ES2911243T3 - Composiciones, procedimientos y/o kits que comprenden un dominio extracelular recombinante de cd38 humano - Google Patents
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Abstract
Composición para la unión a un anticuerpo anti-CD38, que comprende una forma recombinante soluble de un dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo que interfiere con la actividad de unión de un anticuerpo anti-CD38 fusionado a una etiqueta de oligomerización en la que la etiqueta de oligomerización comprende una región Fc de una inmunoglobulina y un dominio poli-His que contiene 8, 9, 10, 11 o 12 residuos de histidina.
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones, procedimientos y/o kits que comprenden un dominio extracelular recombinante de cd38 humano LISTADO DE SECUENCIAS EN FORMATO ELECTRÓNICO
La presente solicitud se presenta junto con un listado de secuencias electrónico como un archivo de texto ASCII a través de EFS-Web. El listado de secuencias electrónico se proporciona como un archivo titulado SEQLISTCD38PCT.txt, creado y guardado por última vez el 31 de mayo de 2018, el cual tiene un tamaño de 73.000 bytes. La información en el listado de secuencias electrónico se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad.
ANTECEDENTES
Sector
La presente memoria descriptiva se refiere al sector de los productos farmacéuticos. Algunas realizaciones de la presente memoria descriptiva se refieren a composiciones, procedimientos y/o kits que comprenden una forma recombinante soluble del dominio extracelular de CD38 y/o fragmentos del mismo expresados en células de mamífero y/o en bacterias. La presente memoria descriptiva también está relacionada con proteínas de fusión que comprenden una etiqueta (“tag”) de oligomerización y con procedimientos para la oligomerización de proteínas de fusión recombinantes utilizando dicha etiqueta.
Descripción de la técnica relacionada
La proteína transmembrana CD38 humana se expresa altamente en cierto mieloma maligno. Los anticuerpos monoclonales anti-CD38 se utilizan como agentes terapéuticos para matar mieloma múltiple y otros tumores hematológicos.
CARACTERÍSTICAS
Se da a conocer una composición para unirse a un anticuerpo anti-CD38 tal como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la composición comprende una forma recombinante soluble de un dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo que interfiere con una actividad de unión de un anticuerpo anti-CD38, en la que una secuencia de la forma recombinante soluble del dominio extracelular de CD38 y/o el fragmento del mismo se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, Se Q ID NO: 10, y SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, y SEQ ID NO: 14.
En algunas realizaciones de la composición, el tamaño de la forma recombinante soluble de un dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo está en el intervalo entre aproximadamente 5 aminoácidos y aproximadamente 300 aminoácidos.
En algunas realizaciones de la composición, el anticuerpo anti-CD38 está dirigido contra CD38 humano, CD38 no humano, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones de la composición, el anticuerpo anti-CD38 es monoclonal, policlonal, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones de la composición, el anticuerpo anti-CD38 se selecciona del grupo que consiste en Darzalex, isatuximab, y MOR202.
En algunas realizaciones de la composición, la forma recombinante soluble de un dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo se expresa en un sistema de expresión eucariota o un sistema de expresión procariótico. En algunas realizaciones de la composición, la concentración de la forma recombinante soluble de un dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo está en el intervalo entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 400 mg/ml.
En algunas realizaciones, se da a conocer un kit tal como se define en las reivindicaciones, para ensayos de diagnóstico e investigación mediante biomonitorización. En algunas realizaciones, el kit comprende una composición que comprende una forma recombinante soluble de un dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo que interfiere con una actividad de unión de un anticuerpo anti-CD38, en el que una secuencia de la forma recombinante soluble del dominio extracelular de CD38 y/o el fragmento del mismo se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, y SEQ ID NO: 14, una placa, y reactivos para identificar la presencia de anticuerpos.
En algunas realizaciones el kit, la placa y los reactivos del kit están configurados para un ensayo ELISA.
En algunas realizaciones el kit, la placa y los reactivos del kit son aquellos de un kit de ensayo vendido con la marca PROMONITOR® en el dia de presentación de la presente solicitud.
En algunas realizaciones, se da a conocer un procedimiento de neutralización o bloqueo de la unión de un anticuerpo anti-CD38 en una muestra. En algunas realizaciones, el procedimiento de neutralización o bloqueo de la unión de un anticuerpo anti-CD38 comprende proporcionar un volumen de la muestra que comprende el anticuerpo anti-CD38, e incubar con un volumen de la composición según la reivindicación 1 suficiente para neutralizar el anticuerpo anti-CD38 en la muestra.
En algunas realizaciones del procedimiento de neutralización o bloqueo de la unión de un anticuerpo anti-CD38, la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma, y suero.
En algunas realizaciones del procedimiento de neutralización o bloqueo de la unión de un anticuerpo anti-CD38, el anticuerpo anti-CD38 se selecciona del grupo que consiste en Darzalex, isatuximab, y MOR202.
En algunas realizaciones del procedimiento de neutralización o bloqueo de la unión de un anticuerpo anti-CD38, el volumen of la muestra está en el intervalo entre aproximadamente 25 pl y aproximadamente 250 pl.
En algunas realizaciones del procedimiento de neutralización o bloqueo de la unión de un anticuerpo anti-CD38, el volumen de la composición está en el intervalo entre aproximadamente 0,5 pl y aproximadamente 50 pl.
En algunas realizaciones del procedimiento de neutralización o bloqueo de la unión de un anticuerpo anti-CD38, la concentración del anticuerpo anti-CD38 en la muestra está en el intervalo entre aproximadamente 0,005 pg/ml y aproximadamente 2000 pg/ml.
En algunas realizaciones del procedimiento de neutralización o bloqueo de la unión de un anticuerpo anti-CD38, la concentración de la forma recombinante soluble de un dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo en la composición está en el intervalo entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 400 mg/ml.
En algunas realizaciones del procedimiento de neutralización o bloqueo de la unión de un anticuerpo anti-CD38, el efecto de neutralización de la forma recombinante soluble de un dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo está en el intervalo entre aproximadamente el 70 % y aproximadamente el 100 %.
En algunas realizaciones del procedimiento de neutralización o bloqueo de la unión de un anticuerpo anti-CD38, la actividad de unión del anticuerpo anti-CD38 se selecciona del grupo que consiste en interferencia con ensayos de pretransfusión de sangre, interferencia con ensayos de compatibilidad sanguínea, e interferencia con terapia con anticuerpos.
La composición para unirse a un anticuerpo anti-CD38 de la presente invención comprende una proteína de fusión en la que la forma recombinante soluble de un dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo que interfiere con una actividad de unión de un anticuerpo anti-CD38está fusionada a una etiqueta de oligomerización, en la que la etiqueta de oligomerización comprende una región Fc de inmunoglobulina y un dominio poli-His que contiene 8, 9, 10, 11 o 12 residuos de histidina.
En algunas realizaciones de la proteína de fusión, la etiqueta de oligomerización es capaz de formar dímeros de orden superior hasta 12mer o 6mer de 2mer y posiblemente un grado superior de oligómeros.
En algunas realizaciones de la proteína de fusión, la secuencia de la región Fc de inmunoglobulina es SEQ ID NO 15. En algunas realizaciones, la secuencia de la región Fc de inmunoglobulina tiene, al menos, un 90 % de identidad con SEQ ID NO 15.
En algunas realizaciones de la proteína de fusión, la secuencia de la proteína de fusión y/o el fragmento de la misma se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, o la SEQ ID NO: 12.
En algunas realizaciones de la proteína de fusión la secuencia de la etiqueta de oligomerización se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 16, y SEQ ID NO 17.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra una realización de un aminoácido diseñado de forma sintética que codifica para CD38ecd-Fc-10H recombinante (SEQ ID NO: 7).
La figura 2 muestra una realización de un aminoácido diseñado de forma sintética que codifica para CD38ecd-10H recombinante (SEQ ID NO: 8).
La figura 3 muestra una realización de un aminoácido diseñado de forma sintética que codifica para 10H-MBPt-CD38ecd recombinante (SEQ ID NO: 9).
La figura 4 muestra una realización de un aminoácido diseñado de forma sintética que codifica para 10Ht-CD38ecd recombinante (SEQ ID NO: 10).
La figura 5 muestra una realización de un aminoácido diseñado de forma sintética que codifica para epítopos 10-MBPt-DARA recombinantes (SEQ ID NO: 11).
La figura 6 muestra una realización de la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de CD38 (CD38ecd) (SEQ ID NO: 1).
La figura 7 muestra una realización de la secuencia de aminoácidos de epítopos DARA (SEQ ID NO: 2).
La figura 8 muestra una realización de la secuencia de aminoácidos de epítopo DARA (epítopo #1) (SEQ ID NO: 3). La figura 9 muestra una realización de la secuencia de aminoácidos de epítopo DARA (epítopo #2) (SEQ ID NO: 4). La figura 10 muestra una realización de la secuencia de aminoácidos de Fc-10H de ratón (SEQ ID NO: 5).
La figura 11 muestra una realización de la secuencia de aminoácidos de 10H-MBPt (SEQ ID NO: 6).
La figura 12 representa un esquema de las diversas proteínas CD38 recombinantes utilizando soportes (“scaffolds”) alternativos.
La figura 13 muestra los datos relacionados con la identificación de un título bajo de anticuerpo anti-D después de la inhibición de anti-CD38 por CD38ecd-Fc-10H.
La figura 14 muestra los datos relacionados con la identificación of anticuerpos inesperados, apenas detectables, después de la inhibición de anti-CD38 por CD38ecd-Fc-10H.
La figura 15 muestra los datos relacionados con la inhibición de anti-CD38 por CD38ecd-Fc-10H o rhCD38.
La figura 16 muestra una funcionalidad equivalente de pretratamientos con CD38ecd-Fc-10H a diferentes temperaturas y tiempos de incubación.
La figura 17 muestra una mejor funcionalidad de CD38ecd-Fc-10H y CD38ecd-flex-Fc-10H con respecto a CD38ecd-10H.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
CD38ecd RECOMBINANTE HUMANO
Daratumumab (DARA) es una anticuerpo monoclonal (mAb) de inmunoglobulina (Ig)G1k humana que se dirige a la proteína transmembrana CD38 que se expresa altamente en células de mieloma maligno (de Weers M, y otros, Daratumumab, a novel therapeutic human CD38 monoclonal antibody, induces killing of mieloma múltiple and other hematological tumors. J Immunol. 2011 Feb 1;186(3):1840-8; Lokhorst HM, y otros, Targeting CD38 with Daratumumab monotherapy in mieloma múltiple. N Engl J Med. 2015 Sep 24;373(13):1207-19) y se utiliza para terapia en humanos. En 2016, la monoterapia con DARA fue aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos (Food and Drug Administration, FDA) para el tratamiento de pacientes con mieloma múltiple que habían recibido, al menos, tres líneas de terapia anteriores.
Se ha informado que DARA interfiere con ensayos de compatibilidad sanguínea de rutina (Chapuy CI y otros, Resolving the DARA interference with blood compatibility testing. Transfusión. 2015 Jun;55(6 Pt 2):1545-54; Oostendorp M y otros, When blood transfusion medicine becomes complicated due to interference by monoclonal antibody therapy. Transfusion. 2015 Jun;55(6 Pt 2):1555-62). DARA reconoce específicamente el dominio extracelular de CD38 endógeno en la superficie celular de los eritrocitos (RBC), provocando reacciones de falsos positivos en ciertos ensayos de diagnóstico in vitro.
Las muestras de plasma de pacientes tratados con DARA causa sistemáticamente reacciones positivas en ensayos anti-globulina indirectos (IAT), tales como ensayos de detección de anticuerpos (cribado), paneles de identificación de anticuerpos, y pruebas cruzadas de globulina anti-humana (AHG). La detección de anticuerpos irregulares en el plasma del paciente se enmascara hasta 6 meses después de la última infusión con DARA. Los anticuerpos inesperados/irregulares, tales como aloanticuerpos y autoanticuerpos, son los anticuerpos que pueden causar incompatibilidad en transfusiones de sangre. Los anticuerpos irregulares son más comúnmente del tipo IgG. Esta interferencia entorpece las pruebas de pretransfusión de rutina y complica la selección de unidades de RBC adecuadas para pacientes tratados con DARA. Además del DARA, otros dos anticuerpos específicos de CD38 (isatuximab y MOR202) se encuentran en desarrollo clínico y algunos otros están en desarrollo preclínico (van de Donk NW, y otros Monoclonal antibodies targeting CD38 in hematological malignancies and beyond. Immunol Rev.
2016 Mar;270(1):95-112).
Para superar este problema, se han desarrollado diferentes soluciones y se ha informado de las mismas. Cada solución tiene sus propias ventajas y desventajas, las cuales se describen en la tabla 1 (Chapuy C.I., y otros DARA-DTT Study Group* for the BEST Collaborative. International validation of a dithiothreitol (DTT)-based method to resolve the daratumumab interference with blood compatibility testing. Transfusion. 2016 Dec;56(12):2964-2972).
T l 1. V n v n l r imi n mii i n l in rf r ni ni- D l
La neutralización de anti-CD38 por una forma soluble del dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo (sCD38ecd, al que también se hace referencia en el presente documento como sCD38) es un método atractivo
porque no daña ningún epítopo en la superficie de los RBC, puede neutralizar cualquier anticuerpo anti-CD38, y su implementación en ensayos de laboratorio de rutina requiere justo la incubación de una muestra de sangre, plasma y/o suero del paciente con sCD38. La principal desventaja es el posible coste elevado de sCD38ecd recombinante. Esta desventaja es subjetiva porque las proteínas recombinantes se utilizan ampliamente en diversos diagnósticos in vitro (IVD) permitiendo que el coste se mantenga alcanzable para el uso rutinario. Una posible desventaja adicional de la utilización de sCD38 es la dilución de la sangre y/o plasma del paciente que tiene lugar cuando se neutraliza anti-CD38 utilizando una solución de sCD38, que podría conducir a la pérdida de anticuerpos de grupo sanguíneo irregulares relevantes en un cribado y/o identificación de anticuerpos posterior. Por lo tanto, es deseable tener sCD38 altamente concentrado disponible, de tal modo que se requieran solo pequeños volúmenes de sCD38 cuando se neutralizan anticuerpos anti-CD38 en una muestra de sangre y/o plasma de un paciente.
Las soluciones alternativas incluyen la utilización de desnaturalizantes químicos para tratar los RBC que tienen un efecto muy amplio y no específico. Actualmente, el procedimiento a elegir para eliminar la interferencia de DARA es el tratamiento DTT de los RBC provocando que el CD38 se reduzca, de tal modo que no sea reconocido por los anticuerpos DARA. Sin embargo, este tratamiento también destruye algunos de otros antígenos de grupo sanguíneo, anticuerpos que no pueden detectarse e identificarse posteriormente sobre las respectivas células. Por ejemplo, el tratamiento de los RCB en un kit de reactivo de eritrocitos, con el agente reductor ditiotreitol (DTT) y rehacer el ensayo anulará de forma eficaz la unión de DARA a CD38 en la superficie celular de los eritrocitos. Sin embargo, el DTT inactiva y destruye diversos antígenos en la superficie celular de los eritrocitos rompiendo los enlaces disulfuro de forma no específica, por ejemplo, el sistema Kell de antígenos que son importantes en la hemoclasificación sanguínea y las reacciones de transfusión.
Por el contrario, el sCD38 no daña ningún epítopo en la superficie de los RBC y puede neutralizar cualquier anticuerpo anti-CD38 siempre que el sCD38 comprenda uno o más epítopos que puedan unirse por el anticuerpo anti-CD38.
Son conocidas composiciones que comprenden sCD38 y una etiqueta de histidina en la técnica anterior (WO 2016/071355, Khoo K.M. et al. 2005 - Protein expression and purification, Vol. 40, no. 2, 1 April 2005; Marlies Oostendorp et al, 2015 - Transfusion, vol. 55, no. 6pt2, 1 June 2015). Alternativamente, son también conocidas composiciones que comprenden sCD38 y una región Fc de inmunoglobulina (Deckert et al. 2014 - Clinical Cancer Research, vol. 20, no. 17, 1 September 2014). Sin embargo, no se conoce en la técnica anterior una composición que comprende una forma recombinante soluble de un dominio extracelular de CD38 y ambos una etiqueta de histidina y una región Fc de inmunoglobulina. Además, la etiqueta de histidina utilizada en la técnica anterior comprende solo 6 residuos de histidina. Una etiqueta de oligomerización que comprende una etiqueta de histidina de 6 histidinas y una región Fc de inmunoglobulina son también conocidas en la técnica anterior (Radu Aricescu et al.
2006 - Acta crystallographica section biological crystallography Vol. 62, no. 10. 1 October 2006; Mekhaiel Aricescu et al. 2011 - Scientific Reports, vol. 1, 19 October 2011).
La presente memoria descriptiva se refiere a composiciones, procedimientos y/o kits que comprenden sCD38 recombinante humano y fragmentos del mismo. La presente memoria descriptiva también se refiere a composiciones, procedimientos y/o kits que comprenden sCD38 humano recombinante y fragmentos del mismo expresados en sistemas de expresión eucarióticos y/o procarióticos.
La invención proporciona una composición para la unión a un anticuerpo anti-CD38, la composición comprendiendo una forma soluble recombinante de un dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo que interfiere con una actividad de unión de un anticuerpo anti-CD38 fusionado a una etiqueta de oligomerización, en la que la etiqueta de oligomerización comprende una región Fc de inmunoglobulina y un dominio poli-His que contiene 8, 9, 10, 11 o 12 residuos de histidina.En algunas realizaciones, el sCD38 recombinante y/o fragmentos del mismo se solubilizan utilizando procedimientos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los presentes inventores han desarrollado un sCD38 recombinante como bloqueo para interferir con DARA y/u otro anticuerpo anti-CD38 terapéutico en desarrollo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la presente memoria descriptiva se refiere al sCD38 recombinante y/o fragmentos del mismo que interfiere con uno o más anticuerpos que se unen a CD38. En algunas realizaciones, el sCD38 recombinante y/o fragmentos del mismo interfiere con uno o más anticuerpos policlonales que se unen a CD38. En algunas realizaciones, el sCD38 recombinante y/o fragmentos del mismo interfieren con uno o más anticuerpos monoclonales que se unen a CD38. En algunas realizaciones, el sCD38 recombinante y/o fragmentos del mismo interfieren con uno o más anticuerpos monoclonales y policlonales que se unen a CD38. En algunas realizaciones, el sCD38 recombinante y/o fragmentos del mismo interfieren con una o más proteínas que se unen a CD38.
En algunas realizaciones, la presente memoria descriptiva está relacionada con la proteína sCD38 recombinante y/o fragmentos de la misma que interfieren con la unión de DARA. En algunas realizaciones, el sCD38 recombinante y/o fragmentos del mismo interfiere con la unión de isatuximab. En algunas realizaciones, el sCD38 recombinante y/o fragmentos del mismo interfieren con la unión de MOR202. En algunas realizaciones, el sCD38 recombinante y/o fragmentos del mismo interfieren con la unión de uno o más de DARA, isatuximab, o MOR202. En algunas realizaciones, el sCD38 y/o un fragmento del mismo se refieren a proteína CD38 humana y/o fragmentos de la misma. En algunas realizaciones, el sCD38 y/o un fragmento del mismo se refieren a proteína CD38 no humana.
Entre los ejemplos no limitativos de fuentes no humanas de CD38 se incluyen perros, gatos, conejo, ratón, conejillo de Indias, mono, vaca, oveja, cabra, zebra, etc.
En algunas realizaciones, CD38ecd (expresado como sCD38) es tal como se ha descrito en la figura 6. En algunas realizaciones, CD38ecd (expresado como sCD38) es tal como se ha descrito en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, CD38ecd es un fragmento de proteína CD38 que comprende los residuos 45 a 300 (SEQ ID NO: 1) de la secuencia de aminoácidos de CD38 humano según UniProt # P28907. En algunas realizaciones, el CD38ecd es un fragmento de la parte de CD38 que se prevé que sea expuesto en una superficie celular cuando se expresa de forma natural en una superficie celular. En algunas realizaciones, el CD38ecd es el supuesto dominio extracelular de la proteína CD38 cuando se expresa de forma natural en una superficie celular.
En algunas realizaciones, la presente memoria descriptiva se refiere a la expresión de CD38ecd (SEQ ID NO: 1) como sCD38, en la que CD38ecd (SEQ ID NO: 1) es parte de la proteína CD38 humana que se prevé que sea expuesta en una superficie celular. En algunas realizaciones, la presente memoria descriptiva se refiere a la expresión de un fragmento de CD38ecd (SEQ ID NO: 1) como sCD38, en la que CD38ecd (SEQ ID NO: 1) es parte de la proteína CD38 humana que se prevé que sea expuesta en una superficie celular.
Para un experto en la materia sería concebible que el CD38ecd recombinante o un fragmento del mismo se pueda expresar utilizando uno o más sistemas de expresión conocidos en la técnica. Entre los ejemplos no limitantes se incluyen sistemas de expresión bacterianos, y/o sistemas de expresión eucarióticos entre los que se incluyen, pero sin limitación a los mismos, células de insecto, levadura, y tipos de células de mamífero.
En algunas realizaciones, el sistema de expresión es un sistema de expresión eucariótico que comprende células de mamífero, células de levadura, células de insecto, etc. En algunas realizaciones, el sistema de expresión eucariótico se selecciona del grupo que consiste en células CHO, HEK, BHK, NSO, Sp2/0, COS, C127, HT-10780, PER.C6, HeLa y/o Jurkat. En algunas realizaciones, entre las ventajas no limitantes de un sistema de expresión eucariótico (por ejemplo, que comprenden células de mamífero) relacionadas con la expresión de sCD38 o fragmentos del mismo se incluyen el plegamiento correcto de sCD38 o fragmentos del mismo para que se unan anticuerpos anti-CD38, modificaciones postraduccionales correctas, ordenación adecuada en los compartimentos de las vías secretoras, funcionalidad adecuada, etc.
En algunas realizaciones, sCD38 se expresa como una proteína de fusión que comprende una región Fc de inmunoglobulina IgG1, tal como se muestra en la figura 1 (a la que se hace referencia en el presente documento como CD38ecd-Fc-10H; SEQ ID NO: 7). En algunas realizaciones, CD38ecd-Fc-10H es una proteína recombinante codificada por un ácido nucleico diseñado de forma sintética que codifica para un fragmento de una región constante de inmunoglobulina IgG1. En algunas realizaciones, CD38ecd-Fc-10H es una proteína recombinante codificada por un ácido nucleico diseñado de forma sintética que codifica para un fragmento de una región constante de inmunoglobulina IgG2. En algunas realizaciones, CD38ecd-Fc-10H es una proteína recombinante codificada por un ácido nucleico diseñado de forma sintética que codifica para un fragmento de una región constante de inmunoglobulina IgG3. En algunas realizaciones, CD38ecd-Fc-10H es una proteína recombinante codificada por un ácido nucleico diseñado de forma sintética que codifica para un fragmento de una región constante de inmunoglobulina IgG4. En algunas realizaciones, CD38ecd-Fc-10H es una proteína recombinante codificada por un ácido nucleico diseñado de forma sintética que codifica para un fragmento de una inmunoglobulina de cualquiera de los isotipos anteriores de IgG de región constante con una región bisagra (“hinge region”) alterada de tal modo que se expresa una fusión Fc monomérica. En algunas realizaciones, CD38ecd-Fc-10H comprende CD38ecd fusionado al extremo N-terminal de SEQ ID NO: 5 (figura 10) que comprende un fragmento de una región constante de inmunoglobulina IgG que comprende una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, que está fusionado en el extremo C-terminal a una etiqueta de 10 histidinas y un codón de terminación. En algunas realizaciones, CD38ecd-Fc-10H se expresa en una superficie celular. En algunas realizaciones, la región constante de IgG1 murina mejora uno o más de expresión, solubilidad, y estabilidad de una proteína expresada. En algunas realizaciones, la región constante de IgG1 murina mejora uno o más de expresión, solubilidad, y estabilidad de una proteína expresada. En algunas realizaciones, la etiqueta His permite la purificación de CD38ecd-Fc-10H mediante purificación por cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC).
Tal como se utiliza en el presente documento, “ácido nucleico” puede estar basado en ADN, ARN, o una combinación de los mismos. Entre los ejemplos no limitantes se incluyen plásmidos, cósmidos, fagos, vectores virales, vectores adenovirales, minicírculos, ácidos nucleicos modificados, análogos de ácido nucleico, etc., que son bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, se diseña un ácido nucleico para la expresión eficaz de una proteína, péptido o ambos en un sistema de expresión eucariótico, un sistema de expresión procariótico, o ambos. También se incluyen los vectores de vacuna basados en ácidos nucleicos. Entre los ejemplos no limitantes se incluyen vectores de vacuna de ADN, vectores de vacuna de ARN, vectores de vacuna basados en virus (por ejemplo, vectores de vacuna basados en virus adenoasociados), etc.
Sin vincularse a ninguna teoría, en la técnica se cree que el estado natural de CD38 en una membrana es dimérico y/o tetramérico (Bruzzone S y otros Dimeric and tetrameric isoforms of catalytically active transmembrane CD38 in transfected HeLa cells. FEBS Lett. 1998 Aug 21;433(3):275-8). En algunas realizaciones, CD38ecd-Fc-10H se expresa como una
proteína dimérica. En algunas realizaciones, la proteína dimérica es un homodímero de CD38ecd-Fc-10H. En algunas realizaciones, CD38ecd-Fc-10H puede ser expresado como una proteína oligomérica que comprende más de dos copias de CD38ecd-Fc-10H. En algunas realizaciones, CD38ecd-Fc-10H se expresa como una proteína oligomérica. En algunas realizaciones, CD38ecd-Fc-10H se expresa como una proteína oligomérica que comprende de dos copias de CD38ecd-Fc-10H a 12 copias de CD38ecd-Fc-10H. En algunas realizaciones, la etiqueta His permite la purificación de CD38ecd-Fc-10H mediante purificación por IMAC.
En algunas realizaciones, sCD38 se expresa como una proteína de fusión, tal como se muestra en la figura 2 (a la que se hace referencia en el presente documento como CD38ecd-10H; SEQ ID NO: 8). En algunas realizaciones, CD38ecd-10H es una proteína recombinante codificada por un ácido nucleico diseñado de forma sintética que codifica CD38ecd con una etiqueta His (es decir, una etiqueta que comprende 10 residuos de histidina). En algunas realizaciones, la etiqueta His permite la purificación de CD38ecd-10H mediante purificación por IMAC.
En algunas realizaciones, la actividad del CD38ecd-Fc-10H oligomérico es mejor que la actividad del CD38ecd-10H en solución, sobre una superficie sólida, o ambos. En algunas realizaciones, “actividad” se refiere a la capacidad de sCD38 para neutralizar un anticuerpo anti-CD38. En algunas realizaciones, “actividad” se refiere a la capacidad de sCD38 de neutralizar uno o más efectos relacionados con un anticuerpo anti-CD38 sobre una superficie sólida o en solución o ambos. En algunas realizaciones, la eficacia/eficiencia de la “actividad” está en el intervalo entre aproximadamente >70 % y aproximadamente el 100 %. En algunas realizaciones, la eficacia/eficiencia de la “actividad” es de aproximadamente el 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%, o un valor dentro del intervalo definido por cualquiera de dos de los valores definidos anteriormente. En algunas realizaciones, la eficacia/eficiencia de la “actividad” está en el intervalo entre aproximadamente >90 % y el 100 %. En algunas realizaciones, la eficacia/eficiencia de la “actividad” de aproximadamente >90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 98.5, 99, 99.5, o el 100 %, o un valor dentro del intervalo definido por cualquiera de dos de los valores definidos anteriormente.
En algunas realizaciones, sCD38 se expresa en un sistema de expresión bacteriano. En algunas realizaciones, entre las ventajas no limitantes de sistema de expresión bacteriano se incluyen el coste inferior aun manteniendo la funcionalidad de una proteína eucariótica. En algunas realizaciones, el sistema de expresión es un sistema de expresión bacteriano. En algunas realizaciones, sCD38 se expresa como una proteína de fusión, tal como se muestra en la figura 3 (a la que se hace referencia en el presente documento como 10H-MBPt-CD38ecd; SEQ ID NO: 9). En algunas realizaciones, 10H-MBPt-CD38ecd es una proteína recombinante codificada por un ácido nucleico diseñado de forma sintética que codifica CD38ecd fusionado en su extremo N-terminal a una etiqueta 10H-MBPt (SEQ ID NO: 6; figura 11, o SEQ ID NO: 19) que comprende 10 residuos de histidina y la proteína de unión a maltosa bacteriana (MBP) entera (Uniprot # P0AEX9; residuos de aminoácidos 29 a 393). En algunas realizaciones, la etiqueta 10 histidina se utiliza para la purificación por IMAC. En algunas realizaciones, la MBP mejora uno o más de expresión, solubilidad, o plegamiento.
En algunas realizaciones, 10H-MBPt-CD38ecd comprende una secuencia de escisión de la proteasa del virus del grabado del tabaco (Tobacco Etch Virus (TEV)). En algunas realizaciones, 10H-MBPt-CD38ecd comprende una secuencia de escisión de la proteasa del TEV entre la MBP y CD38ecd (figura 3). En algunas realizaciones, la secuencia de escisión de la proteasa del TEV entre la MBP y CD38ecd permite la escisión de 10H-MBP desde CD38ecd dando como resultado CD38ecd purificado sin ninguna secuencia adicional.
También se contemplan uno o más de otros sitios de escisión de proteasas o no proteasas. Entre los ejemplos no limitantes se incluyen la proteasa el virus de la fiebre aftosa del ganado (Food-and-mouth disease (FMDV)), la proteinasa Arg-C, la endopeptidasa Asp-N, BNPS-Skatole, Caspasas, Quimotripsina de alta especificidad, Quimotripsina de baja especificidad, Clostripaina (Clostridiopeptidasa B), CNBr, Enteroquinasa, Factor Xa, ácido fórmico, Glutamil endopeptidasa, GranzymeB, Hidroxilamina, ácido Yodosobenzoico, LysC, LysN, NTCB (ácido 2-nitro-5-tiocianobenzoico), Neutrófilo elastasa, Pepsina, Prolina-endopeptidasa, Proteinasa K, Estafilococo peptidasa I, Termolisina, Trombina, Tripsina, y otras enzimas específicas de sitio conocidas por cualquier experto en la materia.
En algunas realizaciones, sCD38 se expresa como una proteína de fusión, tal como se muestra en la figura 4 (a la que se hace referencia en el presente documento como 10Ht-CD38ecd; SEQ ID NO: 10). En algunas realizaciones, 10Ht-CD38ecd es una proteína recombinante codificada por un ácido nucleico diseñado de forma sintética que codifica CD38ecd fusionado en su extremo N-terminal con una etiqueta que comprende 10 residuos de histidina. En algunas realizaciones, la etiqueta 10 histidina se utiliza para purificación por IMAc . En algunas realizaciones, 10H-CD38ecd comprende una secuencia de escisión de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV). En algunas realizaciones, 10H-CD38ecd comprende una secuencia de escisión de la proteasa del TEV entre 10H y CD38ecd (figura 4). En algunas realizaciones, la secuencia de escisión de la proteasa del TEV entre 10H y CD38ecd permite escindir 10H de CD38ecd dando como resultado CD38ecd purificado sin ninguna secuencia adicional.
En algunas realizaciones, sCD38 se expresa como una proteína de fusión, tal como se muestra en la figura 5 (a la que se hace referencia en el presente documento como 10H-MBPt-DARAepítopos; SEQ ID NO: 11). En algunas realizaciones, 10H-MBPt-DARAepítopos es una proteína recombinante codificada por un ácido nucleico diseñado de forma sintética que codifica que comprende la secuencia de aminoácidos (desde el residuo 230 a 280 de Uniprot # P28907; tal como se muestra en SEQ ID NO: 2) de CD38 humano que comprende dos epítopos DARA fusionados
en su extremo N-terminal con una etiqueta de 10 Histidinas y la proteína de unión a maltosa (MBP), tal como se muestra en la figura 5. En algunas realizaciones, los dos epítopos DARA son epítopos DARAepítopo #1 (Uniprot # P28907 desde el residuo 235 a 246; tal como se muestra en SEQ ID NO: 3) y DARAepítopo #2 (Uniprot # p28907 desde el residuo 267 a 280; tal como se muestra en SEQ ID NO: 4).
En algunas realizaciones, uno o más epítopos de sCD38 pueden unir un anticuerpo anti-CD38 con una afinidad medible de aproximadamente 10e-6 (afinidad de péptido) a 10e-10 (afinidad de anticuerpo muy fuerte).
En algunas realizaciones, se utiliza una etiqueta 10 histidina para la purificación por IMAC. En algunas realizaciones, 10H-MBPt-DARAepítopos comprende una secuencia de escisión de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV). En algunas realizaciones, 10H-MBPt-DARAepítopos comprende una secuencia de escisión de la proteasa del TEV entre MBP y DARAepítopos (figura 5). En algunas realizaciones, la secuencia de escisión de la proteasa del TEV entre MBP y DARAepítopos permite escindir 10H-MBP de DARAepítopos dando como resultado DARAepítopos purificado sin ninguna secuencia adicional. En algunas realizaciones, la MBP mejora uno o más de expresión, solubilidad, o plegamiento.
En algunas realizaciones, el fragmento de sCD38 es uno o más epítopos en CD38ecd a los que se han unido uno o más anticuerpos anti-CD38 policlonales y/o monoclonales. En algunas realizaciones, el tamaño del sCD38 y/o el fragmento del mismo está en el intervalo entre aproximadamente 5 aminoácidos y aproximadamente 300 aminoácidos. En algunas realizaciones, el tamaño está en el intervalo entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150 aminoácidos. En algunas realizaciones, el tamaño es de aproximadamente 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300 ó 350 aminoácidos, o un valor dentro del intervalo definido por dos valores cualquiera de los mencionados anteriormente.
También se contemplan una o más de otras etiquetas para la purificación, solubilización, detección, etc. Entre los ejemplos no limitantes se incluyen GST, SUMO, AviTag, Calmodulina-tag, poliglutamato, E-tag, FLAG-tag, HA-tag, His-tag, Myc-tag, NE-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, Strep-tag, TC tag, V5 tag, VSV-tag, Xpress tag, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, proteína portadora de carboxilo de biotina (BCCP), Glutation-S-transferasa-tag, proteína fluorescente verde (GFP)-tag, tags de otras proteínas fluorescentes, HaloTag, proteína de unión a maltosa (MBP)-tag, Nus-tag, Tioredoxina-tag, Fc-tag, tags intrínsecamente desordenados que contienen aminoácidos promotores de desorden (por ejemplo, P, E, S, T, A, Q, G), Ty tag, etc.
La presente memoria descriptiva se refiere a una o más composiciones, procedimientos y/o kits que comprenden cualquiera de una o más de las realizaciones de sCD38 y/o fragmentos del mismo descritas en el presente documento y variantes de las mismas.
En algunas realizaciones, una o más composiciones, procedimientos y/o kits que comprenden sCD38 y/o fragmentos del mismo se refieren al pretratamiento de sangre universal, suero y/o plasma. En algunas realizaciones, el pretratamiento mitiga cualquier interferencia por anticuerpo anti-CD38 en la muestra en la detección y/o identificación de anticuerpos irregulares, así como otros anticuerpos mediante una o más técnicas conocidas por un experto en la materia.
En algunas realizaciones, la interferencia por un anticuerpo anti-CD38 comprende uno o más de interferencia con ensayos de compatibilidad sanguínea, interferencia con terapia con anticuerpos, aglutinación de eritrocitos, interferencia con ensayos de pretransfusión sanguínea, y similares.
En algunas realizaciones, el pretratamiento neutraliza cualquier anticuerpo anti-CD38 para permitir la detección y/o identificación de anticuerpos irregulares en la muestra, así como otros anticuerpos por una o más técnicas conocidas por un experto en la materia. Entre los ejemplos no limitantes de una o más técnicas conocidas por un experto en la materia se incluyen ensayos de tubos convencionales, multitarjeta (“multicard”), ensayos de adherencia de eritrocitos en fase sólida, tecnologías en gel, cualquier otra tecnología actual o futura para la detección/identificación de anticuerpos irregulares.
La mitigación de la interferencia y/o la neutralización del anticuerpo anti-CD38s por el pretratamiento permite la detección y/o identificación de anticuerpos irregulares, así como otros anticuerpos que son relevantes e importantes para los ensayos de compatibilidad. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la neutralización por sCD38 y/o fragmentos del mismo de anti-CD38 en una muestra de plasma, sangre y/o suero se puede combinar con usos diagnósticos, por ejemplo, cribado de anticuerpos, identificación de anticuerpos de grupo sanguíneo irregulares, etc.
En algunas realizaciones, sCD38 y/o fragmentos del mismo se pueden utilizar como un reactivo de pretratamiento en el cribado de sangre, cribado de plasma, cribado de suero, o una combinación de los mismos para anticuerpos irregulares, así como otros anticuerpos. En algunas realizaciones, sCD38 y/o fragmentos del mismo se pueden utilizar como un antígeno en ensayos de diagnóstico e investigación mediante biomonitorización. Por ejemplo, en algunas realizaciones, sCD38 y/o fragmentos del mismo se pueden utilizar en PROMONITOR® ELISA para comprobar la biodisponibilidad e inmunogenicidad de fármacos, por ejemplo, de anticuerpos anti-CD38s, tal como DARA, isatuximab, o MOR202, en pacientes prescritos con terapia biológica para el tratamiento de enfermedades
inflamatorias crónicas y otras indicaciones (por ejemplo, mieloma múltiple). En algunas realizaciones, el sCD38 se pueden utilizar para la familia de ensayos PROMONITOR® para medir tanto los niveles de fármaco como los de anticuerpos anti-fármacos con ELISA validada. En el Apéndice A del presente documento se adjunta un folleto de la familia de pruebas PROMONITOR®.
En algunas realizaciones, la eficacia de la mitigación de la interferencia y/o neutralización del anticuerpo anti-CD38s por el pretratamiento se puede comprobar utilizando una o más técnicas conocidas por un experto en la materia. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se pueden utilizar una o más composiciones que se dan a conocer en el presente documento en DG Gel®, una única tarjeta de gel de 8 columnas basada en la tecnología de aglutinación para la clasificación de grupos sanguíneos y la investigación de anticuerpos inesperados. De este modo, en algunas realizaciones, las composiciones que se dan a conocer en el presente documento se pueden utilizar como un reactivo en tarjetas DG Gel® para comprobar la eficiencia de la neutralización de anti-CD38. En algunas realizaciones, la eficacia está en el intervalo entre aproximadamente >70 % y aproximadamente el 100 %. En algunas realizaciones, la eficacia es aproximadamente el 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 %, o un valor dentro del intervalo definido por dos valores cualquiera de los mencionados anteriormente. En algunas realizaciones, la eficacia está en el intervalo entre aproximadamente >90 % y el 100 %. En algunas realizaciones, la eficacia es aproximadamente >90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 98.5, 99, 99.5, o el 100 %, o un valor dentro del intervalo definido por dos valores cualquiera de los mencionados anteriormente. En algunas realizaciones, el volumen de una o más composiciones que comprenden sCD38 utilizadas en tarjetas DG Gel® pueden estar en el intervalo desde aproximadamente 0,1 pl hasta aproximadamente 40 pl. En algunas realizaciones, el volumen de las composiciones que comprenden sCD38 utilizadas en tarjetas DG Gel® pueden estar en el intervalo desde aproximadamente 0,4 pl hasta aproximadamente 10 pl. En algunas realizaciones, el volumen de la composición que comprende sCD38 utilizado en tarjetas DG Gel® es aproximadamente 2 pl.
En algunas realizaciones, las composiciones que se dan a conocer en el presente documento se pueden utilizar en ensayos para bloquear y/o neutralizar uno o más de DARA, isatuximab, o MOR202 en muestras de sangre, suero, y/o plasma de un paciente.
En algunas realizaciones, las composiciones, procedimientos y/o kits que se dan a conocer en el presente documento se pueden utilizar en ensayos para eliminar uno o más anticuerpos anti-CD38 de muestras de sangre, sureo y/o plasma de un paciente. Por ejemplo, una muestra de un paciente que comprende anticuerpo anti-CD38 se puede incubar con una composición que comprende sCD38 y/o fragmentos del mismo que comprenden una o más etiquetas que se dan a conocer en el presente documento para permitir que el sCD38 etiquetado y/o fragmentos del mismo se una al anticuerpo anti-CD38. A continuación, el completo sCD38-anti-CD38 puede eliminarse por una o más técnicas de cromatografía de afinidad conocidas por un experto en la materia.
En algunas realizaciones, un sCD38 etiquetado y/o fragmentos del mismo se pueden utilizar para eliminar anti-CD38 en plasma, suero y/o sangre humanos durante hemodiálisis, diálisis peritoneal, hemofiltración, hemodiafiltración, terapia de recambio plasmático, plasmaféresis, apheresis, y leucorreducción. Por ejemplo, un sCD38 etiquetado y/o fragmentos del mismo se pueden utilizar para eliminar uno o más de DARA, isatuximab, o MOR202 en muestras de sangre, suero y/o plasma de un paciente.
En algunas realizaciones, la concentración del anticuerpo anti-CD38 en una muestra está en el intervalo entre aproximadamente 0,005 pg/ml y aproximadamente 2000 pg/ml. En algunas realizaciones, la concentración del anticuerpo anti-CD38 en una muestra está en el intervalo entre aproximadamente 0,05 pg/ml y aproximadamente 1000 pg/ml. En algunas realizaciones, la concentración del anticuerpo anti-CD38 en una muestra está en el intervalo entre aproximadamente 0,05 pg/ml y aproximadamente 500 pg/ml. En algunas realizaciones, la concentración del anticuerpo anti-CD38 en una muestra está en el intervalo entre aproximadamente 0,05 pg/ml y aproximadamente 20 pg/ml. En algunas realizaciones, la concentración del anticuerpo anti-CD38 en una muestra está en el intervalo entre aproximadamente 0,05 pg/ml y aproximadamente 100 pg/ml. En algunas realizaciones, la concentración del anticuerpo anti-CD38 en una muestra está en el intervalo entre aproximadamente 0,005, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1, 5, 25, 50, 75, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 750, 1000, 1.500 ó 2000 pg/ml, o un valor dentro del intervalo definido por dos valores cualquiera de los mencionados anteriormente. En otras realizaciones, la concentración del anticuerpo anti-CD38 en una muestra está en el intervalo entre aproximadamente 0,05 pg/ml y aproximadamente 2000 pg/ml.
En algunas realizaciones, el volumen de una o más composiciones que comprenden sCD38 y/o fragmentos del mismo utilizados en los procedimientos y/o kits que se dan a conocer en el presente documentos está en el intervalo desde aproximadamente 0,05 pl hasta aproximadamente 50 pl. En algunas realizaciones, el volumen de una o más composiciones que comprenden sCD38 y/o fragmentos del mismo utilizados en los procedimientos y/o kits que se dan a conocer en el presente documento está en el intervalo desde aproximadamente 0,25 pl hasta aproximadamente 10 pl. En algunas realizaciones, el volumen de una o más composiciones que comprenden sCD38 utilizado en los procedimientos y/o kits que se dan a conocer en el presente documento es aproximadamente 2 pl.
En algunas realizaciones, el volumen de una muestra (por ejemplo, sangre, plasma, suero, etc.) está en el intervalo desde aproximadamente 1 pl hasta aproximadamente 100 pl. En algunas realizaciones, el volumen de una muestra (por ejemplo, sangre, plasma, suero, etc.) está en el intervalo desde aproximadamente 100 pl hasta
aproximadamente 5 ml. En algunas realizaciones, el volumen de una muestra (por ejemplo, sangre, plasma, suero, etc.) está en el intervalo desde aproximadamente 5 ml hasta aproximadamente 500 ml. En algunas realizaciones, el volumen de una muestra (por ejemplo, sangre, plasma, suero, etc.) está en el intervalo desde aproximadamente 250 ml hasta aproximadamente 10.000 ml. En algunas realizaciones, el volumen de una muestra (por ejemplo, sangre, plasma, suero, etc.) está en el intervalo desde aproximadamente 25 pl hasta aproximadamente 250 pl.
En algunas realizaciones, la concentración de sCD38 y/o fragmentos del mismo en las composiciones que se dan a conocer en el presente documento está en el intervalo entre aproximadamente 0,25 mg/ml y aproximadamente 400 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de sCD38 y/o fragmentos del mismo en las composiciones y composiciones en kits de las mismas que se da a conocer en el presente documento está en el intervalo entre aproximadamente 4 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de sCD38 y/o fragmentos del mismo en las gamas de composiciones que se dan a conocer en el presente documento es aproximadamente 0,25, 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375 ó 400 mg/ml, o un valor dentro del intervalo definido por dos valores cualquiera de los mencionados anteriormente. En algunas realizaciones, la concentración de sCD38 y/o fragmentos del mismo en las composiciones que se dan a conocer en el presente documento es aproximadamente 20 mg/ml.
En algunas realizaciones, la concentración de sCD38 y/o fragmentos del mismo para la inhibición óptima de anti-CD38 está en el intervalo entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 500 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de sCD38 y/o fragmentos del mismo para la inhibición óptima de anti-CD38 está en el intervalo entre aproximadamente 5 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml.
En algunas realizaciones, la estabilidad de las realizaciones de sCD38 y/o fragmentos del mismo según la presente memoria descriptiva está en el intervalo entre aproximadamente 30 días y aproximadamente 300 días a 37 °C. En algunas realizaciones, la estabilidad de sCD38 y/o fragmentos del mismo está en el intervalo entre aproximadamente 6 meses y aproximadamente 48 meses a 2 hasta 8 °C.
En algunas realizaciones, las composiciones que se dan a conocer en el presente documento pueden proporcionarse en forma de uno o más kits.
En algunas realizaciones, las composiciones y composiciones en kits de las mismas se proporcionan en forma líquida, sólida o semisólida. Entre los ejemplos no limitantes se incluyen cápsula, tableta, óvulo, inserto, oblea, gránulo, precipitado (“pellet”), partículas, píldora, sobrecitos, comprimidos dispersables, película, crema, gel jarabe, sólido reconstituible, suspensión, emulsión, pastilla, polvo, triturado, plaqueta, etc.
En algunas realizaciones, las composiciones y composiciones en kits de las mismas comprenden ingredientes activos, ingredientes inactivos, excipientes, aditivos, y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Entre los ejemplos no limitantes se incluyen compuestos poliméricos, sales inorgánicas, aminoácidos (entre los ejemplos no limitantes se incluyen arginina, histidina, prolina etc.), aglutinantes, lubricantes, desintegrantes, surfactantes, espesantes, agentes de recubrimiento, agentes de ajuste de pH, antioxidantes, agentes saborizantes, conservantes, colorantes, etc. Entre los ejemplos no limitantes de otros vehículos farmacéuticamente aceptables se incluyen vehículos líquidos, tales como agua, alcohol, emulsión, y vehículos sólidos, tales como gel, polvo, etc. En algunas realizaciones, las composiciones y composiciones en kits de las mismas pueden comprender sales adecuadas y tampones para dar vehículos de liberación estables y permitir la aceptación de células diana.
En algunas realizaciones, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir uno o más disolventes, tampones, soluciones, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, quelantes de metales (por ejemplo, EDTA), agentes de retardo isotónicos y de absorción, y similares.
Las composiciones acuosas y composiciones en kits de las mismas comprenden una cantidad eficaz de sCD38 y/o un fragmento del mismo (por ejemplo, como proteína, ácido nucleico, o ambos) en un vehículo de liberación, (por ejemplo, liposomas, nanopartículas, u otros complejos), disueltos o dispersados en un vehículo farmacéuticamente aceptable o medio acuoso. Entre otros excipientes se incluyen polímero soluble en agua, polímeros insolubles en agua, materiales hidrofóbicos, materiales hidrofílicos, ceras, desintegrantes, superdesintegrantes, diluyentes, aglutinantes, etc.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término “sujeto” o “paciente” se refiere a cualquier vertebrado, que incluye, sin limitación, humanos, primates no humanos, ganado, oveja, cerdos, cabras, caballos, perros, gatos, ratones, ratas, conejillos de Indias, pollo, pavo, patos, gansos. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero. En algunas realizaciones, el sujeto es un humano. En algunas realizaciones, el sujeto es hombre o mujer.
ETIQUETA DE OLIGOMERIZACIÓN PARA PROTEÍNAS DE FUSIÓN
La presente memoria descriptiva también se refiere a proteínas de fusión que comprenden una etiqueta (“tag”) de oligomerización y a procedimientos para la oligomerización de una proteína de fusión recombinante. La presente memoria descriptiva también se refiere a etiquetas de oligomerización para proteínas de fusión recombinantes que
comprenden una región Fc de inmunoglobulina o un fragmento de la misma y un dominio poli-His.
Las proteínas de fusión pueden fusionarse opcionalmente a una etiqueta de oligomerización para la formación de oligómeros, tales como dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, y/o oligómeros de orden superior. Una etiqueta (“tag”) de oligomerización puede favorecer una estequiometría específica, por ejemplo, dímeros, trímeros, tetrámeros, o pentámeros, o una etiqueta de oligomerización puede permitir una distribución de oligómeros que tienen diferentes estequiometrías. Una etiqueta de oligomerización puede estar diseñada para formar homooligómeros, aunque la distinción entre homooligómeros y heterooligómeros no es particularmente limitante. En algunas realizaciones, la etiqueta de oligomerización es capaz de formar un homodímero, homotrímero, homotetrámero, u homopentámero, por ejemplo, en la que la oligomerización de un polipéptido recombinante da como resultado un oligómero predominantemente monodisperso. Una etiqueta de oligomerización proporciona diversas ventajas para las proteínas de fusión que se utilizan en los ensayos. Una etiqueta de oligomerización puede orientar los polipéptidos recombinantes relativos entre sí. Una etiqueta de oligomerización puede también aumentar la afinidad de un polipéptido recombinante por una diana. Una etiqueta de oligomerización también puede aumentar la avidez de un polipéptido recombinante que se refiere a la acumulación funcional de afinidad con múltiples grupos de unión.
La composición para la unión a un anticuerpo anti-CD38 de la invención comprende una proteína de fusión en la que la forma soluble recombinante de un dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo que interfiere con una actividad de unión de un anticuerpo anti-CD38 se fusiona con una etiqueta de oligomerización, en la que la etiqueta de oligomerización comprende una región Fc de inmunoglobulina y un dominio poli-His que contiene 8, 9, 10, 11 o 12 residuos de histidina.
En algunas realizaciones, la secuencia del a proteína de fusión o un fragmento de la misma se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 12.
En algunas realizaciones el dominio poli-His es un dominio de purificación fusionado a una proteína recombinante. En algunas realizaciones el dominio poli-His es una etiqueta de afinidad fusionada a una proteína recombinante. En algunas realizaciones, el dominio poli-His es una etiqueta de oligomerización fusionada a una proteína recombinante. En algunas realizaciones, el dominio poli-His está comprendido dentro de una etiqueta de oligomerización junto con una región Fc de inmunoglobulina.
Un dominio poli-His según las realizaciones en el presente documento, típicamente tiene 8, 9, 10, 11 ó 12 residuos de histidina.
En algunas realizaciones, la etiqueta de oligomerización comprende una región constante de inmunoglobulina IgG1. En algunas realizaciones, la etiqueta de oligomerización comprende una región constante de inmunoglobulina IgG2. En algunas realizaciones, la etiqueta de oligomerización comprende una región constante de inmunoglobulina IgG3. En algunas realizaciones, la etiqueta de oligomerización comprende una región constante de inmunoglobulina IgG4. En algunas realizaciones, la etiqueta de oligomerización comprende un fragmento de una inmunoglobulina de cualquiera de los isotipos de IgG anteriores de la región constante con una región bisagra alterada de tal modo que se expresa una fusión de Fc monomérica. En algunas realizaciones, la etiqueta de oligomerización comprende un fragmento de una región constante de inmunoglobulina IgG que comprende una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, que está fusionado en el extremo C-terminal a un dominio poli-His y a un codón de terminación.
Las especies de un dominio Fc de inmunoglobulina pueden seleccionarse en base a la utilización deseada de una proteína de fusión. Por ejemplo, las especies de dominio Fc de inmunoglobulina pueden seleccionarse de tal modo que un reactivo específico se dirige a o bien ignora el dominio Fc de inmunoglobulina en un ensayo. Un dominio Fc de ratón puede ser útil, por ejemplo, si no se utiliza ningún anticuerpo secundario anti-ratón para detectar otros anticuerpos de ratón en un ensayo. De forma similar, un dominio Fc puede ser útil para entrecruzar una proteína de fusión a un soporte sólido u otro componente de un ensayo, utilizando un anticuerpo anti-ratón. Las especies de dominio Fc pueden ser humano, ratón, conejo, rata, hámster, conejillo de Indias, cabra, oveja, caballo, pollo, o una quimera de cualquiera de las especies anteriores, aunque las especies del dominio Fc no son particularmente limitantes.
Una etiqueta de oligomerización de ejemplo es el dominio Fc de IgG de ratón que comprende la región bisagra, que permite a los polipéptidos recombinantes que comprenden la etiqueta de oligomerización formar un homodímero covalente.
En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la región Fc de la etiqueta de oligomerización es SEQ ID NO 15. En algunas realizaciones, la secuencia de la región Fc de inmunoglobulina tiene, al menos, un 90 % de identidad con SEQ ID NO 15. En algunas realizaciones, la secuencia de la región Fc de inmunoglobulina tiene entre un 90 % y un 100 % de identidad con SEQ ID NO 15. En algunas realizaciones, la secuencia de la región Fc de inmunoglobulina tiene, al menos, un 90 %, al menos, un 95 % o, al menos, un 98 % de identidad con SEQ ID NO 15.
Además de los beneficios de las etiquetas de oligomerización descritos anteriormente, los dominios Fc a menudo aumentan la expresión y/o secreción de un polipéptido recombinante en células de expresión.
Los dominios Fc también pueden ayudar a la purificación de un polipéptido recombinante, dado que los procedimientos de purificación de polipéptidos que comprenden los dominios Fc son bien conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, la secuencia de la etiqueta de oligomerización se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17 y SEQ ID NO 18.
En algunas realizaciones, la etiqueta de oligomerización comprende adicionalmente una región o dominio con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 29, y SEQ ID NO 30.
La presente memoria descriptiva también se refiere a procedimientos para la oligomerización de una proteína de fusión recombinante. En algunas realizaciones, los procedimientos para la oligomerización de una proteína de fusión recombinante comprende las etapas de: a) fusionar genéticamente una secuencia de nucleótidos que codifica para una etiqueta de oligomerización según las realizaciones de la presente memoria descriptiva a una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido; b) expresar la secuencia de nucleótidos resultante de la etapa a) en una célula huésped; c) purificar la proteína de fusión recombinante obtenida en la etapa b).
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos son no limitantes y en el alcance de la presente memoria descriptive se incluyen otras variantes contempladas por un especialista en la materia.
Ejemplo 1
Se construyeron múltiples versiones de la proteína CD38 para intentar recrear el plegamiento correcto de CD38ecd y para impedir que un mAb terapéutico cause problemas en un ensayo de detección de anticuerpos irregulares. Una versión era un dominio extracelular monomérico fusionado a una etiqueta de afinidad (CD38ecd-10His). En una segunda versión, fusión CD38ecd-Fc, el CD38ecd se fusionó a una región Fc murina (hinge-CH2-CH3) lo cual crea, de este modo, versiones diméricas (doblete) unidas por la región Fc. En otra versión, la fusión CD38ecd-Fc-10H, el CD38ecd se fusionó a una etiqueta de oligomerización, lo cual crea, de este modo versiones multiméricas. En otra versión, CD38ecd-Clath, el CD38ecd se fusionó a un dominio de clatrina. El dominio de clatrina permitió la trimerización. Otra versión, CD38ecd-p53, implicó la fusión a un dominio p53. Se conoce que el dominio p53 provoca tetramerización. En todos los casos éstas son composiciones nuevas que no se encuentran en la naturaleza. Las versiones se expresaron en células de mamífero a efectos de mantener cualquier modificación postraduccional esencial para el mantenimiento de la función de CD38.
Ejemplo 2
Varias empresas venden una proteína CD38 recombinante para su utilización en investigación. Sin embargo, la cantidad y el coste del CD38 comercialmente disponible es prohibitivo para muchos objetivos. Los intentos de otras compañías para producir CD38 recombinante han estado cargados de dificultades, tales como problemas de solubilidad, de obtención de una concentración elevada, y avidez del epítopo mediante soporte y ninguna de las proteínas CD38 comercialmente disponibles tiene la composición de las proteínas CD38 y/o fragmentos de las mismas, tal como se dan a conocer en el presente documento.
Los experimentos iniciales con los sistemas de expresión que se describen en el presente documento muestran que CD38ecd-Fc-10H era soluble y funcional. De manera importante, el CD38ecd-Fc-10H recombinante era soluble a concentraciones elevadas (hasta 35 mg/ml) permitiendo la utilización de tan solo 2 pl de la solución concentrada de CD38ecd Fc en tarjetas DG Gel®.
Ejemplo 3 - Titulaciones de Anti-CD38 en muestras de pacientes
El objetivo de este experimento fue establecer la cantidad mínima de la proteína CD38ecd-Fc-10H requerida para inhibir y neutralizar completamente en términos generales el anticuerpo anti-CD38 de concentración y titulación desconocidas que se encuentra en muestras de plasma de pacientes, a efectos de eliminar completamente el efecto del anticuerpo anti-CD38. Se tituló el plasma de tres pacientes después del tratamiento con anti-CD38 en una prueba indirecta de antiglobulina (IAT) con un reactivo de eritrocitos comercial para el cribado de anticuerpos. El experimento se llevó a cabo de la siguiente manera:
Titulación del plasma: Se titularon aritméticamente 75 pl de plasma que contenía anti-CD38 de cada paciente en PBS, pH 7,4 hasta 1:8.192.
Cribado de anticuerpos: Se pipetearon 50 pl de una célula de Screen-Cyte 0,8 % (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suiza) y 25 pl del título de plasma respectivo en la cámara de incubación de una microcolumna en una tarjeta de DG Gel Coombs (Diagnostic Grifols, Barcelona, España) y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. A continuación la tarjeta se centrifugó en una centrífuga para tarjetas DG Gel y se realizó la lectura de los resultados.
Los títulos establecidos oscilaron entre 1:1 y 1:4.096. Se concluyó que para un pretratamiento eficaz de plasma de paciente con sCD38, se tenía que neutralizar un título de anti-CD38 de, al menos, 1:2.048, mejor de 1:8.192.
Ejemplo 4 - sCD38 inhibe anticuerpos anti-CD38
Ejemplo 4a: Inhibición utilizando una preparación que contiene 2,2mg/ml de CD38ecd-Fc-10H
Preparación de las muestras (ensayo de inhibición): Se incubaron 25 pl de plasma del paciente 1 que contenía anti-CD38, no diluido o titulado aritméticamente en PBS, pH 7,4, con 2 pl hasta 32 pl de una preparación que contenía 2,2 mg/ml de CD38ecd-Fc-10H y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. Como experimento de control, de 2 pl a 32 pl de PBS, pH 7,4, se pipetearon en el plasma en lugar de CD38ecd-Fc-10H.
Cribado de anticuerpos: Se pipetearon 50 pl de Screen-Cyte 0,8 % Célula #3, lote 17005 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suiza) y 25 pl del plasma pretratado, tal como se describe anteriormente, en la cámara de incubación de una microcolumna en una tarjeta DG Gel Coombs (lote 17612.01 exp 2018-02; Diagnostic Grifols, Barcelona, España) y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. A continuación la tarjeta se centrifugó en una centrífuga para tarjetas DG Gel y se realizó la lectura de los resultados. Un resultado completamente negativo (un botón plano de células en la parte inferior de la microcolumna) fue indicativo de una inhibición completa del anti-CD38 presente en la muestra del paciente.
Con 2 pl de CD38ecd-Fc10H-20170313-NTAEPCPBS, una dilución de 1:16 del plasma pudo inhibirse completamente. Con 32 pl de CD38ecd-Fc10H-20170313-NTAEPCPBS a una concentración de 2,2 mg/ml, el anti-CD38 en plasma no diluido pudo inhibirse completamente.
Ejemplo 4b: Inhibición utilizando una preparación que contiene 35mg/ml de CD38ecd-Fc-10H
Preparación de las muestras (ensayo de inhibición): Se incubaron 25 pl de plasma del paciente 2 que contenía anti-CD38 (mostrando un título de anti-CD38 de 1:4.096) con 2 pl de CD38ecd-Fc-10H a una concentración de 35 mg/ml y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. Como experimento de control, se pipetearon 2 pl de PBS, pH 7,4 en el plasma en lugar de CD38ecd-Fc-10H.
Cribado de anticuerpos: Se pipetearon 50 pl de cada célula de Screen-Cyte 0,8 %, lote 17017 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suiza) y 25 pl del plasma pretratado, tal como se describe anteriormente, en la cámara de incubación de una microcolumna en una tarjeta DG Gel Coombs (lote 16681.01 exp 2017-11; Diagnostic Grifols, Barcelona, España) y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. La tarjeta se centrifugó en una centrífuga para tarjetas DG Gel y se realizó la lectura de los resultados. Un resultado completamente negativo (un botón plano de células en la parte inferior de la microcolumna) fue indicativo de una inhibición completa del anti-CD38 presente en la muestra del paciente.
Con 2 pl de CD38ecd- Fc10H-20170915-PROTA, pudo inhibirse completamente el plasma del paciente 2.
Ejemplo 4c: Inhibición de plasma de paciente simulado con DARA añadido (0,5mg/ml) utilizando una preparación que contiene 33mg/ml de CD38ecd-Fc-10H
Generación de plasma de paciente simulado con DARA añadido: Se añadió el fármaco terapéutico anti-CD38 (Darzalex) a plasma AB humano a una concentración final de 0,5 mg/ml.
Preparación de las muestras (ensayo de inhibición): Se incubaron 25 pl de plasma de paciente simulado con DARA añadido con 2 pl de CD38ecd-Fc-10H a una concentración de 33 mg/ml y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. Como experimento de control, se pipetearon 2 pl de PBS, pH 7,4 en el plasma en lugar de CD38ecd-Fc-10H.
Cribado de anticuerpos: Se pipetearon 50 pl de cada célula de Screen-Cyte 0,8 %, lote 180005 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suiza) y 25 pl del plasma simulado pretratado, tal como se describe anteriormente, en la cámara de incubación de una microcolumna en una tarjeta DG Gel Coombs (lote 17133.01 exp 2018-10; Diagnostic Grifols, Barcelona, España) y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. La tarjeta se centrifugó en una centrífuga para tarjetas DG Gel y se realizó la lectura de los resultados. Un resultado completamente negativo (un botón plano de células en la parte inferior de la microcolumna) fue indicativo de una inhibición completa del anti-CD38 presente en la muestra del paciente.
Con 2 pl de CD38ecd-FC10H-GDS20171106 pudo inhibirse completamente el plasma del donante con DARA añadido a una concentración de 0,5 mg/ml.
Ejemplo 5 - La inhibición de anti-CD38 por CD38ecd-Fc-10H es específica y no interfiere con aloanticuerpos de grupo sanguíneo relevantes subyacentes
Ejemplo 5a: Detección de un título bajo de anti-D en plasma simulado con DARA añadidodespués del pretratamiento con 2,2mg/ml de CD38ecd-Fc-10H.
Se añadió anti-D policlonal humano a un plasma simulado de un paciente bajo tratamiento con Darzalex el cual se volvió detectable por un panel de cribado comercial sólo después del pretratamiento con sCD38. En el plasma simulado con anti-D añadido pretratado con PBS fue imposible detectar correctamente el anti-D dado que el Darzalex interfirió con el procedimiento de cribado de anticuerpos, conduciendo de este modo a reacciones positivas en todas las células del cribado de anticuerpos derivado de la reacción de células de cribado con Darzalex.
(1) Experimentos de titulación de fármacos: Se utilizó el fármaco terapéutico anti-CD38 (Darzalex; lote GHS0901, Janssen, Estados Unidos) para preparar un plasma de paciente simulado tras la dilución en plasma AB humano en la que un anticuerpo policlonal anti-D humano se añadió al plasma AB humano. Se titularon aritméticamente 75 pl de fármaco terapéutico anti-CD38 (Darzalex) en plasma AB humano para generar plasma de paciente simulado. Se pipetearon 50 pl de Screen-Cyte 0,8 % Célula #3, lote 17005 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suiza) y 25 pl de cada título de Darzalex en la cámara de incubación de una microcolumna en una tarjeta DG Gel Coombs (lote 17612.01 exp 2018-02; Diagnostic Grifols, Barcelona, España) y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. La tarjeta se centrifugó en una centrífuga para tarjetas DG Gel y se realizó la lectura de los resultados. Este experimento estableció el título de anti-CD38 contenido en Darzalex como 1:64.000.
(2) Titulación anti-D: Se tituló aritméticamente suero de donante con título elevado de anti-D en plasma AB humano. Se pipetearon 50 pl de Screen-Cyte 0,8 % Célula #1, lote 17005 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suiza) y 25 pl de cada título de anti-D en la cámara de incubación de una microcolumna en una tarjeta DG Gel Coombs (lote 17612.01 exp 2018-02; Diagnostic Grifols, Barcelona, España) y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. La tarjeta se centrifugó en una centrífuga para tarjetas DG Gel y se realizó la lectura de los resultados. Este experimento estableció el título de anti-D en el suero del donante como 1:16.000 con célula 1.
(3) Plasma de paciente simulado: Se añadió una dilución 1:512 de anti-D a plasma AB humano previamente diluido con 1:16.000 y 1:8.000 de Darzalex a efectos de conseguir un plasma simulado con una concentración de anti-CD38 que se pudiera inhibir con 2 pl de CD38ecd-Fc-10H a una concentración de 2,2 mg/ml y tuviera un valor de anti-D cercano al límite de detección. El plasma simulado con anti-D añadido reaccionó positivamente con las 3 células en el cribado de anticuerpos llevado a cabo, tal como se da a conocer a continuación, en el punto (5). Adicionalmente, se añadió una dilución anti-D 1:4.000 a 100 pl de plasma del paciente 2 (TF1707/527) que contenía anti-CD38.
(4) Preparación de las muestras (ensayo de inhibición): Se incubaron 25 pl de plasma simulado con anti-D añadido, preparado tal como se describe en los puntos (1) a (3) anteriores, respectivamente con 2 pl o 32 pl de CD38ecd-Fc-10H a una concentración de 2,2 mg/ml (CD38ecd-Fc10H-20170313-NTAEPCPBS) y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. Como experimento de control, se pipetearon 2 pl o 32 pl PBS, pH 7,4 en el plasma, en lugar de CD38ecd-Fc-10H.
(5) Cribado de anticuerpos: Se pipetearon 50 pl de Screen-Cyte 0,8 % Células #1-3, lote 17005 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suiza) y 25 pl of the plasma pretratado, tal como se describe anteriormente, en la cámara de incubación de una microcolumna en una tarjeta DG Gel Coombs (lote 17612.01 exp 2018-02; Diagnostic Grifols, Barcelona, España) y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. La tarjeta se centrifugó en una centrífuga para tarjetas DG Gel y se realizó la lectura de los resultados. Un resultado completamente negativo (un botón plano de células en la parte inferior de la microcolumna) fue indicativo de una inhibición completa del anti-CD38 presente en la muestra del paciente.
Con 2 pl de CD38ecd-Fc10H-20170313-NTAEPCPBS a una concentración de 2,2 mg/ml el plasma simulado con anti-D añadido pudo inhibirse completamente en la célula #3, negativa para D, del panel de cribado de anticuerpos. Con 32 pl de CD38ecd-Fc10H-20170313-NTAEPCPBS, el plasma del paciente 2 con anti-D añadido pudo inhibirse completamente en la célula #3, negativa para Darzalex, del panel de cribado de anticuerpos (figura 13). Las células 1 y 2 permanecieron positivas después de la inhibición, indicando que el ensayo de inhibición llevado a cabo de la misma forma que en (4) no tiene impacto en la reactividad del anticuerpo anti-D adicionado. Los experimentos de control con plasma simulado sin anti-D añadido (inhibición completa de células #1-3 y con plasma con anti-D añadido utilizando PBS en lugar de CD38ecd-Fc-10H (sin inhibición) mostraron los resultados esperados (figura 13).
Ejemplo 5b: La inhibición de anti-CD38 por CD38ecd-Fc-10H permite la detección de anticuerpos inesperados relevantes en plasma de donante con anti-CD38 añadido
Se utilizó plasma de donante con anti-CD38 añadido que contenía anticuerpos inesperados para evaluar la detección de anticuerpos inesperados después de la inhibición completa de anti-CD38 por CD38ecd-Fc-10H. Anti-D, anti-E, anti-c, anti-Cw, anti-K, anti-Fya, anti-Jka, anti-S, anti-s, anti-M, anti-Lua, anti-Cob se volvieron detectables por un panel de cribado comercial sólo después del pretratamiento con CD38ecd-Fc-10H.
(1) Generación de plasma de paciente simulado: plasma AB de donante con anti-CD38 y aloanticuerpos añadidos: El fármaco terapéutico anti-CD38 (Darzalex) se añadió al plasma AB humano a una concentración final de 0,5mg/ml. Cada aloanticuerpo listado anteriormente se tituló aritméticamente en plasma AB humano: 50 pl de Screen-Cyte 0,8
% (para cada anticuerpo se seleccionó una célula del panel positivo para el correspondiente antígeno en base a una matriz de antígeno de producto), y 25 j l de cada dilución de aloanticuerpo analizado se pipetearon en la cámara de incubación de una microcolumna en una tarjeta DG Gel Coombs (lote 17133.01 exp 2018-10; Diagnostic Grifols, Barcelona, España) y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. La tarjeta se centrifugó en una centrífuga para tarjetas DG Gel y se realizó la lectura de los resultados. La última dilución para la que se obtuvo una reacción positiva apenas detectable se utilizó como dilución para la adición de anticuerpo inesperado en plasma de donante con anti-CD38 añadido.
(2) Preparación de las muestras (ensayo de inhibición): Se mezclaron 25 j l de plasma de donante con anti-CD38 añadido que contenía anticuerpos inesperados con 2 j l de CD38ecd-Fc-10H a una concentración de 33,4mg/ml y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C.
(3) Cribado de anticuerpos: Se pipetearon 50 j l de Screen-Cyte 0,8 % Células #1-3, lote 17026 ó 18003 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suiza) y 25 j l de plasma simulado pretratado en la cámara de incubación de una microcolumna en una tarjeta DG Gel Coombs (lote 17133.01 exp 2018-10; Diagnostic Grifols, Barcelona, España) y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. La tarjeta se centrifugó en una centrífuga para tarjetas DG Gel y se realizó la lectura de los resultados.
Una proporción de 2 jl de CD38ecd-Fc-10H (33,4mg/ml) por 25 jl de plasma permitió la detección de 16/16 anticuerpos subyacentes añadidos en cantidades apenas detectables en plasma de donante con DARA añadido (figura. 14, tabla 2). Las especificidades de anticuerpo incluían anti-D, anti-E, anti-c, anti-Cw, anti-K, anti-Fya, anti-Jka, anti-S, anti-s, anti-M, anti-Lua, anti-Cob.
Tabla 2. Detección ni r n n l m n n on DARA añadido
Ejemplo 6 - Proyección de la estabilidad de CD38ecd-Fc-10H (Estabilidad acelerada)
Ejemplo 6a: Inhibición completa de plasma anti-CD-38 no diluido
Se tomaron cinco alícuotas de 100 j l de una preparación de CD38ecd-Fc-10H, CD38ecd-Fc10H-20170313-NTAEPCPBS, en tubos separados cerrados con tapones de rosca y se colocaron en un incubador a temperatura constante de 37 °C. Antes de empezar la incubación (es decir, en el día 0) y en los día 7, 14, 21, y 31, un tubo se transfirió a 2-8 °C hasta el día 31. En el día 31 se analizaron todas las alícuotas según el siguiente procedimiento:
Preparación de las muestras (ensayo de inhibición): Se incubaron 25 j l de plasma del paciente 1 (TF1715-197) no diluido con anti-CD38 añadido con 32 j l de CD38ecd-Fc-10H y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. Como experimento de control, se pipetearon 32 j l de PBS, pH 7,4 en el plasma, en lugar de CD38ecd-Fc-10H. De forma alternativa, se incubó plasma solo durante 15 minutos a 37 °C.
Cribado de anticuerpos: Se pipetearon 50 j l de una dilución al 1 % de eritrocito de grupo sanguíneo O en DG Gel Sol (lote 16015 exp 2018-04; Diagnostic Grifols, Barcelona, España) y 25 j l de plasma pretratado, tal como se describe anteriormente, en la cámara de incubación de una microcolumna en una tarjeta DG Gel Coombs (lote 1e7612.01 exp 2018-02; Diagnostic Grifols, Barcelona, España) y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. La tarjeta se centrifugó en una centrífuga para tarjetas DG Gel y se realizó la lectura de los resultados. Un resultado completamente negativo (un botón plano de células en la parte inferior de la microcolumna) fue indicativo de una
inhibición completa del anti-CD38 presente en la muestra del paciente. Los resultados de los días 0, 7, 14, 21, y 31 mostraron igualmente inhibición completa, mientras que el experimento de control mostró una puntuación de reacción de 2, es decir, sin inhibición. En base a un diagrama de Arrhenius, se puede convertir la estabilidad demostrada del CD38ecd-Fc-10H de 31 días a 37 °C en estabilidad de, al menos, 24 meses, cuando se almacena a 2 hasta 8 °C.
Ejemplo 6b: Inhibición de plasma anti-CD38 titulado por 2 pl de CD38ecd-Fc-10H a una concentración de 2,2 mg/ml
Se tomaron cinco alícuotas de 100 pl de una preparación de CD38ecd-Fc-10H, CD38ecd-Fc10H-20170313-NTAEPCPBS, en tubos separados cerrados con tapones de rosca y se colocaron en un incubador a una temperatura constante de 37 °C. Antes de empezar la incubación y en los días 7, 14, 21, 31, un tubo se transfirió a 2-8 °C hasta el día 31. En el día 31 se analizaron todas las alícuotas según el siguiente procedimiento: 200 pl de plasma del paciente 1 (TF1715-197) con anti-CD38 añadido se tituló aritméticamente en PBS, pH 7,4 (1:2, 1:4, 1:8, 1:16) después de que se establecióo en experimentos preliminares que 25 pl of plasma diluido 1:8 podría inhibirse totalmente con un volumen de 2 pl de CD38ecd-Fc-10H.
Preparación de las muestras (ensayo de inhibición): Se incubaron 25 pl de la respectiva titulación de plasma del paciente 1 (TF1715-197) con anti-CD38 añadido con 2 pl de CD38ecd-Fc-10H a una concentración de 2,2 mg/ml y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. Como experimento de control, se pipetearon 2 pl PBS, pH 7,4 en el plasma, en lugar de CD38ecd-Fc-10H.
Cribado de anticuerpos: Se pipetearon 50 pl de una dilución al 1 % de eritrocitos de grupo sanguíneo O en DG Gel Sol (lote 16015 exp 2018-04; Diagnostic Grifols, Barcelona, España) y 25 pl del plasma pretratado, tal como se describe anteriormente, en la cámara de incubación de una microcolumna en una tarjeta DG Gel Coombs (lote 17612.01 exp 2018-02; Diagnostic Grifols, Barcelona, España) y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. La tarjeta se centrifugó en una centrífuga para tarjetas DG Gel y se realizó la lectura de los resultados. Un resultado completamente negativo (un botón plano de células en la parte inferior de la microcolumna) fue indicativo de una inhibición completa del anti-CD38 presente en la muestra del paciente. Los resultados de los días 0, 7, 14, 21, y 31 mostraron igualmente inhibición completa a un título de 1:8, mientras que el control mostró una puntuación de la reacción de 2, es decir, sin inhibición, durante toda la titulación. En base al diagrama de Arrhenius, la estabilidad demostrada del CD38ecd-Fc-10H de 31 días a 37 °C se puede convertir a estabilidad de, al menos, 24 meses, cuando se almacena a 2 hasta 8 °C.
Ejemplo 7 - Comparación de funcionalidad de CD38ecd-Fc-10H frente a CD38 recombinante humano (rhCD38)
Generacion de plasma de paciente simulado con DARA añadido: el fármaco terapéutico anti-CD38 (Darzalex) se añadió al plasma AB humano a una concentración final de 0,5mg/ml.
Preparación de las muestras (ensayo de inhibición): Se mezclaron 25 pl de plasma de donante con anti-CD38 añadido con 2 pl de CD38ecd-Fc10H a una concentración de 33,4mg/ml o con 0,447mg/ml de rhCD38 (CD38-6H, R&D Systems, cat #2404-AC-010, lote PEH0417081, Minneapolis, Estados Unidos) o con PBS, pH 7,4 y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C.
Cribado de anticuerpos: Se pipetearon 50 pl de Screen-Cyte 0,8 % Células #1-3, lote 18001 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suiza) y 25 pl del plasma simulado pretratado en la cámara de incubación de una microcolumna en una tarjeta DG Gel Coombs (lote 17108.01 exp 2018-09; Diagnostic Grifols, Barcelona, España) y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. La tarjeta se centrifugó en una centrífuga para tarjetas DG Gel y se realizó la lectura de los resultados. Un resultado completamente negativo (un botón plano de células en la parte inferior de la microcolumna) fue indicativo de una inhibición completa del anti-CD38 presente en la muestra del paciente.
2pl de CD38ecd recombinante-Fc10H permitieron la inhibición completa de 0,5mg/ml de anti-CD38. Por el contrario, el rhCD38 comercial utilizado en las mismas condiciones experimentales no pudo inhibir la misma concentración de anti-CD38 (figura 15).
Ejemplo 8 - Comparación de tiempos de incubación y temperaturas de incubación para la inhibición de anti-CD38 por CD38ecd-Fc10H
Preparación de las muestras (ensayo de inhibición): El fármaco terapéutico anti-CD38 (Darzalex; lote GHS0901, Janssen, Estados Unidos) se diluyó en PBS pH 7,4 a una concentración final de 2 mg/ml. Se titularon aritméticamente 150 pl de esta solución en PBS, pH 7,4 hasta 1:8. Se mezclaron 25 pl de cada dilución de anti-CD38 con 2 pl de CD38ecd-Fc10H a una concentración de 33,4 mg/ml, y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C, 15 minutos a temperatura ambiente, o 30 minutos a temperatura ambiente.
Cribado de anticuerpos: Se pipetearon 50 pl de Screen-Cyte 0,8 % Células #3, lote 17025 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suiza) y 25 pl de la muestra tratada anteriormente en la cámara de incubación de una microcolumna en una tarjeta DG Gel Coombs (lote 17108.01 exp 2018-09; Diagnostic Grifols, Barcelona, España) y
se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. La tarjeta se centrifugó en una centrífuga para tarjetas DG Gel y se realizó la lectura de los resultados. Un resultado completamente negativo (un botón plano de células en la parte inferior de la microcolumna) fue indicativo de una inhibición completa del anti-CD38 presente en la muestra del paciente.
Con 2 |jl de CD38ecd-Fc10H, una dilución 1:4 de la muestra (correspondiente a 0,5mg/ml de anti-CD38) pudo inhibirse completamente en los tres pretratamientos (figura 16).
Ejemplo 9 - Comparación de la actividad de CD38ecd-Fc-10H con respecto a CD38ecd-flex-Fc-10H y a CD38ecd-10H
Preparación de las muestras (ensayo de inhibición): El fármaco terapéutico anti-CD38 (Darzalex; lote GHS0901, Janssen, Estados Unidos) se diluyó en PBS pH 7,4 a una concentración final de 1 mg/ml. Se titularon aritméticamente 150 j l de esta solución en PBS, pH 7.4 hasta 1:8. Se mezclaron 25 j l de cada dilución anti-CD38 con 2 j l CD38ecd-Fc-10H ~8,5 mg/ml, o CD38ecd-flex-Fc-10H ~8,5mg/ml, o CD38ecd-10H ~5mg/ml y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C.
Cribado de anticuerpos: Se pipetearon 50 j l de Screen-Cyte 0,8 % Células #3, lote 18009 (Medion Grifols Diagnostics, Duedingen, Suiza) y 25 j l de la muestra pretratada anteriormente en la cámara de incubación de una microcolumna en una tarjeta DG Gel Coombs (lote 17133.01 exp 2018-10; Diagnostic Grifols, Barcelona, España) y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. La tarjeta se centrifugó en una centrífuga para tarjetas DG Gel y se realizó la lectura de los resultados. Un resultado completamente negativo (un botón plano de células en la parte inferior de la microcolumna) fue indicativo de una inhibición completa del anti-CD38 presente en la muestra del paciente.
Con 2j l de CD38ecd-Fc-10H y con 2 jl de CD38ecd-flex-Fc-10H, una dilución 1:8 de la muestra (correspondiente a 0,125mg/ml de anti-CD38) pudo inhibirse completamente. Con 2 jl de CD38ecd-10H una dilución 1:8 de la muestra no pudo inhibirse completamente. Solo una dilución 1:128 de la muestra (correspondiente a 0,008mg/ml de anti-CD38) pudo inhibirse completamente con 2 jl de CD38ecd-10H (figura 17).
Ejemplo 10 - Oligomerización de proteínas de fusión Fc-poli-H is
Tres proteínas de interés, CD38ecd, CD47ecd1 y Gp1ba, se fusionaron de forma recombinante a diferentes versiones de la etiqueta (“tag”) de oligomerización Fc-poli-His a efectos de investigar la capacidad de formar oligómeros de las proteínas de fusión recombinantes resultantes.
Una versión fue la proteína recombinante sCD38 fusionada a la etiqueta Fc-10His. Esta proteína se expresó y purificó hasta una concentración de 50mg/ml sin la detección de agregación visible. En una segunda versión, la proteína recombinante sCD38 se fusionó a la etiqueta flex-Fc-10His. En esta versión de la proteína de fusión la región bisagra de Fc se sustituyó por un enlazador (“linker”) flexible sin cisteínas. En una tercera versión, la proteína recombinante sCD38 se fusionó a una región Fc. En una cuarta versión, la proteína recombinante sCD38 se fusionó a la etiqueta 10His.
Con el objetivo de aplicar el procedimiento para la oligomerización de proteínas de fusión a otras proteínas de interés, la etiqueta (“tag”) de oligomerización Fc-10His se fusionó a la proteína CD47ecd1 en una versión de esta proteína. Una versión diferente de la etiqueta de oligomerización también se fusionó a la proteína Gp1ba. En una primera versión la proteína recombinante Gp1ba se fusionó a la etiqueta Fc-8His. En una segunda versión, la proteína recombinante Gp1ba se fusionó a la etiqueta 6His. En una tercera versión la proteína recombinante Gp1ba se fusionó a la etiqueta SBP-6His. En una cuarta versión la proteína recombinante Gp1ba se fusionó a la etiqueta p53-6His. Las etiquetas Fc-10His y Flex-Fc-10His por sí mismas también se utilizaron como controles.
Las múltiples versiones de proteínas de fusión se expresaron y purificaron en un sistema de expresión eucariótico. Mediante cromatografía de exclusión por tamaño mediante dispersion dinámica de luz (SEC-MALs /DLS) se midió la masa (Mw), el radio hidrodinámico (Rh(w)) y la polidispersidad (Mw/Mn) de las proteínas en solución (tabla 3). Se calculó el grado de oligomerización a partir de la proporción entre la masa medida (Mw) y la masa teórica (Th.Mw).
Para las proteínas de fusión sCD38 también se analizó la capacidad de la proteína de titular un anticuerpo como en la inhibición IAT del anti-CD38 (DARATUMUMAB) utilizando CD38ecd-Fc-10H como referencia.
Tabla 3. Grado de oligomerización de proteínas de fusión recombinantes
Las etiquetas (“tag”) de oligomerización que comprenden la combinación específica de una región Fc y un dominio poli-His (Fc-poli-His) desencadenan la oligomerización (al menos 12mer o 6mer de dímeros), de al menos 3 proteínas de interés (sCD38, CD47ecd1 y Gplba) fusionadas a ellas en el extremo N-terminal. La etiqueta Fc-10His por sí misma sin estar fusionada a una proteína de interés también forma oligómeros. Los datos que se muestran en la tabla 3 indican claramente que la oligomerización es una propiedad intrínseca de las etiquetas Fc-poli-His que no está conectada a la proteína de interés utilizada. La oligomerización de la proteína de interés no es dependiente de la región bisagra de Fc, dado que las proteínas fusionadas a Flex-Fc-10His también muestran oligomerización. Las fusiones de proteínas que comprenden solo una etiqueta poli-His sin la región Fc no desencadenan ninguna oligomerización y las proteínas obtenidas son monómeros, tal como se esperaba. Todas las proteínas de fusión que comprenden una etiqueta de oligomerización Fc-poli-His son altamente monodispersas indicando que no son agregados de moléculas no plegadas.
Finalmente, la fusion de una etiqueta (“tag”) de oligomerización Fc-poli-His a proteínas sCD38 aumenta la avidez de CD38ecd al titular un anti-CD38.
Tal como se utiliza en el presente documento, los títulos de las secciones son para propósitos de organización solamente y no se deben interpretar como limitantes de la materia de ninguna manera. Cuando las definiciones de los términos en las referencias incorporadas parecen difeir de las definiciones que se proporcionan en el presente documento, la definición que se proporciona en el presente documento predominará.
En la presente solicitud, la utilización del singular incluye el plural, a menos que específicamente se indique lo contrario. Además, la utilización de “comprende”, “comprenden”, “que comprenden”, “contiene”, “contienen”, “que contiene”, “ incluye”, “incluyen”, y “que incluye” no pretenden ser limitantes.
Tal como se utiliza en la presente especificación y reivindicaciones, las formas del singular “un” “una” y “el”, “ la” incluyen referencias en plural, a menos que el contenido dicte claramente lo contrario de otra forma.
Claims (22)
1. Composición para la unión a un anticuerpo anti-CD38, que comprende una forma recombinante soluble de un dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo que interfiere con la actividad de unión de un anticuerpo anti-CD38 fusionado a una etiqueta de oligomerización en la que la etiqueta de oligomerización comprende una región Fc de una inmunoglobulina y un dominio poli-His que contiene 8, 9, 10, 11 o 12 residuos de histidina.
2. Composición, según la reivindicación 1, caracterizada por que el tamaño de la forma recombinante soluble del dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo está en el intervalo entre aproximadamente 5 aminoácidos y aproximadamente 300 aminoácidos.
3. Composición, según la reivindicación 1, caracterizada por que el anticuerpo anti-CD38 está dirigido contra CD38 humano, CD38 no humano, o una combinación de los mismos.
4. Composición, según la reivindicación 1, caracterizada por que el anticuerpo anti-CD38 es monoclonal, policlonal, o una combinación de los mismos.
5. Composición, según la reivindicación 1, caracterizada por que el anticuerpo anti-CD38 se selecciona del grupo que consiste en Darzalex, isatuximab, y MOR202.
6. Composición, según la reivindicación 1, caracterizada por que la forma recombinante soluble del dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo se expresa en un sistema de expresión eucariótico o un sistema de expresión procariótico.
7. Composición, según la reivindicación 1, caracterizada por que dicha forma soluble del dominio extracelular de CD38 comprende un fragmento de la proteína CD38 que comprende los residuos 45 a 300 (SEQ ID NO: 1).
8. Composición, según la reivindicación 1, caracterizada por que la secuencia de dicha región Fc de una inmunoglobulina tiene como mínimo un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 15.
9. Composición, según la reivindicación 1, caracterizada por que dicha etiqueta de oligomerización comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 5, en la SEQ ID NO: 16, o en la SEQ ID NO: 17.
10. Composición, según la reivindicación 1, caracterizada por que dicha proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 7 o en la SEQ ID n O: 12.
11. Composición, según la reivindicación 1, caracterizada por que la concentración de dicha forma recombinante soluble del dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo está en el intervalo entre aproximadamente 1 mg/mL y aproximadamente 400 mg/ml.
12. Kit para ensayos de diagnóstico e investigación mediante biomonitorización que comprende la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, una placa y reactivos para identificar la presencia de anticuerpos.
13. Kit, según la reivindicación 12, caracterizado por que la placa y los reactivos del kit están configurados para un ensayo ELISA.
14. Procedimiento de neutralización o bloqueo de la unión de un anticuerpo anti-CD38 en una muestra, que comprende:
proporcionar un volumen de la muestra que comprende el anticuerpo anti-CD38; e
incubar con un volumen de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 suficiente para neutralizar el anticuerpo anti-CD38 en la muestra.
15. Procedimiento, según la reivindicación 14, caracterizado por que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma y suero.
16. Procedimiento, según la reivindicación 14, caracterizado por que el anticuerpo anti-CD38 se selecciona del grupo que consiste en Darzalex, isatuximab, y MOR202.
17. Procedimiento, según la reivindicación 14, caracterizado por que el volumen de la muestra está en el intervalo entre aproximadamente 25 |il y aproximadamente 250 |il.
18. Procedimiento, según la reivindicación 14, caracterizado por que el volumen de la muestra está en el intervalo entre aproximadamente 0.5 |il y aproximadamente 50 |il.
19. Procedimiento, según la reivindicación 14, caracterizado por que la concentración del anticuerpo anti-CD38 en la muestra está en el intervalo entre aproximadamente 0,005 pg/ml y aproximadamente 2000 pg/ml.
20. Procedimiento, según la reivindicación 14, caracterizado por que la concentración de la forma recombinante soluble del dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo en la composición está en el intervalo entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 400 mg/ml.
21. Procedimiento, según la reivindicación 14, caracterizado por que el efecto neutralizante de la forma recombinante soluble del dominio extracelular de CD38 y/o un fragmento del mismo está en el intervalo entre aproximadamente 70 % y aproximadamente 100 %.
22. Procedimiento, según la reivindicación 14, caracterizado por que la actividad de unión del anticuerpo anti-CD38 se selecciona del grupo que consiste en interferencia con ensayos de pretransfusión de sangre, interferencia con ensayos de compatibilidad sanguínea, e interferencia con terapia con anticuerpos.
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