ES2914692T3

ES2914692T3 - Células madre adhesivas derivadas de cordón umbilical mejoradas, método de preparación para las mismas, y uso de las mismas

Info

Publication number: ES2914692T3
Application number: ES16835478T
Authority: ES
Inventors: Jeong Min Shin; Ji Min Yu; Jihye Kim; Ahreum Kang; Hye Sun Kim
Original assignee: Cha Biotech Co Ltd
Current assignee: Cha Biotech Co Ltd
Priority date: 2015-08-12
Filing date: 2016-08-12
Publication date: 2022-06-15
Anticipated expiration: 2036-08-12
Also published as: EP3336176A1; US20180236007A1; KR20170020273A; US11690877B2; JP6921249B2; JP2018522576A; EP3336176A4; JP2020072725A; EP3336176B1; JP6648259B2; KR102414662B1; CN108138137A; KR20190017006A

Abstract

Células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas que tienen las siguientes características (a) a (g): a) tener un nivel de expresión más alto de TAGLN, COL1A1, IGFBP4, STC1, LRRC17, y IL33, en comparación con células madre de médula ósea; b) tener un nivel de expresión más bajo de TPMT, NAGK, ANXA4, CCND1, SERPINE1, PRNP, y CYP1B1, en comparación con células madre de médula ósea; c) mantener la morfología de fibroblastos adherentes durante subcultivo; d) tener la capacidad de diferenciarse para dar adipocitos, osteocitos, o condrocitos; e) tener características de antígeno de superficie Oct4-, SSEA4+, Tra-1-60-, CD11c-, CD8a-, CD200+, CD3- , CD1a-, CD16-, CD86-, CD40-, CD141+, CD61+, CD87+ y MIC A/B-; f) tener un nivel de expresión más alto de uno o más seleccionados del grupo que consiste en S100A10, BNIP3, IGFBP5, NDUFA4L2, DPYD, y SCARA3, en comparación con las cultivadas en condición de normoxia; y g) tener un nivel de expresión más bajo de uno o más seleccionados del grupo que consiste en IL8, ALDH1A1, DLC1, CTHRC1, y CPA4, en comparación con las cultivadas en condición de normoxia.

Description

DESCRIPCIÓN

Células madre adhesivas derivadas de cordón umbilical mejoradas, método de preparación para las mismas, y uso de las mismas

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas, un método de preparación de las mismas, y uso de las mismas.

Antecedentes de la técnica

Un agente terapéutico celular es un fármaco usado con el propósito de prevenir o tratar una enfermedad específica mediante el cambio de características de las células mediante un método de proliferación o selección de células ex vivo para restaurar las funciones de células y tejidos, y recientemente ha recibido mucha atención en los campos de enfermedades intratables y medicamentos regenerativos. Los agentes terapéuticos celulares pueden clasificarse en agentes terapéuticos de células somáticas y agentes terapéuticos de células madre según el grado de diferenciación, y los agentes terapéuticos de células madre pueden clasificarse en agentes terapéuticos de células madre embrionarias y agentes terapéuticos de células madre adultas.

Hasta ahora, la mayoría de los estudios con respecto a células madre adultas se han realizado en la médula ósea. En algunos casos, se cultivan y administran células madre aisladas de tejido adiposo o sangre del cordón umbilical. Sin embargo, células madre se recogen de la médula ósea y el tejido adiposo mediante métodos invasivos, y las células madre aisladas de pacientes en la edad adulta o la senescencia tienen una capacidad de diferenciación y proliferación reducida. Aunque la sangre del cordón umbilical es fácil de recoger, el contenido de células madre en la sangre del cordón umbilical es bajo.

A diferencia de células derivadas de tejido adiposo o médula ósea, las del cordón umbilical (CU) no es invasivo y son fáciles de extraer porque se extraen de tejidos ya separados del cuerpo. A diferencia de las células madre derivadas de embriones, el Cu está libre de cuestiones éticas. Recientemente, el CU ha recibido mucha atención como material útil para enfermedades intratables o medicamentos regenerativos. Dado que las células derivadas de CU son células primitivas que satisfacen las capacidades de proliferación y diferenciación al mismo tiempo, existen ventajas de que pueden usarse para la regeneración de órganos y también usarse después de la diferenciación según características de los órganos. Sin embargo, el CU es un tejido en el que están presentes muchos tipos diferentes de células, y, por lo tanto, se requieren estudios para descubrir células óptimas como agentes terapéuticos y para demostrar nuevas características de células que pueden separarse o extraerse como poblaciones celulares homogéneas.

Descripción detallada de la invención

Un aspecto proporciona células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas o poblaciones celulares de las mismas.

Otro aspecto proporciona un método para preparar las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas, incluyendo el método someter a cultivo adherente un cordón umbilical aislado en una placa de cultivo; aislar células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas poniendo en contacto el cordón umbilical cultivado con una enzima de disociación; subcultivar las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas aisladas en un medio que contiene factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF-4) y heparina.

Otro aspecto más proporciona una composición farmacéutica que incluye las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas, las poblaciones celulares de las mismas, o un cultivo de las mismas como principio activo.

Problema técnico

Solución técnica

Un aspecto proporciona células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas.

Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas tienen las características (a) a (e):

a) tener un nivel de expresión más alto de COL1A1, IGFBP4, TAGLN, STC1, LRRC17, y IL33, en comparación con células madre de médula ósea;

b) tener un nivel de expresión más bajo de TPMT, NAGK, ANXA4, CCND1, SERPINE1, PRNP, y CYP1B1, en comparación con células madre de médula ósea;

c) mantener la morfología de fibroblastos adherentes durante subcultivo;

d) tener la capacidad de diferenciarse para dar adipocitos, osteocitos, o condrocitos; y

e) tener antígeno de superficie Oct4-, CD200+, Tra-1-60-, CD3-, CD1a-, CD11c-, CD16-, CD86-, CD8a-, CD40-, CD141+, CD61+, CD87+, MIC A/B-, y SSEA4+.

Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas tienen además las características (f) a (g):

f) tener un nivel de expresión más alto de uno o más seleccionados del grupo que consiste en S100A10, BNIP3, IGFBP5, NDUFA4L2, DpYD, y SCARA3, en comparación con las cultivadas en condición de normoxia; y

g) tener un nivel de expresión más bajo de uno o más seleccionados del grupo que consiste en IL8, ALDH1A1, DLC1, CTHRC1, y CPA4, en comparación con las cultivadas en condición de normoxia.

Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas pueden tener además: h) un nivel de expresión más alto de uno o más seleccionados del grupo que consiste en SNCA, DSG2, NRP2, y PLAT, en comparación con células madre de médula ósea.

Las características de antígeno de superficie e) de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas pueden incluir además Nanog-. Además, CD61+ de las características de antígeno de superficie e) pueden ser una característica de antígeno de superficie de sobreexpresarse en una condición de hipoxia.

El término “cordón umbilical”, como se usa en el presente documento, se refiere a un tubo que conecta la madre y el vientre para permitir que el feto de mamífero crezca en la placenta, y generalmente se refiere a un tejido compuesto por tres vasos, es decir, dos arterias umbilicales y una vena umbilical, que están rodeadas por gelatina de Wharton. Por lo tanto, en la presente divulgación, las “células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas (células madre adherentes de cordón umbilical potenciadas)” o las “células madre adherentes derivadas de cordón umbilical (células madre adherentes de cordón umbilical)” se refieren a células que se derivan del cordón umbilical o del tejido de gelatina de Wharton del cordón umbilical y tienen la capacidad de diferenciarse para dar muchas células diferentes y una característica de crecimiento adherente en la superficie de una placa de cultivo.

Al menos aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 98 %, o aproximadamente un 99 % de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas proporcionadas en la presente invención pueden expresar marcador de superficie positivo para CD200, CD141, CD61, CD87, o SSEA4, que es un marcador celular expresado en la superficie celular, y al menos aproximadamente un 70 % o menos, al menos aproximadamente un 60 % o menos, al menos aproximadamente un 50 % o menos, al menos aproximadamente un 40 % o menos, al menos aproximadamente un 30 % o menos, al menos aproximadamente un 20 % o menos, al menos aproximadamente un 10 % o menos, al menos aproximadamente un 5 % o menos, o al menos aproximadamente un 1 % o menos de las mismas pueden expresar marcador de superficie negativo para Oct4, Nanog, Tra-1-60, CD3, CD1a, CD11c, CD16, CD86, CD8a, MIC A/B, o CD40 que es un marcador de células madre. El término “positivo”, como se usa en el presente documento, con respecto a un marcador de células madre, significa que el marcador celular existe en una gran cantidad o una alta concentración, en comparación con la de otras células no madre como referencia. Es decir, cualquier marcador está presente dentro o sobre la superficie de una célula, y, por lo tanto, si una célula puede distinguirse de uno o más tipos de células usando el marcador, la célula puede ser positiva para el marcador. Además, el término “positivo” significa que las células tienen señales de intensidad más alta que una intensidad de fondo, por ejemplo, las células tienen el marcador en una cantidad suficiente para poder detectarse en un dispositivo de medición celular. Por ejemplo, las células pueden etiquetarse de manera detectable con anticuerpos específicos de CD200, y cuando las señales de estos anticuerpos son detectablemente más intensas que las de un control (por ejemplo, intensidad de fondo), las células son “CD200+”. El término “negativo”, como se usa en el presente documento, significa que aunque se usan anticuerpos específicos para un marcador de superficie celular particular, el marcador no puede detectarse, en comparación con la intensidad de fondo. Por ejemplo, si una célula no puede etiquetarse de manera detectable con un anticuerpo específico de CD3, la célula es “CD3-”.

Las características inmunológicas anteriores pueden determinarse mediante métodos comunes conocidos en la técnica a los que pertenece la presente divulgación. Por ejemplo, pueden usarse diversos métodos tales como citometría de flujo, tinción inmunohistoquímica, RT-PCR, etc....

Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas tienen un nivel de expresión más alto de COL1A1, IGFBP4, TAGLN, STC1, LRRC17 y IL33, en comparación con células madre derivadas de médula ósea. Los genes altamente expresados en las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica, en comparación con las células madre derivadas de médula ósea, pueden incluir además S100A10, SQSTM1, DSTN, DCN, PHGDH, FBLN1, MFGE8, HLA-A, VASN, o KIAA1199. No hay informes sobre la asociación entre los genes anteriores y las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas. Una diferencia en los niveles de expresión de los genes entre las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica y las células madre derivadas de médula ósea puede ser dos veces o más alta. La diferencia en los niveles de expresión puede determinarse mediante, por ejemplo, comparación de los niveles de expresión génica a un nivel de ARNm. Además, la diferencia en los niveles de expresión puede determinarse mediante, por ejemplo, análisis de micromatrices.

Además, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas tienen un nivel de expresión más bajo de TPMT, NAGK, ANXA4, CCND1, SERPINE1, PRNP, y CYP1B1, en comparación con células madre derivadas de médula ósea. Los genes o proteínas expresados débilmente en las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica, en comparación con las células madre derivadas de médula ósea, pueden incluir MTA2A, TM4SF1, HIST1H4C, y NME1. No hay informes sobre la asociación entre los genes o proteínas anteriores y las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas. Una diferencia en los niveles de expresión de los genes o las proteínas entre las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica y las células madre derivadas de médula ósea puede ser dos veces o más alta. La diferencia en los niveles de expresión puede determinarse mediante, por ejemplo, la comparación de los niveles de expresión génica a un nivel de ARNm. Además, la diferencia en los niveles de expresión puede determinarse mediante, por ejemplo, análisis de micromatrices.

Además, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas tienen una morfología de fibroblastos en subcultivo. En una realización específica, las células pueden tener la propiedad de que las células requieran adhesión a la superficie para crecer in vitro, y pueden exhibir una morfología específica de fibroblastos en forma de huso.

En otra realización específica, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas pueden tener capacidad de formación de colonias. Las células pueden tener una alta capacidad de formación de colonias, en comparación con las cultivadas en condición de normoxia.

Además, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas tienen la capacidad de diferenciarse para dar adipocitos, osteocitos, condrocitos. Pueden inducirse a las células a diferenciarse para dar linajes celulares particulares, por ejemplo, adipocitos, condrocitos, osteoblastos, células hematopoyéticas, miocitos, células vasculares, neuronas, o hepatocitos.

El término “diferenciación”, como se usa en el presente documento, se refiere a un proceso por el cual células pasan a estar más especializadas en estructura o función durante el crecimiento celular a través de la división y proliferación, es decir, un proceso mediante el cual células, tejidos, etc. de un cambio de forma o función del organismo vivo para realizar la tarea dada. La determinación de la diferenciación para dar linajes celulares particulares puede lograrse mediante métodos bien conocidos en la técnica, y la diferenciación para dar células particulares puede inducirse a través de los métodos conocidos. Además, la diferenciación puede confirmarse midiendo cambios en marcadores de superficie celular (por ejemplo, tinción de células con anticuerpos específicos de tejido o específicos de marcador celular) y morfología usando técnicas tales como citometría de flujo o inmunocitoquímica, o examinando la morfología de células usando un microscopio óptico o un microscopio confocal, o midiendo cambios en la expresión génica usando técnicas bien conocidas en la técnica, tales como PCR y elaboración de perfiles de expresión génica.

Además, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas pueden secretar IL-6, IL-8, G-CSF, GM-CSF, MCP-3, VEGF, GRO, IFNy, IL-1a, IL-1b, IL-1ra, IL-3, IL-4, IL-7, IL-9, IL-12(p40), IL12(P70), IL-13, IL-14, IFNa2, MDC, sIL-2Ra, Eotaxina, ligando de Flt-3, MCP-1, MIP-1a, MIP1b, RANTE, fractalquina, IP-10, EGF, FGF-2, IGF-1 SR, EpCAM, IGFBP3, o una combinación de estas proteínas. Además, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas pueden secretar, por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más seleccionados del grupo que consiste en IL-6, IL-8, G-CSF, GM-CSF, MCP-3, VEGF, y GRO, y todas las proteínas.

Además, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas cultivadas en una condición de hipoxia pueden tener un nivel de expresión aumentado de uno o más genes o proteínas seleccionados del grupo que consiste en S100A10, BNIP3, IGFBP5, PGK1, TPI1, DCN, PGM1, PFKFB3, LOC644774, MME, MIR1978, SLC2A3, BHLHB2, BNIP3L, IGFBP5, NDUFA4L2, DPYD, y SCARA3, en comparación con las cultivadas en condición de normoxia. Específicamente, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas cultivadas en una condición de hipoxia pueden tener un nivel de expresión aumentado de dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, o seis o más genes o proteínas seleccionados del grupo que consiste en S100A10, BNIP3, IGFBP5, PGK1, TPI1, DCN, PGM1, PFKFB3, LOC644774, MME, MIR1978, SLC2A3, BHLHB2, BNIP3L, IGFBP5, NDUFA4L2, DPYD, y SCARA3, o nivel de expresión aumentado de todos los genes o proteínas, en comparación con las cultivadas en condición de normoxia. No hay informes sobre la asociación entre los genes o proteínas anteriores y las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas. Una diferencia en los niveles de expresión puede ser dos veces o más alta. La diferencia en los niveles de expresión puede determinarse mediante, por ejemplo, la comparación de los niveles de expresión de genes y proteínas a nivel de ARNm o a nivel de proteína. Además, la diferencia en los niveles de expresión puede determinarse mediante, por ejemplo, análisis de micromatrices y análisis proteómico.

Además, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas cultivadas en una condición de hipoxia pueden tener un nivel de expresión disminuido de uno o más genes o proteínas seleccionados del grupo que consiste en IL8, ALDH1A1, NQO1, DLC1, CTHRC1, y CPA4, en comparación con las cultivadas en condición de normoxia. Específicamente, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas cultivadas en una condición de hipoxia pueden tener un nivel de expresión disminuido de dos o más o tres o más genes o proteínas seleccionados del grupo que consiste en IL8, ALDH1A1, NQO1, DLC1, CTHRC1 y CPA4, o nivel de expresión disminuido de todos los genes o proteínas, en comparación con las cultivadas en condición de normoxia. No hay informes sobre la asociación entre los genes o proteínas anteriores y las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas. Una diferencia en los niveles de expresión puede ser dos veces o más alta. La diferencia en los niveles de expresión puede determinarse mediante, por ejemplo, la comparación de los niveles de expresión de genes y proteínas a nivel de ARNm o a nivel de proteína. Además, la diferencia en los niveles de expresión puede determinarse mediante, por ejemplo, análisis de micromatrices y análisis proteómico.

Otro aspecto proporciona poblaciones celulares de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas.

Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical son las mismas que las descritas anteriormente.

Otro aspecto más proporciona un método para preparar las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas, incluyendo el método someter a cultivo adherente un cordón umbilical aislado en una placa de cultivo; aislar células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas poniendo en contacto el cordón umbilical cultivado con una enzima de disociación; subcultivar las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas aisladas en un medio que contiene factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF-4) y heparina.

El cordón umbilical puede ser un cordón umbilical que está separado de una madre sana (por ejemplo, madre negativa para VIH, VHC, VHB) después del parto. Es decir, el “cordón umbilical separado” puede referirse a un cordón umbilical separado del cuerpo de la madre después del parto. El cordón umbilical separado puede almacenarse en un contenedor estéril con hielo inmediatamente después de separarse.

Un método para separar y obtener el cordón umbilical de la placenta puede incluir, por ejemplo, separar el cordón umbilical de la placenta separada; retirar sangre externa del cordón umbilical separado; retirar arterias y venas del cordón umbilical con la sangre retirada; y/o cortar el cordón umbilical, a partir de lo que se retiran la arteria y la vena, en un tamaño predeterminado (por ejemplo, de 1 mm a 20 mm). La retirada de la sangre puede realizarse usando DPBS sin Ca/Mg, o DPBS sin Ca/Mg que contiene gentamicina.

A continuación, Pueden aislarse células madre a partir del cordón umbilical que se corta en un tamaño pequeño (por ejemplo, cordón umbilical separado). El aislamiento de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas puede incluir el cultivo adherente del cordón umbilical separado en una placa de cultivo durante de 5 días a 20 días, por ejemplo, de 10 días a 20 días, por ejemplo, durante de 10 días a 15 días; confirmación de que las células se extienden a partir del tejido de cordón umbilical cultivado; y/o tratamiento del tejido del cordón umbilical con una enzima de disociación.

La enzima de disociación puede incluir colagenasa. La colagenasa puede referirse a una enzima que escinde enlaces peptídicos de colágeno, y puede incluir colagenasa tipo I, tipo II, tipo III, tipo IV, o una combinación de las mismas. Además, la enzima de disociación puede incluir colagenasa de 5 U/ml a 30 U/ml, por ejemplo, de 5 U/ml a 25 U/ml, de 10 U/ml a 25 U/ml, o de 20 U/ml. Además, la enzima de disociación puede incluir tripsina, y/o dispasa. Además, una disolución que incluye la enzima de disociación puede incluir agua, solución salina, por ejemplo, HBSS (solución salina equilibrada de Hank) que contiene colagenasa, tripsina, y/o dispasa. Además, un tiempo de tratamiento de la enzima de disociación puede ser, por ejemplo, de 1 hora a 20 horas, de 2 horas a 10 horas, de 4 horas a 9 horas, o de 5 horas a 6 horas.

En una realización específica, la reacción entre el tejido y la enzima de disociación puede permitirse en agitación, y puede realizarse la agitación, por ejemplo, a de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 40 °C, de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 40 °C, o de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 40 °C, por ejemplo, a aproximadamente 37 °C, durante de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 60 minutos o de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 30 minutos, por ejemplo, durante de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 30 minutos dos veces.

Adicionalmente, después de la reacción del tejido y la enzima de disociación, puede realizarse adicionalmente un proceso de inactivación de la enzima de disociación, y, por ejemplo, la reacción enzimática puede terminarse añadiendo FBS. Además, un método de aislamiento de células de tejido, por ejemplo, células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas a partir de la disolución de reacción enzimática puede realizarse mediante un método común conocido en la técnica. Por ejemplo, después de la centrifugación, las células pueden aislarse usando un filtro de células.

El término “aislamiento de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas”, como se usa en el presente documento, significa retirada de al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de células normalmente asociadas con las células madre en un cordón umbilical de mamífero no tratado. Puede decirse que poblaciones celulares que contienen células madre obtenidas de un órgano “están aisladas”, cuando otras células normalmente asociadas con las células madre en el órgano no tratado son inferiores al 50 % de la totalidad de células.

A continuación, el subcultivo puede realizarse tomando las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas aisladas como P0.

El subcultivo puede incluir además tratar la enzima recombinante sin componentes animales (ACF) antes del trasplante celular para el subcultivo. El término “enzima sin componentes animales”, como se usa en el presente documento, significa que la enzima se origina a partir de un ser vivo no animal, lo que significa que la enzima no se purifica a partir de una fuente de suministro animal. La enzima sin componentes animales puede originarse a partir de recombinación, por ejemplo, originada a partir de bacterias, levaduras, o plantas. La enzima originada a partir de recombinación puede significar cualquier enzima producida por tecnología de ADN recombinante, incluyendo el uso de microorganismos, por ejemplo, bacterias, virus, levaduras, plantas, etc. La enzima puede ser tripsina recombinante sin componentes animales, por ejemplo, tripsina recombinante producida en maíz. La tripsina recombinante sin componentes animales está disponible comercialmente, y, por ejemplo, puede ser TrypLE™ Select (GIBCO Invitrogen), TrypLE™ Express (GIBCO Invitrogen), TrypZean™ (Sigma Aldrich), o Recombinant Trypsin Solution™ (Biological Industries).

El subcultivo puede incluir cultivar las células en un medio de cultivo de células madre, por ejemplo, en un medio enriquecido con factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-4) y heparina. Una concentración de f GF-4 en el medio puede ser de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 40 ng/ml, o de aproximadamente 20 ng/ml a aproximadamente 30 mg/ml, por ejemplo, 25 ng/ml. Una concentración de heparina en el medio puede ser de aproximadamente 0,5 |ig/ml a aproximadamente 2 |ig/ml, o de aproximadamente 0,5 |ig/ml a aproximadamente 1,5 |ig/ml, por ejemplo, de aproximadamente 1 |ig/ml. El medio puede incluir además, por ejemplo, suero bovino fetal y antibióticos (por ejemplo, penicilina, estreptomicina, gentamicina, etc.). En una realización específica, pueden usarse un medio CS-CM enriquecido con suero bovino fetal al 10 %, 50 |ig/ml de gentamicina, 1 |ig/ml de heparina, y 25 ng/ml de FGF-4. El subcultivo puede realizarse de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 40 °C, de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 40 °C, o de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 40 °C, por ejemplo, a aproximadamente 37 °C, y puede ser un tiempo de cultivo para cada subcultivo, por ejemplo, de 2 días a 7 días, o de 3 días a 5 días.

En el método para preparar las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica, un número de pases del subcultivo no está particularmente limitado, y el número de pases puede seleccionarse apropiadamente según el número deseado de células proliferantes. Comúnmente, el número de paso puede ser al menos 1 paso o más, o 10 pases o más. Por ejemplo, pueden realizarse de 1 pase a 20 pases o de 3 pases a 15 pases para obtener el número acumulativo clínicamente requerido de células proliferantes.

Además, tras el subcultivo, el tratamiento de la enzima recombinante sin componentes animales también puede realizarse adicionalmente como se describió anteriormente. Es decir, en cada fase de subcultivo antes del subcultivo de las células a la siguiente fase, las células se trataron con la enzima recombinante sin componentes animales y se recogieron para aumentar la pureza de las células. Por ejemplo, la enzima recombinante sin componentes animales puede tratarse antes de transferir las células para P2 en la fase desde P1 hasta P2.

El subcultivo puede ser subcultivo en una condición de hipoxia a un nivel de oxígeno más bajo que la condición de normoxia del 21 %. El término “hipoxia” significa una presión parcial de oxígeno más baja a una presión parcial de oxígeno del 21 %, que es una condición de normoxia general. La condición de hipoxia puede ser una condición que tiene una presión parcial de oxígeno del 1 % al 15 %, del 1 % al 12 %, del 1 % al 10 %, o del 1 % al 5 %, por ejemplo, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 % o 9 %.

En una realización específica, cuando las células se subcultivan en condición de hipoxia, un nivel de expresión de uno o más seleccionados del grupo que consiste en S100A10, BNIP3, IGFBP5, p Gk 1, TPI1, DCN, p Gm 1, PFKFB3, LOC644774, MME, MIR1978, SLC2A3, BHLHB2, BNIP3L, IGFBP5, NDUFA4L2, DPYD, y SCARA3 puede aumentarse, o un nivel de expresión de uno o más seleccionados del grupo que consiste en IL8, ALDH1A1, NQO1, DLC1, CTHRC1, y CPA4 puede disminuirse, en comparación con las subcultivadas en condición de normoxia.

Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas preparadas mediante el método de preparación anterior pueden tener las características descritas anteriormente, y, por ejemplo, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas preparadas tienen las características (a) a (e):

c) mantener la morfología de fibroblastos adherentes durante subcultivo;

e) tener características de antígeno de superficie Oct4-, CD200+, Tra-1-60-, CD3-, CD1a-, CD11c-, CD16-, CD86-, CD8a-, CD40-, CD141+, CD61+, CD87+, MIC A/B-, y SSEA4+.

Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas tienen además las características (f) a (g): f) tener un nivel de expresión más alto de uno o más seleccionados del grupo que consiste en S100A10, BNIP3, IGFBP5, NDUFA4L2, DpYD, y SCARA3, en comparación con aquellas en condición de normoxia;

g) tener un nivel de expresión más bajo de uno o más seleccionados del grupo que consiste en IL8, ALDH1A1, DLC1, CTHRC1, y CPA4, en comparación con aquellas en condición de normoxia;

Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas pueden tener además la característica: h) tener un nivel de expresión más alto de uno o más seleccionados del grupo que consiste en SNCA, DSG2, NRP2, y PLAT, en comparación con células madre de médula ósea.

Otro aspecto más proporciona un agente terapéutico celular, o una composición o agente farmacéutico que incluye las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas, las poblaciones celulares de las mismas, o un cultivo de las mismas como principio activo.

Otro aspecto más proporciona las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas, las poblaciones celulares de las mismas, o el cultivo de las mismas para su uso en la preparación del agente terapéutico celular, o la composición o agente farmacéutico.

Por ejemplo, se proporciona el agente terapéutico celular, o la composición o agente farmacéutico que incluye las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas que tienen las características (a) a (e), o las poblaciones celulares de las mismas:

c) mantener la morfología de fibroblastos adherentes durante subcultivo;

g) tener un nivel de expresión más bajo de uno o más seleccionados del grupo que consiste en IL8, ALDH1A1, DLC1, CTHRC1, y CPA4, en comparación con aquellas en condición de normoxia.

Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas pueden tener además la característica h) tener un nivel de expresión más alto de uno o más seleccionados del grupo que consiste en SNCA, DSG2, NRP2, y PLAT, en comparación con células madre de médula ósea.

Además, el aspecto anterior incluye una composición farmacéutica que incluye el cultivo de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas. Además, se proporciona, por ejemplo, una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades inflamatorias, enfermedades isquémicas, y/o enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la composición farmacéutica las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas, las poblaciones celulares de las mismas, o el cultivo de las mismas como principio activo.

Otro aspecto más proporciona las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas, las poblaciones celulares de las mismas, o el cultivo de las mismas para su uso en la preparación de un fármaco para tratar o prevenir una enfermedad, por ejemplo, enfermedades inflamatorias, enfermedades isquémicas, y/o enfermedades neurodegenerativas.

Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas son las mismas que las descritas anteriormente.

Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica pueden liberar proteínas (por ejemplo, IL-6, IL-8, G-CSF, GM-CSF, MCP-3, VEGF, o GRO) que son ventajosas para el tratamiento de enfermedades como se describió anteriormente y pueden tener una capacidad notable para migrar a tejidos dañados, así como efectos antiinflamatorios, de regeneración vascular, y de regeneración nerviosa. Por lo tanto, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas pueden aplicarse de manera útil a un agente terapéutico celular o una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de diversas enfermedades, incluyendo enfermedades inflamatorias, enfermedades isquémicas, y/o enfermedades neurodegenerativas.

Ejemplos de las enfermedades pueden incluir enfermedades inflamatorias, enfermedades isquémicas, y/o enfermedades neurodegenerativas. Ejemplos de las enfermedades inflamatorias pueden incluir bronquitis, gastritis, arteriosclerosis, artritis, enfermedad intestinal inflamatoria (EII), hepatitis, colecistitis, infecciones fúngicas, úlcera gástrica, asma, dermatitis atópica, tendinitis o nefritis. Ejemplos de las enfermedades isquémicas pueden incluir accidente cerebrovascular isquémico, infarto de miocardio, enfermedad cardíaca isquémica, enfermedad cerebral isquémica, insuficiencia cardíaca isquémica, enteritis isquémica, enfermedad vascular isquémica, enfermedad ocular isquémica, retinopatía isquémica, glaucoma isquémico, insuficiencia renal isquémica, o enfermedad de una extremidad isquémica. El “accidente cerebrovascular isquémico” o “accidente cerebrovascular” puede referirse a una enfermedad causada por tejidos o células cerebrales necróticas resultantes de la reducción del flujo sanguíneo cerebral durante un determinado período de tiempo o más, y puede usarse indistintamente con “infarto cerebral”.

Ejemplos de enfermedades neurodegenerativas pueden incluir lesión de médula espinal, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal, parálisis supranuclear progresiva, degeneración corticobasal, enfermedad de Pick, o demencia pugilística, (DP).

Una dosificación del agente terapéutico celular o la composición farmacéutica según una realización específica puede ser de 1,0 x 103 a 1,0 x 1010 células/kg (peso corporal) o sujeto, o de 1,0 x 107 a 1,0 x 108 células/kg (peso corporal) o sujeto, basándose en las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas. Sin embargo, la dosificación puede prescribirse de manera diversa dependiendo de diversos factores tales como un método de formulación, un modo de administración, la edad del paciente, peso corporal, sexo, afecciones patológicas, dieta, un tiempo de administración, una vía de administración, una tasa de excreción, y sensibilidad a la reacción, y los expertos en la técnica pueden ajustar adecuadamente la dosificación, considerando estos factores. La frecuencia de administración puede estar una o dos veces o más dentro del intervalo clínicamente permitido de efectos secundarios, y la administración puede darse a un sitio o dos o más sitios. La dosificación por kg o por sujeto para animales no humanos puede ser la misma que para seres humanos, o puede convertirse a partir de la dosificación descrita anteriormente, por ejemplo, basándose en una relación de volumen (por ejemplo, valor medio) entre órganos (corazón, etc.) de los sujetos humanos y animales. Animales a tratar según una realización específica pueden ser ejemplificados por seres humanos y otros mamíferos deseados, y específicamente, pueden incluir seres humanos, monos, ratones, ratas, conejos, ovejas, vacas, perros, caballos, cerdos, etc.

El agente terapéutico celular o la composición farmacéutica según una realización específica puede incluir las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas y portadores y/o aditivos farmacéuticamente aceptables como principio activo, y, por ejemplo, pueden incluir agua esterilizada, solución salina fisiológica, un tampón estándar (por ejemplo, ácido fosfórico, ácido cítrico, u otros ácidos orgánicos), un estabilizador, una sal, un antioxidante (por ejemplo, ácido ascórbico, etc.), un tensioactivo, un agente de suspensión, un agente isotónico, un conservante, etc. Para administración local, el agente terapéutico celular o la composición farmacéutica se combina preferiblemente con una sustancia orgánica tal como un biopolímero, una sustancia inorgánica tal como hidroxiapatita, específicamente, matriz de colágeno, un polímero o copolímero de ácido poliláctico, un polímero o copolímero de polietilenglicol, y derivados químicos de los mismos. Cuando el agente terapéutico celular o la composición farmacéutica según una realización específica se prepara en una formulación inyectable, pueden disolverse poblaciones celulares en un portador farmacéuticamente aceptable o pueden congelarse en un estado de disolución en el que están disueltas las poblaciones celulares.

Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica pueden usarse en diversos tipos de protocolos terapéuticos para potenciar, tratar, o reemplazar un órgano o un tejido del cuerpo por injerto, trasplante, o inyección de poblaciones celulares deseadas, por ejemplo, células madre o poblaciones celulares derivadas de células madre. Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas pueden usarse para reemplazar o potenciar tejidos existentes de modo que el tejido pueda convertirse en un tejido recién alterado o pueda unirse con un tejido o estructura biológica. Además, en protocolos terapéuticos de uso de células madre derivadas de tejidos distintos del cordón umbilical, la célula madre puede reemplazarse por las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas de la presente divulgación.

El agente terapéutico celular o la composición farmacéutica según una realización específica puede incluir, si es necesario, un agente de suspensión, un adyuvante de solubilización, un estabilizador, un agente isotónico, un conservante, un inhibidor de adsorción, un tensioactivo, un diluyente, un excipiente, un ajustador de pH, un agente analgésico, un tampón, un agente reductor, un antioxidante, etc., dependiendo del modo de administración y la formulación. Además de los descritos anteriormente, portadores y agentes farmacéuticamente aceptables adecuados en la presente divulgación se describen en detalle en una bibliografía [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a ed., 1995].

El agente terapéutico celular o la composición farmacéutica según una realización específica puede formularse en una forma de dosificación unitaria o en un recipiente multidosis usando un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable según un método que puede llevarse a cabo fácilmente por los expertos en la técnica a los que pertenece la presente divulgación. A este respecto, la formulación puede estar en forma de una disolución, una suspensión, o una emulsión en un medio oleoso o acuoso, un polvo, gránulos, un comprimido, o una cápsula. Además, el agente terapéutico celular puede prepararse como una formulación inyectable. En este caso, pueden usarse ingredientes comunes conocidos para la formulación, y la formulación puede prepararse mediante un método común.

Efectos ventajosos de la invención

Células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según un aspecto pueden tener efectos antiinflamatorios, de regeneración vascular, y de regeneración nerviosa, por lo tanto, aplicándose de manera útil a una composición farmacéutica o un agente terapéutico celular para tratar o prevenir diversas enfermedades.

Puede usarse un método para preparar las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según otro aspecto para aumentar la pureza, rendimiento, y tasa de proliferación de células madre de un tejido de cordón umbilical.

Descripción de los dibujos

La figura 1A muestra la morfología celular antes y después del tratamiento de una enzima de disociación en el aislamiento de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica; la figura 1B muestra la morfología celular según el tiempo de tratamiento de la enzima de disociación en el aislamiento de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica, G1: Grupo tratado con Col I, G2: Grupo tratado con Col I después de la unión al tejido;

la figura 2 muestra la comparación entre una condición de hipoxia y una condición de normoxia en el cultivo de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica: 3 %: presión parcial de oxígeno baja (3 % de O²), 21 %: presión parcial de oxígeno normal (21 % de O²);

la figura 3 muestra los resultados del cariotipado para examinar la estabilidad genética de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica;

la figura 4 muestra los resultados del análisis de proteínas de superficie de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica;

la figura 5 muestra los resultados del análisis de multipotencia de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica;

la figura 6 muestra los resultados de comparar y analizar las expresiones de proteínas de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica;

la figura 7A muestra los resultados del análisis de un efecto antiinflamatorio de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica;

la figura 7B muestra los resultados del análisis de un efecto de regeneración vascular de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica; y

la figura 7C muestra los resultados del análisis de un efecto de regeneración nerviosa de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica.

Modo de la invención

A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá con más detalle. Sin embargo, estos ejemplos son solo para fines ilustrativos, y el alcance de la presente invención no pretende que esté limitado por estos ejemplos.

Ejemplo 1: Preparación de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas, caracterización de las mismas, y análisis de efectos antiinflamatorios, de regeneración nerviosa y de regeneración vascular

1. Preparación de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas y comparación según el método de cultivo

(1.1) Aislamiento y cultivo de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas 1

Después de que se firmase un formulario de consentimiento informado por una mujer sana que tuvo un parto de manera normal y recibió directamente información sobre la investigación, se separó un cordón umbilical de un tejido placentario recogido durante la extracción de placenta normal. El cordón umbilical retirado se lavó con DPBS sin Ca/Mg dos o cinco veces para retirar la sangre, y luego se retiraron dos arterias y una vena sin retirar una capa externa de amnios, y luego el cordón umbilical se cortó en un tamaño de 1 mm a 5 mm. A continuación, el cordón umbilical se sometió a cultivo adherente en una placa de cultivo durante de 10 días a 15 días. Después de confirmar que las células se extendieron a partir de los tejidos cultivados, se trataron 200 U/ml de colagenasa I durante de 5 horas a 6 horas para aislar células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas. Antes y después del tratamiento de colagenasa I, la morfología celular se examinó bajo un microscopio óptico a un aumento de 40x, 100x para confirmar que las células se extendieron a partir del tejido adherente del cordón umbilical, y los resultados se muestran en la figura 1A.

la figura 1A muestra la morfología celular antes y después del tratamiento de una enzima de disociación en el aislamiento de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica.

Como se muestra en la figura 1A, después del tratamiento de colagenasa I, que es la enzima de disociación, se observó una morfología celular homogénea.

Posteriormente, las células aisladas como P0 se cultivaron en MEM alfa GlutaMAX (medio CS-CM) que contenía 25 ng/ml de FGF4, 1 ug/ml de heparina, y FBS al 10 % a 37 °C en condiciones de cultivo de hipoxia (3 % de O²). Posteriormente, el medio CS-CM se reemplazó cada de 3 días a 4 días para retirar células que no se adhirieron al fondo del matraz. Se subcultivaron células mediante tratamiento con TrypLE (Invitrogen), que es una enzima recombinante sin componentes animales (ACF), en una incubadora a 37 °C durante un corto tiempo (3 minutos) en un primer pase.

(1.2) Aislamiento y cultivo de células madre adherentes procedentes de cordón umbilical potenciadas 2

Se aislaron células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas y se cultivaron de la misma manera que en (1.1), excepto porque el tratamiento de colagenasa I se realizó antes de unir el cordón umbilical a la placa de cultivo en (1.1).

(1.3) Aislamiento y cultivo de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas 3

Se aislaron células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas y se cultivaron de la misma manera que en (1.1), excepto porque las células madre aisladas en (1.1) se cultivaron en condición de normoxia (21 % de O²).

(1.4) Análisis de comparación según el tiempo de tratamiento de enzima de disociación

Para comparar las tasas de recuperación celular de las células madre aisladas en (1.1) y (1.2), las células madre aisladas en (1.2) y (1.1) se denominaron G1 y G2, respectivamente. La morfología celular de las mismas se examinó bajo un microscopio óptico a un aumento de 40x, 100x y los resultados se muestran en la figura 1B.

La figura 1B muestra la morfología celular según el tiempo de tratamiento de enzima de disociación en el aislamiento de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica.

Además, los pesos de tejido de G1 y G2, se compararon el número de células después del tratamiento de enzima de disociación y el número de células (P0).

[Tabla 1]

Como se muestra en la figura 1B y la tabla 1, cuando la enzima de disociación se trató antes del cultivo del cordón umbilical, la mayoría de células tenían morfología en forma de adoquín y proliferaron lentamente para mostrar un bajo rendimiento celular. Cuando la enzima de disociación se trató después del cultivo del cordón umbilical, las células tenían una morfología celular homogénea y proliferaron rápidamente para mostrar un alto rendimiento celular.

(1.5) Análisis de comparación según las condiciones de hipoxia y normoxia

Para comparar las curvas de crecimiento y los tiempos de duplicación de células adherentes subcultivadas durante de 1 pase a 20 pases (P1 a P20) en una condición de hipoxia (1.1) y una condición de normoxia (1.2), cada uno se sembró del mismo número de células en una placa de 6 pocillos, y las células se recogieron cuando ocuparon el 70 % ~ 80 % del área de la parte inferior de la placa. Posteriormente, se mezclaron 10 pl de la muestra con 10 pl de azul de tripano, y se inyectaron 10 pl de esto en una sección de medición de un hemocitómetro. El número de células se contó usando un contador de células automatizado. En este momento, también se registró el tiempo para calcular el tiempo de duplicación. El tiempo de duplicación, que es un tiempo que tarda una celda en duplicarse, se calculó usando el número total de células y el tiempo en que se midió el número. Los resultados se muestran en las figuras 2A y 2B.

Además, para analizar la capacidad de formación de colonias de las células, 150 células por placa se extendieron en una placa de cultivo de 100 mm, y se cultivaron en 12 ml de medio de cultivo durante de 10 días a 14 días. La formación de colonias celulares se examinó bajo un microscopio. A continuación, las células se lavaron con DPBS, y se añadieron de 2 ml a 3 ml de una disolución mixta de glutaraldehído y cristal violeta a células en la placa y se tiñeron durante 30 minutos. Las células se lavaron cuidadosamente con agua estéril y el número de colonias se contó bajo un microscopio, y se presentó como valores medios para analizar los resultados. Los resultados se muestran en la figura 2C.

Además, para analizar la capacidad de las células para migrar a tejidos dañados, la superficie superior del filtro Transwell se recubrió con 0,1 % de gelatina a 37 °C durante 1 hora. Se suspendieron 5 x 105 células en 100 pl de medio libre de suero, y se sembraron en la cámara superior del inserto Transwell. Antes de la siembra, las células se privaron de alimento en el medio sin suero durante la noche. Se añadieron 600 pl de un medio (CS-CM) que contenía quimiostatos a la cámara inferior. Se cultivaron células en una incubadora durante la noche. Las células restantes en el lado superior del filtro se retiraron usando un hisopo de algodón empapado con PBS frío. El filtro Transwell se cortó usando un bisturí, seguido de tinción de Giemsa. El lado inferior se levantó y se colocó sobre un vidrio de portaobjetos y se montó. Las células migradas se examinaron contando el número de células teñidas bajo un microscopio óptico. Los resultados se muestran en la figura 2D.

La figura 2 muestra la comparación entre una condición de hipoxia y una condición de normoxia en el cultivo de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica. Como se muestra en las figuras 2A y 2B, las células cultivadas en condición de hipoxia mostraron una rápida tasa de proliferación celular de un tiempo de duplicación corto. Además, como se muestra en la figura 2C, el número de colonias aumentó aproximadamente dos veces, y como se muestra en la figura 2D, la capacidad de las células para migrar a tejidos dañados mejoró aproximadamente 1,6 veces.

2. Caracterización de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas

(2.1) Análisis de la estabilidad genética de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas

Con el fin de analizar la estabilidad genética de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas preparadas en (1.1) y (1.3), se realizó análisis de tinción cromosómica GTG.

En detalle, se extrajeron ADN de las células de P7 y P14 usando un kit de extracción de ADN Promega, y se usaron como muestras. Se usó un chip Illumina HumanOmni1-Quad y se usó un escáner iSCAN® para la medición. En primer lugar, se amplificaron 400 ng de cada muestra de ADN mediante amplificación del genoma completo, y se fragmentaron aleatoriamente por un método químico, y después se purificaron por precipitación con 2-propanol. El chip se trató previamente con una disolución tampón, y después se aplicó la muestra de ADN al chip. Después de la incubación durante aproximadamente 16 horas, se realizaron tinción, extensión de cebador específico de alelo (ASPE), hibridación, retirada de dianas, y lavado. Posteriormente, se realizó el escaneo por NluminaiScan, y los datos se analizaron usando un software GenomeStudio®. Los resultados se muestran en la figura 3.

La figura 3 muestra los resultados del cariotipado para examinar la estabilidad genética de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica.

Como se muestra en la figura 3, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas preparadas mediante el método de preparación según una realización específica no mostraron anomalías genéticas hasta que se cultivaron hasta P14.

(2.2) Análisis de proteínas de superficie de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas

Con el fin de analizar las proteínas de superficie de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas preparadas en (1.1), se realizaron citometría de flujo y análisis de tinción de inmunofluorescencia.

En detalle, para citometría de flujo, las células se lavaron con DPBS, y después se hicieron reaccionar con marcadores Tra-1-60, CD3, CD1a, CD11c, CD16, CD14, CD86, CD8a, CD19, CD40, CD80, CD200, CD141, CD61, CD87, MIC A/B, SSEA4 en FBS al 2 % que contiene DPBS en hielo durante 20 minutos. A continuación, se analizaron antígenos de superficie mediante FACS Calibur (Becton Bickinson), y los resultados se muestran en la figura 4A.

Para examinar la expresión de Oct4 y Nanog, que son marcadores de células madre embrionarias, se realizó tinción de inmunofluorescencia. En primer lugar, las células se lavaron con DPBS tres veces, y luego se fijaron con paraformaldehído al 4 % en una placa de cultivo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la fijación, las células se lavaron con DPBS tres veces. A continuación, las células se permearon con disolución de Triton X-100 al 0,2 % a temperatura ambiente durante 10 minutos, y se lavaron con DPBS tres veces. El bloqueo se realizó usando suero de cabra normal al 10 % a temperatura ambiente durante 30 minutos. Anticuerpos primarios (Oct4, Nanog) se añadieron, y se hicieron reaccionar durante la noche a 4 °C en la oscuridad. Posteriormente, las células se lavaron con DPBS tres veces, y se añadieron anticuerpos secundarios a las mismas, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Por último, las células se lavaron con DPBS tres veces, y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia. Los resultados se muestran en la figura 4B.

La figura 4 muestra los resultados del análisis de proteínas de superficie de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica.

Como se muestra en la figura 4A, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica fueron células selectivamente positivas para CD200, CD141, CD61, CD87, SSEA4, y selectivamente negativas para TRA-1, CD3, CD1a, CD11c, CD16, CD86, CD8a, CD40, MIC A/B, y adicionalmente, selectivamente positivas para CD61 en una condición de hipoxia. Además, como se muestra en la figura 4B, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica no expresaron proteínas Oct4 y Nanog que son marcadores específicos de células madre embrionarias.

(2.3) Análisis de capacidad de diferenciación de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas

(2.3.1) Análisis de capacidad de diferenciación de adipocitos

El análisis de la capacidad de diferenciación de adipocitos de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas se realizó de la siguiente manera.

Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas preparadas en (1.1) y (1.3) se cultivaron en un medio de diferenciación de adipogénesis (kit de diferenciación de adipogénesis StemPro®, Life Technology) durante 2 semanas mientras se reemplazaba el medio cada tres días. A continuación, el medio de cultivo se retiró y las células se lavaron con DPBS sin Ca/Mg, y se hicieron reaccionar con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las células se lavaron con isopropanol al 60 % y después se hicieron reaccionar con rojo aceite O durante 10 minutos. A continuación, las células se lavaron con agua purificada, y se observaron adipocitos bajo un microscopio. Los resultados se muestran en la figura 5.

(2.3.2) Análisis de capacidad de diferenciación de osteocitos

El análisis de capacidad de diferenciación de osteocitos de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas se realizó de la siguiente manera.

Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas preparadas en (1.1) y (1.3) se cultivaron en un medio de diferenciación de osteogénesis (kit de diferenciación de osteogénesis StemPro®, Life Technology) durante 2 semanas mientras se reemplazaba el medio cada tres días. A continuación, el medio de cultivo se retiró y las células se lavaron con DPBS sin Ca/Mg, y se hicieron reaccionar con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la reacción, las células se lavaron con agua purificada, y se hicieron reaccionar con una disolución de nitrato de plata al 1 % a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las células se lavaron con agua purificada y después se hicieron reaccionar con una disolución de tiosulfato de sodio al 5 % a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación, las células se lavaron con agua purificada, y se hicieron reaccionar con una disolución roja rápida nuclear al 0,1 % a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación, las células se lavaron con agua purificada, y se observó una muestra de deposición de calcio bajo un microscopio. Los resultados se muestran en la figura 5.

(2.3.3) Análisis de capacidad de diferenciación de condrocitos

El análisis de capacidad de diferenciación de condrocitos de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas se realizó de la siguiente manera.

2 x 105 de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas preparadas en (1.1) y (1.3) se colocaron en un tubo de 15 ml, y se centrifugaron a 1.500 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se descartó, y solo las células se cultivaron en un medio de diferenciación de condrogénesis (kit de diferenciación de condrogénesis StemPro®, Life Technology) con una tapa cerrada de manera suelta durante 3 semanas mientras se reemplazaba el medio cada tres días. A continuación, la masa celular se convirtió en un bloque de parafina y se cortó, seguido de tinción con azul alcián. Posteriormente, los condrocitos teñidos con color azul se analizaron con un microscopio óptico y los resultados se muestran en la figura 5.

La figura 5 muestra los resultados del análisis de multipotencia de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica.

Como se muestra en la figura 5, el resultado del análisis de la capacidad de diferenciación de adipocitos mostró que las sustancias grandes y pequeñas (grasas), como gotas, se identificaron en rojo. Además, el resultado del análisis de la capacidad de diferenciación de osteocitos mostró la deposición de partículas de calcio marrón-negro sobre el fondo rosa. Además, el resultado del análisis de la capacidad de diferenciación de condrocitos mostró que durante la diferenciación para dar condrocitos, glicoproteínas que representan la rigidez y elasticidad del cartílago se secretaron y se identificaron en azul. Estos resultados mostraron que las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica preparadas por el método de (1.1) y (1.3) pueden diferenciarse para dar adipocitos, osteocitos, o condrocitos, lo que indica multipotencia.

(2.4) Análisis de elaboración de perfiles y cuantificación de proteínas secretoras de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas

Con el fin de analizar las proteínas secretoras de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas preparadas en (1.1), análisis de perlas múltiples (panel de citoquinas/quimiocinas humanas 1 MILLIPLEX, Merck Millipore, Billerica, Ma, e E.UU.).

En detalle, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas se cultivaron durante 24 horas, y el cultivo de las mismas se incubó con perlas de captura recubiertas con anticuerpo a temperatura ambiente durante 2 horas, seguido de lavado. Las perlas se incubaron con anticuerpo quimiocina y citocina anti-humano etiquetado con biotina durante 1 hora y se incubaron con estreptavidina ficoeritrina durante 30 minutos. Por último, las perlas se lavaron, y para la cuantificación, se usó un programa Luminex 200 para analizar los niveles de expresión de proteínas secretoras. Los resultados se muestran en la tabla 2.

[Tabla 2]

Como se muestra en la tabla 2, puede verse que las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica secretan IL-6, IL-8, G-CSF, GM-CSF, MCP-1, MCP-3, VEGF, GRO, IGF-1 SR, EpCAM, IGFBP3, etc.

(2.5) Análisis de la expresión génica de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas Se analizaron las expresiones génicas de las células madre derivadas de cordón umbilical potenciadas preparadas en (1.1) comparándolas con aquellas de células madre de médula ósea.

En detalle, para analizar genes expresados específicamente en células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas comparándolos con aquellos de células madre de médula ósea, se extrajeron ARN a partir de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas y las células madre de médula ósea, seguido de etiquetado y purificación. Los ADNc etiquetados se hibridaron con el kit Expression Beadchip de Illumina para obtener resultados. Los datos se analizaron estadísticamente, y se muestran en la siguiente tabla 3 y la figura 6.

[Tabla 3]

Como se muestra en la tabla 3 y la figura 6, se observó alta expresión de COL1A1, IGFBP4, TAGLN, S100A10, SQSTM1, DSTN, DCN, PHGDH, FBLN1, MFGE8, HLA-A, VASN, KIAA1199, STC1, LRRC17, IL33, SNCA, DSG2, NRP2, PLAT en las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas y se observó baja expresión de CCND1, SERPINE1, PRNP, MT2A, TM4SF1, HIST1H4C, NME1, CXCL6, NTSR1, PTGS2, CYP1B1, TPMT, NAGK, ANXA4 en las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas, en comparación con células madre de médula ósea.

Entre los genes, COL1A1, que es un gen altamente expresado, es colágeno alfa-1 de tipo I, y se sabe que se expresa en colágeno de tejidos conjuntivos, incluido el cartílago. Sin embargo, no hay informes sobre la asociación entre este gen y las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas.

Entre los genes, IGFBP4, que es un gen altamente expresado, es una proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, y conocido como proteína que inhibe diversas células cancerosas. Hay un informe de que se detecta IGFBP4 en el suero de la sangre del cordón umbilical, pero no hay informes sobre la asociación entre este gen y las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas.

Entre los genes, TAGLN, que es un gen altamente expresado, es un gen expresado en fibroblastos y músculos lisos, y su función aún no se ha revelado. Existe un informe de que TAGLN se expresa en células madre de médula ósea, pero no hay informes sobre la asociación entre este gen y las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas.

Entre los genes, CCND1, que es un gen débilmente expresado, es la ciclina D1. La sobreexpresión de CCND1 conduce a una transición rápida de la fase G1 a la fase S del ciclo celular para facilitar el crecimiento celular. Hay informes de que CCND1 se expresa altamente en células cancerosas, y las células madre de la sangre del cordón umbilical inhiben el glioma C6 a través de la regulación por disminución de CCND1. Sin embargo, no hay informes sobre la asociación entre este gen y las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas.

Entre los genes, SERPINE1, que es un gen débilmente expresado, se conoce como inhibidor del activador del plasminógeno endotelial, y se conoce por funcionar como activador del plasminógeno tisular (tPA). Sin embargo, no hay informes sobre la asociación entre este gen y las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas.

Entre los genes, PRNP, que es un gen débilmente expresado, es una proteína de prión principal (CD230), y se sabe que se expresa en diversos tejidos, así como en el sistema nervioso. Se informa que la anomalía del gen PRNP provoca un trastorno neurológico. Sin embargo, no hay informes sobre la asociación entre este gen y las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas.

La expresión génica de las células madre derivadas de cordón umbilical potenciadas preparadas en (1.1) y (1.3) se comparó y analizó de la misma manera que anteriormente, y los resultados se muestran en la siguiente tabla 4 y la figura 6.

[Tabla 4]

Como se muestra en la tabla 4 y la figura 6, se observó alta expresión de S100A10, BNIP3, IGFBP5, PGK1, TPI1, DCN, PGM1, PFKFB3, LOC644774, MME, MIR1978, PGK1, SLC2A3, BHLHB2, BNIP3L, IGFBP5, NDUFA4L2, DPYD, y SCARA3 en las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas cultivadas en una condición de hipoxia y se observó baja expresión de IL8, ALDH1A1, NQO1, DLC1, CTHRC1, y CPA4 en las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas cultivadas en una condición de hipoxia, en comparación con aquellas en condición de normoxia.

Entre los genes, S100A10, que es un gen altamente expresado, es la proteína A10 de unión a calcio S100, y regula el ciclo celular y la diferenciación. Además, se sabe que S100A10 funciona en exocitosis y endocitosis. Se estudió S100A10 como una de las proteínas altamente expresadas durante la diferenciación de células madre de médula ósea en hueso. Sin embargo, no hay informes sobre la asociación entre este gen y las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas.

Entre los genes, se sabe que BNIP3, que es un gen altamente expresado, está altamente expresado en UCB-MSC, cuando se comparó la expresión génica a niveles de ARNm de UCB-MSC (células madre derivadas de sangre de cordón umbilical) y UCB-MNC (células sanguíneas derivadas de sangre de cordón umbilical). Además, se recogieron células madre amnióticas en una condición de hipoxia, y luego se sometieron a análisis de micromatrices de ARNm. Como resultado, se sabe que el gen de BNIP3 aumenta significativamente en la condición de hipoxia. Sin embargo, no hay informes sobre la asociación entre este gen y las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas.

Entre los genes, IGFBP5, que es un gen altamente expresado, es una proteína 5 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, y funciona en el desarrollo y se localiza en el espacio extracelular. Se informó la expresión del gen de IGFBP5 en células madre de médula ósea, pero no hay informes sobre la asociación entre este gen y las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas.

Entre los genes, se informa que IL8, que es un gen débilmente expresado, se libera desde fagocitos y células mesenquimales para activar la quimiotaxis inductora de neutrófilos cuando se expone a entornos inflamatorios. Sin embargo, no hay informes sobre la asociación entre este gen y las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas.

Entre los genes, ALDH1A1, que es un gen débilmente expresado, es la familia 1 de aldehido deshidrogenasa, miembro A1, y es una enzima implicada en la principal vía de oxidación del metabolismo del alcohol. Sin embargo, no hay informes sobre la asociación entre este gen y las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas.

3. Análisis de efectos antiinflamatorios, de regeneración vascular, y de regeneración nerviosa de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas

(3.1) Análisis de efecto antiinflamatorio de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas

Para analizar un efecto antiinflamatorio de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas preparadas en (1.1), se analizaron la capacidad de inhibición de la proliferación de PBMC y la IL-10 secretada por PBMC activadas.

En detalle, la capacidad de inhibición de la proliferación de PBMC se analizó de la siguiente manera. En primer lugar, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas se inocularon a diferentes concentraciones en una placa de 24 pocillos y se cultivaron durante 24 horas. Posteriormente, las PBMC teñidas con CFSE se estimularon mediante la adición de PHA, y se cocultivaron con las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas durante 5 días. Posteriormente, se examinó si la inflamación se inhibía por citocinas secretadas por las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas o se inhibía por contacto directo de célula a célula por presencia o ausencia de Transwell. Los resultados se muestran en la figura 7A.

Además, para analizar la IL-10 secretada por PBMC activadas, el cocultivo se realizó durante 5 horas y durante 5 días, y después se recogió el medio acondicionado. La cantidad de IL-10 secretada se midió usando el kit ELISA de IL-10 humana (R&D Systems), y los resultados se muestran en la figura 7A.

La figura 7A muestra los resultados del análisis del efecto antiinflamatorio de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica.

Como se muestra en la figura 7A, las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica inhibieron la proliferación de PBMC, en comparación con un grupo de control. Además, cuando una relación de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas: PBMC es 1:10, hasta aproximadamente 30,51 ± 1,74 % de la inhibición de proliferación de PBMC se observó por cocultivo indirecto. Además, los resultados del análisis de IL-10 secretada por PBMC activadas mostraron que las PBMC activadas secretaban citocina antiinflamatoria (IL-10), y las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas funcionan para aumentar la secreción de IL-10 de PBMC.

Los resultados sugieren que las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica pueden aplicarse de manera útil al tratamiento de enfermedades inflamatorias.

(3.2) Análisis de efecto de regeneración vascular de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas

Para analizar un efecto de regeneración vascular de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas preparadas en (1.1), se analizó la proliferación de células endoteliales vasculares.

En detalle, se recogieron EBM-2 y medio acondicionado de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas y se prepararon como muestras. Posteriormente, se inocularon células endoteliales vasculares (HUVEC) en una placa de 96 pocillos. Cuando se hicieron proliferar las células durante aproximadamente 1 día, EBM-2 y el medio de cultivo de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas se añadieron a las mismas, respectivamente y se cultivaron durante 4 días. Se añadió un reactivo del kit de ensayo de viabilidad celular Cyto XTM (WST-1) al medio en una cantidad del 10 % del mismo, y se dejó reaccionar en una incubadora durante de 2 horas a 3 horas. Posteriormente, se analizaron las tasas de proliferación de células endoteliales vasculares a 450 nm usando un microlector, y los resultados se muestran en la figura 7B.

La figura 7B muestra los resultados del análisis del efecto de regeneración vascular de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica.

Como se muestra en la figura 7B, cuando la tasa de proliferación de las células endoteliales vasculares cultivadas en medio EBM-2 se tomó como del 100 %, la tasa de proliferación de las células endoteliales vasculares cultivadas en el medio acondicionado de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas fue de 172 ± 15,22 %.

El resultado sugiere que las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica tienen el efecto de regeneración vascular.

(3.3) Análisis de efecto de regeneración nerviosa de células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas

Para analizar un efecto de regeneración nerviosa de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas preparadas en (1.1), se analizó la proliferación de células nerviosas.

En detalle, se recogieron MEM y medio acondicionado de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas y se prepararon como muestras. Posteriormente, las células nerviosas (SH-SY5Y) se inocularon en una placa de 96 pocillos. Cuando se hicieron proliferar las células durante aproximadamente 1 día, MEM y el medio de cultivo de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas se añadieron a las mismas, respectivamente y se cultivaron durante 4 días. Se añadió un reactivo del kit de ensayo de viabilidad celular Cyto XTM (WST-1) al medio en una cantidad del 10 % del mismo, y se dejó reaccionar en una incubadora durante de 2 horas a 3 horas. Posteriormente, las tasas de proliferación de células nerviosas se analizaron a 450 nm usando un microlector, y los resultados se muestran en la figura 7C.

La figura 7C muestra los resultados del análisis del efecto de regeneración nerviosa de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica.

Como se muestra en la figura 7C, cuando la tasa de proliferación de las células nerviosas cultivadas en medio MEM se tomó como del 100 %, la tasa de proliferación de las células nerviosas cultivadas en el medio acondicionado de las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas fue de 302 ± 15,97 %.

El resultado sugiere que las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según una realización específica tienen el efecto de regeneración nerviosa.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas que tienen las siguientes características (a) a (g):

a) tener un nivel de expresión más alto de TAGLN, COL1A1, IGFBP4, STC1, LRRC17, y IL33, en comparación con células madre de médula ósea;

b) tener un nivel de expresión más bajo de TPMT, NAGK, ANXA4, CCND1, SERPINE1, PRNP, y CYP1B1, en comparación con células madre de médula ósea;

c) mantener la morfología de fibroblastos adherentes durante subcultivo;

d) tener la capacidad de diferenciarse para dar adipocitos, osteocitos, o condrocitos;

e) tener características de antígeno de superficie Oct4-, SSEA4+, Tra-1-60-, C D IIc-, CD8a-, CD200+, CD3-, CDIa-, CD16-, CD86-, CD40-, CD141+, CD61+, CD87+ y MIC A/B-;

f) tener un nivel de expresión más alto de uno o más seleccionados del grupo que consiste en S100A10, Bn IP3, IGFBP5, NDUFA4L2, DPYD, y SCARA3, en comparación con las cultivadas en condición de normoxia; y

g) tener un nivel de expresión más bajo de uno o más seleccionados del grupo que consiste en IL8, ALDH1A1, DLC1, CTHRC1, y CPA4, en comparación con las cultivadas en condición de normoxia.
2. Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según la reivindicación 1, que tiene además la siguiente característica (h):

h) tener un nivel de expresión más alto de uno o más seleccionados del grupo que consiste en SNCA, DSG2, NRP2, y PLAT, en comparación con células madre de médula ósea.
3. Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según la reivindicación 1, en las que las características de a) y b) muestran que la diferencia de nivel de expresión con respecto al de las células madre de médula ósea es dos veces o más, medido por análisis de micromatrices.
4. Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según la reivindicación 2, en las que las características de c) y d) bajo la condición de hipoxia muestran que la diferencia de nivel de expresión de aquellas bajo la condición de normoxia es dos veces o más, medido por análisis de micromatrices o análisis proteómico.
5. Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según la reivindicación 1, en las que las células tienen capacidad de formación de colonias.
6. Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según la reivindicación 1, en las que las células secretan IL-6, IL-8, G-CSF, GM-CSF, MCP-3, VEGF, GRO, IFNy, IL-1a, IL-1b, IL-1ra, IL-3, IL-4, IL-7, IL-9, IL-12(p40), IL12(P70), IL-13, IL-14, IFNa2, MDC, sIL-2Ra, Eotaxina, ligando de Flt-3, MCP-1, MIP-1a, MIP1b, RANTE, fractalquina, IP-10, EGF, FGF-2, IGF-1 SR, EpCAM, IGFBP3, o una combinación de los mismos.
7. Las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según la reivindicación 1, en las que las células se derivan del tejido de gelatina de Wharton de un cordón umbilical de mamífero.
8. Un método para preparar células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según la reivindicación 1, comprendiendo el método:

someter a cultivo adherente un cordón umbilical aislado en una placa de cultivo;

aislar células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas poniendo en contacto el cordón umbilical cultivado con una enzima de disociación; y

subcultivar las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas aisladas en un medio que contiene factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF-4) y heparina.
9. El método según la reivindicación 8, en el que el subcultivo comprende además tratar enzima recombinante sin componentes animales (ACF) antes del trasplante celular para el subcultivo.
10. El método según la reivindicación 8, en el que el subcultivo se mantiene en una condición de hipoxia a un nivel de oxígeno más bajo que una condición de normoxia del 21 %.
11. El método según la reivindicación 8, en el que el subcultivo se realiza en desde 3 hasta 15 pases.
12. El método según la reivindicación 8, en el que la enzima de disociación es colagenasa.
13. Un agente que comprende las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según la reivindicación 1, poblaciones celulares de las mismas, o un cultivo de las mismas como principio activo.
14. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades inflamatorias, comprendiendo la composición farmacéutica las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según la reivindicación 1, poblaciones celulares de las mismas, o un cultivo de las mismas como principio activo.
15. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 14, en la que las enfermedades inflamatorias se seleccionan del grupo que consiste en bronquitis, gastritis, arteriosclerosis, artritis, enfermedad intestinal inflamatoria (EII), hepatitis, colecistitis, infecciones fúngicas, úlcera gástrica, asma, dermatitis atópica, tendinitis, y nefritis.
16. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades isquémicas, comprendiendo la composición farmacéutica las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según la reivindicación 1, poblaciones celulares de las mismas, o un cultivo de las mismas como principio activo.
17. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 16, en la que las enfermedades isquémicas se seleccionan del grupo que consiste en accidente cerebrovascular isquémico, infarto de miocardio, enfermedad cardíaca isquémica, enfermedad cerebral isquémica, insuficiencia cardíaca isquémica, enteritis isquémica, enfermedad vascular isquémica, enfermedad ocular isquémica, retinopatía isquémica, glaucoma isquémico, insuficiencia renal isquémica, y enfermedad de una extremidad isquémica.
18. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades neurodegenerativas, comprendiendo la composición farmacéutica las células madre adherentes derivadas de cordón umbilical potenciadas según la reivindicación 1, poblaciones celulares de las mismas, o un cultivo de las mismas como principio activo.
19. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 18, en la que las enfermedades neurodegenerativas se seleccionan del grupo que consiste en lesión de médula espinal, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal, parálisis supranuclear progresiva, degeneración corticobasal, enfermedad de Pick, y demencia pugilística.