ES2922981T3

ES2922981T3 - Partículas de arenavirus como vacunas contra el cáncer

Info

Publication number: ES2922981T3
Application number: ES16797775T
Authority: ES
Inventors: Sarah Schmidt; Klaus Orlinger; Katherine Cohen
Original assignee: Hookipa Biotech GmbH
Current assignee: Hookipa Biotech GmbH
Priority date: 2015-11-12
Filing date: 2016-11-04
Publication date: 2022-09-22
Anticipated expiration: 2036-11-04
Also published as: US20180344830A1; AU2016352572B2; JP7157662B2; JP2022033736A; EP3373959B1; SI3373959T1; EP3960197A1; US11266727B2; US20220257734A1; DK3373959T3; AU2016352572A1; CN108697775A; JP2018533604A; CN108697775B; EP3373959A1; HRP20221167T1; CA3003548A1; RS63546B1; PL3373959T3; HUE059589T2

Abstract

La presente solicitud se refiere en general a arenavirus modificados genéticamente que son vacunas adecuadas contra enfermedades neoplásicas, como el cáncer. Los arenavirus descritos en el presente documento pueden ser adecuados para vacunas y/o tratamiento de enfermedades neoplásicas y/o para uso en inmunoterapias. En particular, en el presente documento se proporcionan métodos y composiciones para tratar una enfermedad neoplásica mediante la administración de un arenavirus modificado genéticamente en combinación con un inhibidor del punto de control inmunitario, en el que el arenavirus se ha diseñado para incluir una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, un antígeno asociado a un tumor o un fragmento antigénico. del mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Partículas de arenavirus como vacunas contra el cáncer

1. Introducción

La presente solicitud se refiere en general a arenavirus modificados genéticamente que son vacunas adecuadas contra enfermedades neoplásicas, tales como el cáncer. Los arenavirus descritos en el presente documento pueden ser adecuados para vacunas y/o el tratamiento de enfermedades neoplásicas y/o para uso en inmunoterapias. En particular, una enfermedad neoplásica se puede tratar con métodos y composiciones que implican la administración de un arenavirus modificado genéticamente en combinación con un inhibidor de punto de control inmunitario, en donde el arenavirus se ha genomanipulado para incluir una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a un tumor o fragmento antigénico del mismo.

2. Antecedentes

2.1 Investigación del virus de la coriomeningitis linfocítica y enfermedad humana

El virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), un miembro de la familia arenaviridae, es un prototipo de virus de modelo de ratón en la investigación de infecciones virales. Desde su aislamiento en la década de 1930 (Rivers y McNair Scott, 1935, Science, 81 (2105): 439-440) los estudios que utilizan este virus han descubierto muchos conceptos clave en inmunología viral y patogénesis (resumidos en Zinkemagel, 2002, Curr Top Microbiol Immunol, 263:1-5; Oldstone, 2002, Curr Top Microbiol Immunol, 263:83-117). El LCMV se ha utilizado ampliamente para investigar la biología molecular viral y las respuestas inmunitarias, en particular en el contexto de una infección persistente. Los hospedantes naturales del LCMV son los ratones; sin embargo, varios informes pusieron de manifiesto que el LCMV también podría ser un patógeno humano desatendido (Barton, 1996, Clin. Infecí. Dis, 22(1 ):197; Wright et al., 1997, Pediaírics 100(1): E9). Además, se han encontrado muchos otros miembros de la familia de los arenavirus en poblaciones de roedores de todo el mundo. Además del virus Lassa de los arenavirus del Viejo Mundo (LASV), que se puede encontrar en África, varios arenavirus del Nuevo Mundo como Junín, Guanarito o Machupo son prevalentes en diversas poblaciones de roedores de América del Sur (Johnson et al., 1966, Am J Trop Med Hyg, 15(1): 103-106; Tesh et al., 1993, Am J Trop Med Hyg 49(2):227-235; Mills et al., 1994, Trop Med Hyg 51 (5): 554-562). Al transmitirse a los seres humanos, muchos de esos virus pueden causar fiebre hemorrágica viral asociada con una alta mortalidad (Geisbert y Jahrling, 2004, Nat Med 10(12 Suplemento): S110-121).

2.2 Organización genómica del virus de la coriomeningitis linfocítica

Los arenavirus son virus envueltos. Su genoma consiste en dos segmentos de ARN monocatenario de sentido negativo (L: 7,2 kb, S: 3,4 kb). Cada segmento codifica dos genes virales en orientaciones opuestas. El segmento corto (segmento S) codifica el precursor de la glicoproteína viral (GP) (GP-C; 75 kDa) y la nucleoproteína (NP; 63 kDa) (Salvato et al., 1988, Virology 164(2): 517-522). El segmento largo (segmento L) expresa la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp; proteína L; aproximadamente 200 kDa) y la proteína de matriz Z (proteína Z), una proteína de dedo anular (RING finger) (11 kDa) (Fig. 1A) (Salvato et al., 1988, Virology 164(2): 517-522). El precursor de GP, GP-C, se escinde después de la traducción en GP-1 y GP-2, que permanecen asociados de forma no covalente (Buchmeier y Oldstone 1979, Virology 99(1): 111-120). Los trímeros de GP-1 y GP-2 se ensamblan como espigas en la superficie de los viriones y son esenciales para mediar la entrada en las células hospedantes por interacción con los receptores de la superficie celular. Durante mucho tiempo se afirmó que la unión y la entrada del virus en las células hospedantes eran mediadas por la interacción de la GP del LCMV con el receptor celular a-distroglicano como el único receptor celular para el LCMV (Cao et al., 1998, Science, 282(5396):2079-2081). Solo muy recientemente, se postularon tres moléculas humanas adicionales (Axl y Tyro3 de la familia TAM y no integrina que atrapa la molécula de adhesión intracelular 3 específica de células dendríticas) como receptores adicionales para el LCMV y LASV, un pariente cercano del LCMV, que permiten la entrada del LCMV en células independientemente del a-distroglicano (Shimojima y Kawaoka 2012, J Vet Med, 74(10):1363-1366; Shimojima et al., 2012, J Virol 86(4):2067-2078). La NP se une al ARN viral, formando la nucleocápside, que sirve como molde para la proteína L viral. La nucleocápside asociada a la proteína L viral forma el llamado complejo ribonucleoproteico, que es activo tanto en la replicación como en la transcripción y representa la unidad mínima de infectividad viral. Se ha mostrado que la NP y la proteína L son los factores de acción en trans mínimos necesarios para la transcripción y replicación del ARN viral (Lee et al., 2000, J Virol74(8): 3470-3477). Los dos genes de cada segmento están separados por una región intergénica no codificante (IGR) y flanqueados por regiones no traducidas (UTR) 5' y 3'. La IGR forma una estructura de horquilla estable y se ha mostrado que está implicada en la terminación dependiente de la estructura de la transcripción del ARNm viral (Pinschewer et al., 2005, J Virol79(7): 4519-4526). Los nucleótidos terminales de la UTR muestran un alto grado de complementariedad, dando como resultado la formación de estructuras secundarias. Se sabe que estas estructuras tipo mango de sartén (panhandle) sirven como promotores virales para la transcripción y la replicación, y su análisis mediante mutagénesis dirigida al sitio ha puesto de manifiesto la dependencia de la secuencia y la estructura, y no tolera ni siquiera cambios de secuencia menores (Pérez y de la Torre, 2003, Virol 77(2): 1184-1194).

2.3 Sistema genético inverso

Los ARN aislados y purificados de virus de cadena negativa como el LCMV no pueden servir directamente como ARNm, es decir, no pueden ser traducidos cuando se introducen en las células. En consecuencia, la transfección de células con ARN viral no conduce a la producción de partículas virales infecciosas. Con el fin de generar partículas virales infecciosas de virus de ARN de cadena negativa a partir de ADNc en células permisivas cultivadas, el(los) segmento(s) de ARN viral deben complementarse en trans con los factores mínimos necesarios para la transcripción y la replicación. Con la ayuda de un sistema de minigenoma que se publicó hace varios años, finalmente se pudieron analizar los elementos virales de acción en cis y los factores de acción en trans implicados en la transcripción, replicación y formación de partículas virales (Lee et al., 2000, J Virol74(8): 3470-3477; Lee et al., 2002, J Virol76(12): 6393-6397; Perez y de la Torre 2003, J Virol 77(2): 1184-1194; Pinschewer et al., 2003, J Virol 77(6): 3882-3887; Pinschewer et al., 2005, J Virol79(7): 4519-4526.). También para otros arenavirus como el LASV y virus Tacaribe se han establecido sistemas genéticos inversos (Lopez et al., 2001, J Virol75(24): 12241-12251; Hass et al., 2004, J Virol 78(24): 13793-13803). Dos publicaciones mostraron la recuperación de LCMV infeccioso completamente a partir de ADNc utilizando plásmidos dirigidos por pol-I/-II o T7/pol-II, respectivamente (denominados "rescate viral") (Flatz et al., 2006, Proc Natl Acad Sci U S A 103(12): 4663-4668; Sanchez y de la Torre, 2006, Virology 350(2): 370-380).

2.4 LCMV recombinante que expresa genes de interés

La generación de virus recombinantes de ARN de cadena negativa que expresan genes extraños de interés se ha buscado durante mucho tiempo. Se han publicado diferentes estrategias para otros virus (Garcia-Sastre et al., 1994, J Virol68(10): 6254-6261; Percy et al., 1994, J Virol68(7): 4486-4492; Flick y Hobom, 1999, Virology 262(1): 93-103; Machado et al., 2003, Virology 313(1): 235-249). En el pasado se ha mostrado que es posible introducir genes extraños adicionales en el genoma de partículas bisegmentadas de LCMV (Emonet et al., 2009, PNAS, 106(9):3473-3478). Se insertaron dos genes extraños de interés en el genoma bisegmentado de LCMV, lo que dio como resultado partículas de LCMV trisegmentadas (r3LCMV) con dos segmentos S y un segmento L. En el virus trisegmentado, publicado por Emonet et al., (2009), tanto la NP como GP se mantuvieron en sus respectivas posiciones naturales en el segmento S y, por lo tanto, se expresaron bajo sus promotores naturales en la UTR flanqueante.

2.5 Arenavirus de replicación deficiente

Recientemente, se ha mostrado que se puede genomanipular una partícula de arenavirus infecciosa para que contenga un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su material genético en células infectadas pero incapaz de producir más progenie en células normales, no modificadas genéticamente (es decir, una partícula de arenavirus infecciosa, de replicación deficiente) (Publicación internacional N.°: WO 2009/083210 A1 y Publicación Internacional N.2: WO 2014/140301 A1).

2.6 Vectores de arenavirus de replicación deficiente que expresan genes de interés

Se ha descrito el uso de arenavirus infecciosos deficientes en la replicación como vectores para la expresión de antígenos (véase Flatz et al., 2010, Nat. Med., 16(3):339-345; Flatz et al., 2012, J. Virol., 86(15), 7760-7770). Estos arenavirus infecciosos, deficientes en la replicación pueden infectar una célula hospedante, es decir, unirse a una célula hospedante y liberar su material genético en la célula hospedante. Sin embargo, son deficientes en la replicación, es decir, el arenavirus no puede producir más partículas de progenie infecciosas en una célula que no es de complementación, debido a una eliminación o inactivación funcional de un marco de lectura abierto (ORF) que codifica una proteína viral, tal como la proteína GP. En su lugar, el ORF se sustituye por una secuencia de nucleótidos de un antígeno de interés. En Flatz et al. 2010, los autores utilizaron arenavirus infecciosos deficientes en la replicación como vectores para expresar OVA (epítopo SIINFEKL). En Flatz et al. 2012, los autores utilizaron arenavirus deficientes en la replicación como vectores para expresar HIV/SIV Env.

La invención proporciona una partícula de arenavirus para su uso en un método para tratar una enfermedad neoplásica en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto la partícula de arenavirus y un inhibidor de punto de control inmunitario, en donde la partícula de arenavirus es una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende una segmento L y dos segmentos S, y en donde la partícula de arenavirus está genomanipulada para contener un segmento genómico de arenavirus que comprende:

(i) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; y

(ii) al menos un marco de lectura abierto ("ORF") de arenavirus en una posición distinta de la posición natural del ORF, en donde el ORF codifica la glicoproteína ("GP"), la nucleoproteína ("NP"), la proteína de matriz Z ("proteína Z") o la ARN polimerasa L dependiente de ARN ("proteína L") de la partícula de arenavirus.

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una partícula de arenavirus, un inhibidor de punto de control inmunitario y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde la partícula de arenavirus es una partícula de arenavirus trisegmentada como se define en el presente documento en el contexto de su uso para tratar una enfermedad neoplásica según la invención.

La invención proporciona un kit que comprende uno o más envases e instrucciones de uso, en donde uno o más envases comprenden la composición farmacéutica de la invención.

La invención proporciona un kit que comprende dos o más envases e instrucciones de uso, en donde uno de los envases comprende una partícula de arenavirus y otro de los envases comprende un inhibidor de punto de control inmunitario, en donde la partícula de arenavirus es una partícula de arenavirus trisegmentada como se define en el presente documento en el contexto de su uso para el tratamiento de una enfermedad neoplásica según la invención.

La invención proporciona una composición farmacéutica de la invención, o un kit de la invención, para usar en un método para tratar una enfermedad neoplásica en un sujeto.

En el contexto de la invención, la referencia a partículas de arenavirus como tal debe entenderse como una referencia a partículas de arenavirus para su uso en el sentido anterior.

3. Sumario de la invención

En el presente documento se describen métodos y composiciones para tratar una enfermedad neoplásica utilizando una partícula de arenavirus que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo. También se describen en el presente documento métodos y composiciones para tratar una enfermedad neoplásica utilizando un inhibidor de punto de control inmunitario. Tal inhibidor de punto de control inmunitario puede inhibir, disminuir o interferir con la actividad de un regulador negativo de puntos de control. En el contexto de la invención, los métodos para tratar una enfermedad neoplásica utilizan una partícula de arenavirus que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario que inhibe, disminuye o interfiere con la actividad de un regulador negativo de puntos de control. En el contexto de la invención, las composiciones comprenden una partícula de arenavirus que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario que inhibe, disminuye o interfiere con la actividad de un regulador negativo de puntos de control.

La partícula de arenavirus en el contexto de la invención está genomanipulada para contener un segmento genómico de arenavirus que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo y al menos un marco de lectura abierto ("ORF") de arenavirus en una posición diferente de la posición natural del ORF. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus es una partícula de arenavirus infecciosa, de replicación deficiente . En otras realizaciones, la partícula de arenavirus es una partícula de arenavirus trisegmentada, que puede ser de replicación deficiente o competente en la replicación. En otras realizaciones más, la partícula de arenavirus trisegmentada cuando se propaga, no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación.

3.1 Partículas de arenavirus que tienen marco de lectura abierto no natural

Se usan arenavirus con reordenamientos de sus ORF en sus genomas y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo el contexto de la invención. En una realización particular, una partícula de arenavirus incluye un segmento genómico de arenavirus que se ha genomanipulado para llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición natural. Así, en determinadas realizaciones particulares, el segmento genómico de arenavirus comprende: una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; y al menos un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición natural de dicho ORF, en donde el ORF codifica la glicoproteína ("GP"), la nucleoproteína ("NP"), la proteína de matriz Z ("proteína Z") o la ARN polimerasa L ("proteína L") dependiente de ARN de una partícula de arenavirus. Se ha transformado una partícula de arenavirus para que contenga dicho segmento genómico de arenavirus.

En ciertas realizaciones, una partícula de arenavirus es infecciosa, es decir, es capaz de entrar o inyectar su material genético en una célula hospedante. En ciertas realizaciones más específicas, una partícula de arenavirus es infecciosa, es decir, es capaz de entrar o inyectar su material genético en una célula hospedante seguido de la amplificación y expresión de su información genética dentro de la célula hospedante. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus está genomanipulada para ser una partícula de arenavirus infecciosa, de replicación deficiente, es decir, contiene un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células que no son de complementación.

El antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor codificado por la secuencia de nucleótidos incluida dentro de un segmento genómico de arenavirus o partícula de arenavirus puede ser uno o más de los antígenos tumorales o antígenos asociados a tumores seleccionados del grupo que consiste en antígenos virales oncogénicos, antígenos de cáncer de testículo, antígenos oncofetales antígenos, antígenos de diferenciación de tejidos, antígenos de proteínas mutantes, neoantígenos, adipofilina, AIM-2, ALDH1AI, BCLX (L), BING-4, CALCA, CD45, CpSF, ciclina D1, DKKI, ENAH (hMcna), Ga733 (EpCAM), EphA3, EZH2, FGF5, glipican-3, G250 /MN/CAIX, HER-2/neu, IDO1, IGF2B3, IL13Ralpha2, carboxil esterasa intestinal, alfa-fetoproteína, calicreína 4, KIF20A, Lengsin, M-CSF, MCSP, mdm-2, Meloe, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, p53 (no mutante), PAX5, PBF, PRAME, PSMA, RAGE, RAGE-1, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, secernina 1, SOX1O, STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de la próstata 1), survivina, telomerasa, V eGF, WT1, EGF-R, CEA, Cd 20, CD33, CD52, glicoproteína 100 (GP100 o proteína gp 100 ), MELANA/MART1, MART2,NY-ESO-1, p53, MAGE A1, MAGE A3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, CDK4, alfa-actinina-4, ARTC1, BCR-ABL, proteína de fusión BCR-ABL (b3a2), B-RAF, CASP-5, CASP-8, betacatenina, Cdc27, CDK4, CDKN2A, CLPP, CO^a-1, proteína de fusión dek-can, EFTUD2, factor de elongación 2, ETV6-AML, proteína de fusión ETV6-AML1, FLT3-ITD, FN1, GPNMB, proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, NFYC, OGT, OS-9, proteína de fusión pml-RARalpha, PRDX5, PTPRK, H-ras, K-ras (oncogén viral del sarcoma de rata V-Kiras2 Kirsten), N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, SSX, SSX2, SYT-SSX1 o proteína de fusión SSX2, TGF-betaRII, triosafosfato isomerasa, ormdm-2, LMP2, HPV E6/E7, EGFRvIII (factor de crecimiento epidérmico variante III), Idiotipo, GD2, gangliósido G2), mutante Ras, p53 (mutante), proteinasa3 (PR1), tirosinasa, PSA, hTERT, puntos de corte de translocación de sarcoma, EphA2, fosfatasa ácida prostática PAP, neo-PAP, ML-IAP, AFP, ERG (gen de fusión TMPRSS2 ETS), NA17, ^pA^x3, A^lK, receptor de andrógenos, ciclina B1, ácido polisiálico, MYCN, TRP2, TRP2-Int2, GD3, Fucosil GM1, Mesotelina, P^sC^a, sLe(a), cyp1B1, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-B^r-1, SART3, STn, anhidrasa carbónica IX, OY-TES1, proteína espermática 17, LCK, antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA), AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, Legumina, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, FAP, PDGFR-beta, MAD-CT-2, antígeno 1 asociado a For, TRP1, CA-125, CA19-9, calretinina, antígeno de membrana epitelial (EMA), antígeno tumoral epitelial (ETA), CD19, CD34, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína de líquido de enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), antígeno HMB-45, Myo-D1, actina específica de músculo (MSA), neurofilamento, enolasa específica de neurona (NSE), fosfatasa alcalina placentaria, sinaptofisina, tiroglobulina, factor de transcripción tiroidea 1, forma dimérica de la isoenzima piruvato quinasa tipo M2 (tumor M2-PK), BAGE BAGE-1, CAGE, CTAGE, FATE, GAGE, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, HCA661, HOM-TES-85, MAGEA, MAGEB, MAGEC, NA88, NY-SAR-35, SPANXB1, SPA17, SSX, SYCP1, TPTE, carbohidrato/gangliósido GM2 (antígeno oncofetal-inmunogénico-1 OFA-I-1), GM3, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA 50, CAM 43, CEA, EBNA, EF2, antígeno del virus de Epstein-Barr, HLA-A2, HLA-A11, HSP70-2, KIAAO205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, miosina clase I, GnTV, Herv- K-mel, LAGE-1, LAGE-2, (proteína espermática) SP17, SCp-1, P15(58), Hom/Mel-40, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, ^mY^l-RAR, TSP-180, P185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, TAG-72, TAG-72-4, CA-72-4, CAM 17.1, NuMa, 13-catenina, P16, TAGE, CT7, 43-9F,5T4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68\KP1, CO-029, HTgp-175, M344, MG7-Ag, MOV18, NB\70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90, TAAL6, TLP, TPS, CD22, CD27, CD30, CD70, prosteina, TARP (proteína del marco de lectura alternativo gamma del receptor de células T), T rp-p8, integrina avp3 (CD61), galactina o Ral-B, CD123, CLL-1, CD38, CS-1, CD138 y ROR1. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos codifica dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos. En determinadas realizaciones, un fragmento antigénico de un antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor es codificado por la secuencia de nucleótidos incluida en el arenavirus.

Por consiguiente, en determinadas realizaciones, un segmento genómico de arenavirus comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En determinadas realizaciones, el segmento genómico está genomanipulado para transportar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición natural del ORF. En algunas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus se selecciona del grupo que consiste en:

(i) un segmento S, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(ii) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iii) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iv) un segmento S, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(v) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(vi) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(vii) un segmento L, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(viii) un segmento L, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(ix) un segmento L, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(x) un segmento L, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(xi) un segmento L, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus; y

(xii) un segmento L, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus.

En determinadas realizaciones, la 3' UTR de arenavirus es la 3' UTR del segmento S de arenavirus o del segmento L de arenavirus. En ciertas realizaciones, la 5' UTR de arenavirus es la 5' UTR del segmento S de arenavirus o el segmento L de arenavirus.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus comprende un segundo segmento genómico de arenavirus de manera que la partícula de arenavirus comprende un segmento S y un segmento L.

En ciertas realizaciones, una partícula de arenavirus es infecciosa, es decir, es capaz de entrar o inyectar su material genético en una célula hospedante. En ciertas realizaciones más específicas, una partícula de arenavirus es infecciosa, es decir, es capaz de entrar o inyectar su material genético en una célula hospedante seguido de amplificación y expresión de su información genética dentro de la célula hospedante. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus es una partícula de arenavirus infecciosa, de replicación deficiente genomanipulada para contener un genoma con capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células que no son de complementación. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus es competente para la replicación y capaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células normales, no modificadas genéticamente. En ciertas realizaciones más específicas, dicha partícula competente para la replicación está atenuada en relación con el virus de tipo natural del que deriva la partícula competente para la replicación.

En ciertas realizaciones, un segmento genómico de arenavirus, que incluye una partícula de arenavirus que comprende el segmento genómico de arenavirus, comprende al menos un ORF de arenavirus que se ha eliminado al menos parcialmente o inactivado funcionalmente. El ORF puede codificar la GP, NP, proteína Z o proteína L de una partícula de arenavirus. Además, en ciertas realizaciones, se elimina al menos un ORF que codifica la GP, NP, proteína Z o proteína L y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En ciertas realizaciones, solo se elimina uno de los cuatro ORF que codifican la GP, NP, proteína Z y proteína L. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, se elimina el ORF que codifica la GP. En determinadas realizaciones, se elimina el ORF que codifica la NP. En determinadas realizaciones, se elimina el ORF que codifica la proteína Z. En determinadas realizaciones, se elimina el ORF que codifica la proteína L.

Una partícula de arenavirus bisegmentada infecciosa, de replicación deficiente descrita en el presente documento puede comprender al menos un ORF de arenavirus que se elimina al menos parcialmente o se inactiva funcionalmente. El ORF puede codificar la GP, NP, proteína Z o proteína L. Además, en ciertos casos, se puede eliminar al menos un ORF que codifica la GP, NP, proteína Z o proteína L y reemplazar por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En ciertos casos, solo se puede eliminar uno de los cuatro ORF que codifican la GP, NP, proteína Z y proteína L. Por lo tanto, en ciertos casos, se puede eliminar el ORF que codifica la GP. En ciertos casos, se puede eliminar el ORF que codifica la NP. En ciertos casos, se puede eliminar el ORF que codifica la proteína Z. En ciertos casos, se puede eliminar el ORF que codifica la proteína L.

En ciertos casos, una partícula de arenavirus bisegmentada infecciosa, de replicación deficiente puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo y puede comprender además al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores. El péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores puede ser la calreticulina (CRT), o un fragmento de la misma; ubiquitina o un fragmento de la misma; factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), o un fragmento del mismo; cadena invariable (CD74) o un fragmento antigénico de la misma; proteína de choque térmico 70 de Mycobacterium tuberculosis o un fragmento antigénico de la misma; proteína VP22 del virus del herpes simplex 1 o un fragmento antigénico de la misma; ligando de CD40 o un fragmento antigénico del mismo; o ligando de tirosina quinasa 3 relacionado con Fms (Flt3) o un fragmento antigénico del mismo.

En determinadas realizaciones, una partícula de arenavirus deriva de una especie de arenavirus específica, tal como el virus de la coriomeningitis linfocítica ("LCMV") o el virus Junin ("JUNV"). En otras palabras, la información genómica que codifica la partícula de arenavirus deriva de una especie específica de arenavirus. Por tanto, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus deriva del LCMV. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus deriva del JUNV. Además, en realizaciones específicas, el LCMV es la cepa MP, cepa WE, cepa Armstrong o cepa Armstrong Clon 13. En otras realizaciones específicas, el JUNV es la cepa Candid n.°1 de la vacuna JUNV, o la cepa XJ Clon 3 de la vacuna JUNV.

3.2 Arenavirus trisegmentados

Las partículas de arenavirus trisegmentadas en el contexto de la invención comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. Según la invención, la partícula de arenavirus comprende un segmento L y dos segmentos S. En determinadas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada no se recombina en una partícula de arenavirus bisegmentada competente para la replicación. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada no da como resultado una partícula bisegmentada competente para la replicación después de 70 días de infección persistente en ratones que carecen del receptor de interferón tipo I, receptor de interferón tipo II y gen activador de recombinación 1 (RAG1) y que han sido infectados con 104 PFU de la partícula de arenavirus trisegmentada. Las partículas de arenavirus trisegmentadas, en ciertas realizaciones, se pueden genomanipular para mejorar la estabilidad genética y asegurar una expresión transgénica duradera. Además, en ciertas realizaciones, la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos S, uniendo dos ORF de arenavirus en solo uno en lugar de dos segmentos separados, anula la actividad del promotor viral.

En ciertas realizaciones, una partícula de arenavirus trisegmentada es infecciosa, es decir, es capaz de entrar o inyectar su material genético en una célula hospedante. En ciertas realizaciones más específicas, una partícula de arenavirus trisegmentada es infecciosa, es decir, es capaz de entrar o inyectar su material genético en una célula hospedante seguido de amplificación y expresión de su información genética dentro de la célula hospedante. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es una partícula de arenavirus infecciosa, de replicación deficiente genomanipulada para contener un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células que no son de complementación. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es competente para la replicación y es capaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células normales, no modificadas genéticamente. En ciertas realizaciones más específicas, dicha partícula competente para la replicación está atenuada en relación con el virus de tipo natural del que deriva la partícula competente para la replicación.

El antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor codificado por la secuencia de nucleótidos incluida dentro de una partícula de arenavirus trisegmentada puede ser uno o más de los antígenos tumorales o antígenos asociados a tumor seleccionados del grupo que consiste en antígenos virales oncogénicos, antígenos de cáncer de testículo, antígenos oncofetales, antígenos de diferenciación tisular, antígenos proteicos mutantes, neoantígenos, adipofilina, AIM-2, ALDH1AI, BCLX (L), BING-4, CALCA, CD45, CPSF, ciclina D1, DKKI, ENAH (hMcna), Ga733 (EpCAM), EphA3, EZH2, FGF5, glipican-3, G250 /MN/CAIX, HER-2/neu, IDOl, IGF2B3, IL13Ralpha2, carboxil esterasa intestinal, alfafetoproteína, calicreína 4, KIF20A, Lengsin, M-^cS^f, ^mC^sP, mdm-2, Meloe, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, p53 (no mutante), PAX5, P^bF, PRAME, PSMA, RAGE, RAGE-1, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, secernina 1, SOX1O, STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de la próstata 1), survivina, telomerasa, VEGF, WT1, EGF-R, CEA, CD20, CD33, CD52, glicoproteína 100 (proteína GP100 o gp 100), MELANA/MART1, MART2,NY-ESO-1, p53, MAGE A1, MAGE A3, ^mA^gE-4, MAGE-5, MAGE-6, CDK4, alfa-actinina-4, ARTC1, BCR-ABL, proteína de fusión BCR-ABL (b3a2), B-RAF, CASP-5, CASP-8, beta-catenina, Cdc27, CDK4, CDKN2A, CLPP, COA-1, proteína de fusión dek-can, EFTUD2, factor de elongación 2, ETV6-AML, proteína de fusión ETV6-AML1, FLT3-ITD, FN1, GPNMB, proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, NFYC, OGT, OS-9, proteína de fusión pml-RARalpha, PRDX5, PTPRK, H-ras, K-ras (oncogén viral del sarcoma de rata V-Ki-ras2 Kirsten), N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, SSX, SSX2, proteína de fusión SYT-SSX1 o -SSX2, TGF-betaRII, triosafosfato isomerasa, ormdm-2, LMP2, HPV E6/E7, EGFRvIII (variante del factor de crecimiento epidérmico III), Idiotipo, GD2, gangliósido G2), mutante Ras, p53 (mutante), proteinasa3 (PR1), tirosinasa, PSA, hTERT, puntos de corte de translocación de sarcoma, EphA2, fosfatasa ácida prostática ^pA^p, neo-PAP, ^mL-IAP, AFP, ^eR^g(gen de fusión TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, ALK, receptor de andrógenos, ciclina B1, ácido polisiálico, My Cn , TRp2, TRP2-Int2, GD3, fucosil GM1, mesotelina, PSCA, sLe(a), cyp1B1, PLAC1, GM3, b Or IS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, SART3, STn, anhidrasa carbónica IX, OY-TES1, proteína espermática 17, LCK, antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA), AKAP-4, SSX2, XAGE 1, b 7h 3, Legumina, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, FAP, pDGFR-beta, Ma D-CT-2, antígeno relacionado con For 1, TRP1, CA-125, CA19-9, calretinina, antígeno de membrana epitelial (EMA), antígeno de tumor epitelial (ETA), CD19, CD34, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína del líquido de la enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), antígeno HMB-45, Myo-D1, actina específica del músculo (MSA), neurofilamento, enolasa específica de neurona (NSE), fosfatasa alcalina placentaria, sinaptofisina, tiroglobulina, factor de transcripción tiroidea 1, forma dimérica de la isoenzima piruvato quinasa tipo M2 (tumor M2-PK), BAGE BAGE-1, CAGE, CTAGE, FATE, GAGE, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, HCA661, HOM-TES-85, MAGEA, MAGEB, MAGEC, NA88, NY-SAR-35, SPANXB1, SPA17, SSX, SYCP1, TPTE, carbohidrato/gangliósido Gm 2 (antígeno oncofetal-inmunogénico-1 OFA-I-1), GM3, CA 15-3 (CA 27.29\Bc Aa ), CA 195, CA 242, CA 50, CAM 43, CEA, EBNA, EF2, antígeno del virus de Epstein-Barr, HLA-A2, HLA-A11, HSP70-2, KIAAO205, MUM-1, MUM-2, M^uM-3, miosina clase I, GnTV, Herv-K-mel, LAGE-1, LAGE-2, (proteína espermática) SP17, SCP-1, P15(58), Hom/Mel-40, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, TSP-180, P185erbB2, p180erbB-3, cmet, nm-23H1, TAG-72, TAG-72-4, CA-72-4, CAM 17.1, NuMa, 13-catenina, P16, TAGE, CT7, 43-9F,5T4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68\KP1, CO-029, HTgp-175, M344, MG7-Ag, MOV18, NB\70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90, TAAL6, TLP, TPS, CD22, CD27, CD30, CD70, prosteina, TARP (proteína de marco de lectura alternativo gamma del receptor de células T), T rp-p8, integrina avp3 (CD61), galactina o Ral-B, CD123, CLL-1, CD38, CS-1, CD138 y ROR1. En determinadas realizaciones, la secuencia de nucleótidos codifica dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos. En ciertas realizaciones, un fragmento antigénico de un antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor es codificado por la secuencia de nucleótidos incluida dentro del arenavirus trisegmentado.

En determinadas realizaciones, los arenavirus trisegmentados tienen reordenamientos de sus ORF en sus genomas y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En una realización particular, se ha genomanipulado una partícula de arenavirus trisegmentada para llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición natural. Así, en determinadas realizaciones particulares, un arenavirus trisegmentado comprende: una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; y al menos un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición natural de dicho ORF, en donde el ORF codifica la GP, NP, proteína Z o proteína L de una partícula de arenavirus.

En ciertas realizaciones, uno de los dos segmentos S incluidos en la partícula de arenavirus trisegmentada se selecciona del grupo que consiste en:

(i) un segmento S, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus

(ii) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(v) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus; y

(vi) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus.

En ciertas realizaciones, la 3' UTR de partícula de arenavirus trisegmentada es la 3' UTR del segmento S de arenavirus. En otras realizaciones, la 5' UTR de partícula trisegmentada de arenavirus es la 5' UTR del segmento S de arenavirus.

En determinadas realizaciones, los dos segmentos S comprenden: (i) una o dos secuencias de nucleótidos, cada una de las cuales codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; o (ii) uno o dos ORF de arenavirus duplicados; o (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y un ORF de arenavirus duplicado.

En determinadas realizaciones, una partícula de arenavirus trisegmentada comprende al menos un ORF de arenavirus que se elimina al menos parcialmente o se inactiva funcionalmente. El ORF puede codificar la GP, NP, proteína Z o proteína L de una partícula de arenavirus. Además, en ciertas realizaciones, se elimina al menos un ORF que codifica la GP, NP, proteína Z o proteína L y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En ciertas realizaciones, solo se elimina uno de los cuatro ORF que codifican la GP, NP, proteína Z y proteína L. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, se elimina el ORF que codifica la GP. En determinadas realizaciones, se elimina el ORF que codifica la NP. En determinadas realizaciones, se elimina el ORF que codifica la proteína Z. En determinadas realizaciones, se elimina el ORF que codifica la proteína L.

En determinadas realizaciones, una partícula de arenavirus trisegmentada deriva de una especie de arenavirus específica, tal como el virus de la coriomeningitis linfocítica (''LCMV") o el virus Junín (''JUNV''). En otras palabras, la información genómica que codifica la partícula de arenavirus trisegmentada deriva de una especie específica de arenavirus. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada deriva del LCMV. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada deriva del JUNV. Además, en realizaciones específicas, el LCMV es la cepa MP, cepa WE, cepa Armstrong o cepa Armstrong Clon 13. En otras realizaciones específicas, el JUNV es la cepa Candid n.°1 de la vacuna JUNV, o la cepa XJ Clon 3 de la vacuna JUNV.

3.3 Métodos para tratar una enfermedad neoplásica

En el presente documento se proporciona una partícula de arenavirus trisegmentada para usar en métodos de tratamiento de una enfermedad neoplásica en un sujeto. Dichos métodos pueden incluir la administración a un sujeto que lo necesite de una partícula de arenavirus trisegmentada y un inhibidor de punto de control inmunitario.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus usada en los métodos es una partícula de arenavirus infecciosa, de replicación deficiente. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus usada en los métodos es una partícula de arenavirus trisegmentada, que incluye una partícula de arenavirus trisegmentada infecciosa, de replicación deficiente o una partícula de arenavirus trisegmentada competente para la replicación. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada, utilizada en los métodos, es de replicación deficiente, en donde la partícula de arenavirus está genomanipulada para contener un genoma que comprende: (1) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; y (2) la capacidad para amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células que no son de complementación. Además, en determinadas realizaciones, una partícula de arenavirus trisegmentada utilizada en los métodos es competente para la replicación, en donde la partícula de arenavirus trisegmentada está genomanipulada para contener un genoma que comprende: (1) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; (2) la capacidad para amplificar y expresar su información genética en células infectadas; y (3) la capacidad de producir más partículas de progenie infecciosas en células normales, no modificadas genéticamente. En ciertas realizaciones, el inhibidor de punto de control inmunitario inhibe, disminuye o interfiere con la actividad de un regulador negativo de puntos de control. Una partícula de arenavirus puede ser una partícula de arenavirus bisegmentada infecciosa, de replicación deficiente. La partícula de arenavirus infecciosa, de replicación deficiente utilizada en los métodos se transforma para contener un genoma que comprende: (1) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; y (2) la capacidad para amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células que no son de complementación. En ciertas realizaciones, el inhibidor de punto de control inmunitario inhibe, disminuye o interfiere con la actividad de un regulador negativo de puntos de control.

En determinadas realizaciones, el antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor codificado por la secuencia de nucleótidos incluida dentro de una partícula de arenavirus, incluida una partícula de arenavirus trisegmentada, puede ser uno o más de los antígenos tumorales o antígenos asociados a tumores seleccionados del grupo que consiste en antígenos oncogénicos virales, antígenos de cáncer de testículo, antígenos oncofetales, antígenos de diferenciación tisular, antígenos proteicos mutantes, neoantígenos, adipofilina, AIM-2, ALDH1AI, BCLX (L), BING-4, CALCA, CD45, CPSF, ciclina D1, DKKI, ENAH (hMcna), Ga733 (EpCAM), EphA3, EZH2, FGF5, glipican-3, G250 /MN/CAIX, HER-2/neu, IDO1, IGF2B3, IL13Ralpha2, carboxil esterasa intestinal, alfa-fetoproteína, calicreína 4, KIF20A, Lengsin, M-CSF, MCSP, mdm-2, Meloe, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, p53 (no mutante), PAX5, PBF, PRAME, PSMA, RAGE, RAGE-1, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, secernina 1, SOX1O, STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de la próstata 1), survivina, telomerasa, VEGF, WT1, EGF-R, CEA, CD20, CD33, CD52 , glicoproteína 100 (GP100 o proteína gp 100), MELANA/MART1, MART2,NY-ESO-1, p53, MAGE A1, MAGE A3, MAGE-4, MAGE-5, ^mA^gE-6, ^cD^k4, alfa-actinina-4, ARTC1, BCR-ABL, proteína de fusión BCR-ABL (b3a2), B-RAF, CASP-5, CASP-8, beta-catenina, Cdc27, CDK4, CDKN2A, CLPP, COA-1, proteína de fusión dek-can, EFTUD2, factor de elongación 2, ETV6-AML, proteína de fusión ETV6-AML1, FLT3-ITD, Fn 1, GPNMB, proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, NFYC, OGT, OS-9, proteína de fusión pml-RARalfa, p RdX5, PTPRK, H- ras, K-ras (oncogén viral del sarcoma de rata V-Ki-ras2 Kirsten), N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, SSX, SSX2, proteína de fusión SYT-SSX1 o SSX2, TGF-betaRII, triosafosfato isomerasa, ormdm-2, LMP2, HPV E6/E7, EGFRvIII (factor de crecimiento epidérmico variante III), Idiotipo, GD2, gangliósido G2), mutante Ras, p53 (mutante), proteinasa3 (PR1), tirosinasa, PSA, hTERT, puntos de corte de translocación de sarcoma, EphA2, fosfatasa ácida prostática PAP, neo-PAP, ML-IAP, AFP, ERG (gen de fusión TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, ALK, receptor de andrógenos, ciclina B1, ácido polisiálico, MYCN, TRP2, TRP2-Int2, GD3, fucosil GM1, mesotelina, PSCA, sLe(a), cyp1B1, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, SART3, STn, anhidrasa carbónica IX, OY-TES1, proteína espermática 17, LCK, antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA), AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, Legumina, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, FAP, PDGFR-beta, MAD-CT-2, antígeno relacionado con For 1, TRP1, CA-125, CA19-9, calretinina, antígeno de membrana epitelial (EMA), antígeno tumoral epitelial (ETA), CD19, CD34, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína del líquido de la enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), antígeno HMB-45, Myo-D1, actina específica del músculo (MSA), neurofilamento, enolasa específica de neurona (NSE), fosfatasa alcalina placentaria, sinaptofisina, tiroglobulina, factor de transcripción tiroidea 1, forma dimérica de la isoenzima piruvato quinasa tipo M2 (tumor M2-PK), BAGE BAGE-1, CAGE, CTAGE, FATE, GAGE, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, HCA661, HOM-TES-85, MAGEA, MAGEB, MAGEC, NA88, NY-SAR-35, SPANXB1, SPA17, SSX, SYCP1, TPTE, carbohidrato/gangliósido GM2 (antígeno oncofetal-inmunogénico-1 OFA-I-1), GM3, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA 50, CAM 43, CEA, EBNA, EF2, antígeno del virus de Epstein-Barr, HLA-A2, HLA-A11, HSP70-2, KIAAO205, MUM-1 , MUM-2, MUM-3, miosina clase I, GnTV, Herv-K-mel, LAGE-1, LAGE-2, (proteína espermática) SP17, SCP-1, P15(58), Hom/Mel-40, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, TSP-180, P185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, TAG-72, TAG-72-4, CA-72-4, CAM 17.1, NuMa, 13-catenina, P16, TAGE, CT7, 43-9F,5T4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68\KP1, CO-029, HTgp-175, M344, MG7-Ag, MOV18, NB\70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90, TAAL6, TLP, TPS, CD22, CD27, CD30, CD70, prosteina, TARP (proteína del marco de lectura alternativo gamma del receptor de células T), T rp-p8, integrina avp3 (CD61), galactina o Ral-B, CD123, CLL-1, CD38, CS-1, CD138 y ROR1. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos codifica dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos. En determinadas realizaciones, un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, es codificado por la secuencia de nucleótidos incluida en el arenavirus, incluido un arenavirus trisegmentado.

El tratamiento de una enfermedad neoplásica en un sujeto comprende además la administración de un inhibidor de punto de control inmunitario que inhibe, disminuye o interfiere con la actividad de un regulador negativo de puntos de control. En ciertas realizaciones, el regulador negativo de puntos de control se selecciona del grupo que consiste en antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), CD80, CD86, muerte celular programada 1 (PD-1), ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1), ligando de muerte celular programada 2 (PD-L2), gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3; también conocido como CD223), galectina-3, atenuador de linfocitos B y T (BTLA), proteína de membrana 3 de células T (TIM3), galectina-9 (GAL9), B7-H1, B7-H3, B7-H4, inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM (TIGIT/Vstm3/WUCAM/VSIG9), supresor de Ig de dominio V de células T (VISTA), proteína relacionada con el receptor del factor de necrosis tumoral inducida por glucocorticoides (GITR), mediador de entrada del virus del herpes (HVEM), OX40, CD27, CD28, CD137. CGEN-15001T, CGEN-15022, CGEN-15027, CGEN-15049, CGEN-15052 y CGEN-15092.

En ciertas realizaciones, el sujeto que se trata padece, es susceptible o está en riesgo de padecer una enfermedad neoplásica. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el sujeto padece una enfermedad neoplásica. En algunas realizaciones, el sujeto es susceptible a una enfermedad neoplásica. En algunas realizaciones, el sujeto tiene riesgo de padecer una enfermedad neoplásica. En ciertas realizaciones, la enfermedad neoplásica se selecciona del grupo que consiste en leucemia linfoblástica aguda; linfoma linfoblástico agudo; leucemia linfocítica aguda; leucemia mielógena aguda; leucemia mieloide aguda (adulto/infancia); carcinoma corticosuprarrenal; cánceres relacionados con el SIDA; linfoma relacionado con el SIDA; cáncer anal; cáncer de apéndice; astrocitomas; tumor teratoideo/rabdoideo atípico; carcinoma de células basales; cáncer de las vías biliares, extrahepático (colangiocarcinoma); cáncer de vejiga; osteosarcoma óseo/histiocitoma fibroso maligno; cáncer cerebral (adulto/infantil); tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso (adulto/infancia); tumor cerebral, tumor cerebral astrocitoma cerebral/glioma maligno; tumor cerebral, ependimoma; tumor cerebral, meduloblastoma; tumor cerebral, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales; tumor cerebral, glioma de la vía óptica e hipotalámico; glioma del tronco encefálico; cáncer de mama; adenomas/carcinoides bronquiales; tumor bronquial; linfoma de Burkitt; cáncer de la infancia; tumor gastrointestinal carcinoide; tumor carcinoide; carcinoma del adulto, sitio primario desconocido; carcinoma de origen primario desconocido; tumor embrionario del sistema nervioso central; linfoma del sistema nervioso central, primario; cáncer de cuello uterino; carcinoma corticosuprarrenal infantil; cánceres infantiles; astrocitoma cerebral infantil; cordoma, infancia; leucemia linfocítica crónica; leucemia mielógena crónica; leucemia mieloide crónica; trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de colon; cáncer colorrectal; craneofaringioma; linfoma cutáneo de células T; tumor desmoplásico de células redondas pequeñas; enfisema; cáncer endometrial; ependimoblastoma; ependimoma; cáncer de esófago; el sarcoma de Ewing en la familia de tumores de Ewing; tumor extracraneal de células germinales; tumor extragonadal de células germinales; cáncer de vías biliares extrahepáticas; cáncer de vesícula biliar; cáncer gástrico (de estómago); carcinoide gástrico; tumor carcinoide gastrointestinal; tumor del estroma gastrointestinal; tumor de células germinales: tumor trofoblástico gestacional extracraneal, extragonadal u ovárico; tumor trofoblástico gestacional, sitio primario desconocido; glioma; glioma del tronco encefálico; glioma, vía óptica e hipotalámico infantil; leucemia de células pilosas; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de corazón; cáncer hepatocelular (hígado); linfoma de Hodgkin; cáncer de hipofaringe; glioma hipotalámico y de la vía óptica; melanoma intraocular; carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino); sarcoma de Kaposi; cáncer de riñón (cáncer de células renales); histiocitosis de células de Langerhans; cáncer de laringe; cáncer de labio y cavidad oral; liposarcoma; cáncer de hígado (primario); cáncer de pulmón no microcítico; cáncer de pulmón microcítico; linfoma, primario del sistema nervioso central; macroglobulinemia, Waldenstrom; cáncer de mama masculino; histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma; meduloblastoma; meduloepitelioma; melanoma; melanoma, intraocular (ojo); cáncer de células de Merkel; carcinoma de piel de células de Merkel; mesotelioma; mesotelioma, maligno en adulto; cáncer de cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto; cáncer de boca; síndrome de neoplasia endocrina múltiple; mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas; micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos; enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas; leucemia mielógena, crónica; leucemia mieloide aguda del adulto; leucemia mieloide, aguda infantil; mieloma, múltiple (cáncer de la médula ósea); trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de cavidad nasal y senos paranasales; carcinoma nasofaríngeo; neuroblastoma, cáncer de pulmón no microcítico; linfoma no Hodgkin; oligodendroglioma; cáncer oral; cáncer de cavidad oral; cáncer orofaríngeo; osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso; cáncer de ovario; cáncer epitelial de ovario (tumor del estroma epitelial superficial); tumor de células germinales de ovario; tumor de ovario de bajo potencial maligno; cáncer de páncreas; cáncer de páncreas, células de los islotes; papilomatosis; cáncer de seno paranasal y cavidad nasal; cáncer de paratiroides; cáncer de pene; cáncer de faringe; feocromocitoma; astrocitoma pineal; germinoma pineal; tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia; pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales; tumor hipofisario; adenoma hipofisario; neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple; blastoma pleuropulmonar; linfoma primario del sistema nervioso central; cáncer de próstata; cáncer de recto; carcinoma de células renales (cáncer de riñón); cáncer de células de transición de pelvis renal y uréter; carcinoma del tracto respiratorio que implica el gen NUT en el cromosoma 15; retinoblastoma; rabdomiosarcoma, infancia; cáncer de glándulas salivales; sarcoma, familia de tumores de Ewing; síndrome de Sézary; cáncer de piel (melanoma); cáncer de piel (no melanoma); cáncer de pulmón microcítico; cáncer de intestino delgado sarcoma de tejidos blandos; sarcoma de tejidos blandos; tumor de la médula espinal; carcinoma de células escamosas; cáncer de cuello escamoso con primario oculto, metastásico; cáncer de estómago (gástrico); tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial; linfoma de células T, cutáneo (micosis fungoide y síndrome de Sézary); cáncer de testículo; cáncer de garganta; timoma; timoma y carcinoma tímico; cáncer de tiroides; cáncer de tiroides, infantil; cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter; cáncer de uretra; cáncer de útero, endometrio; sarcoma uterino; cáncer de vagina; cáncer de vulva; y Tumor de Wilms.

En determinadas realizaciones, un arenavirus trisegmentado y un inhibidor de punto de control inmunitario que se utilizan en el contexto de la invención se pueden administrar en una variedad de combinaciones diferentes. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus y el inhibidor de punto de control inmunitario se administran simultáneamente. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus se administra antes de la administración del inhibidor de punto de control inmunitario. En otras realizaciones más, la partícula de arenavirus se administra después de la administración del inhibidor de punto de control inmunitario. El intervalo entre la administración de la partícula de arenavirus y el inhibidor de punto de control inmunitario puede ser horas, días, semanas o meses. Así, en algunas realizaciones, el intervalo es de aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 8 días, aproximadamente 9 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 13 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses o más.

En determinadas realizaciones, el método incluye administrar un arenavirus trisegmentado y el inhibidor de punto de control inmunitario en una cantidad terapéuticamente eficaz. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, un método para tratar una enfermedad neoplásica en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una partícula de arenavirus y una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de punto de control inmunitario, en donde la partícula de arenavirus está genomanipulada para contener un segmento genómico que comprende: una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; y al menos un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición natural del ORF, en donde el ORF codifica la GP, NP, proteína Z o proteína L de la partícula de arenavirus, y en donde el inhibidor de punto de control inmunitario inhibe, disminuye o interfiere con la actividad de un regulador negativo de puntos de control.

Un método para tratar una enfermedad neoplásica en un sujeto puede comprender administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una partícula de arenavirus bisegmentada infecciosa, de replicación deficiente y una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de punto de control inmunitario, en donde la partícula de arenavirus está genomanipulada para contener un genoma que comprende: una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; y la capacidad para amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células que no son de complementación, y en donde el inhibidor de punto de control inmunitario inhibe, disminuye o interfiere con la actividad de un regulador negativo de punto de control.

En determinadas realizaciones, los métodos para tratar una enfermedad neoplásica en un sujeto comprenden administrar al sujeto dos o más arenavirus, incluido un arenavirus trisegmentado, que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo. En una realización más específica, el método incluye administrar al sujeto una primera partícula de arenavirus y administrar al sujeto, después de un periodo de tiempo, una segunda partícula de arenavirus. En otra realización más, la primera partícula de arenavirus y la segunda partícula de arenavirus derivan de diferentes especies de arenavirus y/o comprenden secuencias de nucleótidos que codifican diferentes antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos.

De acuerdo con la invención, el método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una partícula de arenavirus que codifica un neoantígeno en combinación con un inhibidor de punto de control inmunitario. En algunas realizaciones, el neoantígeno es una glucoquinasa dependiente de ADP (Adpgk) que tiene una mutación R203M. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer de colon. En algunas realizaciones, el inhibidor de punto de control inmunitario es un anticuerpo que se une o inhibe la actividad de muerte celular programada 1 ("PD1"). En consecuencia, en una realización, se describe en el presente documento un método para tratar el cáncer de colon en un sujeto que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una partícula de arenavirus y un inhibidor de punto de control inmunitario, en donde la partícula de arenavirus está genomanipulada para contener un segmento genómico de arenavirus que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un neoantígeno o un fragmento antigénico del mismo; y (ii) al menos un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición natural del ORF, en donde el ORF codifica la GP, la NP, la proteína Z o la proteína L de la partícula de arenavirus, en donde el neoantígeno es Adpgk que tiene una mutación R203M, el inhibidor de punto de control inmunitario es un anticuerpo que se une o inhibe PD1, la partícula de arenavirus deriva del LCMV y es una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S, y en donde, en uno de los dos segmentos S, el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus, y cada uno de los dos segmentos S comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el neoantígeno o fragmento antigénico del mismo.

En ciertas realizaciones, un método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una partícula de arenavirus que codifica un antígeno de melanoma en combinación con un inhibidor de punto de control inmunitario. En algunas realizaciones, el antígeno de melanoma es la glicoproteína 100 ("GP100"), proteína relacionada con tirosinasa 1 ("TRP1") o proteína relacionada con tirosinasa 2 ("TRP2"). En algunas realizaciones, el sujeto tiene melanoma. En algunas realizaciones, el inhibidor de punto de control inmunitario es un anticuerpo que se une o inhibe la actividad de PD1. Por consiguiente, en una realización, un método para tratar el melanoma en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesite una partícula de arenavirus y un inhibidor de punto de control inmunitario, en donde la partícula de arenavirus está genomanipulada para contener un segmento genómico de arenavirus que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de melanoma o un fragmento antigénico del mismo; y (ii) al menos un ORF de arenavirus en una posición diferente a la posición natural del ORF, en donde el ORF codifica la GP, la NP, la proteína Z o la proteína L de la partícula de arenavirus, en donde el antígeno de melanoma se selecciona del grupo que consiste en GP100, TRP1 y TRP2, el inhibidor de punto de control inmunitario es un anticuerpo que se une o inhibe PD1, la partícula de arenavirus deriva del LCMV y es una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S, y en donde, en uno de los dos segmentos S, el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus, y cada uno de los dos segmentos S comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno de melanoma o fragmento antigénico del mismo.

La invención se refiere al uso de una partícula de arenavirus y un inhibidor de punto de control inmunitario en un método de tratamiento de una enfermedad neoplásica en un sujeto.

3.4 Composiciones farmacéuticas y Kits

En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento composiciones, p. ej., composiciones farmacéuticas, inmunogénicas o de vacunas, que comprenden la partícula de arenavirus trisegmentada, un inhibidor de punto de control inmunitario y un vehículo farmacéuticamente aceptable como se define en el contexto de la invención. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se proporciona en el presente documento una composición farmacéutica que comprende la partícula de arenavirus trisegmentada, un inhibidor de punto de control inmunitario y un vehículo farmacéuticamente aceptable como se define en el contexto de la invención.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus contenida dentro de las composiciones es una partícula de arenavirus trisegmentada infecciosa, de replicación deficiente o una partícula de arenavirus trisegmentada competente para la replicación. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, las composiciones proporcionadas en el presente documento, que incluyen una composición farmacéutica, inmunogénica o de vacuna, comprenden la partícula de arenavirus trisegmentada, que es de replicación deficiente, en donde la partícula de arenavirus está genomanipulada para contener un genoma que comprende: (1) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; y (2) la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células que no son de complementación. Además, en ciertas realizaciones, las composiciones proporcionadas en el presente documento, que incluyen una composición farmacéutica, inmunogénica o de vacuna, comprenden una partícula de arenavirus trisegmentada que es competente para la replicación, en donde la partícula de arenavirus trisegmentada está genomanipulada para contener un genoma que comprende: (1) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; (2) la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas; y (3) la capacidad de producir más partículas de progenie infecciosas en células normales, no modificadas genéticamente. En ciertas realizaciones, el inhibidor de punto de control inmunitario inhibe, disminuye o interfiere con la actividad de un regulador negativo de puntos de control.

En el presente documento se describe una composición farmacéutica que comprende una partícula de arenavirus bisegmentada, infecciosa, de replicación deficiente, un inhibidor de punto de control inmunitario y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La partícula de arenavirus puede estar genomanipulada para contener un genoma que comprende: (1) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; y (2) la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células que no son de complementación. El inhibidor de punto de control inmunitario puede inhibir, disminuir o interferir con la actividad de un regulador negativo de puntos de control.

En ciertas realizaciones, el antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor codificado por la secuencia de nucleótidos incluida dentro de una partícula de arenavirus puede ser uno o más de los antígenos tumorales o antígenos asociados a tumor seleccionados del grupo que consiste en antígenos virales oncogénicos, antígenos de cáncer de testículo, antígenos oncofetales antígenos, antígenos de diferenciación de tejidos, antígenos de proteínas mutantes, neoantígenos, adipofilina, AIM-2, ALDH1AI, BCLX (L), BING-4, CALCA, CD45, CPSF, ciclina D1, DKKI, ENAH (hMcna), Ga733 (EpCAM), EphA3, EZH2, FGF5, glipican-3, G250 /MN/CAIX, HER-2/neu, IDO1, IGF2B3, IL13Ralpha2, carboxil esterasa intestinal, alfa-fetoproteína, calicreína 4, KIF20A, Lengsin, M-CSF, MCSP, mdm-2, Meloe, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, p53 (no mutante), PAX5, PBF, PRAME, PSMA, RAGE, RAGE-1, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, secernina 1, SOX1O , STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de la próstata 1), survivina, telomerasa, VEGF, WT1, EGF-R, CEA, CD20, CD33, CD52, glicoproteína 100 (proteína GP100 o gp 100), MELANA/MART1, MART2,NY-ESO-1, p53, MAGE A1, MAGE A3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, CDK4, alfaactinina-4, ARTC1, BCR-ABL, proteína de fusión BCR-ABL (b3a2), B-RAF, CASP-5, CASP-8, beta-catenina, Cdc27, CDK4, c Dk N2A, CLPP, Co A-1, proteína de fusión dek-can, EFTUD2, factor de elongación 2, ETV6-AML, ETV6 -proteína de fusión AML1, FLT3-ITD, FN1, GPNMB, proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, NFYC, OGT, OS-9, proteína de fusión pml-RARalpha, PRDX5, PTPRK, H-ras, K-ras (oncogén viral del sarcoma de rata Kirsten V-Kiras2), N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, SSX, s SX2, proteína de fusión SYT-SSX1 o -SSX2, TGF-betaRII, triosafosfato isomerasa, ormdm-2, LMP2, HPV E6/E7, EGFRvIII (variante III del factor de crecimiento epidérmico), Idiotipo, GD2, gangliósido G2), mutante Ras, p53 (mutante), proteinasa 3 (PR1), tirosinasa, PSA, hTERT, puntos de corte de translocación de sarcoma, EphA2, fosfatasa ácida prostática PAP, neo-PAP, ML-IAP, AFP, ERG (gen de fusión TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, A^lK, receptor de andrógenos, ciclina B1, ácido polisiálico, MYCN, TRP2, TRP2-Int2, GD3, Fucosil GM1, mesotelina, PSCA, sLe(a), cyp1B1, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, SART3, STn, anhidrasa carbónica IX, OY-TES1, proteína espermática 17, LCK, antígeno asociado a melanoma de peso molecular alto (HMWMAA), AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, Legumina, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, FAP, PDGFR-beta, M^aD-CT-2, antígeno 1 asociado a For, TRP1, CA-125, CA19-9, calretinina, antígeno de membrana epitelial (EMA), antígeno de tumor epitelial (ETA), CD19, CD34, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína de líquido de enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), antígeno HMB-45, Myo-D1, actina específica de músculo (MSA), neurofilamento, enolasa específica de neurona (NSE), fosfatasa alcalina placentaria, sinaptofisina, tiroglobulina, factor de transcripción tiroidea 1, forma dimérica de la isoenzima piruvato quinasa tipo M2 (tumor M2-PK), BAGE BAGE-1, CAGE, CTAGE, FATE, GAGE, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, HCA661, HOM-TES-85, MAGEA, MAGEB, MAGEC, NA88, NY-SAR-35, SPANXB1, SPA17, SSX, SYCP1, TPTE, carbohidrato/gangliósido GM2 (antígeno oncofetal-inmunogénico-1 OFA-I-1), GM3, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA 50, CAM 43, CEA, EBNA, EF2, antígeno del virus de Epstein-Barr, HLA-A2, HLA-A11, HSP70-2, KIAAO205, M^uM-1, MUM-2, MUM-3, miosina clase I, GnTV, Herv-K-mel, LAGE-1, LAGE-2, (proteína espermática) SP17, SCP-1, P15(58), Hom/Mel-40, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, TSP-180, P185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, TAG-72, TAG-72-4, CA-72-4, CAM 17.1, NuMa, 13-catenina, P16, TAGE, CT7, 43-9F,5T4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68\KP1, CO-029, HTgp-175, M344, MG7-Ag, MOV18, NB\70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90, TAAL6, TLP, TPS, CD22, CD27, CD30, CD70, prosteina, TARP (proteína del marco de lectura alternativo gamma del receptor de células T), Trp-p8, integrina avp3 (CD61), galactina o Ral-B, CD123, CLL-1, CD38, CS-1, CD138 y ROR1. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos codifica dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos. En determinadas realizaciones, un fragmento antigénico de un antígeno tumoral o un antígeno asociado a un tumor está codificado por la secuencia de nucleótidos incluida en el arenavirus.

En ciertas realizaciones, la composición proporcionada en el presente documento, que incluye una composición farmacéutica, inmunogénica o de vacuna, incluye un inhibidor de punto de control inmunitario que inhibe, disminuye o interfiere con la actividad de un regulador negativo de puntos de control. En ciertas realizaciones, el regulador negativo de puntos de control se selecciona del grupo que consiste en antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), CD80, CD86, muerte celular programada 1 (PD-1), ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1), ligando de muerte celular programada 2 (PD-L2), gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3; también conocido como CD223), galectina-3, atenuador de linfocitos B y T (BTLA), proteína de membrana 3 de células T (TIM3), galectina-9 (GAL9), B7-H1, B7-H3, B7-H4, inmunorreceptor de células T con dominios de Ig e ITIM (TIGIT/Vstm3/WUCAM/VSIG9), supresor de Ig de dominio V de activación de células T (VISTA), proteína relacionada con el receptor del factor de necrosis tumoral inducida por glucocorticoides (GITR), mediador de entrada del virus del herpes (h V e M), OX40, CD27, CD28, CD 137. CGEN-15001T, CGEN-15022, CGEN-15027, CGEN-15049, CGEN-15052 y CGEN-15092.

En ciertas realizaciones, las composiciones proporcionadas en el presente documento, que incluyen una composición farmacéutica, inmunogénica o de vacuna, pueden usarse de acuerdo con la invención. Por tanto, en ciertas realizaciones, las composiciones se pueden usar para el tratamiento de una enfermedad neoplásica. En ciertas realizaciones específicas, las composiciones proporcionadas en el presente documento se pueden usar para el tratamiento de una enfermedad neoplásica seleccionada del grupo que consiste en leucemia linfoblástica aguda; linfoma linfoblástico agudo; leucemia linfocítica aguda; leucemia mielógena aguda; leucemia mieloide aguda (adulto/infancia); carcinoma corticosuprarrenal; cánceres relacionados con el SIDA; linfoma relacionado con el SIDA; cáncer anal; cáncer de apéndice; astrocitomas; tumor teratoideo/rabdoideo atípico; carcinoma de células basales; cáncer de las vías biliares, extrahepático (colangiocarcinoma); cáncer de vejiga; osteosarcoma óseo/histiocitoma fibroso maligno; cáncer cerebral (adulto/infantil); tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso (adulto/infancia); tumor cerebral, astrocitoma cerebral/tumor cerebral glioma maligno; tumor cerebral, ependimoma; tumor cerebral, meduloblastoma; tumor cerebral, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales; tumor cerebral, glioma de la vía óptica e hipotalámico; glioma del tronco encefálico; cáncer de mama; adenomas/carcinoides bronquiales; tumor bronquial; linfoma de Burkitt; cáncer de la infancia; tumor gastrointestinal carcinoide; tumor carcinoide; carcinoma del adulto, sitio primario desconocido; carcinoma de origen primario desconocido; tumor embrionario del sistema nervioso central; linfoma del sistema nervioso central, primario; cáncer de cuello uterino; carcinoma corticosuprarrenal infantil; cánceres infantiles; astrocitoma cerebral infantil; cordoma, infancia; leucemia linfocítica crónica; leucemia mielógena crónica; leucemia mieloide crónica; trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de colon; cáncer colorrectal; craneofaringioma; linfoma cutáneo de células T ; tumor desmoplásico de células redondas pequeñas; enfisema; cáncer endometrial; ependimoblastoma; ependimoma; cáncer de esófago; sarcoma de Ewing en la familia de tumores de Ewing; tumor extracraneal de células germinales; tumor extragonadal de células germinales; cáncer de vías biliares extrahepáticas; cáncer de vesícula biliar; cáncer gástrico (de estómago); carcinoide gástrico; tumor carcinoide gastrointestinal; tumor del estroma gastrointestinal; tumor de células germinales: tumor trofoblástico gestacional extracraneal, extragonadal u ovárico; tumor trofoblástico gestacional, sitio primario desconocido; glioma; glioma del tronco encefálico; glioma, vía óptica e hipotalámico infantil; leucemia de células pilosas; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de corazón; cáncer hepatocelular (hígado); linfoma de Hodgkin; cáncer de hipofaringe; glioma hipotalámico y de la vía óptica; melanoma intraocular; carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino); sarcoma de Kaposi; cáncer de riñón (cáncer de células renales); histiocitosis de células de Langerhans; cáncer de laringe; cáncer de labio y cavidad oral; liposarcoma; cáncer de hígado (primario); cáncer de pulmón no microcítico; cáncer de pulmón microcítico; linfoma primario del sistema nervioso central; macroglobulinemia, Waldenstrom; cáncer de mama masculino; histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma; meduloblastoma; meduloepitelioma; melanoma; melanoma, intraocular (ojo); cáncer de células de Merkel; carcinoma de piel de células de Merkel; mesotelioma; mesotelioma, adulto maligno; cáncer de cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto; cáncer de boca; síndrome de neoplasia endocrina múltiple; mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas; micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos; enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas; leucemia mielógena, crónica; leucemia mieloide aguda del adulto; leucemia mieloide aguda infantil; mieloma, múltiple (cáncer de la médula ósea); trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de cavidad nasal y senos paranasales; carcinoma nasofaríngeo; neuroblastoma, cáncer de pulmón no microcítico; linfoma no Hodgkin; oligodendroglioma; cáncer oral; cáncer de cavidad oral; cáncer orofaríngeo; osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso; cáncer de ovarios; cáncer epitelial de ovario (tumor del estroma epitelial superficial); tumor de células germinales de ovario; tumor de ovario de bajo potencial maligno; cáncer de páncreas; cáncer de páncreas, células de los islotes; papilomatosis; cáncer de seno paranasal y cavidad nasal; cáncer de paratiroides; cáncer de pene; cáncer de faringe; feocromocitoma; astrocitoma pineal; germinoma pineal; tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia; pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales; tumor hipofisario; adenoma pituitario; neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple; blastoma pleuropulmonar; linfoma primario del sistema nervioso central; cáncer de próstata; cáncer de recto; carcinoma de células renales (cáncer de riñón); cáncer de células de transición de pelvis renal y uréter; carcinoma del tracto respiratorio que implica el gen NUT en el cromosoma 15; retinoblastoma; rabdomiosarcoma, infancia; cáncer de glándulas salivales; sarcoma, familia de tumores de Ewing; síndrome de Sézary; cáncer de piel (melanoma); cáncer de piel (no melanoma); cáncer de pulmón microcítico; cáncer de intestino delgado sarcoma de tejidos blandos; sarcoma de tejidos blandos; tumor de la médula espinal; carcinoma de células escamosas; cáncer de cuello escamoso con primario oculto, metastásico; cáncer de estómago (gástrico); tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial; linfoma de células T, cutáneo (micosis fungoide y síndrome de Sézary); cáncer de testículo; cáncer de garganta; timoma; timoma y carcinoma tímico; cáncer de tiroides; cáncer de tiroides infantil; cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter; cáncer de uretra; cáncer de útero, endometrio; sarcoma uterino; cáncer de vagina; cáncer de vulva; y tumor de Wilms.

También se proporcionan en el presente documento kits que se pueden usar de acuerdo con la invención. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, el kit proporcionado en el presente documento incluye uno o más envases e instrucciones de uso, en el que uno o más envases comprenden una composición (p. ej., una composición farmacéutica, inmunogénica o de vacuna) proporcionada en el presente documento. En otras realizaciones determinadas, un kit proporcionado en el presente documento incluye recipientes que contienen cada uno de los ingredientes activos para realizar los métodos en el contexto de la invención. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el kit proporcionado en el presente documento incluye dos o más envases e instrucciones de uso, en donde uno de los envases comprende una partícula de arenavirus, incluida una partícula de arenavirus trisegmentada, y otro envase comprende un inhibidor de punto de control inmunitario. En una realización específica, un kit proporcionado en el presente documento incluye dos o más envases e instrucciones de uso, en donde uno de los envases comprende una partícula de arenavirus trisegmentada y otro envase comprende un inhibidor de punto de control inmunitario, en donde la partícula de arenavirus está genomanipulada para contener un genoma que comprende: una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; y la capacidad para amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células que no son de complementación. Además, en ciertas realizaciones, uno de los envases comprende una partícula de arenavirus trisegmentada que está genomanipulada para contener un genoma que comprende: una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, un antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; la capacidad para amplificar y expresar su información genética en células infectadas; y la capacidad de producir más partículas de progenie infecciosas en células normales, no modificadas genéticamente. Un kit puede incluir dos o más envases e instrucciones de uso, en donde uno de los envases comprende una partícula de arenavirus bisegmentada infecciosa, de replicación deficiente y otro envase comprende un inhibidor de punto de control inmunitario. Un kit puede incluir dos o más envases e instrucciones de uso, en donde uno de los envases comprende una partícula de arenavirus bisegmentada, infecciosa, de replicación deficiente y otro envase comprende un inhibidor de punto de control inmunitario, en donde la partícula de arenavirus está genomanipulada para contener un genoma que comprende: una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; y la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células que no son de complementación. En ciertas realizaciones, el inhibidor de punto de control inmunitario inhibe, disminuye o interfiere con la actividad de un regulador negativo de puntos de control.

3.5 Convenciones y abreviaturas

4. Breve descripción de las figuras

Fig. 1: Representación esquemática de la organización genómica del LCMV bisegmentado y trisegmentado. El genoma bisegmentado del LCMV de tipo natural consiste en un segmento S que codifica la GP y la NP y un segmento L que codifica la proteína Z y la proteína L (i). Ambos segmentos están flanqueados por las respectivas 5' y 3' UTR. El genoma del LCMV trisegmentado recombinante (r3LCMV) consiste en un segmento L y dos S con una posición donde insertar un gen de interés (aquí GFP, que alternativamente puede ser un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo, como se describe en el presente documento) en cada uno de los segmentos S. r3LCMV-GFPnatural (nat) tiene todos los genes virales en su posición natural (ii), mientras que el ORF de GP en r3LCMV-GFPartificial (art) se yuxtapone artificialmente y se expresa bajo el control de la 3' UTR (iii).

Fig. 2: El genoma de los arenavirus de tipo natural consiste en un segmento de ARN corto (1; ~3,4 kb) y uno grande (2; ~7,2 kb). El segmento corto lleva marcos de lectura abiertos que codifican la nucleoproteína (3) y la glicoproteína (4). El segmento grande codifica la ARN polimerasa L dependiente de ARN (5) y la proteína de matriz Z (6). Los arenavirus de tipo natural pueden convertirse en vectores de vacunas deficientes en la replicación eliminando el gen de la glicoproteína e insertando, en lugar del gen de la glicoproteína, un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo descrito en el presente documento (7) contra el cual se inducirán las respuestas inmunitarias.

Las Figs. 3A-3B representan resultados ilustrativos de un modelo de cáncer de ratón MC-38 OVA (ratones C57BL/6, a los que se han implantado células tumorales MC-38 OVADim) tratado con un vector de arenavirus trisegmentado competente para la replicación que codifica un antígeno OVA (r3LCMV-OVA) y un anticuerpo anti-PD1 (aPD1) sobre el crecimiento tumoral (Fig. 3A) y porcentaje de supervivencia (Fig. 3B). Los símbolos representan la media ± EEM de cinco (no tratados) o seis (otros grupos) ratones por grupo.

Las Figs. 4A-4C representan resultados ilustrativos de un modelo de cáncer de ratón MC-38 (ratones C57BL/6, a los que se han implantado células tumorales MC-38) tratado con un vector de arenavirus trisegmentado competente para la replicación (r3LCMV) o bisegmentado de replicación deficiente (r2LCMV) que codifica un antígeno Adpgkmut (Adpgkmut), y un anticuerpo anti-PD1 (a-PD-1 o PD1) en la inducción de células T citotóxicas CD8+ específicas del antígeno AdpgKmut (Fig. 4A), el crecimiento tumoral (Fig. 4B) y el porcentaje de supervivencia (Fig. 4C).

La Fig. 5A representa gráficamente un régimen de tratamiento ilustrativo de un modelo de ratón con melanoma.

Las Figs. 5B-5D representan resultados ilustrativos de un modelo de ratón de melanoma (ratones C57BL/6 a los que se han inyectado células de melanoma B16F10) tratado con vectores de arenavirus trisegmentados competentes para la replicación (r3LCMV) o bisegmentados de replicación deficiente (rLCMV) que codifican antígenos de melanoma, y un anticuerpo anti-PD1 (a-PD-1) utilizando el régimen de tratamiento de la Fig. 5A, en el crecimiento tumoral (Fig. 5B), porcentaje de supervivencia animal (Fig. 5C) y días de supervivencia (Fig. 5D). Gr.1 indica grupo tratado con r3LCMV y a-PD-1. Gr.2 indica grupo tratado con rLCMV y a-PD-1. Gr.3 indica grupo tratado con tampón y a-PD-1. Gr.4 indica grupo tratado con r3LCMV solamente. Gr.5 indica grupo tratado con rLCMV solamente. Gr.6 indica tratado solo con tampón. Los símbolos representan la media ± EEM de cinco ratones por grupo.

La invención proporciona una partícula de arenavirus para usar en un método para tratar una enfermedad neoplásica en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto la partícula de arenavirus y un inhibidor de punto de control inmunitario, en donde la partícula de arenavirus es una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende una segmento L y dos segmentos S, y en donde la partícula de arenavirus está genomanipulada para contener un segmento genómico de arenavirus que comprende:

(ii) al menos un marco de lectura abierto ("ORF") de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo natural del ORF, en donde el ORF codifica la glicoproteína ("GP"), la nucleoproteína ("NP"), la proteína de matriz Z ("proteína Z") o la ARN polimerasa L dependiente de ARN ("proteína L") de la partícula de arenavirus.

La invención proporciona un kit que comprende dos o más envases e instrucciones de uso, en donde uno de los envases comprende una partícula de arenavirus y otro de los envases comprende un inhibidor de punto de control inmunitario, en donde la partícula de arenavirus es una partícula de arenavirus trisegmentada como se define en el presente documento en el contexto de su uso para tratar una enfermedad neoplásica según la invención.

5. Descripción detallada de la invención

La invención se refiere en general a inmunoterapias para el tratamiento de una enfermedad neoplásica, tal como el cáncer. El término "neoplásico" o "neoplasia" se refiere a un nuevo crecimiento anormal de células o tejido. Este nuevo crecimiento anormal puede formar una masa, también conocida como tumor o neoplasia. Una neoplasia incluye una neoplasia benigna, una neoplasia in situ, una neoplasia maligna y una neoplasia de comportamiento incierto o desconocido. En determinadas realizaciones, la enfermedad neoplásica tratada en el contexto de la invención es el cáncer.

Las inmunoterapias incluyen varios métodos y composiciones. En el presente documento se proporcionan partículas de arenavirus o vectores virales para usar de acuerdo con la invención que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo. Estos virus genéticamente modificados se pueden administrar a un sujeto para el tratamiento de una enfermedad neoplásica, tal como el cáncer. En las secciones 5.1, 5.2, 5.3 y 5.4 se pueden encontrar descripciones detalladas de los arenavirus, incluidas las secuencias de nucleótidos que codifican un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo. Además, los métodos para la generación de partículas de arenavirus o vectores virales para usar según la invención y las composiciones proporcionadas en el presente documento se describen con más detalle en las secciones 5.5 y 5.6.

De acuerdo con la invención, además de administrar partículas de arenavirus o vectores virales a un sujeto, las inmunoterapias para tratar una enfermedad neoplásica incluyen un modulador de punto de control inmunitario. La expresión "modulador de punto de control inmunitario" (también denominado "modulador de punto de control" o "regulador de punto de control") se refiere a una molécula o a un compuesto que modula (p. ej., reduce total o parcialmente, inhibe, interfiere, activa, estimula, aumenta, refuerza o apoya) la función de una o más moléculas de punto de control. Por lo tanto, un modulador de punto de control inmunitario puede ser un inhibidor de punto de control inmunitario o un activador de punto de control inmunitario.

Un "inhibidor de punto de control inmunitario" se refiere a una molécula que inhibe, disminuye o interfiere con la actividad de un regulador negativo de punto de control. En ciertas realizaciones, los inhibidores de puntos de control inmunitarios para usar de acuerdo con la invención y con las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden inhibir la actividad de un regulador negativo de punto de control directamente, o disminuir la expresión de un regulador negativo de punto de control, o interferir con la interacción de un regulador negativo de punto de control y una pareja de unión (p. ej., un ligando). Los inhibidores de puntos de control inmunitarios para usar de acuerdo con la invención y con las composiciones proporcionadas en el presente documento incluyen una proteína, un polipéptido, un péptido, un oligonucleótido antiparalelo, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o una molécula de ARN inhibidora que se dirige a la expresión de un regulador negativo de punto de control.

Un "regulador negativo de punto de control" se refiere a una molécula que regula por disminución las respuestas inmunitarias (p. ej., la activación de células T) mediante el suministro de una señal negativa a las células T después de su acoplamiento con ligandos o contrarreceptores. Las funciones ejemplares de un regulador negativo de punto de control son prevenir la activación inmunitaria desproporcionada, minimizar el daño colateral y/o mantener la autotolerancia periférica. En ciertas realizaciones, un regulador negativo de punto de control es un ligando o receptor expresado por una célula presentadora de antígeno. En ciertas realizaciones, un regulador negativo de punto de control es un ligando o receptor expresado por una célula T. En ciertas realizaciones, un regulador negativo de punto de control es un ligando o receptor expresado tanto por una célula presentadora de antígeno como por una célula T.

Por lo tanto, en ciertas realizaciones, los métodos y composiciones descritos para tratar una enfermedad neoplásica usan una partícula de arenavirus o un vector viral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y un inhibidor de punto de control inmunitario. Tal inhibidor de punto de control inmunitario puede inhibir, disminuir o interferir con la actividad de un regulador negativo de punto de control. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, los métodos para tratar una enfermedad neoplásica usan una partícula de arenavirus o un vector viral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario que inhibe, disminuye o interfiere con la actividad de un regulador de punto de control negativo. Además, en determinadas realizaciones, en el presente documento se proporcionan composiciones que comprenden una partícula de arenavirus o vector viral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario que inhibe, disminuye o interfiere con la actividad de un regulador de punto de control negativo. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus o vector viral está genomanipulado para contener un segmento genómico de arenavirus que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y al menos un marco de lectura abierto ("ORF") de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo natural del ORF. En determinadas realizaciones, la partícula de arenavirus para su uso según la invención es una partícula de arenavirus trisegmentada o un vector viral, que puede ser de replicación deficiente o competente para la replicación. En otras realizaciones más, la partícula de arenavirus o vector viral trisegmentado, cuando se propaga, no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación. Los métodos y composiciones para usar una partícula de arenavirus o vector viral y un inhibidor de punto de control inmunitario descritos se describen con más detalle en las secciones 5.8 y 5.9.

5.1 Arenavirus con un marco de lectura abierto en una posición no natural

Los arenavirus en el contexto de la invención tienen reordenamientos de sus ORF y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En ciertas realizaciones, tales arenavirus son infecciosos y competentes para la replicación. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, un segmento genómico de arenavirus está genomanipulado para llevar un ORF de arenavirus en una posición no natural, es decir, una posición distinta de la posición en la que se encuentra el gen respectivo en virus aislados de la naturaleza, tal como LCMV-MP (denominada en el presente documento "posición natural") y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo.

Los segmentos genómicos de arenavirus de tipo natural y los ORF se conocen en la técnica. En particular, el genoma de arenavirus consiste en un segmento S y un segmento L. El segmento S lleva los ORF que codifican la GP y la NP. El segmento L codifica la proteína L y la proteína Z. Ambos segmentos están flanqueados por las respectivas 5' y 3' UTR.

En ciertas realizaciones, un segmento genómico de arenavirus se puede genomanipular para llevar dos o más ORF de arenavirus en una posición distinta a la posición natural. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus se puede genomanipular para llevar dos ORF de arenavirus, o tres ORF de arenavirus, o cuatro ORF de arenavirus en una posición distinta a la posición natural.

En ciertas realizaciones, un segmento genómico de arenavirus puede ser:

(i) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(ii) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iii) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iv) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(v) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(vi) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(vii) un segmento L de arenavirus, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(viii) un segmento L de arenavirus, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(ix) un segmento L de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(x) un segmento L de arenavirus, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(xi) un segmento L de arenavirus, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus; y

(xii) un segmento L de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus.

En ciertas realizaciones, el ORF que está en la posición no natural del segmento genómico de arenavirus puede estar bajo el control de una 3' UTR de arenavirus o una 5' UTR de arenavirus. En realizaciones más específicas, la 3' UTR de arenavirus es la 3' UTR del segmento S de arenavirus. En otra realización específica, la 3' UTR de arenavirus es la 3' UTR del segmento L de arenavirus. En realizaciones más específicas, la 5' UTR de arenavirus es la 5' UTR del segmento S de arenavirus. En otras realizaciones específicas, la 5' UTR es la 5' UTR del segmento L.

En otras realizaciones, el ORF que está en la posición no natural del segmento genómico de arenavirus puede estar bajo el control del elemento de secuencia terminal conservada de arenavirus (las regiones 5'- y 3'-terminales de 19 20 nt) (véase p. ej., Perez y de la Torre, 2003, J Virol. 77(2): 1184-1194).

En ciertas realizaciones, el ORF que está en la posición no natural del segmento genómico de arenavirus puede estar bajo el control del elemento promotor de la 5' UTR (véase p. ej., Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). En otra realización, el ORF que está en la posición no natural del segmento genómico de arenavirus puede estar bajo el control del elemento promotor de la 3' UTR (véase p. ej., Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). En realizaciones más específicas, el elemento promotor de la 5' UTR es el elemento promotor de la 5' UTR del segmento S o del segmento L. En otra realización específica, el elemento promotor de la 3' UTR es el elemento promotor de la 3' UTR del segmento S o del segmento L.

En ciertas realizaciones, el ORF que está en la posición no natural del segmento genómico de arenavirus puede estar bajo el control de una 3' UTR de arenavirus truncada o una 5' UTR de arenavirus truncada (véase p. ej., Perez y de la Torre, 2003, J Virol. 77(2): 1184-1194; Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). En realizaciones más específicas, la 3' UTR truncada es la 3' UTR del segmento S o el segmento L del arenavirus. En realizaciones más específicas, la 5' UTR truncada es la 5' UTR del segmento S o el segmento L del arenavirus.

En el contexto de la invención, una partícula de arenavirus comprende un primer segmento genómico que se ha genomanipulado para llevar un ORF en una posición diferente de la posición natural del ORF y un segundo segmento genómico de arenavirus de manera que la partícula de arenavirus comprende un segmento S y un segmento L. En realizaciones específicas, el ORF en una posición distinta de la posición natural del ORF es uno de los ORF de arenavirus.

En ciertas realizaciones específicas, la partícula de arenavirus puede comprender un complemento completo de los cuatro ORF de arenavirus. En realizaciones específicas, el segundo segmento genómico de arenavirus se ha genomanipulado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición natural del ORF. En otra realización específica, el segundo segmento genómico de arenavirus puede ser el segmento genómico de tipo natural (es decir, comprende los ORF en el segmento en las posiciones naturales).

En ciertas realizaciones, el primer segmento genómico de arenavirus es un segmento L y el segundo segmento genómico de arenavirus es un segmento S. En otras realizaciones, el primer segmento genómico de arenavirus es un segmento S y el segundo segmento genómico de arenavirus es un segmento L.

En la tabla 1 se ilustran ejemplos no limitantes de la partícula de arenavirus que comprende un segmento genómico con un ORF en una posición diferente de la posición natural del ORF y un segundo segmento genómico.

Tabla 1

Partícula de arenavirus

*La posición 1 está bajo el control de una 5’ UTR del segmento S de arenavirus; La posición 2 está bajo el control de una 3’ UTR del segmento S de arenavirus; La posición 3 está bajo el control de una 5’ UTR del segmento L de arenavirus; La posición 4 está bajo el control de una 3' UTR del segmento L de arenavirus.

En el contexto de la invención, se modifica por ingeniería genética un ADNc del segmento genómico de arenavirus para llevar un ORF en una posición distinta a la posición natural del ORF y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En realizaciones más específicas, un ADNc o un conjunto de ADNc de un genoma de arenavirus es como se expone en la tabla 1.

En ciertas realizaciones, un ADNc del segmento genómico de arenavirus que está genomanipulado para llevar un ORF en una posición diferente de la posición natural del ORF es parte de o se incorpora en un vector de expresión de ADN. En una realización específica, un ADNc del segmento genómico de arenavirus que está genomanipulado para llevar un ORF en una posición distinta a la posición natural del ORF es parte de o se incorpora en un vector de expresión de ADN que facilita la producción de un segmento genómico de arenavirus. En otra realización, se puede incorporar un ADNc en un plásmido. Se proporciona una descripción más detallada de los ADNc o ácidos nucleicos y los sistemas de expresión en la Sección 5.7. Las técnicas para la producción de un ADNc son técnicas rutinarias y convencionales de biología molecular y manipulación y producción de ADN. Puede usarse cualquier técnica de clonación conocida por el experto en la técnica. Tales técnicas son bien conocidas y están disponibles para el experto en la técnica en manuales de laboratorio tales como, Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a edición, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001)).

En determinadas realizaciones, el ADNc del segmento genómico de arenavirus que está genomanipulado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición natural del ORF y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, se introduce (p. ej., transfecta) en una célula hospedante. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una célula hospedante comprende un ADNc del segmento genómico de arenavirus que está genomanipulado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición natural del ORF (es decir, un ADNc del segmento genómico) y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En otras realizaciones, el ADNc es parte de o se puede incorporar en un vector de expresión de ADN e introducir en una célula hospedante. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una célula hospedante comprende un ADNc que está incorporado en un vector. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus se introduce en una célula hospedante.

En el presente documento se describe un método para producir el segmento genómico de arenavirus que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, en donde el método comprende transcribir el ADNc del segmento genómico de arenavirus. En ciertas realizaciones, una proteína polimerasa viral puede estar presente durante la transcripción del segmento genómico de arenavirus in vitro o in vivo.

En determinadas realizaciones, la transcripción del segmento genómico de arenavirus se realiza utilizando un promotor bidireccional. En otras realizaciones, la transcripción del segmento genómico de arenavirus se realiza usando un casete de expresión bidireccional (véase p. ej., Ortiz-Riaño et al., 2013, J Gen Virol., 94 (Pt 6): 1175-1188). En realizaciones más específicas, el casete de expresión bidireccional comprende tanto un promotor de polimerasa I como uno de polimerasa II que se leen desde lados opuestos en los dos extremos del segmento genómico de arenavirus insertado, respectivamente. En realizaciones aún más específicas, el casete de expresión bidireccional con los promotores de pol-I y pol-II lee desde lados opuestos hacia el segmento L y el segmento S.

En otras realizaciones, la transcripción del ADNc del segmento genómico de arenavirus comprende un promotor. Los ejemplos específicos de promotores incluyen un promotor de ARN polimerasa I, un promotor de ARN polimerasa II, un promotor de ARN polimerasa III, un promotor de T7, un promotor de SP6 o un promotor de T3.

En determinadas realizaciones, el método para producir el segmento genómico de arenavirus puede comprender además introducir en una célula hospedante el ADNc del segmento genómico de arenavirus que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En determinadas realizaciones, el método para producir el segmento genómico de arenavirus puede comprender además introducir en una célula hospedante el ADNc del segmento genómico de arenavirus que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, en donde la célula hospedante expresa todos otros componentes para la producción del segmento genómico de arenavirus; y purificar el segmento genómico de arenavirus del líquido sobrenadante de la célula hospedante. Dichos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En el presente documento se describen líneas celulares, cultivos y métodos de cultivo de células infectadas con ácidos nucleicos, vectores y composiciones proporcionadas en el presente documento. En la sección 5.7 se proporciona una descripción más detallada de los ácidos nucleicos, sistemas de vectores y líneas celulares descritos en el presente documento.

En determinadas realizaciones, la partícula de arenavirus da como resultado una partícula de arenavirus infecciosa y competente para la replicación. En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus está atenuada. En una realización particular, la partícula de arenavirus está atenuada de tal manera que el virus permanece, al menos parcialmente, capaz de propagarse y replicarse in vivo, pero solo puede generar cargas virales bajas que dan como resultado niveles subclínicos de infección que no son patógenos. Dichos virus atenuados pueden usarse como una composición inmunogénica. En el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas que comprenden un arenavirus con un ORF en una posición no natural como se describe en la sección 5.9.

5.1.1 Partícula de arenavirus de replicación deficiente con un marco de lectura abierto en una posición no natural

En determinadas realizaciones, en el presente documento se proporciona una partícula de arenavirus trisegmentada para su uso según la invención en la que (i) un ORF está en una posición distinta de la posición natural del ORF; y (ii) un ORF que codifica la GP, NP, proteína Z y proteína L se ha eliminado o inactivado funcionalmente de manera que el virus resultante no puede producir más partículas de virus de progenie infecciosas. Una partícula de arenavirus que comprende un genoma modificado genéticamente en el que uno o más ORF se han eliminado o inactivado funcionalmente se puede producir en células de complementación (es decir, células que expresan el ORF de arenavirus que ha sido eliminado o inactivado funcionalmente). El material genético de la partícula de arenavirus resultante puede transferirse tras la infección de una célula hospedante a la célula hospedante, en donde el material genético puede expresarse y amplificarse. Además, el genoma de la partícula de arenavirus modificada genéticamente puede codificar un ORF heterólogo de un organismo distinto a una partícula de arenavirus.

En ciertas realizaciones, un ORF del arenavirus se elimina o inactiva funcionalmente y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor. En una realización específica, el ORF que codifica la glicoproteína GP del arenavirus se elimina o inactiva funcionalmente. En ciertas realizaciones, la inactivación funcional de un gen elimina cualquier producto de traducción. En ciertas realizaciones, la inactivación funcional se refiere a una alteración genética que permite algo de traducción, sin embargo, el producto de la traducción ya no es funcional y no puede reemplazar a la proteína de tipo natural.

En ciertas realizaciones, al menos uno de los cuatro ORF que codifican la GP, NP, proteína Z y proteína L se elimina y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En otra realización, al menos un ORF, al menos dos ORF, al menos tres ORF o al menos cuatro ORF que codifican la GP, NP, proteína Z y proteína L se pueden eliminar y reemplazar por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En realizaciones específicas, solo uno de los cuatro ORF que codifican la GP, NP, proteína Z y proteína L se elimina y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En realizaciones más específicas, se elimina el ORF que codifica la GP del segmento genómico de arenavirus. En otra realización específica, se elimina el ORF que codifica la NP del segmento genómico de arenavirus. En realizaciones más específicas, se elimina el ORF que codifica la proteína Z del segmento genómico de arenavirus. En otra realización específica más, se elimina el ORF que codifica la proteína L.

Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus comprende un segmento genómico que (i) está genomanipulado para llevar un ORF en una posición no natural; (ii) se elimina un ORF que codifica la GP, NP, proteína Z o proteína L; (iii) el ORF que se elimina se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo.

En determinadas realizaciones, el fragmento del antígeno tumoral o antígeno asociado al tumor es antigénico cuando es capaz de (i) provocar una respuesta inmunitaria de anticuerpos en un hospedante (p. ej., ratón, conejo, cabra, burro o ser humano) en donde los anticuerpos resultantes se unen específicamente a una proteína inmunogénica expresada en o sobre una célula neoplásica (p. ej., una célula cancerosa); y/o (ii) provocar una respuesta inmunitaria de células T específica.

En determinadas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento antigénico tiene de 8 a 100 nucleótidos de longitud, de 15 a 100 nucleótidos de longitud, de 25 a 100 nucleótidos de longitud, de 50 a 200 nucleótidos de longitud, de 50 a 400 nucleótidos de longitud, de 200 a 500 de nucleótidos de longitud, o de 400 a 600 nucleótidos de longitud, de 500 a 800 nucleótidos de longitud. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento antigénico tiene de 750 a 900 nucleótidos de longitud, de 800 a 100 nucleótidos de longitud, de 850 a 1000 nucleótidos de longitud, de 900 a 1200 nucleótidos de longitud, de 1000 a 1200 nucleótidos de longitud, de 1000 a 1500 nucleótidos de longitud o 10 a 1500 nucleótidos de longitud, de 1500 a 2000 nucleótidos de longitud 1700 a 2000 nucleótidos de longitud, de 2000 a 2300 nucleótidos de longitud, de 2200 a 2500 nucleótidos de longitud, de 2500 a 3000 nucleótidos de longitud, de 3000 a 3200 nucleótidos de longitud, de 3000 a 3500 nucleótidos de longitud, de 3200 a 3600 nucleótidos de longitud, de 3300 a 3800 nucleótidos de longitud, de 4000 a 4400 nucleótidos de longitud, de 4200 a 4700 nucleótidos de longitud, de 4800 a 5000 nucleótidos de longitud, de 5000 a 5200 nucleótidos de longitud, de 5200 a 5500 nucleótidos de longitud, de 5500 a 5800 nucleótidos de longitud, de 5800 a 6000 nucleótidos de longitud, de 6000 a 6400 nucleótidos de longitud, de 6200 a 6800 nucleótidos de longitud, de 6600 a 7000 nucleótidos de longitud, de 7000 a 7200 nucleótidos de longitud, de 7200 a 7500 nucleótidos de longitud, o 7500 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos codifica un péptido o polipéptido que tiene de 5 a 10 aminoácidos de longitud, de 10 a 25 aminoácidos de longitud, 25 a 50 aminoácidos de longitud, de 50 a 100 aminoácidos de longitud, de 100 a 150 aminoácidos ácidos de longitud de longitud, de 150 a 200 aminoácidos de longitud, de 200 a 250 aminoácidos de longitud, de 250 a 300 aminoácidos de longitud, de 300 a 400 aminoácidos de longitud, de 400 a 500 aminoácidos de longitud, de 500 a 750 aminoácidos de longitud, de 750 a 1000 aminoácidos de longitud, de 1000 a 1250 aminoácidos de longitud, de 1250 a 1500 aminoácidos de longitud, de 1500 a 1750 aminoácidos de longitud, de 1750 a 2000 aminoácidos de longitud, de 2000 a 2500 aminoácidos de longitud, o más de 2500 o más aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que no supera los 2500 aminoácidos de longitud. En realizaciones específicas, la secuencia de nucleótidos no contiene un codón de terminación. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos es de codones optimizados. En determinadas realizaciones, se puede optimizar la composición de nucleótidos, la composición de pares de nucleótidos o ambas. Las técnicas para dichas optimizaciones se conocen en la técnica y se pueden aplicar para optimizar una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo.

En determinadas realizaciones, el crecimiento y la infectividad de la partícula de arenavirus no están afectados por la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo.

Se pueden utilizar técnicas conocidas por los expertos en la técnica para producir una partícula de arenavirus que comprende un segmento genómico de arenavirus genomanipulado para llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición natural y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de genética inversa para generar dicha partícula de arenavirus. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus de replicación deficiente (es decir, el segmento genómico de arenavirus genomanipulado para llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición natural, en donde se ha eliminado un ORF que codifica la GP, NP, proteína Z, proteína L) puede producirse en una célula de complementación.

En determinadas realizaciones, una partícula de arenavirus o un segmento genómico de arenavirus que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo comprende además al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores. En ciertas realizaciones, el péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores es la calreticulina (CRT) o un fragmento de la misma; ubiquitina o un fragmento de la misma; factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), o un fragmento del mismo; cadena invariable (CD74) o un fragmento antigénico de la misma; proteína de choque térmico 70 de Mycobacterium tuberculosis o un fragmento antigénico de la misma; proteína VP22 del virus del herpes simplex 1 o un fragmento antigénico de la misma; ligando de CD40 o un fragmento antigénico del mismo; o ligando de tirosina quinasa 3 relacionado con Fms (Flt3) o un fragmento antigénico del mismo.

En determinadas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus o la partícula de arenavirus utilizada según la presente invención pueden ser virus del Viejo Mundo, por ejemplo, virus Lassa, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), virus Mobala, virus Mopeia o virus Ippy, o virus del Nuevo Mundo, por ejemplo virus Amapari, virus Flexal, virus Guanarito, virus Junín, virus Latino, virus Machupo, virus Oliveros, virus Paraná, virus Pichinde, virus Pirital, virus Sabiá, virus Tacaribe, virus Tamiami, virus Cañón del Oso o virus Arroyo Agua Blanca.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus es adecuada para usar como una vacuna y en métodos de vacunación y tratamiento de una enfermedad neoplásica, por ejemplo, el cáncer. En la sección 5.8 se proporciona una descripción más detallada de los métodos de uso de la partícula de arenavirus.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus es adecuada para su uso como una composición farmacéutica y en métodos de vacunación y tratamiento de una enfermedad neoplásica, por ejemplo, el cáncer. En la sección 5.9 se proporciona una descripción más detallada de los métodos de uso de la partícula de arenavirus.

5.2 Partícula de arenavirus trisegmentada

Las partículas de arenavirus trisegmentadas en el contexto de la invención tienen reordenamientos de sus ORF y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En el contexto de la invención, una partícula de arenavirus trisegmentada comprende un segmento L y dos segmentos S. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada no se recombina en una partícula de arenavirus bisegmentada competente para la replicación. Más específicamente, en ciertas realizaciones, dos de los segmentos genómicos (p. ej., los dos segmentos S) no pueden recombinarse de forma que produzcan un solo segmento viral que podría reemplazar a los dos segmentos originales. En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende un ORF en una posición diferente de la posición natural del ORF y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En otra realización específica más, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende los cuatro ORF de arenavirus. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es competente para la replicación e infecciosa. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada carece de uno de los cuatro ORF de arenavirus. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es infecciosa pero incapaz de producir más progenie infecciosa en células que no son de complementación.

En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la GP, NP, proteína Z o proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada descrita en el presente documento puede estar bajo el control de una 3' UTR de arenavirus o una 5' UTR de arenavirus. En realizaciones más específicas, la 3' UTR de arenavirus trisegmentado es la 3' UTR de un segmento(s) S de arenavirus. En otra realización específica, la 3' UTR de arenavirus trisegmentado es la 3' UTR de un segmento(s) L de arenavirus trisegmentado. En realizaciones más específicas, la 5' UTR de arenavirus trisegmentado es la 5' UTR de uno segmento(s) S de arenavirus. En otras realizaciones específicas, la 5' UTR es la 5' UTR del(de los) segmento(s) L.

En otras realizaciones, el ORF que codifica la GP, NP, proteína Z o la proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada puede estar bajo el control del elemento de secuencia terminal conservada de arenavirus (las regiones 5'- y 3'-terminales de 19-20 nt) (véase p. ej., Pérez y de la Torre, 2003, J Virol. 77(2): 1184-1194).

En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la GP, NP, proteína Z o la proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada puede estar bajo el control del elemento promotor de la 5' UTR (véase p. ej., Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). En otra realización, el ORF que codifica la GP, NP proteína Z, proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada puede estar bajo el control del elemento promotor de la 3' UTR (véase p. ej., Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). En realizaciones más específicas, el elemento promotor de la 5' UTR es el elemento promotor de la 5' UTR del(los) segmento(s) S o el(los) segmento(s) L. En otra realización específica, el elemento promotor de la 3' UTR es el elemento promotor de la 3’ UTR del(los) segmento(s) S o del(los) segmento(s) L.

En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la GP, NP, proteína Z o la proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada puede estar bajo el control de una 3' UTR de arenavirus truncada o una 5' UTR de arenavirus truncada (véase p. ej., Pérez y de la Torre, 2003, J Virol. 77(2): 1184-1194; Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). En realizaciones más específicas, la 3' UTR truncada es la 3' UTR del segmento S o segmento L de arenavirus. En realizaciones más específicas, la 5' UTR truncada es la 5' UTR del(los) segmento(s) S o segmento(s) L de arenavirus.

En el contexto de la invención, el ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En realizaciones más específicas, la secuencia de nucleótidos de ADN o el conjunto de secuencias de nucleótidos de ADN que codifican una partícula de arenavirus trisegmentada es como se expone en la tabla 2 o tabla 3.

Los ácidos nucleicos que codifican el genoma de arenavirus trisegmentado pueden ser parte o se pueden incorporar en uno o más vectores de expresión de ADN. Los ácidos nucleicos que codifican el genoma de la partícula de arenavirus trisegmentada pueden ser parte o se pueden incorporar en uno o más vectores de expresión de ADN que facilitan la producción de una partícula de arenavirus trisegmentada. Un ADNc se puede incorporar en un plásmido. En la sección 5.7 se proporciona una descripción más detallada de los ADNc y los sistemas de expresión. Las técnicas para la producción de un ADNc son técnicas rutinarias y convencionales de biología molecular y manipulación y producción de ADN. Puede usarse cualquier técnica de clonación conocida por el experto en la técnica. Tales técnicas son bien conocidas y están disponibles para el experto en la técnica en manuales de laboratorio tales como, Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a edición, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001).

El ADNc del arenavirus trisegmentado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo se puede introducir (p. ej., transfectar) en una célula hospedante. Por lo tanto, una célula hospedante puede comprender un ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada (es decir, un ADNc de los segmentos genómicos de la partícula de arenavirus trisegmentada) y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. El ADNc puede ser parte de o se puede incorporar en un vector de expresión de ADN e introducir en una célula hospedante. Por lo tanto, una célula hospedante puede comprender un ADNc que se incorpora en un vector. Los segmentos genómicos de arenavirus trisegmentado (es decir, el segmento L y segmentos S) pueden introducirse en una célula hospedante.

En el presente documento se describe un método para producir la partícula de arenavirus trisegmentada, en donde el método comprende transcribir el ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En ciertos casos, puede estar presente una proteína polimerasa viral durante la transcripción de la partícula de arenavirus trisegmentada in vitro o in vivo. En determinados casos, la transcripción del segmento genómico de arenavirus se realiza usando un promotor bidireccional.

En otros casos, la transcripción del segmento genómico de arenavirus se realiza utilizando un casete de expresión bidireccional (véase p. ej., Ortiz-Riaño et al., 2013, J Gen Virol., 94(Pt 6): 1175-1188). En casos más específicos, el casete de expresión bidireccional comprende tanto un promotor de polimerasa I como uno de polimerasa II que se leen desde lados opuestos en los dos extremos del segmento genómico de arenavirus insertado, respectivamente.

En otros casos, la transcripción del ADNc del segmento genómico de arenavirus comprende un promotor. Los ejemplos específicos de promotores incluyen un promotor de ARN polimerasa I, un promotor de ARN polimerasa II, un promotor de ARN polimerasa III, un promotor de T7, un promotor de SP6 o un promotor de T3.

En ciertos casos, el método para producir la partícula de arenavirus trisegmentada puede comprender además introducir en una célula hospedante el ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En ciertos casos, el método para producir la partícula de arenavirus trisegmentada puede comprender además introducir en una célula hospedante el ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, en donde la célula hospedante expresa todos los demás componentes para la producción de la partícula de arenavirus trisegmentada; y purificar la partícula de arenavirus trisegmentada del líquido sobrenadante de la célula hospedante. Dichos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En el presente documento se describen líneas celulares, cultivos y métodos de cultivo de células infectadas con ácidos nucleicos, vectores y composiciones. En la Sección 5.7 se proporciona una descripción más detallada de los ácidos nucleicos, sistemas de vectores y líneas celulares.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada da como resultado una partícula de arenavirus infecciosa y competente para la replicación. En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus está atenuada. En una realización particular, la partícula de arenavirus trisegmentada se atenúa de manera que el virus permanece, al menos parcialmente, competente para la replicación y puede replicarse in vivo, pero solo puede generar cargas virales bajas que dan como resultado niveles subclínicos de infección que no son patógenos. Dichos virus atenuados pueden usarse como una composición inmunogénica.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada tiene el mismo tropismo que la partícula de arenavirus bisegmentada.

También se proporcionan en el presente documento composiciones que comprenden la partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en las secciones 5.8 y 5.9.

5.2.1 Partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S

Según la invención, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende un segmento L y dos segmentos S. En ciertas realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación. En realizaciones específicas, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de al menos 10 días, al menos 20 días, al menos 30 días, al menos al menos 40 días, al menos 50 días, al menos 60 días, al menos 70 días, al menos 80 días, al menos 90 días o al menos 100 días de infección persistente en ratones que carecen de receptor de interferón tipo I, receptor de interferón tipo II y gen activador de la recombinación (RAG1), y haber sido infectados con 104 PFU de la partícula de arenavirus trisegmentada (véase la sección 5.10.14). En otras realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de al menos 10 pases, al menos 20 pases, al menos 30 pases, al menos 40 pases o al menos 50 pases.

La partícula de arenavirus trisegmentada con todos los genes virales en sus respectivas posiciones naturales es conocida en la técnica (p. ej., Emonet et al., 2011 J. Virol., 85(4):1473; Popkin et al., 2011, J. Virol., 85(15):7928). En particular, el genoma de arenavirus trisegmentado consiste en un segmento L y dos segmentos S, en los que se inserta una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo proporcionado en el presente documento en una posición en cada segmento S. Más específicamente, un segmento S codifica la GP y un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, respectivamente. El otro segmento S codifica un antígeno tumoral, un antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y la NP, respectivamente. El segmento L codifica la proteína L y la proteína Z. Todos los segmentos están flanqueados por las respectivas 5' y 3' UTR.

En ciertas realizaciones, la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos S de la partícula de arenavirus trisegmentada, que une los dos ORF de arenavirus en uno en lugar de dos segmentos separados, da como resultado un promotor no funcional (es decir, un segmento genómico de la estructura: 5' UTR..............5' UTR o un 3' UTR........ ...............3' UTR), en donde cada UTR que forma un extremo del genoma es una secuencia repetida invertida del otro extremo del mismo genoma.

En determinadas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S se ha genomanipulado para llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición natural del ORF y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S se ha genomanipulado para llevar dos ORF de arenavirus, o tres ORF de arenavirus, o cuatro ORF de arenavirus, o cinco ORF de arenavirus, o seis ORF de arenavirus en una posición diferente de la posición natural. En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S comprende un complemento completo de los cuatro ORF de arenavirus. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es una partícula de arenavirus trisegmentada infecciosa y competente para la replicación. En realizaciones específicas, los dos segmentos S de la partícula de arenavirus trisegmentada se han genomanipulado para llevar uno de sus ORF en una posición distinta de la posición natural. En realizaciones más específicas, los dos segmentos S comprenden un complemento completo de los ORF del segmento S. En determinadas realizaciones específicas, el segmento L se ha genomanipulado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición natural o el segmento L puede ser el segmento genómico natural.

En ciertas realizaciones, uno de los dos segmentos S puede ser:

(i) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(ii) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iii) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus; (iv) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus; (v) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la L está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus; y (vi) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S puede comprender un ORF duplicado (es decir, dos ORF de segmento S naturales p. ej., GP o NP). En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S puede comprender un ORF duplicado (p. ej., (GP, GP)) o dos ORF duplicados (p. ej., (GP, GP) y (NP, NP)).

La Tabla 2A, a continuación, es una ilustración de la organización del genoma de una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S, en donde la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos S en el genoma de arenavirus trisegmentado no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación y anula la actividad del promotor arenaviral (es decir, el segmento S recombinado resultante se compone de dos 3' UTR en lugar de una 3' UTR y una 5'UTR).

Tabla 2A

Partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S

La posición 1 está bajo el control de una 5' UTR del segmento S de arenavirus; La posición 2 está bajo el control de una 3' UTR del segmento S de arenavirus; La posición 3 está bajo el control de una 5' UTR del segmento S de arenavirus; La posición 4 bajo el control de una 3' UTR del segmento S de arenavirus; La posición 5 está bajo el control de una 5' UTR del segmento L de arenavirus; La posición 6 está bajo el control de una 3' UTR del segmento L de arenavirus.

*ORF indica que se ha insertado una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo.

En ciertas realizaciones, la IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser una IGR de segmento S o segmento L de arenavirus; la IGR entre la posición tres y cuatro puede ser una IGR de segmento S o segmento L de arenavirus; y la IGR entre la posición cinco y seis puede ser una IGR de segmento L de arenavirus. En una realización específica, la IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser una IGR de segmento S de arenavirus; la IGR entre la posición tres y cuatro puede ser una IGR de segmento S de arenavirus; y la IGR entre la posición cinco y seis puede ser una IGR de segmento L de arenavirus. En ciertas realizaciones, también son posibles otras combinaciones. Por ejemplo, una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S, en donde la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos S en el genoma de arenavirus trisegmentado no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación y anula la actividad del promotor arenaviral (es decir, el segmento S recombinado resultante se compone de dos 5' UTR en lugar de una 3' UTR y una 5' UTR).

En ciertas realizaciones, la recombinación intersegmentaria de un segmento S y un segmento L en la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S, restablece un segmento funcional con dos genes virales en un solo segmento en lugar de dos segmentos separados. En otras realizaciones, la recombinación intersegmentaria de un segmento S y un segmento L en la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación.

En ciertas realizaciones, un experto en la técnica podría construir un genoma de arenavirus con una organización como se ilustra en la tabla 2A y como se describe en el presente documento, y luego usar un ensayo como se describe en la sección 5.10 para determinar si la partícula de arenavirus trisegmentada es genéticamente estable, es decir, no da como resultado una partícula vírica bisegmentada competente para la replicación como se describe en el presente documento.

5.2.2 Partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S

En el presente documento se describe una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S. En ciertos casos, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación. En casos específicos, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de al menos 10 días, al menos 20 días, al menos 30 días, al menos 40 días o al menos 50 días, al menos 60 días, al menos 70 días, al menos 80 días, al menos 90 días, al menos 100 días de persistencia en ratones que carecen de receptor de interferón tipo I, receptor de interferón tipo II y gen activador de recombinación (RAG1), y haber sido infectados con 104 PFU de la partícula de arenavirus trisegmentada (véase la sección 5.10.14). En otros casos, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de al menos 10 pases, 20 pases, 30 pases, 40 pases o 50 pases.

En ciertos casos, la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos L de la partícula de arenavirus trisegmentada, que une los dos ORF de arenavirus en uno en lugar de dos segmentos separados, da como resultado un promotor no funcional (es decir, un segmento genómico de la estructura: 5' UTR..............5' UTR o un 3' UTR........ ..............3' UTR), en donde cada UTR que forma un extremo del genoma es una secuencia repetida invertida del otro extremo del mismo genoma.

En ciertos casos, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S se ha genomanipulado para llevar un ORF de arenavirus en una posición diferente de la posición natural del ORF y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En otros casos, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S se ha genomanipulado para llevar dos ORF de arenavirus, o tres ORF de arenavirus, o cuatro ORF de arenavirus, o cinco ORF de arenavirus, o seis ORF de arenavirus en una posición diferente de la posición natural. En casos específicos, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S comprende un complemento completo de los cuatro ORF de arenavirus. Por lo tanto, en algunos casos, la partícula de arenavirus trisegmentada es una partícula de arenavirus trisegmentada infecciosa y competente para la replicación. En casos específicos, los dos segmentos L de la partícula de arenavirus trisegmentada se han genomanipulado para llevar uno de sus ORF en una posición distinta de la posición natural. En casos más específicos, los dos segmentos L comprenden un complemento completo de los ORF del segmento L. En ciertos casos específicos, el segmento S se genomanipulado para llevar uno de sus ORF en una posición diferente de la posición natural o el segmento S puede ser el segmento genómico de tipo natural.

En determinados casos, uno de los dos segmentos L puede ser:

(i) un segmento L, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(ii) un segmento L, en donde el ORF que codifica NP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iii) un segmento L, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iv) un segmento L, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(v) un segmento L, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus; y

(vi) un segmento L, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus.

La partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S puede comprender un ORF duplicado (es decir, dos ORF de segmento L de tipo natural, p. ej., proteína Z o proteína L). En casos específicos, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S puede comprender un ORF duplicado (p. ej., (proteína Z, proteína Z)) o dos ORF duplicados (p. ej., (proteína Z, proteína Z) y (proteína L, proteína L)).

La tabla 3, a continuación, es una ilustración de la organización del genoma de una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S, en donde la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos L en el genoma de arenavirus trisegmentado no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación y anula la actividad del promotor arenaviral (es decir, el segmento L está compuesto por dos 3' UTR en lugar de una 3' UTR y una 5' UTR). Basándose en la tabla 3, se podrían predecir combinaciones similares para generar una partícula de arenavirus compuesta por dos 5' UTR en lugar de una 3' UTR y una 5' UTR.

Tabla 3A

Partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S

*La posición 1 está bajo el control de una 5' UTR del segmento L de arenavirus; la posición 2 está bajo el control de una 3' UTR del segmento L de arenavirus; la posición 3 está bajo el control de una 5' UTR del segmento L de arenavirus; la posición 4 está bajo el control de una 3' UTR del segmento L de arenavirus; la posición 5 está bajo el control de un 5' UTR del segmento S de arenavirus; la posición 6 está bajo el control de una 3' UTR del segmento S de arenavirus.

*ORF indica que se ha insertado una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, un antígeno asociado a un tumor o un fragmento antigénico del mismo.

En ciertos casos, la IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser una IGR de segmento S o de segmento L de arenavirus; la IGR entre la posición tres y cuatro puede ser una IGR de segmento S o de segmento L de arenavirus; y la IGR entre la posición cinco y seis puede ser una IGR de segmento L de arenavirus. En casos específicos, la IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser una IGR de segmento L de arenavirus; la IGR entre la posición tres y cuatro puede ser una IGR de segmento L de arenavirus; y la IGR entre la posición cinco y seis puede ser una IGR de segmento S de arenavirus. En determinados casos, también son posibles otras combinaciones.

En ciertos casos, la recombinación intersegmentaria de un segmento L y un segmento S de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S restablece un segmento funcional con dos genes virales en un solo segmento en lugar de dos segmentos separados. En otros casos, la recombinación intersegmentaria de un segmento L y un segmento S en la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación.

En ciertos casos, un experto en la técnica podría construir un genoma de arenavirus con una organización como se ilustra en la tabla 3A y como se describe en el presente documento, y luego usar un ensayo como se describe en la sección 5.10 para determinar si la partícula de arenavirus trisegmentada es genéticamente estable, es decir, no da como resultado una partícula vírica bisegmentada competente para la replicación como se describe en el presente documento.

5.2.3 Partícula de arenavirus trisegmentada de replicación deficiente

En determinadas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es la partícula de arenavirus trisegmentada en la que (i) un ORF está en una posición distinta de la posición natural del ORF; o (ii) un ORF que codifica la GP, NP, proteína Z o proteína L se ha eliminado o inactivado funcionalmente de manera que el virus resultante no puede producir más partículas de virus de progenie infecciosas (es decir, es de replicación deficiente). En ciertas realizaciones, el tercer segmento de arenavirus puede ser un segmento S. En realizaciones más específicas, el tercer segmento de arenavirus se puede genomanipular para llevar un ORF en una posición distinta de la posición natural del ORF o el tercer segmento de arenavirus puede ser el segmento genómico de arenavirus de tipo natural. En realizaciones aún más específicas, el tercer segmento de arenavirus carece de un ORF de arenavirus que codifica la GP, NP, proteína Z o la proteína L.

Un segmento genómico trisegmentado puede ser un híbrido de un segmento S o L (es decir, un segmento genómico que puede ser una combinación del segmento S y el segmento L). El segmento híbrido puede ser un segmento S que comprenda una IGR de segmento L. El segmento híbrido puede ser un segmento L que comprenda una IGR de segmento S. El segmento híbrido puede ser una UTR de segmento S con un IGR de segmento L. El segmento híbrido puede ser una UTR de segmento L con una IGR de segmento S. El segmento híbrido puede ser una 5' UTR de segmento S con una IGR de segmento L o una 3' UTR de segmento S con una IGR de segmento L. El segmento híbrido puede ser una 5' UTR de segmento L con una IGR de segmento S o una 3' UTR de segmento L con una IGR de segmento S.

Una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un genoma modificado genéticamente en el que uno o más ORF se han eliminado o inactivado funcionalmente se puede producir en células de complementación (es decir, células que expresan el ORF de arenavirus que se ha eliminado o inactivado funcionalmente). El material genético de la partícula de arenavirus resultante puede transferirse tras la infección de una célula hospedante a la célula hospedante, en donde el material genético se puede expresar y amplificar. Además, el genoma de la partícula de arenavirus modificada genéticamente puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo.

En ciertas realizaciones, se elimina al menos uno de los cuatro ORF que codifican la GP, NP, proteína Z y proteína L y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En otra realización, se puede eliminar al menos un ORF, al menos dos ORF, al menos tres ORF o al menos cuatro ORF que codifican la GP, NP, proteína Z y proteína L y reemplazar por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En realizaciones específicas, se elimina solo uno de los cuatro ORF que codifican la GP, NP, proteína Z y proteína L y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En realizaciones más específicas, se elimina el ORF que codifica la GP del segmento genómico de arenavirus. En otra realización específica, se elimina el ORF que codifica la NP del segmento genómico de arenavirus. En realizaciones más específicas, se elimina el ORF que codifica la proteína Z del segmento genómico de arenavirus. En otra realización específica más, se elimina el ORF que codifica la proteína L.

En determinadas realizaciones, una partícula de arenavirus trisegmentada comprende un segmento L y dos segmentos S en los que (i) un ORF está en una posición distinta de la posición natural del ORF; y (ii) se ha eliminado o inactivado funcionalmente un ORF que codifica la GP o NP, de manera que el virus resultante es de replicación deficiente y no es infeccioso. En una realización específica, se elimina un ORF y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En otra realización específica, se eliminan dos ORF y se reemplazan por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En otras realizaciones específicas, se eliminan tres ORF y se reemplazan por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En realizaciones específicas, se elimina el ORF que codifica la GP y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En otras realizaciones específicas, se elimina el ORF que codifica la NP y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En realizaciones aún más específicas, se eliminan el ORF que codifica la NP y el ORF que codifica la GP y reemplazan por una o dos secuencias de nucleótidos que codifican antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende (i) un segmento L y dos segmentos S; (ii) un ORF en una posición distinta de la posición natural ORF; (iii) una o más secuencias de nucleótidos que codifican antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos.

En el presente documento se describe una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S en el que (i) un ORF está en una posición distinta de la posición natural del ORF; y (ii) un ORF que codifica la proteína Z y/o la proteína L se ha eliminado o inactivado funcionalmente, de manera que el virus resultante es de replicación deficiente y no es infeccioso. En un caso específico, se elimina un ORF y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En otro caso específico, se eliminan dos ORF y se reemplazan por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En casos específicos, se elimina el ORF que codifica la proteína Z y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En otros casos específicos, se elimina el ORF que codifica la proteína L y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En casos aún más específicos, se eliminan el ORF que codifica la proteína Z y el ORF que codifica la proteína L y se reemplazan por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. Así, en ciertos casos, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende (i) dos segmentos L y un segmento S; (ii) un ORF en una posición distinta de la posición natural del ORF; (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo.

Así, en ciertos casos, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende una partícula de arenavirus trisegmentada (es decir, un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S) que i) está genomanipulada para llevar un ORF en una posición no natural; ii) se elimina un ORF que codifica la GP, NP, proteína Z o proteína L); iii) el ORF que se elimina se reemplaza por una o más secuencias de nucleótidos que codifican antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos.

En determinadas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento antigénico tiene de 8 a 100 nucleótidos de longitud, de 15 a 100 nucleótidos de longitud, de 25 a 100 nucleótidos de longitud, de 50 a 200 nucleótidos de longitud, de 50 a 400 nucleótidos de longitud, de 200 a 500 de nucleótidos de longitud, o de 400 a 600 nucleótidos de longitud, de 500 a 800 nucleótidos de longitud. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento antigénico tiene de 750 a 900 nucleótidos de longitud, de 800 a 100 nucleótidos de longitud, de 850 a 1000 nucleótidos de longitud, de 900 a 1200 nucleótidos de longitud, de 1000 a 1200 nucleótidos de longitud, de 1000 a 1500 nucleótidos o 10 a 1500 nucleótidos de longitud 1500 a 2000 nucleótidos de longitud 1700 a 2000 nucleótidos de longitud, 2000 a 2300 nucleótidos de longitud 2200 a 2500 nucleótidos de longitud, 2500 a 3000 nucleótidos de longitud, 3000 a 3200 nucleótidos de longitud, de 3000 a 3500 nucleótidos de longitud, de 3200 a 3600 nucleótidos de longitud, 3300 a 3800 nucleótidos de longitud, 4000 nucleótidos a 4400 nucleótidos de longitud, de 4200 a 4700 nucleótidos de longitud, de 4800 a 5000 nucleótidos de longitud, de 5000 a 5200 nucleótidos de longitud, de 5200 a 5500 nucleótidos de longitud, de 5500 a 5800 nucleótidos de longitud, de 5800 a 6000 nucleótidos de longitud, de 6000 a 6400 nucleótidos de longitud, de 6200 a 6800 nucleótidos de longitud, de 6600 a 7000 nucleótidos de longitud, de 7000 a 7200 nucleótidos de longitud, de 7200 a 7500 nucleótidos de longitud, o 7500 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos codifica un péptido o polipéptido que tiene de 5 a 10 aminoácidos de longitud, de 10 a 25 aminoácidos de longitud, de 25 a 50 aminoácidos de longitud, de 50 a 100 aminoácidos de longitud, de 100 a 150 aminoácidos ácidos de longitud, 150 a 200 aminoácidos de longitud, 200 a 250 aminoácidos de longitud, de 250 a 300 aminoácidos de longitud, de 300 a 400 aminoácidos de longitud, de 400 a 500 aminoácidos de longitud, de 500 a 750 aminoácidos de longitud, de 750 a 1000 aminoácidos de longitud, 1000 a 1250 aminoácidos de longitud, de 1250 a 1500 aminoácidos de longitud, de 1500 a 1750 aminoácidos de longitud, 1750 a 2000 aminoácidos de longitud, de 2000 a 2500 aminoácidos de longitud, o más de 2500 o más aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que no supera 2500 aminoácidos de longitud. En realizaciones específicas, la secuencia de nucleótidos no contiene un codón de parada.

En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos está optimizada en codones. En determinadas realizaciones, se puede optimizar la composición de nucleótidos, la composición de pares de nucleótidos o ambas. Las técnicas para dichas optimizaciones se conocen en la técnica y se pueden aplicar para optimizar una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, un antígeno asociado a un tumor o un fragmento antigénico del mismo.

Cualquier secuencia de nucleótidos que codifique un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo puede incluirse en la partícula de arenavirus trisegmentada. En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo es capaz de provocar una respuesta inmunitaria.

Se pueden utilizar técnicas conocidas por los expertos en la técnica para producir una partícula de arenavirus que comprende un segmento genómico de arenavirus genomanipulado para llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición natural y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de genética inversa para generar dicha partícula de arenavirus. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus de replicación deficiente (es decir, el segmento genómico de arenavirus genomanipulado para llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición natural, en donde se ha eliminado un ORF que codifica la GP, NP, proteína Z, proteína L) puede producirse en una célula complementaria.

En ciertas realizaciones, una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo comprende además al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores. En ciertas realizaciones, el péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores es la calreticulina (CRT), o un fragmento de la misma; ubiquitina o un fragmento de la misma; factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), o un fragmento del mismo; cadena invariable (CD74) o un fragmento antigénico de la misma; proteína de choque térmico 70 de Mycobacterium tuberculosis o un fragmento antigénico de la misma; proteína VP22 del virus del herpes simplex 1 o un fragmento antigénico de la misma; ligando CD40 o un fragmento antigénico del mismo; o ligando de tirosina quinasa 3 relacionado con Fms (Flt3) o un fragmento antigénico del mismo.

Los arenavirus para usar con los métodos y composiciones en el contexto de la invención pueden ser virus del Viejo Mundo, por ejemplo, virus Lassa, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), virus Mobala, virus Mopeia o virus Ippy, o virus del Nuevo Mundo, por ejemplo, virus Amapari, virus Flexal, virus Guanarito, virus Junín, virus Latino, virus Machupo, virus Oliveros, virus Paraná, virus Pichinde, virus Pirital, virus Sabiá, virus Tacaribe, virus Tamiami, virus Cañón del Oso o virus Arroyo Agua Blanca.

En ciertas realizaciones, se proporciona la partícula de arenavirus trisegmentada para usar como una vacuna y métodos para usar dicha partícula de arenavirus en una vacunación y tratamiento de una enfermedad neoplásica, por ejemplo, cáncer. Se proporciona una descripción más detallada de los métodos de uso de la partícula de arenavirus descrita en el presente documento en la sección 5.8

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es adecuada para usar como una composición farmacéutica y se proporcionan métodos para usar dicha partícula de arenavirus en una vacunación y tratamiento de una enfermedad neoplásica, por ejemplo, cáncer. En la sección 5.9 se proporciona una descripción más detallada de los métodos de uso de la partícula de arenavirus descrita en el presente documento.

5.3 Partículas de arenavirus infecciosas, de replicación deficiente

Un arenavirus genéticamente modificado incluye el arenavirus que:

- es infeccioso;

- no puede formar virus de progenie infecciosos en una célula que no es de complementación (es decir, una célula que no expresa la funcionalidad que falta en el arenavirus de replicación deficiente y hace que sea deficiente en la replicación);

- es capaz de replicar su genoma y expresar su información genética; y

- codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo.

Un arenavirus modificado genéticamente descrito en el presente documento es infeccioso, es decir, se puede unir a una célula hospedante y liberar su material genético en la célula hospedante. Un arenavirus modificado genéticamente descrito en el presente documento es deficiente en la replicación, es decir, el arenavirus no puede producir más partículas de progenie infecciosas en una célula que no es de complementación. En particular, el genoma del arenavirus se modifica (p. ej., por la eliminación o inactivación funcional de un ORF) de modo que un virus que lleva el genoma modificado ya no puede producir virus de progenie infecciosos. Una célula que no es de complementación es una célula que no proporciona la funcionalidad que se ha eliminado del arenavirus deficiente en la replicación por modificación del genoma del virus (p. ej., si el ORF que codifica la proteína GP se elimina o se inactiva funcionalmente, una célula que no es de complementación no proporciona la proteína GP). Sin embargo, un arenavirus genéticamente modificado es capaz de producir virus de progenie infecciosos en células de complementación. Las células de complementación son células que proporcionan (en trans) la funcionalidad que se ha eliminado del arenavirus de replicación deficiente por modificación del genoma del virus (p. ej., si el ORF que codifica la proteína GP se elimina o se inactiva funcionalmente, una célula de complementación proporciona la proteína GP). La expresión de la funcionalidad complementaria (p. ej., la proteína GP) se puede lograr por cualquier método conocido por el experto en la técnica (p. ej., expresión transitoria o estable). Un arenavirus genéticamente modificado puede amplificar y expresar su información genética en una célula que ha sido infectada por el virus. Un arenavirus modificado genéticamente puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo tal como, pero no limitado al antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo descrito en la sección 5.4.

En un arenavirus genéticamente modificado, un ORF del genoma de arenavirus puede eliminarse o inactivarse funcionalmente de manera que el virus resultante no puede producir más partículas de virus de progenie infecciosas en células que no son de complementación. Una partícula de arenavirus que comprende un genoma modificado genéticamente en el que se elimina o inactiva funcionalmente un ORF se puede producir en células de complementación (es decir, en células que expresan el ORF de arenavirus que se ha eliminado o inactivado funcionalmente). El material genético de las partículas de arenavirus resultantes puede transferirse tras la infección de una célula hospedante a la célula hospedante, en donde el material genético se puede expresar y amplificar. Además, el genoma de las partículas de arenavirus modificadas genéticamente codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo que puede expresarse en la célula hospedante.

Un ORF del arenavirus se puede eliminar o inactivar funcionalmente y reemplazar por un nucleótido que codifica un antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor. Específicamente, se puede eliminar o inactivar funcionalmente el ORF que codifica la glicoproteína GP del arenavirus. En ciertos casos, la inactivación funcional de un gen elimina cualquier producto de traducción. En ciertos casos, la inactivación funcional se refiere a una alteración genética que permite algo de traducción; sin embargo, el producto de la traducción ya no es funcional y no puede reemplazar a la proteína de tipo natural.

En ciertos casos, el ORF que codifica la glicoproteína (GP) del arenavirus se elimina para generar un arenavirus de replicación deficiente para su uso y en las composiciones proporcionadas en el presente documento. Específicamente, el arenavirus de replicación deficiente puede comprender un segmento genómico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, una partícula de arenavirus modificada genéticamente comprende un segmento genómico que a) tiene una eliminación o inactivación funcional de un ORF que está presente en la forma natural del segmento genómico; y b) codifica (en paralelo o antiparalelo) un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo.

En determinadas realizaciones, el antígeno codificado por el nucleótido que se inserta en el genoma del arenavirus de replicación deficiente puede codificar, por ejemplo, un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo o combinaciones de antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos, incluidos, pero no limitados a antígenos virales oncogénicos, antígenos de cáncer de testículo, antígenos oncofetales, antígenos de diferenciación tisular, antígenos de proteínas mutantes, neoantígenos, adipofilina, AIM-2, ALDH1AI, BCLX (L), BING-4, CALCA, CD45, CPSF, ciclina D1, DKKI, ENAH (hMcna), Ga733 (EpCAM), EphA3, EZH2, FGF5, glipican-3, G250 /MN/CAIX, HER-2/neu, IDO1, IGF2B3, IL13Ralpha2, carboxil esterasa intestinal, alfafetoproteína, calicreína 4, KIF20A, Lengsin, M-CSF, MCSP, mdm-2, Meloe, MMP-2, MMP-7, MUCl, MUC5AC, p53 (no mutante), PAX5, PBF, PRAME, PSMA, RAGE, RAGE-1, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, secernina 1, SOX1O, STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de la próstata 1), survivina, Telomerasa, VEGF, WT1, EGF-R, CEA, CD20, CD33, CD52, glicoproteína 100 (proteína GP100 o gp 100), MELANA/MART1, MART2,NY-ESO-1, p53, MAGE A1, MAGE A3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, CDK4, alfa-actinina-4, ARTC1, BCR-ABL, proteína de fusión BCR-ABL (b3a2), B-RAF, CASP-5, CASP-8, beta-catenina, Cdc27, CDK4, CDKN2A, CLPP, C^oA-1, proteína de fusión dek-can, EFTUD2, factor de elongación 2, ETV6-AML, proteína de fusión ETV6-AML1, FLT3-ITD, FNl, GPNMB, proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, NFYC, OGT, OS-9, proteína de fusión pml-RARalpha, PRDX5, PTPRK, H-ras, K-ras (oncogén viral de sarcoma de rata V-Ki-ras2 Kirsten), N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPDl, SSX, SSX2, proteína de fusión SYT-SSX1 o -SSX2, TGF-betaRII, triosafosfato isomerasa, ormdm-2, LMP2, HPV E6/E7, eGf Rv III (factor de crecimiento epidérmico variante III), Idiotipo, GD2, gangliósido G2), Ras-mutante, p53 (mutante), proteinasa3 (PR1), tirosinasa, PSA, hTERT, puntos de corte de translocación de sarcoma, EphA2, fosfatasa ácida prostática P^aP, neo-PAP, ML-IAP, AFP, ERG (gen de fusión TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, ALK, receptor de andrógenos, ciclina B1, ácido polisiálico, m Yc N, TRP2, TRP2-Int2, GD3, fucosil GM1, mesotelina, PSCA, sLe(a), cyp1B1, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, SART3, STn, anhidrasa carbónica IX, OY-TES1, proteína espermática 17, LCK, antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA), AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, Legumina, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, FAP, PDGFR-beta, MAD-CT-2, antígeno 1 asociado con For, TRP1, CA-125, CA19-9, calretinina, antígeno de membrana epitelial (EMA), antígeno de tumor epitelial (ETA), CD19, CD34, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína de líquido de enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), antígeno HMB-45, Myo-D1, actina específica de músculo (MSA), neurofilamento, enolasa neuronal específica (NSE), fosfatasa alcalina placentaria, sinaptofisina, tiroglobulina, factor de transcripción tiroidea 1, forma dimérica de la isoenzima piruvato quinasa tipo M2 (tumor M2-PK), BAGE BAGE-1, CAGE, CTAGE, FATE, GAGE, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, HCA661, HOM-TES-85, MAGEA, MAGEB, MAGEC, NA88, NY-SAR-35, SPANXB1, SPA17, SSX, SYCP1, TPTE, carbohidrato/gangliósido G^m2 (antígeno oncofetal-inmunogénico-1 OFA-I-1), GM3, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), Ca 195, CA 242, CA 50, CAM 43, CEA, EBNA, EF2, antígeno del virus de Epstein-Barr, HLA-A2, HLA-A11, HSP70-2, KIAAO205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, miosina clase I, GnTV, Herv-K-mel, LAGE-1, LAGE-2, (proteína espermática) SP17, SCP-1, P15(58), Hom/Mel-40, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, TSP-180, P185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, TAG-72, TAG-72-4, CA-72-4, CAM 17.1, NuMa, 13-catenina, P16, TAGE, CT7, 43-9F,5T4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68\KP1, CO-029, HTgp-175, M344, MG7-Ag, MOV18, NB\70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90, TAAL6, TLP, TPS, CD22, CD27 , CD30, CD70, prosteína, TARP (proteína de marco de lectura alternativo gamma del receptor de células T), Trp-p8, integrina avp3 (CD61), galactina o Ral-B, CD123, CLL-1, CD38, CS-1, CD138, y ROR1. En la sección 5.4 se proporciona una descripción detallada de los antígenos descritos en el presente documento.

Los arenavirus para usar de acuerdo con la invención y con las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden ser virus del Viejo Mundo, por ejemplo, virus Lassa, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), virus Mobala, virus Mopeia o virus Ippy, o virus del Nuevo Mundo, por ejemplo, virus Amapari, Virus Flexal, virus Guanarito, virus Junín, virus Latino, virus Machupo, virus Oliveros, virus Paraná, virus Pichinde, virus Pirital, virus Sabiá, virus Tacaribe, virus Tamiami, virus Cañón del Oso o virus Arroyo Agua Blanca.

El genoma del arenavirus de tipo natural consiste en un segmento de ARN corto (~3,4 kb) y uno grande (~7,2 kb). El segmento corto lleva los ORF que codifican los genes de la nucleoproteína NP y la glicoproteína GP. El segmento grande comprende los genes de la ARN polimerasa L dependiente de ARN y de la proteína de matriz Z. Los arenavirus de tipo natural pueden volverse deficientes en replicación para generar vectores vacunales sustituyendo el gen de la glicoproteína por uno o más antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos, contra los que se van a inducir respuestas inmunitarias.

Las partículas de arenavirus infecciosas de replicación deficiente que expresan un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una combinación de antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos, pueden usarse para tratar (de manera inmunoterapéutica) a sujetos que tienen una enfermedad neoplásica.

Se sabe que la enfermedad y la inmunosupresión por arenavirus en la infección por arenavirus de tipo natural son el resultado de una replicación viral no controlada. Al anular la replicación, es decir, la capacidad de producir partículas de virus de progenie infecciosas, de partículas de arenavirus por eliminación de su genoma, p. ej., el gen Z que se requiere para la liberación de partículas, o el gen GP que se requiere para la infección de las células diana, el número total de células infectadas puede estar limitado por el inóculo administrado, p. ej., a un receptor de la vacuna, o transmitido accidentalmente al personal implicado en aplicaciones médicas o biotecnológicas, o a los animales. Por lo tanto, la supresión de la replicación de partículas de arenavirus previene la patogénesis como resultado de la transmisión intencional o accidental de partículas de vector. Un aspecto importante se refiere a explotar la necesidad anterior de supresión de la replicación de una manera beneficiosa con el fin de expresar antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos. Una partícula de arenavirus puede volverse deficiente en replicación mediante la modificación genética de su genoma. Tales modificaciones en el genoma pueden incluir:

- eliminación de un ORF (p. ej., el ORF que codifica la proteína GP, NP, L o Z);

- inactivación funcional de un ORF (p. ej., el ORF que codifica la proteína GP, NP, L o Z). Por ejemplo, esto se puede lograr introduciendo una mutación de cambio de sentido o una mutación sin sentido;

- cambio de la secuencia del ORF (p. ej., el intercambio de un sitio de escisión SIP con el sitio de escisión de otra proteasa);

- mutagénesis de uno de los extremos 5' o 3' de uno de los segmentos genómicos;

- mutagénesis de una región intergénica (es decir, del segmento genómico L o S).

Un arenavirus bisegmentado infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo puede ser un virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) en donde el segmento S del virus se modifica sustituyendo el ORF que codifica la proteína GP por un ORF que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo.

Se puede diseñar un genoma de vector de arenavirus de tipo natural para retener al menos los elementos reguladores esenciales en las regiones no traducidas (UTR) 5' y 3' de ambos segmentos, y/o también las regiones intergénicas (IGR). Sin estar ligado a la teoría, los factores mínimos de acción en trans para la expresión génica en las células infectadas permanecen en el genoma del vector como ORF que se pueden expresar, aunque se pueden poner de manera diferente en el genoma y se pueden poner bajo el control de un promotor diferente al natural, o pueden expresarse a partir de sitios internos de entrada al ribosoma. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo se transcribe a partir de uno de los promotores de arenavirus endógenos (es decir, 5' UTR, 3' UTR del segmento S, 5' UTR, 3' UTR del segmento L). En otras realizaciones, el ácido nucleico que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo se expresa a partir de secuencias de promotores heterólogas introducidas que pueden ser leídas por la ARN polimerasa dependiente de ARN viral, por la ARN polimerasa I celular, ARN polimerasa II o ARN polimerasa III, tal como duplicaciones de secuencias de promotores virales que se encuentran naturalmente en las UTR virales, el promotor de ARN ribosomal 28S, el promotor de beta-actina o el promotor de ARN ribosomal 5S, respectivamente. En determinadas realizaciones, los ácidos ribonucleicos que codifican un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo son transcritos y traducidos por sí mismos o como ultralectura por fusión a los ORF de proteína de arenavirus, y la expresión de proteínas en la célula hospedante puede mejorarse introduciendo en la secuencia del transcrito viral en el(los) lugar(es) apropiado(s) uno o más, p. ej., dos, tres o cuatro, sitios internos de entrada al ribosoma.

En ciertas realizaciones, el vector generado para codificar uno o más antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos puede estar basado en una cepa específica de LCMV. Las cepas de LCMV incluyen Clon 13, cepa MP, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille n°12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN y sus derivados. En ciertas realizaciones, el vector generado para codificar uno o más antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos puede estar basado en Clon 13 del LCMV. En otras realizaciones, el vector generado para codificar uno o más antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos puede basarse en la cepa MP de LCMV.

En determinadas realizaciones, el vector generado para codificar uno o más antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos puede estar basado en una cepa específica del virus Junín. Las cepas del virus Junín incluyen las cepas vacunales XJ13, XJn°44 y Candidn°1, así como IV4454, un aislado humano. En ciertas realizaciones, el vector generado para codificar uno o más antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos se basa en la cepa Candid n°1 del virus Junín.

5.4 Antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores y fragmentos antigénicos

En determinadas realizaciones, un antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor para usar con los métodos y composiciones en el contexto de la invención es una proteína inmunogénica expresada en o sobre una célula neoplásica o un tumor, tal como una célula cancerosa o tumor maligno. En ciertas realizaciones, un antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor para usar con los métodos y composiciones en el contexto de la invención es una proteína no específica, mutante, sobreexpresada o anormalmente expresada, que puede estar presente tanto en una célula neoplásica o tumoral como en una célula o tejido normal. En ciertas realizaciones, un antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor para usar con los métodos y composiciones en el contexto de la invención es un antígeno específico de tumor que está restringido a células tumorales. En ciertas realizaciones, un antígeno tumoral para usar con los métodos y composiciones en el contexto de la invención es un antígeno específico de cáncer que está restringido a células cancerosas.

En determinadas realizaciones, un antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor puede presentar una, dos, tres o más, incluyendo todas, de las siguientes características: sobreexpresado/acumulado (es decir, expresado tanto por tejido normal como neoplásico, pero altamente expresado en neoplasia), oncofetal (es decir, generalmente solo se expresa en tejidos fetales y en células somáticas cancerosas), oncovirales o virales oncogénicos (es decir, codificado por virus transformadores tumorigénicos), de cáncer de testículo (es decir, expresado solo por células cancerosas y tejidos reproductivos adultos, p. ej., testículos), de linaje restringido (es decir, expresado en gran medida por un solo histotipo de cáncer), mutado (es decir, expresado únicamente en tejido neoplásico como resultado de mutación genética o alteración en la transcripción), alterado postraduccionalmente (p. ej., alteraciones asociadas a tumores en la glicosilación), o idiotípica (es decir, desarrollado a partir de expansiones clonales malignas de linfocitos B o T).

En ciertas realizaciones, el antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor para usar con los métodos y composiciones en el contexto de la invención incluye antígenos de enfermedades neoplásicas que incluyen leucemia linfoblástica aguda; linfoma linfoblástico agudo; leucemia linfocítica aguda; leucemia mielógena aguda; leucemia mieloide aguda (adulto/infancia); carcinoma corticosuprarrenal; cánceres relacionados con el SIDA; linfoma relacionado con el SIDA; cáncer anal; cáncer de apéndice; astrocitomas; tumor teratoideo/rabdoideo atípico; carcinoma de células basales; cáncer de las vías biliares, extrahepático (colangiocarcinoma); cáncer de vejiga; osteosarcoma óseo/histiocitoma fibroso maligno; cáncer cerebral (adulto/infancia); tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso (adulto/infancia); tumor cerebral, astrocitoma cerebral/tumor cerebral glioma maligno; tumor cerebral, ependimoma; tumor cerebral, meduloblastoma; tumor cerebral, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales; tumor cerebral, glioma de la vía óptica e hipotalámico; glioma del tronco encefálico; cáncer de mama; adenomas/carcinoides bronquiales; tumor bronquial; linfoma de Burkitt; cáncer en la infancia; tumor gastrointestinal carcinoide; tumor carcinoide; carcinoma del adulto, sitio primario desconocido; carcinoma de origen primario desconocido; tumor embrionario del sistema nervioso central; linfoma del sistema nervioso central, primario; cáncer de cuello uterino; carcinoma corticosuprarrenal en la infancia; cánceres infantiles; astrocitoma cerebral infantil; cordoma, infancia; leucemia linfocítica crónica; leucemia mielógena crónica; leucemia mieloide crónica; trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de colon; cáncer colorrectal; craneofaringioma; linfoma cutáneo de células T; tumor desmoplásico de células redondas pequeñas; enfisema; cáncer endometrial; ependimoblastoma; ependimoma; cáncer de esófago; sarcoma de Ewing en la familia de tumores de Ewing; tumor extracraneal de células germinales; tumor extragonadal de células germinales; cáncer de vías biliares extrahepáticas; cáncer de vesícula biliar; cáncer gástrico (de estómago); carcinoide gástrico; tumor carcinoide gastrointestinal; tumor del estroma gastrointestinal; tumor de células germinales: tumor trofoblástico gestacional extracraneal, extragonadal u ovárico; tumor trofoblástico gestacional, sitio primario desconocido; glioma; glioma del tronco encefálico; glioma, vía óptica e hipotalámico infantil; leucemia de células pilosas; cáncer de cabeza y cuello de Hodgkin; cáncer de corazón; cáncer hepatocelular (hígado); linfoma de Hodgkin; cáncer de hipofaringe; glioma hipotalámico y de la vía óptica; melanoma intraocular; carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino); sarcoma de Kaposi; cáncer de riñón (cáncer de células renales); histiocitosis de células de Langerhans; cáncer de laringe; cáncer de labio y cavidad oral; liposarcoma; cáncer de hígado (primario); cáncer de pulmón no microcítico; cáncer de pulmón microcítico; linfoma primario del sistema nervioso central; macroglobulinemia, Waldenstrom; cáncer de mama masculino; histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma; meduloblastoma; meduloepitelioma; melanoma; melanoma, intraocular (ojo); cáncer de células de Merkel; carcinoma de piel de células de Merkel; mesotelioma; mesotelioma, adulto maligno; cáncer de cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto; cáncer de boca; síndrome de neoplasia endocrina múltiple; mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas; micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos; enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas; leucemia mielógena, crónica; leucemia mieloide, aguda del adulto; leucemia mieloide aguda infantil; mieloma, múltiple (cáncer de la médula ósea); trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de cavidad nasal y senos paranasales; carcinoma nasofaríngeo; neuroblastoma, cáncer de pulmón de no células pequeñas; linfoma no Hodgkin; oligodendroglioma; cáncer oral; cáncer de cavidad oral; cáncer orofaríngeo; osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso; cáncer de ovario; cáncer epitelial de ovario (tumor del estroma epitelial superficial); tumor de células germinales de ovario; tumor de ovario de bajo potencial maligno; cáncer pancreático; cáncer pancreático, células de los islotes; papilomatosis; cáncer de seno paranasal y cavidad nasal; cáncer de paratiroides; cáncer de pene; cáncer de faringe; feocromocitoma; astrocitoma pineal; germinoma pineal; tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia; pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales; tumor hipofisario; adenoma pituitario; neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple; blastoma pleuropulmonar; linfoma primario del sistema nervioso central; cáncer de próstata; cáncer de recto; carcinoma de células renales (cáncer de riñón);, cáncer de células de transición de la pelvis renal y uréter; carcinoma del tracto respiratorio que implica el gen NUT en el cromosoma 15; retinoblastoma; rabdomiosarcoma, infancia; cáncer de glándulas salivales; sarcoma, familia de tumores de Ewing; síndrome de Sézary; cáncer de piel (melanoma); cáncer de piel (no melanoma); cáncer de pulmón microcítico; cáncer de intestino delgado sarcoma de tejidos blandos; sarcoma de tejidos blandos; tumor de la médula espinal; carcinoma de células escamosas; cáncer de cuello escamoso con primario oculto, metastásico; cáncer de estómago (gástrico); tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial; linfoma de células T, cutáneo (Micosis Fungoide y Síndrome de Sézary); cáncer testicular; cáncer de garganta; timoma; carcinoma de timoma y tímico; cáncer de tiroides; cáncer de tiroides, infantil; cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter; cáncer de uretra; cáncer de útero, endometrio; sarcoma uterino; cáncer de vagina; cáncer de vulva; y Tumor de Wilms.

En ciertas realizaciones, el antígeno tumoral o el antígeno asociado a tumor para usar con los métodos y composiciones en el contexto de la invención incluye antígenos virales oncogénicos, antígenos de cáncer de testículo, antígenos oncofetales, antígenos de diferenciación de tejidos, antígenos de proteínas mutantes, neoantígenos, adipofilina, AIM-2, ALDH1AI, BCLX (L), BING-4, CALCA, CD45, CPSF, ciclina D1, DKKI, ENAH (hMcna), Ga733 (EpCAM), EphA3, EZH2, FGF5, glipican-3, G250 /MN/C^aIX, HER-2/neu, IDO1, IGF2B3, IL13Ralpha2, carboxil esterasa intestinal, alfa-fetoproteína, calicreína 4, KIF20A, Lengsin, M-CSF, MCSP, mdm-2, Meloe, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, p53 (no mutante), PAX5, PBF, PRAME, PSMA, RAGE, RAGE-1, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, secernina 1, SOX1O, STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembranas de la próstata 1), survivina, telomerasa, VEGF, WT1, EGF-R, CEA, CD20, CD33, CD52, glicoproteína 100 (proteína GP100 o gp 100), MELANA/MART1, MART2,NY-ESO-1, p53, MAGE A1, MAGE A3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, CDK4, alfa-actinina-4, A RTC1, BCR-ABL, proteína de fusión Bc R-ABL (b3a2), B-RAF, CASP-5, CASP-8, beta-catenina, Cdc27, CDK4, CDKN2A, CLPP, COA-1, proteína de fusión dek-can, EFTUD2 , factor de elongación 2, ETV6-AML, proteína de fusión ETV6-AML1, FLT3-ITD, FN1, GPNMB, proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, NFYC, OGT, OS-9, proteína de fusión pml-RARalfa, PRDX5, PTPRK, H-ras, K-ras (oncogén viral del sarcoma de rata Kirsten V-Ki-ras2), N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, SSX, Ss X2, proteína de fusión SYT-SSX1 o -SSX2, TGF-betaRII, triosafosfato isomerasa, ormdm-2, LMP2, HPV E6/E7, EGFRvIII (factor de crecimiento epidérmico variante III), Idiotipo, GD2, gangliósido G2), mutante Ras, p53 (mutante), proteinasa3 (PR1), tirosinasa, PSA, hTERT, puntos de corte de translocación de sarcoma, EphA2 , fosfatasa ácida prostática PAP, neo-PAP, ML-IAP, AFP, ERG (gen de fusión TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, ALK, receptor de andrógenos, ciclina B1, ácido polisiálico, M^yCⁿ, TRP2, TRP2-Int2, GD3, fucosil ^gM1, mesotelina, PSCA, sLe(a), cyp1B1, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, SART3, STn, anhidrasa carbónica IX, OY-TES1, Proteína espermática 17, LCK, antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA), AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, Legumina, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1 , FAP, PDGFR-beta, MAD-CT-2, antígeno 1 relacionado con For, TRP1, CA-125, CA19-9, calretinina, antígeno de membrana epitelial (EMA), antígeno tumoral epitelial (ETA), CD19, CD34, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína del líquido de la enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), antígeno HMB-45, Myo-D1, actina específica del músculo (MSA), neurofilamento, enolasa neuroespecífica (NSE), fosfatasa alcalina placentaria, sinaptofisina, tiroglobulina, factor de transcripción tiroidea 1, forma dimérica de la isoenzima piruvato quinasa tipo M2 (tumor M2-PK), BAGE BAGE-1, CAGE, CTAGE, FATE, GAGE, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, HCA661, HOM-TES-85, MAGEA, MAGEB, MAGEC, NA88, NY-SAR-35, SPANXB1, SPA17, SSX, SYCP1, TPTE, carbohidrato/gangliósido G^m2 (antígeno oncofetal-inmunogénico-1 OFA-I-1), GM3, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA 50, CAM 43, CEA, EBNA, EF2, antígeno del virus de Epstein-Barr, HLA-A2, HLA-A11, HSP70-2, KIAAO205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, miosina clase I, GnTV, Herv-K-mel, LAGE-1, LAGE-2, (proteína espermática) SP17, SCP-1, P15(58), Hom/Mel-40, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, ^mY^l-RAR, TSP-180, P185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, TAG-72, TAG-72-4, CA-72-4, CAM 17.1, NuMa, 13-catenina, P16, TAGE, CT7, 43-9F,5T4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68\KP1, CO-029, HTgp-175, M344, MG7-Ag, MOV18, NB\70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90, TAAL6, TLP, TPS, CD22, CD27, CD30, CD70, prosteína, TARP (proteína de marco lectura alternativo gamma del receptor de células T), Trp-p8, integrina avp3 (CD61), galactina o Ral-B, CD123, CLL-1, CD38, CS-1, CD138 y ROR1.

En determinadas realizaciones, el antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor para usar con los métodos y composiciones en el contexto de la invención incluye antígenos virales oncogénicos, en donde los antígenos virales oncogénicos son antígenos del virus del papiloma humano (HPV), antígenos del virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi, tal como el antígeno nuclear asociado a la latencia, antígenos del virus de Epstein-Barr, tales como EBV-EA, EBV-MA o EBV-VCA, antígenos del poliomavirus de células de Merkel, tales como el antígeno MCV T o antígenos del virus linfotrópico humano de células T, tal como el antígeno Tax HTLV-1.

En ciertas realizaciones, el antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor es un neoantígeno. Un "neoantígeno", tal como se usa en el presente documento, significa un antígeno que surge por mutación en una célula tumoral y dicho antígeno generalmente no se expresa en células o tejidos normales. Sin estar ligado a la teoría, debido a que los tejidos sanos generalmente no poseen estos antígenos, los neoantígenos representan un objetivo preferido. Además, sin estar ligados a ninguna teoría, en el contexto de la presente invención, dado que las células T que reconocen el neoantígeno pueden no haber sufrido una selección tímica negativa, dichas células pueden tener una gran avidez por el antígeno y generar una fuerte respuesta inmunitaria contra los tumores, a la vez que carece del riesgo de inducir la destrucción del tejido normal y el daño autoinmunitario. En determinadas realizaciones, el neoantígeno es un neoantígeno restringido por MHC de clase I. En ciertas realizaciones, el neoantígeno es un neoantígeno restringido por MHC de clase II. En ciertas realizaciones, una mutación en una célula tumoral del paciente da como resultado una nueva proteína que produce el neoantígeno.

En ciertas realizaciones, el antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor puede ser un ortólogo de antígeno, p. ej., un mamífero (es decir, primate no humano, cerdo, perro, gato o caballo) para un antígeno tumoral humano o antígeno asociado a tumor.

En determinadas realizaciones, un fragmento antigénico de un antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor está codificado por la secuencia de nucleótidos incluida en el arenavirus. En determinadas realizaciones, un fragmento es antigénico cuando es capaz de (i) provocar una respuesta inmunitaria de anticuerpos en un hospedante (p. ej., ratón, conejo, cabra, burro o ser humano) en donde los anticuerpos resultantes se unen específicamente a una proteína inmunogénica expresada en o sobre una célula neoplásica (p. ej., una célula cancerosa); y/o (ii) provocar una respuesta inmunitaria de células T específica.

En determinadas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento antigénico de un antígeno tumoral o un antígeno asociado a tumor es de 8 a 100 nucleótidos de longitud, de 15 a 100 nucleótidos de longitud, de 25 a 100 nucleótidos de longitud, de 50 a 200 nucleótidos de longitud, de 50 a 400 nucleótidos de longitud, 200 a 500 nucleótidos de longitud, o de 400 a 600 nucleótidos de longitud, de 500 a 800 nucleótidos de longitud. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos tiene es de 750 a 900 nucleótidos de longitud, de 800 a 100 nucleótidos de longitud, de 850 a 1000 nucleótidos de longitud, de 900 a 1200 nucleótidos de longitud, de 1000 a 1200 nucleótidos de longitud, de 1000 a 1500 nucleótidos o de 10 a 1500 nucleótidos de longitud, de 1500 a 2000 nucleótidos de longitud, de 1700 a 2000 nucleótidos de longitud, de 2000 a 2300 nucleótidos de longitud, de 2200 a 2500 nucleótidos de longitud, de 2500 a 3000 nucleótidos de longitud, de 3000 a 3200 nucleótidos de longitud, de 3000 a 3500 nucleótidos de longitud, de 3200 a 3600 nucleótidos de longitud, de 3300 a 3800 nucleótidos de longitud, de 4000 nucleótidos a 4400 nucleótidos de longitud, de 4200 a 4700 nucleótidos de longitud, de 4800 a 5000 nucleótidos de longitud, de 5000 a 5200 nucleótidos de longitud, de 5200 a 5500 nucleótidos de longitud, de 5500 a 5800 nucleótidos de longitud, de 5800 a 6000 nucleótidos de longitud, de 6000 a 6400 nucleótidos de longitud, de 6200 a 6800 nucleótidos de longitud, de 6600 a 7000 nucleótidos de longitud, de 7000 a 7200 nucleótidos de longitud, de 7200 a 7500 nucleótidos de longitud, o 7500 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos codifica un péptido o polipéptido que tiene de 5 a 10 aminoácidos de longitud, de 10 a 25 aminoácidos de longitud, de 25 a 50 aminoácidos de longitud, de 50 a 100 aminoácidos de longitud, de 100 a 150 aminoácidos ácidos de longitud, 150 a 200 aminoácidos de longitud, de 200 a 250 aminoácidos de longitud, de 250 a 300 aminoácidos de longitud, de 300 a 400 aminoácidos de longitud, de 400 a 500 aminoácidos de longitud, de 500 a 750 aminoácidos de longitud, 750 a 1000 aminoácidos de longitud, de 1000 a 1250 aminoácidos de longitud, de 1250 a 1500 aminoácidos de longitud, de 1500 a 1750 aminoácidos de longitud, de 1750 a 2000 aminoácidos de longitud, de 2000 a 2500 aminoácidos de longitud, o más de 2500 o más aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que no supera 2500 aminoácidos de longitud. En realizaciones específicas, la secuencia de nucleótidos no contiene un codón de parada. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos está optimizada en codones. En determinadas realizaciones, se puede optimizar la composición de nucleótidos, la composición de pares de nucleótidos o ambas. Las técnicas para dichas optimizaciones se conocen en la técnica y se pueden aplicar para optimizar una secuencia de nucleótidos de un antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor.

En determinadas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada pueden comprender una o más secuencias de nucleótidos que codifican antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada pueden comprender al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo, al menos dos secuencias de nucleótidos que codifican antígenos tumorales, antígenos tumorales asociados, o fragmentos antigénicos de los mismos, al menos tres secuencias de nucleótidos que codifican antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores, o fragmentos antigénicos de los mismos, o más secuencias de nucleótidos que codifican antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores, o fragmentos antigénicos de los mismos.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo pueden introducirse en el genoma de un arenavirus bisegmentado infeccioso, de replicación deficiente por sustitución de la secuencia de ácido nucleico del ORF de la glicoproteína GP, la proteína de la matriz. Z, la nucleoproteína NP o la proteína polimerasa L. En otras realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo se fusiona con el ORF de la glicoproteína GP, la proteína de matriz Z, la nucleoproteína NP, o la proteína polimerasa L. La secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo, una vez insertado en el genoma de un arenavirus bisegmentado infeccioso, de replicación deficiente, puede transcribirse y/o expresarse bajo el control de los cuatro promotores de arenavirus (5' UTR y 3' UTR del segmento S, y 5' UTR y 3' UTR del segmento L), así como ácidos ribonucleicos que pueden ser insertados con elementos reguladores que pueden ser leídos por la ARN polimerasa dependiente de ARN viral, ARN polimerasa I celular, ARN polimerasa II o ARN polimerasa III, tal como duplicaciones de secuencias de promotores virales que se encuentran naturalmente en las UTR virales, el promotor de ARN ribosomal 28S, el promotor de beta-actina o el promotor de ARN ribosomal 5S, respectivamente. Los ácidos nucleicos que codifican el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo pueden transcribirse y/o expresarse por sí mismos o como ultralectura mediante fusión con ORF y genes de arenavirus, respectivamente, y/o en combinación con uno o más, p. ej., dos, tres o cuatro sitios internos de entrada al ribosoma.

En determinadas realizaciones, una partícula de arenavirus que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo comprende además al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores. En ciertas realizaciones, el péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores es la calreticulina (CRT), o un fragmento de la misma; ubiquitina o un fragmento de la misma; factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), o un fragmento del mismo; cadena invariable (CD74) o un fragmento antigénico de la misma; proteína de choque térmico 70 de Mycobacterium tuberculosis o un fragmento antigénico de la misma; proteína VP22 del virus del herpes simplex 1 o un fragmento antigénico de la misma; ligando CD40 o un fragmento antigénico del mismo; o ligando de tirosina quinasa 3 relacionado con Fms (Flt3) o un fragmento antigénico del mismo.

En ciertas realizaciones, una partícula de arenavirus comprende un segmento genómico que a) tiene una eliminación o inactivación funcional de un ORF que está presente en la forma de tipo natural del segmento genómico; y b) codifica (ya sea en paralelo o antiparalelo): (i) uno o más antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o un fragmento antigénico del mismo y (ii) uno o más péptidos, polipéptidos o proteínas inmunomoduladores

En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores están en la misma posición del genoma viral. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores están en diferentes posiciones del genoma viral.

En determinadas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores se separan mediante una secuencia espaciadora. En ciertas realizaciones, la secuencia que codifica el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores están separadas por un sitio interno de entrada de ribosoma, o una secuencia que codifica un sitio de escisión de proteasa. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores están separadas por una secuencia de nucleótidos que codifica un conector o un péptido autoescindible. Se puede usar cualquier péptido conector o péptido autoescindible conocido por el experto con las composiciones y métodos en el contexto de la invención. Un ejemplo no limitante de un péptido conector es GSG. Los ejemplos no limitantes de un péptido autoescindible son el péptido 2A del teschovirus-1 porcino, el péptido 2A del virus Thosea asigna o el péptido 2A del virus de la fiebre aftosa.

En ciertas realizaciones, el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y el péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores se fusionan directamente entre sí. En ciertas realizaciones, el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y el péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores se fusionan entre sí a través de un conector peptídico. En ciertas realizaciones, el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y el péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores se separan entre sí a través de un péptido autoescindible. Un ejemplo no limitante de un conector peptídico es GSG. Los ejemplos no limitantes de un péptido autoescindible son el péptido 2A del teschovirus-1 porcino, el péptido 2A del virus Thosea asigna o el péptido 2A del virus de la fiebre aftosa.

En ciertas realizaciones, el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y el péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores se expresan en la misma partícula de arenavirus. En ciertas realizaciones, el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y el péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores se expresan en diferentes partículas de arenavirus. En ciertas realizaciones, el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y el péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores se expresan en diferentes virus de la misma cepa. En ciertas realizaciones, el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y el péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores se expresan en diferentes virus de diferentes cepas.

En determinadas realizaciones, una partícula de arenavirus generada para codificar uno o más antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos. En realizaciones específicas los antígenos tumorales o fragmentos antigénicos de los mismos están separados por uno o más conectores, espaciadores o sitios de escisión

5.5 Generación de una partícula de arenavirus y una partícula de arenavirus trisegmentada

En general, las partículas de arenavirus se pueden producir de forma recombinante mediante técnicas de genética inversa estándar como se describe para LCMV (véase Flatz et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103:4663-4668; Sanchez et al., 2006, Virology 350:370; Ortiz-Riano et al., 2013, J Gen Virol. 94:1175-88. Para generar las partículas de arenavirus, estas técnicas se pueden aplicar como se describe a continuación. El genoma de los virus se puede modificar como se describe en el presente documento.

5.5.1 Marco de lectura abierto en posición no natural

La generación de una partícula de arenavirus que comprende un segmento genómico que se ha genomanipulado para llevar un ORF viral en una posición diferente de la posición natural del ORF y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo se puede producir de forma recombinante mediante cualquier técnica de genética inversa conocida por un experto en la técnica.

(i) Partícula de arenavirus infecciosa y competente para la replicación

En ciertas realizaciones, el método para generar la partícula de arenavirus comprende (i) transfectar en una célula hospedante el ADNc del primer segmento genómico de arenavirus; (ii) transfectar en una célula hospedante el ADNc del segundo segmento genómico de arenavirus; (iii) transfectar en una célula hospedante plásmidos que expresan los factores mínimos de acción en trans NP y L del arenavirus; (iv) mantener la célula hospedante en condiciones adecuadas para la formación de virus; y (v) recoger la partícula de arenavirus. En ciertas realizaciones más específicas, el ADNc está contenido en un plásmido.

Una vez generadas a partir del ADNc, las partículas de arenavirus (p. ej., infecciosas y competentes para la replicación) pueden propagarse. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus se puede propagar en cualquier célula hospedante que permita que el virus crezca hasta títulos que permitan los usos del virus como se describe en el presente documento. En una realización, la célula hospedante permite que la partícula de arenavirus crezca hasta títulos comparables a los determinados para el tipo natural correspondiente.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus puede propagarse en células hospedantes. Los ejemplos específicos de células hospedantes que se pueden usar incluyen BHK-21, HEK 293, VERO u otras. En una realización específica, la partícula de arenavirus puede propagarse en una línea celular.

En determinadas realizaciones, las células hospedantes se mantienen en cultivo y se transfectan con uno o más plásmidos. El(los) plásmido(s) expresan el(los) segmento(s) genómico(s) de arenavirus que se van a generar bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamífero, p. ej., que consisten en un promotor y terminador de la polimerasa I.

Los plásmidos que se pueden usar para la generación de la partícula de arenavirus pueden incluir: i) un plásmido que codifica el segmento genómico S, p. ej., pol-I S, ii) un plásmido que codifica el segmento genómico L, p. ej., pol-I L. En determinadas realizaciones, el plásmido que codifica una polimerasa de arenavirus que dirige la síntesis intracelular de los segmentos L y S virales puede incorporarse a la mezcla de transfección. Por ejemplo, puede estar presente un plásmido que codifica la proteína L y/o un plásmido que codifica la NP (pC-L y pC-NP, respectivamente). La proteína L y la NP son los factores mínimos de acción en trans necesarios para la transcripción y replicación del ARN viral. Alternativamente, la síntesis intracelular de los segmentos L y S virales, junto con la NP y proteína L se puede llevar a cabo usando un casete de expresión con promotores de pol-I y pol-II leyendo desde lados opuestos en los ADNc de los segmentos L y S de dos plásmidos separados, respectivamente.

En ciertas realizaciones, los segmentos genómicos de arenavirus están bajo el control de un promotor. Típicamente, pueden usarse casetes de expresión dirigidos por la ARN polimerasa I, casetes dirigidos por la ARN polimerasa II o casetes dirigidos por la ARN polimerasa de bacteriófago T7. En ciertas realizaciones, el(los) plásmido(s) que codifican los segmentos genómicos de arenavirus pueden ser los mismos, es decir, la secuencia del genoma y los factores de acción en trans pueden ser transcritos por un promotor de un plásmido. Los ejemplos específicos de promotores incluyen un promotor de ARN polimerasa I, un promotor de ARN polimerasa II, un promotor de ARN polimerasa III, un promotor de T7, un promotor de SP6 o un promotor de T3.

Además, el(los) plásmido(s) pueden presentar un marcador de selección de mamífero, p. ej., resistencia a la puromicina, bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión génica en células de mamífero, p. ej., el casete de expresión de la polimerasa II como antes, o el(los) transcrito(s) de genes virales van seguidos de un sitio interno de entrada al ribosoma, tal como el del virus de la encefalomiocarditis, seguido del marcador de resistencia de mamífero. Para la producción en E.coli, el plásmido presenta además un marcador de selección bacteriana, tal como un casete de resistencia a la ampicilina.

La transfección de una célula hospedante con un plásmido(s) se puede realizar utilizando cualquiera de las estrategias comúnmente utilizadas, tales como protocolos basados en fosfato de calcio, en liposomas o electroporación. Unos días más tarde se añade el agente de selección adecuado, p. ej., puromicina, en concentraciones valoradas. Los clones supervivientes se aíslan y subclonan siguiendo procedimientos estándar, y los clones de expresión alta se identifican utilizando procedimientos de transferencia Western o de citometría de flujo con anticuerpos dirigidos contra la(s) proteína(s) viral(es) de interés.

Para recuperar la partícula de arenavirus están previstos los siguientes procedimientos. Primer día: las células, normalmente con una confluencia de 80% en placas de pocillos M6, se transfectan con una mezcla de plásmidos, como se ha descrito anteriormente. Para ello, se pueden aprovechar las estrategias de uso común, tales como los protocolos basados en fosfato de calcio, en liposomas o la electroporación.

3-5 días después: se recoge el líquido sobrenadante cultivado (preparación del vector de arenavirus), se divide en partes alícuotas y se almacena a 4°C, -20°C u -80°C, dependiendo de cuánto tiempo deba almacenarse el vector de arenavirus antes de su uso. El título infeccioso de la preparación del vector de arenavirus se evalúa mediante un ensayo de inmunoenfoque. Alternativamente, las células transfectadas y el líquido sobrenadante se pueden pasar a un recipiente más grande (p. ej., un matraz de cultivo de tejidos T75) el día 3-5 después de la transfección, y el líquido sobrenadante del cultivo se recoge hasta cinco días después del pase.

La presente solicitud se refiere además a la expresión de un ORF heterólogo, en donde un plásmido que codifica el segmento genómico se modifica para incorporar un ORF heterólogo. El ORF heterólogo se puede incorporar al plásmido usando enzimas de restricción.

(ii) Partícula de arenavirus infecciosa, de replicación deficiente

Las partículas de arenavirus infecciosas de replicación deficiente se pueden rescatar como se describe anteriormente. Sin embargo, una vez generados a partir del ADNc, los arenavirus infecciosos de replicación deficiente pueden propagarse en células de complementación. Las células de complementación son células que proporcionan la funcionalidad que se ha eliminado del arenavirus de replicación deficiente mediante la modificación de su genoma. (p. ej., si el ORF que codifica la proteína GP se elimina o se inactiva funcionalmente, una célula de complementación proporciona la proteína GP).

Debido a la eliminación o inactivación funcional de uno o más de los ORF en vectores de arenavirus (aquí se tomará como ejemplo la eliminación de la glicoproteína, GP), los vectores de arenavirus pueden generarse y expandirse en células que proporcionan en trans el(los) gene(s) viral(es) eliminados, p. ej., la GP en el presente ejemplo. Dicha línea celular de complementación, denominada en lo sucesivo células C, se genera por transfección de una línea celular tal como BHK-21, HEK 293, VERO u otra con uno o más plásmidos para la expresión del(los) gene(s) viral(es) de interés (plásmido de complementación, denominado plásmido C). El(los) plásmido(s) C expresan el(los) gen(es) viral(es) eliminado(s) en el vector de arenavirus que se va a generar bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamífero, p. ej., un promotor de polimerasa II de mamífero tal como el promotor EF1 alfa con una señal de poliadenilación. Además, el plásmido de complementación presenta un marcador de selección de mamífero, p. ej., resistencia a la puromicina, bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión génica en células de mamífero, p. ej., casete de expresión de la polimerasa II como se indicó anteriormente, o el(los) transcrito(s) del gen viral van seguidos por un sitio interno de entrada al ribosoma, tal como el del virus de la encefalomiocarditis, seguido por el marcador de resistencia de mamífero. Para la producción en E. coli, el plásmido presenta además un marcador de selección bacteriana, tal como un casete de resistencia a la ampicilina.

Las células que se pueden usar, p. ej., BHK-21, HEK 293, MC57G u otras, se mantienen en cultivo y se transfectan con el(los) plásmido(s) de complementación usando cualquiera de las estrategias comúnmente usadas, tales como protocolos basados en fosfato de calcio, en liposomas o electroporación. Unos días más tarde se añade el agente de selección adecuado, p. ej., puromicina, en concentraciones valoradas. Los clones supervivientes se aíslan y subclonan siguiendo procedimientos estándar, y los clones de células C de expresión alta se identifican mediante procedimientos de transferencia Western o de citometría de flujo con anticuerpos dirigidos contra la(s) proteína(s) viral(es) de interés. Como alternativa al uso de células C transfectadas de forma estable, la transfección transitoria de células normales puede complementar el(los) gen(es) viral(es) que faltan en cada una de las etapas donde se utilizarán células C a continuación. Además, se puede utilizar un virus auxiliar para proporcionar la funcionalidad que falta en trans.

Los plásmidos pueden ser de dos tipos: i) dos plásmidos, denominados plásmidos TF para expresar intracelularmente en células C los factores de acción en trans mínimos del arenavirus, derivan p. ej., de proteínas NP y L de LCMV en el presente ejemplo; y ii) plásmidos, denominados plásmidos GS, para expresar intracelularmente en células C los segmentos del genoma del vector de arenavirus, p. ej., los segmentos con modificaciones genomanipuladas. Los plásmidos TF expresan las proteínas NP y L del respectivo vector de arenavirus bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión de proteínas en células de mamífero, típicamente p. ej., un promotor de polimerasa II de mamífero tal como el CMV o el promotor EF1 alfa, cualquiera de ellos preferiblemente en combinación con una señal de poliadenilación. Los plásmidos GS expresan los segmentos genómicos pequeño (S) y grande (L) del vector. Típicamente, se pueden usar casetes de expresión dirigidos por la polimerasa I o casetes de expresión dirigidos por la ARN polimerasa de bacteriófago T7 (T7-), este último preferiblemente con una ribozima 3'-terminal para el procesamiento del transcrito primario para producir el extremo correcto. En el caso de utilizar un sistema basado en T7, la expresión de T7 en células C debe proporcionarse incluyendo en el procedimiento de recuperación un plásmido de expresión adicional, construido de manera análoga a los plásmidos TF, siempre que T7, o las células C se construyan para expresar adicionalmente T7 de manera estable. En ciertas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser los mismos, es decir, la secuencia del genoma y los factores de acción en trans pueden ser transcritos por los promotores de T7, poll y polII de un plásmido.

Para la recuperación del vector de arenavirus, se pueden usar los siguientes procedimientos. Primer día: las células C, normalmente con una confluencia del 80% en placas de pocillos M6, se transfectan con una mezcla de los dos plásmidos TF más los dos plásmidos GS. En ciertas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser los mismos, es decir, la secuencia del genoma y los factores de acción en trans pueden ser transcritos por los promotores de T7, poll y polII de un plásmido. Para esto, se puede aprovechar cualquiera de las estrategias comúnmente utilizadas, como los protocolos basados en fosfato de calcio, en liposomas o la electroporación.

3-5 días después: se recoge el líquido sobrenadante del cultivo (preparación del vector de arenavirus), se divide en partes alícuotas y se almacena a 4°C, -20°C u -80°C, dependiendo de cuánto tiempo deba almacenarse el vector de arenavirus antes de su uso. Luego, el título infeccioso de la preparación del vector de arenavirus se evalúa mediante un ensayo de inmunoenfoque en células C. Alternativamente, las células transfectadas y el líquido sobrenadante se pueden pasar a un recipiente más grande (p. ej., un matraz de cultivo de tejidos T75) el día 3-5 después de la transfección, y el líquido sobrenadante del cultivo se recoge hasta cinco días después del pase.

La invención se refiere además a la expresión de un antígeno en un cultivo celular en donde el cultivo celular se infecta con un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno. Cuando se usa para la expresión de un antígeno en células cultivadas, se pueden usar los dos procedimientos siguientes:

i) El tipo de célula de interés se infecta con la preparación de vector de arenavirus descrita en el presente documento con una multiplicidad de infección (MOI) de uno o más, p. ej., dos, tres o cuatro, lo que da como resultado la producción del antígeno en todas las células poco después de la infección.

ii) Alternativamente, se puede usar una MOI más baja y se pueden seleccionar clones de células individuales por su nivel de expresión de antígeno dirigida por virus. Posteriormente, los clones individuales se pueden expandir infinitamente debido a la naturaleza no citolítica de los vectores de arenavirus. Independientemente del enfoque, el antígeno posteriormente se puede recoger (y purificar) del líquido sobrenadante del cultivo o de las propias células, según las propiedades del antígeno producido. Sin embargo, la invención no se limita a estas dos estrategias, y se pueden considerar otras formas de dirigir la expresión del antígeno usando arenavirus infecciosos de replicación deficiente como vectores.

5.5.2 Generación de una partícula de arenavirus trisegmentada

Una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo se puede producir de forma recombinante mediante técnicas de genética inversa conocidas en la técnica, por ejemplo, como se describe en Emonet et al., 2008, PNAS, 106(9):3473-3478; Popkin et al., 2011, J. Virol., 85 (15):7928-7932. La generación de la partícula de arenavirus trisegmentada se puede modificar como se describe en la Sección 5.2.

(i) Partícula de arenavirus trisegmentada infecciosa y competente para la replicación

En ciertas realizaciones, el método para generar la partícula de arenavirus trisegmentada comprende (i) transfectar en una célula hospedante los ADNc de un segmento L y dos segmentos S; (ii) transfectar en una célula hospedante plásmidos que expresan los factores de acción en trans mínimos NP y L del arenavirus; (iii) mantener la célula hospedante en condiciones adecuadas para la formación de virus; y (iv) recoger la partícula de arenavirus.

Una vez generada a partir del ADNc, la partícula de arenavirus trisegmentada (es decir, infecciosa y competente para la replicación) puede propagarse. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada se puede propagar en cualquier célula hospedante que permita que el virus crezca hasta títulos que permitan los usos del virus como se describe en el presente documento. En una realización, la célula hospedante permite que la partícula de arenavirus trisegmentada crezca hasta títulos comparables a los determinados para el tipo natural correspondiente.

En determinadas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada puede propagarse en células hospedantes. Los ejemplos específicos de células hospedantes que se pueden usar incluyen BHK-21, HEK 293, VERO u otras. En una realización específica, la partícula de arenavirus trisegmentada puede propagarse en una línea celular.

En realizaciones específicas, las células hospedantes se mantienen en cultivo y se transfectan con uno o más plásmidos. El(los) plásmido(s) expresan el(los) gen(es) viral(es) que se generarán bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamíferos, p. ej., que consiste en un promotor y terminador de la polimerasa I.

Los plásmidos que se pueden usar para generar el arenavirus trisegmentado que comprende un segmento L y dos segmentos S pueden incluir: i) dos plásmidos, cada uno de los cuales codifica el segmento genómico S p. ej., pol-I S, ii) un plásmido que codifica el segmento genómico L p. ej., pol-I L. Los plásmidos necesarios para el arenavirus trisegmentado que comprende dos segmentos L y un segmento S son: i) dos plásmidos, cada uno de los cuales codifica el segmento genómico L, p. ej., pol-I L, ii) un plásmido que codifica el segmento genómico S, p. ej., pol-I S.

En ciertas realizaciones, los plásmidos que codifican una polimerasa de arenavirus que dirige la síntesis intracelular de los segmentos L y S virales pueden incorporarse a la mezcla de transfección. Por ejemplo, un plásmido que codifica la proteína L y un plásmido que codifica la NP (pC-L y pC-NP, respectivamente). La proteína L y la NP son los factores mínimos de acción en trans necesarios para la transcripción y replicación del ARN viral. Alternativamente, la síntesis intracelular de los segmentos L y S virales, junto con la proteína NP y L se puede realizar usando un casete de expresión con promotores pol-I y pol-II leyendo desde lados opuestos en los ADNc de los segmentos L y S de dos plásmidos separados, respectivamente.

Además, el(los) plásmido(s) presenta(n) un marcador de selección de mamífero, p. ej., resistencia a la puromicina, bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión génica en células de mamífero, p. ej., el casete de expresión de la polimerasa II como antes, o el(los) transcrito(s) del gen viral van seguidos de un sitio interno de entrada al ribosoma, tal como el del virus de la encefalomiocarditis, seguido por el marcador de resistencia de mamífero. Para la producción en E. coli, el plásmido presenta además un marcador de selección bacteriana, tal como un casete de resistencia a la ampicilina.

La transfección de células BHK-21 con plásmido(s) se puede realizar utilizando cualquiera de las estrategias comúnmente utilizadas, tales como protocolos basados en fosfato de calcio, en liposomas o electroporación. Unos días más tarde se añade el agente de selección adecuado, por ejemplo, puromicina, en concentraciones tituladas. Los clones supervivientes se aíslan y subclonan siguiendo procedimientos estándar, y los clones de expresión alta se identifican utilizando procedimientos de transferencia Western o de citometría de flujo con anticuerpos dirigidos contra la(s) proteína(s) viral(es) de interés.

Típicamente, se pueden usar casetes de expresión dirigidos por la ARN polimerasa I, casetes dirigidos por la ARN polimerasa II o casetes dirigidos por la ARN polimerasa de bacteriófago T7, este último preferiblemente con un ribozima 3'-terminal para el procesamiento del transcrito primario para producir el extremo correcto. En ciertas realizaciones, los plásmidos que codifican los segmentos genómicos de arenavirus pueden ser los mismos, es decir, la secuencia del genoma y los factores de acción en trans pueden ser transcritos por los promotores de T7, poll y polII de un plásmido.

Para recuperar el vector de arenavirus trisegmentado, están previstos los siguientes procedimientos. Primer día: las células, típicamente con una confluencia del 80% en placas de pocillos M6, se transfectan con una mezcla de plásmidos, como se ha descrito anteriormente. Para ello, se pueden aprovechar las estrategias de uso común, tales como los protocolos basados en fosfato de calcio, en liposomas o la electroporación.

Ciertas realizaciones enseñan la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo, en donde un plásmido que codifica el segmento genómico se modifica para incorporar una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo. La secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo puede incorporarse al plásmido utilizando enzimas de restricción.

(ii) Partícula de arenavirus trisegmentada infecciosa, de replicación deficiente

Las partículas de arenavirus trisegmentadas infecciosas, de replicación deficiente pueden rescatarse como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, una vez generados a partir del ADNc, los arenavirus infecciosos, de replicación deficiente pueden propagarse en células de complementación. Las células de complementación son células que proporcionan la funcionalidad que ha sido eliminada del arenavirus de replicación deficiente por modificación de su genoma (p. ej., si el ORF que codifica la proteína GP se elimina o se inactiva funcionalmente, una célula de complementación proporciona la proteína GP).

Debido a la eliminación o inactivación funcional de uno o más de los ORF en vectores de arenavirus (aquí se tomará como ejemplo la eliminación de la glicoproteína, GP), los vectores de arenavirus pueden generarse y expandirse en células que proporcionan en trans los genes virales eliminados, p. ej., la GP en el presente ejemplo. Dicha línea celular de complementación, denominada en lo sucesivo células C, se genera por transfección de una línea celular de mamífero tal como BHK-21, HEK 293, VERO u otra (aquí se tomará BHK-21 como ejemplo) con uno o más plásmido(s) para la expresión del(los) gen(es) viral(es) de interés (plásmido de complementación, denominado plásmido C). El(los) plásmido(s) C expresan el(los) gen(es) viral(es) eliminado(s) en el vector de arenavirus que se va a generar bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamífero, p. ej., un promotor de polimerasa II de mamífero tal como el promotor de CMV o EF1 alfa con una señal de poliadenilación. Además, el plásmido de complementación presenta un marcador de selección de mamífero, p. ej., resistencia a la puromicina, bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión génica en células de mamífero, p. ej., casete de expresión de polimerasa II como antes, o el(los) transcrito(s) del gen viral van seguidos por un sitio interno de entrada al ribosoma, tal como el del virus de la encefalomiocarditis, seguido por el marcador de resistencia de mamífero. Para la producción en E. coli, el plásmido presenta además un marcador de selección bacteriana, tal como un casete de resistencia a la ampicilina.

Las células que se pueden usar, p. ej., BHK-21, HEK 293, MC57G u otras, se mantienen en cultivo y se transfectan con los plásmidos de complementación usando cualquiera de las estrategias comúnmente usadas, tales como protocolos basados en fosfato de calcio, en liposomas o electroporación. Unos días más tarde se añade el agente de selección adecuado, p. ej., puromicina, en concentraciones tituladas. Los clones supervivientes se aíslan y subclonan siguiendo procedimientos estándar, y los clones de células C de expresión alta se identifican utilizando procedimientos de transferencia Western o de citometría de flujo con anticuerpos dirigidos contra la(s) proteína(s) viral(es) de interés. Como alternativa al uso de células C transfectadas de forma estable, la transfección transitoria de células normales puede complementar el(los) gen(es) viral(es) que faltan en cada una de las etapas donde se utilizarán células C a continuación. Además, se puede utilizar un virus auxiliar para proporcionar la funcionalidad que falta en trans.

Se pueden usar plásmidos de dos tipos: i) dos plásmidos, denominados plásmidos TF para expresar intracelularmente en células C los factores mínimos de acción en trans del arenavirus, derivados de, p. ej., proteínas NP y L del LCMV en el presente ejemplo; y ii) plásmidos, denominados plásmidos GS, para expresar intracelularmente en células C los segmentos del genoma del vector de arenavirus, p. ej., los segmentos con modificaciones genomanipuladas. Los plásmidos TF expresan las proteínas NP y L del respectivo vector de arenavirus bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión de proteínas en células de mamífero, típicamente p. ej., un promotor de la polimerasa II de mamífero tal como el promotor de CMV o EF1alfa, cualquiera de ellos preferiblemente en combinación con una señal de poliadenilación. Los plásmidos GS expresan los segmentos genómicos pequeño (S) y grande (L) del vector. Típicamente, se pueden usar casetes de expresión dirigidos por la polimerasa I o casetes de expresión dirigidos por la ARN polimerasa de bacteriófago T7 (T7-), este último preferiblemente con una ribozima 3'-terminal para procesar el transcrito primario para producir el extremo correcto. En el caso de utilizar un sistema basado en T7, la expresión de T7 en células C debe proporcionarse mediante la inclusión en el procedimiento de recuperación de un plásmido de expresión adicional, construido de manera análoga a los plásmidos TF, siempre que T7, o las células C se construyan para expresar adicionalmente T7 de manera estable. En ciertas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser los mismos, es decir, la secuencia del genoma y los factores de acción en trans pueden ser transcritos por los promotores T7, poll y polII de un plásmido.

Para la recuperación del vector de arenavirus, se pueden usar los siguientes procedimientos. Primer día: las células C, normalmente con una confluencia del 80% en placas de pocillos M6, se transfectan con una mezcla de los dos plásmidos TF más los dos plásmidos GS. En ciertas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser los mismos, es decir, la secuencia del genoma y los factores de acción en trans pueden ser transcritos por los promotores T7, poll y polII de un plásmido. Para esto, se puede explotar cualquiera de las estrategias comúnmente utilizadas, tales como los protocolos basados en fosfato de calcio, en liposomas o la electroporación.

En el presente documento se describe la expresión de un antígeno en un cultivo celular en donde el cultivo celular se infecta con un arenavirus trisegmentado infeccioso, de replicación deficiente, que expresa un antígeno. Cuando se usa para la expresión de un antígeno en células cultivadas, se pueden usar los dos procedimientos siguientes:

i) El tipo de célula de interés se infecta con la preparación de vector de arenavirus descrita en el presente documento con una multiplicidad de infección (MOI) de uno o más, p. ej., dos, tres o cuatro, lo que da como resultado la producción del antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo en todas las células ya poco tiempo después de la infección.

ii) Alternativamente, se puede usar una MOI más baja y se pueden seleccionar clones de células individuales por su nivel de expresión dirigida por virus de un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo. Posteriormente, los clones individuales se pueden expandir infinitamente debido a la naturaleza no citolítica de los vectores de arenavirus. Independientemente del enfoque, el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo posteriormente se puede recoger (y purificar) del líquido sobrenadante del cultivo o de las propias células, dependiendo de las propiedades del antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico producido. Sin embargo, la invención no se limita a estas dos estrategias, y se pueden considerar otras formas de dirigir la expresión del antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo usando arenavirus infecciosos de replicación deficiente como vectores.

5.6 Generación de arenavirus infecciosos, de replicación deficiente que expresan un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo

En general, las partículas de arenavirus se pueden producir de forma recombinante mediante técnicas de genética inversa estándar como se describe para el LCMV (L. Flatz, A. Bergthaler, J. C. de la Torre y D. D. Pinschewer, Proc Natl Acad Sci USA 103:4663-4668, 2006; A. B. Sanchez y J. C. de la Torre, Virology 350:370, 2006; E. Ortiz-Riano, B.Y. Cheng, J. C. de la Torre, L. Martinez-Sobrido. J Gen Virol. 94:1175-88, 2013). Para generar arenavirus infecciosos de replicación deficiente para usar con la presente invención, se pueden usar estas técnicas, sin embargo, el genoma del virus rescatado se modifica como se describe en el presente documento. Estas modificaciones pueden ser: i) uno o más, por ejemplo, dos, tres o cuatro, de los cuatro ORF de arenavirus (glicoproteína (GP); nucleoproteína (NP); la proteína de matriz Z; la ARN polimerasa L dependiente de ARN) se eliminan o inactivan funcionalmente para evitar la formación de partículas infecciosas en células normales, aunque permitiendo todavía la expresión génica en células hospedantes infectadas con vector de arenavirus; y ii) se pueden introducir nucleótidos que codifican un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo. Los virus infecciosos, de replicación deficiente, como se describe en el presente documento, se pueden producir como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 2009/083210 (número de solicitud PCT/EP2008/010994) y la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 2014/140301 (número de solicitud PCT/EP2014/055144).

Una vez generados a partir del ADNc, los arenavirus infecciosos de replicación deficiente pueden propagarse en células de complementación. Las células de complementación son células que proporcionan la funcionalidad que se ha eliminado del arenavirus de replicación deficiente mediante la modificación de su genoma (p. ej., si el ORF que codifica la proteína GP se elimina o se inactiva funcionalmente, una célula de complementación proporciona la proteína GP).

Debido a la eliminación o inactivación funcional de uno o más de los genes virales en vectores de arenavirus (aquí se tomará como ejemplo la eliminación de la glicoproteína, GP), los vectores de arenavirus pueden generarse y expandirse en células proporcionando en trans el(los) gen(es) viral(es) eliminado, p. ej., la GP en el presente ejemplo. Dicha línea celular de complementación, denominada en lo sucesivo células C, se genera mediante la transfección de una línea celular de mamífero tal como BHK-21, HEK 293, VERO u otra (aquí se tomará BHK-21 como ejemplo) con uno o más plásmido(s) para la expresión del(los) gen(es) viral(es) de interés (plásmido de complementación, denominado plásmido C). El(los) plásmido(s) C expresan el(los) gen(es) viral(es) eliminados en el vector de arenavirus que se generará bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamífero. p. ej., un promotor de polimerasa II de mamífero tal como el promotor de CMV o EF1 alfa con una señal de poliadenilación. Además, el plásmido de complementación presenta un marcador de selección de mamífero, p. ej., resistencia a la puromicina, bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión génica en células de mamífero, p. ej., casete de expresión de polimerasa II como antes, o el(los) gen(es) viral(es) transcritos van seguidos por un sitio interno de entrada al ribosoma, tal como el del virus de la encefalomiocarditis, seguido por el marcador de resistencia de mamífero. Para la producción en E. coli, el plásmido presenta además un marcador de selección bacteriana, tal como un casete de resistencia a la ampicilina.

Las células que se pueden usar, p. ej., BHK-21, HEK 293, MC57G u otras, se mantienen en cultivo y se transfectan con el(los) plásmido(s) de complementación usando cualquiera de las estrategias comúnmente usadas, tales como protocolos basados en fosfato de calcio, en liposomas o electroporación. Unos días más tarde se añade el agente de selección adecuado, p. ej., puromicina, en concentraciones tituladas. Los clones supervivientes se aíslan y subclonan siguiendo procedimientos estándar, y los clones de células C de expresión alta se identifican por procedimientos de transferencia Western o de citometría de flujo con anticuerpos dirigidos contra la(s) proteína(s) viral(es) de interés. Como alternativa al uso de células C transfectadas de forma estable, la transfección transitoria de células normales puede complementar el(los) gen(es) viral(es) que faltan en cada una de las etapas en los que se van a usar células C a continuación. Además, se puede utilizar un virus auxiliar para proporcionar la funcionalidad que falta en trans.

Los plásmidos que se pueden usar pueden ser de dos tipos: i) dos plásmidos, denominados plásmidos TF para expresar intracelularmente en células C los factores mínimos de acción en trans del arenavirus, p. ej., proteínas NP y L del LCMV en el presente ejemplo; y ii) plásmidos, denominados plásmidos GS, para expresar intracelularmente en células C los segmentos genómicos del vector de arenavirus, p. ej., los segmentos con modificaciones genomanipuladas. Los plásmidos TF expresan las proteínas NP y L del respectivo vector de arenavirus bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión de proteínas en células de mamíferos, típicamente p. ej., un promotor de la polimerasa II de mamífero tal como el promotor de CMV o EF1 alfa, cualquiera de ellos preferiblemente en combinación con una señal de poliadenilación. Los plásmidos GS expresan los segmentos genómicos pequeño (S) y grande (L) del vector. Típicamente, se pueden usar casetes de expresión dirigidos por la polimerasa I o casetes de expresión dirigidos por la ARN polimerasa de bacteriófago T7 (T7-), este último preferiblemente con una ribozima 3'-terminal para procesar el transcrito primario para dar el extremo correcto. En el caso de utilizar un sistema basado en T7, la expresión de T7 en células C debe proporcionarse mediante la inclusión en el procedimiento de recuperación de un plásmido de expresión adicional, construido de manera análoga a los plásmidos TF, siempre que T7, o las células C se construyan para expresar adicionalmente T7 de manera estable. En ciertas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser los mismos, es decir la secuencia del genoma y los factores de acción en trans pueden ser transcritos por los promotores T7, poll y pollI de un plásmido.

Para la recuperación del vector de arenavirus, se pueden usar los siguientes procedimientos. Primer día: las células C, normalmente con una confluencia del 80% en placas de pocillos M6, se transfectan con una mezcla de los dos plásmidos TF más los dos plásmidos GS. En ciertas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser los mismos, es decir la secuencia del genoma y los factores de acción en trans pueden ser transcritos por los promotores T7, poll y polII de un plásmido. Para esto, se puede explotar cualquiera de las estrategias comúnmente utilizadas, tales como los protocolos basados en fosfato de calcio, en liposomas o electroporación.

3-5 días después: se recoge el líquido sobrenadante del cultivo (preparación del vector de arenavirus), se divide en partes alícuotas y se almacena a 4°C, -20°C u -80°C, dependiendo de cuánto tiempo deba almacenarse el vector de arenavirus antes de su uso. Luego, el título infeccioso de la preparación del vector de arenavirus se evalúa mediante un ensayo de inmunoenfoque en células C.

En el presente documento se describe la expresión de un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo en un cultivo celular en donde el cultivo celular se infecta con un arenavirus infeccioso bisegmentado de replicación deficiente que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo. Cuando se usa para la expresión de un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo en células cultivadas, se pueden usar los dos procedimientos siguientes:

ii) Alternativamente, se puede usar una MOI más baja y se pueden seleccionar clones de células individuales por su nivel de expresión dirigida por virus de un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo. Posteriormente, los clones individuales se pueden expandir infinitamente debido a la naturaleza no citolítica de los vectores de arenavirus. Independientemente del enfoque, el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo posteriormente se puede recoger (y purificar) del líquido sobrenadante del cultivo o de las propias células, dependiendo de las propiedades del antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo producido. Sin embargo, la invención no se limita a estas dos estrategias, y se pueden considerar otras formas de dirigir la expresión de un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo usando arenavirus infecciosos de replicación deficiente como vectores.

Alternativamente, se puede usar un sistema de rescate que consiste en tres plásmidos: (1) el primer plásmido expresa la proteína NP por transcripción a través de la polimerasa II y posterior traducción en células transfectadas; (2) el segundo plásmido da lugar al segmento L (de cadena negativa) del genoma del LCMV por transcripción a través de la polimerasa I, así como a la proteína L por transcripción a través de la polimerasa II del mismo molde en la dirección opuesta al promotor de la polimerasa I; (3) el tercer plásmido da lugar al segmento S del genoma del LCMV (que codifica la secuencia codificante del antígeno en lugar de la glicoproteína del LCMV) a través de la transcripción por la polimerasa I. Se utilizan 3 gg de cada plásmido para la electroporación de las células C, seguido de siembra de células en placas de 6 pocillos e incubación a 37°C. Después de la incubación, las células y el líquido sobrenadante de las transfecciones se combinan con células C recién sembradas, y se recogen los vectores y se limpian de células y desechos en un punto de tiempo definido después de la infección. Una vez que se ha generado el vector, se puede insertar un ácido nucleico que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo en un plásmido a partir del cual se transcribe un segmento genómico de un vector infeccioso de replicación deficiente mediante cualquier técnica conocida por los expertos.

Debido a la eliminación o inactivación funcional de uno o más de los genes virales en vectores de arenavirus (aquí se tomará como ejemplo la eliminación de la glicoproteína, GP), los vectores de arenavirus pueden generarse y expandirse en células que proporcionan el(los) gen(es) viral(es) eliminados o funcionalmente inactivados (p. ej., la GP) en trans. El virus resultante en sí mismo es infeccioso, pero no puede producir más partículas de progenie infecciosas en células que no son de complementación debido a la falta del(los) gen(es) viral(es) eliminados o funcionalmente inactivados (p. ej., la GP). La célula de complementación puede proporcionar la funcionalidad que falta ya sea por transfección estable, transfección transitoria o por infección con un virus auxiliar que exprese la funcionalidad que falta.

En ciertos casos, la célula de complementación proporciona el gen viral que se ha eliminado o inactivado funcionalmente del genoma del vector de arenavirus. En un caso específico, la célula de complementación proporciona el gen viral de una cepa viral que es la misma que la cepa viral que se utilizó para generar el genoma del vector de arenavirus. En otro caso, la célula de complementación proporciona el gen viral de una cepa viral diferente de la cepa viral que se utilizó para generar el genoma del vector de arenavirus. Por ejemplo, el gen viral proporcionado en la célula de complementación se obtiene de la cepa MP del LCMV. En otro ejemplo, el gen viral proporcionado en la célula de complementación se obtiene de la cepa Clon 13 del LCMV. En otro ejemplo, el gen viral proporcionado en la célula de complementación se obtiene de la cepa WE del LCMV.

En un caso específico, la célula de complementación proporciona la GP de la cepa MP del LCMV y el vector de arenavirus comprende un ORF de un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo, en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En un caso aún más específico, la célula de complementación proporciona la GP de la cepa MP del LCMV y el vector de arenavirus se obtiene del Clon 13 del LCMV y comprende un ORF de un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo como se describe en el presente documento en lugar del ORF que codifica la proteína GP.

En un caso específico, la célula de complementación proporciona la GP de la cepa Clon 13 del LCMV y el vector de arenavirus comprende un ORF de un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En un caso aún más específico, la célula de complementación proporciona la GP de la cepa Clon 13 del LCMV y el vector de arenavirus se obtiene de la cepa MP del LCMV y comprende un ORF de un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo en lugar del ORF que codifica la proteína GP.

En un caso específico, la célula de complementación proporciona la GP de la cepa WE del LCMV y el vector de arenavirus comprende un ORF de un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En un caso aún más específico, la célula de complementación proporciona la GP de la cepa WE del LCMV y el vector de arenavirus se obtiene del Clon 13 del LCMV y comprende un ORF de un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo en lugar del ORF que codifica la proteína GP.

En un caso específico, la célula de complementación proporciona la GP de la cepa WE del LCMV y el vector de arenavirus comprende un ORF de un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En un caso aún más específico, la célula de complementación proporciona la GP de la cepa WE del LCMV y el vector de arenavirus se obtiene de la cepa MP del LCMV y comprende un ORF de un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo en lugar del ORF que codifica la proteína GP.

5.7 Ácidos nucleicos, sistemas de vectores y líneas celulares

En ciertos casos, los ADNc comprenden o consisten en el segmento genómico de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada

5.7.1 Marco de lectura abierto en posición no natural

En una realización, los ácidos nucleicos codifican un segmento genómico de arenavirus como se describe en la sección 5.1. En realizaciones más específicas, en la Tabla 1 se exponen una secuencia de nucleótidos de ADN o un conjunto de secuencias de nucleótidos de ADN. Las células hospedantes que comprenden dichos ácidos nucleicos también se describen en la sección 5.1.

En realizaciones específicas, un ADNc del segmento genómico de arenavirus está genomanipulado para llevar un ORF en una posición diferente de la posición natural del ORF y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo, en donde el segmento genómico de arenavirus codifica un ORF heterólogo como se describe en la sección 5.1

En una realización, un sistema de vectores de expresión de ADN codifica el segmento genómico de arenavirus genomanipulado para llevar un ORF en una posición diferente de la posición natural del ORF y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo. En una realización específica, uno o más vectores de un sistema de vectores de expresión de ADN codifican dos segmentos genómicos de arenavirus, en concreto, un segmento L y un segmento S, de una partícula de arenavirus. Dicho sistema de vectores puede codificar una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo.

En otra realización, un ADNc del segmento S de arenavirus se ha genomanipulado para llevar un ORF en una posición diferente de la posición natural y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo es parte de o está incorporado en un sistema de expresión de ADN. En otras realizaciones, un ADNc del segmento L de arenavirus se ha genomanipulado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición natural y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo es parte de o está incorporado en un sistema de expresión de ADN. En determinadas realizaciones, el ADNc del segmento genómico de arenavirus se ha genomanipulado para llevar (i) un ORF en una posición distinta de la posición natural del ORF; y (ii) y el ORF que codifica la GP, NP, proteína Z o proteína L se ha eliminado y reemplazado por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo.

En ciertas realizaciones, el ADNc puede derivar de una cepa particular del LCMV. Las cepas de LCMV incluyen Clon 13, cepa MP, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille n212, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN y sus derivados. En realizaciones específicas, el ADNc deriva del Clon 13 del LCMV. En otras realizaciones específicas, el ADNc deriva de la cepa MP del LCMV.

En ciertas realizaciones, el vector generado para codificar una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada puede basarse en una cepa específica de LCMV. Las cepas de LCMV incluyen Clon 13, cepa MP, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille n°12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, G^r01, ^sN05, CA^bN y sus derivados. En determinadas realizaciones, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada puede basarse en el Clon 13 del LCMV. En otras realizaciones, el vector generado para codificar una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada puede basarse en la cepa MP del LCMV.

En otra realización, una célula comprende un ADNc o un sistema de vectores en el contexto de la invención. Las líneas celulares derivadas de dichas células, los cultivos que comprenden dichas células, los métodos para cultivar dichas células también se describen en el presente documento. En determinadas realizaciones, una célula comprende un ADNc del segmento genómico de arenavirus que se ha genomanipulado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición natural del ORF y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo. En algunas realizaciones, la célula comprende el segmento S y/o el segmento L.

5.7.2 Partícula de arenavirus trisegmentada

En una realización, los ácidos nucleicos codifican una partícula de arenavirus trisegmentada en el contexto de la invención. En realizaciones más específicas, una secuencia de nucleótidos de ADN o un conjunto de secuencias de nucleótidos de ADN, por ejemplo, se expone en la Tabla 2 o la Tabla 3. Las células hospedantes que comprenden dichos ácidos nucleicos también se describen en la sección 5.2.

En realizaciones específicas, un ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada se ha genomanipulado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición natural del ORF. En otras realizaciones, un ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada se ha genomanipulado para (i) llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición natural del ORF; y (ii) codificar un ORF heterólogo como se describe en la sección 5.2.

En una realización, un sistema de vectores de expresión de ADN codifica conjuntamente la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo. Específicamente, en el contexto de la invención, un sistema de vectores de expresión de ADN comprende uno o más vectores que codifican tres segmentos genómicos de arenavirus, en concreto, un segmento L y dos segmentos S de una partícula de arenavirus trisegmentada. Dicho sistema de vectores puede codificar un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo.

En otra realización, un ADNc del(los) segmento(s) S de arenavirus se ha genomanipulado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición natural y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo que es parte o se incorpora en un sistema de expresión de ADN. En otras realizaciones, un ADNc del(los) segmento(s) L de arenavirus se ha genomanipulado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición natural y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo que es parte o se incorpora en un sistema de expresión de ADN. En ciertas realizaciones, un ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada se ha genomanipulado para llevar (i) un ORF en una posición distinta de la posición natural del ORF; y (ii) se ha eliminado un ORF que codifica la GP, NP, proteína Z o proteína L y se ha reemplazado por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo.

En ciertas realizaciones, el ADNc puede derivar de una cepa particular de LCMV. Las cepas del LCMV incluyen Clon 13, cepa MP, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille n212, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN y sus derivados. En realizaciones específicas, el ADNc deriva del Clon 13 del LCMV. En otras realizaciones específicas, el ADNc deriva de la cepa MP del LCMV.

En ciertas realizaciones, el vector generado para codificar una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada puede basarse en una cepa específica de LCMV. Las cepas del LCMV incluyen Clon 13, cepa MP, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille n°12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, Gr 01, s N05, CABN y sus derivados. En determinadas realizaciones, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada puede basarse en el Clon 13 del LCMV. En otras realizaciones, el vector generado para codificar una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada puede basarse en la cepa MP del LCMV.

Una célula puede comprender un ADNc o un sistema de vectores descrito anteriormente en esta sección. También se describen en el presente documento líneas celulares derivadas de tales células, cultivos que comprenden tales células, métodos para cultivar tales células infectadas. Una célula puede comprender un ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada. En algunos casos, la celda puede comprender el segmento S y/o el segmento L.

5.7.3 Arenavirus de replicación deficiente

En el presente documento se describe una secuencia de ácido nucleico que es el ADNc del segmento genómico grande (segmento L) de un arenavirus bisegmentado infeccioso de replicación deficiente, en el que un ORF del segmento genómico se elimina o se inactiva funcionalmente, y el segmento genómico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo.

En el presente documento se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus bisegmentado infeccioso de replicación deficiente, en el que un ORF del segmento genómico se elimina o se inactiva funcionalmente y en donde el segmento genómico corto comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo. En el presente documento se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus bisegmentado infeccioso de replicación deficiente descrito en el presente documento, en el que el ORF del gen de la glicoproteína se elimina o inactiva funcionalmente y en donde el segmento genómico corto comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo. En ciertos casos más específicos, el antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo, es un antígeno descrito en la sección 5.4.

En ciertos casos, las secuencias de ácido nucleico pueden derivar de una cepa particular de LCMV. Las cepas de LCMV incluyen Clon 13, cepa MP, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille n°12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN y sus derivados. En casos específicos, el ácido nucleico deriva del Clon 13 del LCMV. En otros casos específicos, el ácido nucleico deriva de la cepa MP del LCMV.

En un caso más específico, un ácido nucleico comprende un segmento genómico de arenavirus; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo.

En un caso, un sistema de vectores comprende uno o más vectores que juntos comprenden el genoma de una partícula de arenavirus bisegmentada infecciosa, de replicación deficiente. En el presente documento se describe un sistema de vectores en donde uno o más vectores comprenden dos segmentos genómicos de arenavirus, en concreto, un segmento L y un segmento S, de un arenavirus bisegmentado infeccioso, de replicación deficiente descrito en el presente documento. Dicho sistema de vectores puede comprender (en una o más moléculas de ADN separadas):

- Un segmento genómico S de arenavirus que se modifica de tal manera que una partícula de arenavirus que lleva este segmento genómico S modificado no puede producir partículas de virus de progenie infecciosas y un segmento genómico L de arenavirus que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica (en paralelo o antiparalelo) un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo;

- Un segmento genómico L de arenavirus que se modifica de tal manera que una partícula de arenavirus que lleva este segmento genómico L modificado no puede producir partículas de virus de progenie infecciosas y un segmento genómico S de arenavirus que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica (en paralelo o antiparalelo) un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo;

- Un segmento genómico S de arenavirus que se modifica de tal manera que una partícula de arenavirus que lleva este segmento genómico S modificado no puede producir partículas de virus de progenie infecciosas y en donde el segmento genómico S de arenavirus comprende una secuencia de nucleótidos que codifica (en paralelo o antiparalelo) un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo y que comprende un segmento genómico L de arenavirus de tipo natural; o

- Un segmento genómico L de arenavirus que se modifica de tal manera que una partícula de arenavirus que lleva este segmento genómico L modificado no puede producir partículas de virus de progenie infecciosas y en donde el segmento genómico L de arenavirus comprende una secuencia de nucleótidos que codifica (en paralelo o antiparalelo) un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo y que comprende un segmento genómico S de arenavirus de tipo natural.

En el presente documento se describe una secuencia de ácido nucleico que comprende un segmento genómico de arenavirus (p. ej., LCMV) en el que el ORF que codifica la GP del segmento genómico S puede sustituirse por una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo, que se selecciona del grupo que consiste en antígenos virales oncogénicos, antígenos de cáncer de testículo, antígenos oncofetales, antígenos de diferenciación tisular, antígenos de proteínas mutantes, neoantígenos, adipofilina, AIM-2, ALDH1AI, BCLX (L), BING-4, CALCA, CD45, CPSF, ciclina D1, DKKI, ENAH (hMcna), Ga733 (EpCAM), EphA3, EZH2, Fg F5, glipican-3, G250 /MN/CAIX, HER-2/neu, IDO1, IGF2 B3 , IL13Ralpha2, carboxil esterasa intestinal, alfa-fetoproteína, calicreína 4, KIF20A, Lengsin, M-CSF, Mc Sp , mdm-2, Meloe, MMP-2, MMP-7, MUCl, MUC5AC, p53 (no mutante), PAX5, PBF, PRAME, PSMA, Ra GE, RAGE-1, RGS5, RhoC, r Nf43 , RU2 AS, secernina 1, SOX1O, STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de la próstata 1), survivina, telomerasa, VEGF, WT1, EGF-R, CEA, CD20, CD33, CD52, glicoproteína 100 (proteína GP100 o gp 100), MELANA/MART1, MART2,NY-ESO-1, p53, MAGE A1, MAGE A3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, CDK4, alfa-actinina-4, ARTC1, BCR-ABL, proteína de fusión BCR-ABL (b3a2), B-RAF, CASP-5, CASP-8, beta-catenina, Cdc27, CDK4, CDKN2A, CLPP, COA-1, proteína de fusión dek-can, EFTUD2, factor de elongación 2, ETV6- AML, proteína de fusión ETV6-AML1, FLT3- ⁱT^d, FN1, GPNMB, proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, NFYC, ^oGT, OS-9, proteína de fusión pml-RARalpha, PRDX5, PT^pR^k, H-ras, K-ras (oncogén viral del sarcoma de rata V-Ki-ras2 Kirsten), N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, SSX, SSX2, proteína de fusión SYT-SSX1 o -SSX2, TGF-betaRII, triosafosfato isomerasa, ormdm-2, LMP2 , HPV E6/E7, EGFRvIII (variante III del factor de crecimiento epidérmico), Idiotipo, GD2, gangliósido G2), mutante Ras, p53 (mutante), proteinasa 3 (PR1), tirosinasa, PSA, hTERT, puntos de corte de translocación de sarcoma, EphA2, fosfatasa ácida prostática pAp , neo-PAP, ML-IAP, A f P, Er G (gen de fusión TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, ALK, receptor de andrógenos, ciclina B1, ácido polisiálico, MYCN, TRP2, TRP2-Int2, GD3, Fucosil GM1, mesotelina, PSCA, sLe(a), cyp1B1, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, SART3, STn, anhidrasa carbónica IX, OY-TES1, proteína espermática 17, LCK, antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA), AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, Legumina, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, FAP, PDGFR-beta, MAD-CT-2, antígeno 1 asociado con For, TRP1, CA-125, CA19-9, calretinina, antígeno de membrana epitelial (EMA), antígeno tumoral epitelial (ETA), CD19, CD34, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína del líquido de la enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), antígeno HMB-45, Myo-D1, actina específica del músculo (MSA), neurofilamento, enolasa específica de neurona (NSE), fosfatasa alcalina placentaria, sinaptofisina, tiroglobulina, factor de transcripción tiroidea 1, forma dimérica de la isoenzima piruvato quinasa tipo M2 (tumor M2-PK), BAGE BAGE-1, CAGE, CTAGE, FATE, GAGE, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, HCA661, HOM-TES-85, MAGEA, MAGEB, MAGEC, NA88, NY-SAR-35, SPANXB1, SPA17, SSX, SYCP1, TPTE, carbohidrato/gangliósido G^m2 (antígeno oncofetal-inmunogénico-1 OFA-I-1), GM3, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), C^a195, CA 242, CA 50, CAM 43, CEA, EBNA, EF2, antígeno del virus de Epstein-Barr, HLA-A2, HLA-A11, HSP70-2, KIAAO205, MUM-1, m Um -2, MUM-3, miosina clase I, GnTV, Herv -K-mel, LAGE-1, LAGE-2, (proteína espermática) SP17, SCP-1, P15(58), Hom/Mel-40, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, TSP-180, P185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, TAG-72, TAG-72-4, CA-72-4, CAM 17.1, NuMa, 13-catenina, P16, TAGE, CT7, 43-9F,5T4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68\KP1, CO-029, HTgp-175, M344, MG7-Ag, MOV18, NB\70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90, TAAL6, TLP, TPS, CD22, CD27, CD30, CD70, prosteina, TARP (proteína del marco de lectura alternativo gamma del receptor de células T), Trp-p8, integrina avp3 (CD61), galactina o Ral-B, CD123, CLL-1, CD38, CS-1, CD138 y ROR1.

En el presente documento se describe una secuencia de ácido nucleico que comprende un segmento genómico de arenavirus (p. ej., LCMV) en el que el ORF que codifica la GP del segmento genómico S puede sustituirse por una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos (p. ej., uno o más de los enumerados en el párrafo anterior).

En el presente documento se describe una célula en donde la célula comprende un ácido nucleico o un sistema de vectores descrito anteriormente en esta sección. También se describen en el presente documento líneas celulares derivadas de tales células, cultivos que comprenden tales células y métodos para cultivar tales células infectadas con ácidos nucleicos o sistemas de vectores. En el presente documento se describe una célula en donde la célula comprende un ácido nucleico que comprende el segmento genómico grande (segmento L) de un arenavirus bisegmentado infeccioso, de replicación deficiente descrito en el presente documento, en el que un ORF del segmento genómico se elimina o se inactiva funcionalmente, y el segmento genómico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo.

En el presente documento se describe una célula en donde la célula comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus bisegmentado infeccioso, de replicación deficiente descrito en el presente documento, en el que un ORF del segmento genómico se elimina o se inactiva funcionalmente, y en donde el segmento genómico corto comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo.

En el presente documento se describe una célula en donde la célula comprende dos ácidos nucleicos o sistemas de vectores. También se describen líneas celulares derivadas de dichas células, cultivos que comprenden dichas células y métodos para cultivar dichas células infectadas con ácidos nucleicos o sistemas de vectores.

5.8 Métodos de uso

Las vacunas han tenido éxito para prevenir y/o tratar enfermedades infecciosas, tales como las del virus de la poliomielitis y el sarampión. Sin embargo, la inmunización terapéutica en el contexto de enfermedades crónicas establecidas, incluido el cáncer, ha tenido menos éxito. La capacidad de generar una partícula de arenavirus que se usa en combinación con un inhibidor de punto de control inmunitario representa una nueva estrategia de vacuna novedosa.

En determinadas realizaciones, en el presente documento se proporciona una partícula de arenavirus trisegmentada para usar en métodos para tratar una enfermedad neoplásica en un sujeto. Dichos métodos pueden incluir la administración a un sujeto que lo necesite de una partícula de arenavirus y un inhibidor de punto de control inmunitario. La partícula de arenavirus para usar según la invención es una partícula de arenavirus trisegmentada, incluyendo una partícula de arenavirus trisegmentada infecciosa, de replicación deficiente o una partícula de arenavirus trisegmentada competente para la replicación. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, una partícula de arenavirus trisegmentada, para usar según la invención, es de replicación deficiente, en donde la partícula de arenavirus está genomanipulada para contener un genoma que comprende: (1) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; y (2) la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células que no son de complementación. Además, en determinadas realizaciones, una partícula de arenavirus trisegmentada para usar según la invención es competente para la replicación, en donde la partícula de arenavirus trisegmentada está genomanipulada para contener un genoma que comprende: (1) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, tumor antígeno asociado o un fragmento antigénico del mismo; (2) la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas; y (3) la capacidad de producir más partículas de progenie infecciosas en células normales, no modificadas genéticamente. En ciertos casos, la partícula de arenavirus utilizada en los métodos es una partícula de arenavirus bisegmentada infecciosa, de replicación deficiente. Por lo tanto, en ciertos casos, la partícula de arenavirus infecciosa de replicación deficiente utilizada en los métodos está genomanipulada para contener un genoma que comprende: (1) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo; y (2) la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células que no son de complementación. En ciertas realizaciones, el inhibidor de punto de control inmunitario inhibe, disminuye o interfiere con la actividad de un regulador negativo de punto de control.

En una realización, los métodos para tratar una enfermedad neoplásica en un sujeto comprenden administrar al sujeto una o más partículas de arenavirus que expresan un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario. En una realización específica, un método para tratar una enfermedad neoplásica comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más partículas de arenavirus que expresan un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario. El sujeto puede ser un mamífero, tal como, pero no limitado a un ser humano, un ratón, una rata, un cobayo, un animal doméstico, tal como, pero no limitado a una vaca, un caballo, una oveja, un cerdo, una cabra, un gato, un perro, un hámster, un burro. En una realización específica, el sujeto es un ser humano.

En otra realización, los métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra una célula o tejido neoplásico, tal como una célula cancerosa o tumor, en un sujeto comprenden administrar al sujeto una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor del punto de control inmunitario.

En otra realización, los sujetos a los que se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario tienen, son susceptibles o corren el riesgo de padecer una enfermedad neoplásica.

En otra realización, los sujetos a los que se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario tienen, son susceptibles o corren el riesgo de desarrollar una enfermedad neoplásica, tal como el cáncer, o presentar una lesión tisular precancerosa. En otra realización específica, a los sujetos a los que se les administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario se les diagnostica una enfermedad neoplásica, tal como cáncer, o presentan una lesión tisular precancerosa.

En otra realización, los sujetos a los que se les administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario padecen, son susceptibles o corren el riesgo de padecer, una enfermedad neoplásica seleccionada de, pero no limitada a leucemia linfoblástica aguda; linfoma linfoblástico agudo; leucemia linfocítica aguda; leucemia mielógena aguda; leucemia mieloide aguda (adulto/infancia); carcinoma corticosuprarrenal; cánceres relacionados con el SIDA; linfoma relacionado con el SIDA; cáncer anal; cáncer de apéndice; astrocitomas; tumor teratoideo/rabdoideo atípico; carcinoma de células basales; cáncer de las vías biliares, extrahepático (colangiocarcinoma); cáncer de vejiga; osteosarcoma óseo/histiocitoma fibroso maligno; cáncer cerebral (adulto/infantil); tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso (adulto/infancia); tumor cerebral, astrocitoma cerebral/tumor cerebral glioma maligno; tumor cerebral, ependimoma; tumor cerebral, meduloblastoma; tumor cerebral, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales; tumor cerebral, glioma de la vía óptica e hipotalámico; glioma del tronco encefálico; cáncer de mama; adenomas/carcinoides bronquiales; tumor bronquial; linfoma de Burkitt; cáncer en la infancia; tumor gastrointestinal carcinoide; tumor carcinoide; carcinoma del adulto, sitio primario desconocido; carcinoma de origen primario desconocido; tumor embrionario del sistema nervioso central; linfoma del sistema nervioso central, primario; cáncer de cuello uterino; carcinoma corticosuprarrenal infantil; cánceres infantiles; astrocitoma cerebral infantil; cordoma, infancia; leucemia linfocítica crónica; leucemia mielógena crónica; leucemia mieloide crónica; trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de colon; cáncer colorrectal; craneofaringioma; linfoma cutáneo de células T; tumor desmoplásico de células redondas pequeñas; enfisema; cáncer endometrial; ependimoblastoma; ependimoma; cáncer de esófago; el sarcoma de Ewing en la familia de tumores de Ewing; tumor extracraneal de células germinales; tumor extragonadal de células germinales; cáncer de vías biliares extrahepáticas; cáncer de vesícula biliar; cáncer gástrico (de estómago); carcinoide gástrico; tumor carcinoide gastrointestinal; tumor del estroma gastrointestinal; tumor de células germinales: tumor trofoblástico gestacional extracraneal, extragonadal u ovárico; tumor trofoblástico gestacional, sitio primario desconocido; glioma; glioma del tronco encefálico; glioma, vía óptica infantil e hipotalámico; leucemia de células pilosas; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de corazón; cáncer hepatocelular (hígado); linfoma de Hodgkin; cáncer de hipofaringe; glioma hipotalámico y de la vía óptica; melanoma intraocular; carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino); sarcoma de Kaposi; cáncer de riñón (cáncer de células renales); histiocitosis de células de Langerhans; cáncer de laringe; cáncer de labio y cavidad oral; liposarcoma; cáncer de hígado (primario); cáncer de pulmón no microcítico; cáncer de pulmón microcítico; linfoma primario del sistema nervioso central; macroglobulinemia, Waldenstrom; cáncer de mama masculino; histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma; meduloblastoma; meduloepitelioma; melanoma; melanoma, intraocular (ojo); cáncer de células de Merkel; carcinoma de piel de células de Merkel; mesotelioma; mesotelioma, adulto maligno; cáncer de cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto; cáncer de boca; síndrome de neoplasia endocrina múltiple; mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas; micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos; enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas; leucemia mielógena, crónica; leucemia mieloide, aguda del adulto; leucemia mieloide, aguda infantil; mieloma, múltiple (cáncer de la médula ósea); trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de cavidad nasal y senos paranasales; carcinoma nasofaríngeo de Hodgkin; neuroblastoma, cáncer de pulmón no microcítico; linfoma no Hodgkin; oligodendroglioma; cáncer bucal; cáncer de cavidad oral; cáncer orofaríngeo; osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso; cáncer de ovario; cáncer epitelial de ovario (tumor del estroma epitelial superficial); tumor de células germinales de ovario; tumor de ovario de bajo potencial maligno; cáncer de páncreas; cáncer de páncreas, células de los islotes; papilomatosis; cáncer de seno paranasal y cavidad nasal; cáncer de paratiroides; cáncer de pene; cáncer de faringe; feocromocitoma; astrocitoma pineal; germinoma pineal; tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia; pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales; tumor hipofisario; adenoma hipofisario; neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple; blastoma pleuropulmonar; linfoma primario del sistema nervioso central; cáncer de próstata; cáncer de recto; carcinoma de células renales (cáncer de riñón); pelvis renal y uréter, cáncer de células de transición; carcinoma del tracto respiratorio que implica el gen NUT en el cromosoma 15; retinoblastoma; rabdomiosarcoma, infancia; cáncer de glándulas salivales; sarcoma, familia de tumores de Ewing; síndrome de Sézary; cáncer de piel (melanoma); cáncer de piel (no melanoma); cáncer de pulmón microcítico; cáncer de intestino delgado sarcoma de tejidos blandos; sarcoma de tejidos blandos; tumor de la médula espinal; carcinoma de células escamosas; cáncer de cuello escamoso con primario oculto, metastásico; cáncer de estómago (gástrico); tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial; linfoma de células T, cutáneo (micosis fungoide y síndrome de Sézary); cáncer testicular; cáncer de garganta; timoma; timoma y carcinoma tímico; cáncer de tiroides; cáncer de tiroides infantil; cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter; cáncer de uretra; cáncer de útero, endometrio; sarcoma uterino; cáncer de vagina; cáncer de vulva; y tumor de Wilms.

En otra realización, se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor del punto de control inmunitario a un sujeto de cualquier grupo de edad que padece, es susceptible o está en riesgo de padecer una enfermedad neoplásica. En una realización específica, se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario a un sujeto con un sistema inmunitario comprometido, a una persona embarazada, a un sujeto que se somete a un trasplante de órgano o médula ósea, un sujeto que toma fármacos inmunosupresores, un sujeto que se somete a hemodiálisis, un sujeto que tiene cáncer, o un sujeto que padece, es susceptible, o está en riesgo de padecer una enfermedad neoplásica. En una realización más específica, se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario a un sujeto que es un niño que tiene 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 años que padece, es susceptible o está en riesgo de padecer una enfermedad neoplásica. En otra realización específica más, se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario a un sujeto que es un bebé que padece, es susceptible o está en riesgo de padecer una enfermedad neoplásica. En otra realización específica más, se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario a un sujeto que es un bebé de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses de edad que padece, es susceptible o está en riesgo de padecer una enfermedad neoplásica. En otra realización específica más, se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario a un sujeto de edad avanzada que padece, es susceptible o está en riesgo de padecer una enfermedad neoplásica. En una realización más específica, se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario a un sujeto mayor de 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 o 90 años.

En otra realización, se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario a sujetos con un mayor riesgo de metástasis del cáncer. En una realización específica, se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario a sujetos en el período neonatal con un sistema inmunitario neonatal y, por lo tanto, inmaduro.

En otra realización, se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario a un sujeto que tiene un cáncer de grado 0 (es decir, neoplasia in situ), grado 1, grado 2, grado 3 o grado 4 o una subcategoría del mismo, tal como grado 3A, 3B o 3C, o un equivalente del mismo.

En otra realización, se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario a un sujeto que tiene cáncer en una etapa de tumor, ganglio, metástasis (TNM) de cualquier combinación seleccionada de tumor T1, T2, T3 y T4, y ganglio N0, N1, N2 o N3, y metástasis M0 y M1.

El tratamiento con éxito de un paciente con cáncer puede evaluarse como la prolongación de la supervivencia esperada, la inducción de una respuesta inmunitaria antitumoral o la mejora de una característica particular de un cáncer. Ejemplos de características de un cáncer que podrían mejorarse incluyen el tamaño del tumor (p. ej., T0, T es o T1-4), estado de metástasis (p. ej., M0, M1), número de tumores observables, afectación de ganglios (p. ej., N0, N1-4, Nx), grado (es decir, grados 1, 2, 3 o 4), estadio (p. ej., 0, I, II, III o IV), presencia o concentración de ciertos marcadores en las células o en los fluidos corporales (p. ej., Af P, B2M, beta-HCG, BTA, CA 15-3, CA 27.29, CA 125, CA 72.4, CA 19-9, calcitonina, CEA, crograinina A, EGFR, receptores hormonales, HER2, HCG, inmunoglobulinas, NSE, ⁿM^p22, PSA, PAP, P^sM^a, S-100, TA-90 y tiroglobulina) y/o patologías asociadas (p. ej., ascitis o edema) o síntomas (p. ej., caquexia, fiebre, anorexia o dolor). La mejora, si se puede medir en porcentaje, puede ser de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% (p. ej., supervivencia, o volumen o dimensiones lineales de un tumor).

En otra realización, se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario a un sujeto que tiene un cáncer latente (p. ej., el sujeto está en remisión). Por tanto, en una realización, un método es para prevenir la reactivación de un cáncer.

En otra realización, se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario a un sujeto que tiene un cáncer recurrente.

En otra realización, se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario a un sujeto con una predisposición genética a un cáncer. En otra realización, se administra a un sujeto con factores de riesgo una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario. Los factores de riesgo de ejemplo incluyen el envejecimiento, tabaco, exposición al sol, exposición a la radiación, exposición a sustancias químicas, antecedentes familiares, alcohol, mala alimentación, falta de actividad física o sobrepeso.

En otra realización, se administra una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario a sujetos que padecen uno o más tipos de cáncer. En otras realizaciones, cualquier tipo de enfermedad neoplásica, tal como el cáncer, que sea susceptible de tratamiento con las composiciones en el contexto de la invención podría ser el objetivo.

En otra realización, la administración de una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo a sujetos confiere inmunidad mediada por células (CMI) contra una célula neoplásica o tumor, tal como una célula cancerosa o tumor. Sin estar ligados a ninguna teoría, en otra realización, una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo infecta y expresa antígenos de interés en células presentadoras de antígenos (APC) del hospedante (p. ej., macrófagos) para la presentación directa de antígenos en el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I y II. En otra realización, la administración de una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo a sujetos induce respuestas de células T CD4+ y CD8+ plurifuncionales coproductoras de IFN-y y TNF-a específicas del cáncer (IFN-y es producido por células T CD4+ y CD8+ y TNF-a es producido por células T CD4+) de gran magnitud para tratar una enfermedad neoplásica.

En otra realización, la administración de una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo y un inhibidor de punto de control inmunitario aumenta o mejora uno o más resultados clínicos para el tratamiento del cáncer. Ejemplos no limitantes de dichos resultados son la supervivencia global, supervivencia sin progresión, tiempo hasta la progresión, tiempo hasta el fracaso del tratamiento, supervivencia sin acontecimientos, tiempo hasta el siguiente tratamiento, tasa de respuesta global y duración de la respuesta. El aumento o mejora en uno o más de los resultados clínicos puede ser de al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, o más, en comparación con un paciente o grupo de pacientes que tienen la misma enfermedad neoplásica en ausencia de tal tratamiento.

Los cambios en la función de respuesta de inmunidad mediada por células (CMI) contra una célula neoplásica o tumor, incluyendo una célula cancerosa o tumor, inducidos mediante la administración de una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, en los sujetos se pueden medir por cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica, que incluye, pero no se limita a citometría de flujo (véase, p. ej., Perfetto S.P. et al., Nat Rev Immun. 2004; 4(8):648-55), ensayos de proliferación de linfocitos (véase, p. ej., Bonilla F.A. et al., Ann Allergy Asthma Immunol. 2008; 101:101-4; y Hicks M.J. et al., Am J Clin Pathol. 1983; 80:159-63), ensayos para medir la activación de linfocitos, incluida la determinación de cambios en la expresión de marcadores de superficie después de la activación de la medición de citoquinas de linfocitos T (véase, p. ej., Caruso A. et al., Cytometry. 1997;27:71-6), ensayos ELISPOT (véase, p. ej., Czerkinsky C.C. et al., J Immunol Methods. 1983; 65:109-121; y Hutchings P.R. et al., J Immunol Methods. 1989; 120:1-8), o ensayos de citotoxicidad de células citolíticas naturales (véase, p. ej., Bonilla F.A. et al., Ann Allergy Asthma Immunol. 2005 mayo; 94(5 Suplemento 1 ):S1 -63).

Los inhibidores de puntos de control inmunitarios que se pueden usar de acuerdo con la invención y con las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden dirigirse a cualquier regulador negativo de puntos de control. En determinadas realizaciones, dicho regulador negativo de puntos de control es una proteína implicada en la activación de células T. En ciertas realizaciones más específicas, tal regulador negativo de puntos de control es el antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), CD80, CD86, muerte celular programada 1 (PD-1), ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1), ligando de muerte celular programada 2 (PD-L2), gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3; también conocido como CD223), galectina-3, atenuador de linfocitos B y T (BTLA), proteína de membrana 3 de células T (TIM3), galectina-9 (GAL9), B7-H1, B7-H3, B7-H4, inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM (TIGIT/Vstm3/WUCAM/VSIG9), supresor de Ig de dominio V de la activación de células T (VISTA), proteína relacionada con el receptor del factor de necrosis tumoral inducida por glucocorticoides (GITR), mediador de entrada del virus del herpes (HVEM), OX40, CD27, CD28, CD137. CGEN-15001T, CGEN-15022, CGEN-15027, CGEN-15049, CGEN-15052 o CGEN-15092. En la Tabla 4 se presenta una descripción general de tales reguladores de puntos de control y medicamentos que se dirigen a ellos.

Tabla 4

Objetivo para Modo de acción Nombre Aproba Indicación (humano) Evaluación preclínica inmunoterapia comercial ción

PD1/PD1-L(1,2) Anticuerpos que se unen a Nivolumab Sí ^fda

Melanoma metastásico, Sí.

(proteína de muerte PD1 (Bloqueo de receptor) (Opdivo-Bristol cáncer de pulmón no

celular programada Myers Squibb) microcítico Ab PD1 solo y en combinación 1) Pembrolizumab Sí Melanoma metastásico con CTLA4 se han evaluado (Keytruda, MK- (ensayos clínicos para sistemáticamente en 7 3475 Merck) cáncer de pulmón, modelos de ratón diferentes.

linfoma, mesotelioma) (Barnes et al, Póster de la Pidilizumab (CT- No Ensayos clínicos - reunión anual de la AACR n.° 011, Cure Tech) cánceres múltiples 3362 (2015))

Los anticuerpos se unen a BMS936559 No Melanoma, cáncer de También se han evaluado PD-L1 (inhiben la unión al (Bristol Myers- pulmón no microcítico, P815-B7-H1 modificado receptor) Squibb) cáncer de ovario Fase I: (mastocitoma). (Véase Hirano VIH et al.,

9-96 ^C

(2 ^a

0 ⁿ

0 ^c

5 ^e

) ^r

) ^Res., 65(3), 108

MPDL328OA No NSCLC y melanoma

(Roche) (tumor localmente

avanzado o

metastásico)

Objetivo para Modo de acción Nombre Aproba Indicación (humano) Evaluación preclínica inmunoterapia comercial

ción FDA

CTLA4 (antígeno 4 Al unirse a CTLA4, los Ipilimumab Si Melanoma Si.

asociado a compuestos mejoran la (MDX010, Véase Simpson et al. linfocitos T activación de las células T y Yervoy; Bristol

i xi l n l r M r- i ^J

2 ^.

1 ^Exp.M

:1 ^ed. 2013:

-71

En determinadas realizaciones, una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo o una composición del mismo, y un inhibidor de punto de control inmunitario se administra preferiblemente en inyecciones múltiples (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 40, 45 o 50 inyecciones) o por infusión continua (p. ej., usando una bomba) en múltiples sitios (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 o 14 sitios). En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, se administra en dos o más inyecciones separadas a lo largo de un período de 6 meses, un período de 12 meses, un período de 24 meses período, o un período de 48 meses. En determinadas realizaciones, la partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, se administra con una primera dosis en una fecha elegida, una segunda dosis al menos 2 meses después de la primera dosis, y una tercera dosis 6 meses después de la primera dosis.

En un ejemplo, las inyecciones cutáneas se realizan en múltiples sitios del cuerpo para reducir la extensión de las reacciones cutáneas locales. En un día de vacunación dado, el paciente recibe la dosis total asignada administrada de una jeringa en 3 a 5 inyecciones intradérmicas de la dosis separadas (p. ej., al menos 0,4 ml, 0,2 ml o 0,1 ml) cada una en una extremidad separadas al menos aproximadamente 5 cm (p. ej., al menos 4,5, 5, 6, 7, 8, 9 o cm) en la entrada de la aguja desde la inyección vecina más cercana. En los días de vacunación subsiguientes, los sitios de inyección se rotan a diferentes extremidades en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj.

En determinadas realizaciones, los métodos comprenden además la coadministración de la partícula de arenavirus y un inhibidor de punto de control inmunitario. En ciertas realizaciones, la coadministración es simultánea. En otra realización, la partícula de arenavirus se administra antes de la administración del inhibidor de punto de control inmunitario. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus se administra después de la administración del inhibidor de punto de control inmunitario. En determinadas realizaciones, el intervalo entre la administración de la partícula de arenavirus y el inhibidor de punto de control inmunitario es de aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas o aproximadamente 12 horas. En determinadas realizaciones, el intervalo entre la administración de la partícula de arenavirus y el inhibidor de punto de control inmunitario es de aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 8 días, aproximadamente 9 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 13 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas. En determinadas realizaciones, el intervalo entre la administración de la partícula de arenavirus y el inhibidor de punto de control inmunitario es de aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses o aproximadamente 6 meses. En algunas realizaciones, el método incluye además la administración de al menos una terapia adicional.

En ciertas realizaciones, los métodos para tratar una enfermedad neoplásica en un sujeto comprenden administrar al sujeto una o más partículas de arenavirus y un inhibidor de indolamina-2,3-dioxigenasa ("IDO"). El método para tratar una enfermedad neoplásica en un sujeto puede incluir administrar al sujeto una o más partículas de arenavirus que expresan un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de IDO. En determinadas realizaciones, los métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra una célula o tejido neoplásico, tal como una célula cancerosa o tumor, en un sujeto comprenden la administración al sujeto de una partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, o una composición del mismo, y un inhibidor de IDO. En ciertas realizaciones, los métodos comprenden la coadministración de una partícula de arenavirus y un inhibidor de IDO. En ciertas realizaciones, los métodos comprenden la coadministración de la partícula de arenavirus, un inhibidor de punto de control inmunitario y un inhibidor de IDO.

En otra realización, se administran dos partículas de arenavirus en un régimen de tratamiento en relaciones molares que están en el intervalo de aproximadamente 1:1 y 1:1000, que incluyen en particular: relación 1:1, relación 1:2, relación 1:5, relación 1:10, relación 1:20, relación 1:50, relación 1:100, relación 1:200, relación 1:300, relación 1:400, relación 1:500, relación 1:600, relación 1:700, relación 1:800, relación 1:900, relación 1:1000.

En ciertas realizaciones, un método para tratar la enfermedad neoplásica es el método en donde se administra primero una primera partícula de arenavirus como "sensibilización" y se administra una segunda partícula de arenavirus como "refuerzo". La primera y la segunda partículas de arenavirus pueden expresar los mismos o diferentes antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos. Alternativamente, o adicionalmente, en algunas realizaciones determinadas, la administración de "sensibilización" y de "refuerzo" se realizan con una partícula de arenavirus derivada de diferentes especies. En ciertas realizaciones específicas, la administración de "sensibilización" se realiza con una partícula de arenavirus derivada del LCMV, y el "refuerzo" se realiza con una partícula de arenavirus derivada del virus Junín. En ciertas realizaciones específicas, la administración de "sensibilización" se realiza con una partícula de arenavirus derivada del virus Junín, y el "refuerzo" se realiza con una partícula de arenavirus derivada del LCMV.

En ciertas realizaciones, la administración de una primera partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo, seguida de la administración de una segunda partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo da como resultado una mayor respuesta de células T CD8+ específicas de antígeno que la administración de una única partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En ciertas realizaciones, el recuento de células T CD8+ específicas de antígeno aumenta en 50%, 100%, 150% o 200% después de la segunda administración en comparación con la primera administración. En determinadas realizaciones, la administración de una tercera partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo da como resultado una mayor respuesta de células T CD8+ específicas de antígeno que la administración de dos partículas de arenavirus consecutivas que expresan un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En determinadas realizaciones, el recuento de células T CD8+ específicas de antígeno aumenta en aproximadamente 50%, aproximadamente 100%, aproximadamente 150%, aproximadamente 200% o aproximadamente 250% después de la tercera administración en comparación con la primera administración.

En ciertas realizaciones, los métodos para tratar una enfermedad neoplásica comprenden administrar dos o más partículas de arenavirus, en donde las dos o más partículas de arenavirus son homólogas, y en donde el intervalo de tiempo entre cada administración es de aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 7 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 9 meses, aproximadamente 10 meses, aproximadamente 11 meses, aproximadamente 12 meses, aproximadamente 18 meses o aproximadamente 24 meses.

En determinadas realizaciones, la administración de una primera partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo y una segunda partícula de arenavirus heteróloga que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo produce una mayor respuesta de células T CD8+ que la administración de una primera partícula de arenavirus que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo y una segunda partícula de arenavirus homologa que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo.

5.9 Composiciones, administración y dosis

Las vacunas, composiciones inmunogénicas (p. ej., formulaciones de vacunas) y las composiciones farmacéuticas comprenden una partícula de arenavirus para usar según la invención y un inhibidor de punto de control inmunitario. Tales vacunas, composiciones inmunógenas y composiciones farmacéuticas pueden formularse según procedimientos estándar en la técnica.

En una realización, las composiciones proporcionadas en el presente documento comprenden una partícula de arenavirus infecciosa, competente para la replicación y un inhibidor de punto de control inmunitario. En otra realización, las composiciones proporcionadas en el presente documento comprenden una partícula de arenavirus infecciosa, de replicación deficiente y un inhibidor de punto de control inmunitario. Dichas composiciones pueden usarse en métodos para tratar una enfermedad neoplásica. En otra realización específica, las composiciones inmunogénicas proporcionadas en el presente documento pueden usarse para inducir una respuesta inmunitaria en un hospedante al que se administra la composición. Las composiciones inmunogénicas proporcionadas en el presente documento se pueden usar como vacunas y, en consecuencia, se pueden formular como composiciones farmacéuticas. En una realización específica, las composiciones inmunogénicas se usan en el tratamiento de una enfermedad neoplásica en un sujeto (p. ej., sujeto humano). En otras realizaciones, la vacuna, composición inmunogénica o composición farmacéutica son adecuadas para administración veterinaria y/o humana.

En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas que comprenden una partícula de arenavirus (o una combinación de diferentes partículas de arenavirus). En ciertas realizaciones, dicha composición inmunogénica comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, dicha composición inmunogénica comprende además un adyuvante. El adyuvante para la administración en combinación con una composición descrita en el presente documento puede administrarse antes, simultáneamente con o después de la administración de dicha composición. En algunas realizaciones, el término "adyuvante" se refiere a un compuesto que, cuando se administra junto con o como parte de una composición descrita en el presente documento, aumenta, mejora y/o potencia la respuesta inmunitaria a una partícula de arenavirus infecciosa de replicación deficiente, pero cuando el compuesto se administra solo no genera una respuesta inmunitaria a la partícula de arenavirus infecciosa, de replicación deficiente. En algunas realizaciones, el adyuvante genera una respuesta inmunitaria a la partícula de arenavirus infecciosa, de replicación deficiente y no produce alergia u otra reacción adversa. Los adyuvantes pueden potenciar una respuesta inmunitaria por varios mecanismos que incluyen, p. ej., el reclutamiento de linfocitos, estimulación de células B y/o T y estimulación de macrófagos. Cuando una vacuna o composición inmunogénica de la invención comprende adyuvantes o se administra junto con uno o más adyuvantes, los adyuvantes que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a adyuvantes de sales minerales o adyuvantes de gel de sales minerales, adyuvantes en partículas, adyuvantes en micropartículas, adyuvantes mucosales y adyuvantes inmunoestimuladores. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, pero no se limitan a sales de aluminio (alumbre) (tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio), monofosforil lípido A 3 Des-O-acilado (MPL) (véase el documento GB 2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), polisorbato 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), compuestos de imidazopiridina (véase la solicitud internacional N.° PCT/US2007/064857, publicado como publicación internacional N.° WO2007/109812), compuestos de imidazoquinoxalina (véase la solicitud internacional N.° PCT/US2007/064858, publicado como publicación internacional N.° WO2007/109813) y saponinas, tales como QS21 (véase Kensil et al., en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); patente de EE. UU. N.° 5.057.540). En algunas realizaciones, el adyuvante es el adyuvante de Freund (completo o incompleto). Otros adyuvantes son las emulsiones de aceite en agua (tales como el escualeno o el aceite de cacahuete), opcionalmente en combinación con inmunoestimulantes, tales como el monofosforil lípido A (véase Stoute et al., N. Engl. J.Med. 336, 86-91 (1997)).

Las composiciones de la invención comprenden las partículas de arenavirus trisegmentadas, infecciosas, de replicación deficiente, solas o junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable y un inhibidor de punto de control inmunitario. Pueden usarse suspensiones o dispersiones de partículas de arenavirus genéticamente modificadas, especialmente suspensiones o dispersiones acuosas isotónicas. Las composiciones farmacéuticas se pueden esterilizar y/o pueden comprender excipientes, p. ej., conservantes, estabilizantes, agentes humectantes y/o emulsionantes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica y/o tampones, y se preparan de manera conocida, por ejemplo mediante medios de procedimientos convencionales de dispersión y suspensión. En ciertas realizaciones, dichas dispersiones o suspensiones pueden comprender agentes reguladores de la viscosidad. Las suspensiones o dispersiones se mantienen a temperaturas de aproximadamente 2-8°C, o preferiblemente para un almacenamiento más prolongado, se pueden congelar y luego descongelar poco antes de su uso. Para inyección, la vacuna o las preparaciones inmunogénicas pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.

En ciertas realizaciones, las composiciones comprenden adicionalmente un conservante, p. ej., el derivado de mercurio timerosal. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas comprenden de 0,001% a 0,01% de timerosal. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas no comprenden un conservante.

Las composiciones farmacéuticas comprenden de aproximadamente 103 a aproximadamente 1011 unidades formadoras de focos de partículas de arenavirus modificadas genéticamente. Las formas de dosis unitarias para administración parenteral son, por ejemplo, ampollas o viales, p. ej., viales que contienen aproximadamente de 103 a 1010 unidades formadoras de focos o de 105 a 1015 partículas físicas de partículas de arenavirus modificadas genéticamente.

En otra realización, una vacuna o composición inmunogénica proporcionada en el presente documento se administra a un sujeto por, incluyendo pero no limitado a, las vías oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, tópica, subcutánea, percutánea, intranasal y de inhalación, y mediante escarificación (raspado a través de las capas superiores de la piel, p. ej., utilizando una aguja bifurcada). Específicamente, se pueden utilizar las vías subcutánea, intramuscular o intravenosa.

Para la administración por vía intranasal o por inhalación, la preparación para usar según la presente invención puede administrarse convenientemente en forma de una presentación de pulverizador de aerosol de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina para usar en un inhalador o insufladores que contienen una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

La dosis del principio activo depende del tipo de vacunación y del sujeto, y su edad, peso, condición individual, los datos farmacocinéticos individuales y el modo de administración.

En ciertas realizaciones, las composiciones se pueden administrar al paciente en una dosis única que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la partícula de arenavirus y una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de punto de control inmunitario. En algunas realizaciones, la partícula de arenavirus se puede administrar al paciente en una dosis única que comprende una partícula de arenavirus y un inhibidor de punto de control inmunitario, cada uno en una cantidad terapéuticamente eficaz.

En ciertas realizaciones, la composición se administra al paciente como una dosis única seguida de una segunda dosis de tres a seis semanas más tarde. De acuerdo con estas realizaciones, las inoculaciones de refuerzo pueden administrarse a los sujetos en intervalos de seis a doce meses después de la segunda inoculación. En determinadas realizaciones, las inoculaciones de refuerzo pueden utilizar una partícula de arenavirus diferente o composición de la misma. En algunas realizaciones, la administración de la misma composición que se describe en el presente documento puede repetirse y estar separada por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses.

En determinadas realizaciones, la vacuna, composición inmunogénica o composición farmacéutica que comprende una partícula de arenavirus se puede utilizar como vacunación viva. Las dosis de ejemplo para una partícula de arenavirus vivo pueden variar de 10-100, o más, PFU de virus vivo por dosis. En algunas realizaciones, las dosis adecuadas de una partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada son 102, 5x102, 103, 5x103, 104, 5x104, 105, 5x105, 106, 5x106, 1075x107, 108, 5x108, 1x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x10", 5x10" o 1012 pfu, y se puede administrar a un sujeto una, dos, tres o más veces con intervalos tan a menudo como sea necesario. En otra realización, se formula un arenavirus vivo de manera que una dosis de 0,2 ml contiene 1065-1075 unidades de foco fluorescentes de partículas vivas de arenavirus. En otra realización, se formula una vacuna inactivada de manera que contenga de aproximadamente 15 pg a aproximadamente 100 pg, de aproximadamente 15 pg a aproximadamente 75 pg, de aproximadamente 15 pg a aproximadamente 50 pg, o de aproximadamente 15 pg a aproximadamente 30 pg de un arenavirus.

También se describen procedimientos y usos de una partícula de arenavirus y un inhibidor de punto de control inmunitario para la fabricación de vacunas en forma de preparados farmacéuticos, que comprenden la partícula de arenavirus y el inhibidor de punto de control inmunitario como principio activo. Además, también se proporciona una combinación de una partícula de arenavirus y un inhibidor de punto de control inmunitario para usar en el tratamiento de una enfermedad neoplásica según la invención. En ciertas realizaciones, la combinación está en la misma composición farmacéutica. En ciertas realizaciones, la combinación no está en la misma composición farmacéutica, tal como cuando la partícula de arenavirus y el inhibidor de punto de control inmunitario deben administrarse por separado. Las composiciones farmacéuticas de la presente solicitud se preparan de manera en sí conocida, por ejemplo mediante procedimientos convencionales de mezcla y/o dispersión.

En ciertas realizaciones, los métodos y composiciones se usan en combinación con medicina personalizada. La medicina personalizada busca beneficiar a los pacientes mediante el uso de información del perfil genético y/o epigenético único de un paciente para predecir la respuesta de un paciente a diferentes terapias e identificar qué terapias tienen más probabilidades de ser efectivas. Las técnicas que se pueden usar en combinación con los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento para obtener el perfil genético y/o epigenético único de un paciente incluyen, pero no se limitan a secuenciación del genoma, secuenciación del ARN, análisis de la expresión génica e identificación de un antígeno tumoral (p. ej., neoantígeno), antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo. En determinadas realizaciones, la selección de un antígeno tumoral de arenavirus o antígeno asociado a tumor para usar según la invención y las composiciones proporcionadas en el presente documento se realiza basándose en el perfil genético del paciente. En ciertas realizaciones, la selección de un antígeno tumoral de arenavirus o antígeno asociado a tumor para usar según la invención y las composiciones proporcionadas en el presente documento se realiza basándose en el perfil genético de un tumor o célula tumoral.

También se proporcionan en el presente documento kits que se pueden usar de acuerdo con la invención. En determinadas realizaciones, el kit proporcionado en el presente documento puede incluir uno o más envases. Estos envases pueden contener para el almacenamiento las composiciones (p. ej., composición farmacéutica, inmunogénica o de vacuna) proporcionadas en el presente documento. También se incluyen en el kit las instrucciones de uso. Estas instrucciones describen, con suficiente detalle, un protocolo de tratamiento para usar las composiciones contenidas en ellos. Por ejemplo, las instrucciones pueden incluir instrucciones de dosis y administración o los métodos para tratar una enfermedad neoplásica.

En ciertas realizaciones, un kit proporcionado en el presente documento incluye envases que contiene cada uno los principios activos para llevar a cabo los métodos descritos en el presente documento. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el kit proporcionado en el presente documento incluye dos o más envases e instrucciones de uso, en donde uno de los envases comprende una partícula de arenavirus infecciosa, de replicación deficiente y otro envase que comprende un inhibidor de punto de control inmunitario.

5.10 Ensayos

5.10.1 Ensayos de detección de arenavirus

El experto en la técnica podría detectar un segmento genómico de arenavirus o partícula de arenavirus trisegmentada, utilizando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, se puede usar la RT-PCR con cebadores que son específicos para un arenavirus para detectar y cuantificar un segmento genómico de arenavirus que se ha genomanipulado para llevar un ORF en una posición diferente de la posición natural del ORF o un partícula de arenavirus trisegmentada. Se pueden usar transferencia Western, ELISA, radioinmunoensayo, inmunoprecipitación, inmunocitoquímica o inmunocitoquímica junto con FACS para cuantificar los productos génicos del segmento genómico de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada.

5.10.2 Ensayo para medir la infectividad

Puede usarse cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica para medir la infectividad de una preparación de vectores de arenavirus. Por ejemplo, la determinación del título de virus/vector se puede realizar mediante un "ensayo de unidades formadoras de focos" (ensayo FFU). En resumen, células de complementación, p. ej., células MC57 o HEK293 que expresan opcionalmente la proteína GP del LCMV se sembraron en placa y se inocularon diferentes diluciones de una muestra de virus/vector. Después de un período de incubación, para permitir que las células formen una monocapa y que el virus se adhiera a las células, la monocapa se cubre con metilcelulosa. Cuando las placas se incuban más, las células infectadas originales liberan progenie viral. Debido a la superposición de metilcelulosa, la propagación de los nuevos virus se restringe a las células vecinas. En consecuencia, cada partícula infecciosa produce una zona circular de células infectadas llamada Foco. Dichos focos pueden hacerse visibles y, por tanto, contables utilizando anticuerpos contra LCMV-NP u otra proteína expresada por la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada y una reacción de color basada en HRP. El título de un virus/vector se puede calcular en unidades formadoras de focos por mililitro (FFU/ml).

5.10.3 Crecimiento de una partícula de Arenavirus

El crecimiento de una partícula de arenavirus se puede evaluar mediante cualquier método conocido en la técnica o descrito en el presente documento (p. ej., cultivo de células). El crecimiento viral se puede determinar mediante inoculación de diluciones en serie de una partícula de arenavirus en cultivos celulares (p. ej., células Vero o células BHK-21). Después de la incubación del virus durante un tiempo específico, el virus se aísla usando métodos estándar.

5.10.4 ELISA del suero

La determinación de la respuesta inmunitaria humoral tras la vacunación de animales (p. ej., ratones, cobayos) se puede hacer mediante ELISA del suero específico de antígeno (ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas). En resumen, las placas se recubren con antígeno (p. ej., proteína recombinante), se bloquean para evitar la unión inespecífica de anticuerpos y se incuban con diluciones seriadas de sueros. Después de la incubación, los anticuerpos séricos unidos se pueden detectar, p. ej., utilizando un anticuerpo específico anti-especie (p. ej., ratón, cobayo) acoplado a enzima (detectando la IgG total o subclases de IgG) y la subsiguiente reacción de color. Los títulos de anticuerpos se pueden determinar como, p. ej., título medio geométrico de punto final.

También se puede realizar ELISA de inmunocaptura (IC-ELISA) (véase Shanmugham et al., 2010, Clin. Vaccine Immunol. 17(8):1252-1260), en donde los agentes de captura se entrecruzan en perlas.

5.10.5 Ensayo para medir la actividad neutralizante de anticuerpos inducidos

La determinación de los anticuerpos neutralizantes en los sueros se realiza con el siguiente ensayo celular utilizando células ARPE-19 de la ATCC y un virus marcado con GFP. Además, se usa suero complementario (p. ej., suero de cobayo) como fuente de complemento exógeno. El ensayo se inicia con la siembra de 6,5 x 103 células/pocillo (50 pl/pocillo) en una placa de 384 pocillos uno o dos días antes del uso para la neutralización. La neutralización se hace en placas de cultivo de tejidos estériles de 96 pocillos sin células durante 1 hora a 37°C. Después de la etapa de incubación de neutralización, la mezcla se añade a las células y se incuba durante 4 días adicionales para la detección de GFP con un lector de placas. Se utiliza un suero humano neutralizante positivo como control positivo del ensayo en cada placa para comprobar la fiabilidad de todos los resultados. Los títulos (EC50) se determinan utilizando un ajuste de curva logística de 4 parámetros. Como ensayo adicional, los pocillos se comprueban con un microscopio de fluorescencia.

5.10.6 Ensayo de reducción en placa

En resumen, los ensayos de reducción (neutralización) en placa para el LCMV se pueden realizar usando un LCMV competente o deficiente en replicación que se marca con proteína verde fluorescente, se puede usar suero de conejo al 5% como fuente de complemento exógeno y las placas se pueden contar por microscopía de fluorescencia. Los títulos de neutralización se pueden definir como la dilución más alta de suero que da como resultado una reducción de 50%, 75%, 90% o 95% en las placas, en comparación con las muestras de suero de control (preinmunes).

Los genomas de ARN de LCMV de la qPCR se aíslan utilizando el kit QlAamp Viral RNA mini (QIAGEN), de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Los equivalentes de genoma de ARN del LCMV se detectan por PCR cuantitativa llevada a cabo en un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems) con el Kit de qRT-PCR de un solo paso SuperScript® III Platino® (Invitrogen) y cebadores y sondas (indicador FAM y atenuador NFQ-MGB) específicos para parte de la región codificante de la NP del LCMV u otro tramo genómico de la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada. El perfil de temperatura de la reacción puede ser: 30 min a 60°C, 2 min a 95°C, seguido de 45 ciclos de 15 s a 95°C, 30 s a 56°C. El ARN se puede cuantificar mediante comparación de los resultados de la muestra con una curva patrón preparada a partir de una serie de diluciones log10 de un fragmento de ARN transcrito in vitro cuantificado por espectrofotometría, correspondiente a un fragmento de la secuencia codificante de la NP del LCMV u otro tramo genómico de la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que contiene los sitios de unión del cebador y la sonda.

5.10.7 Ensayo de neutralización en células de fibroblastos de pulmón de cobayo (GPL)

En resumen, se prepararon diluciones seriadas de sueros de ensayo y de control (antes de la vacunación) en medio completo GPL con suero de conejo complementario (1%) como fuente de complemento exógeno. La serie de dilución abarcó desde 1:40 hasta 1:5120. Las diluciones de suero se incubaron con virus marcado con eGFP (100-200 pfu por pocillo) durante 30 min a 37°C y luego se transfirieron a placas de 12 pocillos que contenían células GPL confluentes. Las muestras se procesaron por triplicado. Después de 2 horas de incubación a 37°C, las células se lavaron con PBS, se volvieron a alimentar con medio completo GPL y se incubaron a 37°C/5% de CO2 durante 5 días. Las placas se visualizaron por microscopía de fluorescencia, se contaron y compararon con pocillos de control. Aquella dilución de suero que daba como resultado una reducción de 50% en el número de placas en comparación con los controles se denominó el título neutralizante.

5.10.8 Transferencia Western

Las células infectadas cultivadas en matraces de cultivo de tejidos o en suspensión se lisan en los puntos de tiempo indicados después de la infección usando tampón RIPA (Thermo Scientific) o se usan directamente sin lisis celular. Las muestras se calientan a 99°C durante 10 minutos con agente reductor y tampón de muestra NuPage LDS (NOVEX) y se enfrían a temperatura ambiente antes de cargarlas en geles con SDS al 4-12% para electroforesis. Las proteínas se transfieren a las membranas utilizando el dispositivo de transferencia de gel iBlot de Invitrogens y se visualizan mediante tinción de Ponceau. Finalmente, las preparaciones se analizan con anticuerpos primarios dirigidos contra proteínas de interés y anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina, seguido de tinción con solución de NBT/BCIP de 1 paso (INVITROGEN).

5.10.9 Ensayo de tinción de multímeros de péptido-MHC para la detección de la proliferación de células T CD8+ específicas de antígeno

Puede usarse cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica para ensayar las respuestas de células T CD8+ específicas de antígeno. Por ejemplo, se puede usar el ensayo de tinción de tetrámero de péptido-MHC (véase, p. ej., Altman J.D. et al., Science. 1996; 274:94-96; y Murali-Krishna K. et al., Immunity. 1998; 8:177-187). Brevemente, el ensayo comprende las siguientes etapas, se usa un ensayo de tetrámero para detectar la presencia de células T específicas de antígeno. Con el fin de que una célula T detecte el péptido para el que es específica, debe reconocer tanto el péptido como el tetrámero de las moléculas MHC hechas a la medida para una especificidad de antígeno definida y un haplotipo de MHC de células T (típicamente marcado con fluorescencia). A continuación, el tetrámero se detecta por citometría de flujo a través del marcador fluorescente.

5.10.10 Ensayo ELISPOT para detectar la proliferación de células T CD4+ específicas de antígeno.

Puede usarse cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica para ensayar las respuestas de células T CD4+ específicas de antígeno. Por ejemplo, se puede utilizar el ensayo ELISPOT (véase, p. ej., Czerkinsky C.C. et al., J Immunol Methods. 1983; 65:109-121; y Hutchings P.R. et al., J Immunol Methods. 1989; 120:1-8). Brevemente, el ensayo comprende las siguientes etapas: una placa de Immunospot se recubre con un anticuerpo anti-citoquina. Las células se incuban en la placa de Immunospot. Las células secretan citoquinas y luego se lavan. A continuación, las placas se recubren con un segundo anticuerpo antiquitocina biotinilado y se visualizan con un sistema de avidina-HRP.

5.10.11 Ensayo de citoquinas intracelulares para detectar la funcionalidad de las respuestas de células T CD8+ y CD4+.

Cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica se puede utilizar para ensayar la funcionalidad de respuestas de células T CD8+ y CD4+. Por ejemplo, se puede usar el ensayo de citoquinas intracelulares combinado con citometría de flujo (véase, p. ej., Suni M.A. et al., J Immunol Methods. 1998; 212:89-98; Nomura LE et al., Cytometry. 2000; 40:60-68; y Ghanekar S.A. et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2001; 8:628-63). Brevemente, el ensayo comprende las siguientes etapas: activación de células a través de péptidos o proteínas específicos, se añade una inhibición del transporte de proteínas (p. ej., brefeldina A) para retener las citoquinas dentro de la célula. Después de un período definido de incubación, típicamente 5 horas, le sigue una etapa de lavado y se pueden añadir a las células anticuerpos contra otros marcadores celulares. A continuación, las células se fijan y permeabilizan. Se añaden los anticuerpos anti-citoquina conjugados con fluorocromo y las células pueden analizarse por citometría de flujo.

5.10.12 Ensayo para confirmar la deficiencia de la replicación de vectores virales

Cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica que determine la concentración de partículas virales infecciosas y competentes para la replicación también se puede usar para medir partículas virales de replicación deficiente en una muestra. Por ejemplo, se pueden utilizar para este fin ensayos de FFU con células no de complementación.

Además, los ensayos basados en placa son el método estándar utilizado para determinar la concentración de virus en términos de unidades formadoras de placas (PFU) en una muestra de virus. Específicamente, una monocapa confluente de células hospedantes no de complementación se infecta con el virus en diluciones variables y se cubre con un medio semisólido, tal como agar, para evitar que la infección por el virus se propague indiscriminadamente. Una placa viral se forma cuando un virus infecta y se replica con éxito en una célula dentro de la monocapa de células fijas y se propaga a las células circundantes (véase, p. ej., Kaufmann, S.H.; Kabelitz, D. (2002). Methods in Microbiology Vol.32: Immunology of Infection. Academic Press. ISBN 0-12-521532-0). La formación de placa puede tardar de 2 a 14 días, dependiendo del virus que se esté analizando. Las placas generalmente se cuentan manualmente y los resultados, en combinación con el factor de dilución utilizado para preparar la placa, se utilizan para calcular el número de unidades formadoras de placa por unidad de volumen de muestra (PFU/ml). El resultado de PFU/ml representa el número de partículas infectivas competentes para la replicación dentro de la muestra. Cuando se usan células C, se puede usar el mismo ensayo para valorar partículas de arenavirus de replicación deficiente o partículas de arenavirus trisegmentadas.

5.10.13 Ensayo para la expresión de antígeno viral

Puede usarse cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica para medir la expresión de antígenos virales. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de FFU. Para la detección, se utiliza(n) preparación(es) de anticuerpos monoclonales o policlonales contra los respectivos antígenos virales (FFU específicas de transgén).

5.10.14 Modelos animales

Para investigar la recombinación y la infectividad de una partícula de arenavirus se pueden utilizar modelos animales in vivo. En ciertas realizaciones, los modelos animales que pueden usarse para investigar la recombinación y la infectividad de una partícula de arenavirus trisegmentada incluyen ratones, cobayos, conejos y monos. En una realización preferida, los modelos animales que se pueden usar para investigar la recombinación y la infectividad de un arenavirus incluyen ratones. En una realización más específica, los ratones pueden usarse para investigar la recombinación y la infectividad de una partícula de arenavirus que son triplemente deficientes para el receptor de interferón tipo I, el receptor de interferón tipo II y el gen activador de recombinación 1 (RAG1).

En ciertas realizaciones, los modelos animales pueden usarse para determinar la infectividad de los arenavirus y la estabilidad del transgén. En algunas realizaciones, el ARN viral se puede aislar del suero del modelo animal. Las técnicas son fácilmente conocidas por los expertos en la técnica. El ARN viral se puede transcribir de forma inversa y el ADNc que lleva los ORF de arenavirus se puede amplificar mediante PCR con cebadores específicos de genes. La citometría de flujo también se puede utilizar para investigar la infectividad de arenavirus y la estabilidad del transgén.

La seguridad, tolerancia y eficacia inmunogénica de las vacunas que comprenden un arenavirus bisegmentado infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o fragmento antigénico del mismo descrito en el presente documento o una composición del mismo se pueden ensayar en modelos animales. En ciertas realizaciones, los modelos animales que se pueden usar para ensayar la seguridad, tolerancia y la eficacia inmunogénica de las vacunas y las composiciones de las mismas usadas en el presente documento incluyen ratones, cobayos, ratas, monos y chimpancés. En una realización preferida, los modelos animales que se pueden usar para ensayar la seguridad, tolerancia y eficacia inmunogénica de las vacunas y las composiciones de las mismas usadas en el presente documento incluyen ratones.

5.10.15 Ensayos de inhibidores de puntos de control inmunitarios

Se han ideado una serie de ensayos para evaluar las propiedades de los inhibidores de puntos de control propuestos, por ejemplo, como se describe en Lechner et al., J. Immunother. 36(9), 477-89 (2013). Los modelos tumorales que se pueden usar para ensayar los métodos y composiciones descritos en el presente documento incluyen Colon26 (CT26), MC38 (adenocarcinoma de colon de ratón), B16F10 (B16), pulmonar de Lewis (LLC), Madison109 (Mad 109), EMT-6 (cáncer de mama murino), 4T1 (4T1) (cáncer de mama murino) y (RENCA) (cáncer renal murino).

En ciertas realizaciones, en estos sistemas modelo, los "tumores trasplantables" pueden generarse mediante inoculación subcutánea (p. ej., CT26, 4T1, MAD109, RENCA, LLC o B16) o intracerebral (p. ej., GL261, ONC26M4) de líneas de células tumorales en roedores, por ejemplo en ratones hembra adultos. Los tumores pueden desarrollarse en intervalos de tiempo predeterminados, por ejemplo, varios días. Estos tumores crecen en cepas singénicas de roedores inmunocompetentes, por ejemplo, de ratón. Por ejemplo, CT26, 4T1, MAD109 y RENCA se pueden cultivar en ratones BALB/c, L^lC, B16 y GL261 se pueden cultivar en ratones C57BL/6 y ONC26M4 se puede cultivar en ratones FVBN. Los "tumores espontáneos" pueden generarse por inyección intracerebral de plásmidos de ADN que codifican una serie (p. ej., uno, dos, tres o más) de oncogenes y codifican uno o más indicadores, p. ej., indicador de luciferasa de luciérnaga, en ratones neonatales C57BL/6 o FVBN para transformar las células cerebrales endógenas. El crecimiento de gliomas puede controlarse mediante técnicas conocidas en la técnica, p. ej., formación de imágenes por bioluminiscencia. El crecimiento de tumores subcutáneos puede controlarse mediante técnicas conocidas en la técnica, p. ej., mediciones de calibre en tres dimensiones a intervalos de tiempo especificados.

7. Ejemplos

Los ejemplos en esta sección que no se refieren a la invención reivindicada son solo para referencia.

7.1 Tratamiento con vector de arenavirus trisegmentado e inhibidor de punto de control inmunitario en un modelo tumoral de adenocarcinoma de colon

Este ejemplo demuestra que el tratamiento con un vector de arenavirus que codifica un antígeno específico de tumor de ejemplo (ovoalbúmina (OVA)) y un inhibidor de punto de control inmunitario (anticuerpo anti-PDl) daba como resultado un efecto sinérgico en el crecimiento tumoral y el porcentaje de supervivencia.

Para determinar los efectos del tratamiento con un vector de LCMV trisegmentado competente para la replicación que codifica la ovoalbúmina (OVA) (r3LCMV-OVA) y el inhibidor de punto de control anti-PD1 (anticuerpo anti-PD1), se utilizó un modelo de ratón de MC38-OVA subcutáneo. El día 0, se implantaron células tumorales de carcinomas de colon MC38-OVAdim (5 x 105) por vía subcutánea en el flanco de ratones C57BL/6. Cuando los tumores se hicieron palpables (el día 7), los ratones se dejaron sin tratar (grupo 1), se trataron con 12,5 mg/kg de anticuerpo anti-PD1 (clon RMP1-14, BioXCell) (administrado por vía intraperitoneal) los días 13, 17, 20 y 24 (grupo 2), se les inyectó por vía intravenosa 105 PFU de r3LCMV-OvA el día 7 (grupo 3), o se trataron con una combinación de r3LCMV-OVA y anticuerpo anti-PD1 utilizando el mismo régimen de tratamiento (grupo 4). Cinco ratones se dejaron sin tratar, mientras que todos los demás grupos incluían seis ratones por grupo. Se controló el crecimiento tumoral a lo largo del tiempo así como la supervivencia de los animales.

El experimento anterior mostró que los tumores establecidos de células de adenocarcinoma de colon MC38 que expresan OVA mostraban una respuesta limitada al tratamiento con anticuerpos anti-PD1 o r3LCMV-OVA solos, mientras que una combinación de inmunoterapia con anticuerpos anti-PD1 y r3LCMV-OVA daba como resultado un efecto de sinergia que conducía a una reducción significativa en el crecimiento del tumor (Fig. 3A) así como un mayor porcentaje de supervivencia (Fig. 3B).

7.2. Tratamiento con vectores de arenavirus trisegmentados o bisegmentados que codifican un neoantígeno tumoral e inhibidor de punto de control inmunitario en un modelo tumoral de adenocarcinoma de colon

Este ejemplo demuestra que el tratamiento con un vector de arenavirus que codifica un neoantígeno (MC-38 Adpgkmut) y un inhibidor de punto de control inmunitario (anticuerpo anti-PD1) daban como resultado un efecto sinérgico en la inducción de células T CD8+ específicas de antígeno, crecimiento tumoral y porcentaje de supervivencia.

Para determinar la inmunogenicidad y los efectos del tratamiento con vectores basados en arenavirus de replicación competente y replicación deficiente que codifican un neoantígeno tumoral (p. ej., MC-38 Adpgkmut (mutación R204M en glucoquinasa dependiente de ADP (Adpgk)); Yadav et al., 2014, Nature 515: 572-576), los ratones a los que se implantaron células tumorales MC-38 se evaluaron después del tratamiento con vectores de arenavirus trisegmentados de replicación competente (r3LCMV-Adpgkmut) o bisegmentados de replicación deficiente (r2LCMV-Adpgkmut) que codifican Adpgkmut e inhibición de punto de control de PD1 (anticuerpo anti-PD 1).

En el día -7 del experimento se implantaron células tumorales MC-38 (1x106) por vía subcutánea en el flanco de ratones C57BL/6. Siete días más tarde, el día 0 del experimento, los ratones se inmunizaron una vez por inyección intravenosa de 5,5 x 105 PFU de r2LCMV-Adpgkmut (grupos 1 y 2) o 5,5x104 PFU de r3LCMV-Adpgkmut que corresponde a un total de 5,5x105 partículas virales (grupos 3 y 4) o tampón (grupos 5 y 6). Los animales de los grupos 1, 3 y 5 se trataron adicionalmente por inyección intraperitoneal de 6,8 mg/kg de clon RMP1-14 de anticuerpo anti-PD1 los días 0, 3, 6 y 9. La inducción de células T CD8+ específicas de Adpgkmut se analizaron posteriormente con pentámeros específicos de MC-38 Adpgkmut (F4B-EH-2Db-ASMTNMELM, Prolmmune) en muestras de sangre periférica los días 7 y 14 después de la vacunación.

Los experimentos anteriores mostraron que se indujeron respuestas de células T CD8+ específicas de neoantígeno de considerable magnitud en algunos animales tratados con vectores de LCMV que expresan Adpgkmut (grupos 1-4) (Fig. 4A). Sin embargo, se observaron frecuencias de células T CD8+ significativamente más altas en animales tratados con el vector de replicación trisegmentado (grupos 3 y 4) en comparación con el vector de replicación deficiente bisegmentado (grupos 1 y 2) (Fig. 4A). Se indujeron respuestas de células T CD8+ específicas de neoantígeno más altas en ratones tratados con un vector de LCMV competente para la replicación que expresa Adpgkmut y el anticuerpo anti-PD1 (grupo 3), lo que apunta a un efecto sinérgico del tratamiento combinado sobre la inmunogenicidad de los neoantígenos (Fig. 4A). El nivel más alto de control tumoral y las mejores tasas de supervivencia se observaron en animales tratados con una combinación de r3LCMV-Adpgkmut y anticuerpo anti-PD1 (Fig. 4B y 4C).

7.3. Tratamiento con vectores de arenavirus trisegmentados o bisegmentados e inhibidor de punto de control inmunitario en un modelo de melanoma

Este ejemplo demuestra que el tratamiento con una mezcla de vectores de arenavirus trisegmentados que codifican antígenos de melanoma (glucoproteína 100 ("GP100"), proteína relacionada con tirosinasa 1 ("TRP1") y proteína relacionada con tirosinasa 2 ("TRP2")) con y sin un inhibidor de punto de control inmunitario (anticuerpo anti-PD1) daba como resultado una reducción del tamaño del tumor y una mayor supervivencia de los animales (porcentaje de supervivencia y días totales de supervivencia).

Para determinar los efectos del tratamiento con vectores basados en arenavirus competentes en replicación y de replicación deficiente que codifican antígenos de melanoma e inhibición del punto de control de PD1, se utilizó un modelo de melanoma B16F10 de ratón.

El día 0 del experimento se implantaron células de melanoma B16F10 (1x105) por vía subcutánea en el flanco de ratones C57BL/6 (Fig. 5A). El día 7 del experimento, se inyectó a los ratones por vía intravenosa 1,2 x 105 PFU de RCV (en total) de una mezcla de vectores de arenavirus trisegmentados competentes para la replicación (4x104 PFU de cada r3LCMV-GP100, r3LCMV-Trp1 y r3LCMV-Trp2) el día 7 (grupos 1 y 4), 1,2x106 PFU (en total) de una mezcla de vectores de arenavirus bisegmentados de replicación deficiente (4x105 PFU de cada rLCMV-GP100, rLCMV-Trp1 y rLCMV-T rp2) el día 7 (grupos 2 y 5), o solo con tampón (grupos 3 y 6). Los días 10, 13, 16, 19 y 22 del experimento, los ratones de los grupos 1, 2 y 3 se trataron adicionalmente con 200 pg de anticuerpo anti-PD1 (clon 29F.1A12, BioXCell), administrados por vía intraperitoneal. Se controló el crecimiento del tumor a lo largo del tiempo, así como el porcentaje de supervivencia de los animales y los días de supervivencia. Había cinco ratones por grupo.

Los experimentos anteriores mostraron que los tumores de melanoma establecidos respondían a un solo tratamiento con una mezcla de vectores de LCMV trisegmentados competentes para replicación que expresaban los antígenos de melanoma GP100, Trp1 y Trp2 (grupo 4), como se muestra por los volúmenes tumorales reducidos (Fig. 5B) y mayores tasas de supervivencia en comparación con los animales de control (grupo 6) (Figs. 5C y 5D). Por el contrario, no hubo respuesta al tratamiento con una mezcla de vectores de LCMV bisegmentados de replicación deficiente que expresaban los mismos antígenos de melanoma, independientemente de la presencia o ausencia de inhibición del punto de control (grupos 2 y 5) (Figs. 5B-5D). El bloqueo de anti-PD1 solo tampoco tuvo efecto sobre el crecimiento tumoral o la supervivencia de los animales (grupo 3) (Figs. 5B-5D). Sin embargo, en ratones tratados con vectores de LCMV trisegmentados que expresan antígenos de melanoma competentes para la replicación en combinación con anticuerpos anti-PD1 (grupo 1), se observó un aumento en las tasas de supervivencia que se correlacionaba con una disminución en los volúmenes tumorales, en comparación con los animales tratados con una mezcla de solo vectores de LCMV trisegmentados competentes para la replicación, lo que apunta a un efecto sinérgico de estas modalidades de tratamiento (Figs. 5B-5D).

8. SECUENClAS

Las secuencias de la Tabla 5 son secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos ilustrativas que se pueden usar con los métodos y composiciones descritos en el presente documento. En algunos casos, se usa una secuencia de ADN para describir la secuencia de ARN de un segmento genómico viral. La secuencia de ARN se puede deducir fácilmente a partir de la secuencia de ADN.

Tabla 5

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una partícula de arenavirus para usar en un método para tratar una enfermedad neoplásica en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto dicha partícula de arenavirus y un inhibidor de punto de control inmunitario, en donde dicha partícula de arenavirus es una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S, y en donde dicha partícula de arenavirus está genomanipulada para contener un segmento genómico de arenavirus que comprende:

(ii) al menos un marco de lectura abierto ("ORF") de arenavirus en una posición distinta de la posición natural de dicho ORF, en donde dicho ORF codifica la glicoproteína ("GP"), la nucleoproteína ("NP"), la proteína de matriz Z ("proteína Z") o la ARN polimerasa L dependiente de ARN ("proteína L") de dicha partícula de arenavirus.

2. Una composición farmacéutica que comprende una partícula de arenavirus, un inhibidor de punto de control inmunitario y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde dicha partícula de arenavirus es una partícula de arenavirus trisegmentada como se define en la reivindicación 1.

3. Un kit que comprende uno o más envases e instrucciones de uso, en donde dichos uno o más envases comprenden la composición farmacéutica de la reivindicación 2.

4. Un kit que comprende dos o más envases e instrucciones de uso, en donde uno de dichos envases comprende una partícula de arenavirus y otro de dichos envses comprende un inhibidor de punto de control inmunitario, en donde dicha partícula de arenavirus es una partícula de arenavirus trisegmentada como se define en la reivindicación 1.

5. Una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 2, o un kit como se define en la reivindicación 3 o 4, para usar en un método para tratar una enfermedad neoplásica en un sujeto.

6. La partícula de arenavirus para uso de la reivindicación 1, la composición farmacéutica de la reivindicación 2, el kit de la reivindicación 3 o 4, o la composición farmacéutica para uso o el kit de uso de la reivindicación 5, en donde:

(i) dicho antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor se selecciona del grupo que consiste en antígenos virales oncogénicos, antígenos de cáncer de testículo, antígenos oncofetales, antígenos de diferenciación tisular, antígenos proteicos mutantes, neoantígenos, adipofilina, A iM-2, ALDH1AI, BCLX (L), BING-4, CALCA, CD45, CPSF, ciclina D1, DKKI, ENAH (hMcna), Ga733 (EpCAM), EphA3, EZH2, FGF5, glipican-3, G250 /MN/CAIX, HER-2/neu, IDO1, IGF2B3, IL13Ralpha2, carboxil esterasa intestinal, alfa-fetoproteína, calicreína 4, KIF20A, Lengsin, M-CSF, MCSP, mdm-2, Meloe, MMP-2, MMP-7, MUCl, MUC5AC, p53 (no mutante), PAX5, PBF, PRAME, PSMA, RAGE, RAGE-1, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, secernina 1, SOX1O, STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de la próstata 1), survivina, telomerasa, VEGF, WT1, EGF-R, ^cE^a, CD20, CD33, CD52, glicoproteína 100 (proteína GP100 o gp 100), MELANA/MART1, MART2,NY-ESO-1, p53, MAGE A1, MAGE A3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, CDK4, alfaactinina-4, ARTC1, BCR-ABL, proteína de fusión BCR-ABL (b3a2), B-RAF, CASP-5, CASP-8, beta-catenina, Cdc27, CDK4, CDKN2A, CLPP, COA-1, proteína de fusión dek-can, EFTUD2 , factor de elongación 2, ETV6-AML, proteína de fusión ETV6-AML1, FLT3-ITD, FNl, GPNMB, proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, NFYC, OGT, OS-9, proteína de fusión pml-RARalpha, PRDX5, PTPRK, H-ras, K-ras (oncogén viral de sarcoma de rata V-Ki-ras2 Kirsten), N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPDl, SSX, SSX2, proteína de fusión SYT-SSXl o -SSX2, TGF-betaRII, triosafosfato isomerasa, ormdm-2, LMP2, HPV E6/E7, EGFRvIII (factor de crecimiento epidérmico variante III), Idiotipo, GD2, gangliósido G2), mutante Ras, p53 (mutante), proteinasa3 (PR1), tirosinasa, PSA, hTERT, puntos de corte de translocación de sarcoma, EphA2, fosfatasa ácida prostática PAP, neo-PAP, ML-IAP, AFP, ERG (gen de fusión TMPRSS2 ETS), NA17, ^pA^x3, A^lK, receptor de andrógenos, ciclina B1, ácido polisiálico, MYCN, TRP2, TRP2-Int2, GD3, fucosil g M1, mesotelina, PSCA, sLe(a), cyp1B1, PLAC1, GM3, b Or IS, Tn, GLoboH, NY-Br -1, SART3, STn, anhidrasa carbónica IX, OY-TES1, proteína espermática 17, LCK, antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA), AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, Legumina, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, FAP, PDGFR-beta, MAD-CT-2, antígeno 1 relacionado con For, TRP1, CA-125, CA19-9, calretinina, antígeno de membrana epitelial (EMA), antígeno de tumor epitelial (ETA), CD19, CD34, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína de líquido de enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), antígeno HMB-45, Myo-D1, actina específica de músculo (MSA), neurofilamento, enolasa específica de neurona (NSE), fosfatasa alcalina placentaria, sinaptofisina, tiroglobulina, factor de transcripción tiroidea 1, forma dimérica de la isoenzima piruvato quinasa tipo M2 (tumor M2-PK), BAGE BAGE-1, CAGE, CTAGE, FATE, GAGE, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, HCA661, HOM-TES-85, MAGEA, MAGEB, MAGEC, NA88, NY-SAR-35, SPANXB1, SPA17, SSX, SYCP1, TPTE, carbohidrato/gangliósido Gm 2 (antígeno oncofetal-inmunogénico-1 OFA-I-1), GM3, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA 50, CAM 43, CEA, EBNA, EF2, antígeno del virus de Epstein-Barr, HLA-A2, HLA-A11, HSP70-2, KIAAO205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, miosina clase I, GnTV, Herv-K-mel, LAGE-1, LAGE-2, (proteína espermática) SP17, SCP-1, P15(58), Hom/Mel-40, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, m Yl -RAR, TSP-180, P185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, TAG-72, TAG-72-4, CA-72-4, CAM 17.1, NuMa, 13-catenina, P16, TAGE, CT7, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68\KP1, CO-029, HTgp-175, M344, MG7-Ag, MOV18, NBY70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90, TAAL6, TLP, TPS, CD22, CD27, CD30, CD70, prosteina, TARP (proteína de marco de lectura alternativo gamma del receptor de células T), Trp-p8, integrina avp3 (CD61), galactina o Ral-B, CD123, CLL-1, CD38, CS-1, CD138 y ROR1; o

(ii) dicha secuencia de nucleótidos codifica dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más antígenos tumorales o antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos.

7. La partícula de arenavirus para uso de la reivindicación 1 o 6, la composición farmacéutica de la reivindicación 2 o 6, el kit de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 y 6, o la composición farmacéutica para uso o el kit para uso de la reivindicación 5 o 6, en donde dicho inhibidor de punto de control inmunitario:

(i) inhibe, disminuye o interfiere con la actividad de un regulador de punto de control negativo, y en donde dicho regulador de punto de control negativo se selecciona del grupo que consiste en antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), CD80, CD86, muerte celular programada 1 (PD-1), ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1), ligando de muerte celular programada 2 (PD-L2), gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3; también conocido como CD223), galectina-3, atenuador de linfocitos B y T (BTLA), proteína de membrana 3 de células T (TIM3), galectina-9 (GAL9), B7-H1, B7-H3, B7-H4, inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM (TIGIT/Vstm3 /WUCAM/VSIG9), supresor de Ig del dominio V de la activación de células T (VISTA), proteína relacionada con el receptor del factor de necrosis tumoral inducida por glucocorticoides (GITR), mediador de entrada del virus del herpes (HVEM), OX40, CD27, CD28, CD137, CGEN-15001T, CGEN-15022, CGEN-15027, CGEN-15049, CGEN-15052 y CGEN-15092; o

(ii) es un anticuerpo que se une o inhibe la actividad de muerte celular programada 1 (PD1), ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1), antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA4), proteína de membrana 3 de células T (TIM-3), gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3) o inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM (TIGIT).

8. La partícula de arenavirus para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1,6 y 7, o la composición farmacéutica para uso o el kit para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde dicho sujeto padece, es susceptible o está en riesgo de padecer una enfermedad neoplásica seleccionada del grupo que consiste en leucemia linfoblástica aguda; linfoma linfoblástico agudo; leucemia linfocítica aguda; leucemia mielógena aguda; leucemia mieloide aguda (adulto/infancia); carcinoma corticosuprarrenal; cánceres relacionados con el SIDA; linfoma relacionado con el SIDA; cáncer anal; cáncer de apéndice; astrocitomas; tumor teratoideo/rabdoideo atípico; carcinoma de células basales; cáncer de las vías biliares, extrahepático (colangiocarcinoma); cáncer de vejiga; osteosarcoma óseo/histiocitoma fibroso maligno; cáncer cerebral (adulto/infantil); tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso (adulto/infancia); tumor cerebral, astrocitoma cerebral/tumor cerebral glioma maligno; tumor cerebral, ependimoma; tumor cerebral, meduloblastoma; tumor cerebral, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales; tumor cerebral, glioma de la vía óptica e hipotalámico; glioma del tronco encefálico; cáncer de mama; adenomas/carcinoides bronquiales; tumor bronquial; linfoma de Burkitt; cáncer en la infancia; tumor gastrointestinal carcinoide; tumor carcinoide; carcinoma del adulto, sitio primario desconocido; carcinoma de origen primario desconocido; tumor embrionario del sistema nervioso central; linfoma del sistema nervioso central, primario; cáncer de cuello uterino; carcinoma corticosuprarrenal infantil; cánceres en la infancia; astrocitoma cerebral infantil; cordoma, infancia; leucemia linfocítica crónica; leucemia mielógena crónica; leucemia mieloide crónica; trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de colon; cáncer colorrectal; craneofaringioma; linfoma cutáneo de células T; tumor desmoplásico de células redondas pequeñas; enfisema; cáncer endometrial; ependimoblastoma; ependimoma; cáncer de esófago; sarcoma de Ewing en la familia de tumores de Ewing; tumor extracraneal de células germinales; tumor extragonadal de células germinales; cáncer de vías biliares extrahepáticas; cáncer de vesícula biliar; cáncer gástrico (de estómago); carcinoide gástrico; tumor carcinoide gastrointestinal; tumor del estroma gastrointestinal; tumor de células germinales: tumor trofoblástico gestacional extracraneal, extragonadal u ovárico; tumor trofoblástico gestacional, sitio primario desconocido; glioma; glioma del tronco encefálico; glioma, de la vía óptica e hipotalámico infantil; leucemia de células pilosas; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de corazón; cáncer hepatocelular (hígado); linfoma de Hodgkin; cáncer de hipofaringe; glioma hipotalámico y de la vía óptica; melanoma intraocular; carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino); sarcoma de Kaposi; cáncer de riñón (cáncer de células renales); histiocitosis de células de Langerhans; cáncer de laringe; cáncer de labio y cavidad oral; liposarcoma; cáncer de hígado (primario); cáncer de pulmón no microcítico; cáncer de pulmón microcítico; linfoma primario del sistema nervioso central; macroglobulinemia, Waldenstrom; cáncer de mama masculino; histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma; meduloblastoma; meduloepitelioma; melanoma; melanoma, intraocular (ojo); cáncer de células de Merkel; carcinoma de piel de células de Merkel; mesotelioma; mesotelioma, adulto maligno; cáncer de cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto; cáncer de boca; síndrome de neoplasia endocrina múltiple; mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas; micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos; enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas; leucemia mielógena, crónica; leucemia mieloide, aguda del adulto; leucemia mieloide, aguda infantil; mieloma, múltiple (cáncer de la médula ósea); trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de cavidad nasal y senos paranasales; carcinoma nasofaríngeo; neuroblastoma, cáncer de pulmón no microcítico; linfoma no Hodgkin; oligodendroglioma; cáncer bucal; cáncer de cavidad oral; cáncer orofaríngeo; osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso; cáncer de ovario; cáncer epitelial de ovario (tumor del estroma epitelial superficial); tumor de células germinales de ovario; tumor de ovario de bajo potencial maligno; cáncer de páncreas; cáncer de páncreas, células de los islotes; papilomatosis; cáncer de seno paranasal y cavidad nasal; cáncer de paratiroides; cáncer de pene; cáncer de faringe; feocromocitoma; astrocitoma pineal; germinoma pineal; tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia; pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales; tumor hipofisario; adenoma hipofisario; neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple; blastoma pleuropulmonar; linfoma primario del sistema nervioso central; cáncer de próstata; cáncer de recto; carcinoma de células renales (cáncer de riñón); pelvis renal y uréter, cáncer de células de transición; carcinoma del tracto respiratorio que implica el gen NUT en el cromosoma 15; retinoblastoma; rabdomiosarcoma, infancia; cáncer de glándulas salivales; sarcoma, familia de tumores de Ewing; síndrome de Sézary; cáncer de piel (melanoma); cáncer de piel (no melanoma); cáncer de pulmón microcítico; cáncer de intestino delgado sarcoma de tejidos blandos; sarcoma de tejidos blandos; tumor de la médula espinal; carcinoma de células escamosas; cáncer de cuello escamoso con primario oculto, metastásico; cáncer de estómago (gástrico); tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial; linfoma cutáneo de células T (micosis fungoide y síndrome de Sezary); cáncer testicular; cáncer de garganta; timoma; timoma y carcinoma tímico; cáncer de tiroides; cáncer de tiroides infantil; cáncer de células de transición de la pelvis renal y uréter; cáncer de uretra; cáncer de útero, endometrio; sarcoma uterino; cáncer de vagina; cáncer de vulva; y tumor de Wilms.

9. La partícula de arenavirus para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6 a 8, o la composición farmacéutica para uso o el kit para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde dicho método comprende:

(i) coadministrar simultáneamente dicha partícula de arenavirus y dicho inhibidor del punto de control inmunitario;

(ii) administrar dicha partícula de arenavirus antes de la administración de dicho inhibidor de punto de control inmunitario, o administrar dicha partícula de arenavirus después de la administración de dicho inhibidor de punto de control inmunitario, opcionalmente en donde el intervalo entre la administración de dicha partícula de arenavirus y dicho inhibidor de punto de control inmunitario es de aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 8 días, aproximadamente 9 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 13 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses o más;

(iii) administrar dicha partícula de arenavirus y dicho inhibidor de punto de control inmunitario en una cantidad terapéuticamente eficaz; o

(iv) administrar a dicho sujeto una primera partícula de arenavirus, y administrar a dicho sujeto, después de un período de tiempo, una segunda partícula de arenavirus, en donde opcionalmente dicha primera partícula de arenavirus y dicha segunda partícula de arenavirus derivan de diferentes especies de arenavirus y/o comprenden secuencias de nucleótidos que codifican diferentes antígenos tumorales, antígenos asociados a tumores o fragmentos antigénicos de los mismos.

10. La partícula de arenavirus para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6 a 9, la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 6 y 7, el kit de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 6 y 7, o la composición farmacéutica para uso o el kit para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en donde:

(i) la propagación de dicha partícula de arenavirus trisegmentada no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación;

(ii) la propagación de dicha partícula de arenavirus trisegmentada no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de 70 días de infección persistente en ratones que carecen de receptor de interferón tipo I, receptor de interferón tipo II y gen activador de recombinación 1 (RAG1) y que se han infectado con 104 PFU de dicha partícula de arenavirus trisegmentada; o

(iii) la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos S, uniendo dos ORF de arenavirus en solo uno en lugar de dos segmentos separados, anula la actividad del promotor viral.

11. La partícula de arenavirus para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6 a 10, la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 6, 7 y 10, el kit de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 6, 7 y 10, o la composición farmacéutica para uso o el kit para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en donde uno de los dos segmentos S se selecciona del grupo que consiste en:

(iii) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus; (iv) un segmento S, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(v) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus; y (vi) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus.

12. La partícula de arenavirus para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6 a 11, la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 6, 7, 10 y 11, el kit de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 6, 7, 10 y 11, o la composición farmacéutica para uso o el kit para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en donde los dos segmentos S comprenden:

(i) una o dos secuencias de nucleótidos, cada una de las cuales codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo;

(ii) uno o dos ORF de arenavirus duplicados; o

(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo y un ORF de arenavirus duplicado.

13. La partícula de arenavirus para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6 a 12, la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 6, 7 y 10 a 12, el kit de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 6, 7 y 10 a 12, o la composición farmacéutica para uso o el kit para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en donde dicha partícula de arenavirus comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores, opcionalmente donde dicho péptido, polipéptido o proteína inmunomoduladores se selecciona del grupo que consiste en:

(i) calreticulina (CRT), o un fragmento de la misma;

(ii) ubiquitina o un fragmento de la misma;

(iii) factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), o un fragmento del mismo;

(iv) cadena invariable (CD74) o un fragmento antigénico de la misma;

(v) proteína de choque térmico 70 de Mycobacterium tuberculosis o un fragmento antigénico de la misma;

(vi) proteína VP22 del virus del herpes simplex 1 o un fragmento antigénico de la misma;

(vii) ligando de CD40 o un fragmento antigénico del mismo; y

(viii) ligando de tirosina quinasa 3 relacionado con Fms (Flt3) o un fragmento antigénico del mismo.

14. La partícula de arenavirus para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6 a 13, la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 6, 7 y 10 a 13, el kit de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 6, 7 y 10 a 13, o la composición farmacéutica para uso o el kit para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, en donde dicha partícula de arenavirus deriva del virus de la coriomeningitis linfocítica (''LCMV") o virus Junín (''JUNV''), en donde opcionalmente dicho LCMV es la cepa MP, cepa WE, cepa Armstrong o cepa Armstrong Clon 13, y dicho JUNV es la cepa Candid n°1 de la vacuna JUNV, o la cepa XJ Clon 3 de la vacuna JUNV.

15. La partícula de arenavirus para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6 a 14, la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 6, 7 y 10 a 14, el kit de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 6, 7 y 10 a 14, o la composición farmacéutica para uso o el kit para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14, en donde el crecimiento o la infectividad de dicha partícula de arenavirus no están afectados por dicha secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno tumoral, antígeno asociado a tumor o un fragmento antigénico del mismo.

16. La partícula de arenavirus para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6 a 15, o la composición farmacéutica para uso o el kit para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 15, en donde dicha partícula de arenavirus codifica

(i) un neoantígeno, opcionalmente en donde dicho neoantígeno es glucoquinasa dependiente de ADP (Adpgk) que tiene una mutación R203M, además opcionalmente en donde dicho sujeto padece cáncer de colon; o

(ii) un antígeno de melanoma, opcionalmente en donde dicho antígeno de melanoma es la glicoproteína 100 (GP100), proteína relacionada con tirosinasa 1 (TRP1) o proteína relacionada con tirosinasa 2 (TRP2), además opcionalmente en donde dicho sujeto padece melanoma.