ES2899176T3 - Plantas tolerantes a las bajas temperaturas - Google Patents
Plantas tolerantes a las bajas temperaturas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2899176T3 ES2899176T3 ES15196721T ES15196721T ES2899176T3 ES 2899176 T3 ES2899176 T3 ES 2899176T3 ES 15196721 T ES15196721 T ES 15196721T ES 15196721 T ES15196721 T ES 15196721T ES 2899176 T3 ES2899176 T3 ES 2899176T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- nucleic acid
- plant
- acid sequence
- seq
- tolerance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 195
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 125
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 124
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 111
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 89
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 53
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 53
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 198
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 77
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 62
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 55
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 54
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 48
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 45
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 43
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 43
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 40
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 32
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 27
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 16
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 claims description 14
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 230000008645 cold stress Effects 0.000 claims description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 30
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 30
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 18
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 15
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 15
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 14
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 14
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000001127 nanoimprint lithography Methods 0.000 description 14
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 11
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 11
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 11
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 9
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 9
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 7
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 7
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 6
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 6
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 6
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108010060806 Photosystem II Protein Complex Proteins 0.000 description 5
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 5
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 5
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 5
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 4
- 101150045313 COLD1 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 101150070234 31 gene Proteins 0.000 description 3
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 241000482268 Zea mays subsp. mays Species 0.000 description 3
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 3
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 3
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 3
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 3
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 3
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- TWQHGBJNKVFWIU-UHFFFAOYSA-N 8-[4-(4-quinolin-2-ylpiperazin-1-yl)butyl]-8-azaspiro[4.5]decane-7,9-dione Chemical compound C1C(=O)N(CCCCN2CCN(CC2)C=2N=C3C=CC=CC3=CC=2)C(=O)CC21CCCC2 TWQHGBJNKVFWIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 2
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 2
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 2
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 2
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 244000240162 corn Species 0.000 description 2
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 2
- 208000006278 hypochromic anemia Diseases 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000012225 targeting induced local lesions in genomes Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- KGPGQDLTDHGEGT-JCIKCJKQSA-N zeven Chemical compound C=1C([C@@H]2C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C3=CC(O)=C4)C(=O)NCCCN(C)C)=O)[C@H](O)C5=CC=C(C(=C5)Cl)OC=5C=C6C=C(C=5O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O5)C(O)=O)NC(=O)CCCCCCCCC(C)C)OC5=CC=C(C=C5)C[C@@H]5C(=O)N[C@H](C(N[C@H]6C(=O)N2)=O)C=2C(Cl)=C(O)C=C(C=2)OC=2C(O)=CC=C(C=2)[C@H](C(N5)=O)NC)=CC=C(O)C=1C3=C4O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O KGPGQDLTDHGEGT-JCIKCJKQSA-N 0.000 description 2
- WTGXAWKVZMQEDA-XFWGRBSCSA-N (2R)-DIMBOA glucoside Chemical compound O([C@@H]1C(=O)N(O)C2=CC=C(C=C2O1)OC)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WTGXAWKVZMQEDA-XFWGRBSCSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 101100364901 Arabidopsis thaliana SAUR19 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100532610 Arabidopsis thaliana SAUR36 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 235000005976 Citrus sinensis Nutrition 0.000 description 1
- 240000002319 Citrus sinensis Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 240000001140 Mimosa pudica Species 0.000 description 1
- 235000016462 Mimosa pudica Nutrition 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 101100029173 Phaeosphaeria nodorum (strain SN15 / ATCC MYA-4574 / FGSC 10173) SNP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000167882 Rhopalosiphum maidis Species 0.000 description 1
- 101100094821 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SMX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000332749 Setosphaeria turcica Species 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 235000010716 Vigna mungo Nutrition 0.000 description 1
- 235000011453 Vigna umbellata Nutrition 0.000 description 1
- 244000075787 Zea mays ssp mexicana Species 0.000 description 1
- 235000002485 Zea mays ssp. mexicana Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 208000005652 acute fatty liver of pregnancy Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- QDOXWKRWXJOMAK-UHFFFAOYSA-N dichromium trioxide Chemical compound O=[Cr]O[Cr]=O QDOXWKRWXJOMAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000008995 epigenetic change Effects 0.000 description 1
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 230000014634 leaf senescence Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000020429 meristem development Effects 0.000 description 1
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000009400 out breeding Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000019935 photoinhibition Effects 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010408 sweeping Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012033 transcriptional gene silencing Methods 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un casete de expresión que comprende un ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en a) una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO 29, b) una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 90% idéntica a una secuencia de a), c) una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO 30, caracterizada porque, la secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a un promotor que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 33.
Description
DESCRIPCIÓN
Plantas tolerantes a las bajas temperaturas
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la modificación de plantas por medio de métodos de biología molecular y tecnología de marcadores y la técnica de ingeniería genética. Se refiere a una nueva planta tolerante a las bajas temperaturas, especialmente una planta de maíz, así como a la identificación y la caracterización molecular, y al uso de genes y marcadores de un intervalo cromosómico de 25,7 kb, el cual en las líneas de maíz contiene un locus para la tolerancia al frío/a las bajas temperaturas. Otro aspecto de la invención se refiere al desarrollo de marcadores moleculares para ayudar durante el cultivo, especialmente para evitar una fijación de un barrido selectivo (“selective sweep”) en una región con una tasa de recombinación reducida.
Antecedentes de la invención
El término “bajas temperaturas” se refiere a temperaturas a las cuales la planta de maíz puede sobrevivir, pero el crecimiento se ve perjudicado o incluso muy perjudicado. La temperatura de crecimiento óptima para la germinación de las semillas de maíz y el desarrollo de plantas de maíz se encuentra entre 21-27 °C (Greaves JA (1996) Improving suboptimal temperature tolerance in maize-the search for variation. J Exp Bot 47: 307-323, 1996).
Por lo tanto aparece el estrés ya a temperaturas por debajo de 20 °C, que es una temperatura típica medida durante el tiempo de siembra en el norte de Europa. Un estrés por bajas temperaturas más leve, con fotosíntesis reducida bajo luz y crecimiento reducido se encuentra a 12-17 °C, y un estrés por bajas temperaturas más fuerte aparece junto con estrés hídrico por las bajas temperaturas, un tipo de estrés por sequía, bajo luz a 2-10 °C (Marocco A., Lorenzoni C and Fracheboud Y, 2005. Chilling stress in maize. Maydica, 50: 571-580).
El estrés por bajas temperaturas se produce o bien con una fotoinhibición y estrés oxidativo bajo luz o modificaciones de la expresión genética en la oscuridad (resumido en Marocco et al., 2005). La más sensible es la fase heterótrofa (de la siembra hasta la tercer hoja), sin embargo, el estrés por bajas temperaturas perjudica también a la fase autótrofa temprana (Bhosale et al., 2007.Chilling Tolerance of Central European Maize Lines and their Factorial Crosses, Annals of Botany 100: 1315-1321). Una incidencia prolongada de temperaturas reducidas lleva a un daño irreversible de las células y del tejido (Greaves, 1996) y un crecimiento y rendimiento en consecuencia reducidos.
Un crecimiento fuerte temprano de la planta se considera un indicador importante de rendimientos altos y estables, por ejemplo, en el maíz, especialmente en el clima fresco de Europa Central y del Norte. Adicionalmente, las clases de maíz que tienen un mayor crecimiento temprano producen un mejor cubrimiento del suelo y ayudan de este modo a reducir la erosión y el lavado de nitratos al comienzo de la fase de crecimiento.
Se realizaron múltiples investigaciones del locus de rasgos cuantitativos (QTL = Quantitative Trait Locus) para identificar una tolerancia genética a las bajas temperaturas en el maíz. La mayoría de los estudios analizaron plantas de maíz que fueron cultivadas en cámaras de crecimiento bajo condiciones óptimas (25/22 °C) y subóptimas (15/13 °C). Para ello se midieron parámetros tales como la eficiencia cuántica del Fotosistema II, la eficiencia cuántica máxima del Fotosistema II, la fluorescencia de clorofila, el contenido de clorofila de la tercer hoja (SPAD), la superficie de la hoja y el peso seco de la plántula (Fracheboud, Y., et al. "Identification of quantitative trait loci for cold-tolerance of photosynthesis in maize (Zea mays L.)." Journal of experimental botany 53.376 (2002): 1967-1977; Fracheboud, Y., et al. "Genetic analysis of cold-tolerance of photosynthesis in maize." Plant molecular biology 56.2 (2004): 241-253; Hund, A., et al. "q Tl controlling root and shoot traits of maize seedlings under cold stress." Theoretical and applied genetics 109.3 (2004): 618-629; Hund, Andreas, et al. "Cold tolerance of the photosynthetic apparatus: pleiotropic relationship between photosynthetic performance and specific leaf area of maize seedlings." Molecular Breeding 16.4 (2005): 321-331; Guerra-Peraza, Orlene, et al. "Temperature at night affects the genetic control of acclimation to cold in maize seedlings." Maydica 56.4 (2012)), sin embargo, en todos estos experimentos no se documentó ningún QTL en la proximidad del QTL descrito en el cromosoma 4 y clonado. Leipner et al. (QTL studies reveal little relevance of chilling-related seedling traits for yield in maize. Theor Appl Genet (2008) 116:555-562) informaron sobre un experimento de mapeo de QTL durante la fase de floración y cosecha en un experimento de campo con dos siembras temporalmente diferentes. Los parámetros medidos eran tiempo de floración, altura de la planta, peso de la materia seca de la paja y las espigas, y los autores compararon sus QTLs identificados con QTLs que fueron identificados por medio de experimentos en cámaras de crecimiento en la fase de germinación, como publicaron Jompuk et al. (Mapping of quantitative trait loci associated with chilling tolerance in maize (Zea mays L.) seedlings grown under field conditions. Journal of experimental botany, 2005, Año 56., No. 414, pp. 1153-1163.). Sólo de comprobaron pocos QTLs comunes. Leipner et al. llegaron a la conclusión a partir de esto que la tolerancia a las bajas temperaturas de las plántulas aparentemente no tenía un efecto significativo sobre el rendimiento.
Jompuk et al. (2005) determinaron el intercambio de carbono y la fluorescencia de la clorofila, la eficiencia cuántica operativa del Fotosistema II, la coloración verde de la tercer hoja (SPAD), la superficie de la tercer hoja y la masa seca de la plántula en la misma población, y mapearon un QTL para SPAD en una siembra temprana y la eficiencia cuántica operativa del Fotosistema II sobre el cromosoma 4 a 31,1 Mb, lo que se encuentra aproximadamente 6 Mb alejado del QTL de la presente invención en la posición 37 Mb.
Usando marcadores SSR Presterl et al. 2007 ("Quantitative trait loci for early plant vigour of maize grown in chilly environments." Theoretical and Applied Genetics 114.6 (2007): 1059-1070) mapearon sobre el cromosoma 4 un QTL de 4 cM, el cual comprende sin embargo, un tamaño físico de aproximadamente 155 Mb, lo que representa no menos de aproximadamente 7 % del genoma total en el maíz. Si bien se informa de un estudio de mapeo fino continuado en Baliashvili en 2011 (Feinkartierung eines QTL (Quantitative Trait Locus) für Kühletoleranz auf Chromosom 4 in Mais und dessen molekularbiologische und phanotypische Charakterisierung. Diss. Universitats- y Landesbibliothek der Heinrich-Heine-Universitat Düsseldorf, 2011), no se publican allí, sin embargo, ni los marcadores ni otras informaciones de secuencias.
Un estudio sobre QTL realizado hace poco fue publicado por Rodriguez et al. (Effects of selection for color intensity on antioxidant capacity in maize (Zea mays L.). Euphytica, 2013, 193. Año, No. 3, pp. 339-345.). Los descendientes de un cruzamiento de maíz flint y maíz dent fueron evaluados bajo condiciones controladas, en donde la línea de maíz dent reaccionó en forma sensible contra las bajas temperaturas y mostró una reducción drástica del contenido de clorofila. Las temperaturas de control se ajustaron allí a 25/20 °C, y las temperaturas más frías a 14/8 °C. Los parámetros medidos eran el número de plantas que sobrevivieron bajo las condiciones control y de frío, el peso seco de la plántula bajo condiciones control, el rendimiento cuántico del Fotosistema II bajo condiciones control y el contenido total de antocianina. Si bien cuatro de 10 regiones comprobadas de QTL se superpusieron con el QTL mapeado por Presterl et al 2007 sobre el cromosoma 4, no se realizaron, sin embargo, otras investigaciones con respecto a las bases genéticas, como por ej., el mapeo fino de las regiones o la identificación de los genes candidatos.
En tales investigaciones es importante básicamente que por el análisis de un origen parental de alelos en marcadores que flanquean un locus objetivo se pueda seleccionar individuos con un segmento cromosómico dador intacto corto alrededor del gen objetivo y así se pueda reducir el arrastre por ligamiento ("linkage drag"). Stam y Zeven (The theoretical proportion of the donor genome in near-isogenic lines of self-fertilizers bred by backcrossing. Euphytica, 1981, 30. Jg., Nr. 2, S. 227-238) mostraron, sin embargo, que la longitud esperada de un segmento cromosómico dador que está acoplado con un gen objetivo, incluso después de seis generaciones de retrocruzamientos y combinado con la selección aún se encuentra en el gen objetivo 32 cM sobre un cromosoma de100 cM. Se encuentran ejemplos de propiedades genéticamente codificadas negativas que permanecen acopladas con un gen objetivo bajo selección (Zeven, AC; Knott, DR; Johnson, R. Investigation of linkage drag in near isogenic lines of wheat by testing for seedling reaction to races of stem rust, leaf rust and yellow rust. Euphytica, 1983, Año 32., No. 2, pp. 319-327).
Básicamente, la tolerancia a las bajas temperaturas en el desarrollo ulterior de las plantas de cultivo es una característica importante. Así, para otros tipos de cultivo ya se conocen genes que brindan tolerancia a las bajas temperaturas. Ma et al. describen (en: COLD1confers chilling tolerance in rice. Cell. 2015 Mar 12; 160(6):1209-21), por ejemplo el QTL COLD1 en el arroz. Una sobreexpresión de COLD1(jap) aumenta la tolerancia a las bajas temperaturas en forma significativa. El COLD1 codifica para un regulador de la cascada de señales de la proteína G. Además, también se describe un SNP en COLD1, denominado SNP2. La tolerancia a las bajas temperaturas también es un objetivo importante para el cultivo de maíz con respecto a los silos, los granos y la energía en numerosas regiones de cultivo de maíz, especialmente en las regiones frías de Europa Central y del Norte, pero también en Europa del Sur, en donde los granjeros desearían poder sembrar más temprano las plantas de maíz, para poder aprovechar mejor la humedad del invierno que se encuentra en el suelo. El hallazgo y la caracterización de genes que brinden tolerancia a las bajas temperaturas y la provisión de nuevos marcadores para la tolerancia a las bajas temperaturas en plantas en general y especialmente en plantas de cultivo, así como la provisión de plantas con una mayor tolerancia a las bajas temperaturas, sin que estas plantas presenten además otras desventajas agronómicas o de cultivo, es por lo tanto de interés especial y un objeto de esta invención. Otros aspectos resultarán evidentes para el experto en el arte durante el estudio de la siguiente descripción y los ejemplos.
Un primer aspecto de la presente solicitud describe la provisión de un ácido nucleico que tiene una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en a) una secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO 29, b) una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos 90% o 95% o es preferente al menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia de a), c) una secuencia de ácidos nucleicos que, según el código genético degenerado, se deriva de una secuencia de ácidos nucleicos según a) o b), o d) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína según una de SEQ ID NO 30. Además, se describe un ácido nucleico que tiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica uno o más ARN que es/son al menos parcialmente capaces de hibridar consigo mismo o entre sí y de ese modo formar una parte bicatenaria, esta secuencia de ácidos nucleicos sobre al menos 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, preferiblemente al menos 30, 32, 34, 36, 38 o 40, con especial preferencia al menos 50, 60, 70, 80, 90 o 100, o muy particularmente preferiblemente al menos 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750 o 1000 nucleótidos consecutivos corresponden a una de las secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en (i) una secuencia de ácidos nucleicos según SEQ ID NO: 27, ( ii) una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria a una secuencia de i) es, (iii) una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos 80%, 85%, 90% o 95% o preferiblemente al menos 96%, 97%, 98 % o 99% idéntica a una secuencia de (i) o (ii), (iv) una secuencia de un ácidos nucleicos, que según el código genético degenerado, se deriva de una secuencia de ácidos nucleicos según (i), (ii) o (iii), (v) una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos según (i) ), (ii) o (iii) bajo condiciones rigurosas, (vi) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de acuerdo con SEQ ID NO: 28, o un homólogo, análogo u ortólogo de la misma, o vii) una secuencia de ácidos nucleicos en orientación antisentido a una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con (i) a (vi).
La presente invención es el resultado de esfuerzos del inventor para identificar en forma precisa y localizar un locus marcador cuantitativo de tolerancia a las bajas temperaturas (quantitative trait locus (QTL)) en el cromosoma 4 del maíz, clonar y secuenciar este QTL, e identificar el o los genes que son responsables del fenotipo de tolerancia a las bajas temperaturas. La región identificada de 25,7 kb en total (genotipo dador) fue investigada molecularmente, y se identificaron genes candidatos adecuados (véase Figura 1). La validación funcional realizada comprendía la identificación de mutantes de Tilling y estudios de expresión génica. De esta manera se vuelve aprovechar recién la tolerancia a las bajas temperaturas identificada con respecto al cultivo y a la técnica de ingeniería genética. En el curso de los trabajos de mapeo y mapeo fino se desarrollaron marcadores moleculares especiales que se pueden usar como diagnóstico para la selección de plantas con mayor tolerancia a las bajas temperaturas. Además, los marcadores desarrollados pueden ser usados para introducir por cruzamiento específicamente la fuente genética de la mayor tolerancia a las bajas temperaturas en material de cultivo presente (por ej., tipo existentes, líneas de elite, etc.) y de este modo mantener reducida la longitud de la introgresión producida. De este modo es posible por primera vez transferir la característica de tolerancia a las bajas temperaturas, sin arrastrar un sector genético extenso de la región del centrómero del cromosoma 4 del dador. Esto es especialmente ventajoso porque se determinó que este sector genético está fijado fuertemente y por lo tanto sólo admite una medida reducida de diversidad genética y frecuencia de recombinación. Si se arrastrara este sector genético, que representa más del 5% del genoma total del maíz, esto limitaría drásticamente el aprovechamiento de cultivo de tipos que tienen esta importante característica agronómica. La presente invención posibilita por lo tanto en forma ventajosa el aprovechamiento de cultivo de la característica de tolerancia a las bajas temperaturas identificada y reduce al mismo tiempo la pérdida de la diversidad genética (selective sweep) a un mínimo.
Como resultado de los análisis realizados en el marco de la invención se pudo hallar también una correlación significativa de marcadores fenotípicos para la tolerancia a las bajas temperaturas con la región entre los marcadores ma59778s31 y ma59778119 (véase, por ejemplo, Figura 2). El hallazgo de un QTL en el cromosoma 4 en el pool de dent que aclara el 35% de la variancia fenotípica para la tolerancia a las bajas temperaturas, representa un recurso decisivo para el aprovechamiento en el cultivo.
En base a la reducida tasa de recombinación y de la posición pericentromérica del QTL era especialmente difícil limitar el sector original en el estrecho intervalo y en lugar de un medio cromosoma de 122 MB, con el cual se heredaban aún otras características negativas y que hubieran llevado a una pérdida de la diversidad genética, introducir por cruzamiento en el cultivo sólo pocos kb. Con el conocimiento de las bases genéticas de rasgo de tolerancia a las bajas temperaturas también fue posible su aprovechamiento único evitando un arrastre de ligamiento y una reducida diversidad genética.
En la región alrededor de dicho QTL, por medio de comparaciones entre las diversas plantas y comparaciones de bancos de datos subsiguientes se pudieron identificar varios elementos funcionales, y genes, (véanse ejemplos), que participan solos o en combinación en la tolerancia a las bajas temperaturas. Las siguientes Tablas 1a, 1b y 1c los presentan.
Tabla 1a: Elementos genéticos y genes en la región objetivo 25,7 kb (genotipo TH; marco de lectura abierta ORF -(open reading frame) como se identificó; SL - línea sensible; TH - línea tolerante)
Tabla 1b: Elementos genéticos y genes en la región objetivo de 25,7 kb, los que no están presentes en el genotipo TH o los que presentan en el genotipo TH una expresión modificada, preferentemente reducida (ORF - marco de lectura abierta (open reading frame) como se identificó; SL - línea sensible; TH - línea tolerante).
Tabla 1c: Elementos genéticos y genes en la región objetivo de 25,7 kb (Genotipo SL; ORF - Marco de lectura abierta (open reading frame) como se identificó; SL - línea sensible; TH - línea tolerante)
De especial interés en el marco de la presente invención, y por lo tanto preferidos, son ORF-09 (SAUR31), ORF-08 y ORF-02, los que mostraron diferente expresión entre las líneas SL y Th (véase Tabla 1b). Por ejemplo, la tasa de expresión de ORF-09 bajo estrés por bajas temperaturas era mayor en las líneas más sensibles a las bajas temperaturas (SL) que en las líneas más tolerantes a las bajas temperaturas (TH) y fue disminuyendo con el tiempo.
Los datos de análisis con respecto al gen ORF-09 y la anotación correspondiente SAUR31 de acuerdo con la SEQ ID NO: 27 (secuencia de nucleótidos del genotipo SL), la SEQ ID NO: 29 (secuencia de nucleótidos del genotipo TH) y la SEQ ID NO: 31 (secuencia de nucleótidos de la línea de referencia del genoma del maíz B73) permitieron con ayuda de los análisis de marcadores y la evaluación de las frecuencias de recombinación en las diversas líneas SL, TH y B73 (Figura 1) un claro posicionamiento de SAUR31 dentro de un tramo en el cromosoma 4 entre los marcadores ma59778s31 y ma59778119, preferentemente entre ma59778s32 y ma59778119. Para ello SAUR31 es un gen, que codifica para la proteína que responde a auxina del mismo nombre (véase SEQ ID NOs: 28, 30 y 32). De los genes SAUR se conoce que participan en la expansión celular, la transducción de señales mediada por auxina y el desarrollo de los meristemas de raíces y también son reguladores positivos de la senecescencia de la hoja (Xu, N.; Hagen, G; Guilfoyle, T. "Multiple auxin response modules in the soybean SAUR 15A promoter". Plant Science, 1997, Año 126, No. 2, pp. 193-201; Jain, M; Tyagi, AK; Khurana, JP. "Genome-wide analysis, evolutionary expansion, and expression of early auxin-responsive SAUR gene family in rice (Oryza sativa)". Genomics, 2006, Año 88, No. 3, pp. 360-371; Jain, M; Khurana, JP. "Transcript profiling reveals diverse roles of auxin-responsive genes during reproductive development and abiotic stress in rice". Febs Journal, 2009, Año 276., No. 11, pp. 3148-3162; Spartz, AK, et al. "The SAUR19 subfamily of SMALL AUXIN UP RNA genes promote cell expansion". The Plant Journal, 2012, Año 70, No.
6, pp. 978-990; Hou et al.. "SAUR36, a small auxin up RNA gene, is involved in the promotion of leaf senescence in Arabidopsis". Plant physiology, 2013, Año 161, No. 2, pp. 1002-1009). Los genes SAUR son genes primarios que responde a auxina, los que participan el camino de señales de auxina (Chen et al. Jun. "Small auxin upregulated RNA (SAUR) gene family in maize: Identification, evolution, and its phylogenetic comparison with Arabidopsis, rice, and sorghum". Journal of integrative plant biology, 2014, Año 56, No. 2, pp. 133-150). Pueden ser divididos en diversos grupos y se hallaron hasta ahora en A. thaliana, arroz y soja en diversas funciones. En el maíz se identificaron en el genoma B73, 79 genes SAUR putativos (Chen et al. "Small auxin upregulated RNA (SAUR) gene family in maize: Identification, evolution, and its phylogenetic comparison with Arabidopsis, rice, and sorghum". Journal of integrative plant biology, 2014, Año 56, No. 2, pp. 133-150). El gen candidato ORF-09 fue mencionado como ZmSAUR37, pero el significado en la transmisión de tolerancia a las bajas temperaturas sin embargo no ha sido descrito previamente y es sorprendente. En los estudios en los que se basa la invención se determinó una expresión de diferente intensidad de SAUR31 en las líneas sensibles (SL) en comparación con las líneas tolerantes (TH) durante el estrés por bajas temperaturas (Tabla 1b). La secuencia de promotores mostró un alto número de polimorfismos entre las líneas investigadas, mientras que la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada permaneció en gran parte inalterada. Si bien se puede suponer que la diferente expresión del gen SAUR putativo, transmitida por la variación en su promotor participa en el presente fenotipo tolerante a las bajas temperaturas, también todos los otros genes o regiones (como se representa en la Tabla 1a-c) ) dentro del q Ul que trasmite la tolerancia a las bajas temperaturas, en forma individual o juntos, eventualmente junto con SAUR, pueden ser responsables del fenotipo de la tolerancia a las bajas temperaturas o tener influencia sobre la medida de la tolerancia a las bajas temperaturas.
El objeto en el que se basa la invención se logra por medio de la provisión de un casete de expresión que comprende un ácido nucleico con una secuencia de ácidos nucleicos, seleccionada del grupo compuesto por a) una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con una de la SEQ ID NO 29 b) una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos 90% o 95% o preferentemente al menos 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a una secuencia de a) o c) una secuencia de ácidos nucleicos, que codifica para una proteína de acuerdo con una la SEQ ID NO 30, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a un promotor que comprende la secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO: 33. Además, se describe un casete de expresión que comprende un ácido nulceico con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para uno o más ARNs, que pueden hibridarse al menos parcialmente consigo mismos o entre sí y formar de este modo una parte de doble hebra, en donde esta secuencia de ácidos nucleicos concuerda en al menos 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, preferentemente al menos 30, 32, 34, 36, 38 o 40, más preferentemente al menos 50, 60, 70, 80, 90 o 100, o más preferentemente aún con al menos 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750 o 1000 nucleótidos consecutivos con una de las secuencias de ácidos nucleicos seleccionada del grupo compuesto por (i) una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NO: 27, (ii) una secuencia de ácidos nucleicos (i) , que es complementaria de una secuencia (iii) una secuencia de ácidos nucleicos, que es al menos 80%, 85%, 90% o 95% o preferentemente al menos 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a una secuencia de (i) o (ii), (iv) una secuencia de ácidos nucleicos, que de acuerdo con el código genético degenerado, se deriva de una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con (i), (ii) o (iii), (v) una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con (i), (ii) o (iii) bajo condiciones rigurosas, (vi) una secuencia de ácidos nucleicos, que codifica para una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO: 28, o un homólogo, análogo u ortólogo de éstas, o vii) una secuencia de ácidos nucleicos en orientación antisentido con respecto a una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con (i) a (vi).
Un casete de expresión de acuerdo con la invención es adecuado preferentemente, después de la transcripción o después de la expresión en una planta, para transmitir la propiedad de tolerancia a las bajas temperaturas o para aumentar la tolerancia a las bajas temperaturas de la planta.
En principio, los casetes de expresión, su estructura y sus componentes son conocidos por el experto en el arte y se han descrito en la literatura (Sambrook et al.2001, "Molecular cloning: a laboratory manual" (conjunto de 3 volúmenes) (Vol. 999). Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Tales casetes están compuestos al menos por un gen a expresar y un promotor unido operativamente con éste. Tales promotores pueden transmitir la expresión transgénica de determinados genes específica para el desarrollo de la planta o específica del tejido, como por ejemplo, en la WO 2003/006660 o la WO 2000/026388. La DE102005021365 describe, por ejemplo, un casete de expresión específico para la floración. También puede estar contenida al menos una secuencia terminadora funcional en células vegetales y organismos vegetales (por ejemplo, como en la WO 2003/008596). También pueden estar contenidos uno o más genes de tolerancia en el casete de expresión, los que permiten una selección de células transformadas o transfectadas exitosamente. El experto en el arte conoce también diversos genes de tolerancia adecuados para la selección (marcadores de selección) del estado de la técnica (Miki, B; McHugh, S. "Selectable marker genes in transgenic plants: applications, alternatives and biosafety". Journal of Biotechnology, 2004, Año 107, No. 3, pp. 193-232). Estos pueden comprender, por ejemplo, una tolerancia a la kanamicina, la estreptomicina o la ampicilina. Los casetes de expresión pueden encontrarse como ácidos nucleicos lineales o en un vector o plásmido.
En una forma de realización del casete de expresión de la presente invención, un ácido nucleico descrito anteriormente está unido operativamente con un promotor constitutivo, como por ejemplo, el promotor 35S (Odell, JT; Nagy, F; Chua, NH. "Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S Promotor". 1985, US5, 352, 605A), un promotor inducible por bajas temperaturas/frío como por ejemplo, BN115 (US5, 847, 102A) o un promotor como por ejemplo, p63 (EP2116606B1), el que es especialmente activo en el desarrollo temprano de plantas o en tejidos jóvenes de plantas, en donde desarrollo temprano significa las primeras 12 semanas después de la
germinación, especialmente las primeras 8 semanas después de la germinación y especialmente las primeras 4 semanas después de la germinación.
En una forma de realización preferida de la presente invención, el casete de expresión comprende un ácido nucleico, que presenta una secuencia de ácidos nucleicos, seleccionada del grupo compuesto por a) una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NOs 29, b) una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos 90% o 95% o preferentemente al menos 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a una secuencia de a) o c), una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO 30, , preferentemente se une operativamente con un promotor, el que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 33. También se describe que el casete de expresión está operativamente unido a una variante alélica o una forma modificada de un promotor que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 34, en donde la variante alélica o la forma modificada que produce una tasa de expresión comparable o una medida de expresión igual que el promotor que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 33. Una variante alélica o una forma modificada del promotor significa un promotor que causa una tasa de expresión o una medida de expresión reducida en más de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40% o 50% en comparación con la tasa de expresión o medida de expresión, producida por el promotor que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 34. Una tasa de expresión o medida de expresión comparable significa que la variante alélica o la forma modificada del promotor que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 34 presenta sustancialmente una tasa de expresión o medida de expresión que se diferencia en no más de 20%, 18%, 16%, 14% o 12%, preferentemente en no más de 10%, 9%, 8%, 7% o 6%, o más preferentemente no más de 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% o 0% de la tasa de expresión o medida de expresión del promotor que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 33.
La presente invención comprende además también un promotor que responde al estrés por bajas temperaturas que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 33 o 34 o una secuencia de nucleótidos complementaria de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 33 o 34 o una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 33 o 34 o a una secuencia de nucleótidos complementaria de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 33 o 34, así como un casete de expresión que comprende el promotor que responde al estrés por bajas temperaturas, un vector que comprende el promotor que responde al estrés por bajas temperaturas o el casete de expresión que comprende el promotor que responde al estrés por bajas temperaturas, una célula huésped o una planta o partes de ésta que comprenden el promotor que responde al estrés por bajas temperaturas como transgén, el casete de expresión que comprende el promotor que responde al estrés por bajas temperaturas, o el vector que comprende el promotor que responde al estrés por bajas temperaturas o el casete de expresión que comprende el promotor que responde al estrés por bajas temperaturas.
En otro aspecto la presente invención se refiere a un vector que comprende el casete de expresión de acuerdo con la invención. El vector puede ser un plásmido, un cósmido, un fago o un vector de expresión, un vector de transformación, un vector shuttle o un vector de clonación, puede ser de hebra simple o doble, lineal o circular o puede transformar un huésped procariota o eucariota ya sea por integración en su genoma o en forma extracromosómica. Además, se describe que el ácido nucleico descrito anteriormente está unido operativamente en un vector con una o más secuencias reguladoras las cuales permiten la transcripción y opcionalmente la expresión en una célula huésped procariota o eucariota. Una secuencia reguladora, preferentemente ADN, puede ser homóloga o heteróloga con respecto al ácido nucleico de acuerdo con la invención. Por ejemplo, el ácido nucleico se encuentra bajo el control de un promotor adecuado o un terminador.
Además de los vectores arriba descritos, la presente invención proporciona también un procedimiento que comprende la introducción de un vector descrito en una célula huésped. El vector puede ser introducido, por ejemplo, por conjugación, movilización, transformación biolística, transformación mediada por Agrobacterium, transfección, transducción, infiltración al vacío o electroporación. Tales procedimientos, igual que los procedimientos para la preparación de los vectores descritos son conocidos por el experto en el arte (Sambrook et al. 2001, "Molecular cloning: a laboratory manual" (conjunto de 3 volúmenes) (Vol. 999). Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).
En otro aspecto la presente invención se refiere a una célula huésped que comprende el ácido nucleico descrito anteriormente, el casete de expresión o el vector. Una célula huésped en el sentido de la invención puede ser una célula procariota (por ejemplo, bacteriana) o una célula eucariota (por ejemplo, una célula vegetal o una célula de levadura). Preferentemente, la célula huésped es un Agrobacterium, tal como Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes o una célula vegetal que comprende el ácido nucleico, el casete de expresión o el vector de la presente invención. El experto en el arte conoce tanto numerosos métodos, tales como conjugación o electroporación, con los cuales pueden introducir el ácido nucleico descrito anteriormente, el casete de expresión o el vector en un Agrobacterium, como también métodos tales como diversos procedimientos de transformación (transformación biolística, transformación mediada por Agrobacterium), con los cuales se puede introducir el ácido nucleico descrito anteriormente, el casete de expresión o el vector en una célula de planta (Sambrook et al. 2001).
En otro aspecto la presente invención se refiere a una célula de planta transgénica de la especie Zea mays, la cual comprende el casete de expresión o el vector de la presente invención, donde el ácido nucleico descrito anteriormente está presente como un transgén, y una planta transgénica de la especie Zea mays, o una parte de ésta, las cuales
comprenden las células de planta transgénica. Una célula de planta transgénica o planta como ésta es, por ejemplo, una célula de planta o una planta de la especie Zea mays, que ha sido transformada con el casete de expresión o con el vector de la presente invención, preferentemente en forma estable. Una planta transgénica o célula de la presente invención presenta preferentemente una tolerancia a las bajas temperaturas recién transmitida o un aumento de la tolerancia a las bajas temperaturas en comparación con una planta de tipo salvaje, la que es isogénica, pero que no fue transformada, sin embargo, con el casete de expresión o con el vector de la presente invención, preferentemente en forma estable.
Una secuencia reguladora, preferentemente ADN, puede ser homóloga o heteróloga con respecto al ácido nucleico anterior. El constructo total del ácido nucleico descrito anteriormente y su o sus secuencias reguladoras pueden representar entonces el transgén en forma del casete de expresión. Una parte de una planta puede ser una semilla fecundada o no fecundada, un embrión, un polen, un tejido, un órgano o una célula de planta, en donde la semilla fecundada o no fecundada, el embrión o el polen son producidos en la planta transgénica y en su genoma está integrado el casete de expresión o el vector está integrado, estando presente el ácido nucleico descrito anteriormente como un transgén. La presente invención comprende también un descendiente de la planta transgénica, en cuyo genoma está integrado el casete de expresión o el vector.
Se presenta una tolerancia a las bajas temperaturas transmitida o una tolerancia a las bajas temperaturas aumentada en comparación con una planta de tipo salvaje, la cual es isogénica, pero que no ha sido transformada con el casete de expresión o con el vector de la presente invención, preferentemente en forma estable.
Una tolerancia a las bajas temperaturas recién transmitida o aumentada puede ser determinada específicamente por especies y experimentalmente. Para ello se realiza un análisis del cuadro foliar, el cual sustancialmente comprende las siguientes etapas de procedimiento: a) dos a cuatro semanas de cultivo exogámico de las plantas bajo condiciones sin estrés con respecto a la temperatura exterior, b) exposición de las plantas a un estrés por bajas temperaturas significativo durante un período de al menos una semana, c) realización de una fase de regeneración de nuevo bajo condiciones sin estrés durante un período de al menos una semana y d) medición de la pérdida del color verde de las hojas en una o más hojas, cuyo crecimiento se produjo durante el período de aplicación del estrés por bajas temperaturas. Como ejemplo se describe a continuación esto para el maíz (Zea mays): Las plantas se cultivan durante dos semanas bajo condiciones óptimas (sin estrés) en el invernadero a 25 °C (temperatura de día) y 22 °C (temperatura de noche). A continuación durante una semana se las coloca en una cámara acondicionada con 8 °C y 6 °C. Luego sigue una fase de regeneración de una semana en el invernadero a 25 °C y 22 °C. A continuación se examinó preferentemente la 4° y 5° hoja con respecto a su color. Para ello se da un valor de 100% para la conservación completa del color verde de la hoja y un valor de 0% para una coloración amarillenta completa (Clorosis). En el marco de la presente invención se pudo demostrar así que la variante TH era superior a la variante SL con respecto a la conservación de la clorofila bajo estrés por bajas temperaturas (véase Tabla 5). En total se midieron valores de 10% a 85% de color verde de la hoja. La pérdida del color verde de las variantes TH era de alrededor de 19% hasta 75% reducido con respecto a las variantes SL, es decir, la tolerancia a las bajas temperaturas había aumentado significativamente. Por lo tanto, el concepto de tolerancia a las bajas temperaturas - sin quedar limitado a éste -significa una reducción de la pérdida del color verde bajo estrés por bajas temperaturas de alrededor de 5%, 10%, 15%, 20%, preferentemente 30%, 40% o 50%, más preferentemente 60%, 70%, 80% o 90% medida con el análisis del cuadro foliar arriba descrito.
Alternativamente, la tolerancia a las bajas temperaturas recién transmitida o aumentada en una planta puede ser medida por la altura de la planta en el momento del comienzo del crecimiento de estiramiento en el sector de brote. Para ello se cultivan plantas tolerantes a las bajas temperaturas y sensibles a las bajas temperaturas bajo condiciones de estrés por bajas temperaturas en pruebas comparativas. En el marco de la presente invención se pudo demostrar así que, por ejemplo, la variante TH del maíz tienen una longitud aproximadamente 35% mayor, la que considerada en forma absoluta representó aproximadamente 21 cm adicionales en comparación con la variante Sl sensible. Por lo tanto, el concepto tolerancia a las bajas temperaturas también puede significar que una planta con tolerancia a las bajas temperaturas recién transmitida o aumentada presenta una altura de la planta al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% o 35% aumentada en comparación con una planta control en el momento del comienzo del crecimiento de estiramiento.
Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para la producción de una planta tolerante a las bajas temperaturas. Un procedimiento de este tipo comprende las siguientes etapas: A) mutagenización de células de plantas o de partes de una planta y regeneración subsiguiente de plantas a partir de las células de plantas mutagenizadas o partes mutagenizadas o mutagenización de plantas, y B) identificación de una planta de A), la que en una secuencia de ADN endógena, la que es idéntica a una secuencia de ácidos nucleicos, seleccionada del grupo compuesto por (i) una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NO: 27, (ii) una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de la secuencia de i), (iii) una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos 80%, 85%, 90% o 95% o preferentemente al menos 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a una secuencia de (i) o (ii), (iv) una secuencia de ácidos nucleicos, la que de acuerdo con el código genético degenerado, se deriva de una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con (i), (ii) o (iii), (v) una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con (i), (ii) o (iii) bajo condiciones rigurosas, o (vi) una secuencia de ácidos nucleicos, que codifica para una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO: 28, o un homólogo, análogo u ortólogo de éstas, o en una secuencia reguladora de la secuencia de ADN endógena, presenta al menos una mutación que causa una
modificación de la expresión de transcripción o de la tasa de expresión o de la medida de transcripción o la medida de expresión de la secuencia de ADN endógena en la planta identificada en comparación con una planta de tipo salvaje no mutagenizada o una modificación de la actividad o estabilidad de una proteína o polipéptido codificada por la secuencia de ADN endógena en la planta identificada en comparación con una planta de tipo salvaje no mutagenizada. Preferentemente la al menos una mutación hace que la planta identificada se torne tolerante a las bajas temperaturas o que aumente la tolerancia a las bajas temperaturas ya existente.
Preferentemente, la secuencia de ADN endógena de la etapa B) codifica para una proteína que responde a auxina o una proteína SAUR, más preferentemente para la proteína SAUR31 de acuerdo con una de las SEQ ID NOs: 28 o 30 o un homólogo, análogo u ortólogo de éstas. Preferentemente, la secuencia reguladora de la secuencia de ADN endógena de la etapa B) es un promotor o una parte de éste. Más preferentemente, el promotor es un promotor de acuerdo con la SEQ ID NO: 34 o un promotor que presenta una identidad de al menos 80%, 85% o 90%, preferentemente de al menos 92%, 94%, 96%o 98% o más preferentemente de al menos 98,5%, 99%, 99,5% o 99,8% con el promotor de acuerdo con la SEQ ID NO: 34. Un ejemplo de una forma mutada potencial de una secuencia reguladora de una secuencia de ADN endógena es el promotor de acuerdo con la SEQ ID NO: 33.
Una mutación significa una modificación a nivel del ADN, es decir, una modificación de la genética y/o de la epigenética. Por ejemplo, una modificación de la genética puede ser el intercambio de al menos una nucleobase en la secuencia de ADN endógena o en una secuencia reguladora de la secuencia de ADN endógena. Si se produce un intercambio de nucleobases de este tipo, por ejemplo, en un promotor, esto puede llevar a una actividad modificada del promotor, ya que, por ejemplo, elementos cis-reguladores son modificados de tal modo que la afinidad de un factor de transcripción con respecto a los elementos cis-reguladores mutados está modificada en comparación con el promotor de tipo salvaje de tal modo que la actividad del promotor con los elementos cis-reguladores mutados está aumentada o disminuida, según si el factor de transcripción es un represor o un inductor o si la afinidad del factor de transcripción con respecto a los elementos cis-reguladores mutados está reforzada o debilitada. Si se produce un intercambio de nucleobases de este tipo, por ejemplo, en una región codificadora de la secuencia de ADN endógena, esto puede llevar a un intercambio de aminoácidos en la proteína codificada, lo que puede causar una modificación de la actividad o estabilidad de la proteína en comparación con la proteína de tipo salvaje. Otro ejemplo de una modificación de la genética es la deleción de nucleótidos en la secuencia reguladora y/o en la secuencia de ADN endógena así como la adición de nucleótidos en la secuencia reguladora y/o en la secuencia de ADN endógena. Un ejemplo de la regulación de genes por inserción de nucleótidos por mutagénesis de transposón en el maíz muestran Das & Martienssen (Das, Lekha, and Robert Martienssen. "Site-selected transposon mutagenesis at the hcf106 locus in maize". The Plant Cell 7.3 (1995): 287-294.). Una modificación de la epigenética puede producirse, por ejemplo, por un modelo de metilación modificado del ADN.
El experto en el arte conoce que se puede lograr una mutación en el sentido de la invención por medio del proceso de una mutagenización en la etapa A) del procedimiento para la producción de una planta tolerante a las bajas temperaturas. La mutagenización comprende aquí tanto la mutagénesis convencional como también la mutagénesis específica de un sitio, y la edición del genoma ('Genome Editing1). En la mutagénesis convencional no se realiza la modificación a nivel de ADN en forma direccionada. La célula de planta o la planta se expone a condiciones mutagénicas, tales como por ejemplo, TILLING por radiación con luz UV o el uso de sustancias químicas (Till, Bradley J., et al. "Discovery of induced point mutations in maize genes by TILLING". BMC Plant Biology 4.1 (2004): 12.). Otro método de la mutagénesis al azar es la mutagénesis con ayuda de un transposón. Se encuentra a disposición libremente una amplia colección de mutantes a través del proyecto UniformMU. La colección y el método se describen en McCarty et al. (McCarty, Donald R., et al. "Steady-state transposon mutagenesis in inbred maize". The Plant Journal 44.1 (2005): 52-61.). La mutagénesis específica de un sitio hace posible la introducción de una modificación a nivel del ADN direccionada a sitios predefinidos del ADN. Para ello se pueden usar, por ejemplo, TALENS (WO 2010/079430, WO 2011/072246), meganucleasas (Silva, George, et al. "Meganucleases and other tools for targeted genome engineering: perspectives and challenges for gene therapy". Current gene therapy 11.1 (2011): 11.), endonucleasas de Homing (Stoddard, Barry L. "Homing endonucleases: from microbial genetic invaders to reagents for targeted DNA modification". Structure 19.1 (2011): 7-15.), nucleasas de dedo de zinc (Lloyd, Alan, et al. "Targeted mutagenesis using zinc-finger nucleases in Arabidopsis". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102.6 (2005): 2232-2237) o un sistema CRISPR/Cas (Gaj, Thomas, Charles A. Gersbach, and Carlos F. Barbas. "ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering". Trends in biotechnology 31.7 (2013): 397-405). Preferentemente se realiza la mutación en todas las copias o alelos o en donde sea conveniente en todos los homólogos de las secuencias de ADN endógenas correspondientes. Esto significa, con respecto a un organismo diploide, como por ejemplo, Zea mays, típicamente al menos dos alteraciones.
La identificación de una planta en la etapa B) se puede realizar, por ejemplo, con ayuda de marcadores moleculares o sondas. Las sondas de ADN son, por ejemplo, cebadores o pares de cebadores que se pueden usar en una reacción de PCR. Por ejemplo, mutantes de Tilling pueden ser determinados o identificados por secuenciación del gen objetivo en una población de Tilling o por otros métodos que determinan malos apareamientos en el ADN, como por ejemplo, análisis de puntos de fusión o el uso de nucleasas específicas de malos apareamientos. La presente invención comprende para ello también los cebadores/pares de cebadores que se pueden utilizar, como por ejemplo, cebadores para la determinación de SAUR31 o una forma mutante del promotor de SAUR31. Además, las mutantes que son producidas por medio de transposones pueden ser determinadas por medio del uso de cebadores específicos del transposón y cebadores específicos del gen objetivo en la PCR a través de toda la población y la secuenciación
subsiguiente de productos de PCR. También estos cebadores están comprendidos en la presente invención. La modificación de la tasa de expresión o medida de expresión se puede determinar, por ejemplo, con RT-PCR en tejidos vegetales, la modificación de la estabilidad, por ejemplo, por examen de los sitios de unión de ubiquitina y predicción de las modificaciones de la estructura terciaria. Además, también son adecuadas la expresión recombinante de las proteínas de tipo salvaje y de las proteínas mutadas correspondientes y tests de actividad bioquímicos siguientes. El experto en el arte conoce del estado de la técnica otros medios y procedimientos que puede usar para la identificación de una planta o célula de planta en la etapa B).
La presente invención se refiere también a marcadores moleculares que demuestran la presencia o ausencia de una mutación en la secuencia de ADN endógena o en una secuencia reguladora de la secuencia de ADN endógena. Tales marcadores se basan, por ejemplo, en un SNP y son específicos para la mutación (Ejemplos: marcadores KASPar o TaqMan).
La presente invención se refiere además también a una planta que se puede producir o que ha sido producida con el procedimiento precedente, o una parte de esta planta, en donde una parte de una planta puede ser una semilla fecundada o no fecundada, un embrión, un polen, un tejido, un órgano o una célula vegetal, en donde la semilla fecundada o no fecundada, el embrión o el polen son producidos en la planta transgénica y en cuyo genoma se encuentra presente en la al menos una mutación. La presente invención comprende también un descendiente de la planta, el cual presenta la al menos una mutación y es tolerante a las bajas temperaturas.
La presente invención se refiere también a un procedimiento para el aislamiento de un ácido nucleico, el que transmite o aumenta en una planta o célula de planta la tolerancia a las bajas temperaturas, que comprende las siguientes etapas:
A) Producción de una planta de acuerdo con el procedimiento descrito más arriba o provisión de una planta o una célula de una planta, que se puede producir o ha sido producida con el procedimiento descrito más arriba, y B) aislamiento de un ácido nucleico que comprende la secuencia de ADN endógena con la al menos una mutación del genoma de la planta o la célula de planta de A). El aislamiento del ácido nucleico en la etapa B) puede realizarse por extracción CTAb o a través de columnas que ligan el ADN, la comprobación de la mutación a través de secuenciación o marcadores moleculares, como marcadores KASPar basados en SNP o TaqMan, o en mutantes por inserción o deleción a través de marcadores en base a polimorfismos de longitud.
La presente invención comprende también un ácido nucleico, el cual fue obtenido mediante el procedimiento descrito más arriba para el aislamiento o que se puede obtener mediante el procedimiento descrito más arriba, así como un casete de expresión o un vector, que comprende el ácido nucleico aislado.
Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para la producción de una planta transgénica, tolerante a las bajas temperaturas de las especie Zea mays. El procedimiento puede comprender las siguientes etapas: A) Provisión del ácido nucleico o del casete de expresión descritos más arriba, o provisión del vector arriba descrito, B) transformación, preferentemente transformación en forma estable, de al menos una célula de planta de la especie Zea mays mediante la introducción del casete de expresión o del vector de A), C) regeneración de plantas transgénicas a partir de la al menos una célula de planta transformada de B), y D) identificación de una planta transgénica, tolerante a las bajas temperaturas de la especie Zea mays de C). Complementariamente también se pueden usar como transgén, aparte de los ácidos nucleicos descritos anteriormente, también uno o más de otros ácidos nucleicos, los que se conoce que se pueden usar para la transmisión o el aumento de la tolerancia a las bajas temperaturas (por ejemplo, WO2002/048378A2, WO2008/148298A1).
La presente invención se refiere además también a una planta transgénica, tolerante a las bajas temperaturas, la que se puede producir o que ha sido producida con el procedimiento mencionado, o una parte de esta planta, en donde una parte de una planta puede ser una semilla fecundada o no fecundada, un embrión, un polen, un tejido, un órgano o una célula vegetal, en donde la semilla fecundada o no fecundada, el embrión o el polen son producidos en la planta transgénica y en cuyo genoma está integrado el casete de expresión o el vector, en el que el ácido nucleico descrito anteriormente está presente como un transgén. La presente invención comprende también un descendiente de la planta transgénica, el cual es tolerante a las bajas temperaturas.
En otro aspecto la presente invención se describe un procedimiento para la transmisión o el aumento de la tolerancia a las bajas temperaturas en una célula de planta o una planta. Un procedimiento de este tipo puede comprender las siguientes etapas: A) transformación, preferentemente transformación estable, preferentemente de al menos una célula de planta mediante la introducción del ácido nucleico de acuerdo con la invención arriba descrito o el casete de expresión de la presente invención, o del vector de la presente invención arriba descrito, opcionalmente B) regeneración de plantas transgénicas a partir de la al menos una célula de planta transformada de A).
El procedimiento para la producción de la planta transgénica, tolerante a las bajas temperaturas comprende también la transformación de dos o más de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, arriba descritos, opcionalmente también diferentes formas de realización de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención y opcionalmente de uno o más casetes de expresión o vectores de la presente invención. En una forma de realización preferida del procedimiento la transformación en la etapa A) lleva a una célula de planta o planta, la que en comparación con una
célula de planta de tipo salvaje, que es, por ejemplo, una célula de planta isogénica, no transformada, o con una planta, la que, por ejemplo, fue regenerada a partir de una célula de planta isogénica, no transformada, presenta preferentemente un modelo de expresión modificado, caracterizada porque en base al silenciamiento de genes posttranscripcional, se ha reducido la tasa de expresión o medida de expresión de una secuencia de ADN endógena con una secuencia de ácidos nucleicos, seleccionada del grupo compuesto por (i) una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NO: 27, (ii) una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de i), (iii) una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos 80%, 85%, 90% o 95% o preferentemente al menos 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a una secuencia de (i) o (ii), (iv) una secuencia de ácidos nucleicos, la que de acuerdo con el código genético degenerado, se deriva de una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con (i), (ii) o (iii), (v) una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con (i), (ii) o (iii) bajo condiciones rigurosas, o (vi) una secuencia de ácidos nucleicos, que codifica para una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO: 28, o un homólogo, análogo u ortólogo de éstas.
Además a un aspecto alternativo al uso del ácido nucleico descrito anteriormente, del casete de expresión o del vector de la presente invención en un procedimiento para la producción de una célula de planta o planta transgénica, tolerante a las bajas temperaturas o en un procedimiento para la transmisión o el aumento de la tolerancia a las bajas temperaturas en una célula de planta o planta.
En otro aspecto la presente invención se refiere a un medio para la aplicación exterior en plantas. Este medio se provee para la aplicación exterior en plantas. Contiene ARN de doble hebra, en donde una hebra de este ARN presenta una secuencia de ácidos nucleicos, la que concuerda en al menos 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, preferentemente al menos 30, 32, 34, 36, 38 o 40, más preferentemente al menos 50, 60, 70, 80, 90 o 100, o más preferentemente aún en al menos 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750 o 1000 nucleótidos consecutivos con una de las secuencias de ácidos nucleicos seleccionada del grupo compuesto por (i) una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NO: 27, (ii) una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de i), (iii) una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos 80%, 85%, 90% o 95% o preferentemente al menos 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a una secuencia de (i) o (ii), (iv) una secuencia de ácidos nucleicos, la que de acuerdo con el código genético degenerado, se deriva de una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con (i), (ii) o (iii), (v) una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con (i), (ii) o (iii) bajo condiciones rigurosas, (vi) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO: 28, o un homólogo, análogo u ortólogo de éstas, o vii) una secuencia de ácidos nucleicos en orientación antisentido con respecto a una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con (i) a (vi). El ARN de doble hebra para la producción del medio de acuerdo con la invención puede ser producido in vitro mediante métodos conocidos por el experto en el arte. Por ejemplo, la síntesis del ARN de doble hebra se puede realizar sintéticamente, en donde el ARN es formado directamente in vitro. El ARN de doble hebra también puede ser sintetizado partiendo de un ADN de doble hebra a través de la formación de un transcripto de mARN, el cual forma luego, por ejemplo, una estructura de horquilla.
El medio se puede usar como mezcla en una cubierta de semillas o en el desarrollo temprano por medio del rociado en forma de un spray. Además, el medio puede ser usado mediante el mezclado con el sustrato de cultivo antes o después de la emergencia de las plantas. En cada caso, el medio es adecuado para transmitir tolerancia a las bajas temperaturas o para aumentar la tolerancia a las bajas temperaturas en una célula de la semilla o planta, o en la semilla o la planta propiamente dichas. En el uso para el tratamiento previo de las semillas, el medio puede ser combinado primero con una sustancia vehículo y en una combinación, que comprende el ARN de doble hebra y la sustancia vehículo, y aplicado sobre las semillas, en donde la sustancia vehículo, por ejemplo, tiene la acción estabilizadora del ARN. Como estabilizadores del ARN se pueden usar, por ejemplo, liposomas, los cuales encapsulan la molécula de ARN.
Además, también se describe un procedimiento para la transmisión o el aumento de la tolerancia a las bajas temperaturas en una célula de planta o una planta, que comprende la etapa de la aplicación exterior del medio. Preferentemente, el medio se mezcla con la cubierta de las semillas o la película de las semillas o es rociado directamente sobre las semillas o la planta. También se describe el uso del medio para la transmisión o el aumento de la tolerancia a las bajas temperaturas en una célula de planta o una planta.
En un aspecto adicional, se describe una planta de maíz tolerante a las bajas temperaturas o una parte de ésta que comprende un primer intervalo cromosómico de un dador en el cromosoma 4 entre las posiciones de los marcadores ma59778s31 y ma59778119, el que presenta un ácido nucleico que transmite una tolerancia a las bajas temperaturas, preferentemente un ácido nucleico endógeno que transmite la tolerancia a las bajas temperaturas, y en una región del cromosoma 4 flanqueada por las posiciones de los marcadores ma59778119 y ma20205s01 presenta al menos otro intervalo cromosómico del mismo dador que el primer intervalo cromosómico y al menos un intervalo cromosómico que no proviene del dador, en donde el ácido nucleico que transmite la tolerancia a las bajas temperaturas comprende una o más secuencias de ácidos nucleicos, seleccionadas del grupo compuesto por a) una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NO 29, b) una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos 98%, 99% o 99,5% idéntica a una secuencia de a) o b), c) una secuencia de ácidos nucleicos, la que de acuerdo con el código genético degenerado, se deriva de una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con a), d) una secuencia de ácidos nucleicos, que codifica para una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO 30 o un homólogo, análogo u ortólogo de éstas. En un ejemplo de realización preferido, el intervalo cromosómico en el cromosoma 4, que presenta un ácido nucleico que transmite una tolerancia a las bajas temperaturas, comprende un intervalo entre las posiciones de los marcadores
ma59778s32 y ma59778119 y/o el ácido nucleico que transmite la tolerancia a las bajas temperaturas comprende una secuencia de ácidos nucleicos, seleccionada del grupo compuesto por a) una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con las SEQ ID NOs 29, b) una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos 98%, 99% o 99,5% idéntica a una secuencia de a), c) una secuencia de ácidos nucleicos, la que de acuerdo con el código genético degenerado, se deriva de una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con a), o d) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una proteína de acuerdo con una de las SEQ ID NO 30 o un homólogo, análogo u ortólogo de éstas, preferentemente la secuencia de ácidos nucleicos está unida operativamente con un promotor, el cual comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 33, o con una variante alélica o una forma modificada de un promotor, el cual comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 34, en donde la variante alélica o la forma modificada comprende una tasa de expresión o medida de expresión comparable como el promotor, que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 33. Una variante alélica o una forma modificada del promotor significa un promotor que causa una tasa de expresión o medida de expresión reducida en más de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40% o 50% en comparación con la tasa de expresión o la medida de expresión, producida por el promotor, que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 34. Una tasa de expresión o medida de expresión comparable significa que la variante alélica o la forma modificada del promotor, que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 34, sustancialmente presenta una tasa de expresión o medida de expresión que no se aparte más de 20%, 18%, 16%, 14% o 12%, preferentemente no más de 10%, 9%, 8%, 7% o 6%, o más preferentemente no más de 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% o 0% de la tasa de expresión o medida de expresión del promotor que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 33.
Además, la presencia del al menos un intervalo cromosómico, que no proviene del dador, en la región del cromosoma 4 flanqueada por las posiciones de marcadores ma59778119 y ma20205s01, significa que, por ejemplo, en base a uno o más eventos de recombinación en el proceso de cruzamiento con una planta de maíz, que no es portadora de los intervalos dadores, se reemplazó un intervalo dador correspondiente o intervalos dadores correspondientes por el al menos un intervalo cromosómico, que no proviene del dador. Expresado de otro modo, el intervalo cromosómico proveniente originalmente del dador flanqueado por las posiciones de los marcadores ma59778119 y ma20205s01 está acortado por alelos dadores o se encuentra en forma truncada.
Alternativamente, la biotecnología moderna pone a disposición del experto en el arte diversas otras herramientas que hacen posible una ingeniería genética precisa del genoma: las propuestas de técnica genética con las cuales se pueden reemplazar los tramos dadores en forma direccionada por tramos no dadores y así se puede reducir o eliminar un barrido selectivo (,selective sweep’) en un genoma de planta, comprenden el uso de nucleasas TALE (TALENs) o nucleasas de dedo de zinc (ZFNs) así como sistemas CRISPR/Cas, los que se describen, entre otros, por ejemplo, en la solicitud de patente alemana DE 102013 014637 para la eliminación de secuencias de nucleótidos que llevan el arrastre por ligamiento ("Linkage Drag") del genoma de maíz (híbrido) tolerante a1 Helminthosporium turcicum; ver la DE 102013014637 en las págiinas 13 y 14 en los párrafos [0038] a [0042] y las referencias allí mencionadas. Estas técnicas, que también se describen en la solicitud de patente internacional WO 2014/104878, se pueden usar en forma equivalente en la producción de las plantas de acuerdo con la presente invención.
La presente descripción comprende además también una combinación de la técnica de cultivo convencional y de la moderna biotecnología. Así, por ejemplo, con ayuda de estas nuevas propuestas novedosas de la edición del genoma se pueden crear puntos calientes ("Hot spots") de recombinación en una planta, los que se realizan en sitios adecuados, para favorecer directamente el intercambio de tramos dadores en la región del cromosoma 4 flanqueada por las posiciones de los marcadores ma59778119 y ma20205s01 por tramos no dadores. La presente invención pone a disposición del experto en el arte para ello las informaciones necesarias sobre localización de los barridos selectivos ('selective sweeps'), así como la posición del o de los ácidos nucleicos que transmiten la tolerancia a las bajas temperaturas.
En un ejemplo, la planta presenta en la región del cromosoma 4 flanqueada por las posiciones de los marcadores ma59778119 y ma20205s01 al menos otro intervalo cromosómico del mismo dador y al menos un intervalo cromosómico, que no proviene del dador, en donde el al menos otro intervalo cromosómico del mismo dador representa menos de 90%, menos de 80%, menos de 70%, preferentemente menos de 60%, menos de 50%, menos de 40%, o más preferentemente menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 5%, menos de2% o menos de 1% de la región del cromosoma 4 flanqueada por las posiciones de los marcadores ma59778119 y ma20205s01, o en donde el al menos un intervalo cromosómico, que no proviene del dador, representa más de 5%, más de 10%, más de 20%, más de 30%, preferentemente más de 40%, más de 50%, más de 60%, o más preferentemente más de 70%, más de 80%, más de 90%, más de 95%, más de 98% o más de 99% de la región del cromosoma 4 flanqueada por las posiciones de los marcadores ma59778119 y ma20205s01.
En otro ejemplo, la planta en la región del cromosoma 4 flanqueada por las posiciones de los marcadores ma59778119 y ma20205s01 presenta al menos otro intervalo cromosómico del mismo dador y al menos un intervalo cromosómico, que no proviene del dador, en donde el al menos otro intervalo cromosómico del mismo dador representa menos de 100 Mb, menos de 90Mb, menos de 80Mb, preferentemente menos de 70 Mb, menos de 60 Mb, menos de 50 Mb, o más preferentemente menos de 40 Mb, menos de 30 Mb, menos de 20 Mb, menos de 15 Mb, menos de 10 Mb o menos de 5 Mb de la región del cromosoma 4 flanqueada por las posiciones de los marcadores ma59778119 y ma20205s01, o en donde el al menos un intervalo cromosómico, que no proviene del dador, representa más de 5 Mb,
más de 10 Mb, más de 15 Mb, más de 20 Mb, preferentemente más de 30 Mb, más de 40 Mb, más de 50 Mb, o más preferentemente más de 60 Mb, más de 70 Mb, más de 80 Mb, más de 90 Mb o más de 100 Mb de la región del cromosoma 4 flanqueada por las posiciones de los marcadores ma59778119 y ma20205s01.
Ppor ejemplo, la planta presenta en la región del cromosoma 4 flanqueada por las posiciones de los marcadores ma59778119 y ma20205s01 un intervalo cromosómico del mismo dador de las posiciones de los marcadores ma59778119 a ma52594s01 y un intervalo cromosómico, que no proviene del dador, de ma52594s01 a ma20205s01.
Además, la región en el cromosoma 4 flanqueada por las posiciones de los marcadores ma59778119 y ma20205s01 está caracterizada o bien alternativamente o adicionalmente porque presenta, al menos en partes, una mayor frecuencia de alelos.
El intervalo cromosómico entre las posiciones de los marcadores ma59778s31 y ma59778119 y el intervalo cromosómico entre las posiciones de los marcadores ma59778119 y ma20205s01 se encuentran localizados en el cromosoma 4 en el genoma del maíz. El intervalo cromosómico entre las posiciones de los marcadores ma59778119 y ma20205s01 puede contener el centrómero del cromosoma 4.
En un ejemplo, el intervalo cromosómico que presenta un ácido nucleico que transmite una tolerancia a las bajas temperaturas, es un intervalo cromosómico entre las posiciones de los marcadores ma59778s32 y ma59778119. En otro ejemplo de realización preferido, el intervalo cromosómico entre las posiciones de los marcadores ma59778s31 y ma59778119 comprende un intervalo cromosómico flanqueado por las posiciones de los marcadores ma59778s32 y ma59778119
El intervalo cromosómico entre las posiciones de los marcadores ma59778s31 y ma59778119 así como también el ácido nucleico que transmite la tolerancia a las bajas temperaturas allí contenido provienen de una línea de maíz del pool de Dent o es característico para el pool de Dent, es decir, el experto en el arte puede identificar el tramo cromosómico claramente como proveniente del pool de dent, por ejemplo, con ayuda de marcadores moleculares.
Una selección en genes con fuertes efectos o intervalos cromosómicos que contienen un gen con fuerte efecto, como por ejemplo, en el intervalo del genoma de acuerdo con la invención o el QTL que tramite la tolerancia a las bajas temperaturas (especialmente el gen SAUR31 identificado) lleva a una modificación de las frecuencias de alelos. Dependiendo del grado de recombinación y de la intensidad de selección, esta modificación de la frecuencia de los alelos no sólo afecta el sector adyacente al gen o al intervalo, sino también las regiones cromosómicas adyacentes. Esto puede llevar a una diversidad genética limitada, la que es denominada barrido selectivo ("selective sweep"). Para un experto en el arte en el campo del cultivo de plantas, este barrido selectivo ("Selective Sweep") es extraordinariamente desventajoso, ya que el material de planta producido ya no puede desarrollar su potencial originalmente presente en los cultivos posteriores. El empobrecimiento genético hace que termine en nada la propuesta clásica del cultivo de nueva recombinación y selección. Esto se puede ver claramente en la Fig. 5. La Figura muestra una diversidad genética claramente reducida en el pool de genes de Dent en comparación con el pool de genes de Flint en el sector del QTL que transmite la tolerancia a las bajas temperaturas, que comprende, por ejemplo, el gen SAUR31. Todos los ORFs que se encuentran aquí del QTL y los genes correspondientes provienen del pool de genes de Dent. El cruzamiento no controlado del QTL que transmite la tolerancia a las bajas temperaturas en otra base genética (por ejemplo el pool de Flint) llevaría también en ese pool a un retroceso drástico de las frecuencias de alelos. En el marco de la invención se tornó evidente que el cruzamiento del intervalo cromosómico de acuerdo con la invención entre las posiciones de los marcadores ma59778s31 y ma59778119, que presenta un ácido nucleico que transmite una tolerancia a las bajas temperaturas, sin las medidas adecuadas para contrarrestarla en cada caso llevaría a una clara disminución de la frecuencia de alelos en el cromosoma 4. La transmisión del QTL identificado o del ácido nucleico que trasmite la tolerancia a las bajas temperaturas identificado, sin una reducción de la diversidad del material de cultivo representaba un enorme desafío y pudo ser realizada finalmente por un mapeo fino de la región con el apoyo de marcadores, muy complicado. En este contexto también era necesaria la identificación de los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs; sucesión de los SNPs = haplotipo) en el intervalo cromosómico y los sectores adyacentes. Mediante la identificación de los haplotipos TH provistos de una mayor tolerancia a las bajas temperaturas y el desarrollo de nuevos marcadores fue posible sorprendentemente de acuerdo con la invención, por medio de marcadores moleculares recién desarrollados, para una selección ayudada por los marcadores, cruzar el intervalo cormosómico correspondiente de acuerdo con la invención, arriba descrito, con el ácido nucleico que transmite la tolerancia a las bajas temperaturas dentro de un intervalo fuertemente limitado. Las plantas producidas de este modo mostraron una mayor tolerancia a las bajas temperaturas y al mismo tiempo una amplia diversidad genética mantenida. De líneas de cultivo conocidas, como por ejemplo, la B73, no se pudo derivar una solución para el problema del barrido selectivo debido a la diferente estructura de la región.
Una frecuencia de alelos aumentada “al menos en partes” significa, por ejemplo, que la región del cromosoma 4 flanqueada por las posiciones de los marcadores ma59778119 y ma20205s01 en una región de al menos 5 Megabases (Mb), al menos 10 Mb, al menos 15 Mb, al menos 20 Mb o al menos 25 Mb, preferentemente al menos 30 Mb, al menos 40 Mb, al menos 50 Mb o al menos 60 Mb, o más preferentemente al menos 70 Mb, al menos 80 Mb, al menos 90 Mb o al menos 100 Mb, presenta una mayor frecuencia de alelos. Además, una mayor frecuencia de alelos "al menos en partes” puede significar que la región del cromosoma 4 flanqueada por las posiciones de los marcadores ma59778119 y ma20205s01 en una región de al menos 1 Mb, al menos 2 Mb, al menos 3 Mb, al menos 4 Mb o al
menos 5 Mb, preferentemente al menos 10 Mb, al menos 15 Mb, al menos 20 Mb o al menos 25 Mb, o más preferentemente al menos 30 Mb, al menos 35 Mb, al menos 40 Mb o al menos 50 Mb, presenta a ambos lados del centrómero, preferentemente del cromosoma 4, una mayor frecuencia de alelos.
Una "mayor frecuencia de alelos” significa, por ejemplo, una diferencia con respecto a la frecuencia de alelos de 0,5, de no más de 0,4, 0,375 o 0,35, preferentemente no más de 0,325, 0,3 o 0,275, o más preferentemente no más de 0,25. Además, una "mayor frecuencia de alelos” puede significar también que la frecuencia de alelos es no menor que 0,1, 0,125 o 0,15, preferentemente no menor que 0,175, 0,2 o 0,225, o más preferentemente no menor que 0,25. Además, una "mayor frecuencia de alelos” puede significar que al menos 10%, 15% o 20%, preferentemente 25%, 30% o 40% o más preferentemente 45% o 50% de un tramo cromosómico provienen del pool de Flint. Por el contrario, una "menor frecuencia de alelos” significa una diferencia con respecto a la frecuencia de alelos de 0,5, de más de 0,4 o 0,425. Además, una "menor frecuencia de alelos” también puede significar que la frecuencia de alelos es menor que 0,1 o 0,075. Además, una "menor frecuencia de alelos” también puede significar que menos de 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10% de un tramo cromosómico provienen del pool de Flint. Con relación a la presente invención, una "mayor frecuencia de alelos” también puede significar que el intervalo cromosómico, que tiene que presentar la mayor frecuencia de alelos, preferentemente proximal o distal al ácido nucleico que transmite la tolerancia a las bajas temperaturas, está truncado o acortado, por ejemplo, en al menos 5 megabases (Mb), al menos 10 Mb, al menos 15 Mb, al menos 20 Mb o al menos 25 Mb, preferentemente al menos 30 Mb, al menos 40 Mb, al menos 50 Mb o al menos 60 Mb, o más preferentemente al menos 70 Mb, al menos 80 Mb, al menos 90 Mb o al menos 100 Mb.
En otro aspecto la presente invención comprende marcadores moleculares que son adecuados, en un intervalo cromosómico flanqueado por las posiciones de los marcadores ma59778s31 y ma20205s01 o por las posiciones de los marcadores ma59778s31 y ma52594s01 o por las posiciones de los marcadores ma59778s31 y ma59778119, diferenciar entre un haplotipo tolerante a las bajas temperaturas y uno sensible a las bajas temperaturas. Preferentemente, el haplotipo tolerante a las bajas temperaturas de la línea TH se corresponde con un haplotipo de acuerdo con la Tabla 2, y/o el haplotipo sensible a las bajas temperaturas de la línea SL se corresponde con un haplotipo de acuerdo con la Tabla 2. Un marcador molecular de la presente solicitud puede ser, por ejemplo, un marcador molecular que es adecuado, para diferenciar en una de las posiciones de los marcadores ma59778s31, ma59778s32, ma59778119, ma52594s01y ma20205s01 entre un haplotipo tolerante a las bajas temperaturas y uno sensible a las bajas temperaturas. Un marcador molecular puede ser un oligonucleótido, especialmente un cebador oligonucleótido, o puede encontrarse en forma aislada. En una forma de realización especialmente preferida, el marcador molecular de la presente solicitud es adecuado, sólo o en combinación con otros marcadores moleculares para determinar el ácido nucleico que transmite la tolerancia a las bajas temperaturas. La presente solicitud describe aemás el uso de al menos uno de los marcadores moleculares de la presente invención para la identificación o selección de una planta de maíz, o de una parte de ésta, tolerante a las bajas temperaturas.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz tolerante al frío, que comprende un intervalo cromosómico de un donante en el cromosoma 4 entre las posiciones del marcador ma59778s31 y ma59778119, que tiene un ácido nucleico mediador de tolerancia al frío, preferiblemente un ácido nucleico endógeno que media la tolerancia al frío, en el que el donante tiene una "T" en la posición del marcador ma59778s31, una "T" en la posición del marcador ma59778s32 y una "C" en la posición del marcador ma59778119 y el ácido nucleico que media la tolerancia al frío comprende un secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en a) una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 29, b) una secuencia de ácido nucleico que es al menos 98% idéntica a la secuencia de a), c) una secuencia de ácido nucleico que deriva de la secuencia de ácido nucleico según a) según el código genético degenerado, y d) una secuencia de ácido nucleico que para una proteína según SEQ ID NO: 30 codificado, que comprende las etapas de A) aislamiento de ADN del genoma de una planta de maíz, y B) detección de un alelo de un marcador diagnóstico para el ácido nucleico mediador de tolerancia al enfriamiento en un intervalo cromosómico flanqueado por las posiciones de marcador ma59778s31 y ma59778119 en el cromosoma 4, el alelo del ácido nucleico mediador de tolerancia al frío o está estrechamente acoplado al locus del ácido nucleico mediador de tolerancia al frío, el locus acoplado para la expresión del rasgo fenotípico de la altura de una planta aumentó en al menos un 10% en comparación con una planta de control de un genotipo comparable que no está en su genoma y que contiene ácido nucleico que media la tolerancia al frío, contribuye en condiciones de estrés por frío y en el momento del inicio del crecimiento de elongación en el área de los brotes, las posiciones del marcador con referencia a la línea de maíz B73 AGPv2 son las siguientes: ma59778s31 = 37263172 pb, ma59778s32 = 37296672 pb y ma59778119 = 37297901 pb. El procedimiento se puede ampliar opcionalmente mediante una etapa C) Detección de al menos un intervalo cromosómico que no proviene del donante, o de una frecuencia de alelos al menos parcialmente aumentada en un intervalo cromosómico flanqueado por las posiciones de marcador ma59778119 y ma20205s01 o por las posiciones de marcador ma59778119 y ma52594s01. En otra realización particularmente preferida, los marcadores moleculares descritos anteriormente se utilizan para la detección en la etapa B).
En un aspecto adicional, se describe un procedimiento para la selección de una planta de maíz, o una parte de ésta, tolerante a las bajas temperaturas, de acuerdo con la invención, arriba descrita, que comprende el procedimiento arriba descrito para la identificación de una planta de maíz, o una parte de ésta, tolerante a las bajas temperaturas, de acuerdo con la invención, arriba descrita, es ampliado con una etapa adicional de la etapa de la selección de la planta de maíz o una parte de ésta tolerante a las bajas temperaturas en base a las determinaciones de la etapa B) y opcionalmente de la etapa C).
Además se describe un procedimiento para la producción de una planta de maíz descrito anteriormente, que comprende una primera etapa de cruzamiento de dos plantas de maíz, en donde una planta de maíz que es tolerante a las bajas temperaturas comprende un primer intervalo cromosómico entre las posiciones de los marcadores ma59778s31 y ma59778119, que presenta un ácido nucleico que transmite la tolerancia a las bajas temperaturas y otro intervalo cromosómico flanqueado por las posiciones de los marcadores ma59778119 y ma20205s01, el cual proviene al menos en parte del mismo dador que el primer intervalo cromosómico, y/o presenta al menos en parte una menor frecuencia de alelos, y como segunda etapa, el procedimiento arriba descrito para la selección de una planta de maíz tolerante a las bajas temperaturas de acuerdo con la invención, proveniente de los descendientes del cruzamiento de la primera etapa. Preferentemente, el ácido nucleico que transmite la tolerancia a las bajas temperaturas comprende una o más secuencias de ácidos nucleicos, seleccionadas del grupo compuesto por a) una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NO 29, b) una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos 98%, 99% o 99,5% idéntica a una secuencia de a) o b), c) una secuencia de ácidos nucleicos, que de acuerdo con el código genético degenerado, se deriva de una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con a), d) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO 30 o un homólogo, análogo u ortólogo de éstas. En un ejemplo de realización preferido, el intervalo cromosómico que se encuentra en el cromosoma 4, el cual presenta un ácido nucleico que transmite una tolerancia a las bajas temperaturas, es un intervalo entre las posiciones de los marcadores ma59778s32 y ma59778119 y/o el ácido nucleico que transmite la tolerancia a las bajas temperaturas comprende una secuencia de ácidos nucleicos, seleccionada del grupo compuesto por a) una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NO 29, b) una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos 98%, 99% o 99,5% idéntica a una secuencia de a), c) una secuencia de ácidos nucleicos, que de acuerdo con el código genético degenerado, se deriva de una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con a), o d) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO 30 o un homólogo, análogo u ortólogo de éstas, preferentemente la secuencia de ácidos nucleicos está unida operativamente con un promotor que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 33, o con una variante alélica o una forma modificada de un promotor, que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 34, en donde la variante alélica o la forma modificada produce una tasa de expresión o medida de expresión comparable como el promotor que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 33. Una variante alélica o una forma modificada del promotor significa un promotor, que tiene una tasa de expresión o medida de expresión reducida en más de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40% o 50% en comparación con la tasa de expresión o medida de expresión, producida por el promotor, que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 34. Una tasa de expresión o medida de expresión comparable significa que la variante alélica o la forma modificada del promotor, que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 34, sustancialmente presenta una tasa de expresión o medida de expresión, que se desvía no más de 20%, 18%, 16%, 14% o 12%, preferentemente no más de 10%, 9%, 8%, 7% o 6%, o más preferentemente no más de 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% o 0% de la tasa de expresión o medida de expresión del promotor que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 33.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un procedimiento para el aumento del rendimiento de plantas o plantas de maíz, que comprende el cultivo de plantas transgénicas de acuerdo con la invención, tolerantes a las bajas temperaturas, plantas mutadas tolerantes a las bajas temperaturas o plantas de maíz de acuerdo con la invención, tolerantes a las bajas temperaturas, así como la cosecha de un mayor rendimiento. Las plantas que crecen disponen de una mayor tolerancia a las bajas temperaturas, las cuales en latitudes moderadas les permite, durante una fase de estrés por bajas temperaturas, crecer más rápido que una planta de genotipo comparable, que no contienen en su genoma un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Esto lleva a que en el momento de la cosecha las plantas transgénicas tolerantes a las bajas temperaturas de acuerdo con la invención, las plantas mutadas tolerantes a las bajas temperaturas o las plantas de maíz tolerantes a las bajas temperaturas de acuerdo con la invención den un mayor rendimiento.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento para la reducción del uso de herbicidas en el cultivo de plantas o plantas de maíz, especialmente durante el desarrollo temprano de las plantas o plantas de maíz, que comprende el cultivo de plantas transgénicas tolerantes a las bajas temperaturas de acuerdo con la invención, plantas mutadas tolerantes a las bajas temperaturas o plantas de maíz tolerantes a las bajas temperaturas, de acuerdo con la invención. Las plantas que crecen disponen de una mayor tolerancia a las bajas temperaturas, la que en las latitudes moderadas les permite durante una fase de estrés por bajas temperaturas crecer más rápido que una planta de genotipo comparable que no contiene en su genoma un ácido nucleico de acuerdo con la invención. De este modo, las plantas son competitivas con respecto a malezas/ vegetación extraña que crece. Preferentemente las plantas cultivadas disponen adicionalmente de una resistencia a los herbicidas.
Algunos de los términos usados en esta solicitud se explicarán más detalladamente a continuación:
Bajo "hibridar” o "hibridación” se entiende un procedimiento con el cual una molécula de ácido nucleico de una sola hebra se une con una hebra de ácido nucleico más complementaria, es decir, se produce un apareamiento de bases. Procedimientos estándar para la hibridación se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. 2001. Preferentemente se entiende bajo este término que al menos 60%, más preferentemente al menos 65%, 70%, 75%, 80% o 85%, más preferentemente aún 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las bases de la molécula de ácido nucleico forma un apareamiento de bases con la hebra de ácido nucleico más complementaria. La posibilidad de una unión de este tipo depende de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. El término "rigurosidad” se refiere a
las condiciones de hibridación. Alta rigurosidad es aquella en la que se dificulta un apareamiento de bases, baja rigurosidad es aquella en la que se facilita un apareamiento de bases. La rigurosidad de las condiciones de hibridación depende, por ejemplo, de la concentración de sales o la concentración de iones y la temperatura. En general, la rigurosidad puede aumentarse por medio de un aumento de la temperatura y/o una disminución del contenido de sales. Bajo "condiciones de hibridación rigurosas” se entienden aquellas condiciones bajo las cuales se produce una hibridación principalmente sólo entre moléculas de ácidos nucleicos homólogas. El término "condiciones de hibridación” se refiere para ello no sólo a las condiciones imperantes durante la unión de los ácidos nucleicos propiamente dicha, sino también a las condiciones imperantes durante las etapas de lavado subsiguientes. Las condiciones de hibridación rigurosas son, por ejemplo, condiciones bajo las cuales principalmente sólo se hibridan aquellas moléculas de ácidos nucleicos, que presentan una identidad de secuencia de al menos 70%, preferentemente al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95%. Condiciones de hibridación rigurosas son, por ejemplo: hibridación en 4 x SSC a 65 °C y a continuación múltiples lavados en 0,1 x SSC a 65 °C durante aproximadamente 1 hora en total. El término aquí usado "condiciones de hibridación rigurosas" también puede significar: hibridación a 68 °C en 0,25 M fosfato de sodio, pH 7,2, 7 % SDS, 1 mM EDTA y 1 % BSA durante 16 horas y a continuación lavado dos veces con 2 x SSC y 0,1 % s Ds a 68 °C. Preferentemente se realiza una hibridación bajo condiciones rigurosas.
En el sentido de la invención, se entiende bajo un "homólogo” una proteína de igual origen filogenético, bajo un "análogo” una proteína que tiene la misma función, pero tiene otro origen filogenético, y bajo un "ortólogo” se entiende una proteína de otra especie que tiene la misma función.
Una "planta" en el sentido de la invención es una planta de la especie Zea mays.
"Unido operativamente" significa unido en una molécula común de ácido nucleico, de una manera que los elementos unidos están posicionados y orientados entre sí de tal modo que se puede realizar una transcripción de la molécula de ácido nucleico. Un ADN que está unido operativamente con un promotor, se encuentra bajo el control transcripcional de este promotor.
Por "órganos" de la planta se entienden, por ejemplo, hojas, eje del tallo, tallo, raíces, brotes vegetativos, meristemas, embriones, anteras, óvulos o frutos. Por "partes" de la planta se entiende un conjunto de varios órganos, por ejemplo, una flor o una semilla, o una parte de un órgano, por ejemplo, una sección del eje del tallo. "Tejidos" de la planta, son, por ejemplo, tejidos del callo, tejidos de almacenamiento, tejidos meristemáticos, tejidos de las hojas, tejidos de los brotes, tejidos de las raíces, tejido tumoral de la planta o tejido reproductivo. Bajo "células" de la planta se entienden, por ejemplo, células aisladas con una pared celular o agregados de éstas o protoplastos.
Un "fragmento funcional” de una secuencia de nucleótidos significa un tramo de una secuencia de nucleótidos, el cual presenta una funcionalidad idéntica o comparable con la secuencia total de nucleótidos, de la cual proviene el fragmento funcional. Como tal, el fragmento funcional puede poseer una secuencia de nucleótidos que es idéntica en una longitud de al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94% 96%, 97%, 98% o 99% u homóloga con la secuencia de nucleótidos total. Además, un "fragmento funcional” de una secuencia de nucleótidos también puede significar un tramo de una secuencia de nucleótidos, el cual modifica la funcionalidad de la secuencia de nucleótidos total, por ejemplo, en el curso de un silenciamiento de genes posttranscripcional o transcripcional. Como tal, el fragmento funcional de una secuencia de nucleótidos puede comprender al menos 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, preferentemente al menos 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120 o 140, más preferentemente al menos 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos total.
El término "heterólogo" significa que el polinucleótido introducido proviene, por ejemplo, de una célula o un organismo con otra base genética de la misma especie o de otra especie, o es homólogo con respecto a la célula huésped procariota o eucariota, luego, sin embargo es localizado en un ambiente genético diferente y así se diferencia de un polinucleótido correspondiente eventualmente naturalmente existente. Un polinucleótido heterólogo puede estar presente adicionalmente a un gen endógeno correspondiente.
En el contexto de la presente invención, el término "secuencia reguladora" se refiere a una secuencia de nucleótidos, que influye sobre la especificidad y/o la fuerza de la expresión, por ejemplo, en cuanto la secuencia reguladora transmite una determinada especificidad del tejido. Una secuencia reguladora como ésta puede estar localizada corriente arriba del punto de iniciación de la transcripción de un promotor mínimo, pero también corriente debajo de éste, como por ejemplo, en una secuencia líder transcripta pero no traducida o dentro de un intrón.
El término "intervalo cromosómico” significa un tramo lineal continuo en un ADN genómico, el cual se encuentra en un cromosoma individual en la planta o en un fragmento del cromosoma. Si el intervalo cromosómico es definido por la indicación de dos posiciones de los marcadores que lo flanquean, éstos representan los puntos extremos del intervalo hacia los lados distal y proximal. Para ello las posiciones de los marcadores, que definen el intervalo en los extremos también pueden ser parte del intervalo. En la descripción también se especifica un intervalo con la indicación "entre la posición del marcador A y la posición del marcador B”. Entonces el intervalo cromosómico representa un tramo de ADN lineal continuo, el cual está localizado entre las posiciones especificadas de los marcadores. Las posiciones de
los marcadores no son los puntos extremos del intervalo hacia los lados distal y proximal. Las posiciones de los marcadores especificadas no son parte del intervalo.
El término “alelo” se refiere a una de dos o más secuencias de nucleótidos en un locus determinado en el genoma. Un primer alelo se encuentra en un cromosoma, un segundo en un segundo cromosoma en la misma posición. Si los dos alelos son diferentes, son heterocigotas, si son los mismos alelos son homocigotas. Diversos alelos de un gen (alelos de gen) se diferencian en al menos un SNP. Según el contexto de la descripción, un alelo puede significar también un solo SNP, el que, por ejemplo, permite una diferenciación entre dos haplotipos. Una planta de maíz es una planta de la especie Zea mays así como sus subespecies, como por ejemplo, Zea mays ssp. mays, Zea mays ssp. mexicana o Zea mays ssp. parviglumis.
Un "marcador" o "marcador molecular” es una secuencia de nucleótidos que se usa como punto de referencia u orientación. Un marcador para reconocer un evento de recombinación debería ser adecuado para controlar diferencias o polimorfismos dentro de una población de plantas. Para los marcadores estas diferencias se encuentran a nivel del a Dn y son, por ejemplo, diferencias de secuencias de polinucleótidos, como por ejemplo, SSRs (simple sequence repeats), RFLPs (restriction fragment length polymorphisms), FLPs (fragment length polymorphisms) o SNPs (single nucleotide polymorphisms). Los marcadores pueden ser derivados de ácidos nucleicos genómicos o expresados, como por ejemplo, ARN empalmado, cADN o ESTs y también se pueden referir a ácidos nucleicos, los que se usan como sondas o pares de cebadores y como tales son adecuados para amplificar un fragmento de secuencia usando un procedimiento basado en PCR. Los marcadores, que se refieren a polimorfismos genéticos entre partes de una población, pueden ser determinados por medio de procedimientos conocidos del estado de la técnica ("An Introduction to Genetic Analysis". 7a Edición, Griffiths, Miller, Suzuki et al., 2000). Estos comprenden, por ejemplo: secuenciación de ADN, amplificación específica de secuencias basada en PCR, determinación de RFLPs, determinación de polimorfismos de polinucleótidos por medio de hibridación específica de alelos (ASH), detección de SSRs, SNPs o AFLPs. Además también se conocen los procedimientos para la detección de ESTs (expressed sequence tags) y RAPD (randomly amplified polymorphic DNA). Según el contexto, el término marcadores en la descripción también puede significar una posición específica del cromosoma en el genoma de una especie, en donde se puede hallar un marcador específico (por ejemplo, SNP). Una posición de marcador como ésta puede ser aprovechada para controlar la presencia de un locus acoplado, por ejemplo, un locus acoplado que aporta para la expresión de una determinada característica fenotípica. Por ejemplo, el locus del marcador también puede ser usado para controlar la segregación de alelos en un locus (QTL o gen individual), que están acoplados estrechamente genéticamente o físicamente con la posición del marcador.
La presente invención se explicará a continuación en los ejemplos haciendo referencia a las figuras, pero sin quedar limitada por éstas. En las figuras se muestra:
Figura 1: La sucesión esquemática de genes candidatos en el sector entre las posiciones de los marcadores ma59778s31 y ma59778119 en comparación entre SL, TH y B73 AGPv02. Marco de línea continua: gen anotado; marco de línea de puntos: información del mapeo soportado por los marcadores; sectores en los cuales existe un polimorfismo genético entre la línea SL y la t H, son ORF-SL-01/ORF-TH-01, ORF-SL-02/ORF-TH-02, Región-SL-13a/Región-TH-13a, Región-SL-13b/Región-TH-13b, ORF-SL-05, ORF-SL-06, Región-SL-11/ORF-TH-11, ORF-SL-12/Región-TH-12, Región-SL-06/Región-TH-06, ORF-SL-09/ORF-TH-09 y Región-SL-07/Región-TH-07; las puntas de las flechas muestran en la dirección 5'-3', según sobre qué hebra de ADN se encuentre el gen correspondiente; SL: genotipo sensible a las bajas temperaturas; TH: genotipo tolerante a las bajas temperaturas; B73: línea de maíz cuyo genoma fue secuenciado y que el experto en el arte utiliza para el cultivo de maíz como genoma de referencia. Con ayuda de los datos de B73 es posible indicar aparte de la posición del gen candidato soportado por los marcadores también su posición relativa (relativa con respecto al genoma de referencia B73).
Figura 2: Efectos aditivos de los marcadores (la mitad de la diferencia entre los valores medios de las dos expresiones de los marcadores homocigotas) para las características fenotípicas altura de planta temprana y color verde de la hoja de las plantas recombinantes examinadas después del estrés por bajas temperaturas en experimentos en el campo (izquierda) y en la cámara acondicionada (derecha). La longitud de una barra detrás de la indicación de la posición del marcador representa la magnitud de la influencia de la genética sobre la expresión de dichas características después del estrés por bajas temperaturas. De acuerdo con esto, las posiciones de los marcadores ma59778s32, ma59778116 y m a59778ll9 deciden en gran parte si una planta es tolerante a las bajas temperaturas. Los valores de medición y los cálculos de la Figura 2 pueden ser obtenidos de la Tabla 5.
La Figura 3 muestra en el sector superior (A) la representación esquemática del cromosoma No. 4 de Zea mays con aproximadamente 225 Megabases en total. La posición del centrómero y cuatro posiciones importantes de los marcadores se indican con nombres. En el sector inferior (B) hay un recorte alrededor de los marcadores Zm4-5, en el cual se encuentra también el gen SAUR31, representado en forma ampliada. Se trata de un mapeo fino, el cual por medio de tres posiciones de los marcadores reproduce con exactitud la posición de SAUR31. SAUR31 es flanqueado por los dos marcadores ma59778s32 y ma59778119.
La Figura 4 muestra los valores medios de la características altura de crecimiento de la planta de plantas con la mutación en el sector 5'UTR delante del gen SAUR31 en comparación con el medio de la línea de salida no mutagenizada. Se representan dos puntos de tiempo de medición diferentes (dos estadios diferentes del desarrollo de
la planta): La medición representada a la izquierda se realizó 50 días después de la siembra y la segunda medición representada a la derecha se realizó 27 días después de la primera medición representada a la izquierda. La emergencia en el campo se produjo bajo condiciones de primavera de baja temperatura y las dos mediciones se realizaron antes de la floración del maíz. Los datos verifican la importancia de SAUR31 en la expresión fenotípica de la característica de tolerancia a bajas temperaturas.
La Figura 5 muestra la medida de la diversidad genética en base a la frecuencia de alelos en el pool de genes de Dent (línea inferior) y en el pool de genes de Flint (línea superior) en el cromosoma 4. Hay una diversidad genética máxima a una frecuencia de alelos de 0,5. Los valores 0,0 y 1,0 representan Extrama, los que indican la fijación completa de una base genética determinada sin cualquier variabilidad. Como se puede observar de la figura, se encuentra en el pool de genes de Dent una clara fijación genética en comparación con el pool de genes de Flint, especialmente en el límite con el sector del QTL que transmite la tolerancia a bajas temperaturas, que contiene el gen SAUR31.
La Figura 6 muestra la expresión relativa del gen SAUR31 en líneas sensibles a bajas temperaturas y tolerantes a bajas temperaturas. Las plantas se cultivaron durante dos semanas a temperaturas de 22 °C/25 °C y a continuación fueron expuestas a un estrés por bajas temperaturas de 6 °C/8 °C durante 24 hs. Al comienzo del tratamiento con bajas temperaturas (0 h) así como también después de 4 hs y 24 hs se usaron las partes que estaban sobre la tierra de ocho plantas para el aislamiento del ARN. El ARN se examinó con ayuda del RT-PCR. Los ensayos se realizaron dos veces y ambos eventos se representan como dos barras adyacentes. Todos los valores fueron estandarizados al valor SL 0 h, el que se definió como 1.
SEQ ID NOs: 1 a 35 muestran:
SEQ ID NO: 1 marco de lectura abierto ORF-SL-01 de la línea SL
SEQ ID NO: 2 la proteína codificada por la SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 3 marco de lectura abierto ORF-TH-01 de la línea TH
SEQ ID NO: 4 la proteína codificada por la SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 5 marco de lectura abierto ORF-SL-02 de la línea SL
SEQ ID NO: 6 la proteína codificada por la SEQ ID NO: 5
SEQ ID NO: 7 marco de lectura abierto ORF-TH-02 de la línea TH
SEQ ID NO: 8 la proteína codificada por la SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 9 marco de lectura abierto ORF-SL-03 de la línea SL
SEQ ID NO: 10 la proteína codificada por la SEQ ID NO: 9
SEQ ID NO: 11 marco de lectura abierto ORF-TH-03 de la línea TH
SEQ ID NO: 12 la proteína codificada por la SEQ ID NO: 11
SEQ ID NO: 13 marco de lectura abierto ORF-SL-04 de la línea SL
SEQ ID NO: 14 la proteína codificada por la SEQ ID NO: 13
SEQ ID NO: 15 marco de lectura abierto ORF-TH-04 de la línea TH
SEQ ID NO: 16 la proteína codificada por la SEQ ID NO: 15
SEQ ID NO: 17 marco de lectura abierto ORF-SL-05 de la línea SL
SEQ ID NO: 18 la proteína codificada por la SEQ ID NO: 17
SEQ ID NO: 19 marco de lectura abierto ORF-SL-06 de la línea SL
SEQ ID NO: 20 la proteína codificada por la SEQ ID NO: 19
SEQ ID NO: 21 marco de lectura abierto ORF-SL-12 de la línea SL
SEQ ID NO: 22 la proteína codificada por la SEQ ID NO: 21
SEQ ID NO 23 marco de lectura abierto ORF-SL-08 de la línea SL
SEQ ID NO: 24 la proteína codificada por la SEQ ID NO: 23
SEQ ID NO: 25 marco de lectura abierto ORF-TH-08 de la línea TH, que es idéntico al ORF-SL-08 de la línea SL
SEQ ID NO: 26 la proteína codificada por la SEQ ID NO: 25
SEQ ID NO: 27 marco de lectura abierto ORF-SL-09 de la línea SL, el cual corresponde al gen SAUR 31.
SEQ ID NO: 28 la proteína codificada por la SEQ ID NO: 27
SEQ ID NO: 29 marco de lectura abierto ORF-TH-09 de la línea TH, el cual corresponde al gen SAUR 31, en donde el gen se encuentra en una variación alélica, la que sustancialmente participa en la expresión de la tolerancia a bajas temperaturas.
SEQ ID NO: 30 la proteína codificada por la SEQ ID NO: 29
SEQ ID NO: 31 marco de lectura abierto ORF-B73-09 de la línea de referencia B73 del genoma del maíz, el cual corresponde al gen SAUR 31.
SEQ ID NO: 32 la proteína codificada por la SEQ ID NO: 31
SEQ ID NO: 33 Región promotora del gen SAUR31 que corresponde a la variación alélica ORF-TH-09, en donde la región promotora se encuentra en una variación alélica, la que participa sustancialmente en la expresión de la tolerancia a bajas temperaturas.
SEQ ID NO: 34 Región promotora del gen SAUR31 que corresponde a la variación alélica ORF-SL-09
SEQ ID NO: 35 marco de lectura abierto ORF-TH-11 de la línea TH
SEQ ID NO: 36 Cebador
SEQ ID NO: 37 Cebador
SEQ ID NO: 38 Versión mutada de SAUR31 con intercambio de bases de adenina contra una guanina en la posición -25 (con relación al inicio de la traducción), se representa la hebra codogénica en la dirección 5' a 3'
Ejemplos:
Se realizó un estudio de mapeo de QTL en una población de mapeo bi-parental de las líneas SL y TH producidas por endogamia. La línea endogámica SL es sensible con respecto a las bajas temperaturas durante el desarrollo temprano de las plantas en el campo, mientras que la TH es la línea parental tolerante.
Los experimentos de campo se realizaron con 720 líneas DH (haploides dobles) en 8 sitios (Presterl et al., 2007). Las 720 líneas DH fueron genotipadas con 188 SSR marcadores más allá del genoma. Se realizó un fenotipado del desarrollo de las plantas en un estadio temprano (seis a ocho hojas completamente desarrolladas) y el rendimiento total de material de planta fresco y el número de plantas fue determinado como medida de la tolerancia a bajas temperaturas en el campo.
El mapeo de QTL fue calculado al nivel de la línea per se y cruzamientos de prueba. Como resultado se pudieron determinar 7 regiones QTL en 6 cromosomas, en donde el QTL más fuerte se determinó en el cromosoma 4 en un intervalo 4 cM con 33,7% de la variancia del fenotipo declarada. En el primer mapeo de QTL sólo 3 SSR marcadores cubrían la región del genoma (Presterl et al. 2007). En el mapa físico de B73 AGPv01 esta región comprende 155 Mb. El mapeo de QTL fue verificado más tarde en esta población. Se realizaron mapeos adicionales de esta región. Se desarrollaron 23 marcadores para la región QTL y se genotiparon líneas casi isogénicas (NILs = Near Isogenic Lines) para la región QTL grande, y se derivaron otras plantas recombinantes de cruzamientos entre NILs y la SL parental sensible, para desarrollar NILs con segmentos de cromosomas más pequeños. Se pudieron mapear dos marcadores polimorfos flanqueadores de la región QTL a 36,7 Mb (Zm4-5) y 156,4Mb (Zm4-6) en el mapa físico de B73 AGPv01 (véase Figura 3). Los marcadores recién desarrollados pudieron ser mapeados a 37,1 Mb. Los nuevos marcadores estrecharon la región QTL a 119,7 Mb, pero debido a una reducida frecuencia de recombinación en esta región (región pericentrómera) y sin suficientes recursos genómicos no se pudo determinar un intervalo más pequeño (Baliashvili, 2011).
Se estableció un test fenotípico para la determinación de la sensibilidad a bajas temperaturas, en donde las plantas se cultivaron en una cámara de crecimiento durante 14 días (estadio de tres hojas) durante el día a 25 °C y a 22 °C a la noche. Luego se redujo la temperatura a 8 °C en el día y 6 °C en la noche durante una semana. El rendimiento a 25 °C en el día y 22 °C en la noche después del tratamiento con bajas temperaturas dio una lesión clorótica en la cuarta y la quinta hojas, cuando la planta es sensible al tratamiento con bajas temperaturas (línea SL). Las plantas tolerantes permanecen verdes (líneaTH).
Análisis molecular y recursos genómicos: Para enriquecer la región QTL con los nuevos marcadores moleculares, se produjeron nuevos recursos genómicos. Así una propuesta de captura de secuencia con las líneas SL, TH y la línea
NIL TH-N4-32 28 dio nuevos marcadores polimorfos SNP en la comparación entre SL y TH. Se prepararon además las secuencias BAC de dos bibliotecas BAC, las que provenían de una línea que llevaba el alelo SL sensible en el QTL y una línea que llevaba el alelo TH tolerante en el QTL. Se realizó un rastreo de bibliotecas BAC, una secuenciación y una construcción de un andamio. Las bibliotecas BAC fueron rastreadas con los marcadores conocidos de la región QTL en ambas bibliotecas. Tres clones BAC de las bibliotecas SL-BAC y cuatro clones BAC de las bibliotecas de TH-BAC fueron secuenciados con tres diferentes técnicas de la generación siguiente. Para el andamio de SL-BAC pudo componerse un tamaño total de 284 kb y para el andamio de TH-BAC un tamaño total de 356 kb, en donde ambos contienen la región objetivo entre ma59778s31y ma59778119 inclusive las regiones flanqueadoras. La falta de marcadores polimorfos en dirección al centrómero pudo ser confirmada por la comparación de las secuencias BAC de ambas bibliotecas. Detrás de 38729663 bp en el mapa de B73 AGPv02 no se pudo determinar ningún polimorfismo entre las dos líneas. En la posición 37297901 bp pudo establecerse como último marcador funcional ma59778119. Este marcador hace posible la determinación 3' de la región QTL, ya que de la posición 38729663 en adelante no observaron otros polimorfismos entre SL y TH. Sin estos marcadores no hubiera sido posible identificar introgresiones tan pequeñas como 35 kb (de los marcadores ma59778s31 a ma59778119) (véase Figura 3).
Identificación de los genes candidatos: los andamios BAC de ambas bibliotecas BAC fueron anotados. Los genes/regiones candidatos fueron adjudicados cuando concordaban con los resultados del rastreo recombinante, su anotación funcional, los resultados de los análisis de expresión, y si mostraban polimorfismos entre las líneas SL y TH. En total se pudieron anotar nueve marcos de lectura abiertos (ORFs) en el andamio SL-BAC, y siete ORFs se pudieron anotar en el andamio TH-BAC entre ma59778s31 y 7202707. Los ORFs pudieron ser demostrados, en donde la mayoría codificaban para elementos transponibles completos o acortados (Tabla 1a a c). Es conocido que tales elementos, cuando están localizados cerca de genes, pueden influir sobre su expresión (Butelli, Eugenio, et al. "Retrotransposons control fruit-specific, cold-dependent accumulation of anthocyanins in blood oranges". The Plant Cell 24.3 (2012): 1242-1255; Meihls, Lisa N., et al. "Natural variation in maize aphid resistance is associated with 2, 4-dihydroxy-7-methoxy-1, 4-benzoxazin-3-one glucoside methyltransferase activity." The Plant Cell 25.6 (2013): 2341-2355.).
Dos ORFs (ORF-SL-03/ORF-TH-03, ORF-SL-08/ORF-TH-08) anotados no mostraron entre SL y TH ninguna diferencia de secuencias genómicas. Cuatro ORFs (ORF-SL-02/ORF-TH-02, ORF-SL-04/ORF-TH-04, ORF-SL-09/ORF-TH-09, ORF-TH-11/Región-SL-11, ORF-SL-12/Región-TH-12) anotados mostraron polimorfismo o bien de nucleótidos individuales o inserciones/deleciones, un ORF (ORF-SL-01/ORF-TH-01) estaba mapeado sólo parcialmente entre los genotipos. Dos ORFs (ORF-SL-05, ORF-SL-06), que fueron identificados y anotados en la SL, faltan en la TH. Como resultados, todos los ORFs, que son polimorfos, entre los cuales faltan dos genotipos o muestran una expresión diferente, son genes candidatos adecuados para la propiedad observada de tolerancia a bajas temperaturas. De especial interés es ORF-09, el cual fue identificado como SAUR31 en el banco de datos del maíz. Los genes SAUR (small auxin upregulated RNA) reaccionan a auxina.
Validación de genes candidatos: El rastreo de una población de Tilling con el alelo tolerante de TH para la región QTL que transmite tolerancia a bajas temperaturas en el cromosoma 4) se inició para los genes candidatos especialmente Or F -S L-09, ORF-TH-09 (B73: GRMZM2G420812). Dos intercambios de aminoácidos pudieron ser identificados en los mutantes, y dos mutantes presentaban polimorfismos en la región 5' del gen.
La expresión de genes candidatos elegidos fue analizada por qRT-PCR en ambas líneas parentales y en dos NlLs, que se diferenciaban en la tolerancia a bajas temperaturas. Las plantas fueron cultivadas en una cámara de crecimiento bajo las condiciones arriba mencionadas, y se analizó la expresión de los genes candidatos con respecto a tres puntos de tiempo del tratamiento con bajas temperaturas:
1. Antes del tratamiento con bajas temperaturas (t0),
2. Cuatro horas después de comenzar el tratamiento con bajas temperaturas (t4) y
3. 24 horas después de comenzar el tratamiento con bajas temperaturas (t24).
La expresión del gen SAUR31 (ORF-09) era mayor en las líneas sensibles a bajas temperaturas y disminuyó con cada punto de tiempo de medición en forma continua. Dos de los elementos transponibles analizados (ORF-08 y ORF-02) mostraron igualmente una expresión diferente entre las líneas sensibles y tolerantes (Fig. 6). Las Tablas 1a a c resumen los genes candidatos, su anotación, los polimorfismos observados y los eventos del análisis de expresión. Las diferencias de la expresión pueden asumirse como la causa del retardo del crecimiento bajo condiciones de bajas temperaturas.
Desarrollo de una SAUR31-mutante y su análisis en el ensayo de campo: En base a la especial influencia de SAUR 31 sobre la expresión fenotípica de la tolerancia a bajas temperaturas se buscó una validación funcional de este gen. Como propuesta se eligió una mutagénesis EMS no direccionada de polen de maíz (según Neuffer y Coe, 1978; "Paraffin oil technique for treating mature corn pollen with chemical mutagens". Maydica 23: 21-28). Después de la mutagénesis de una línea original (KWS279) se distribuyeron semillas M1 y a continuación se realizó una cosecha de las hojas de las plantas individuales correspondientes. La extracción de ADN subsiguiente de las muestras de hojas
cosechadas permite amplificar por medio de un cebador específico (SEQ ID NOs 36 y 37), un fragmento de ADN del gen SAUR31. Por medio de secuenciación de estos fragmentos de ADN pueden detectarse desviaciones con respecto a la secuencia original del gen SAUR31 y reintroducirlas en la planta individual correspondiente. Por medio de este procedimiento se pudo identificar en forma exitosa una mutante de este tipo que presenta una mutación del gen SAUR31 en la 5'-UTR (región no traducida). Aquí se puede observar en una posición (-25), partiendo del Start ATG, un intercambio de G/C a A/T con respecto a la secuencia original. La secuencia correspondiente se representa como SEQ ID NO: 38. La mutación heterocigota identificada en la generación M1 se fijó por medio de autofecundación de la planta individual correspondiente en la generación M2 siguiente.
En los ensayos de campo en el sitio A se cultivó la mutante en filas con 20 plantas cada una en 5 repeticiones. La línea original no mutagenizada se cultivó en cada caso en la proximidad directa de la mutante, para garantizar la mejor comparación posible. La evaluación estadística de los valores medios de la mutante a la línea original muestra un crecimiento significativamente peor de la mutante bajo condiciones de bajas temperaturas de primavera en comparación con la línea original (Fig. 4). La Fig. 4 muestra los valores medios de la característica de altura de crecimiento de la planta de la mutante con respecto al medio de la línea de partida no mutagenizada en dos puntos de tiempo de medición diferentes (dos estadios diferentes del desarrollo de la planta): La segunda medición representada en la Figura 4 a la derecha se realizó 27 días después de la primera medición representada a la izquierda. La emergencia en el campo se realizó bajo condiciones de bajas temperaturas de primavera.
Desarrollo de NlLs recombinantes: Con ayuda de los nuevos marcadores moleculares se desarrollaron además NlLs recombinantes que provenían de los NlLs TH-N4-8X, TH-N4-56X y TH-N4-32. Se pudieron identificar muy pequeños eventos de recombinación, los que comprenden 34,729 kb en el mapa físico B73AGPv02, 32,731 kb en el andamio SL-BAC y 25,662 kb en el andamio TH-BAC (Los bordes son indicados por los marcadores ma59778s31 a marcadores ma59778119) (Tabla 2). Un panorama de los NlLs, que se usaron en diversas propuestas se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2: Panorama de NlLs y progenitores, como se usaron para las diversas propuestas. Las posiciones de los marcadores con referencia a AGPv2 son: ma11840s01= 31306276 bp; ma59778s31= 37263172 bp; ma59778s32= 37296672 bp; ma59778119= 37297901 bp; ma52594s01= 58033711 bp; ma20205s01= 156.998.152 bp.
Evaluación fenotípica: Las NlLs que contenían el segmento dador en los marcadores ma59778s32, pero contenían el alelo SL en los marcadores ma59778s31, y a la inversa, fueron fenotipadas en el campo y en la cámara de crecimiento.
Las NILs y las líneas parentales fueron evaluadas con respecto al desarrollo de la planta en un estadio temprano en dos sitios A y B en el norte de Alemania, los que son conocidos por las bajas temperaturas de períodos de crecimiento tempranos del maíz. El Experimento 1 se realizó en dos sitios con 27 plantas recombinantes en 20 réplicas, y el Experimento 2 estaba compuesto por 38 plantas recombinantes en 10 réplicas y se evaluó en el sitio A. En los dos experimentos se plantaron NILs en una fila con 20 plantas cada una. El desarrollo de las plantas se midió como la altura de la planta al comienzo de la fase de extensión del tallo.
Tabla 3: Medios de la heredabilidad en función del sitio de ensayo para la altura de la planta temprana para los Experimentos 1y 2
La altura de la planta temprana mostró una heredabilidad muy alta (>97%, Tabla 3). Las dos líneas parentales SL y TH se incluyeron en ambos experimentos y se diferenciaron claramente en la altura de la planta temprana.
La altura de la planta temprana de NILs fue calculada como porcentaje de la SL de los progenitores sensibles (Tabla 3). Los RecNILs con genotipos idénticos en el intervalo cromosómico entre los marcadores ma59778s31 y ma59778119 fueron resumidos como haplotipos (Tabla 4). Los RecNILs, que mostraron el genotipo SL en los marcadores ma59778s32, ma59778119 y ma59778116, tenían claramente una menor altura de planta temprana en comparación con los genotipos TH correspondientes. La variante TH tenía sorprendentemente una longitud de planta aproximadamente 35% aumentada, la que considerada en forma absoluta representaba aproximadamente 21 cm adicionales. Dos NILs con el genotipo SL en los marcadores ma59778s32 y TH en los marcadores ma59778119 y ma59778116 presentaban también una altura de planta temprana similarmente reducida.
Adicionalmente, las NILs fueron fenotipadas en la cámara acondicionada usando el test de fenotipo arriba indicado. Las líneas fueron cultivadas durante dos semanas en el invernadero (25/22 °C) y se transfirieron una semana a la cámara acondicionada a 8/6 °C (condiciones de baja temperatura), después de una semana de recuperación en el invernadero (25/22 °C) se evaluó el color verde de las hojas cuatro y cinco entre 0 (amarillo) y 100 % (verde). Aquí el valor de 100% indica la conservación completa del color de hoja verde y un valor de 0% indica un color amarillo completo (clorosis). Se mostró que la variante TH era superior a la variante SL también en la conservación de la clorofila bajo estrés por baja temperatura. En total se midieron valores de 10 a 85%. La pérdida del color verde de las hojas de las variantes TH era alrededor de 19 hasta 75% reducida con respecto a las variantes SL.
Tabla 4: Panorama en forma de tabla de los haplotipos NIL, representados con un número diferente (N) en NILs individuales y sus resultados de fenotipo para las propiedades de altura de planta temprana (SL = 100%) y color verde de las hojas.
Claims (6)
1. Un casete de expresión que comprende un ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en
a) una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO 29,
b) una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 90% idéntica a una secuencia de a),
c) una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO 30, caracterizada porque, la secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a un promotor que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 33.
2. Vector que comprende el casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Célula de planta transgénica de la especie Zea mays, que comprende el casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 1 o el vector de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el ácido nucleico definido en la reivindicación 1 está presente como transgén.
4. Planta transgénica de la especie Zea mays o una parte de la misma, que comprende la célula de planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 3.
5. Procedimiento para producir una planta transgénica tolerante al frío de la especie Zea mays, que comprende las siguientes etapas:
A) provisión de
i) el casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, o
ii) el vector de acuerdo con la reivindicación 2,
B) transformar al menos una célula de planta de la especie Zea mays introduciendo el casete de expresión o el vector de A),
C) regenerar plantas transgénicas de la especie Zea mays a partir de la al menos una célula de planta transformada de B), y
D) identificar una planta transgénica tolerante al frío de la especie Zea mays de C).
6. Procedimiento para identificar una planta de maíz tolerante al frío, que comprende un intervalo cromosómico de un donante en el cromosoma 4 entre las posiciones de los marcadores ma59778s31 y ma59778119, que tiene un ácido nucleico mediador de tolerancia al frío, preferiblemente un ácido nucleico endógeno mediador de tolerancia al frío, en el que el donante en la posición del marcador ma59778s31 tiene una "T", una "T" en la posición del marcador ma59778s32 y una "C" en la posición del marcador ma59778119 y el ácido nucleico que media la tolerancia al frío comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en
a) una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 29,
b) una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 98% idéntica a la secuencia de a),
c) una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con a) de acuerdo con el código genético generado, y
d) una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO: 30, que comprende las etapas
A) aislamiento de ADN del genoma de una planta de maíz, y
B) detección de un alelo de un marcador diagnóstico para el ácido nucleico mediador de tolerancia al frío en un intervalo cromosómico flanqueado por las posiciones de los marcadores ma59778s31 y ma59778119 en el cromosoma 4, estando el alelo en el ácido nucleico mediador de tolerancia al frío o estrechamente acoplado al locus del ácido nucleico mediador de la tolerancia al frío,
en el que el locus acoplado contribuye a la expresión del rasgo fenotípico de la altura de una planta aumentada en al menos un 10% en comparación con una planta de control de un genotipo comparable que no contiene el ácido nucleico que media la tolerancia al frío en su genoma, bajo condiciones de estrés por frío y en el momento del inicio del crecimiento de estiramiento en el área del brote,
en el que las posiciones del marcador con referencia a la línea de maíz B73 AGPv2 son las siguientes: ma59778s31 = 37263172 bp, ma59778s32 = 37296672 bp y ma59778119 = 37297901 bp.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP15196721.3A EP3173485B1 (de) | 2015-11-27 | 2015-11-27 | Kühletolerante pflanze |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2899176T3 true ES2899176T3 (es) | 2022-03-10 |
Family
ID=54707643
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES15196721T Active ES2899176T3 (es) | 2015-11-27 | 2015-11-27 | Plantas tolerantes a las bajas temperaturas |
| ES16804741T Active ES2927268T3 (es) | 2015-11-27 | 2016-11-26 | Planta resistente al frío |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES16804741T Active ES2927268T3 (es) | 2015-11-27 | 2016-11-26 | Planta resistente al frío |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11345923B2 (es) |
| EP (2) | EP3173485B1 (es) |
| CN (1) | CN109121420B (es) |
| AR (1) | AR107578A1 (es) |
| CA (1) | CA3006589A1 (es) |
| CL (2) | CL2018001415A1 (es) |
| EA (1) | EA038546B1 (es) |
| ES (2) | ES2899176T3 (es) |
| NZ (1) | NZ743235A (es) |
| UA (1) | UA126435C2 (es) |
| WO (1) | WO2017089601A2 (es) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UY38693A (es) * | 2019-05-13 | 2020-12-31 | Kws Saat Se & Co Kgaa | Tolerancia a la sequía en maíz |
| CN112410460B (zh) * | 2020-12-14 | 2022-02-11 | 广东省农业科学院水稻研究所 | 稳定表达的水稻芽期耐冷qtl紧密连锁的分子标记及其应用 |
| CN116262922B (zh) * | 2021-12-14 | 2025-12-19 | 山东农业大学 | 马铃薯生长素响应基因StSAUR30231在抑制鲜切马铃薯酶促褐变中的应用 |
| CN114582426A (zh) * | 2022-01-11 | 2022-06-03 | 黑龙江省农业科学院玉米研究所 | 一种基于mas技术的玉米育种方法 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5352605A (en) | 1983-01-17 | 1994-10-04 | Monsanto Company | Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters |
| CA2146712C (en) | 1995-04-10 | 2002-06-25 | Jas Singh | Cold induced promoter from winter brassica napus |
| DE19852195C2 (de) | 1998-11-04 | 2000-11-02 | Inst Pflanzengenetik & Kultur | Neue Expressionskassette zur Expression von beliebigen Genen in Pflanzensamen |
| CA2321944A1 (en) | 2000-10-27 | 2002-04-27 | Fathey Sarhan | Enhancement of freezing tolerance in transgenic strawberry |
| US7214786B2 (en) * | 2000-12-14 | 2007-05-08 | Kovalic David K | Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement |
| AU2002354531B2 (en) | 2001-07-13 | 2008-02-14 | Sungene Gmbh & Co. Kgaa | Expression cassettes for the transgenic expression of nucleic acids |
| WO2003008596A2 (de) | 2001-07-13 | 2003-01-30 | Sungene Gmbh & Co. Kgaa | Expressionskassetten zur transgenen expression von selektionsmarkern |
| EP2116606B1 (en) | 2003-03-28 | 2012-12-19 | Monsanto Technology, LLC | Novel plant promoters for use in early seed development |
| DE102005021365A1 (de) | 2005-05-04 | 2006-11-09 | Sungene Gmbh & Co. Kgaa | Transgene Expressionskassetten zur Expression von Nukleinsäuren in Blütengeweben von Pflanzen |
| WO2008034648A1 (en) * | 2006-04-05 | 2008-03-27 | Metanomics Gmbh | Process for the production of a fine chemical |
| US20100115670A1 (en) | 2006-11-16 | 2010-05-06 | Ceres, Inc. | Nucleotide sequences and polypeptides encoded thereby useful for modifying plant characteristics in response to cold |
| CN101200724A (zh) | 2007-06-01 | 2008-06-18 | 华中农业大学 | 利用水稻蛋白激酶基因OsCIPK03提高植物耐冷能力 |
| EP2206723A1 (en) | 2009-01-12 | 2010-07-14 | Bonas, Ulla | Modular DNA-binding domains |
| DK2816112T3 (en) | 2009-12-10 | 2018-11-19 | Univ Minnesota | TAL effector-mediated DNA modification |
| EP3491915B1 (en) | 2012-12-27 | 2023-05-31 | Keygene N.V. | Method for inducing a targeted translocation in a plant. |
| US20160010109A1 (en) * | 2013-03-14 | 2016-01-14 | Pioneer Hi Bred International, Inc | Enhanced adaptation of corn |
| DE102013014637A1 (de) | 2013-09-04 | 2015-03-05 | Kws Saat Ag | HELMlNTHOSPORlUM TURClCUM-RESlSTENTE PFLANZE |
-
2015
- 2015-11-27 ES ES15196721T patent/ES2899176T3/es active Active
- 2015-11-27 EP EP15196721.3A patent/EP3173485B1/de active Active
-
2016
- 2016-11-25 AR ARP160103631A patent/AR107578A1/es unknown
- 2016-11-26 WO PCT/EP2016/078920 patent/WO2017089601A2/de not_active Ceased
- 2016-11-26 EA EA201891227A patent/EA038546B1/ru unknown
- 2016-11-26 EP EP16804741.3A patent/EP3380618B1/de active Active
- 2016-11-26 NZ NZ743235A patent/NZ743235A/en unknown
- 2016-11-26 UA UAA201806685A patent/UA126435C2/uk unknown
- 2016-11-26 US US15/779,328 patent/US11345923B2/en active Active
- 2016-11-26 CN CN201680080338.XA patent/CN109121420B/zh active Active
- 2016-11-26 CA CA3006589A patent/CA3006589A1/en active Pending
- 2016-11-26 ES ES16804741T patent/ES2927268T3/es active Active
-
2018
- 2018-05-25 CL CL2018001415A patent/CL2018001415A1/es unknown
-
2020
- 2020-09-25 CL CL2020002479A patent/CL2020002479A1/es unknown
-
2022
- 2022-04-22 US US17/727,068 patent/US20220251592A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ743235A (en) | 2022-07-29 |
| WO2017089601A2 (de) | 2017-06-01 |
| WO2017089601A3 (de) | 2017-07-20 |
| CN109121420B (zh) | 2022-11-22 |
| EP3173485B1 (de) | 2021-08-25 |
| UA126435C2 (uk) | 2022-10-05 |
| EA038546B1 (ru) | 2021-09-13 |
| CN109121420A (zh) | 2019-01-01 |
| EA201891227A1 (ru) | 2018-12-28 |
| CL2020002479A1 (es) | 2021-01-29 |
| AR107578A1 (es) | 2018-05-16 |
| US20180371486A1 (en) | 2018-12-27 |
| US11345923B2 (en) | 2022-05-31 |
| EP3380618A2 (de) | 2018-10-03 |
| CA3006589A1 (en) | 2017-06-01 |
| CL2018001415A1 (es) | 2019-02-22 |
| ES2927268T3 (es) | 2022-11-03 |
| EP3173485A1 (de) | 2017-05-31 |
| US20220251592A1 (en) | 2022-08-11 |
| EP3380618B1 (de) | 2022-08-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2987427T3 (es) | Planta resistente a Helminthosporium turcicum | |
| ES2568896T3 (es) | Evento de maíz MIR604 | |
| ES2590177T3 (es) | Acontecimiento de planta de maíz MON87460 y composiciones y procedimientos para la detección del mismo | |
| Liu et al. | OsPRR37 and Ghd7 are the major genes for general combining ability of DTH, PH and SPP in rice | |
| US20220251592A1 (en) | Cold-tolerant plant | |
| Park et al. | Construction of high-resolution linkage map of the Ms locus, a restorer-of-fertility gene in onion (Allium cepa L.) | |
| EP4118215A2 (en) | Autoflowering markers | |
| BR112018070041A2 (pt) | planta de tabaco e método para fabricação da mesma | |
| US20230054527A1 (en) | Enhanced disease resistance of maize to northern corn leaf blight by a qtl on chromosome 4 | |
| BR112020014242A2 (pt) | Métodos de aumento da eficiência de uso de nutriente | |
| ES2989717T3 (es) | Modulación del vigor de las semillas | |
| BR112019019058A2 (pt) | planta de tabaco e método de produção da mesma | |
| Zhong et al. | MC03g0810, an important candidate gene controlling black seed coat color in bitter gourd (Momordica spp.) | |
| US8212112B2 (en) | Gene participating in low temperature germinability in rice and utilization of the same | |
| CN106701895B (zh) | 与玉米抗旱性相关的单体型及其分子标记 | |
| ES2362903T3 (es) | Procedimiento para producir plantas que presentan una eficacia de transpiración mejorada y plantas producidas a partir del mismo. | |
| ES2902959T5 (en) | Restorer plants | |
| EP4669743A1 (en) | HIGH-PERFORMANCE PLANTS | |
| BR112019019030A2 (pt) | planta de tabaco e método de produção da mesma | |
| AU2020103262A4 (en) | Nucleotide sequence and method for detecting maize plant AN1 | |
| Fang et al. | Discover Life | |
| JP2021191261A (ja) | 放射相称花を有するクサトベラ属（Ｓｃａｅｖｏｌａ）植物 | |
| Zhao | The Mechanism of the Silencing of a Transgene, NCED3-LUC, in Arabidopsis Thaliana | |
| BR112018004300B1 (pt) | Gene quimérico, constructo genético, vetor, uso e método para conferir diplosporia em uma planta | |
| BR122022020300B1 (pt) | Processo para aumentar o rendimento de uma planta de milho resistente a helminthosporium turcicum |