brazzavillense, Panicum brevifolium, Panicum caaguazuense, Panicum campestre, Panicum capillare, Panicum cayennense, Panicum cayoense, Panicum cervicatum, Panicum chloroleucum, Panicum claytonii, Panicum coloratum, Panicum cyanescens, Panicum decompositum, Panicum deustum, Panicum dichotomiflorum, Panicum dinklagei, Panicum distichophyllum, Panicum dregeanum, Panicum elephantipes, Panicum fauriei, Panicum flexile, Panicum fluviicola, Panicum gouinii, Panicum gracilicaule, Panicum granuliferum, Panicum guatemalense, Panicum hallii, Panicum heterostachyum, Panicum hirticaule, Panicum hirtum, Panicum hylaeicum, Panicum incumbens, Panicum infestum, Panicum italicum, Panicum laetum, Panicum laevinode, Panicum lanipes, Panicum larcomianum, Panicum longipedicellatum, Panicum machrisianum, Panicum malacotrichum, Panicum margaritiferum, Panicum micranthum, Panicum miliaceum, Panicum milioides, Panicum millegrana, Panicum mystasipum, Panicum natalense, Panicum nephelophilum, Panicum nervosum, Panicum notatum, Panicum olyroides, Panicum paludosum, Panicum pansum, Panicum pantrichum, Panicum parvifolium, Panicum parviglume, Panicum pedersenii, Panicum penicillatum, Panicum petersonii, Panicum phragmitoides, Panicum piauiense, Panicum pilosum, Panicum pleianthum, Panicum polycomum, Panicum polygonatum, Panicum pseudisachne, Panicum pygmaeum, Panicum pyrularium, Panicum queenslandicum, Panicum racemosum, Panicum repens, Panicum rhizogonum, Panicum rigidulum, Panicum rivale, Panicum rude, Panicum rudgei, Panicum schinzii, Panicum schwackeanum, Panicum sellowii, Panicum seminudum, Panicum stapfianum, Panicum stenodes, Panicum stramineum, Panicum subalbidum, Panicum subtiramulosum, Panicum sumatrense, Panicum tenellum, Panicum tenuifolium, Panicum trichanthum, Panicum trichidiachne, Panicum trichoides, Panicum tricholaenoides, Panicum tuerckheimii, Panicum turgidum, Panicum urvilleanum, Panicum validum, Panicum venezuelae, Panicum verrucosum, Panicum virgatum, Panicum wettsteinii, Panicum sp., Panicum sp. Christin 16-200, Panicum sp. ELS-2011, Panicum sp. EM389 o Panicum sp. Forest 761.

En una realización adicional, el material a base de plantas de la subfamilia Panicoideae es maíz (Zea), sorgo (Sorghum), pasto varilla (Panicum virgatum), mijo (Panicum miliaceum), mijo perla (Cenchrus violaceus también denominada Pennisetum glaucum), moha de Italia (Setaria italica también denominada Panicum italicum) o en una forma procesada tal como maíz molido, maíz desgrasado, maíz desalmidonado desgrasado, sorgo molido, pasto varilla molido, mijo molido, moha de Italia molida, mijo perla molido, o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, el material a base de plantas de la subfamilia Panicoideae es de la semilla de la planta. En una realización preferida, el material a base de plantas de la subfamilia Panicoideae es de la semilla de maíz (Zea), sorgo (Sorghum), pasto varilla (Panicum virgatum), mijo (Panicum miliaceum), mijo perla (Cenchrus violaceus también denominada Pennisetum glaucum), moha de Italia (Setaria italica también denominada Panicum italicum) o habiéndose procesado la semilla tal como maíz molido, maíz desgrasado, maíz desalmidonado desgrasado, sorgo molido, pasto varilla molido, mijo molido, moha de Italia molida, mijo perla molido, o cualquier combinación de los mismos.

Enzimas adicionales

En una realización, se contemplan actividades enzimáticas aparte de, o además de, polipéptidos que tienen actividad arabinofuranosidasa útil de acuerdo con la invención. En particular, se contemplan actividades de proteasa y celulolíticas adicionales.

En una realización, la invención comprende el uso de un polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa y una xilanasa GH10.

En una realización, la invención comprende el uso de un polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa y una xilanasa GH11.

En una realización, la invención comprende el uso de un polipéptido GH43 que tiene actividad arabinofuranosidasa y una xilanasa GH10.

En una realización, la invención comprende el uso de un polipéptido GH43 que tiene actividad arabinofuranosidasa y una xilanasa GH11.

Proteasas

La proteasa puede ser cualquier proteasa. Las proteasas adecuadas incluyen proteasas microbianas tales como proteasas fúngicas y bacterianas. Las proteasas preferidas son proteasas ácidas, es decir, proteasas caracterizadas por la capacidad de hidrolizar proteínas en condiciones ácidas por debajo de pH 7. Las proteasas preferidas son endoproteasas ácidas. Se prefiere una proteasa fúngica ácida, pero también se pueden utilizar otras proteasas.

La proteasa fúngica ácida puede derivar de Aspergillus, Candida, Coriolus, Endothia, Enthomophtra, Irpex, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Sclerotium y Torulopsis. En particular, la proteasa puede derivarse de Aspergillus aculeatus (documento WO 95/02044), Aspergillus awamori (Hayashida et al., 1977, Agric. Biol. Chem. 42(5), 927-933), Aspergillus niger (véase, por ejemplo, Koaze et al., 1964, Agr. Biol. Chem. Japan 28: 216), Aspergillus saitoi (véase, por ejemplo, Yoshida, 1954, J. Agr. Chem. Soc. Japan 28: 66) o Aspergillus oryzae, tal como la proteasa pepA; y proteasas ácidas de Mucor miehei o Mucor pusillus.

En una realización, la proteasa ácida es un complejo de proteasa de A. oryzae vendido con el nombre comercial Flavourzyme® (de Novozymes A/S) o una proteasa aspártica de Rhizomucor miehei o Spezyme® FAN o GC 106 de Genencor Int.

En una realización preferida, la proteasa ácida es una proteasa aspártica, tal como una proteasa aspártica derivada de una cepa de Aspergillus, en particular A. aculeatus, especialmente A. aculeatus CBD 101.43.

Las proteasas ácidas preferidas son las proteasas aspárticas, que conservan la actividad en presencia de un inhibidor seleccionado del grupo que consiste en pepstatina, Pefabloc, PMSF o EDTA. La proteasa I derivada de A. aculeatus CBS 101.43 es una proteasa ácida de este tipo.

En una realización preferida, el proceso de la invención se realiza en presencia de la Proteasa I ácida derivada de A. aculeatus CBS 101.43 en una cantidad eficaz.

En otra realización, la proteasa se obtiene a partir de una cepa del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus aculaetus, tal como Aspergillus aculeatus CBS 101.43, tal como la descrita en el documento WO 95/02044, o una proteasa que tiene al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% de identidad con la proteasa del documento WO 95/02044. En un aspecto, la proteasa difiere en hasta 10 aminoácidos, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, del polipéptido maduro del documento WO 95/02044. En otra realización, la presente invención se refiere a variantes del polipéptido maduro del documento WO 95/02044 que comprenden una sustitución, deleción y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En una realización, el número de sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos introducidas en el polipéptido maduro del documento WO 95/02044 es de hasta 10, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10. Los cambios de los aminoácidos pueden ser poco relevantes, es decir, inserciones o sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente al plegamiento y/o la actividad de la proteína; eliminaciones pequeñas, normalmente de 1-30 aminoácidos; extensiones pequeñas en el extremo amino o en el extremo carboxilo, tales como un resto de metionina en el extremo amino; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 restos; o una extensión pequeña que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función.

La proteasa puede ser una proteasa neutra o alcalina, tal como una proteasa derivada de una cepa de Bacillus. Una proteasa particular deriva de Bacillus amyloliquefaciens y presenta una secuencia que se puede obtener en Swissprot con el N.° de acceso P06832. Las proteasas pueden presentar una identidad secuencial de al menos un 90% respecto a la secuencia de aminoácidos descrita en la base de datos Swissprot, N^ de acceso P06832, tal como una identidad de al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o particularmente al menos un 99%.

La proteasa puede tener al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos descrita como secuencia 1 en el documento WO 2003/048353, tal como al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o particularmente al menos un 99% de identidad.

La proteasa puede ser una proteasa similar a la papaína seleccionada del grupo constituido por proteasas de tipo EC 3.4.22.* (cisteín proteasa), tal como EC 3.4.22.2 (papaína), EC 3.4.22.6 (quimopapaína), EC 3.4.22.7 (asclepaína), EC 3.4.22.14 (actinidaína), EC 3.4.22.15 (catepsina L), EC 3.4.22.25 (glicilendopeptidasa) y EC 3.4.22.30 (caricaína). En una realización, la proteasa es un preparado de proteasa derivado de una cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae. En otra realización, la proteasa deriva de una cepa de Rhizomucor, preferentemente Rhizomucor miehei. En otra realización, la proteasa es un preparado de proteasa, preferentemente una mezcla de un preparado proteolítico derivado de una cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae, y una proteasa derivada de una cepa de Rhizomucor, preferentemente Rhizomucor miehei.

Se describen ácido aspártico proteasas, por ejemplo, en el Handbookof Proteolytic Enzymes, editado por A.J. Barrett, N.D. Rawlings y J.F. Woessner, Academic Press, San Diego, 1998, Capítulo 270. Los ejemplos de proteasas de ácido aspártico incluyen, por ejemplo, los descritos en Berka et al., 1990, Gene 96: 313; Berka et al., 1993, Gene 125: 195 198; y Gomi et al., 1993, Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1095-1100, que se incorporan a la presente por referencia. La proteasa también puede ser una metaloproteasa, que se define como una proteasa seleccionada del grupo constituido por:

(a) proteasas pertenecientes a EC 3.4.24 (metaloendopeptidasas); preferiblemente EC 3.4.24.39 (metaloproteinasas de ácido);

(b) metaloproteasas que pertenecen al grupo M del Manual anterior;

(c) metaloproteasas aún no asignadas a clanes (designación: Clan MX) o que pertenecen a cualquiera de los clanes MA, MB, MC, MD, ME, MF, MG, MH (que se definen en las págs. 989-991 del manual anterior); (d) otras familias de metaloproteasas (como se define en las págs. 1448-1452 del Manual anterior);

(e) metaloproteasas con un motivo HEXXH;

(f) metaloproteasas con un motivo HEFTH;

(g) metaloproteasas que pertenecen a una de las familias M3, M26, M27, M32, M34, M35, M36, M41, M43, o M47 (como se define en las págs. 1448-1452 del Manual anterior);

(h) metaloproteasas que pertenecen a la familia M28E; y

(i) metaloproteasas que pertenecen a la familia M35 (como se define en las págs. 1492-1495 del Manual anterior).

En otras realizaciones particulares, las metaloproteasas son hidrolasas en las que el ataque nucleófilo sobre un enlace peptídico está mediado por una molécula de agua, que se activa mediante un catión metálico divalente. Algunos ejemplos de cationes divalente son zinc, cobalto o manganeso. El ión metálico se puede mantener en su lugar mediante ligandos aminoacídicos. El número de ligandos puede ser cinco, cuatro, tres, dos, uno o cero. En una realización particular, el número es dos o tres, preferentemente tres.

No hay limitaciones sobre el origen de la metaloproteasa utilizada en un proceso de la invención. En una realización, la metaloproteasa se clasifica como EC 3.4.24, preferentemente EC 3.4.24.39. En una realización, la metaloproteasa es una metaloproteasa estable a los ácidos, por ejemplo, una metaloproteasa estable a los ácidos fúngica, tal como una metaloproteasa derivada de una cepa del género Thermoascus, preferiblemente una cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC N.° 0670 (clasificada como EC 3.4.24.39). En otra realización, la metaloproteasa deriva de una cepa del género Aspergillus, preferentemente una cepa de Aspergillus oryzae.

En una realización, la metaloproteasa tiene un grado de identidad de secuencia con los aminoácidos -159 a 177, o preferiblemente los aminoácidos 1 a 177 (el polipéptido maduro) de la Secuencia Número 1 del documento WO 2010/008841 (una metaloproteasa de Thermoascus aurantiacus) de al menos un 80%, al menos un 82%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 97%; y que tienen actividad metaloproteasa.

La metaloproteasa de Thermoascus aurantiacus es un ejemplo preferido de una metaloproteasa adecuada para ser utilizada en un proceso de la invención. Otra metaloproteasa se obtiene a partir de Aspergillus oryzae y comprende la secuencia número 11 descrita en el documento WO 2003/048353, o los aminoácidos 23-353; 23-374; 23-397; 1-353; 1-374; 1-397; 177-353; 177-374; o 177-397 de la misma, y la Secuencia Número 10 descrita en el documento WO 2003/048353.

Otra metaloproteasa adecuada para su uso en un proceso de la invención es la metaloproteasa de Aspergillus oryzae que comprende la Secuencia Número 5 del documento WO 2010/008841, o una metaloproteasa es un polipéptido aislado que tiene un grado de identidad con la Secuencia Número 5 de al menos aproximadamente un 80%, al menos un 82%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 97%; y que tienen actividad metaloproteasa. En realizaciones particulares, la metaloproteasa consiste en la secuencia de aminoácidos de la Secuencia Número 5.

En una realización particular, una metaloproteasa tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en cuarenta, treinta y cinco, treinta, veinticinco, veinte, o en quince aminoácidos de los aminoácidos -159 a 177, o 1 a 177 de las secuencias de aminoácidos de las metaloproteasas de Thermoascus aurantiacus o Aspergillus oryzae.

En otra realización, una metaloproteasa tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en diez, en nueve, en ocho, en siete, en seis, o en cinco aminoácidos desde los aminoácidos -159 a 177, o de 1 a 177 de las secuencias de aminoácidos de estas metaloproteasas, por ejemplo, en cuatro, tres, dos, o un aminoácido.

En realizaciones particulares, la metaloproteasa a) comprende o b) está constituida por

i) la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos -159 a 177, o 1 a 177 de la Secuencia Número 1 del documento WO 2010/008841;

ii) la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 23-353, 23-374, 23-397, 1-353, 1-374, 1-397, 177-353, 177-374, o 177-397 de la Secuencia Número 3 del documento WO 2010/008841;

iii) la secuencia de aminoácidos de la Secuencia Número 5 del documento WO 2010/008841; o

variantes alélicas o fragmentos de las secuencias de i), ii) y iii) que presentan actividad proteasa.

Un fragmento de los aminoácidos -159 a 177, o 1 a 177 de la Secuencia Número 1 del documento WO 2010/008841 o de los aminoácidos 23-353, 23-374, 23-397, 1-353, 1-374, 1-397, 177-353, 177-374, o 177-397 de la Secuencia Número 3 del documento WO 2010/008841; es un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos eliminados del extremo amino y/o carboxilo de estas secuencias de aminoácidos. En una realización, un fragmento contiene al menos 75 residuos aminoacídicos, o al menos 100 residuos aminoacídicos, o al menos 125 residuos aminoácidicos, o al menos 150 residuos aminoácidicos, o al menos 160 residuos aminoácidicos, o al menos 165 residuos aminoácidicos, o al menos 170 residuos aminoácidicoso al menos 175 residuos aminoácidicos.

En otra realización, la metaloproteasa se combinan con otra proteasa tal como una proteasa fúngica, preferentemente una proteasa fúngica ácida.

En otra realización, la proteasa se selecciona del grupo que consiste en:

(a) proteasas que pertenecen al grupo de enzimas EC 3.4.21.; y/o

(b) proteasas que pertenecen al grupo enzimático EC 3.4.14; y/o

(c) Serina proteasas de la familia peptidasa S53 que comprende dos tipos diferentes de peptidasas: tripeptidilaminopeptidasas (tipo exo) y endopeptidasas; como se describe en 1993, Biochem. J. 290:205-218 y en MEROPS protease database, release, 9.4 (31 de enero de 2011) (www.merops.ac.uk). La base de datos se describe en Rawlings, N.D., Barrett, A.J. y Bateman, A., 2010, "MEROPS: the peptidase database", Nucl. Acids Res. 38: D227-D233. Véase también el documento PCT/CN2013/087861, presentado el 26 de noviembre de 2013.

Los productos que se pueden adquirir de proveedores comerciales incluyen ALCALASE®, ESPERASE™, FLAVOURZYME™, NEUTRASE®, RENNILASE®, NOVOZYM™ FM 2.0L e iZyme BA (se puede adquirir en Novozymes A/S, Dinamarca), y GC106™ y SPEZ^yM^e™ FAN de Genencor International, Inc., EE. UU.

La proteasa puede estar presente en una cantidad de 0.0001-1 mg de proteína de enzima por g de granos de sólidos secos (DS), preferiblemente de 0.001 a 0.1 mg de proteína de enzima por g de granos de DS.

En una realización, la proteasa es una proteasa ácida añadida en una cantidad de 1 -20,000 HUT/100 g de granos de DS, tales como 1-10,000 HUT/100 g de granos de DS, preferiblemente 300-8,000 HUT/100 g de granos de DS, especialmente 3,000-6,000 HUT/100 g de granos de DS, o 4,000-20,000 HUT/100 g de proteasa ácida de granos de ^dS, preferiblemente 5,000-10,000 HUT/100 g, especialmente de 6,000-16,500 HUT/100 g de granos de DS.

Composiciones celulolíticas

En realizaciones adicionales, la invención se refiere al uso de combinaciones con composiciones celulolíticas.

Las composiciones celulolíticas ejemplares son como se describen, por ejemplo, en los documentos WO 2015/081139 y PCT/US2015/034179.

En una realización, la composición celulolítica se deriva de una cepa de Trichoderma, tal como una cepa de Trichoderma reesei; una cepa de Humicola, como una cepa de Humicola insolens, y/o una cepa de Chrysosporium, tal como una cepa de Chrysosporium lucknowense.

En una realización preferida, la composición celulolítica se deriva de una cepa de Trichoderma reesei.

La composición celulolítica puede comprender uno o más de los siguientes polipéptidos, incluyendo enzimas: Polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, beta-glucosidasa, beta-xilosidasa, CBHI y CBHII, endoglucanasa, xilanasa, o una mezcla de dos, tres o cuatro de los mismos. En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica y una beta-glucosidasa. En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica y una beta-xilosidasa.

En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica y una endoglucanasa.

En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica y una xilanasa.

En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una endoglucanasa, y una xilanasa.

En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa, y una beta-xilosidasa. En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa, y una endoglucanasa. En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa, y una xilanasa.

En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-xilosidasa, y una endoglucanasa. En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-xilosidasa, y una xilanasa.

En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa, una beta-xilosidasa, y una endoglucanasa. En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa, una beta-xilosidasa, y una xilanasa. En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa, una endoglucanasa, y una xilanasa.

En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-xilosidasa, una endoglucanasa, y una xilanasa.

En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa, una beta-xilosidasa, una endoglucanasa, y una xilanasa.

En una realización, la endoglucanasa es una endoglucanasa I.

En una realización, la endoglucanasa es una endoglucanasa II.

En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una endoglucanasa I, y una xilanasa.

En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una endoglucanasa II, y una xilanasa.

En otra realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa, y una CBHI.

En otra realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa, una CBHI, y una CBHII.

La composición celulolítica puede comprender además una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, una swolenina y una fitasa.

Xilanasa (polipéptidos GH10 y GH11)

Las realizaciones ejemplares relacionadas con el polipéptido GH10 o GH11 que tienen actividad de xilanasa se describen a continuación en el presente documento, como alternativa, se denominan xilanasa de la familia 10 y xilanasa de la familia 11, respectivamente.

En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa tal como la xilanasa de Aspergillus aculeatus (Xyl II) como se describe en el documento WO 1994/021785 como SEQ ID NO: 5 y se describe en el presente documento como SEQ ID NO: 70.

En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 70 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa tal como la xilanasa de Clostridium acetobutylicum como se describe en J. Bacteriol. 2001,183(16):4823 como Swissprot:Q97TP5 y se describe en el presente documento como SEQ ID NO: 71.

En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 71 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa tal como la xilanasa de Aspergillus aculeatus como se describe en la SEQ ID NO: 8 en el documento WO 2005/059084 y se describe en el presente documento como SEQ ID NO: 72.

En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 72 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH11 que tiene actividad xilanasa tal como la xilanasa de Thermomyces lanuginosus como se describe en la SEQ ID NO: 2 en el documento WO1996/23062 y se describe en el presente documento como SEQ ID NO: 73.

En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 73 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH11 que tiene actividad xilanasa tal como la xilanasa de Dictyoglomus thermophilum como se describe en la SEQ ID NO: 305 en el documento WO2011/057140 y se describe en el presente documento como SEQ ID NO: 74.

En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 74 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH11 que tiene actividad xilanasa tal como la xilanasa de Paenibacillus Pabulicomo se describe en la SEQ ID NO: 2 en el documento WO2005/079585 y se describe en el presente documento como SEQ ID NO: 75.

En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 75 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH11 que tiene actividad xilanasa tal como la xilanasa de Geobacillus stearothermophilus como se describe en el presente documento como SEQ ID NO: 78. En una realización, la composición comprende un polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa que tiene una identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 77 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 78 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH11 que tiene actividad xilanasa tal como la xilanasa de Streptomyces beijiangensis como se describe en el presente documento como SEQ ID NO: 84. En una realización, la composición comprende un polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa que tiene una identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 83 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 84 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH11 que tiene actividad xilanasa tal como la xilanasa de Fusarium oxysporum denominada FoxXyn6 como se describe en la SEQ ID NO: 2 en el documento WO2014/019220 y como se describe en el presente documento como SEQ ID NO: 88.

En una realización, la composición comprende un polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa que tiene una identidad de secuencia con SEQ ID NO: 88 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH11 que tiene actividad xilanasa tal como la xilanasa de Fusarium oxysporum denominada AclXyn5 como se describe en la SEQ ID NO: 7 en el documento WO2014/020143 y como se describe en el presente documento como SEQ ID NO: 89.

En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 89 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH11 que tiene actividad xilanasa es la xilanasa de Cornyascus tal como Corynascus thermophilus, de Scytalidium tal como Scytalidium thermophilum, de Penicillium tal como Penicillium oxalicum como se describe en el documento WO 2013/075642, o un polipéptido GH11 que tiene una actividad xilanasa que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% con cualquiera de estos.

En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa incluye la xilanasa de Talaromyces leycettanus como se describe en el documento WO 2013/019827 y se describe en el presente documento como SEQ ID NO: 104. En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 104 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa incluye la xilanasa de Trichophaea saccata como se describe en el documento WO 2011/057083 y se describe en el presente documento como SEQ ID NO: 106. En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 106 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En una realización, la composición celulolítica comprende una xilanasa. En un aspecto preferido, la xilanasa es una xilanasa de la familia 10.

Los ejemplos de xilanasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, pero sin limitación, xilanasas de Aspergillus aculeatus (GeneSeqP:AAR63790; documento WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (documento WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (documento WO 2011/041405), Penicillium sp. (documento WO 2010/126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (documento WO 2009/079210) y Trichophaea saccata GH10 (documento ^wO 2011/057083).

En una realización, la xilanasa GH10 se deriva del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus aculeatus, tal como la descrita en el documento WO 94/021785 como la Secuencia Número 5 (denominada como Xyl II; o una xilanasa GH10 que tiene al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% de identidad con la Secuencia Número 5 en el documento WO 94/021785. En un aspecto, la proteasa difiere en hasta 10 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, del polipéptido maduro. En otra realización, la presente invención se refiere a variantes del polipéptido maduro que comprenden una sustitución, deleción y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En una realización, el número de sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos introducidas en el polipéptido maduro es de hasta 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10. Los cambios de los aminoácidos pueden ser poco relevantes, es decir, inserciones o sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente al plegamiento y/o la actividad de la proteína; eliminaciones pequeñas, normalmente de 1 -30 aminoácidos; extensiones pequeñas en el extremo amino o en el extremo carboxilo, tales como un resto de metionina en el extremo amino; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 restos; o una extensión pequeña que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función.

En una realización, la xilanasa GH10 se deriva del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como se describe en el documento WO 2006/078256 como Xyl III, o una xilanasa GH10 que tiene al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% de identidad con Xyl III en el documento WO 2006/078256. En un aspecto, la proteasa difiere en hasta 10 aminoácidos, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, del polipéptido maduro. En otra realización, la presente invención se refiere a variantes del polipéptido maduro que comprenden una sustitución, deleción y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En una realización, el número de sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos introducidas en el polipéptido maduro es de hasta 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10. Los cambios de los aminoácidos pueden ser poco relevantes, es decir, inserciones o sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente al plegamiento y/o la actividad de la proteína; eliminaciones pequeñas, normalmente de 1-30 aminoácidos; extensiones pequeñas en el extremo amino o en el extremo carboxilo, tales como un resto de metionina en el extremo amino; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 restos; o una extensión pequeña que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función.

En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa tal como la xilanasa de Aspergillus nigercomo se describe en el presente documento como SEQ ID NO: 119.

En una realización, el polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 119 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

Polipéptido AA9 (GH61) que tiene actividad potenciadora celulolítica

La composición celulolítica puede comprender, en una realización, uno o más polipéptidos AA9 (GH61) que tiene actividad potenciadora celulolítica.

En un aspecto, el polipéptido AA9 (GH61) es cualquier polipéptido AA9 que tiene actividad potenciadora celulolítica. Los ejemplos de polipéptidos AA9 incluyen, pero sin limitación, polipéptidos AA9 de Thielavia terrestris (documentos WO 2005/074647, WO 2008/148131, y WO 2011/035027), Thermoascus aurantiacus (documentos WO 2005/074656 y WO 2010/065830), Trichoderma reesei (documentos WO 2007/089290 y WO 2012/149344), Myceliophthora thermophila (documentos WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868, WO 2009/033071, WO 2012/027374, y WO 2012/068236), Aspergillus fumigatus (documento WO 2010/138754), Penicillium pinophilum (documento W ^o2011/005867), Thermoascus sp. (documento WO 2011/039319), Penicillium sp. (emersonii) (documento WO 2011/041397 y w O 2012/000892), Thermoascus crustaceous (documento WO 2011/041504), Aspergillus aculeatus (documento WO 2012/125925), Thermomyces lanuginosus (documentos WO 2012/113340, WO 2012/129699, WO 2012/130964, y WO 2012/129699), Aurantiporus alborubescens (documento WO 2012/122477), Trichophaea saccata (documento WO 2012/122477), Penicillium thomii (documento WO 2012/122477), Talaromyces stipitatus (documento WO 2012/135659), Humicola insolens (documento WO 2012/146171), Malbranchea cinnamomea (documento WO 2012/101206), Talaromyces leycettanus (documento WO 2012/101206), y Chaetomium thermophilum (documento WO 2012/101206), Talaromyces emersonii (documento WO 2012/000892), Trametes versicolor (documento WO 2012/092676 y WO 2012/093149), y Talaromyces thermophilus (documentos WO 2012/129697 y WO 2012/130950); que se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.

En otro aspecto, el polipéptido AA9 que tiene actividad potenciadora celulolítica se selecciona del grupo que consiste en: (i) un polipéptido AA9 que tiene actividad potenciadora celulolítica que comprende o que consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 102; (ii) un polipéptido AA9 que tiene actividad potenciadora celulolítica que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 102; (iii) un polipéptido AA9 que tiene actividad potenciadora celulolítica codificada por un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 101; e (iv) un polipéptido AA9 que tiene actividad potenciadora celulolítica codificada por un polinucleótido que hibrida en al menos condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, condiciones de rigurosidad muy alta, con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 101 o el complemento de longitud completa del mismo.

En otro aspecto, el polipéptido AA9 de Penicillium sp. (emersonii) que tiene actividad potenciadora celulolítica o un homólogo del mismo se selecciona del grupo que consiste en: (i) un polipéptido AA9 que tiene actividad potenciadora celulolítica que comprende o que consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 102; (ii) un polipéptido AA9 que tiene actividad potenciadora celulolítica que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 102; (iii) un polipéptido AA9 que tiene actividad potenciadora celulolítica codificada por un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 101; e (iv) un polipéptido AA9 que tiene actividad potenciadora celulolítica codificada por un polinucleótido que hibrida en al menos condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, condiciones de rigurosidad muy alta, con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 101 o el complemento de longitud completa del mismo.

En una realización, el polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, se deriva del género Thermoascus, tal como una cepa de Thermoascus aurantiacus, tal como la descrita en el documento WO 2005/074656 como la Secuencia Número 2; o un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica que tiene al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% de identidad con la Secuencia Número 2 en el documento WO 2005/074656. En un aspecto, la proteasa difiere en hasta 10 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, del polipéptido maduro. En otra realización, la presente invención se refiere a variantes del polipéptido maduro que comprenden una sustitución, deleción y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En una realización, el número de sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos introducidas en el polipéptido maduro es de hasta 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10. Los cambios de los aminoácidos pueden ser poco relevantes, es decir, inserciones o sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente al plegamiento y/o la actividad de la proteína; eliminaciones pequeñas, normalmente de 1-30 aminoácidos; extensiones pequeñas en el extremo amino o en el extremo carboxilo, tales como un resto de metionina en el extremo amino; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 restos; o una extensión pequeña que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función.

En una realización, el polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, se deriva de una cepa derivada de Penicillium, tal como una cepa de Penicillium emersonii, tal como la descrita en el documento WO 2011/041397, o un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica que tiene al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% de identidad con la Secuencia Número 2 en el documento WO 2011/041397. En un aspecto, la proteasa difiere en hasta 10 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, del polipéptido maduro. En otra realización, la presente invención se refiere a variantes del polipéptido maduro que comprenden una sustitución, deleción y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En una realización, el número de sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos introducidas en el polipéptido maduro es de hasta 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10. Los cambios de los aminoácidos pueden ser poco relevantes, es decir, inserciones o sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente al plegamiento y/o la actividad de la proteína; eliminaciones pequeñas, normalmente de 1-30 aminoácidos; extensiones pequeñas en el extremo amino o en el extremo carboxilo, tales como un resto de metionina en el extremo amino; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 restos; o una extensión pequeña que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función.

En una realización, el polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica se deriva del género Thielavia, tal como una cepa de Thielavia terrestris, tal como la descrita en el documento WO 2005/074647 como la Secuencia Número 7 o la Secuencia Número 8; un uno derivado de una cepa de Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como la descrita en el documento WO 2010/138754 como la Secuencia Número 2, o un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica que tiene al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% de identidad con cualquiera de estos.

Endoglucanasa

En una realización, la composición celulolítica comprende una endoglucanasa, tal como una endoglucanasa I o endoglucanasa II.

Los ejemplos de endoglucanasas bacterianas que pueden usarse en los procesos de la presente invención incluyen, sin limitación, una endoglucanasa de Acidothermus cellulolyticus (documentos WO 91/05039; WO 93/15186; Patente de Estados Unidos N.° 5,275,944; WO 96/02551; Patente de Estados Unidos N.° 5,536,655, documentos WO 00/70031, WO 05/093050); endoglucanasa III de Thermobifida fusca (documento WO 05/093050); y endoglucanasa V de Thermobifida fusca (documento WO 05/093050).

Los ejemplos de endoglucanasas fúngicas que pueden usarse en la presente invención, incluyen, pero sin limitación, una endoglucanasa I de Trichoderma reesei(Penttila etal., 1986, Gene45: 253-263, endoglucanasa I de Trichoderma reesei Cel7B (GENBANK™ n.° de acceso M15665), endoglucanasa II de Trichoderma reesei (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11-22), endoglucanasa II de Trichoderma reeseiCel5A (GENBANK™ n.° de acceso M19373), endoglucanasa III de Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563, GENBANK™ n.° de acceso AB003694), endoglucanasa V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228, GENBANK™ n.° de acceso Z33381), endoglucanasa de Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884), la endoglucanasa de Aspergillus kawachii (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439), endoglucanasa de Erwinia carotovara (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14), endoglucanasa de Fusarium oxysporum (GENBANK™ n.° de acceso L29381), endoglucanasa de Humicola grisea var. thermoidea (GENBANK™ n.° de acceso AB003107), endoglucanasa de Melanocarpus albomyces (GENBANK™ n.° de acceso MAL515703), endoglucanasa de Neurospora crassa (GENBANK™ n.° de acceso XM_324477), endoglucanasa V de Humicola insolens, endoglucanasa de Myceliophthora thermophila CBS 117.65, endoglucanasa de basidiomycete CBS 495.95, endoglucanasa de basidiomycete CBS 494.95, endoglucanasa de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6B, endoglucanasa de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6C, endoglucanasa de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7C, endoglucanasa de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7E, endoglucanasa de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7F, endoglucanasa de Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A, y endoglucanasa de Trichoderma reesei cepa N.2 VTT-D-80133 (GENBANK™ n.2 de acceso M15665).

En una realización, la endoglucanasa es una endoglucanasa II, tal como una derivada de Trichoderma, tal como una cepa de Trichoderma reesei, tal como la descrita en el documento WO 2011/057140 como la Secuencia Número 22; o una endoglucanasa que tiene al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% de identidad con la Secuencia Número 22 en el documento WO 2011/057140. En un aspecto, la proteasa difiere en hasta 10 aminoácidos, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, del polipéptido maduro 3. En otra realización, la presente invención se refiere a variantes del polipéptido maduro que comprenden una sustitución, deleción y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En una realización, el número de sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos introducidas en el polipéptido maduro es de hasta 10, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10. Los cambios de los aminoácidos pueden ser poco relevantes, es decir, inserciones o sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente al plegamiento y/o la actividad de la proteína; eliminaciones pequeñas, normalmente de 1-30 aminoácidos; extensiones pequeñas en el extremo amino o en el extremo carboxilo, tales como un resto de metionina en el extremo amino; un péptido conector pequeño de hasta 20 25 restos; o una extensión pequeña que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función.

En un aspecto, la endoglucanasa I se selecciona del grupo que consiste en: (i) una endoglucanasa I que comprende o que consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 110; (ii) una endoglucanasa I que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 110; (iii) una endoglucanasa I codificada por un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 109; e (iv) una endoglucanasa I codificada por un polinucleótido que hibrida en al menos condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, condiciones de rigurosidad muy alta, con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 109 o el complemento de longitud completa del mismo.

En otro aspecto, la endoglucanasa II se selecciona del grupo que consiste en: (i) una endoglucanasa II que comprende o que consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 112; (ii) una endoglucanasa II que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 112; (iii) una endoglucanasa II codificada por un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 111; e (iv) una endoglucanasa II codificada por un polinucleótido que hibrida en al menos condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, condiciones de rigurosidad muy alta, con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 111 o el complemento de longitud completa del mismo.

Beta-xilosidasa

Los ejemplos de beta-xilosidasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, pero sin limitación, betaxilosidasas de Neurospora crassa (SwissProt número de acceso Q7SOW4), Trichoderma reesei (UniProtKB/TrEMBL número de acceso Q92458), y Talaromyces emersonii (SwissProt número de acceso Q8X212).

En una realización, la beta-xilosidasa se deriva del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como la descrita en el documento WO 2011/057140 como la Secuencia Número 206;, o una beta-xilosidasa que tiene al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% de identidad con la Secuencia Número 206 en el documento WO 2011/057140. En un aspecto, la proteasa difiere en hasta 10 aminoácidos, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, del polipéptido maduro. En otra realización, la presente invención se refiere a variantes del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 6 que comprende una sustitución, eliminación y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En una realización, el número de sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos introducidas en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 6 es de hasta 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Los cambios de los aminoácidos pueden ser poco relevantes, es decir, inserciones o sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente al plegamiento y/o la actividad de la proteína; eliminaciones pequeñas, normalmente de 1-30 aminoácidos; extensiones pequeñas en el extremo amino o en el extremo carboxilo, tales como un resto de metionina en el extremo amino; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 restos; o una extensión pequeña que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función.

En una realización, la beta-xilosidasa se deriva de una cepa del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como la descrita en el documento provisional de Estados Unidos n.° 61/526,833 o la PCT/US12/052163 (Ejemplos 16 y 17), o se deriva de una cepa de Trichoderma, tal como una cepa de Trichoderma reesei, tal como el polipéptido maduro de la Secuencia Número 58 en el documento WO 2011/057140 o una beta-xilosidasa que tiene al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% de identidad con la misma.

En otro aspecto, la beta-xilosidasa de Talaromyces emersonii o un homólogo de la misma se selecciona del grupo que consiste en: (i) una beta-xilosidasa que comprende o que consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 108; (ii) una beta-xilosidasa que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 108; (iii) una beta-xilosidasa codificada por un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 107; e (iv) una beta-xilosidasa codificada por un polinucleótido que hibrida en al menos condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, condiciones de rigurosidad muy alta, con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 107 o el complemento de longitud completa del mismo.

Beta-glucosidasa

La composición celulolítica puede comprender, en una realización, una o más beta-glucosidasas. La beta-glucosidasa, en una realización, puede derivarse de una cepa del género Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae, tal como la descrita en el documento WO 2002/095014 o la proteína de fusión que tiene la actividad beta-glucosidasa descrita en el documento WO 2008/057637, o Aspergillus fumigatus, tal como el descrito en el documento WO 2005/047499 o una variante de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus, tal como se describe en la solicitud PCT WO 2012/044915, tal como la que tiene las siguientes sustituciones: F100D, S283G, N456E y F512Y.

En una realización, la beta-glucosidasa se deriva del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como la descrita en el documento WO 2005/047499, o una beta-glucosidasa que tiene al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% de identidad con la misma.

En una realización, la beta-glucosidasa se deriva del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como la descrita en el documento WO 2012/044915, o una beta-xilosidasa que tiene al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% de identidad con la misma.

En otro aspecto, la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus o un homólogo de la misma se selecciona del grupo que consiste en: (i) una beta-glucosidasa que comprende o que consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 100; (ii) una beta-glucosidasa que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 100; (iii) una beta-glucosidasa codificada por un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 99; e (iv) una beta-glucosidasa codificada por un polinucleótido que hibrida en al menos condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, condiciones de rigurosidad muy alta, con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 99 o el complemento de longitud completa del mismo.

Celobiohidrolasa I

La composición celulolítica, en una realización, puede comprender una o más CBH I (celobiohidrolasa I). En una realización, la composición celulolítica comprende una celobiohidrolasa I (CBHI), tal como una derivada de una cepa del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como la CBHI Cel7A descrita en la Secuencia Número 2 en el documento WO 2011/057140, o una cepa del género Trichoderma, tal como una cepa de Trichoderma reesei.

En una realización, la celobiohidrolasa I se deriva del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como la descrita en el documento WO 2011/057140, o una CBHI que tiene al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% de identidad con la misma.

En un aspecto, la celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus o un homólogo de la misma, se selecciona del grupo que consiste en: (i) una celobiohidrolasa I que comprende o que consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 114; (ii) una celobiohidrolasa I que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 114; (iii) una celobiohidrolasa I codificada por un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 113; e (iv) una celobiohidrolasa I codificada por un polinucleótido que hibrida en al menos condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, condiciones de rigurosidad muy alta, con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 113 o el complemento de longitud completa del mismo.

Celobiohidrolasa II

La composición celulolítica puede comprender, en una realización, una o más CBH II (celobiohidrolasa II). En una realización, la celobiohidrolasa II (CBHII), tal como la derivada de una cepa del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, o una cepa del género Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, o una cepa del género Thielavia, tal como una cepa de Thielavia terrestris, tal como celobiohidrolasa II CEL6A de Thielavia terrestris.

En una realización, la celobiohidrolasa II se deriva del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como la descrita en el documento WO 2011/057140, o una CBHII que tiene al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% de identidad con la misma.

En otro aspecto, la celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus o un homólogo de la misma, se selecciona del grupo que consiste en: (i) una celobiohidrolasa II que comprende o que consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 116; (ii) una celobiohidrolasa II que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 116; (iii) una celobiohidrolasa II codificada por un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 115; e (iv) una celobiohidrolasa II codificada por un polinucleótido que hibrida en al menos condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, condiciones de rigurosidad muy alta, con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 115 o el complemento de longitud completa del mismo.

Composiciones celulolíticas ejemplares

En particular, de acuerdo con una realización, la presente invención se refiere al uso de composiciones enzimáticas, que comprenden: (A) (i) una celobiohidrolasa I, (ii) una celobiohidrolasa II, e (iii) al menos una enzima seleccionada del grupo que consiste en una beta-glucosidasa o una variante de la misma, un polipéptido AA9 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una xilanasa GH10, y una beta-xilosidasa; (B) (i) una xilanasa GH10 e (ii) una beta-xilosidasa; o (C) (i) una celobiohidrolasa I, (ii) una celobiohidrolasa II, (iii) una xilanasa GH10, e (iv) una beta-xilosidasa;

en donde la celobiohidrolasa I se selecciona del grupo que consiste en: (i) una celobiohidrolasa I que comprende o que consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 96; (ii) una celobiohidrolasa I que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 96; (iii) una celobiohidrolasa I codificada por un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 95; e (iv) una celobiohidrolasa I codificada por un polinucleótido que hibrida en al menos condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, condiciones de rigurosidad muy alta, con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 95 o el complemento de longitud completa del mismo;

en donde la celobiohidrolasa II se selecciona del grupo que consiste en: (i) una celobiohidrolasa II que comprende o que consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 98; (ii) una celobiohidrolasa II que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 98; (iii) una celobiohidrolasa II codificada por un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 97; e (iv) una celobiohidrolasa II codificada por un polinucleótido que hibrida en al menos condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, condiciones de rigurosidad muy alta, con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 97 o el complemento de longitud completa del mismo;

en donde la beta-glucosidasa se selecciona del grupo que consiste en: (i) una beta-glucosidasa que comprende o que consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 100; (ii) una beta-glucosidasa que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 100; (iii) una beta-glucosidasa codificada por un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 99; e (iv) una beta-glucosidasa codificada por un polinucleótido que hibrida en al menos condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, condiciones de rigurosidad muy alta, con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 99 o el complemento de longitud completa del mismo;

en donde la xilanasa se selecciona del grupo que consiste en: (i) una xilanasa que comprende o que consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 104 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 106; (ii) una xilanasa que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 104 o el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 106; (iii) una xilanasa codificada por un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 103 o la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 105; e (iv) una xilanasa codificada por un polinucleótido que hibrida en al menos condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, condiciones de rigurosidad muy alta, con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 103 o la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 105; o el complemento de longitud completa del mismo; y

donde la beta-xilosidasa se selecciona del grupo que consiste en: (i) una beta-xilosidasa que comprende o que consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 108; (ii) una beta-xilosidasa que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 108; (iii) una beta-xilosidasa codificada por un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 107; e (iv) una beta-xilosidasa codificada por un polinucleótido que hibrida en al menos condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, condiciones de rigurosidad muy alta, con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 107 o el complemento de longitud completa del mismo.

En particular, de acuerdo con una realización, la presente invención se refiere al uso de composiciones enzimáticas, que comprenden: (A) (i) una celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus; (ii) una celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus; (iii) una beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus o variante de la misma; (iv) un polipéptido AA9 de Penicillium sp. que tiene actividad potenciadora celulolítica; (v) una xilanasa GH10 de Trichophaea saccata; y (vi) una beta-xilosidasa de Talaromyces emersonii; u homólogos de los mismos; (B) (i) una celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus; (ii) una celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus; (iii) una xilanasa GH10 de Trichophaea saccata; e (iv) una beta-xilosidasa de Talaromyces emersonii; u homólogos de los mismos; o (C) (i) una xilanasa GH10 de Trichophaea saccata; e (ii) una beta-xilosidasa de Talaromyces emersonii; u homólogos de los mismos.

En una realización, la cantidad de celobiohidrolasa I en una composición enzimática de la presente invención es del 5% al 60% de la proteína total de la composición enzimática, por ejemplo, del 7.5% al 55%, del 10% al 50%, del 12.5% al 45%, del 15% al 40%, del 17.5% al 35%, y del 20% al 30% de la proteína total de la composición enzimática.

En otra realización, la cantidad de celobiohidrolasa II en una composición enzimática de la presente invención es del 2.0-40% de la proteína total de la composición enzimática, por ejemplo, del 3.0% al 35%, del 4.0% al 30%, del 5% al 25%, del 6% al 20%, del 7% al 15%, y del 7.5% al 12% de la proteína total de la composición enzimática.

En otra realización, la cantidad de beta-glucosidasa en una composición enzimática de la presente invención es del 0% al 30% de la proteína total de la composición enzimática, por ejemplo, del 1% al 27.5%, del 1.5% al 25%, del 2% al 22.5%, del 3% al 20%, del 4% al 19%, del 4.5 % al 18%, del 5% al 17%, y del 6% al 16% de la proteína total de la composición enzimática.

En otra realización, la cantidad de polipéptido AA9 en una composición enzimática de la presente invención es del 0% al 50% de la proteína total de la composición enzimática, por ejemplo, del 2.5% al 45%, del 5% al 40%, del 7.5% al 35%, del 10% al 30%, del 12.5% al 25%, y del 15% al 25% de la proteína total de la composición enzimática.

En otra realización, la cantidad de xilanasa en una composición enzimática de la presente invención es del 0% al 30% de la proteína total de la composición enzimática, por ejemplo, del 0.5% al 30%, del 1.0% al 27.5%, del 1.5% al 25%, del 2% al 22.5%, del 2.5% al 20%, del 3% al 19%, del 3.5% al 18%, y del 4% al 17% de la proteína total de la composición enzimática.

En otra realización, la cantidad de beta-xilosidasa en una composición enzimática de la presente invención es del 0% al 50% de la proteína total de la composición enzimática, por ejemplo, del 0.5% al 30%, del 1.0% al 27.5%, del 1.5% al 25%, del 2% al 22.5%, del 2.5% al 20%, del 3% al 19%, del 3.5% al 18%, y del 4% al 17% de la proteína total de la composición enzimática.

En otra realización, la cantidad de endoglucanasa I en una composición enzimática de la presente invención es del 0.5% al 30% de la proteína total de la composición enzimática, por ejemplo, del 1.0% al 25%, del 2% al 20%, del 4% al 25%, del 5% al 20%, del 16% al 15%, y del 7% al 12% de la proteína total de la composición enzimática.

En otra realización, la cantidad de endoglucanasa II en una composición enzimática de la presente invención es del 0.5% al 30% de la proteína total de la composición enzimática, por ejemplo, del 1.0% al 25%, del 2% al 20%, del 4% al 25%, del 5% al 20%, del 16% al 15%, y del 7% al 12% de la proteína total de la composición enzimática.

Como se ha mencionado anteriormente, la composición celulolítica puede comprender varios polipéptidos diferentes, tales como enzimas.

En una realización, la composición celulolítica comprende una preparación de celulasa de Trichoderma reeseique contiene la proteína de fusión beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (documento WO 2008/057637) y el polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus (documento WO 2005/074656).

En una realización, la composición celulolítica comprende una mezcla de una xilanasa GH10 de Aspergillus aculeatus (documento WO 94/021785) y una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (documento WO 2005/047499) y el polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus(documento WO 2005/074656).

En una realización, la composición celulolítica comprende una mezcla de una xilanasa GH10 de Aspergillus fumigatus (documento WO 2006/078256) y beta-xilosidasa de Aspergillus fumigatus (documento WO 2011/057140) con una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus (documento ^wO 2011/057140), celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus (documento WO 2011/057140), una variante betaglucosidasa de Aspergillus fumigatus (documento WO 2012/044915), y el polipéptido GH61 de Penicillium sp. (emersonii) (documento WO 2011/041397).

En una realización, la composición celulolítica comprende una composición enzimática celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además el polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus que tiene actividad potenciadora celulolítica (documento WO 2005/074656) y la proteína de fusión beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (documento WO 2008/057637).

En otra realización, la composición celulolítica comprende una composición enzimática celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además el polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus que tiene actividad potenciadora celulolítica (Secuencia Número 2 en el documento WO 2005/074656) y beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (Secuencia Número 2 del documento WO 2005/047499).

En otra realización, la composición celulolítica comprende una composición enzimática celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además el polipéptido GH61A de Penicillium emersonii que tiene la actividad potenciadora celulolítica descrita en el documento WO 2011/041397, beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (Secuencia Número 2 del documento WO 2005/047499) o una variante de los mismos con las siguientes sustituciones: F100D, S283G, N456Ey F512Y.

En una realización, la composición celulolítica comprende xilanasa de la familia 10 de Aspergillus aculeatus y una composición celulolítica derivada de RutC30 de Trichoderma reesei.

En una realización, la composición celulolítica comprende xilanasa de la familia 10 de Aspergillus aculeatus.

En una realización, la composición celulolítica se deriva de Trichoderma reesei RutC30.

En una realización, la composición celulolítica comprende una mezcla de una xilanasa GH10 de Trichophaea saccata (documento WO 2011/057083) y beta-xilosidasa de Talaromyces emersonii con una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus(documento WO 2011/057140), celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus(documento WO 2011/057140), una variante beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (documento WO 2012/044915), y el polipéptido GH61 de Penicillium sp. (emerson/'/)(documento WO 2011/041397).

En una realización, la composición celulolítica comprende una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene xilanasa GH10 de Trichophaea saccata (documento WO 2011/057083) y beta-xilosidasa de Talaromyces emersonii.

En una realización, la composición celulolítica comprende una xilanasa GH10 de Talaromyces leycettanus(documento WO 2013/019827).

En una realización, la composición celulolítica comprende una xilanasa GH10 de Trichophaea saccata (documento WO 2011/057083).

En una realización, la composición celulolítica es como se describe en el documento PCT/US2015/034179.

La composición enzimática de la presente invención puede estar en cualquier forma adecuada para su uso, tal como, por ejemplo, un caldo de fermentación en bruto con o sin células eliminadas, un lisado celular con o sin restos celulares, una composición enzimática purificada o semi-purificada, o una célula huésped, por ejemplo, la célula huésped de Trichoderma, como fuente de las enzimas.

La composición enzimática puede ser un granulado o polvo seco, un granulado que no genera polvo, un líquido, un líquido estabilizado o una enzima protegida estabilizada. Las composiciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, estabilizarse añadiendo estabilizadores tales como un azúcar, un alcohol de azúcar u otro poliol, y/o ácido láctico u otro ácido orgánico de acuerdo con procesos establecidos.

De acuerdo con la invención, también puede estar presente o añadirse una cantidad eficaz de una o más de las siguientes actividades durante el tratamiento de los granos: actividad de acetilxilano esterasa, pentosanasa, pectinasa, arabinanasa, arabinofurasidasa, xiloglucanasa, fitasa.

Se cree que después de la división de los granos en partículas más finas, la enzima o enzimas pueden actuar de manera más directa y, por lo tanto, más eficientemente sobre la pared celular y la matriz proteica de los granos. De este modo, el almidón se lava más fácilmente en las etapas posteriores.

Cantidad enzimática

Las enzimas se pueden añadir en una cantidad eficaz, que se puede ajustar de acuerdo con el médico y las necesidades particulares del proceso. En general, la enzima puede estar presente en una cantidad de 0.0001-1 mg de proteína enzimática por g de granos de sólidos secos (DS), tal como 0.001-0.1 mg de proteína enzimática por g de granos de DS. En realizaciones particulares, la enzima puede estar presente en una cantidad de, por ejemplo, 1 gg, 2.5 gg, 5 gg, 10 gg, 20 gg, 25 gg, 30 gg, 35 gg, 40 gg, 45 gg, 50 gg, 75 gg, 100 gg, 125 gg, 150 gg, 175 gg, 200 gg, 225 gg, 250 gg, 275 gg, 300 gg, 325 gg, 350 gg, 375 gg, 400 gg, 450 gg, 500 gg, 550 gg, 600 gg, 650 gg, 700 gg, 750 gg, 800 gg, 850 gg, 900 gg, 950 gg, 1000 gg proteína enzimática por g de granos de DS.

La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos

Materiales y métodos

Enzimas

Arabinofuranosidasa GH62 A: Arabinofuranosidasa GH62 de Penicillium capsulatum (documento WO 2006/125438). Arabinofuranosidasa GH62 B: Arabinofuranosidasa GH62 de Penicillium oxalicum (SEQ ID NO: 24).

Arabinofuranosidasa GH62 C: Arabinofuranosidasa GH62 de Talaromyces pinophilus (SEQ ID NO: 27).

Arabinofuranosidasa GH62 D: Arabinofuranosidasa GH62 derivada de Aspergillus n iger(SEQ ID NO: 117).

Arabinofuranosidasa GH62 E: Arabinofuranosidasa GH62 derivada de Aspergillus niger (SEQ ID NO: 118).

Las enzimas que tienen actividad arabinofuranosidasa son útiles solas o en combinación con, por ejemplo, cualquiera de Celluclast, Celulasa A, Celulasa B, Celulasa C, Celulasa D, Celulasa E, Celulasa F, Celulasa G, Celulasa H, Celulasa J, Celulasa K, Celulasa L, Celulasa M, Xilanasa GH10 A, Proteasa A, Proteasa B, Proteasa C y/o Proteasa D.

Celluclast: Celulasa derivada de Celluclast 1.5 L, producto comercial disponible en Novozymes A/S.

Celulasa A: Una mezcla de una xilanasa GH10 de Aspergillus aculeatus (documento WO 94/021785) y una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (documento ^wO 2005/047499) y el polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus (documento W ^o2005/074656).

Celulasa B: Una preparación de celulasa de Trichoderma reeseique contiene la proteína de fusión beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (documento WO 2008/057637) y el polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus (documento WO 2005/074656).

Celulasa C: Una mezcla de una xilanasa GH10 de Aspergillus fumigatus (documento WO 2006/078256) y betaxilosidasa de Aspergillus fumigatus (documento WO 2011/057140) con una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus (documento WO 2011/057140), celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus (documento WO 2011/057140), una variante beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (documento WO 2012/044915), y el polipéptido GH61 de Penicillium sp. (emersonii) (documento W ^o2011/041397). Celulasa D: Xilanasa GH10 de Aspergillus aculeatus (documento WO 94/021785).

Celulasa E: Una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene xilanasa GH10 de Aspergillus aculeatus (documento WO 94/021785).

Celulasa F: Una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene xilanasa GH10 de Aspergillus fumigatus (documento WO 2006/078256) y beta-xilosidasa de Aspergillus fumigatus (documento WO 2011/057140).

Celulasa G: Una composición enzimática celulolítica que contiene xilanasa de la familia 10 de Aspergillus aculeatus (documento WO 1994/021785) y una composición enzimática celulolítica derivada de RutC30 de Trichoderma reesei. Celulasa H: Una composición celulolítica derivada de RutC30 de Trichoderma reesei.

Celulasa J: Una mezcla de una xilanasa GH10 de Trichophaea saccata (documento WO 2011/057083) y betaxilosidasa de Talaromyces emersonii con una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus(documento WO 2011/057140), celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus(documento WO 2011/057140), una variante beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (documento WO 2012/044915), y el polipéptido GH61 de Penicillium sp. (emersonii)(documento W o 2011/041397).

Celulasa K: Una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene xilanasa GH10 de Trichophaea saccata (documento WO 2011/057083) y beta-xilosidasa de Talaromyces emersonii.

Celulasa L: Una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene una xilanasa GH10 de SEQ ID NO: 104.

Celulasa M: Una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene una xilanasa GH10 de SEQ ID NO: 106.

Celulasa N: Una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene una celobiohidrolasa I de SEQ ID NO: 96, una celobiohidrolasa II de SEQ ID NO: 98, una xilanasa GH10 de SEQ ID NO: 104, y una beta-xilosidasa de SEQ ID NO: 108.

Celulasa P: Una preparación de celulasa de Trichoderma reeseique contiene una celobiohidrolasa I de SEQ ID NO: 96, una celobiohidrolasa II de SEQ ID NO: 98, una variante beta-glucosidasa de SEQ ID NO: 100, y un AA9 (GH61) de SEQ ID NO: 102.

Celulasa Q: Una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene una celobiohidrolasa I de SEQ ID NO: 96, una celobiohidrolasa II de SEQ ID NO: 98, y un AA9 (GH61) de SEQ ID NO: 102.

Xilanasa GH10 A: Xilanasa GH10 derivada de Aspergillus niger (SEQ ID NO: 119).

Proteasa I: Proteasa ácida de Aspergillus aculeatus, CBS 101.43 descrita en el documento WO 95/02044.

Proteasa A: Aspergillopepsina A de Aspergillus oryza, descrita en Gene, vol. 125, edición 2, páginas 195-198 (30 de marzo de 1993).

Proteasa B: Una metaloproteasa de Thermoascus aurantiacus (AP025) que tiene la secuencia de ácido maduro mostrada como los aminoácidos 1 -177 SEQ ID NO: 2 en el documento WO2003/048353-A1.

Proteasa C: Rhizomucor miehei derivado de endopeptidasa aspártica producida en Aspergillus oryzae (NovorenTM) disponible en Novozymes A/S, Dinamarca.

Proteasa D: S53 proteasa 3 de Meripilus giganteus descrita en el documento WO 2014/037438 (SEQ ID NO: 6). Métodos

Determinación de la actividad HUT de proteasa:

1 HUT es la cantidad de enzima que, a 40 °C y a pH 4.7 durante 30 minutos forma un hidrolizado a partir de la digestión de hemoglobina desnaturalizada equivalente en absorbancia a 275 nm con respecto a una solución de 1.10 pg/ml de tirosina en HCl 0.006 N cuya absorbancia es 0.0084. El sustrato de hemoglobina desnaturalizada se digiere mediante la enzima en un tampón de acetato 0.5 M en las condiciones dadas. La hemoglobina no digerida se precipita con ácido tricloroacético y se mide la absorbancia a 275 nm del hidrolizado en el sobrenadante.

Ensayo de xilosa

Se preparó una curva patrón de xilosa de desde 0 hasta 125 pg de xilosa/mL a partir de una disolución madre de 2.5 mg xilosa/mL (preparada disolviendo 0.125 g de xilosa en 50 mL agua desionizada,).

Principio del ensayo. La interconversión de las formas a- y p-anoméricas de D-xilosa se cataliza por xilosa mutarrotasa (XMR) usando el kit de ensayo de D-xilosa de Megazyme International Ireland. La B-D-xilosa se oxida por NAD+ a ácido D-xilónico en presencia de B-xilosa deshidrogenasa (B-XDH) a pH 7.5. La cantidad de NADH formada en esta reacción es estequiométrica con la cantidad de D-xilosa y se mide mediante el aumento en absorbancia a 340 nm.

(XMR)

a-D-Xi!osa ---------------------- ► P-D-xilosa

( p - X D H )

p-D-Xilosa+ NAD+------------^{► á c id o D -x i ló n ic o}+ NADH H+

Ejemplo 1.

El ensayo de fibras de 10 g generalmente incluye la incubación de muestras de fibra húmeda obtenidas de la planta de molienda en húmedo, en presencia de enzimas, en condiciones relevantes para el proceso (pH 3.5 a 4, Temp. de aproximadamente 52 °C) y durante un periodo de tiempo de entre 1 a 4 h. Después de la incubación, la fibra se transfiere y se prensa sobre un tamiz (típicamente de 100 micrómetros o más pequeño), donde los filtrados que consisten principalmente en el almidón y el gluten separados se recolectan entonces. Se realizan varios lavados sobre el tamiz, y los lavados se recogen junto con el filtrado inicial. El filtrado recogido se pasa después por un filtro de embudo (filtro de vidrio con abertura de 0.45 micrómetros) para separar adicionalmente los sólidos insolubles (almidón y gluten) del resto de los filtrados (principalmente sólidos disueltos). Estos sólidos insolubles retenidos se lavan y luego se secan al horno a sequedad. La masa seca insoluble se pesa y después se analiza para determinar el contenido de almidón.

El ensayo de fibras de 10 g se realiza a pH 3.8, incubando a 52 °C durante 1 hora a una dosis de 30 ug de EP/g de maíz. Se utilizan mezclas de Arabinofuranosidasa GH62 B+Celulasa L, Arabinofuranosidasa GH62 B+Celulasa M, Arabinofuranosidasa GH62 C+Celulasa L, y Arabinofuranosidasa GH62 C+Celulasa M. Se mide la liberación de almidón gluten (sustancia seca) de la fibra de maíz a una dosis de 30 ug/g de maíz.

Más particularmente, de acuerdo con un ensayo de fibra de 10 g ejemplar, el equipo y los reactivos a continuación se usan para analizar la muestra de fibra de maíz prensada (procedente de la planta de molienda en húmedo), que se almacena congelada y se descongela antes de su uso, de acuerdo con las etapas de la tabla:

Tamices de apertura de 150 gm y bandeja de recogida (Retsch GmbH)

Matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapas

Botellas de 150 ml

Papel de micro filtro de vidrio (Whatman de 150 mm de diámetro)

Aparato de filtración al vacío

Pequeñas bandejas de aluminio

Vaso de precipitados de plástico de 2000 ml

Vaso de precipitados de vidrio de 600 ml

Embudo

Analizador de humedad

Viales y tapas de vidrio para el sistema HPLC

Sistema HPLC

Filtros de jeringa de polipropileno de 0.45 gm de tamaño de poro (Whatman)

Jeringas de plástico de 3 ml

Horno (Capaz de calentar a 105 °C)

Baño de hielo

Balance analítico

Espátula de goma

HCl 0.4 M

Tampón de acetato sódico 1 M (pH 4)

Ácido acético 1 M

Acetato sódico 1 M a pH 7

Ejemplo 2.

El ensayo de fibras de 10 g se realiza a pH 4.0, incubando a 52 °C durante 4 horas a dosis de 35 ug de EP/g de maíz, usando una mezcla de Celulasa K, Celulasa L, o Celulasa N, en combinación adicionalmente con Proteasa D y Arabinofuranosidasa GH62 C. La mezcla consiste en el 10% (p/p) de Proteasa D, 10% (p/p) de Arabinofuranosidasa GH62 C, y el 80% (p/p) restante de Celulasa K/Celulasa L/Celulasa N. Para comparación, se incluyó una mezcla que contenía Celulasa K y Arabinofuranosidasa GH62 C solamente (sin GH62). Se midió la liberación de almidón gluten (sustancia seca) de la fibra de maíz a las dosis especificadas a continuación.

Ejemplo 3.

El ensayo de fibras de 10 g se realiza a pH 4.0, incubando a 52 °C durante 4 horas a dosis de 35 ug de EP/g de maíz o 50 ug de EP/g de maíz o 70 ug de EP/g de maíz, usando una mezcla de Celulasa L o Celulasa N, junto con Proteasa D y Arabinofuranosidasa GH62 B. La mezcla consiste en el 10% (p/p) de Proteasa D, 10% (p/p) de Arabinofuranosidasa GH62 B, y el 80% (p/p) restante de Celulasa L o Celulasa N. Para comparación, se incluyó una mezcla que no contenía GH62. Se midió la liberación de almidón gluten (sustancia seca) de la fibra de maíz a las dosis especificadas a continuación.

Ejemplo 4.

El ensayo de fibras de 10 g se realiza a pH 4.0, incubando a 52 °C durante 4 horas a una dosis de 35 ug de EP/g de maíz, usando una mezcla de Celulasa N, con o sin inclusión de Arabinofuranosidasa GH62 B, y con o sin Proteasa D. La mezcla consiste en el 10% (p/p) de Proteasa D cuando se incluye, el 10% (p/p) de Arabinofuranosidasa GH62 B cuando se incluye, y la cantidad restante (80, 90 o 100% (p/p)) de Celulasa N. Se midió la liberación de almidón gluten (sustancia seca) de la fibra de maíz.

Ejemplo 5.

El ensayo de fibras de 10 g se realiza a pH 3.8, incubando a 52 °C durante 1 hora a una dosis de 35 ug de EP/g de maíz, usando una mezcla que incluye Celluclast y Xilanasa GH10 A, junto con Arabinofuranosidasa GH62 D o Arabinofuranosidasa GH62 E. La mezcla consiste en el 5% (p/p) de Arabinofuranosidasa GH62 D o Arabinofuranosidasa GH62 E, 15% (p/p) de Xilanasa GH10 A, y el 80% (p/p) restante de Celluclast. Para comparación, se incluyó una mezcla que contenía Celluclast y Xilanasa GH10 D solamente (sin GH62). Se midió la liberación de almidón gluten (sustancia seca) de la fibra de maíz a las dosis especificadas a continuación.

Por lo tanto, la adición de Arabinofuranosidasa GH62 D y Arabinofuranosidasa GH62 E sobre Celluclast Xilanasa GH10 A puede aumentar significativamente el rendimiento de almidón gluten en el proceso de molienda en húmedo de maíz.

Ejemplo 6.

Se realizó un estudio industrial a gran escala en una planta de molienda en húmedo que molía 1400 MT de maíz al día. El estudio se realizó durante un lapso de meses, que se puede dividir aproximadamente en un valor inicial de preenzima (Valor inicial 1), fase de mezcla 1, valor inicial post-mezcla 1 (Valor inicial 2), y fase de mezcla 2. Las enzimas que se ensayaron y la dosis relevante usada se dan en la Tabla 1 a continuación. Las enzimas se añadieron directamente a la fase de lavado de la fibra, después de la 3a etapa de molienda.

Tabla 1

La principal diferencia en la composición entre las dos mezclas de enzimas usadas en el estudio fue que la adición de una arabinofuranosidasa GH62, y el organismo de origen de la xilanasa (Familia GH10) usado diferían entre estas dos mezclas.

La Tabla 1 muestra la diferencia de dosis entre estas mezclas durante el estudio. La Mezcla 1 que se dosificó fue cuatro veces más alta en proteínas enzimáticas totales en comparación con la Mezcla 2. Las Tablas 2 y 3 a continuación muestran el efecto de la adición de enzimas en el proceso en comparación con sus valores iniciales, tanto en términos de composición de fibras como de los rendimientos reales alcanzados. Estos números de rendimiento y la composición de fibras se promediaron durante dos semanas de datos donde las condiciones fueron relativamente estables, y el tiempo de residencia general en el lavado de fibra fue consistentemente de aproximadamente 80-90 minutos.

La combinación de una dosis 4 veces menor y un mejor rendimiento de la Mezcla 2 a juzgar por la mayor reducción en el almidón de la fibra (diferencia de 10 frente a 6 puntos porcentuales) apunta fuertemente al efecto potenciador del GH62 en la mezcla. Ambos mostraron aproximadamente la misma reducción en proteínas y humedad en la fibra. En cuanto a los rendimientos alcanzados, el mejor rendimiento de la Mezcla 2 se muestra de nuevo por los mayores rendimientos de almidón obtenidos (una diferencia de aproximadamente 1 punto porcentual en el rendimiento de almidón). La reducción de gluten entre estas enzimas fue aproximadamente la misma (0.2 a 0.3 puntos porcentuales de diferencia con respecto al valor inicial, con la Mezcla 2 probablemente ligeramente mejor). Esto también se demostró cuando se normalizó el contenido de proteína del maíz entrante (la recuperación total parece ser ligeramente mejor con la Mezcla 2).

Tabla 2. Composición de la fibra

Tabla 3. Rendimientos/reducción de energía alcanzados

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para tratar granos de cultivo, que comprende las etapas de:

a) empapar los granos en agua para producir granos empapados;

b) moler los granos empapados; y

c) tratar los granos empapados en presencia de una cantidad eficaz de un polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa y un polipéptido GH10 que tiene actividad xilanasa;

en el que la etapa c) se realiza después de la etapa b) en la etapa de lavado de la fibra.

2. El proceso de la reivindicación 1, que comprende además tratar los granos empapados en presencia de una proteasa.

3. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además tratar los granos empapados en presencia de una enzima celulolítica.

4. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además tratar los granos empapados en presencia de una enzima seleccionada del grupo que consiste en una endoglucanasa, una xilanasa, una celobiohidrolasa I, una celobiohidrolasa II, una GH61, o una combinación de las mismas.

5. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además tratar los granos empapados en presencia de una endoglucanasa.

6. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además tratar los granos empapados en presencia de una xilanasa.

7. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los granos se empapan en agua durante aproximadamente 2-10 horas, preferiblemente aproximadamente 3 horas.

8. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la inmersión se realiza a una temperatura entre aproximadamente 40 °C y aproximadamente 60 °C, preferiblemente aproximadamente 50 °C.

9. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la inmersión se realiza a pH ácido, preferiblemente aproximadamente 3-5, tal como aproximadamente 3-4.

10. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la inmersión se realiza en presencia de entre el 0.01-1%, preferiblemente el 0.05-0.3%, especialmente el 0.1% de SO2 y/o NaHSO3.

11. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los granos de cultivo son de maíz, arroz, cebada, sorgo, o cáscaras de frutas, o trigo.

12. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido GH62 que tiene actividad arabinofuranosidasa se deriva de una cepa del género Penicillium, tal como una cepa de Penicillium capsulatum o Penicillium oxalicum, una cepa de Talaromyces, tal como una cepa de Talaromyces pinophilus, o una cepa de Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus niger.

13. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además tratar los granos empapados en presencia de una xilanasa GH10 o una xilanasa GH11.

14. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la xilanasa GH10 se deriva de una cepa del género Talaromyces, tal como una cepa de Talaromyces leycettanus o Trichophaea, tal como una cepa de Trichophaea saccata, o una cepa de Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus niger.