ES2908729T3

ES2908729T3 - Nuevos compuestos y uso farmacéutico de los mismos en el tratamiento del cáncer

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Publication number: ES2908729T3
Application number: ES17725541T
Authority: ES
Inventors: Santos A Susin; Philippe Karoyan; Hélène Merle-Beral
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sorbonne Universite; Universite de Paris
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sorbonne Universite; Universite Paris Cite
Priority date: 2016-05-10
Filing date: 2017-05-10
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2037-05-10
Also published as: US20190144501A1; DK3454879T3; WO2017194627A1; US11759496B2; US20230414702A1; EP3454879B1; EP3454879A1

Abstract

Compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de fórmula (III): -A-B-X1-X2-X3-X4-X5-X6-C-D- (III) en la que A es una (D)-lisina), B es una (L)-arginina, C es una (L)-lisina, D es una (D)-lisina; A y B están unidos entre sí por un enlace pseudopeptídico -CO-NMe-; y X1-X2-X3-X4-X5-X6 es FYVVXW (SEQ ID 1), FYVVIW (SEQ ID 2), FYVVKW (SEQ ID 3) o FYVVLW (SEQ ID 4), en la que X es norleucina.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos compuestos y uso farmacéutico de los mismos en el tratamiento del cáncer

La presente invención se refiere a un compuesto o una sal farmacéutica del mismo que comprende una secuencia hexapeptídica de fórmula (III), su método de síntesis y su uso en la terapia contra el cáncer.

La descripción también se refiere a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer que comprende al menos un péptido soluble de acuerdo con la descripción o al menos un ácido nucleico que codifica los péptidos de acuerdo con la descripción o al menos un vector de expresión que codifica los péptidos de acuerdo con la descripción, o al menos una célula huésped para la provisión de los péptidos de acuerdo con la descripción y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Introducción/antecedentes de la invención

El cáncer es una neoplasia maligna. También es un amplio grupo de diversas enfermedades, todas relacionadas con el crecimiento celular no regulado. En 2007, el cáncer causó alrededor del 13 % de todas las muertes humanas en todo el mundo (7.9 millones). Las tasas están aumentando a medida que más personas viven hasta una edad avanzada y se producen cambios masivos en el estilo de vida en el mundo en desarrollo.

En particular, la leucemia linfocítica crónica (CLL) es la leucemia más común en adultos en los países occidentales y se caracteriza por una acumulación progresiva de linfocitos B monoclonales CD5+ en sangre periférica, médula ósea y órganos linfoides secundarios. La congestión resultante conduce a la falla progresiva de los sistemas inmunológico y hematopoyético. Las características de alto riesgo que predicen la progresión de la CLL incluyen la mutación/deleción de las características citogenéticas de 17p13 (TP53) y 11 q22-q23 (ATM), estado no mutado de IGHV, alta expresión de ZAP70, CD38, aumento de CD23 soluble y y las mutaciones actualmente estudiadas y aún no validadas en los genes NOTCH1, MYD88, BIRC3, XPO1, KLHL6, SF3B1 y POT1 [Gribben JG, 2010; Lanasa MC, 2010 and Chiorazzi N. et al., 2005]. Los pacientes con disfunción relacionada con los genes ATM y TP53 tienen el peor pronóstico y requieren una terapia agresiva específica que incluya un trasplante alogénico de células madre [Pospisilova N, 2012]. Las características de la CLL son: (i) incurable, ya que todos los pacientes eventualmente recaerán, lo que subraya una resistencia de la enfermedad a las opciones de tratamiento actuales, (ii) enfermedad muy heterogénea en términos de respuesta a los tratamientos existentes, aunque no óptimos, (iii) La farmacorresistencia sigue siendo una de las principales causas del fracaso del tratamiento en la CLL y su destino inevitable debido al curso natural prolongado de la enfermedad y los tratamientos repetidos, creando un problema social y de salud relevante, (iv) Afecta principalmente a las personas mayores y se considera un ejemplo paradigmático de la mayoría de los cánceres relacionados con la edad, (v) Todavía faltan marcadores robustos y específicos que predigan la respuesta al tratamiento, aunque se necesitan con urgencia para implementar un tratamiento personalizado y adaptado al riesgo y maximizar el beneficio clínico y minimizar los costes.

Aunque la causa directa del desarrollo de esta malignidad no se comprende completamente, ahora está bien demostrado que la CLL representa un ejemplo perfecto de una malignidad humana causada por un desequilibrio entre la proliferación y la Muerte Celular Programada (PCD) [Chiorazzi N, 2007]. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos de PCD que regulan la vida útil de las células de CLL leucémica debería proporcionar avances clave para las intervenciones terapéuticas en esta leucemia.

La PCD es un proceso de autodestrucción caracterizado por cambios ultraestructurales estereotipados que incluyen alteraciones mitocondriales, condensación del núcleo y el citoplasma, formación de ampollas en la membrana y exhibición externa de fosfatidilserina. La intensa investigación realizada en la última década ha identificado multitud de enzimas y otras proteínas reguladoras implicadas en la modulación de la PCD. Estos estudios concluyen que, en la mayoría de los casos, la PCD se produce cuando se activa una familia de cisteína proteasas, conocidas como caspasas. Dado que la inducción de la apoptosis mediante el uso de activadores de caspasa puede constituir teóricamente un tratamiento para el cáncer, los ensayos anticancerígenos proapoptóticos iniciales se han centrado en la actividad de la caspasa. Desafortunadamente, la mayoría de estos estudios aún se encuentran en desarrollo preclínico debido a su baja eficacia. En parte, esto puede deberse al hecho de que la PCD puede proceder incluso cuando la cascada de caspasas está bloqueada. Este hecho ha puesto de manifiesto la existencia de una vía alternativa definida como independiente de caspasas. Por lo tanto, un análisis exhaustivo de las vías de PCD independientes de caspasa ofrece un nuevo desafío en el diseño de estrategias terapéuticas contra la CLL y otras enfermedades neoplásicas.

Como se indicó anteriormente, la resistencia a los fármacos sigue siendo una de las principales causas de fracaso del tratamiento en la CLL. De hecho, las terapias actuales son responsables de varios efectos secundarios, lo que aumenta la aparición de discapacidades relacionadas con el tratamiento que, en última instancia, pueden afectar el bienestar, si no la tasa de supervivencia, de la mayoría de los pacientes. Hasta ahora, el objetivo de la terapia ha sido mantener la mejor calidad de vida y comenzar el tratamiento solo cuando los pacientes presentan síntomas de su enfermedad. Para la mayoría de los pacientes, esto significa seguir un enfoque de "esperar y ver" para determinar la tasa de progresión de la enfermedad y evaluar el desarrollo de los síntomas. Los tratamientos iniciales para los pacientes con CLL incluían un análogo de nucleósido (Fludarabina) o un agente alquilante (Clorambucilo). Este enfoque inicial ha sido mejorado por regímenes combinados tales como fludarabina y ciclofosfamida (FC), o más recientemente por la adición de rituximab a FC (tratamiento FCR) que ahora se acepta como la terapia estándar de primera línea. Se han desarrollado tratamientos alternativos para pacientes resistentes o en recaída como bendamustina, inhibidores del proteosoma o anticuerpos monoclonales (anti-CD52, anti-CD20 optimizado, anti-CD23, etc.).

En cuanto a los ensayos clínicos actuales, los más relevantes son el uso de anticuerpos monoclonales (GA101, lumiliximab, lucatumumab), miméticos de BH3 (obatoclax, ABT-263), inhibidores de la quinasa dependiente de ciclina (flavopiridol, SNS-032), inhibidores de la quinasa Lyn (dasatinib, bafetinib), agentes hipometilantes (azacitidina, decitabina), inhibidores de histona desacetilasa (parobinastat), análogos de purina (8-cloroadenosina, forodesina) e inmunofármacos modulares pequeños (TRU-016). Las moléculas que inhiben la señalización corriente abajo después de la ligadura del receptor de células B son nuevos agentes orales que interactúan en diferentes objetivos, incluidos los inhibidores de la fosfatidilinositol 3-quinasa (CAL-101), la tirosina quinasa de Bruton (BTK) (PCI-32765) y la los inhibidores de la tirosina quinasa del bazo (SYK) (fostamitinib).

La mayoría de los tratamientos quimioterapéuticos descritos anteriormente inducen citotoxicidad a través de un mecanismo dependiente de caspasa (véase arriba, página 2) con un resultado bastante variable, con muchos pacientes que tienen una reacción positiva mientras que otros siguen siendo refractarios (15-25 % de los pacientes con CLL se vuelven refractarios durante el curso de la enfermedad). De hecho, dado que las células B leucémicas presentan defectos moleculares que las hacen particularmente resistentes a la vía PCD dependiente de caspasa (inactivación de p53, sobreexpresión de proteínas antiapoptóticas, tales como Mcl-1 o Bcl-2), un grupo significativo de pacientes con CLL son refractarios a los tratamientos quimioterápicos actuales. Por esa razón, la introducción de nuevos fármacos que inducen PCD a través de vías alternativas de PCD independientes de caspasa podría proporcionar nuevos medios para mejorar las estrategias terapéuticas actuales utilizadas en el tratamiento de la CLL.

El receptor CD47 es un miembro ampliamente expresado de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig), que funciona como receptor de la trombospondina-1 (TSP-1) y como ligando para las proteínas reguladoras de la señal transmembrana SIRP a y y [Brown EJ et al., 2001]. Estas moléculas regulan diversos fenómenos biológicos en el sistema inmunológico, incluida la activación plaquetaria, la migración de leucocitos, la multinucleación de macrófagos y la PCD. Ni SIRP a ni SIRP y se han implicado en la PCD inducida por CD47 en contraste con TSP-1, que se ha demostrado que se une a CD47 específicamente a través de su dominio de unión celular COOH-terminal. Muchos cánceres parecen sobrerregular el CD47 como mecanismo de evasión inmunitaria y algunos trabajos relativamente recientes demostraron que el CD47 es un factor pronóstico y un objetivo terapéutico potencial en diferentes tipos de linfomas no Hodgkin (n Hl ), incluida la CLL [Edris, B et al., 2012; Willingham, S.B et al., 2012; Chao, MP et al., 2010; Jaiswal, S et al., 2009 y Chao, M.P et al., 2011]. Recientemente se ha demostrado que la ligadura de CD47, por un mAb anti-CD47 inmovilizado (no por un anti-CD47 soluble), induce PCD independiente de caspasa, incluso en células de CLL de pacientes refractarios [Mateo V et al., 1999; Roue G et al., 2003; Barbier S et al., 2009; Merle-Bera1H et al, 2009; Bras M et al, 2007; Mateo V et al, 2002].

En el documento WO 2013/182650 se demostró que la unión de CD47 por 4N1K, un decapéptido soluble y monovalente que imita el dominio C-terminal de TSP-1, induce PCD independiente de caspasa en células primarias de leucemia linfocítica crónica (CLL) B. Se demostró que, al contrario que el mAb anti-CD47 que debe inmovilizarse para inducir PCD, el péptido soluble 4N1K no necesita recubrirse con plástico para inducir PCD independiente de caspasa. Se encontró que un péptido de control negativo 4NGG (4N1K mutado en dos aminoácidos) no puede inducir PCD, lo que significa la especificidad de la inducción de PCD 4N1K. Además, se descubrió que la ligadura de CD47 por 4N1K y su derivado PKHB1 elimina específicamente las células B leucémicas, y no los linfocitos B sanos o las células B normales en reposo de pacientes con CLL (Figura 2, 5 y 6) y, por lo tanto, representa un mejor medio de inducir la muerte que la PCD dependiente de caspasa (esta forma de muerte es eficaz incluso en células de CLL de individuos refractarios a fármacos que tienen deleción en 17pl3 o I1q22-q23: ATM/TP53 inactivado). Los estudios en ratones in vivo confirmaron completamente la especificidad de esta estrategia peptídica para inducir PCD en células leucémicas. Por lo tanto, esta invención se refiere a un péptido soluble que comprende la secuencia de aminoácidos: KRFYVVMWK o una variante conservadora de función del mismo para su uso en el tratamiento del cáncer.

Sin embargo, y aunque en el documento WO 2013/182650 permitieron identificar secuencias peptídicas específicas para su uso en el tratamiento del cáncer, todavía existe la necesidad de identificar compuestos más potentes que presenten propiedades de ligamiento de CD47, en particular para la investigación y el tratamiento del cáncer. La presente invención responde a esta primera necesidad mediante la identificación de los residuos de farmacóforos en una secuencia peptídica de seis residuos de aminoácidos esenciales.

Además desde un punto de vista práctico y además de la estabilidad metabólica, el uso de péptidos como herramientas terapéuticas requiere preferiblemente el diseño de compuestos estables en formulación líquida, especialmente en soluciones acuosas. Esto permite una fácil preparación de la solución a inyectar, en caso de que se prepare extemporáneamente. Esto también permite un proceso de preparación más sencillo y económico en comparación con los productos liofilizados, es decir, en forma de polvo o, más generalmente, como sólidos, en los que los costes de producción son elevados, ya que comprende los costes de congelación, producción de vacío y almacenamiento/reciclado de disolventes del tratamiento de cantidades relativamente grandes de soluciones que se van a secar. Además, en el caso de soluciones inyectables que deben prepararse extemporáneamente a partir de un polvo y agua estéril, los medios de almacenamiento, logística y transporte son más voluminosos, pesados (diferentes empaques para diferentes productos), complicados y, por lo tanto, más costosos de manejar.

Por lo tanto, la estabilidad de los fármacos que comprenden una secuencia peptídica en formulaciones líquidas (p. ej., acuosas) es un factor importante que hay que considerar en el diseño y desarrollo de fármacos peptídicos. Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que los análogos de 4N1K diseñados inicialmente a veces eran rápidos para la agregación y han resuelto este problema principal mediante el diseño de nuevos compuestos (especialmente PKT16) descritos a continuación.

Sumario de la invención

El asunto objeto de la invención está definido por las reivindicaciones 1 a 5.

En particular, la presente invención se refiere a un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de fórmula (III):

-A-B-X1-X2-X3-X4-X5-X6-C-D- (III)

en la que

A es una (D)-lisina), B es una (L)-arginina, C es una (L)-lisina, D es una (D)-lisina;

A y B están unidos entre sí por un enlace pseudopeptídico -CO-NMe-; y

X1-X2-X3-X4-X5-X6 es FYVVXW (SEQ ID 1), FYVVIW (SEQ ID 2), FYVVKW (SEQ ID 3) o FYVVLW (SEQ ID 4), en la que X es norleucina.

En una realización, dicho compuesto o sal farmacéuticamente aceptable del mismo se elige del grupo que consiste en: H-(D)K ^(CONMe)R F Y V V X W K (D)K-OH (SEQ ID 21)

H-(D)K ^(CONMe)R F Y V V L W K (D)K-OH (SEQ ID 22)

H-(D)K ^(CONMe)R F Y VV I W K (D)K-OH (SEQ ID 23)

La presente invención también se refiere a un método para producir dicho compuesto o una sal farmacéutica caracterizado por las siguientes etapas sucesivas:

a) el compuesto (III) se produce primero, como en un soporte sólido a través de la síntesis de péptidos de soporte sólido a partir del extremo C-terminal, con los grupos protectores convenientes en las cadenas laterales de residuos de aminoácidos X1, X2, X3, X4, X5, X6;

b) opcionalmente, el extremo N-terminal del compuesto (III) se desprotege y se injerta con el fragmento conveniente;

c) opcionalmente, el extremo C-terminal del compuesto (III) se desprotege o escinde e injerta con el fragmento conveniente; y

d) luego se eliminan los grupos protectores restantes del compuesto (III).

Además, el asunto objeto de la presente invención se refiere a un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable como se define actualmente para su uso como medicamento.

Además, el objeto de la presente invención se refiere a un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable según se define actualmente para su uso como inhibidor de CD47, en particular en el tratamiento del cáncer.

Descripción detallada

La presente descripción generalmente se refiere a un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que comprende una secuencia hexapeptídica de fórmula (I):

-XI-X2-X3-X4-XS-X6-(I)

en la que:

• X1, X2, X3, X4, X5, X6 están unidos entre sí de forma independiente de acuerdo con la fórmula (I) a través de enlaces peptídicos o al menos un enlace pseudopeptídico;

• X1 es un residuo escogido en la lista que consiste en fenilalanina sustituida o no sustituida, paratirosina sustituida o no sustituida, ortotirosina sustituida o no sustituida, metatirosina sustituida o no sustituida u homofenilalanina sustituida o no sustituida;

• X2 es un residuo escogido en la lista que consiste en para-tirosina sustituida o no sustituida, orto-tirosina sustituida o no sustituida, meta-tirosina sustituida o no sustituida, fenilalanina sustituida o no sustituida, homofenilalanina, homo-meta-tirosina, homo-para-tirosina u homo-orto-tirosina

• X3 es un residuo escogido en la lista que consiste en valina sustituida o no sustituida, alanina sustituida o no sustituida, leucina sustituida o no sustituida, isoleucina sustituida o no sustituida, preferiblemente valina;

• X4 es un residuo escogido en la lista que consiste en valina sustituida o no sustituida, alanina sustituida o no sustituida, leucina sustituida o no sustituida, isoleucina sustituida o no sustituida, preferiblemente valina;

• X5 es un residuo escogido en la lista que consiste en metionina sustituida o no sustituida o cualquier aminoácido con propiedades similares tales como una homocisteína metilada, lisina, norleucina, leucina o isoleucina; • X6 es un residuo escogido en la lista que consiste en triptófano sustituido o no sustituido, heterotriptófano sustituido o no sustituido, paratirosina sustituida o no sustituida, ortotirosina sustituida o no sustituida, metatirosina sustituida o no sustituida, fenilalanina sustituida o no sustituida, o naftilalanina no sustituida; • X1 es el lado N-terminal de la molécula de fórmula (I), X6 es el lado C-terminal de la molécula de fórmula (I); • la secuencia hexapeptídica de fórmula (I) comprende al menos un residuo de paratirosina sustituida o no sustituida, ortotirosina sustituida o no sustituida, metatirosina sustituida o no sustituida,

caracterizado por que dicho compuesto es un agonista de CD47,

con la condición de que dicho compuesto no sea uno descrito en WO2013/182650 o en WO2015/086727 (que divulga las mismas estructuras peptídicas que WO 2013/182650). De hecho, la presente descripción ha permitido comprender mejor lo que en los compuestos descritos en WO2013/182650 permite mejorar la actividad, en particular en CD47. Hay varias maneras de lograr esto. Esto también ha llevado a darse cuenta de que los compuestos descritos y reivindicados en WO2013/182650 son sólo una minoría de los compuestos que son susceptibles de presentar la actividad.

Sin estar ligado a la definición del presente, la expresión "con la condición de que dicho compuesto no sea uno de los descritos en WO2013/182650” significa que cualquier compuesto per se que haya sido expresamente divulgado en WO 2013/182650 debe excluirse del alcance de la presente descripción. Por lo tanto, el objeto de la presente descripción se refiere a un compuesto o una de sus sales farmacéuticamente aceptables que comprende una secuencia hexapeptídica de fórmula (I) como se define en el presente, con la condición de que no se cubra ninguno de los siguientes péptidos:

KRFYGGMWKK;

(D)KRFYGGMW(D)K

KRFYVVMWKK

(D)R-F-Y-V-V-M-W-K

R-(D)F-Y-V-V-M-W-K

R-F-(D)Y-V-V-M-W-K

R-F-Y-(D)V-V-M-W-K

R-F-Y-V-(D)V-M-W-K

R-F-Y-V-V-(D)M-W-K

R-F-Y-V-V-M-(D)W-K

R-F-Y-V-V-M-W-(D)K

(D)R-(D)F-(D)Y-(D)V-(D)V-(D)M-(D)W-(D)K

(D)K-(D)W-(D)M-(D)V-(D)V-(D)Y-(D)F-(D)R

AzÍdo(D)K-(D)W-(D)M-(D)V-(D)V-(D)Y-(D)F-(D)R

(D)K-R-F-Y-V-V-M-W-K-K

K-(D)R-F-Y-V-V-M-W-K-K

K-R-(D)F-Y-V-V-M-W-K-K

K-R-F-(D)Y-V-V-M-W-K-K

K-R-F-Y-(D)V-V-M-W-K-K

K-R-F-Y-V-(D)V-M-M-K-K

K-R-F-Y-V-V-(D)M-W-K-K

K-R-F-Y-V-V-M-(D)W-K-K

R-R-F-Y-V-V-M-W-(D)K-K

K-R-F-Y-V-V-M-W-K-(D)K

K-R-F-Y-V-V-M-W-K-(D)R

(D)K-R-F-Y-V-V-M-W-K-(D)K

(D)K-(D)R-(D)F-(D)Y-(D)V-(D)V-(D)M-(D)W-(D)K-(D)K (D) K-( D) K-( D)W-(D) M-(D)V-( D)V-(D)Y-( D) F-( D) R-(D)K

en la que R7 se refiere a cadenas laterales de metionina, metionina sulfóxido, metionina sulfona o alanina o butilglicina o lisina,

en la que R4 se refiere a cadenas laterales de metionina o alanina o butilglicina o lisina;

y

Aunque las siguientes estructuras se distinguen de la fórmula (I) de la presente descripción por una prolina en la posición X4 para PKHB9 y una metil-prolina en la posición X3 para PKHB10, es obvio que la fórmula (I) no cubre PKHB9 o PKHB10:

De la misma forma, la fórmula (I) no comprende moléculas como las que se encuentran en la página 14, líneas 10 a 13 de WO2015/086727:

Donde X y/o Y pueden ser nada o hidrógeno y/o espaciadores y/o tintes fluorescentes.

Preferiblemente, la fórmula (I) de la presente descripción no comprende espaciadores (como se define en WO2015/086727) o tintes fluorescentes (como se define en WO2015/086727). Más preferiblemente, la fórmula (I) de la presente descripción no comprende ningún residuo de aminoácido de lisina unido a uno o varios espaciadores (como se define en WO2015/086727) o tintes fluorescentes (como se define en WO2015/086727).

Más precisamente, el objeto de la presente descripción se refiere a un compuesto o una de sus sales farmacéuticamente aceptables que comprende una secuencia hexapeptídica de fórmula (I) como se define actualmente, con la condición de que cuando X1, X2, X3, X4, X5, X6 están todos unidos entre sí de acuerdo con la fórmula (I) a través de enlaces peptídicos únicamente:

si X5 es una lisina o un n-butil-a-glicina, entonces el hexapéptido (I), con X 1, X2, X3, X4 y

X5 todos excepto uno que tiene la configuración (L), no se pueden unir a través de enlaces peptídicos a través de X1 a H-(L)Lys- y a través de X6 a -(L)Lys-OH; o

X5 no es un residuo de metionina en los casos en que:

el hexapéptido (I), con Xi, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X 1 al Arg del dipéptido H-(L)Lys(L)Arg- y a través de X6 al dipéptido -(L)Lys(L)Lys-OH; el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X1 al Arg del dipéptido [Marcador]-(L)Lys(L)Arg- y a través de X6 al dipéptido -(L)Lys(L)Lys-OH, en el que el [Marcador] es:

unido por su extremo de cadena NH;

el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X 1 al Arg del dipéptido H-(D)Lys(L)Arg- y a través de X6 a -(D)Lys-OH;

el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X 1 al Arg del dipéptido H-(L)Lys(L)Arg- y a través de X6 al dipéptido -(L)Lys(D)Lys-OH; el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X 1 al Arg del dipéptido H-(D)Lys(L)Arg- y a través de X6 al dipéptido -(L)Lys(L)Lys-OH; el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X 1 al Arg del dipéptido H-(L)Lys(D)Arg- y a través de X6 al dipéptido -(L)Lys(L)Lys-OH; el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todos excepto para uno que es de la configuración (L), están unidos a través de enlaces peptídicos a través de X 1 al Arg del dipéptido H-(L)Lys(L)Arg- y a través de X6 al dipéptido -(L)Lys(L)Lys-OH;

el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X 1 al Arg del dipéptido H-(L)Lys(L)Arg- y a través de X6 al dipéptido -(D)Lys(L)Lys-OH; el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X 1 al Arg del dipéptido H-(L)Lys(L)Arg- y a través de X6 al dipéptido -(L)Lys(D)Lys-OH; el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X 1 al Arg del dipéptido H-(D)Lys(L)Arg- y a través de X6 al dipéptido -(L)Lys(D)Lys-OH; el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todos siendo de la configuración (D), están unidos a través de enlaces peptídicos a través de X 1 al Arg del dipéptido H-(D)Lys(D)Arg- y a través de X6 al dipéptido -(D)Lys(D)Lys-OH; el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X1 al Arg del dipéptido H-(L)Lys(L)Arg- y a través de X6 a la Lys del dipéptido -(L)Lys(D)Arg-OH;

el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X 1 al Arg del dipéptido N-(L)^(N2)Lys(L)Arg- y a través de X6 a -(L)Lys-OH;

el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X 1 a N-(L)^(N2)Lys- y a través de X6 a -(L)Lys-OH;

el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X1 a H-[beta(2,2)-homo-Lys]- y a través de X6 a la (L)-Lys del dipéptido -(L)Lys(D)Lys-OH; el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X 1 a H-(L)Arg- o H-(D)Arg- y a través de X6 a -(L)Lys-OH;

• el hexapéptido (I), con Xi, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X 1 a H-(L)[homo-Arg]- y a través de X6 a -(L)Lys-OH;

• el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X 1 a H-(L)[homo-Arg]- y a través de X6 a -(L)[homo-Lys]-OH;

• el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todo siendo de la configuración (L), está unido a través de enlaces peptídicos a través de X 1 a H-[beta(2,2)-homo-Arg]- y a través de X6 a -[beta(2,2)-homo-Lys]-OH;

• el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todos excepto uno que tiene la configuración (L), están unidos a través de enlaces peptídicos a través de X1 a H-(D)Arg- y a través de X6 a -(L)Lys-OH;

• el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todos excepto uno que tiene la configuración (L), están unidos a través de enlaces peptídicos a través de X1 a H-(L)Arg- y a través de X6 a -(L)Lys-OH;

• el hexapéptido (I), con X1, X2, X3, X4 y X5 todos excepto uno que tiene la configuración (L), están unidos a través de enlaces peptídicos a través de X1 a H-(L)Arg- y a través de X6 a -(D)Lys-OH;

o con la condición de que en dicho compuesto o sal del mismo no sean de la siguiente fórmula:

en la que R7 se refiere a las cadenas laterales de metionina, sulfóxido de metionina, sulfona de metionina, alanina, butilglicina o lisina.

Debe entenderse que el término "péptido" significa un polímero de aminoácidos, estando unidos dichos aminoácidos entre sí por un enlace peptídico y/o pseudopeptídico. Un péptido contiene generalmente entre 2 y 80 a 100 aminoácidos, no estando claramente definido el límite superior. Los compuestos de la presente descripción contienen péptidos entre 6 y 80 aminoácidos, más preferiblemente entre 7 y 40 aminoácidos, y aún más preferiblemente entre 8 y 20 aminoácidos.

Por “péptido lineal” se entiende que todos los aminoácidos del péptido están enlazados en su orden secuencial y que el péptido tiene un N-terminal y un C-terminal.

Generalmente, por "péptido cíclico" se entiende una secuencia de aminoácidos sin un N-terminal o C-terminal. En el contexto de la presente descripción, un péptido cíclico puede estar unido por una cadena lateral al soporte sólido, por lo que se aplica la definición general, o puede estar unido al soporte por uno de sus extremos N-terminal o C-terminal y luego el anillo se cierra por medio de al menos una cadena lateral de aminoácido.

Un "pseudopéptido" es un péptido que comprende al menos un enlace pseudopeptídico. Un "enlace pseudopeptídico" une dos aminoácidos de una manera diferente al enlace -CO-NH-. Por lo tanto, uno de los dos aminoácidos puede ser no natural o ser reemplazado por un análogo no aminoacídico que tenga los grupos funcionales necesarios para el enlace pseudopeptídico como, p. ej., un diácido de tipo diamina o malonato. En el contexto de la presente descripción, los enlaces pseudopeptídicos se seleccionan ventajosamente de -CO-N(alquilo C1-C6)- tal como -CO-N(Me)-, -CO-N(OH)-, -CO-N(alquilo C1-C6 OH)-, -CON(NH2)-, -CO-CH2-, -CO-CH(alquilo C1-C6)- tal como -CO-CH(Me)-, -CO-O-, -COS-, -CS-NH-, -CS-N(alquilo C1-C6)- tal como -CS-N(Me)-, -CS-N(Oh )-, -CS-N(alquilo C1-C6 sustituido por OH)-, -CS-N(NH2)-, -CS-CH2-, -CS-O-, -CS-S-, -CS-(NH-NH)-, -(C=CH2)-NH-, -(C=CH2)-N(alquilo C1-C6)- tal como -(C=CH2)-N(Me)-, -(C=CH2)-N(OH)-, -(C=CH2)-N(alquilo C1-C6 sustituido por OH)-, -(C=CH2)-N(NH2)-, -(C=CH2)-CH2-, -(C=CH2)-O-, -(C=CH2)-S-,-(C=CH2)-(NH-NH)-

Los enlaces pseudopeptídicos preferidos de acuerdo con la presente descripción son -CO-N(alquilo C1 -C6)- tal como -CO-N(Me)-, -CO-CH(alquilo CrCa)- tal como -CO-CH(Me)-.

Cuando se forman enlaces pseudopeptídicos, también se pueden proteger los diversos grupos reactivos de los aminoácidos. El término "pseudopéptidos" también comprende compuestos que tienen enlaces pseudopeptídicos cuyos grupos reactivos, como los de las cadenas laterales, están protegidos.

Estos grupos protectores son grupos conocidos por el experto en la técnica. Estos grupos protectores y su uso se describen en trabajos tales como, p. ej., Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, New York, 2007 4thedition; Harrison et al., "Compendium of Synthetic Organic Methods", Vol. 1 to 8 (J. Wiley & Sons, 1971 to 1996). Moreover, peptide synthesis techniques are described in Paul Lloyd to Williams, Fernando Albericio, Ernest Giralt, "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins", CRC Press, 1997 or Houben-Weyl, "Methods of Organic Chemistry, Synthesis of Peptides and Peptidomimetics", Vol. E 22a, Vol. E 22b, Vol. E 22c, Vol. E 22d., M. Goodmann Ed., Georg Thieme Verlag, 2002.

Un ejemplo de un pseudopéptido preferido son los depsipéptidos, es decir, péptidos en los que al menos un enlace peptídico ha sido reemplazado por un enlace éster -COO-.

La expresión "aminoácido" se refiere a cualquier molécula que tiene al menos un ácido carboxílico, al menos una amina y al menos un carbono que une dicha amina y dicho ácido carboxílico. Preferiblemente, los aminoácidos que se pueden usar en el contexto de la presente descripción son los llamados aminoácidos "naturales" y/o aminoácidos sintéticos como se define a continuación. Preferiblemente, los aminoácidos de la presente descripción son L-aminoácidos.

La expresión "aminoácido natural" representa, pero no se limita a, los siguientes aminoácidos: glicina (Gly), alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile), serina (Ser), treonina (Thr), fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr), triptófano (Trp), cisteína (Cys), metionina (Met), prolina (Pro), ácido aspártico (Asp), asparagina (Asn), glutamina (Gln), glutámico (Glu), histidina (His), arginina (Arg) y lisina (Lys). Los aminoácidos naturales preferidos de acuerdo con la presente descripción son L-aminoácidos.

Por "aminoácido sintético" se entiende todos los aminoácidos no naturales como se define anteriormente. Estos aminoácidos sintéticos se pueden seleccionar de: p-alanina, alilglicina, tert-leucina, norleucina (Nle), ácido 3-aminoadípico, ácido 2-aminobenzoico, ácido 3-aminobenzoico, ácido 4, ácido 2-aminobutanoico, ácido 4-aminolcarboximetil piperidina, ácido 1-amino-1-ciclobutanocarboxílico, ácido 4-aminociclohexanoacético, ácido 1-amino-1-ciclohexanocarboxílico, ácido (1R,2R)-2-aminociclohexanocarboxílico, ácido (1R,2S)-2-aminociclohexanocarboxílico, ácido (1S,2R)-2-aminociclohexanocarboxílico, ácido (1S,2S)-2-aminociclohexanocarboxílico, ácido 3-aminociclohexanocarboxílico, ácido 4-aminociclohexanocarboxílico, ácido (1R,2R)-2-aminociclopentanocarboxílico, ácido (1R,2S)-2-aminociclopentanocarboxílico, ácido 1-amino-1-ciclopentanocarboxílico, ácido 1-amino-1-ciclopropanocarboxílico, ácido 3-aminometilbenzoico, ácido 4-aminometilbenzoico, ácido 2-aminobutanoico, ácido 4-aminobutanoico, ácido 6-aminohexanoico, 1-aminoindano-1 -ácido carboxílico, ácido 2-aminoisobutírico (Aib), ácido 4-aminometil-fenilacético, ácido 4-aminofenilacético, ácido 3-amino-2-naftoico, ácido 4-aminofenilbutanoico, ácido 4-amino-5-(3-indolil)-pentanoico, ácido (4R,5S)-4-amino-5-metilheptanoico, ácido (R)-4-amino-5-metilhexanoico, ácido (R)-4-amino-6-metiltiohexanoico, ácido (S)-4-aminopentanoico, ácido (R)-4-amino-5-fenilpentanoico, ácido 4-aminofenilpropiónico, ácido (R)-4-aminopimérico, ácido (4R,5R)-4-amino-5-hidroxihexanoico, ácido (R)-4-amino-5-hidroxipentanoico, ácido (R)-4-amino-5-(p-hidroxifenil)-pentanoico, 8 -ácido aminooctanoico, ácido (2S,4R)-4-amino-pirrolidin-2-carboxílico, ácido (2S,4S)-4-amino-pirrolidin-2-carboxílico, ácido azetidin-2-carboxílico, ácido (2S,4R)-4-bencil-pirrolidin-2-carboxílico, ácido (S)-4,8-diaminooctanoico, tert-butilglicina, Y-carboxiglutamato, p-ciclohexilalanina, citrulina, ácido 2,3-diaminopropiónico, ácido hipúrico, homociclohexilalanina, moleucina, homofenilalanina, 4-hidroxiprolina, ácido indolin-2-carboxílico, ácido isonipecótico, a-metil-alanina, naftil-alanina, ácido nicopético, norvalina, ácido octahidroindol-2-carboxílico, ornitina (Orn), penicilamina, fenilglicina (Phg), ácido 4-fenil-pirrolidin-2-carboxílico, propargilglicina, 3-piridinilalanina, 4-piridinilalanina, ácido 1 -pirrolidin-3-carboxílico, sarcosina, estatinas, ácido tetrahidroisoquinolin-1-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, ácido tranexámico, 4,4-difluoroprolina, 4-fluoroprolina, alfa-(3,4-difluorobencil)-prolina, gamma-(3, 4-difluorobencil)-prolina, alfa-(trifluorometil)fenilalanina, hexafluoroleucina, 5,5,5-trifluoroleucina, 6,6,6-trifluoronorleucina, 2-(trifluorometil)leucina, 2-(trifluorometil)norleucina, 4,4,4-trifluorovalina, 4,4,4,4',4',4'-hexafluorovalina, pentafluorofenilalanina, 2,3-difluorofenilalanina, 2,4-difluorofenilalanina, 2,5-difluorofenilalanina, 2,6-difluorofenilalanina, 3,4-difluorofenilalanina, 3,5-difluorofenilalanina, 3,3-difluoro-3-(4-fluorofenil)alanina, 2,3-difluorofenilglicina, 2,4-difluorofenilglicina, 2,5-difluorofenilglicina, 3,4-difluorofenilglicina, 4,4-difluoroetilglicina, 4,4,4-trifluoroetilglicina, 4-fluorotriptófano, 5-fluorotriptófano, 6-fluorotriptófano, 5-metiltriptófano, Stritilcisteína, selenocisteína, selenometionina, etionina, p-(2-tienil)alanina, p-cloroalanina, tiazolilalanina, triazolalanina, p-fluorofenilalanina, o-fluorofenilalanina, m-fluorofenilalanina, dihidroxifenilalanina, 2,5-dihidrofenilalanina, tioprolina, ácido pipecólico, canavanina, indospicina, 3,4-deshidroprolina, histidinol y hexafluoronorleucina, y similares.

El término "cadena lateral de un aminoácido" se refiere al fragmento que lleva el carbono alfa de un aminoácido. P. ej., las cadenas laterales de aminoácidos naturales tales como la glicina, la valina, la alanina y el ácido aspártico corresponden al átomo de hidrógeno y a los grupos isopropilo, metilo y -CH2-COOH, respectivamente.

Las cadenas laterales de otros aminoácidos pueden incluirse en la definición de cadena lateral de un aminoácido, como las de los siguientes aminoácidos: ácido 4-amino tetrahidropiran-4-carboxílico, alilglicina, ácido diaminobutírico, ácido diaminopropiónico, aminoserina, ácido aminobutírico, aminobutilglicina, fenilglicina, 4-fluorofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, citrulina, ciclohexilalanina, tienilalanina y similares.

Las cadenas laterales de aminoácidos pueden estar protegidas por grupos protectores (P) y más particularmente por grupos N-protectores, O-protectores o S-protectores cuando estas cadenas contienen los correspondientes heteroátomos. Ciertos grupos funcionales reactivos de péptidos deben protegerse durante la síntesis de dichos péptidos. De hecho, los péptidos se sintetizan normalmente mediante la activación del grupo funcional ácido carboxílico de un aminoácido, o de una cadena de aminoácidos, por medio de un agente de acoplamiento. Este ácido activado se junta con un aminoácido, o una cadena de aminoácidos, cuya amina terminal no está protegida, lo que da como resultado la formación de un enlace amida, también llamado enlace peptídico. Las condiciones de acoplamiento y los agentes de acoplamiento utilizados son muy conocidos por el experto en la técnica.

Los grupos protectores (P) son también grupos conocidos por el experto en la técnica. Estos grupos protectores y su uso se describen en trabajos tales como, p. ej., Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, New York, 2007 4thedition; Harrison et al., "Compendium of Synthetic Organic Methods", Vol. 1 to 8 (J. Wiley & Sons, 1971 to 1996). Moreover, peptide synthesis techniques are described in Paul Lloyd-Williams, Fernando Albericio, Ernest Giralt, "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins", CRC Press, 1997 or Houben-Weyl, "Methods of Organic Chemistry, Synthesis of Peptides and Peptidomimetics", Vol. E 22a, Vol. E 22b, Vol. E 22c, Vol. E 22d., M. Goodmann Ed., Georg Thieme Verlag, 2002. Los grupos protectores transportados por un átomo de nitrógeno se denominarán grupos N-protectores.

Lo mismo se aplica a los grupos protectores S y protectores O, etc. P. ej., el hidroxilo puede protegerse mediante un grupo tritilo, o el ácido carboxílico puede protegerse en forma de éster tert-butílico. En el caso de síntesis sobre soporte sólido, es la resina la que sirve como grupo protector del grupo funcional carboxílico C-terminal.

La protección del grupo amino (es decir, "alfa amina") del aminoácido se puede llevar a cabo, p. ej., mediante un grupo tert-butiloxicarbonilo (en lo sucesivo denominado Boc-) o un grupo -9-fluorenilmetiloxicarbonilo (en lo sucesivo denominado como Fmoc-).

La protección se lleva a cabo de acuerdo con métodos conocidos de la técnica anterior. P. ej., la protección por el grupo Boc se puede obtener haciendo reaccionar el aminoácido con di-tert-butilpirocarbonato (Boc2O). Al proteger grupos funcionales de aminoácidos naturales, los aminoácidos obtenidos son sintéticos hasta que se elimine el grupo o grupos protectores, liberando así el llamado aminoácido natural.

Los péptidos normalmente se sintetizan mediante la activación del grupo funcional ácido carboxílico de un aminoácido, o una cadena de aminoácidos, por medio de un agente de acoplamiento. Este ácido activado se junta con un aminoácido, o una cadena de aminoácidos, cuya amina terminal no está protegida, lo que da como resultado la formación de un enlace amida, también llamado enlace peptídico. Las condiciones de acoplamiento y los agentes de acoplamiento utilizados son bien conocidos por el experto en la técnica y se describen, p. ej., en trabajos tales como Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, New York, 20074thedition; Harrison et al., "Compendium of Synthetic Organic Methods", Vol. 1 to 8 (J. Wiley & Sons, 1971 to 1996). Moreover, peptide synthesis techniques are described in Paul Lloyd-Williams, Fernando Albericio, Ernest Giralt, "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins", CRC Press, 1997 or Houben-Weyl, "Methods of Organic Chemistry, Synthesis of Peptides and Peptidomimetics", Vol. E 22a, Vol. E 22b, Vol. E 22c, Vol. E 22d., M. Goodmann Ed., Georg Thieme Verlag, 2002

Los enlaces peptídicos "-NH-CO-" (o sus enlaces pseudopeptídicos equivalentes) incrustados en el esqueleto de la secuencia peptídica permiten dar al péptido un "extremo C-terminal" que corresponde al CO del lado lejano del péptido (es decir, el último CO de la secuencia), que puede ser COOH, COO-, CONH2, CO-resina, COOtBu, etc. De manera similar, el "extremo N-terminal" del péptido es, por lo tanto, el lado opuesto del péptido que puede ser un -NH2, - NH3+, -NH-Boc, -NH-Fmoc, N3, NAc, etc

La expresión "fenilalanina sustituida o no sustituida" significa un residuo de fenilalanina que está sustituido en la cadena lateral, es decir, CH2-Ph, por ejemplo un átomo de halógeno, preferiblemente flúor, o un grupo escogido entre -NH2 o -NO2. En una realización particular de la presente descripción, la sustitución es en la posición para del fenilo.

La expresión "homofenilalanina sustituida o no sustituida" significa un residuo de homofenilalanina que está sustituido en la cadena lateral, es decir, -CH2-CH2-Ph, por ejemplo un átomo de halógeno, preferiblemente flúor, o un grupo escogido entre -NH2, -NO2 o -OH. En una realización particular de la presente descripción, la sustitución es en la posición para del fenilo.

Aunque el término "tirosina" puede abarcar para-tirosina, orto-tirosina o meta-tirosina, preferiblemente significa paratirosina.

La expresión "para-tirosina sustituida o no sustituida" significa un residuo de para-tirosina que está sustituido en la cadena lateral, es decir, -CH2-Ph-OH en el que OH está en la posición 4, por ejemplo un átomo de halógeno, preferiblemente flúor, o un grupo escogido entre amina, nitro, hidroxilo. En una realización particular de la presente descripción, la sustitución es la posición meta (posiciones 3 y/o 5) y/u orto (posiciones 2 y/o 6) del fenilo.

La expresión "orto-tirosina sustituida o no sustituida" significa un residuo de orto-tirosina que está sustituido en la cadena lateral, es decir, -CH2-Ph-OH en el que OH está en la posición 2, por ejemplo un átomo de halógeno, preferiblemente flúor, o un grupo escogido entre amina, nitro, hidroxilo. En una realización particular de la presente descripción, la sustitución es la posición meta (posiciones 3 y/o 5), orto (posición 6) y/o para (posición 4) del fenilo.

La expresión "meta-tirosina sustituida o no sustituida" significa un residuo de meta-tirosina que está sustituido en la cadena lateral, es decir, -CH2-Ph-OH en el que OH está en la posición 3, por ejemplo un átomo de halógeno, preferiblemente flúor, o un grupo escogido entre amina, nitro, hidroxilo. En una realización particular de la presente descripción, la sustitución es la posición meta (posición 5), orto (posiciones 2 y/o 6) y/o para (posición 4) del fenilo.

La expresión "valina sustituida o no sustituida" significa un residuo de valina que está sustituido en la cadena lateral, es decir, -CH-(CH3)2, por ejemplo un átomo de halógeno, preferiblemente flúor, o un grupo escogido entre amina, nitro, hidroxilo. En una realización particular de la presente descripción, la sustitución es al menos un átomo de hidrógeno reemplazado por un átomo de flúor, es decir, la cadena lateral es -CH-[(CH3)(CF3)].

La expresión "alanina sustituida o no sustituida" significa un residuo de alanina que está sustituido en la cadena lateral, es decir, -CH3, por ejemplo un átomo de halógeno, preferiblemente flúor, o un grupo escogido entre amina, nitro, hidroxilo. En una realización particular de la presente descripción, la sustitución es al menos un átomo de hidrógeno reemplazado por un átomo de flúor, es decir, la cadena lateral es - CF3.

La expresión "leucina sustituida o no sustituida" significa un residuo de leucina que está sustituido en la cadena lateral, es decir, -CH2-CH-(CH3)2, por ejemplo un átomo de halógeno, preferiblemente flúor, o un grupo escogido entre amina, nitro, hidroxilo. En una realización particular de la presente descripción, la sustitución es al menos un átomo de hidrógeno reemplazado por un átomo de flúor, es decir, la cadena lateral es -CH2-CH-[(CH3)(CF3)].

La expresión "isoleucina sustituida o no sustituida" significa un residuo de isoleucina que está sustituido en la cadena lateral, es decir, -CH-[(CH3)(CH2CH3)], por ejemplo un átomo de halógeno, preferiblemente flúor, o un grupo escogido entre amina, nitro, hidroxilo. En una realización particular de la presente descripción, la sustitución es al menos un átomo de hidrógeno reemplazado por un átomo de flúor, es decir, la cadena lateral es -CH-[(CF3)(CH2CH3)].

La expresión "metionina sustituida o no sustituida" significa un residuo de metionina que está sustituido en la cadena lateral, es decir, -CH2-CH2-S-CH3, por ejemplo un átomo de halógeno, preferiblemente flúor, o un grupo escogido entre amina, nitro, hidroxilo. En una realización particular de la presente descripción, la sustitución es al menos un átomo de hidrógeno reemplazado por un átomo de flúor, es decir, la cadena lateral es -CF2-CH2-S-CH3.

El término "norleucina" significa ácido 2-aminohexanoico.

La expresión "triptófano sustituido o no sustituido" significa un residuo de triptófano que está sustituido en la cadena lateral, es decir, -CH2-(1 H-indol-3-ilo), por ejemplo un átomo de halógeno, preferiblemente flúor, o un grupo escogido entre amina, nitro, hidroxilo. En una realización particular de la presente descripción, la sustitución es al menos un átomo de hidrógeno reemplazado por un átomo de flúor, es decir, la cadena lateral es -CF2-(1 H-indol-3-ilo).

Un "heterotriptófano" es un residuo de aminoácido de triptófano en el que el "NH" de la cadena lateral de -CH2-(1H-indol-3-il) ha sido reemplazada por una "O" o una "S". La expresión "heterotriptófano sustituido o no sustituido" significa un residuo de heterotriptófano que está sustituido en la cadena lateral, por ejemplo un átomo de halógeno, preferiblemente flúor, o un grupo escogido entre amina, nitro, hidroxilo. En una realización particular de la presente descripción, la sustitución es al menos un átomo de hidrógeno sustituido por un átomo de flúor.

Una "naftil-alanina" es un residuo de aminoácido de alanina sustituido por un fragmento de naftaleno, es decir, la cadena lateral es -CH2-(naftilo). La expresión "naftil-alanina sustituida o no sustituida" significa un residuo de naftilalanina que está sustituido en la cadena lateral, por ejemplo un átomo de halógeno, preferiblemente flúor, o un grupo escogido entre amina, nitro, hidroxilo. En una realización particular de la presente descripción, la sustitución es un fragmento naftilo.

La expresión "agonista de CD47" significa que el compuesto se unirá al receptor de CD47. Como se explicó anteriormente, el receptor CD47 es un miembro ampliamente expresado de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig), que funciona tanto como un receptor para la trombospondina-1 (TSP-1) como un ligando para las proteínas reguladoras de la señal transmembrana SIRP a e y [Brown EJ et al., 2001]. Preferiblemente, la constante de disociación (KD) para caracterizar tales agonistas es inferior a 50 pM, preferiblemente inferior a 20 pM, más preferiblemente inferior a 15 pM, incluso más preferiblemente inferior a 10 pM o 5 pM.

En el marco de la presente descripción, la expresión "grupo alquilo C1-C6" significa cualquier radical hidrocarburo saturado lineal de uno a seis átomos de carbono o radical hidrocarburo saturado ramificado de tres a seis átomos de carbono. Ejemplos de radicales alquilo (C1-C6) incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, 1-etilpropilo, sec-butilo, iso-butilo, tert-butilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, etc.

En el marco de la presente descripción, "grupo alquilo lineal C1-C6" significa cualquier radical de hidrocarburo saturado lineal que tiene de uno a seis átomos de carbono. Ejemplos de radicales alquilo C1-C6 lineales consisten en metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo.

En el marco de la presente descripción, "grupo alquilo C3-C6 ramificado" significa cualquier radical hidrocarburo saturado ramificado que tiene de tres a seis átomos de carbono. Ejemplos de radicales alquilo C3-C6 ramificados incluyen, pero no se limitan a, isopropilo, 1 -etilpropilo, sec-butilo, tert-butilo, etc.

En el marco de la presente descripción, "grupo arilo C5-C8 " significa un grupo aromático tal como un grupo fenilo o piridinilo.

En el marco de la presente descripción, "grupo alcoxi C1-C6" significa un grupo alquilo C1-C6 como se define anteriormente unido al resto de la molécula por un átomo de oxígeno ("O"). Ejemplos de dichos grupos alcoxi son metoxi, etoxi, n-propiloxi, isopropiloxi, 1-etilpropiloxi, sec-butiloxi, isobutiloxi, tert-butiloxi, n-butiloxi, n-pentiloxi, nhexiloxi, etc.

En el marco de la presente descripción, "grupo ariloxi C5-C8" significa un grupo arilo C5-C8 como se define anteriormente unido al resto de la molécula por un átomo de oxígeno ("O"). Ejemplos de tales grupos ariloxi son fenoxi o piridiniloxi.

En el marco de la presente descripción, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad mínima de agente activo, que es necesaria para impartir un beneficio terapéutico a un sujeto. P. ej., una "cantidad terapéuticamente eficaz del agente activo" para un sujeto es una cantidad del agente activo que induce, mejora o provoca una mejora en los síntomas patológicos, la progresión de la enfermedad o las condiciones físicas asociadas con la enfermedad que afecta al sujeto.

En el marco de la presente descripción, el término "tratar" se refiere a un trastorno o condición y se refiere a revertir, aliviar o inhibir el proceso de uno o más síntomas de tal trastorno o condición.

Dentro del marco de la presente descripción, el término "sujeto" denota un mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino y un primate. Preferiblemente, un sujeto de acuerdo con la descripción es un ser humano.

El asunto objeto de la presente descripción se refiere específicamente a un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se define anteriormente, caracterizado por que el valor de Kd con CD47 es inferior a 50 pM, preferiblemente inferior a 20 pM, más preferiblemente inferior a 15 pM, incluso más preferiblemente inferior a 10 pM o 5 pM. De hecho, la síntesis de péptidos en fase sólida desarrollada en los últimos 50 años ha permitido producir fácilmente casi cualquier péptido (o al menos el experto en la técnica ahora sabe hasta qué punto esto es posible o no), en particular hasta 30 o 20 meros, con por ejemplo sintetizadores de péptidos automatizados. Además, es relativamente fácil probar la afinidad de las moléculas en un objetivo determinado, tal como CD47. Por lo tanto, está al alcance de la persona experta en la técnica probar simplemente uno de los péptidos cubiertos por la fórmula (I) como se define actualmente para comprobar si presenta la actividad deseada (especialmente por que se prevé que la mayoría de los péptidos cubiertos debe tener esta actividad). Esta característica de actividad de CD47, aunque es de primordial importancia, es un aspecto secundario de la presente descripción que ha establecido los límites de las moléculas que presentan la actividad, es decir, la secuencia de fórmula (I) anterior.

La presente descripción generalmente se refiere a un compuesto o una de sus sales farmacéuticamente aceptables que comprende una secuencia hexapeptídica de fórmula (l):

-X1-X2-X3-X4-X5-X6-(I)

en la que:

• X5 es un residuo escogido en la lista que consiste en metionina sustituida o no sustituida, o cualquier aminoácido con propiedades similares, lisina, norleucina, leucina o isoleucina;

• X6 es un residuo escogido en la lista que consiste en triptófano sustituido o no sustituido, o cualquier aminoácido con propiedades similares, heterotriptófano sustituido o no sustituido, paratirosina sustituida o no sustituida, ortotirosina sustituida o no sustituida, metatirosina sustituida o no sustituida, fenilalanina sustituida o no sustituida, o naftilalanina sustituida o no sustituida;

• X1 es el lado N-terminal de la molécula de fórmula (I), X6 es el lado C-terminal de la molécula de fórmula (I);

• que comprende al menos un residuo de para-tirosina sustituida o no sustituida, orto-tirosina sustituida o no sustituida, meta-tirosina sustituida o no sustituida, con la condición de que dicho compuesto no sea uno de los descritos en WO2013/182650,

más específicamente caracterizado por términos de estructura por que:

• la fórmula (I) está embebida en una estructura peptídica que comprende en total (es decir, contando la secuencia de la fórmula (I)) de 6 a 20 aminoácidos, más preferiblemente de 7 a 15 aminoácidos, aún más preferiblemente de 8 a 12 aminoácidos, lo más preferiblemente 10 aminoácidos;

• X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, y preferiblemente X 1 es una fenilalanina, preferiblemente X2 es una tirosina, preferiblemente X3 es una valina, preferiblemente X4 es una valina y preferiblemente X6 es un triptófano;

• el al menos un enlace pseudopeptídico es un enlace peptídico N-metilo, preferiblemente en el lado N-terminal o C-terminal de la fórmula (I) (es decir, comprendido en un fragmento/fragmentos unidos a X 1 y/o X6); y/o

• X2 la carga parcial iónica en el extremo C-terminal y/o N-terminal del hexapéptido de fórmula (I) está comprendida entre -1 y 1 por residuo de aminoácido, preferiblemente entre -0.75 y 0.75 por residuo de aminoácido.

Por lo tanto, el asunto objeto de la presente descripción se refiere particularmente a un compuesto o una de sus sales farmacéuticamente aceptables como se definió anteriormente, caracterizado por que la carga parcial iónica en el extremo C-terminal y/o N-terminal del hexapéptido de fórmula (I) están comprendidos entre -1 y 1 por residuo de aminoácido, preferiblemente entre -0.75 y 0.75 por residuo de aminoácido, más preferiblemente entre -0.5 y 0.5 por residuo de aminoácido, aún más preferiblemente entre -0.25 y 0.25 por residuo de aminoácido. De hecho, sorprendentemente, deshacerse de las cargas de los extremos (N y/o C terminal) mediante técnicas conocidas (tal como la acetilación de heteroátomos, p. ej., aminas u oxígenos, o el uso de aminoácidos alifáticos tales como alaninas, valinas, leucinas, isoleucinas, norleucinas...) permite incrementar la actividad de los compuestos sin comprometer la solubilidad de dicha secuencia peptídica. Una de las realizaciones preferidas de la presente descripción es, por lo tanto, proporcionar un péptido con pequeños grupos polares, es decir, sin o con pocas cargas iónicas, preferiblemente en los extremos del péptido. Esto, por supuesto, también puede depender del pH del medio ambiente. P. ej., sería posible acetilar la amina N-terminal de la estructura peptídica y bloquear el extremo C-terminal con una amida (-CO-NH2), reduciendo así las cargas de los extremos de la estructura peptídica.

Preferiblemente, X2 es un residuo de tirosina, más preferiblemente una paratirosina.

Alternativamente, X2 es un residuo de fenilalanina, más preferiblemente un residuo de fenilalanina sin sustituir.

En una realización particular, el compuesto de fórmula (I) es un péptido que comprende la secuencia de fórmula (II):

-A-B-X1-X2-X3-X4-X5-X6- (II)

en la que

A y B son residuos de aminoácidos, preferiblemente residuos de aminoácidos naturales o sintéticos como se define anteriormente;

X1, X2, X3, X4, X5 y X6 son como se definen actualmente;

o una de sus sales farmacéuticas.

Preferiblemente en la fórmula (II), A es una (D)-lisina y B es una arginina. Preferiblemente en la fórmula (II), A (tal como (D)-lisina) y B (tal como (L)-arginina) están unidos entre sí por un enlace pseudopeptídico, tal como (-CO-NMe-). Preferiblemente en la fórmula (II) X1-X2-X3-X4-X5-X6 es FYVVXW, FYVVIW, FYVVKW o FYVVLW, en la que X es norleucina. Alternativamente, en la fórmula (II) X 1 -X2-X3-X4-X5-X6 es FFVVXW, FFVVIW, FFVVKW o FFVVLW, en la que X es norleucina

En una realización particular, el compuesto de fórmula (I) es un péptido que comprende la secuencia de fórmula (III):

-A-B-X1-X2-X3-X4-X5-X6-C-D- (III)

en la que

A, B, C y D son residuos de aminoácidos, preferiblemente residuos de aminoácidos naturales o sintéticos como se define anteriormente;

X1, X2, X3, X4, X5 y X6 son como se definen actualmente;

o una de sus sales farmacéuticas.

Preferiblemente en la fórmula (III), A es una (D)-lisina y B es una arginina. Preferiblemente, C es una (L)-lisina y D es una (D)-lisina. Preferiblemente en la fórmula (III), A (como (D)-lisina) y B (tal como (L)-arginina) están unidos entre sí por un enlace pseudopeptídico, tal como (-CO-NMe-). Preferiblemente en la fórmula (III) X1-X2-X3-X4-X5-X6 es FYVVXW (SEQ ID 1), FYVVIW (SEQ ID 2), FYVVKW (SEQ ID 3) o FYVVLW (SEQ ID 4), en la que X es norleucina. Alternativamente, en la fórmula (III) X1-X2-X3-X4-X5-X6 es FFVVXW, FFVVIW, FFVVKW o FFVVLW, en la que X es norleucina.

Ventajosamente, el compuesto de fórmula (I) es un péptido que comprende la secuencia X1-X2-X3-X4-X5-X6 (fórmula (I)) y para mantener la solubilidad del péptido de fórmula (I), la naturaleza y el tamaño de la estructura está comprendida entre un péptido de 6 y 20 aminoácidos, más preferiblemente entre 7 y 15 aminoácidos, aún más preferiblemente 8 y 12 aminoácidos, lo más preferiblemente 10 aminoácidos. Más preferiblemente, el compuesto de fórmula (I) es un decapéptido (10 aminoácidos) con un dipéptido unido al extremo N-terminal de la secuencia X1-X2-X3-X4-X5-X6 (fórmula (I)) a través de un enlace peptídico o pseudopeptídico, y un dipéptido unido al extremo C-terminal de la secuencia X1-X2-X3-X4-X5-X6 a través de un enlace peptídico o pseudopeptídico en el N-terminal dando una fórmula (IV):

Y-A-B-X1-X2-X3-X4-X5-X6-C-D-Z (IV)

en la que

Y es un hidrógeno, un C1-C6 grupo alquilo, un C5-C8 grupo arilo, un fragmento R1-CO- donde R1 es un átomo de hidrógeno, un C1-C6 grupo alquilo, preferiblemente un metilo, o un C5-C8 grupo arilo, preferiblemente un fenilo;

Z es un -OH, C1-C6 grupo alquilo, un C5-C8 grupo arilo, un grupo NH2, un C1-C6 grupo alcoxi o un C5-C8 grupo ariloxi;

o una de sus sales farmacéuticas.

Preferiblemente en la fórmula (IV), todos los residuos amino a ambos lados de la secuencia peptídica X1-X2-X3-X4-X5-X6 son residuos de aminoácidos de configuración (D) o (L) naturales y/o sintéticos de configuración (D) o (L) como se define anteriormente. En una realización específica, las cadenas laterales y/o el esqueleto del compuesto de fórmula (I) se protegen químicamente de acuerdo con las definiciones anteriores.

Preferiblemente en la fórmula (IV), A es una (D)-lisina y B es una arginina. Preferiblemente, C es una (L)-lisina y D es una (D)-lisina. Preferiblemente en la fórmula (IV), A (tal como (D)-lisina) y B (tal como (L)-arginina) están unidos entre sí por un enlace pseudopeptídico, tal como (-CO-NMe-). Y es preferiblemente en la fórmula (IV) un átomo de hidrógeno o un acetilo mientras que Z es un NH2. Preferiblemente en la fórmula (IV), X1-X2-X3-X4-X5-X6 es FYVVXW, FYVVIW, FYVVKW o FYVVLW, donde X es norleucina. Alternativamente en la fórmula (IV), X 1-X2-X3-X4-X5-X6 es FFVVXW, FFVVIW, FFVVKW o FFVVLW, donde X es norleucina.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X1, X2, X5 y/o X6 son residuos de aminoácidos cargados no iónicos, como X5 es un residuo de norleucina, leucina o isoleucina, preferiblemente un residuo de norleucina.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que al menos un enlace pseudopeptídico es un enlace peptídico N-metilo, preferiblemente en un fragmento unido a X1 en el lado N-terminal del compuesto de fórmula (I) y/o en un fragmento unido a X6 en el lado C-terminal del compuesto de fórmula (I).

La presente descripción se refiere a un compuesto o su sal farmacéuticamente aceptable como se describe actualmente, caracterizado por que un átomo de hidrógeno, un residuo de aminoácido o un fragmento de péptido está unido a la amina N-terminal del hexapéptido de fórmula (I).

La presente descripción se refiere a un compuesto o su sal farmacéuticamente aceptable como se describe actualmente, caracterizado por que un grupo -OH, un grupo -NH2, un residuo de aminoácido o un fragmento de péptido está unido al carbonilo C-terminal del hexapéptido de fórmula (I).

La presente descripción se refiere a un compuesto o su sal farmacéuticamente aceptable como se describe actualmente, caracterizado por que la amina N-terminal del compuesto (I) o una sal farmacéutica del mismo está protegida por un grupo cargado no iónico escogido preferiblemente de la lista que consiste en un grupo alquilo C1-C6, un grupo arilo C5-C8, un fragmento R1-CO- donde R1 es:

• un átomo de hidrógeno,

• un grupo alquilo C1-C6, preferiblemente un metilo o

• un grupo arilo C5-C8, preferiblemente un fenilo.

La presente descripción se refiere a un compuesto o su sal farmacéuticamente aceptable como se describe actualmente, caracterizado por que el ácido carboxílico C-terminal ha sido reemplazado por un grupo cargado no iónico tal como COR2 en el que R2 es un grupo alquilo C1-C6, un grupo arilo C5-C8, un grupo NH2, un grupo alcoxi C1-C6 o un grupo ariloxi C5-C8.

La presente descripción se refiere a un compuesto o su sal farmacéuticamente aceptable como se describe en la presente, caracterizado por que dicho compuesto o su sal farmacéuticamente aceptable comprende la secuencia YVV, preferiblemente en la posición X2-X3-X4.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina y X1 es una fenilalanina.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina y X2 es una tirosina. La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina y X2 es una fenilalanina.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina y X3 es una valina.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina y X4 es una valina.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina y X6 es un triptófano.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, X 1 es una fenilalanina y X2 es una tirosina. La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, X1 es una fenilalanina y X2 es una fenilalanina.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, X 1 es una fenilalanina y X3 es una valina.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, X 1 es una fenilalanina y X4 es una valina.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, X1 es una fenilalanina y X6 es un triptófano.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, X1 es una fenilalanina, X2 es una tirosina y X3 es una valina. La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, Xi es una fenilalanina, X2 es una fenilalanina y X3 es una valina.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, X1 es una fenilalanina, X2 es una tirosina y X4 es una valina. La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, X1 es una fenilalanina, X2 es una fenilalanina y X4 es una valina.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, X1 es una fenilalanina, X2 es una tirosina y X6 es un triptófano. La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, X1 es una fenilalanina, X2 es una fenilalanina y X6 es un triptófano.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, X1 es una fenilalanina, X2 es una tirosina, X3 es una valina y X4 es una valina. La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, X1 es una fenilalanina, X2 es una fenilalanina, X3 es una valina y X4 es una valina.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, X1 es una fenilalanina, X2 es una tirosina, X3 es una valina y X6 es un triptófano. La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, X1 es una fenilalanina, X2 es una fenilalanina, X3 es una valina y X6 es un triptófano.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, X1 es una fenilalanina, X2 es una tirosina, X3 es una valina X4 es una valina y X6 es un triptófano. La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X5 es una lisina, norleucina, leucina o isoleucina, X1 es una fenilalanina, X2 es una fenilalanina, X3 es una valina X4 es una valina y X6 es un triptófano.

La presente descripción se refiere a un compuesto o su sal farmacéuticamente aceptable como se describe en la presente, caracterizado por que dicho compuesto o su sal farmacéuticamente aceptable comprende la secuencia YVV-norleucina (SEQ ID 5), preferiblemente en la posición X2-X3-X4-X5.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X1, X2, y/o X6 es una para-fluoro-fenilalanina, para-amino-fenilalanina o para-nitrofenilalanina.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X1 es una fenilalanina sustituida o no sustituida, X2 es una paratirosina sustituida o no sustituida, y X6 es un triptófano sustituido o no sustituido. La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X 1 es una fenilalanina sustituida o no sustituida, X2 es una fenilalanina sustituida o no sustituida, y X6 es un triptófano sustituido o no sustituido. La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe actualmente, caracterizado por que X1 es una fenilalanina sustituida o no sustituida, X2 es una fenilalanina no sustituida, y X6 es un triptófano sustituido o no sustituido.

La presente descripción se refiere a un compuesto o a su sal farmacéuticamente aceptable como se describe actualmente, caracterizado por que el hexapéptido de fórmula (I) está comprendido entre dos residuos de aminoácidos de la configuración (D), tal como dos (D)-lisinas.

La presente descripción se refiere a un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe en la presente, caracterizado por que se elige en el grupo que consiste en:

H-KRFYGGMWKK-OH (SEQ ID 6)

Ac-RFYVVMWK-NH2(SEQ ID 7)

Ac-KRFYVVMWKK-NH2 (SEQ ID 8)

H-(D)KRFYVVMWA(D)K-OH (SEQ ID 9)

H-(D)KAFYVVMWK(D)K-OH (SEQ ID 10)

H-(D)KRFYVV(Nle)WK(D)K-OH (SEQ ID 12)

H-FYVVXW-OH (SEQ ID 1)

H-FYVVXW-NH2 (SEQ ID 13)

Ac-FYVVXW-OH (SEQ ID 14)

AC-FYVVXW-NH2 (SEQ ID 15)

H-(D)KFYVVXW(D)K-OH (SEQ ID 16)

H-FYVVKW-OH (SEQ ID 3)

H-FYVVKW-NH2 (SEQ ID 17)

H-(D)K ^(CONMe)RF Y V V M W K (D)K-OH (SEQ ID 18)

H-(D)K R F Y V V M W ^(CONMe)K(D)K-OH (SEQ ID 19)

H-(D)K ^CONMe)RF Y V V M W ^(CONMe)K(D)K-OH (SEQ ID 20)

H-(D)K ^(CONMe)RF Y V V X W K (D)K-OH (SEQ ID 21)

H-(D)K ^(CONMe)RF Y V V L W K (D)K-OH (SEQ ID 22)

H-(D)K ^(CONMe)RF Y VV I W K (D)K-OH (SEQ ID 23)

H-(D)K ^(CONMe)RF F V V X W K (D)K-OH (PKT16-FF)

En los péptidos anteriores:

• la "H" en el lado izquierdo de las estructuras representa un átomo de hidrógeno,

• el término "Ac" significa que la amina N-terminal está acetilada,

• el "OH" en el lado derecho de las estructuras representa el OH del COOH C-terminal,

• la "X" representa el residuo de norleucina,

• el "NH2" en el lado derecho de las estructuras significa que el OH del COOH C-terminal ha sido reemplazado por NH2,

• la (D) significa que el siguiente residuo de aminoácido tiene la configuración (D), los términos "hR" y "hK" representan homo-arginina y homo-lisina respectivamente,

• "^(CONMe)" representa el enlace pseudopeptídico que une los dos residuos de aminoácidos a cada lado de este término, y

• Nle representa un residuo de norleucina.

En realizaciones específicas, se contempla que los compuestos de fórmula (I) utilizados en los métodos terapéuticos de la presente descripción pueden modificarse para mejorar su eficacia terapéutica. Tal modificación de los compuestos terapéuticos puede usarse para disminuir la toxicidad, aumentar el tiempo de circulación o modificar la biodistribución. P. ej., la toxicidad de compuestos terapéuticos potencialmente importantes puede reducirse significativamente mediante la combinación con una variedad de vehículos portadores de fármacos que modifican la biodistribución.

Una estrategia para mejorar la viabilidad de los fármacos es la utilización de polímeros solubles en agua. Se ha demostrado que varios polímeros solubles en agua modifican la biodistribución, mejoran el modo de captación celular, cambian la permeabilidad a través de barreras fisiológicas; y modifican la tasa de aclaramiento del cuerpo. Para lograr un efecto dirigido o de liberación sostenida, se han sintetizado polímeros solubles en agua que contienen fracciones de fármaco tales como grupos terminales, como parte de la columna vertebral o como grupos colgantes en la cadena polimérica.

El polietilenglicol (PEG) ha sido ampliamente utilizado como portador de fármacos, dado su alto grado de biocompatibilidad y facilidad de modificación. Se ha demostrado que la unión a varios fármacos, proteínas y liposomas mejora el tiempo de residencia y disminuye la toxicidad. El PEG se puede acoplar a agentes activos a través de los grupos hidroxilo en los extremos de la cadena y mediante otros métodos químicos; sin embargo, el propio PEG está limitado como máximo a dos agentes activos por molécula. En un enfoque diferente, los copolímeros de PEG y aminoácidos se exploraron como nuevos biomateriales que mantendrían las propiedades de biocompatibilidad de PEG, pero que tendrían la ventaja añadida de numerosos puntos de unión por molécula (proporcionando una mayor carga de fármaco), y que podrían ser sintetizados diseñado para adaptarse a una variedad de aplicaciones.

Los expertos en la técnica conocen las técnicas de PEGilación para la modificación eficaz de fármacos. P. ej., VectraMed (Plainsboro, N.J.) ha utilizado polímeros de administración de fármacos que consisten en polímeros alternos de PEG y monómeros trifuncionales tales como la lisina. Las cadenas de PEG (típicamente 2000 daltons o menos) están unidas a los grupos amino a- y e- de la lisina a través de enlaces de uretano estables. Dichos copolímeros retienen las propiedades deseables del PEG, al tiempo que proporcionan grupos colgantes reactivos (los grupos de ácido carboxílico de la lisina) a intervalos estrictamente controlados y predeterminados a lo largo de la cadena del polímero. Los grupos colgantes reactivos se pueden usar para la derivación, el entrecruzamiento o la conjugación con otras moléculas. Estos polímeros son útiles para producir profármacos estables de circulación prolongada variando el peso molecular del polímero, el peso molecular de los segmentos de PEG y el enlace escindible entre el fármaco y el polímero. El peso molecular de los segmentos de PEG afecta el espaciado del complejo fármaco/grupo de enlace y la cantidad de fármaco por peso molecular del conjugado (los segmentos de PEG más pequeños proporcionan una mayor carga de fármaco). En general, el aumento del peso molecular total del conjugado de copolímero en bloque aumentará la vida media circulatoria del conjugado. Sin embargo, el conjugado debe ser fácilmente degradable o tener un peso molecular por debajo del umbral que limita la filtración glomular (p. ej., menos de 45 kDa).

Además, dado que la columna vertebral del polímero es importante para mantener la vida media circulatoria y la biodistribución, los enlazadores se pueden usar para mantener el agente terapéutico en forma de profármaco hasta que se libere del polímero de la columna vertebral mediante un activador específico, normalmente la actividad enzimática en el tejido objetivo. P. ej., este tipo de suministro de fármacos activado por tejido es particularmente útil cuando se requiere el suministro a un sitio específico de biodistribución y el agente terapéutico se libera en el sitio de la patología o cerca de él. Los expertos en la técnica conocen bibliotecas de grupos de enlace para su uso en la administración de fármacos activados y pueden basarse en la cinética enzimática, la prevalencia de la enzima activa y la especificidad de escisión de las enzimas específicas de la enfermedad seleccionadas (véase, p. ej., tecnologías de establecidas por VectraMed, Plainsboro, Nueva Jersey). Dichos enlazadores se pueden usar para modificar los derivados de péptidos solubles descritos en la presente memoria para la administración terapéutica.

De acuerdo con la descripción, los péptidos solubles se pueden producir mediante métodos convencionales de síntesis de péptidos automatizados o mediante expresión recombinante. Los principios generales para diseñar y fabricar proteínas son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Los péptidos solubles de la descripción pueden sintetizarse en solución o sobre un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Varios sintetizadores automáticos están disponibles comercialmente y pueden usarse de acuerdo con protocolos conocidos como se describe en Stewart and Young; Tarn et al, 1983; Merrifield, 1986 y Barany and Merrifield, Gross and Meienhofer, 1979. Los péptidos solubles de la descripción también se pueden sintetizar mediante tecnología de fase sólida empleando un sintetizador de péptidos de ejemplo, tales como el Modelo 433A de Applied Biosystems Inc. La pureza de cualquier proteína dada; generada a través de la síntesis de péptidos automatizada o a través de métodos recombinantes se puede determinar usando análisis de HPLC en fase reversa. La autenticidad química de cada péptido puede establecerse mediante cualquier método bien conocido por los expertos en la técnica.

Como alternativa a la síntesis de péptidos automatizada para péptidos que contienen solo aminoácidos naturales, se puede emplear tecnología de ADN recombinante en la que una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de elección se inserta en un vector de expresión, se transforma o transfecta en una célula huésped adecuada y se cultiva en condiciones adecuado para la expresión como se describe a continuación en la presente memoria. Los métodos recombinantes son especialmente preferidos para producir polipéptidos más largos.

Se puede utilizar una variedad de sistemas de vector/huésped de expresión para contener y expresar la secuencia codificante de péptido o proteína. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de a Dn de bacteriófagos, plásmidos o cósmidos recombinantes; levadura transformada con vectores de expresión de levadura (Giga-Hama et al, 1999); sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus (p. ej., baculovirus, véase Ghosh et al., 2002); sistemas de células vegetales transfectados con vectores de expresión de virus (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión bacterianos (p. ej., Ti o plásmido pBR322; véase, p. ej., Babe et al, 2000); o sistemas de células animales. Los expertos en la técnica conocen diversas técnicas para optimizar la expresión de proteínas en mamíferos, véase, p. ej., Kaufman, 2000; Colosimo et al, 2000. Las células de mamífero que son útiles en la producción de proteínas recombinantes incluyen, pero no se limitan a, células VERO, células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), células COS (tales como COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 y 293 células. Protocolos de ejemplo para la expresión recombinante de los sustratos peptídicos o polipéptidos de fusión en bacterias, levaduras y otros invertebrados son conocidos por los expertos en la técnica y se describen brevemente en la presente memoria a continuación. Los documentos U.S. Pat. No. 6,569,645; U.S. Pat. No.

6,043,344; U.S. Pat. No. 6,074,849; y U.S. Pat. No. 6,579,520 proporcionan ejemplos específicos para la producción recombinante de péptidos solubles. Los sistemas huésped de mamíferos para la expresión de proteínas recombinantes también son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las cepas de células huésped pueden elegirse por una capacidad particular para procesar la proteína expresada o producir ciertas modificaciones posteriores a la traducción que serán útiles para proporcionar actividad proteica. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraduccional que escinde una forma "prepro" de la proteína también puede ser importante para la correcta inserción, plegamiento y/o función. Diferentes células huésped tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38 y similares tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades postraduccionales y pueden elegirse para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña introducida.

En la producción recombinante de los péptidos solubles derivados de la descripción, sería necesario emplear vectores que comprendan moléculas de polinucleótidos para codificar los péptidos solubles derivados. Los métodos para preparar dichos vectores así como para producir células huésped transformadas con dichos vectores son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las moléculas polinucleotídicas utilizadas en dicho esfuerzo pueden unirse a un vector, que generalmente incluye un marcador seleccionable y un origen de replicación, para la propagación en un huésped. Estos elementos de las construcciones de expresión son bien conocidos por los expertos en la técnica. Generalmente, los vectores de expresión incluyen ADN que codifica la proteína dada que se une operativamente a secuencias reguladoras transcripcionales o traduccionales adecuadas, tales como las derivadas de genes de mamíferos, microbianos, virales o de insectos. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores transcripcionales, operadores o potenciadores, sitios de unión al ribosoma de ARNm y secuencias apropiadas que controlan la transcripción y la traducción.

Los términos "vector de expresión", "constructo de expresión" o "casete de expresión" se utilizan indistintamente a lo largo de esta especificación y pretenden incluir cualquier tipo de constructo genético que contenga un ácido nucleico que codifique un producto génico en el que parte o la totalidad de la secuencia codificante del ácido nucleico es capaz de ser transcrita.

La elección de un vector de expresión adecuado para la expresión de los péptidos o polipéptidos de la descripción dependerá, por supuesto, de la célula huésped específica que se vaya a usar, y está dentro de la experiencia del experto en la técnica. Los métodos para la construcción de vectores de expresión de mamíferos se describen, p. ej., en Okayama and Berg, 1983; Cosman et al., 1986; Cosman et al., 1984; EP-A-0367566; y WO 91/18982. Otras consideraciones para producir vectores de expresión se detallan, p. ej., en Makrides et al, 1999; Kost et al, 1999. Wurm et al, 1999 como factores didácticos a considerar en la expresión transitoria a gran escala en células de mamíferos para la producción de proteínas recombinantes.

La expresión requiere que se proporcionen señales apropiadas en los vectores, como potenciadores/promotores de fuentes víricas y de mamíferos que pueden usarse para impulsar la expresión de los ácidos nucleicos de interés en las células huésped. Normalmente, el ácido nucleico que se expresa está bajo el control transcripcional de un promotor. Un "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, requerida para iniciar la transcripción específica de un gen. Las secuencias de nucleótidos se unen operativamente cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con el ADN que codifica el péptido de interés. Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos del promotor se une operativamente a una secuencia de ADN dada si la secuencia de nucleótidos del promotor dirige la transcripción de la secuencia.

De manera similar, la expresión "bajo control transcripcional" significa que el promotor está en la ubicación y orientación correctas en relación con el ácido nucleico para controlar la iniciación de la ARN polimerasa y la expresión del gen. Puede usarse cualquier promotor que impulse la expresión del ácido nucleico. No se cree que el promotor particular empleado para controlar la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés sea importante, siempre que sea capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico en la célula diana. Por lo tanto, cuando se dirige a una célula humana, es preferible colocar la región codificante del ácido nucleico adyacente y bajo el control de un promotor que es capaz de expresarse en una célula humana. En términos generales, tal promotor podría incluir un promotor humano o viral. Los promotores comunes incluyen, p. ej., el promotor génico temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV), el promotor temprano SV40, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, [beta]- actina, promotor de insulina de rata, promotor de fosfoglicerol quinasa y promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, todos los cuales son promotores bien conocidos y fácilmente disponibles para los expertos en la técnica, puede usarse para obtener un alto nivel de expresión de la secuencia codificante de interés. También se contempla el uso de otros promotores de fagos bacterianos o celulares virales o de mamíferos que son bien conocidos en la técnica para lograr la expresión de una secuencia codificante de interés, siempre que los niveles de expresión sean suficientes para producir un rendimiento recuperable de proteína de interás. Mediante el empleo de un promotor con propiedades bien conocidas, se puede optimizar el nivel y el patrón de expresión de la proteína de interés después de la transfección o transformación. También pueden usarse promotores inducibles.

Otro elemento regulador que se utiliza en la expresión de proteínas es un potenciador. Estos son elementos genéticos que aumentan la transcripción de un promotor ubicado en una posición distante en la misma molécula de ADN. Cuando un constructo de expresión emplea un inserto de ADNc, típicamente se deseará incluir una secuencia señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación adecuada del transcrito génico. Cualquier secuencia señal de poliadenilación reconocida por las células de las especies animales transgénicas seleccionadas es adecuada para la práctica de la descripción, tal como la hormona del crecimiento humana o bovina y las señales de poliadenilación de SV40.

Ácidos nucleicos, vectores, células huésped recombinantes y usos de los mismos Otro objeto de la descripción se refiere a un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de fórmula (I) o una variante conservadora de su función como se describe en la presente memoria anteriormente para su uso en la prevención o tratamiento del cáncer.

En una realización, dicho ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de fórmula (I).

Los ácidos nucleicos de la descripción se pueden producir mediante cualquier técnica conocida per se en la técnica, como, sin limitación, cualquier técnica química, biológica, genética o enzimática, ya sea sola o en combinaciones.

Otro objeto de la descripción es un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia amino que comprende la secuencia de fórmula (I) o una variante conservadora de función de la misma como se describe en la presente memoria anteriormente para su uso en la prevención o tratamiento del cáncer.

De acuerdo con la descripción, los vectores de expresión adecuados para su uso en la descripción pueden comprender al menos un elemento de control de la expresión ligado operativamente a la secuencia de ácido nucleico. Los elementos de control de la expresión se insertan en el vector para controlar y regular la expresión de la secuencia de ácido nucleico. Ejemplos de elementos de control de la expresión incluyen, pero no se limitan a, sistema lac, regiones operadoras y promotoras del fago lambda, promotores de levadura y promotores derivados de polioma, adenovirus, retrovirus, lentivirus o SV40. Los elementos operativos preferidos o requeridos adicionales incluyen, pero no se limitan a, secuencia líder, codones de terminación, señales de poliadenilación y cualquier otra secuencia necesaria o preferida para la transcripción adecuada y la posterior traducción de la secuencia de ácido nucleico en el sistema huésped. Un experto en la técnica entenderá que la combinación correcta de los elementos de control de expresión requeridos o preferidos dependerá del sistema huésped escogido. Se entenderá además que el vector de expresión debe contener elementos adicionales necesarios para la transferencia y posterior replicación del vector de expresión que contiene la secuencia de ácido nucleico en el sistema huésped. Los ejemplos de tales elementos incluyen, pero no se limitan a, orígenes de replicación y marcadores seleccionables. Un experto en la técnica comprenderá además que tales vectores se construyen fácilmente usando métodos convencionales o disponibles comercialmente. Otro objeto de la descripción es una célula huésped que comprende un vector de expresión como se describe en la presente memoria anteriormente para su uso en la prevención o tratamiento del cáncer.

De acuerdo con la descripción, ejemplos de células huésped que pueden usarse son células eucariotas, tales como células animales, vegetales, de insectos y levaduras y células procariotas, tales como E. coli. Los medios por los que el vector que lleva el gen puede introducirse en las células incluyen, pero no se limitan a, microinyección, electroporación, transducción o transfección usando DEAE-dextrano, lipofección, fosfato de calcio u otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

En otra realización, se usan vectores de expresión eucarióticos que funcionan en células eucarióticas. Ejemplos de tales vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales tales como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, virus vaccinia, poxvirus, poliovirus; lentivirus, vectores de expresión bacterianos, plásmidos, tales como pcADN3 o los vectores de transferencia de baculovirus. Las líneas de células eucariotas preferidas incluyen, pero no se limitan a, células COS, células CHO, células HeLa, células NIH/3T3, células 293 (ATCC# CRL1573), células T2, células dendríticas o monocitos.

Métodos terapéuticos

El objeto de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (III) como se define en la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso como inhibidor de CD47, en particular en el tratamiento del cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de la corteza suprarrenal, cáncer anal, cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer de cerebro y del sistema nervioso central, cáncer de mama, enfermedad de Castleman, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, enfermedad de Hodgkin, Linfoma no Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe e hipofaringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma, plasmacitoma, cáncer de cavidad nasal y senos paranasales, cáncer de nasofaringe, neuroblastoma, cáncer de cavidad oral y orofaringe, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, cáncer de hipófisis, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer de vagina, cáncer de vulva y cáncer de útero, o en la prevención y el tratamiento de la leucemia y particularmente en la leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica B, leucemia de células pilosas, leucemia leucemia de células T adultas, leucemia prolinfocítica de tipo de células T o leucemia mieloide.

En una realización, la leucemia es una leucemia linfocítica crónica B (CLL).

En una realización particular, los péptidos solubles, los ácidos nucleicos, el vector de expresión o las células huésped de la descripción pueden ser útiles en el tratamiento de una CLL refractaria. En otra realización particular, los péptidos solubles, ácidos nucleicos, vector de expresión o células huésped de la descripción pueden ser útiles en el tratamiento de una CLL refractaria y de mal pronóstico, incluyendo IGHV no mutado, cariotipo complejo y disfuncional o mutado TP53, ATM, NOTH1, MYD88, XPO1, KLHL6, SF3B1, POTI y células B IRC 3 B.

Como se usa en la presente memoria, el término "CLL refractaria" denota una CLL refractaria a los tratamientos comunes usados contra la leucemia (descritos en las páginas 2 y 3).

En una realización particular, los péptidos solubles, los ácidos nucleicos, el vector de expresión o las células huésped de la descripción pueden ser útiles en el tratamiento de la CLL refractaria que presenta mutaciones intrínsecas que podrían permitir la resistencia a los medicamentos (p. ej., mutación/deleciones en TP53, ATM, NOTH1, MYD88, XPO1, KLHL6, SF3B1, POTI y BIRC3 o refractarios a los tratamientos descritos en las páginas 2 y 3).

De hecho, se demostró que las células de CLL B que tienen la mutación C481S del gen BTK (resistencia al tratamiento con Ibrutinib) son sensibles al tratamiento con PKT16 de acuerdo con la presente descripción.

En una realización particular, los péptidos solubles, los ácidos nucleicos, el vector de expresión o las células huésped de la descripción pueden ser útiles en el tratamiento de la CLL refractaria donde el tratamiento común como el anti-CD20, la fludarabina o la cladribina no funcionan.

Otro objeto de la descripción se refiere a un método para tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de péptidos solubles como se describe anteriormente o un ácido nucleico de acuerdo con la descripción o un vector de expresión de acuerdo con la descripción o una célula huésped de acuerdo con la descripción.

En un aspecto, la descripción se refiere a un método para tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de péptido de la secuencia de fórmula (I) o una variante conservadora de la función del mismo como se describe anteriormente.

En otra realización, la descripción se refiere a un método para tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido soluble de acuerdo con la descripción.

Composición farmacéutica

Otro objeto de la descripción es una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer que comprende:

a) al menos un compuesto de fórmula (1) de acuerdo con la descripción;

b) al menos un ácido nucleico de acuerdo con la descripción; o

c) al menos un vector de expresión de acuerdo con la descripción o;

d) al menos una célula huésped de acuerdo con la descripción;

e) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización, dicha composición farmacéutica comprende al menos un compuesto de fórmula (I) con un hexapéptido que tiene la secuencia de fórmula (I), embebido en su interior.

En otra realización, dicha composición farmacéutica comprende una variante conservadora de función de la misma del compuesto de fórmula (I) con un hexapéptido que tiene la secuencia de fórmula (I), embebido en su interior. En aún otra realización, dicha composición farmacéutica comprende el péptido PKT16 o PKT 16-FF.

Cualquier agente terapéutico de la descripción que se ha descrito anteriormente puede combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones terapéuticas.

"Farmacéuticamente" o "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen reacciones adversas, alérgicas u otras reacciones adversas cuando se administran a un mamífero, especialmente a un ser humano, según corresponda. Un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a un agente de relleno, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación de cualquier tipo sólido, semisólido o líquido no tóxico. La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosificación y el régimen dependen naturalmente de la condición que se va a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente, etc.

Las composiciones farmacéuticas de la descripción se pueden formular para administración tópica, oral, intranasal, intraocular, intravenosa, intramuscular o subcutánea y similares.

Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que se puede inyectar. Éstas pueden ser, en particular, soluciones salinas estériles, isotónicas (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente secadas por congelación, que mediante la adición, según el caso, de agua esterilizada o suero fisiológico, permiten la constitución de soluciones inyectables.

Las dosis utilizadas para la administración pueden adaptarse en función de diversos parámetros, y en particular en función del modo de administración utilizado, de la patología relevante, o alternativamente de la duración deseada del tratamiento.

Para preparar composiciones farmacéuticas, se puede disolver o dispersar una cantidad eficaz de un polipéptido o un ácido nucleico de acuerdo con la descripción en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable.

Las formas farmacéuticas adecuadas para su uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de maní o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil capacidad de aplicación mediante jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe ser preservado contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos, mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estos preparados contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Los péptidos de los mismos o el ácido nucleico de acuerdo con la descripción se pueden formular en una composición en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, p. ej., ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, p. ej., hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

El vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, p. ej., agua, etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, p. ej., mediante el uso de un recubrimiento, tal como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, p. ej., parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, p. ej., azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, p. ej., monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son las técnicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución filtrada previamente estéril del mismo.

También se contempla la preparación de soluciones más concentradas o altamente concentradas para inyección directa, donde se contempla el uso de DMSO como solvente para dar como resultado una penetración extremadamente rápida, entregando altas concentraciones de los agentes activos a un área tumoral pequeña.

T ras la formulación, las soluciones se administrarán de manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tal como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, p. ej., la solución se puede regular adecuadamente y el diluyente líquido primero se vuelve isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán los medios acuosos estériles que pueden emplearse a la luz de la presente descripción. P. ej., una dosis podría disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y agregarse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el lugar propuesto para la infusión (véase, p. ej., "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15.a edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente ocurrirá alguna variación en la dosificación dependiendo de la condición del sujeto que se está tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual.

Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tales como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo tabletas u otros sólidos para administración oral; cápsulas de liberación prolongada; y cualquier otra forma utilizada actualmente.

En una realización, la composición farmacéutica puede comprender células que expresan de forma estable un péptido o una variante del mismo de acuerdo con la descripción. P. ej., la composición farmacéutica puede comprender células HEK293T que expresan de manera estable el péptido del polipéptido de descripción, o células HCT116 que expresan de manera estable el péptido de descripción. Las células se pueden encapsular en perlas de gel de alginato, como se describe en Desille et al, 2001, 2002 y Mahler et al, 2003. Este enfoque de vectorización permite una administración localizada del polipéptido de la descripción.

Las composiciones de la presente descripción pueden comprender un activo terapéutico adicional.

La presente descripción también se refiere a un kit que comprende un compuesto de fórmula (I) con un hexapéptido que tiene la secuencia de fórmula (I), incluido dentro de acuerdo con la descripción y un agente activo terapéutico adicional.

En una realización, dicho agente activo terapéutico es un agente anticancerígeno. P. ej., dichos agentes anticancerígenos incluyen, pero no se limitan a, fludarabina, gemcitabina, capecitabina, metotrexato, taxol, taxotere, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiurea, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureas, complejos de platino tales como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino, mitomicina, dacarbazina, procarbazina, etopósido, tenipósido, campatecinas, bleomicina, doxorrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, L-asparaginasa, doxorrubicina, epimbicm, 5-fluorouracilo, taxanos tales como docetaxel y paclitaxel, leucovorina, levamisol, irinotecán, estramustina, etopósido, mostazas nitrogenadas, BCNU, nitrosoureas tales como carmustme y lomustina, alcaloides de la vinca tales como vinblastina, vincristina y vinorelbina, mesilato de imatimb, hexametilenamina, topotecan, inhibidores de quinasa, inhibidores de fosfatasa, inhibidores de ATPasa, tirfostinas, inhibidores de proteasa, inhibidores herbimycm A, genisteína, erbstatina y lavendustina A. En una realización, los agentes anticancerígenos adicionales se pueden seleccionar de, pero no limitados a, uno o una combinación de la siguiente clase de agentes: agentes alquilantes, alcaloides vegetales, inhibidores de la topoisomerasa de ADN, antifolatos, análogos de pirimidina, análogos de purina, antimetabolitos de ADN, taxanos, podofilotoxina, terapias hormonales, retinoides, fotosensibilizadores o terapias fotodinámicas, inhibidores de la angiogénesis, agentes antimitóticos, inhibidores de isoprenilación, inhibidores del ciclo celular, actinomicinas, bleomicinas, antraciclinas, inhibidores de MDR e Inhibidores de la Ca2+ ATPasa.

Se pueden seleccionar agentes anticancerígenos adicionales de, pero no limitados a, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, factores inhibidores del crecimiento, hormonas, receptores solubles, receptores señuelo, anticuerpos monoclonales o policlonales, anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos, monocuerpos, policuerpos.

Se pueden seleccionar agentes anticancerígenos adicionales de, pero no limitados a, factores de crecimiento o hematopoyéticos tales como eritropoyetina y trombopoyetina, y miméticos de factores de crecimiento de los mismos.

En los presentes métodos para tratar el cáncer, el agente activo terapéutico adicional puede ser un agente antiemético. Los agentes antieméticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, metoclopromida, domperidona, proclorperazina, prometazina, clorpromazina, trimetobenzamida, ondansetrón, granisetrón, hidroxizina, monoemanolamina de acetilleucina, alizaprida, azasetrón, benzquinamida, bietanautina, bromoprida, buclizina, cleboprida, ciclizina, dunenhidrinato, difenidol, dolasetrón, meclizme, metalatal, metopimazina, nabilona, oxipemidil, pipamazina, escopolamina, sulpirida, tetrahidrocannabinoles, thiefhylperazine, tioproperazina y tropisetrón. En una realización particular, el agente antiemético es granisetrón u ondansetrón.

En otra realización, el agente activo terapéutico adicional puede ser un factor estimulante de colonias hematopoyéticas. Los factores estimulantes de colonias hematopoyéticas adecuados incluyen, pero no se limitan a, filgrastim, sargramostim, molgramostim y epoyetina alfa.

En todavía otra realización, el otro agente activo terapéutico puede ser un agente analgésico opioide o no opioide. Los agentes analgésicos opioides adecuados incluyen, pero no se limitan a, morfina, heroína, hidromorfona, hidrocodona, oximorfona, oxicodona, metopón, apomorfina, nomioifina, etoipbina, buprenorfina, mepeddina, lopermida, anileddina, etoheptazina, piminidina, betaprodina, difenoxilato, fentanilo, sufentanilo, alfentanilo, remifentanilo, levorfanol, dextrometorfano, fenazodna, pemazocina, ciclazocina, metadona, isometadona y propoxifeno. Los agentes analgésicos no opioides adecuados incluyen, pero no se limitan a, aspirina, celecoxib, rofecoxib, diclofinac, diflusinal, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, ketoprofeno, indometacina, ketorolaco, meclofenamato, ácido mefanámico, nabumetona, naproxeno, piroxicam y sulindaco.

En aún otra realización, el agente activo terapéutico adicional puede ser un agente ansiolítico. Los agentes ansiolíticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, buspirona y benzodiazepinas tales como diazepam, lorazepam, oxazapam, clorazepato, clonazepam, clordiazepóxido y alprazolam.

La descripción se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos.

Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ningún modo como limitantes del alcance de la presente descripción.

Figura 1 : ensayo de degradación de péptidos.

Cuatro péptidos (1, 2, 3 y 4) fueron diseñados para mejorar la estabilidad del suero humano, la cual se determinó siguiendo la degradación del péptido después de la incubación a 37 °C durante dos horas. 4NGG: análogo inactivo de 4N1K donde ambas valinas de la secuencia VVM han sido mutadas por dos glicinas (véase Manna, P.P. et al.; J. Immunol. 2003, 170: 3544-3553).

Figura 2A y 2B: PKT16, un péptido derivado de PKHB1 con actividad PCD mejorada en células CLL.

Figura 2A: la muerte celular, medida como anexina-V y copositividad de PI, se evaluó en células leucémicas tratadas durante 6 h con diferentes concentraciones de PKT16 o PKHB1. Los datos en la gráfica son la media ± s.d. (n=5).

Figura 2B: la muerte celular inducida por PKT16 (100 pM, 6 h) se midió en células B de veinte donantes sanos y cuarenta pacientes con CLL. Los porcentajes se refieren a la media de la tinción positiva para Anexina-V/PI

Figura 3: Espectroscopia de CD realizada en PBS o en agua

La propensión conformacional de cada péptido se examinó luego mediante espectros

péptidos no muestran propensión helicoidal y solo se puede observar un pequeño contenido de lámina p para los péptidos 4N1 y PKT1 menos solubles, lo que sugiere que la estructura b surge de especies agregadas.

Figura 4: compara las muertes en células OSU tratadas con PKT16 o PKT16-FF. Para PKT16, se puede observar que las muertes reportadas son de 11.1, 17.9 y 52.7 % para concentraciones de 25pM, 50pM y 100pM respectivamente. Para PKT16-FF, se puede observar que las muertes reportadas son de 16.6, 38.3 y 82.4 % para concentraciones de 25pM, 50pM y 100pM respectivamente. La prueba de control proporcionó un 9.5 % de muerte de las células.

Ejemplos

Preámbulo: Síntesis y caracterización de los péptidos

Química. Todos los péptidos se sintetizaron manualmente a partir de aminoácidos protegidos con Fmoc utilizando métodos estándar de sintesis de péptidos en fase sólida (SPPS). Los aminoácidos protegidos apropiados se acoplaron secuencialmente usando HBTU/HOBT como activador. Los péptidos se escindieron de la resina con (94:1:2.5:2.5) TFA/TIS/H2O/EDT. Los productos crudos se purificaron usando RP-HPLC. Los productos finales se caracterizaron por RP-HPLC analítica, LCMS y RMN. Todos los compuestos probados eran sales de trifluoroacetato y tenían una pureza de al menos el 95 %. Se realizaron estudios de RMN detallados para los péptidos relevantes.

Productos químicos: Todos los productos químicos y disolventes comerciales eran de grado reactivo y se utilizaron sin purificación adicional a menos que se especifique lo contrario. Todas las reacciones excepto aquellas en medio acuoso se llevaron a cabo con el uso de técnicas estándar para la exclusión de humedad. Todas las reacciones se realizaron bajo argón o nitrógeno en material de vidrio secado al horno utilizando disolventes anhidros y técnicas de jeringa estándar. Se sintetizaron B2-homolisina y homoarginina como se informó anteriormente.i Las transformaciones y lavados de la sintesis de péptidos se realizaron a 20 °C. Todos los derivados de aminoácidos protegidos con carbamato Fmoc, HATU, HoAt, HBTU, HOBt, Fmoc-Rink Amida (malla 200-400, carga 0.62 mmol/g) y resina 2-CTC (malla 100-200, carga 1.6 mmol/g) fueron adquiridos en Iris Biotech (Marktredwitz, Alemania). Los reactivos tales como DIEA, piperidina, DMF, IPA, Ac2O, MeOH, t Fa y TIS se obtuvieron de Sigma-Aldrich (San Luis, Estados Unidos). Los pesos moleculares de los compuestos se calcularon utilizando ChemBioDraw® Ultra 12. Todos los productos finales tenían una pureza > 95 % a menos que se indique lo contrario (determinado mediante LC-MS analítica en fase reversa). Los datos analíticos se dan en Tabla 6 (ejemplo 6) como ilustración de dos péptidos potentes de acuerdo con la presente descripción.

Analítica: Se llevaron a cabo dos métodos para el análisis LC-MS.

Método A : se realizó una HPLC analítica en una columna X-Select CSH C18 XP (30 x 4.6 mm id, 2.5 pm) eluyendo con ácido fórmico al 0.1 % en agua (disolvente A) y ácido fórmico al 0.1 % en acetonitrilo (disolvente B), utilizando el siguiente gradiente de elución 0 - 3.2 min: 0 % a 50 % B, 3.2 - 4 min 100 % B, a un caudal de 1.8 ml/min a 40 °C. Los espectros de masas (MS) se registraron en un Espectrómetro de masas Waters ZQ que utiliza modos de ionización positiva por electropulverización [ES+ para dar (MH)+ iones moleculares] o ionización negativa por electropulverización [ES- para dar (MH)- iones moleculares]. El voltaje del cono era de 20 V.

Método B : se realizó una HPLC analítica en una columna X-Select CSH C18 XP (30 x 4.6 mm id., 2.5 pm) eluyendo con ácido fórmico al 0.1 % en agua (disolvente A) y ácido fórmico al 0.1 % en acetonitrilo (disolvente B), utilizando el siguiente gradiente de elución 0 - 3.2 min: 5 % a 100 % B, 3.2 - 4 min: 100 % B, a un caudal de 1.8 ml/min a 40 °C. Los espectros de masas (MS) se registraron en un Espectrómetro de masas Waters ZQ que utiliza modos de ionización positiva por electropulverización [ES+ para dar (MH)+ iones moleculares] o ionización negativa por electropulverización [ES- para dar (MH)- iones moleculares]. El voltaje del cono era de 20 V.

Purificación: La purificación a escala preparativa de los péptidos se realizó mediante HPLC en fase reversa en un sistema Waters que consitía en un módulo de gradiente cuaternario (Water 2535) y un detector de absorbancia UV/Visible de doble longitud de onda (Waters 2489), pilotado por software EmpowerPro 3 usando las siguientes columnas: columna preparativa Macherey-Nagel (Nucleodur HTec, C18, 250 x 16 mm id, 5 gm, 110 Á) y columna preparativa Analítica de Higgins (Proto 200, C18, 150 x 20 mm id, 5 gm, 200 Á) a un caudal de 14 ml/min y 20 ml/min respectivamente. Los crudos a pequeña escala (< 30 mg) se purificaron utilizando una columna Ace semipreparativa (Ace 5, C18, 250 x 10 mm id, 5 gm, 300 Á) a un caudal de 5 ml/min. Los gradientes de purificación se eligieron para obtener una rampa de aproximadamente 1 % de solución B por minuto en el área de interés y la detección UV se realizó a 220 nm y 280 nm. Las fracciones peptídicas de la purificación se analizaron por LC-MS (método A o B dependiendo del tiempo de retención) o por HPLC analítica en un sistema Dionex que consitía en un sistema LC automatizado (Ultimate 3000) equipado con un muestreador automático, un bloque de bombas compuesto por dos bombas de gradiente ternarias y un detector de longitud de onda dual, pilotado por software Chromeleon. Todos los análisis de LC-MS o HPLC se realizaron en columnas C18. Las fracciones puras se recolectaron según su pureza y luego se liofilizaron utilizando un secador por congelación Alpha 2/4 de Bioblock Scientific para obtener el péptido esperado como un polvo blanco. La pureza del péptido final (> 95 %) de las fracciones agrupadas correspondientes se verificó mediante LC-MS utilizando el método A.

• Carga manual del primer aminoácido:

Las síntesis de péptidos en fase sólida se realizaron en jeringas Torviq de polipropileno (10 o 20 ml) provistas de un disco poroso de polietileno en la parte inferior y cerradas con un pistón apropiado.

El disolvente y los reactivos solubles se eliminaron mediante movimientos de ida y vuelta. La resina 2-CTC se hinchó previamente en DCM estrictamente anhidro (destilado) durante 2 h. Se acopló Fmoc-Aa-OH protegido de cadena lateral (0.30 mmol, 1 eq.) a resina 2-CTC (400 mg, carga 1.6 mmol/g) en presencia de DIEA (1.2 mmol, 4 eq.) en DCM (4 ml). Los sitios sin reaccionar de la resina se taparon lavando con una mezcla de DCM/MeOH/DIEA (17:2:1) repetida 3 veces. Por tanto, la carga se redujo a 0.80 mmol/g para un crecimiento óptimo del péptido. En el caso de la resina Rink Amida, el hinchamiento en DCM se realizó de manera similar en 2 h (500 mg, cargando 0.62 mmol/g). Sin embargo, el primer acoplamiento se realizó directamente con Fmoc-Aa-OH protegido (1.2 mmol, 4 eq.), HBTU (1.2 mmol, 4 eq.), HOBt (1.2 mmol, 4 eq.) y DIEA (2.4 mmol, 8 eq.) sin disminuir la carga.

• Síntesis manual de péptidos en fase sólida:

En todas las síntesis la escala fue de 0.30 mmol. El grupo Fmoc se separó mediante tratamiento con piperidina/DMF (1:4) (1 x 1 min, 1 x 10 min). Las etapas de lavado entre la desprotección y el acoplamiento se realizaron con DMF (3 x 1 min), IPA (3 x 1 min) y DMF (3 x 1 min). La etapa de activación se llevó a cabo con Fmoc-Aa-OH (1.2 mmol, 4 eq.), HBTU (1.2 mmol, 4 eq.) como agente de acoplamiento, HOBt (1.2 mmol, 4 eq.) como nucleófilo auxiliar y DIEA (2.4 mmol, 8 eq.) como base. Luego, el aminoácido activado se transfiere a la resina donde se realizó el acoplamiento durante 1 a 18 h. Las reacciones de acoplamiento compatibles se controlaron mediante la prueba clásica de Kaiser (kit de solución de Sigma-Aldrich). Cuando se completó la elongación de la cadena peptídica, se añadió una etapa de lavado con MeOH después de la eliminación final de Fmoc N-terminal para la contracción completa de la resina al vacío.

• N-Metilación selectiva del sitio del esqueleto peptídico:

El residuo fue N-metilado en fase sólida a través de las condiciones de Kessler: primero, la funcionalidad amino libre se protegió y activó con el grupo o-nitrobencenosulfonilo (o-NBS), luego N-metilado utilizando 1,8-diazabiciclo[5,4,0]undec-7-eno (DBU) y dimetilsulfato (DMS), y finalmente desprotegido (eliminación de o-NBS) mediante el tratamiento de la resina con ^mercaptoetanol y DBU.

Protección de o-NBS: Se añadió una solución de o-NBS-Cl (4 eq.) y colidina (10 eq.) en NMP a los péptidos de amina libres unidos a la resina y se agitó durante 15 min a temperatura ambiente. La resina se lavó con NMP (5x).

N-Metilación con DBU y DMS: Se añadió una solución de DBU (3 eq.) en NMP a los péptidos protegidos con o-NBS unidos a resina y se agitó durante 3 min. A continuación, se añadió a la mezcla de reacción una solución de sulfato de dimetilo (10 eq.) en NMP y se agitó durante 2 min. La resina se filtró, se lavó una vez con NMP y el procedimiento de N-metilación se repitió una vez más. La resina se lavó con NMP (5x).

Desprotección de o-NBS: La resina unida Na-metil-Na-o-NBS-péptidos se trató con una solución de fi-mercaptoetanol (10 eq.) y DBU (5 eq.) en NMP durante 5 min. El procedimiento de desprotección se repitió una vez más y la resina se lavó con NMP (5x).

[Biron, E.; Chatterjee, J.; Kessler, H. J. Peptide Sci. 2006, 12, 213 y referencias citadas en el mismo]

• Desprotección final de la cadena lateral y escisión de la resina:

Los péptidos crudos se trataron con el siguiente cóctel de escisión: TFA/H2O/TIS (95/2.5/2.5, 10 ml). Las jeringas se agitaron durante 3 h y luego se precipitaron 3 veces usando Et2O enfriado (3 x 30 ml), se recuperaron después de las centrifugaciones (3 x 5 min, 7800 rpm), se eliminó el éter dietílico (3 veces) y luego los sedimentos de péptido se secaron (bajo flujo de nitrógeno). El péptido crudo resultante se disolvió en TFA acuoso al 0.1 % (v/v). La purificación se realizó en una columna HPLC Prep C18 en fase reversa, eluyendo con TFA al 0.1 % en agua (disolvente A) y TFA al 0.1 % en acetonitrilo (disolvente B) como se describió anteriormente.

Ensayos de degradación de péptidos. Los péptidos (10 mg/mL), diluidos en una mezcla de suero humano/RPMI 1640 1:4, se incubaron a 37 °C en diferentes tiempos, luego se mezclaron con etanol y 5 mL de NaOH 1 M y se incubaron a 4 °C durante al menos 15 min para precipitar las proteínas séricas. El sobrenadante se recogió, se inyectó en una HPLC y el péptido soluble se eluyó mediante un gradiente lineal de ACN al 5 al 50 % [TFA al 0.1 % (v/v) en acetonitrilo] en TFA acuoso al 0.1 % (v/v). La concentración del péptido se calculó integrando la absorbancia a 220 nm en función del tiempo de retención.

Espectroscopia de CD. Los espectros de CD se registraron en un espectropolarímetro Jasco 815 (Jasco Inc., Easton, m D) en el rango de longitud de onda de 190-260 nm, a intervalos de 0.2 nm y 10 nm.min.-1 velocidad de escaneo. Los péptidos se disolvieron a una concentración de 50 gM en un regulador de fosfato de sodio 10 mM a pH 7.4, utilizando celdas de cuarzo de 0.1 cm de longitud de paso óptico (Hellma, Mullheim, Alemania). Los espectros de CD se desconvolucionaron con el programa CDFriend con el fin de estimar el contenido de la estructura secundaria del péptido.

Análisis conformacional de RMN. Los experimentos de RMN se registraron en un espectrómetro Bruker Avance III de 500 MHz (Wissembourg, Francia) equipado con una sonda criogénica TCI. Las muestras de RMN se prepararon en regulador de succinato de sodio 50 mM, pH 5, utilizando una concentración de péptido 2 mM. Se añadió 2,2-dimetil-2-silapentano-afe-5-sulfonato de sodio (Sigma Aldrich) a una concentración de 0.1 mM para la calibración del desplazamiento químico y la medición de la concentración de péptido solubilizado. Los experimentos de RMN se procesaron con el software TOPSPIN 2.1 (Bruker) y los espectros se analizaron con el programa Sparky. Las resonancias 1H, 13C y 15N fueron asignadas usando espectros 2D 1H-1H TOCSY (esquema isotrópico DIPSI2 de 70 ms de duración), 2D 1H-1H ROESY (tiempo de mezcla de 300 ms), 2D 1H-13C HSQC, 2D 1H-15N HSQC y 2D 1H-13C HMBC. Las asignaciones completas por RMN 1H, 13C y 15N de péptidos 4N1K, PKT2, PKHB1 y 4NGG se proporcionan en las tablas S1-S4 (información de apoyo). Para los tres péptidos poco solubles 4N1, PKT1 y PKHB3, sólo se pudieron obtener asignaciones parciales de 1H (Tablas S5-S7). 3JHN-Ha, las constantes de acoplamiento se midieron en experimentos 1D 1H WATERGATE. Las desviaciones de desplazamiento químico de los protones Ha y los carbonos Ca se calcularon como las diferencias entre los desplazamientos químicos observados y los valores de bobina aleatorios informados en el agua. El análisis conformacional de la trombospondina-1 se llevó a cabo sobre la estructura cristalina de un fragmento C-terminal de trombospondina-1 humana utilizando los programas Pymol (Schrodinger) y Procheck. Las predicciones de los desplazamientos químicos de RMN en la estructura de rayos X se llevaron a cabo utilizando el programa SHIFTX2.

Ensayos biológicos

Mediciones de afinidad de unión. Las afinidades de unión de los péptidos para una preparación de membrana a partir de células MEC-1 se midieron mediante interferometría de biocapa en un sistema Octet RED96 (Pall FortéBio Corp., Menlo Park, CA).

Mediciones de afinidad de unión por interferometría de biocapa. Las afinidades de unión de los péptidos para una preparación de membrana a partir de células MEC-1 se midieron mediante interferometría de biocapa en un sistema Octet RED96 (Pall FortéBio Corp., Menlo Park, CA). Este sistema monitoriza la interferencia de la luz reflejada desde dos fuentes (una superficie de reflexión interna y la interfaz líquido/sólido de un sensor de fibra óptica) para medir la velocidad de unión de las moléculas a la superficie del biosensor.

La preparación de la membrana celular MEC-1 se biotiniló con el kit EZ-Link NHS-PEG4-Biotin de Thermo-Scientific. A continuación, las membranas biotiniladas se cargaron en biosensores SuperStreptavidin (SSA) (Pall FortéBio Corp.) a concentraciones determinadas empíricamente. Todas las medidas de afinidad se llevaron a cabo en regulador de ensayo (PBS con albúmina de suero bovino al 0.2 % y sulfóxido de dimetilo al 1 %) a 30 °C.

Ejemplo 1: Primera generación de compuestos peptídicos

Aquí, se exploró la capacidad de 4N1K para inducir PCD selectiva en líneas de células cancerosas sin afectar las células normales. Considerando su potencial como abordaje terapéutico para tratar el cáncer, incluso de pacientes refractarios con deleción de TP53, se exploró su estabilidad en suero y análogos diseñados resistentes a las proteasas. Para resaltar las propiedades farmacológicas de estos péptidos, se inició un estudio SAR sistemático mediante el desarrollo de un ensayo de unión que permitiera evaluar la afinidad de los análogos de 4N1K por CD47. Se realizaron estudios conformacionales por CD y RMN y se compararon los datos con la estructura de rayos X de la secuencia 4N1 en el contexto de la proteína TSP-1. Se implementó un Ala-scan para identificar los farmacóforos de 4N1K. El ensayo de degradación de péptidos de estos péptidos se informa en la Figura 1.

Por lo tanto, se sintetizaron los siguientes péptidos usando métodos comunes de síntesis en fase sólida (como se describe anteriormente):

Luego, las estructuras de los péptidos se probaron mediante RMN y rayos X. Los péptidos también fueron probados por su actividad en MEC-1 y su Ksd y se determinaron los tiempos de retención en LCMS.

Tabla 1: Comparación de constantes de acoplamiento 3JHN-Ha de RMN experimental con bobina J y valores deducidos de la estructura de rayos X

Residuo Bobina Ja 4N1K 4 2 4NGG Rayos Xb Arg2 6.92 7.0 br s 7.2 br s 9.1 Phe3 7.35 7.9 7.4 7.9 8.0 4.6 Tyr4 7.32 7.9 7.8 7.8 7.8 8.9 Val5 7.55 8.1 8.1 8.0 (Gly) 9.2 Val6 7.55 7.8 7.9 7.6 (Gly) 9.8 Met7 6.97 7.4 7.3 7.1 7.3 9.5 Trp8 7.01 7.0 n.d. 6.8 n.d. 9.4 Lys9 6.92 7.4 7.5 7.3 n.d. 9.6 Lys10 6.92 7.3 7.9 6.6 n.d.

a Constantes de acoplamiento promedio de la biblioteca de bobinas tomadas de la referencia "Avbelj, F. et al. proc. nacional Academia ciencia ^eE. UU. 2006, 103, 1272-1277". b Valores calculados en la estructura cristalina 1 UX6 utilizando la relación Karplus de referencia Vuister, C.W. et al. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 7772-7777.

Tabla 2. Caracterización de la estructura, afinidad y actividad de los péptidos diseñados para mejorar la estabilidad

. . .

4NGG KRFYGGMWKK (SEQ ID 6) DNP DNP 2 %

Péptidos Secuencia ^{Kda (pM)}Kda (pM) (MST) Muerte celular MEC-1 (%)b 2h _(O)

2 Ac-KRFYVVMWKK-NH2 (SEQ ID 8) 40 ± 24 1.2 ±0.16 30 %

4 kRFYVVMWKk (SEQ ID 27) 43 ± 21 3.04 ± 0.25 63 % _(PKHB1)

a- b Los valores de Kd informados y el % de PCD son un promedio de, al menos, tres experimentos independientes, NPD: Datos no pertinentes.05 % al 100 % durante 55 min de acetonitrilo/agua que contenía 0.1 % de TFA.

Tabla 3. Caracterización de la estructura, afinidad y actividad de los péptidos diseñados para la identificación de farmacóforos

. .

a- b Los valores de Kd informados y el % de muerte celular son un promedio de dos o más mediciones, NPD: datos no pertinentes.05 % al 100 % durante 55 min de acetonitrilo/agua que contenía 0.1 % de TFA.01 Nle: Norleucina.e: Los tiempos de retención se indican para el método A de LCMS.

Método A: Se realizaron dos métodos para el análisis LC-MS. Método A: se realizó una HPLC analítica en una columna X-Select CSH C18 XP (30 x 4.6 mm de id, 2.5 pm) eluyendo con ácido fórmico al 0.1 % en agua (disolvente A) y ácido fórmico al 0.1 % en acetonitrilo (disolvente B), utilizando el siguiente gradiente de elución 0 - 3.2 min: 0 % a 50 % B, 3.2 - 4 min 100 % B, a un caudal de 1.8 ml/min a 40 °C. Los espectros de masas (MS) se registraron en un Espectrómetro de masas Waters ZQ que utiliza modos de ionización positiva por electropulverización [ES+ para dar (MH)+ iones moleculares] o ionización negativa por electropulverización [ES- para dar (MH)- iones moleculares]. El voltaje del cono era de 20 V.

Ejemplo 2: Segunda generación de compuestos peptídicos

Se utilizaron W-metil aminoácidos en el diseño de PKT16 para interrumpir la interacción péptido-péptido que promueve la agregación. De hecho, la sustitución del protón amida por un grupo metilo parece evitar las interacciones de enlaces de hidrógeno que normalmente estabilizan la lámina p a través de interacciones entre cadenas p individuales. Es más, los N-metilaminoácidos parecen impedir el acercamiento de las cadenas p debido al impedimento estérico y favorecen la estructura de la cadena p en el propio péptido debido a la preferencia de las amidas terciarias por la trans conformación.

Tabla 4. Caracterización de la estructura, afinidad y actividad de los péptidos de N-metilo

Además, la propensión conformacional de cada péptido se examinó luego mediante espectros

Los espectros de CD de UV lejano de los diferentes péptidos están dominados por una firma de bobina aleatoria, como se deduce de la fuerte banda negativa alrededor de 195 nm. La deconvolución de los espectros conduce a contribuciones de bobinas aleatorias que van del 80 al 90 %. Los péptidos no muestran propensión helicoidal y solo se puede observar un pequeño contenido de lámina p para los péptidos 4N1 y PKT1 menos solubles, lo que sugiere que la estructura b surge de especies agregadas. Curiosamente, la mayoría de los péptidos exhiben una pequeña fracción de conformación Pii, como sugiere la débil banda positiva cerca de 220-225 nm.

En general, la espectroscopia de CD indica que estos péptidos lineales cortos tienden a no estar estructurados en gran medida en solución acuosa. A continuación, se utilizó la espectroscopia de RMN para sondear las conformaciones locales de aminoácidos individuales, basándose en el análisis de parámetros de RMN tales como desviaciones de desplazamiento químico de 1Ha y 13 Ca (CSD), constantes de acoplamiento 3JHN-Ha y NOEs.

Las desviaciones del desplazamiento químico de resonancias de 1Ha y 13Ca se calculan como las diferencias entre los desplazamientos químicos observados y los valores correspondientes en la conformación de espiral aleatoria para cada aminoácido. Se pueden usar CSD significativos para detectar la presencia de hélices, láminas o giros. Los CSD muestran valores cercanos a cero para los diferentes análogos (datos no mostrados), lo que confirma que estos péptidos no adoptan estructuras secundarias regulares en solución, como se muestra arriba por espectroscopía de CD.

Ejemplo 3: Estudios de estabilidad en PKT16

3.1. Degradación en suero humano/de ratón

A una mezcla de 250 gl de suero humano (o de ratón) y 750 gl de RPMI 1640 se añadieron 20 gl de la solución madre de péptido DMSO a 10 mg/ml. La mezcla se incubó a 37 °C. Se extrajeron alícuotas de 100 gL del medio a diferentes tiempos, se mezclaron con 100 gL de acetonitrilo y se incubaron a 4 °C durante al menos 15 min para precipitar todas las proteínas séricas. Después de centrifugar a 12000 rpm durante 2 min, se transfirieron 50 gL del sobrenadante a un vial de inyección y se analizaron por HPLC con un gradiente lineal de MeCN en agua (5 a 95 % 0.1 % TFA). Las concentraciones relativas de los péptidos solubles restantes se calcularon por integración de la absorbancia a 220 nm en función del tiempo de retención (área del pico).

3.2. Estabilidad bajo incubación con proteinasa K, quimotripsina y tripsina

Se cargó un tubo de 0.6 ml con 180 gl de regulador fosfato pH 7.4, 10 gl de enzima (0.05 mg/ml de solución madre en regulador fosfato pH 7.4), 10 gl de péptido (solución madre 10 mM en DMSO). La mezcla de reacción resultante se protegió y se incubó a temperatura ambiente durante 3 horas. Se inactivaron 20 pL de la reacción cruda mediante la adición de 180 pL de agua al 50 %: acetonitrilo al 50 % y se sometieron a análisis de LC-MS. Método A o Método B de acuerdo con los péptidos.

Ejemplo 4: Mediciones de afinidad de unión por interferometría de biocapa (BI) y termoforesis a microescala (MT)

Protocolos:

4.1. BI:

Las afinidades de unión de los péptidos para una preparación de membrana de células MEC-1 se midieron mediante interferometría de biocapa en un sistema Octet RED96 (Pall FortéBio Corp. Menlo Park, CA).

Este sistema monitoriza la interferencia de la luz reflejada desde dos fuentes (una superficie de reflexión interna y la interfaz líquido/sólido de un sensor de fibra óptica) para medir la tasa de unión de las moléculas a la superficie del biosensor. La preparación de membrana de células MEC-1 se biotinila con el kit EZ-Link NHS-PEG4-Biotin de Thermo-Scientific y el exceso de biotina se elimina mediante una columna de desalinización de Thermo-Scientific. A continuación, las membranas biotiniladas se cargan en biosensores SuperStreptavidin (SSA) (Pall FortéBio Corp.) a concentraciones determinadas empíricamente. Todas las mediciones de afinidad se llevaron a cabo en regulador de ensayo (PBS con Tween 20 al 0.05 % y DMSO al 1 %) a 30 °C. Típicamente, los biosensores se preequilibraron en PBS que contenía membranas biotiniladas o biocitina 100 pg/mL. A continuación, los biosensores se equilibran en el regulador de ensayo durante 10 minutos, se llevan a la línea de base en el regulador de ensayo durante 60 segundos. y se transfirió a pocillos que contenían péptido en respuesta a la dosis (asociación durante 120 seg. y disociación durante 300 seg.). La referencia doble con biosensores cargados con membrana sin ninguna respuesta a la dosis de péptido o biosensores cargados con biocitina con cada respuesta a la dosis de péptido se ejecutaron en paralelo para las sustracciones dobles de la señal de fondo. La cinética de unión se calculó utilizando el software FortéBio Data Analysis v8.2.

4.2. MST:

Para todos los experimentos, la concentración de la membrana marcada con NT.115 se mantuvo constante, mientras que se variaron las concentraciones del ligando (péptido). Después de un breve tiempo de incubación (5 min), las muestras se cargaron en capilares de vidrio premium MST y el análisis MST se realizó con el Monolith NT.115.

Tabla 5: Valores aparentes de Kd informados con desviaciones estándar asociadas (= 2; 3 o 4)

Ejemplo 5: PKT16-FF: Un nuevo péptido potente

La sustitución del residuo de tirosina en la posición "X2" (es decir, de acuerdo con la fórmula (I)) de PKT16 por un residuo de alanina conduce a un péptido inactivo que subraya la importancia de este residuo.

Para evaluar la importancia del grupo -OH de esta tirosina, esta tirosina se reemplazó con un residuo de fenilalanina. Aunque este residuo mantiene el núcleo aromático, sorprendentemente se muestra más activo que PKT16.

Este nuevo péptido se denominó PKT16-FF, que es activo a partir de 25 microM durante 6 horas, como se indica en

Claims

REIVINDICACIONES

1. Compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de fórmula (III):

-A-B-Xi -X2-X3-X4-X5-X6-C-D- (III)

en la que

A y B están unidos entre sí por un enlace pseudopeptídico -CO-NMe-; y

2. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado por que se elige en el grupo que consiste en:

H-(D)K ^(CONMe)R F Y V V X W K (D)K-OH (SEQ ID 21)

H-(D)K ^(CONMe)R F Y V V L W K (D)K-OH (SEQ ID 22)

H-(D)K ^(CONMe)R F Y VV I W K (D)K-OH (SEQ ID 23).

3. Método para producir un compuesto o una sal farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 caracterizado por las siguientes etapas sucesivas:

b) opcionalmente, el extremo N-terminal del compuesto (III) se desprotege entonces y se injerta con el fragmento conveniente;

c) opcionalmente, el extremo C-terminal del compuesto (III) se desprotege entonces o escinde e injerta con el fragmento conveniente; y

d) luego se eliminan los grupos protectores restantes del compuesto (III).

4. Compuesto o sal farmacéuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 para su uso como medicamento.

5. Compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 para su uso en el tratamiento del cáncer.