ES2898329T3

ES2898329T3 - Métodos mejorados para supervisar el estado inmunitario de un sujeto

Info

Publication number: ES2898329T3
Application number: ES17738918T
Authority: ES
Inventors: James Richard Berenson
Original assignee: Oncotracker Inc
Current assignee: Oncotracker Inc
Priority date: 2016-01-12
Filing date: 2017-01-12
Publication date: 2022-03-07
Anticipated expiration: 2037-01-12
Also published as: US20190049437A1; DK3402515T3; WO2017123741A1; EP3402515B8; JP2019508714A; CA3010019A1; JP2022058619A; JP7011600B2; EP3402515B1; US11698369B2; EP3402515A4; EP4079320A1; EP3402515A1

Abstract

Un método de supervisión del estado inmunitario de un sujeto, que comprende: (a) detectar una cantidad de polipéptido de BCMA en una muestra biológica que se ha obtenido del sujeto; y (b) comparar la cantidad de polipéptido de BCMA detectado en (a) con un valor límite predeterminado o con una cantidad detectada en una muestra de suero de control, en donde una cantidad disminuida del polipéptido de BCMA en la muestra biológica del sujeto, en comparación con el valor límite predeterminado o con la cantidad en la muestra de suero o plasma de control, es indicativa de un sistema inmunitario deteriorado como resultado de una enfermedad de inmunodeficiencia seleccionada del grupo que consiste en: agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (XLA), deficiencia inmunitaria variable común (CVID), deficiencia de IgG, deficiencia de IgM o síndrome de hiperIgM, en donde la muestra biológica es una muestra de suero o plasma o sobrenadante obtenido de un cultivo de las células mononucleares de médula ósea o de células mononucleares de sangre periférica del sujeto y en donde el polipéptido de BCMA comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 75, un 80 o un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos mejorados para supervisar el estado inmunitario de un sujeto

Antecedentes

Las composiciones y métodos de la invención se refieren, en general, a la detección de biomarcadores para la supervisión del estado inmunitario. En particular, la invención se refiere a composiciones y métodos para la detección del antígeno de maduración de linfocitos B para la supervisión del estado inmunitario de un sujeto.

El sistema inmunitario es un sistema de muchas estructuras y procesos biológicos dentro de un sujeto que protege contra las enfermedades. Para funcionar correctamente, un sistema inmunitario debe detectar una amplia variedad de agentes, conocidos como patógenos, desde virus a lombrices parasitarias y distinguirlos de un tejido sano del propio sujeto. Por lo tanto, el funcionamiento adecuado del sistema inmunitario requiere que todos los componentes del sistema inmunitario funcionen de una forma coordinada para neutralizar patógenos. Un deterioro del sistema inmunitario de un sujeto conduce a infecciones por patógenos oportunistas que finalmente pueden demostrarse como fatales. En cambio, un sistema inmunitario hiperactivo (por ejemplo, en enfermedades autoinmunitarias) provoca que el sistema inmunitario ataque los tejidos normales de un sujeto como si fueran organismos extraños. La eficacia general (es decir, normal, hiperactiva o deteriorada) de un sistema inmunitario de un sujeto, se denomina estado inmunitario del sujeto.

El sistema inmunitario puede clasificarse en subsistemas (inmunidad innata e inmunidad adaptativa). La defensa contra patógenos está mediada por las reacciones tempranas de la inmunidad innata y por las respuestas posteriores de la inmunidad adaptativa. Existen dos tipos de respuestas inmunitarias adaptativas, denominadas inmunidad mediada por linfocitos (mediada por linfocitos B) e inmunidad humoral (mediada por linfocitos B).

Los linfocitos B o células B son un tipo de glóbulos blancos de la sangre del subtipo linfocitos. Funcionan en el componente inmunitario humoral del sistema inmunitario adaptativo mediante la secreción de anticuerpos. Adicionalmente, los linfocitos B presentan antígenos (también se clasifican como células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés) profesionales) y secretan citocinas. En los mamíferos, los linfocitos B maduran en la médula ósea. Los linfocitos B, a diferencia de las otras dos clases de linfocitos, los linfocitos T y los linfocitos citolíticos naturales, expresan receptores de linfocitos B (BCR, por sus siglas en inglés) en su membrana celular. Los BCR permiten al linfocito B unirse a un antígeno específico, contra el que iniciará una respuesta de anticuerpos.

La superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 17 (TNFRSF17, también designado como antígeno de maduración de linfocitos B (BCMA, por sus siglas en inglés) o CD269) es un receptor que se identificó primero en una línea tumoral de linfocitos T (Laabi et al., 1992) y posteriormente se mostró que se expresaba en linfocitos B según maduraban (Laabi et al., 1994). Los ligandos de BCMA incluyen BAFF (factor de activación de linfocitos B; por sus siglas en inglés; TNFSF13B) y APRIL (un ligando inductor de proliferación; por sus siglas en inglés; TNFSF13) (Rennert et al., 2000; Thompson et al., 2000). En líneas celulares de mieloma múltiple (MM), estos ligandos activan las rutas de proliferación celular y regulan positivamente proteínas antiapoptóticas (Moreaux et al., 2004). Ambos ligandos también se unen al receptor TACI (activador transmembrana e interactor de CAML; por sus siglas en inglés; TNFRSF13B) (Gross et al., 2000; Wu et al., 2000; Yu et al., 2000). Adicionalmente, BAFF se une a un tercer receptor, denominado receptor de BAFF (BAFFR; TNFRSF13C), si bien a Pr IL no se une (Thompson et al., 2001; Day et al., 2005). Los ligandos BAFF y APRIL son miembros de la familia de necrosis tumoral (t Nf , por sus siglas en inglés) y la unión de los miembros de TNF a sus receptores puede conducir a apoptosis, diferenciación o proliferación (Smith et al., 1994).

Se ha demostrado que BCMA se sitúa intracelularmente en líneas celulares plasmáticas (Laabi et al., 1992, 1994) y que es esencial para la supervivencia a largo plazo de las células plasmáticas de médula ósea (B. P. O'CONNOR, "BCMA Is Essential for the Survival of Long-lived Bone Marrow Plasma Cells", JOURNAL o F EXPERIMENTAL MEDICINE, (20030101), vol. 199, n.° 1, páginas 91 -98). La expresión en superficie de BCMA se encontró en linfocitos B tonsilares humanos (Thompson et al., 2000) y en células de Mm que expresan CD138 humanas (Novak et al., 2004). Las células malignas del linfoma de Hodgkin y los pacientes de macroglobulinemia de Waldenstrom (WM, por sus siglas en inglés) también expresan esta proteína (Elsawa et al., 2006; Chiu et al., 2007).

Los presentes inventores han demostrado previamente que el BCMA está presente en el suero de pacientes que tienen diversos trastornos malignos, por ejemplo, mieloma múltiple (MM), leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en inglés) y linfomas no Hodgkin de linfocitos B (NHL, por sus siglas en inglés) y que se correlaciona con la respuesta del paciente a la terapia y la supervivencia general. Además, los presentes inventores han descubierto que los niveles de BCMA aumentan en el suero de pacientes de MM, CLL y n Hl , en comparación con los sujetos sanos normales no afectados por estos cánceres. Otros autores también correlacionan BCMA con MM (véanse, por ejemplo, ERIC SANCHEZ ET AL., "Serum B-cell maturation antigen is elevated in multiple myeloma and correlates with disease status and survival", BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY, (20120718), vol. 158, n.° 6 , páginas 727 - 738, documento WO 2014/124280). Los anticuerpos específicos para BCMA se desvelan, por ejemplo, en los documentos WO 2010/ 104949, EP 2762496, WO 2014/068079, US 2014/193433, WO 2015/166073 o US 2014/220014.

Unos estudios adicionales indican que el BCMA se expresa como una proteína receptora de superficie celular en linfocitos B activados que se escinde posteriormente mediante una enzima Y-secretasa, que da como resultado la liberación de la parte extracelular del BCMA como una forma de BCMA soluble (Laurent et al., 2015, Nature Communications, 6:7333-7344).

En la actualidad, no se dispone de una prueba objetiva para determinar el estado inmunitario de un sujeto y la existencia de una enfermedad o infección se determina mediante una observación por un médico de los síntomas físicos del sujeto (por ejemplo, temperatura corporal o molestia física, tal como dolor). Sin embargo, tales observaciones son subjetivas y pueden variar de un médico a otro. Asimismo, en la actualidad tampoco se dispone de una determinación rápida y fiable de una respuesta del sujeto al tratamiento, lo que se vería facilitado en gran medida por una prueba que pudiera supervisar de forma fiable el estado inmunitario de un sujeto en diferentes momentos durante el ciclo de un régimen de tratamiento. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica para diseñar una prueba rápida, reproducible, barata y fiable que pueda indicar el estado inmunitario de un sujeto.

Los presentes inventores han encontrado ahora sorprendentemente que los niveles del polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica (por ejemplo, suero) de un sujeto se correlaciona con el estado inmunitario general de un sujeto. Los presentes inventores han encontrado que una cantidad disminuida de polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica obtenida de un sujeto en comparación con polipéptido de BCMA o un fragmento del mismo en una muestra biológica de control obtenida de un sujeto sano normal, es indicativa de un sistema inmunitario deteriorado como se indica por una reducción en sus niveles de inmunoglobulinas, si bien una cantidad aumentada del polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica obtenida de un sujeto en comparación con las cantidades de polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica obtenida de un sujeto sano normal indica que el sujeto sufre una infección o una enfermedad.

Breve sumario

De conformidad con el fin de la presente invención, según se realiza y se describe ampliamente en el presente documento, esta invención en general proporciona métodos para supervisar de forma fiable y reproducible el estado inmunitario de un sujeto. Los niveles de polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica obtenida de un sujeto puede detectarse y/o medirse y compararse frente a un valor inicial o un control para supervisar de forma fiable y reproducible el estado inmunitario del sujeto.

Se proporciona un método de supervisión del estado inmunitario de un sujeto. El método de supervisión del estado inmunitario de un sujeto, comprende: (a) detectar una cantidad de polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica obtenida del sujeto; y (b) comparar la cantidad de polipéptido de BCMA o de fragmento del mismo detectado en (a) con un valor límite predeterminado o con una cantidad detectada en una muestra de suero de control, en donde una cantidad disminuida del polipéptido de BCMA o fragmento en la muestra biológica del sujeto, en comparación con el valor límite predeterminado o cantidad en la muestra de suero de control es indicativa de un sistema inmunitario deteriorado, en donde la muestra biológica es una muestra de suero o sobrenadante obtenido de un cultivo de las células mononucleares de médula ósea o de células mononucleares de sangre periférica del sujeto.

Otro método de supervisión del estado inmunitario de un sujeto, comprende: (a) detectar una cantidad de polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica obtenida del sujeto; y (b) comparar la cantidad de polipéptido de BCMA o de fragmento del mismo detectado en (a) con un valor límite predeterminado o con una cantidad detectada en una muestra de suero de control, en donde una cantidad aumentada del polipéptido de BCMA o fragmento en la muestra biológica del sujeto, en comparación con el valor límite predeterminado o cantidad en la muestra biológica de control, indica que el sujeto sufre o está en mayor riesgo de desarrollar una infección o una enfermedad relacionada con una deficiencia inmunitaria, en donde la muestra biológica es una muestra de suero o plasma o sobrenadante obtenido de un cultivo de las células mononucleares de médula ósea o de células mononucleares de sangre periférica del sujeto.

Un método adicional de supervisión del estado inmunitario de un sujeto, comprende: (a) detectar una cantidad de polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica obtenida del sujeto; y (b) comparar la cantidad de polipéptido de BCMA o de fragmento del mismo detectado en (a) con un valor límite predeterminado o con una cantidad detectada en una muestra de suero o plasma de control, en donde una cantidad disminuida del polipéptido de BCMA o fragmento en la muestra biológica del sujeto, en comparación con el valor límite predeterminado o cantidad en la muestra de suero o plasma de control es indicativa de un sistema inmunitario deteriorado y una cantidad aumentada del polipéptido de BCMA o fragmento en la muestra biológica del sujeto, en comparación con el valor límite predeterminado o cantidad en la muestra de suero o plasma de control indica que el sujeto sufre o está en mayor riesgo de desarrollar una infección o un trastorno relacionado con una deficiencia inmunitaria, en donde la muestra biológica es una muestra de suero o plasma o sobrenadante obtenido de un cultivo de las células mononucleares de médula ósea o de células mononucleares de sangre periférica del sujeto.

Se proporciona un método de supervisión de la respuesta a un tratamiento de un sujeto. El método de supervisión de la respuesta a un tratamiento de un sujeto comprende: (a) detectar una cantidad de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica, obtenida del sujeto en un momento anterior al inicio del tratamiento; (b) detectar una cantidad de BCMA o de un fragmento del mismo en la muestra biológica, obtenida del sujeto en un momento posterior al inicio del tratamiento; y (c) comparar la cantidad del polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo detectado en (a) con la cantidad de polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo detectado en (b), en donde una cantidad disminuida del polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo detectado en (b) en comparación con la cantidad de polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo detectado en (a) indica que el sujeto está respondiendo al tratamiento y en donde una cantidad aumentada o sin cambios del polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo detectado en (b) en comparación con la cantidad del polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo detectada en (a) indica que el sujeto no está respondiendo al tratamiento, en donde la muestra biológica es una muestra de suero o plasma o sobrenadante obtenido de un cultivo de las células mononucleares de médula ósea o de células mononucleares de sangre periférica del sujeto.

La muestra biológica incluye, sin limitación, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, fluido biológico y muestras de tejido. En determinadas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de suero. En otras realizaciones, la muestra biológica es un sobrenadante obtenido de un cultivo de las células mononucleares de médula ósea del sujeto. En incluso otras realizaciones, la muestra biológica es un sobrenadante obtenido de un cultivo de las células mononucleares de sangre periférica del sujeto.

En algunas realizaciones, el fragmento de BCMA es un polipéptido de BCMA escindido. En algunas realizaciones, el polipéptido de BCMA escindido es una forma soluble del polipéptido de BCMA. En determinadas realizaciones, el polipéptido de BCMA o un fragmento del mismo, comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1:

MetLeuGlnMetAlaGlyGlnCysSerGlnAsnGluTyrPheAspSerLeu LeuHisAlaCysIleProCysGlnLeuArgCysSerSerAsnThrProProLeu ThrCysGlnArgTyrCysAsnAlaSerValThrAsnSerValLysGlyThrAsnAla

El polipéptido de BCMA o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 20 % de identidad, al menos aproximadamente un 30 % de identidad, al menos aproximadamente un 40 % de identidad, al menos aproximadamente un 50 % de identidad, al menos aproximadamente un 60 % de identidad, al menos aproximadamente un 70 % de identidad, al menos aproximadamente un 75 % de identidad, al menos aproximadamente un 80 % de identidad, al menos aproximadamente un 90 % de identidad, al menos aproximadamente un 95 % de identidad, al menos aproximadamente un 96 % de identidad, al menos aproximadamente un 97 % de identidad, al menos aproximadamente un 98 % de identidad o al menos aproximadamente un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.

El polipéptido de BCMA o un fragmento del mismo comprende al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 10 o al menos aproximadamente 5 aminoácidos. En realizaciones específicas, el polipéptido de BCMA o un fragmento del mismo comprende 54 aminoácidos.

En realizaciones adicionales, el polipéptido de BCMA o un fragmento del mismo se detecta utilizando un sistema de detección seleccionado del grupo que consiste en: una inmunohistoquímica, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés), radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés), inmunoensayo enzimático (EIA, por sus siglas en inglés), inmunoensayo de fluorescencia (FIA, por sus siglas en inglés), inmunoensayo de luminiscencia (LIA, por sus siglas en inglés), ensayo de flujo lateral o ensayo de tira. En algunas realizaciones, el sistema de detección es un ensayo ELISA. En otras realizaciones, el sistema de detección es un ensayo de flujo lateral.

En algunas realizaciones, la detección se realiza utilizando un anticuerpo específico para el polipéptido de BCMA o un fragmento del mismo. En determinadas realizaciones, el anticuerpo específico para el polipéptido de BCMA o un fragmento del mismo es un anticuerpo monoclonal. En otras realizaciones, el anticuerpo específico para el polipéptido de BCMA o un fragmento del mismo es un anticuerpo policlonal.

En algunos aspectos, el sistema inmunitario deteriorado es el resultado de una enfermedad de inmunodeficiencia. En algunas realizaciones, la enfermedad de inmunodeficiencia incluye, aunque no de forma limitativa, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA, por sus siglas en inglés), telangiectasia ataxia, síndrome de Chediak Higashi, deficiencia inmunitaria variable común (CVID, por sus siglas en inglés), enfermedad de inmunodeficiencia combinada, deficiencias de complemento, síndrome de DiGeorge, hipogammaglobulinemia, síndrome de Job, deficiencia de adhesión de leucocitos, panhipogammaglobulinemia, agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (enfermedad de Bruton), agammaglobulinemia congénita, deficiencia selectiva de IgA, síndrome de Wiskott Aldrich, enfermedad granulomatosa crónica, enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave, síndrome de hiperinmunoglobulina E (síndrome de Job), síndrome de hiperIgM, agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (XLA, por sus siglas en inglés), enfermedad de Crohn, timoma, inmunodeficiencias asociadas con mutaciones en el gen LRBA (que codifica la proteína sensible a lipopolisacáridos y de anclaje de tipo beige) o inmunodeficiencias asociadas con fosfatidilinositol 3-quinasa 8 (PI3KD).

La infección incluye, aunque no de forma limitativa, una infección vírica, una infección bacteriana, una infección previa o una infección fúngica. La enfermedad incluye, aunque no de forma limitativa, enfermedades autoinmunitarias que incluyen, sin limitaciones, lupus eritematoso sistémico (LES), esclerosis múltiple (MS, por sus siglas en inglés), tiroiditis de Hashimoto, artritis reumatoide o diabetes mellitus tipo 1. La enfermedad incluye enfermedades genéticas tales como cáncer, que incluye, aunque no de forma limitativa, mieloma, linfoma o leucemia. En algunos aspectos, el ^{mieloma es mieloma múltiple} (Mm). ^{En otros aspectos, el linfoma es un linfoma no Hodgkin (NHL). En aspectos}adicionales la leucemia es leucemia linfocítica crónica (LLC).

Se desvela un kit para supervisar el estado inmunitario de un sujeto. En determinados aspectos, el kit para supervisar el estado inmunitario de un sujeto comprende un reactivo adecuado para determinar los niveles del polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica obtenida del sujeto, en donde la muestra biológica es una muestra de suero o plasma o sobrenadante obtenido de un cultivo de las células mononucleares de médula ósea o de células mononucleares de sangre periférica del sujeto.

En algunos aspectos el kit comprende un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de BCMA o fragmento del mismo. En determinados aspectos, el anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de BCMA o fragmento del mismo es un anticuerpo monoclonal. En otros aspectos, el anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de BCMA o fragmento del mismo es un anticuerpo policlonal.

En algunos aspectos, el kit comprende un sistema de detección seleccionado del grupo que consiste en: ensayo ELISA, ensayo RIA, ensayo EIA, ensayo FIA, ensayo LIA, ensayo de flujo lateral o ensayo de tira. En algunos aspectos, el kit comprende un ensayo ELISA. En otros aspectos, el kit comprende un ensayo de flujo lateral.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos adjuntos, que se incorporan y constituyen parte de esta memoria descriptiva, ilustran varias realizaciones del método y composiciones desveladas y junto con la descripción, sirven para explicar los principios de los métodos desvelados.

La Figura 1 muestra que se encuentra BCMA en el suero de sujetos de control humanos y a un paciente con un nivel de IgG bajo. Un sujeto con niveles de IgG bajos tuvo niveles de BCMA séricos bajos (14,6 ng/ml) en comparación con los niveles de BCMA séricos (mediana=36,0 ng/ml; intervalo=13,45 ng/ml-958,1 ng/ml) en sujetos de control (N=104).

La Figura 2 muestra que los niveles de IgG de pacientes con mieloma múltiple (MM) de IgA que han logrado la remisión completa (RC) con mieloma no mensurable se correlacionan con sus niveles de BCMA séricos. Los pacientes de MM IgA (N=23) que están en RC que muestran BCMA séricos bajos (<10 ng/ml; p<0,0001) tienen niveles de IgG significativamente disminuidos (mediana=319,0 mg/dl) en comparación con niveles de IgG (mediana=535,0 mg/dl) entre pacientes de MM IgG (N=40) que están en RC y muestran BCMA séricos mayores (>10 ng/ml; p<0 ,0001).

La Figura 3 muestra que los niveles de IgG de pacientes con MM IgG que han logrado la remisión completa (RC) con mieloma no mensurable se correlacionan con sus niveles de BCMA séricos. Los pacientes de MM IgG (N=47) que están en RC que muestran BCMA séricos bajos (<10 ng/ml; p<0,0001) tienen niveles de IgG significativamente disminuidos (mediana=402,0 mg/dl) en comparación con niveles de IgG (mediana=643,5 mg/dl) entre pacientes ^{de MM IgG (N=84) que están en} rC ^{y muestran BCMA séricos mayores (>10 ng/ml; p<0,0001).}

La Figura 4 muestra que los niveles de IgA no implicados normales de pacientes con MM IgG que han logrado la RC se correlacionan con sus niveles de BCMA séricos. Los pacientes de MM IgG (N=47) que están en RC y de niveles de BCMA séricos bajos (<10 ng/ml; p<0,0001) tienen niveles de IgA significativamente disminuidos (mediana=26,0 mg/dl) en comparación con niveles de IgA (mediana=61,0 mg/dl) en pacientes de MM IgG (N=84) que están en RC y muestran BCMA séricos mayores (>10 ng/ml; p<0,0001).

La Figura 5 muestra que los niveles de IgM no implicados normales de pacientes con MM IgG que han logrado la RC se correlacionan con sus niveles de BCMA séricos. Los pacientes de MM IgG (N=47) que están en RC y que muestran BCMA séricos bajos (<10 ng/ml; p<0,0001) tienen niveles de IgM significativamente disminuidos (mediana=11,0 mg/dl) en comparación con niveles de IgM (mediana=32,5 mg/dl) en pacientes de MM IgG (N=84) que están en RC y muestran BCMA séricos mayores (>10 ng/ml; p<0,0001).

La Figura 6 muestra los niveles de BCMA séricos de pacientes basados en el diagnóstico de inmunodeficiencia. Los niveles de BCMA séricos fueron sustancialmente inferiores en pacientes con inmunodeficiencia (XLA, CVID, deficiencia de IgG, deficiencia de IgA, deficiencia de IgM, síndrome de hiperIgM, PRH o enfermedad de Crohn), en comparación con los niveles de BCMA séricos en sujetos de control.

La Figura 7 muestra que los niveles de BCMA séricos de los pacientes con inmunodeficiencia (N=68) fueron significativamente inferiores (7,3 ng/ml (intervalo; 0,84 ng/ml - 189,5 ng/ml); p<0,0001) en comparación con los niveles de BCMA séricos (35,2 ng/ml (intervalo; 12,2 ng/ml - 958,1 ng/ml); p<0,0001) en donantes sanos normales (N=119).

Las Figuras 8 y 10 muestran los niveles de BCMA séricos de pacientes basados en el diagnóstico de inmunodeficiencia. Los niveles de BCMA séricos fueron sustancialmente inferiores en pacientes con inmunodeficiencia (XLA, CVID, CVID linfoma, CVID linfoma de Tx, deficiencia de IgG, deficiencia de IgA, deficiencia de IgM, síndrome de hiperIgM, PI3KD, LRBA/LRBA o timoma), en comparación con los niveles de BCMA séricos en sujetos de control.

Las Figuras 9 y 11 muestran los niveles de BCMA séricos de pacientes basados en el diagnóstico de inmunodeficiencia. Los niveles de BCMA séricos fueron sustancialmente inferiores en pacientes con inmunodeficiencia (XLA, CVID, CVID linfoma, CVID linfoma de Tx, deficiencia de IgG, deficiencia de IgA, IgA, IgA IgG, IgA IgG2, deficiencia de IgM o síndrome de hiperIgM), en comparación con los niveles de BCMA séricos en sujetos de control.

Descripción detallada

Los presentes inventores han encontrado que los niveles de BCMA o de un fragmento del mismo séricos se correlacionan con el estado inmunitario general de un sujeto. Los presentes inventores han encontrado que una cantidad disminuida de polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica obtenida de un sujeto en comparación con el polipéptido de BCMA o un fragmento del mismo en una muestra biológica de control obtenida de un sujeto sano normal, es indicativa de un sistema inmunitario deteriorado, si bien una cantidad aumentada del polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica obtenida de un sujeto en comparación con las cantidades de polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica obtenida de un sujeto sano normal indica que el sujeto sufre o está en riesgo más elevado de sufrir una infección o una enfermedad relacionada con una deficiencia inmunitaria.

En diversas realizaciones, se proporcionan métodos para supervisar con fiabilidad del estado inmunitario de un sujeto. Las concentraciones de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica (por ejemplo, el suero de un sujeto) se detectan y/o miden y se comparan frente a un valor inicial o un control para supervisar con fiabilidad el estado inmunitario de un sujeto. Sin desear quedar ligados a una teoría particular, se cree que debido a que se detectaron niveles altos de BCMA o de un fragmento del mismo en muestras biológicas de sujetos que tienen una enfermedad activa en comparación con muestras biológicas de sujetos que tienen enfermedad indolente, al tiempo que se detectaron niveles bajos de BCMA o de un fragmento del mismo en muestras biológicas de sujetos que tienen sistemas inmunitarios deteriorados, en comparación con muestras biológicas de sujetos sanos normales, los niveles de BCMA o de un fragmento del mismo pueden utilizarse para supervisar con fiabilidad el estado inmunitario de un sujeto.

Se proporcionan métodos para supervisar con fiabilidad la respuesta de un sujeto a tratamientos dirigidos a mejorar el estado inmunitario del sujeto. Los niveles de BCMA o de un fragmento del mismo se utilizan para supervisar la respuesta de un sujeto a los tratamientos dirigidos a mejorar el estado inmunitario de un sujeto. Sin desear quedar ligados a una teoría particular, se cree que debido a que los niveles de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica obtenida de un sujeto se correlacionan con el estado inmunitario del sujeto, los niveles de BCMA o de un fragmento del mismo en la muestra biológica pueden determinarse en diferentes momentos posteriores al inicio del tratamiento y compararse con un momento inicial antes del inicio del tratamiento para supervisar la respuesta de un sujeto a los tratamientos dirigidos a mejorar el estado inmunitario del sujeto.

La práctica de la invención empleará, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, química orgánica, biología molecular, microbiología, técnicas de ADN recombinante, genética, inmunología y biología celular que están dentro de la habilidad de la técnica, muchos de los cuales se describen a continuación con fines ilustrativos. Tales técnicas se explican con detalle en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición, 2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edición, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, actualizado julio de 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, Nueva York (1992); Transcription and Translation (B. Hames y S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); y Harlow y Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1998).

A. Definiciones

Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por los expertos en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento en la práctica o en el ensayo de la presente invención, en el presente documento se describen realizaciones preferidas de composiciones, métodos y materiales. Para los fines de la presente invención, a continuación se definen los siguientes términos.

En el presente documento, los artículos "un", "uno(a)" y "el/la", se usan para hacer referencia a uno o a más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "alrededor de" o "aproximadamente" se refiere a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud, que varía tanto como un 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6 , 5, 4, 3, 2 o 1 % con respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia. En realizaciones particulares, cuando las expresiones "alrededor de" o "aproximadamente" preceden a un valor numérico, indican el valor más o menos un intervalo de un 15 %, 10 %, 5 % o 1 %.

En toda esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera otra cosa, las palabras "comprender", "comprende" y "que comprende", se entenderán como que implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos indicados, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos. Por "que consiste en" se entiende que incluye y se limita a, lo que sea que sigue a la expresión "que consiste en". Por tanto, la expresión "que consiste en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios y que no pueden estar presentes otros elementos. Por "que consiste esencialmente en" se entiende que incluye cualquier elemento enumerado después de la expresión y se limita a otros elementos que no interfieren ni contribuyen a la actividad o acción especificada en la divulgación de los elementos enumerados. Por tanto, la expresión "que consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que lo demás elementos son opcionales y pueden o no estar presentes dependiendo de si afectan o no a la actividad o acción de los elementos enumerados.

La referencia en toda esta memoria descriptiva a "una realización", "una realización", "realización", "una realización particular", "una realización relacionada", "una determinada realización", "una realización adicional", "algunas realizaciones", "otras realizaciones", "realizaciones adicionales", "otras realizaciones" o "una realización adicional" o combinaciones de las mismas, significa que un rasgo, una estructura o una característica particular, que se describe en relación con la realización, se incluye en al menos una realización de la presente invención. Por tanto, las apariciones de las expresiones anteriores en diversos lugares a lo largo de la presente memoria descriptiva no se refieren todas necesariamente a la misma realización. Asimismo, los rasgos particulares, estructuras o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones.

Como se utiliza en el presente documento, el término "BCMA" pretende referirse genéricamente a los polipéptidos de antígenos de maduración de linfocitos B tanto de tipo silvestre como variantes, a menos que se denote específicamente de otro modo. Los polipéptidos de BCMA están codificados por el gen BCMA. Como se usa comúnmente en la técnica, el término "gen" pretende referirse a la región genómica que abarca la(s) región(ones) no traducida 5' (UTR, por sus siglas en inglés), exones, intrones y UTR 3'. Los segmentos individuales pueden referirse específicamente a, por ejemplo, un promotor, una región codificante, etc. Las combinaciones de tales segmentos que proporcionan una proteína BCMA completa pueden referirse genéricamente como una secuencia codificante de proteínas. Existen cuatro haplotipos principales del gen BCMA en el genoma humano, en la presente divulgación el término "BCMA" se entiende que abarca los cuatro (Kawasaki et al., Genes Immun. 2:276-9, 2001).

Las expresiones "BCMA" o "polipéptido de BCMA" se utilizan indistintamente y abarcan una secuencia de aminoácidos codificada por un marco de lectura abierto (ORF, por sus siglas en inglés) de un polinucleótido de BCMA conocido, que incluye el polipéptido nativo de longitud completa y los fragmentos del mismo, en particular, los fragmentos biológicamente activos y/o los fragmentos correspondientes a los dominios funcionales, por ejemplo, una región o dominio que tiene actividad biológica, etc.; fragmentos antigénicos del mismo y que incluyen fusiones de los polipéptidos sujeto a otras proteínas o partes de las mismas. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de BCMA se han desvelado. (Véanse, por ejemplo, Laabi et al., Nucleic Acids Research 22: 1147-1154, 1994; Laabi et al., EMBO J., 11: 3897-3904 (1992); Gras et al., Int. Immunology, 7: 1093-1106 (1995); y Madry et al., Int. Immunology, 10: 1693-1702 (1998). Los polipéptidos de BCMA de la invención pueden aislarse a partir de diversas fuentes, tales como a partir de tipos de tejido humano o muestras biológicas tales como suero, plasma, hueso, médula ósea o tejido.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "fragmento del mismo" se refiere a una porción del polipéptido de BCMA nativo de longitud completa. En algunas realizaciones, el fragmento de BCMA es un polipéptido de BCMA escindido. En algunas realizaciones, el polipéptido de BCMA escindido es una forma soluble del polipéptido de BCMA.

En determinadas realizaciones, el polipéptido de BCMA o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 20 % de identidad, al menos aproximadamente un 30 % de identidad, al menos aproximadamente un 40 % de identidad, al menos aproximadamente un 50 % de identidad, al menos aproximadamente un 60 % de identidad, al menos aproximadamente un 70 % de identidad, al menos aproximadamente un 75 % de identidad, al menos aproximadamente un 80 % de identidad, al menos aproximadamente un 90 % de identidad, al menos aproximadamente un 95 % de identidad, al menos aproximadamente un 96 % de identidad, al menos aproximadamente un 97 % de identidad, al menos aproximadamente un 98 % de identidad o al menos aproximadamente un 99 % de identidad con la forma soluble del polipéptido de BCMA humano (SEQ ID NO: 1).

En algunas realizaciones, el polipéptido de BCMA o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 20 % de identidad, al menos aproximadamente un 30 % de identidad, al menos aproximadamente un 40 % de identidad, al menos aproximadamente un 50 % de identidad, al menos aproximadamente un 60 % de identidad, al menos aproximadamente un 70 % de identidad, al menos aproximadamente un 75 % de identidad, al menos aproximadamente un 80 % de identidad, al menos aproximadamente un 90 % de identidad, al menos aproximadamente un 95 % de identidad, al menos aproximadamente un 96 % de identidad, al menos aproximadamente un 97 % de identidad, al menos aproximadamente un 98 % de identidad o al menos aproximadamente un 99 % de identidad con el polipéptido de BCMA humano nativo de longitud completa (SEQ ID NO: 2).

En otras realizaciones, el polipéptido de BCMA o un fragmento del mismo comprende al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 10 o al menos aproximadamente 5 aminoácidos. En realizaciones específicas, el polipéptido de BCMa o un fragmento del mismo comprende 54 aminoácidos.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "estado inmunitario" de un sujeto se refiere a la eficacia del sistema inmunitario del sujeto. Como tal, el estado inmunitario de un sujeto indica si el sistema inmunitario del sujeto es normal, está deteriorado (por ejemplo, si el sujeto sufre de una enfermedad de deficiencia inmunitaria) o es hiperactivo (por ejemplo, si el sujeto está alterado por una enfermedad, una enfermedad autoinmunitaria o una patología), en comparación con un sujeto sano normal.

La expresión "sistema inmunitario" se refiere a un sistema de muchas estructuras y procesos biológicos dentro de un organismo que protege contra las enfermedades.

Las siguientes son realizaciones no limitativas de polinucleótidos: un gen o fragmento génico, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Una molécula de ácido nucleico también puede comprender moléculas de ácidos nucleicos modificadas, tales como moléculas de ácidos nucleicos metiladas y análogos de moléculas de ácidos nucleicos. Los análogos de purinas y pirimidinas son conocidas en la técnica. Los ácidos nucleicos pueden ser de origen natural, por ejemplo, ADN o ARN o pueden ser análogos sintéticos, como se conoce en la técnica. Tales análogos pueden preferirse para utilizarse como sondas, debido a una estabilidad superior en condiciones de ensayo. Las modificaciones en la estructura nativa, incluyendo alteraciones en el esqueleto, azúcares o bases heterocíclicas, han demostrado aumentar la estabilidad intracelular y la afinidad de unión. Entre los cambios útiles en la química del esqueleto están los fosforotioatos; fosforoditioatos, donde ambos oxígenos no de puente se sustituyen con sulfuro; fosforoamiditas; alquil fosfotriésteres y boranofosfatos. Los derivados de fosfatos aquirales incluyen 3'-0'-5'-S-fosforotioato, 3'-S-5'-O-fosforotioato, 3'-CH2-5'-O-fosfonato y 3'-NH-5'-O-fosforoamidato. Los ácidos nucleicos peptídicos reemplazan el esqueleto de fosfodiéster de ribosa completo con un enlace peptídico.

Los términos "polipéptido" y "proteína", utilizados indistintamente en el presente documento, se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos modificados o derivatizados química o bioquímicamente y polipéptidos que tienen cadenas principales peptídicas modificadas. En diversas realizaciones, los polipéptidos de BCMA se contemplan para usar dentro de composiciones y métodos de diagnóstico, pronóstico o supervisión desvelados en el presente documento. El término incluye proteínas de fusión, incluyendo, aunque no de forma limitativa, proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, fusiones con secuencias líder heterólogas y homólogas, con o sin restos de metionina en el extremo N; proteínas etiquetadas inmunológicamente; y similares.

Una sustancia "aislada sustancialmente" o "aislada" es una que está libre sustancialmente de sus materiales circundantes asociados en la naturaleza. Por libre sustancialmente se entiende al menos un 50 %, preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 80 % y aún más preferentemente al menos un 90 % libre de materiales con los que se asocia en la naturaleza. Como se utiliza en el presente documento, un "aislado" puede referirse a polinucleótidos, polipéptidos, células, muestras y anticuerpos.

Las reacciones de hibridación pueden realizarse en condiciones de diferente "rigurosidad". Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas en la materia y están publicadas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989). Los ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden de rigurosidad creciente): temperaturas de incubación de 25 °C, 37 °C, 50 °C y 68 °C; concentraciones de tampón de 10*SSC, 6 *SSC, 1XSSC, 0,1*SSC (donde SSC es 0,15 M NaCl y tampón de citrato 15 mM) y sus equivalentes utilizando otros sistemas de tampón; concentraciones de formamida de 0 %, 25 %, 50 % y 75 %; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 o más etapas de lavado; tiempos de incubación de 1, 2 o 15 minutos; y soluciones de lavado de 6 *SSC, 1*SSC, 0,1*SSC o agua desionizada. Unos ejemplos de condiciones rigurosas son hibridación y lavado a 50 °C o superior y en 0,1*SSC (NaCl 9 mM/citrato sódico 0,9 mM).

La expresión "célula diana" incluye una célula individual, una célula de una muestra biológica o un cultivo celular. Las células diana incluyen la progenie de una célula diana individual y la progenie puede no ser completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN total) respecto a la célula parental debido a una mutación y/o cambio natural, accidental o deliberado. En realizaciones particulares, las células diana incluyen mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, linfoma o células tumorales de macroglobulinemia de Waldenstrom, médula ósea o células mononucleares de sangre periférica, linfocitos B o células plasmáticas.

Los sistemas de detección se basan, en parte, en la capacidad de un agente aglutinante para unirse a BCMA o a un fragmento del mismo. En general, la invención contempla el uso de un agente aglutinante que se une específicamente a BCMA o a un fragmento del mismo, dando como resultado la formación de un complejo detectable de BCMA o un fragmento del mismo y un agente aglutinante. En algunas realizaciones, la invención utiliza dos agentes aglutinantes, un agente aglutinante de captura y un agente aglutinante de detección, que se unen a BCMA o a un fragmento del mismo, dando como resultado la formación de un complejo ternario que comprende un agente aglutinante de captura, BCMA y un agente aglutinante de detección.

Puede utilizarse una variedad de agentes aglutinantes, incluyendo, por ejemplo, polipéptidos, azúcares y ácidos nucleicos. En incluso otras realizaciones, la invención además incluye el uso de un agente aglutinante adicional que se une al agente aglutinante de detección. Tal agente aglutinante adicional puede ser útil, por ejemplo, en la detección del agente aglutinante de detección unido. Por consiguiente, un ejemplo de tal agente aglutinante adicional son los anticuerpos específicos para un fragmento de un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fc, que pueden estar marcados de forma detectable y, por lo tanto, utilizarse para detectar un agente aglutinante de detección unido y son particularmente útiles cuando el agente aglutinante de detección no es en sí mismo fácilmente susceptible al marcaje. En determinadas realizaciones, el agente aglutinante es un anticuerpo específico para bacterias.

La expresión "se une específicamente", en el contexto de unión de anticuerpos, se refiere a la avidez y/o unión de alta afinidad de un anticuerpo a un polipéptido específico, es decir, epítopo de un BCMA o de un fragmento del mismo. La unión de anticuerpos a un epítopo en un polipéptido específico (también referido en el presente documento como "un epítopo") preferentemente es más fuerte que la unión del mismo anticuerpo a cualquier otro epítopo, particularmente los que pueden estar presentes en moléculas en asociación o en la misma muestra, como el polipéptido específico de interés, por ejemplo, se une más fuertemente a un epítopo de BCMA específico que a un epítopo de BCMA diferente o epítopo no de BCMA. Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de interés pueden ser capaces de unirse a otros polipéptidos en un nivel débil, pero detectable (por ejemplo, un 10 % o menos, un 5 % o menos, 1 % o menos de la unión mostrada al polipéptido de interés). Tal unión débil o unión de fondo, es fácilmente discernible de la unión de anticuerpos específica al compuesto o polipéptido de interés, por ejemplo, mediante el uso de controles adecuados. En general, los anticuerpos utilizados en composiciones y métodos de la invención que se unen a un polipéptido de BCMA específico o a un fragmento del mismo con una afinidad de unión de 107 mol/l o más, preferentemente 108 mol/l o más, se dice que se unen específicamente al polipéptido de BCMA específico. En general, un anticuerpo con una afinidad de unión de 106 mol/l o menos no es útil por cuanto no se unirá a un antígeno en un nivel detectable utilizando la metodología convencional utilizada actualmente.

En algunas realizaciones, la afinidad de unión específica de un agente aglutinante de BCMA a BCMA o a un fragmento del mismo es aproximadamente 2 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 5 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 10 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 20 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 50 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 100 veces mayor que la unión de fondo o aproximadamente 1000 veces mayor que la unión de fondo o más.

En otras realizaciones, la afinidad de unión específica es entre aproximadamente 2 a aproximadamente 1.000 veces mayor que la unión de fondo, entre aproximadamente 2 a 500 veces mayor que la unión de fondo, entre aproximadamente 2 a aproximadamente 100 veces mayor que la unión de fondo, entre aproximadamente 2 a aproximadamente 50 veces mayor que la unión de fondo, entre aproximadamente 2 a aproximadamente 20 veces mayor que la unión de fondo, entre aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces mayor que la unión de fondo, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces mayor que la unión de fondo, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 50 veces mayor que la unión de fondo, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 20 veces mayor que la unión de fondo, entre aproximadamente 10 a aproximadamente 100 veces mayor que la unión de fondo, entre aproximadamente 10 a aproximadamente 50 veces mayor que la unión de fondo, entre aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces mayor que la unión de fondo o cualquier intervalo intermedio de afinidad.

Por consiguiente, se produce unión específica entre un agente aglutinante y BCMA o un fragmento del mismo cuando hay una interacción entre los dos que produce un complejo unido que tiene las características de una interacción anticuerpo/antígeno o enzima/sustrato. En algunas realizaciones, la unión específica se caracteriza cuando un miembro de un par se une sustancialmente a una especie particular y no a otra especie dentro de la familia de compuestos a la que pertenece el miembro correspondiente del miembro de unión. En otras realizaciones, la unión específica se caracteriza cuando un miembro de un par se une sustancialmente a una o más especies particulares y no a otra especie dentro de la familia de compuestos a la que pertenece el miembro correspondiente del miembro de unión. En incluso otras realizaciones, la unión específica se caracteriza cuando un miembro de un par se une sustancialmente a 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10 o más especies particulares y no a otra especie dentro de la familia de compuestos a la que pertenece el miembro correspondiente del miembro de unión.

En términos generales, la afinidad de unión de un agente aglutinante (A) a BCMA o a un fragmento del mismo (B) puede expresarse generalmente por la constante de equilibrio Kd que resulta de la siguiente reacción: [A]+[B]-[AB]. A continuación, la constante de equilibrio químico Kd está dada por: Kd=[A]x[B]/[AB]. Puede juzgarse si la unión de un agente aglutinante es específica o no a partir de la diferencia entre la afinidad de unión (valor de Kd) del agente aglutinante a BCMA o a un fragmento del mismo, frente a la unión a otro polipéptido.

Los valores de Kd y las diferencias en los valores de Kd pueden medirse utilizando, por ejemplo, ensayos de unión in vitro o in vivo y/o ensayos sobre otros materiales, tales como una placa de microtitulación de poliestireno o una superficie especializada en un biosensor analítico. En algunas realizaciones, la diferencia entre el valor de Kd de un agente aglutinante a BCMA o a un fragmento del mismo, frente a la unión a un polipéptido indeseado es de aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 9 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces, aproximadamente 1000 veces o más.

En otras realizaciones, el valor de Kd es menos de 104 M, menos de 105 M, menos de 106 M, menos de 107 M, menos de 108 M, menos de 109 M, menos de 1010 M y puede ser 1011 M, menos de 1012 M, menos de 1013 M, menos de 1014 M, menos de 1015 M o menos.

En otros aspectos, el valor de Kd es entre aproximadamente 104 M y aproximadamente 1015 M, entre aproximadamente 104 M y aproximadamente 1012 M, entre aproximadamente 104 M y aproximadamente 1010 M, entre aproximadamente 106 M y aproximadamente 1015 M, entre aproximadamente 106 M y aproximadamente 1012 M, entre aproximadamente 106 M y aproximadamente 1010 M, entre aproximadamente 108 M y aproximadamente 1015 M, entre aproximadamente 108 M y aproximadamente 1012 M, entre aproximadamente 108 M y aproximadamente 1010 M, entre aproximadamente 107 M y aproximadamente 1010 M o cualquier intervalo intermedio de afinidad.

El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio y específicamente abarca anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada.

La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias.

En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal antiBCMA. En otras realizaciones, el anticuerpo monoclonal reconoce específicamente un epítopo presente en un fragmento del polipéptido de BCMA.

Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Asimismo, al contrario de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque se sintetizan mediante el cultivo de hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo estando obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse mediante el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de fagotecas de anticuerpos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo en particular, si bien el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo de las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente de Estados Unidos n.° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos quiméricos.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab') 2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana.

En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que los restos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco conservada (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes restos no humanos. Asimismo, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las CDR o las secuencias marco importadas. Estas modificaciones se realizan para perfeccionar y maximizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno y normalmente dos, dominios variables, en el (los) que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de la inmunoglobulina humana, aunque las regiones FR pueden incluir una o más sustituciones de aminoácidos que mejoren la afinidad de unión. El número de estas sustituciones de aminoácidos en la FR es normalmente no más de 6 en la cadena H y no más de 3 en la cadena L. El anticuerpo humanizado comprenderá también óptimamente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo PRIMATTZED en donde la región de unión a antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido, por ejemplo, inmunizando monos macacos con el antígeno de interés. Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos humanizados.

Los anticuerpos humanos se pueden producir usando varias técnicas conocidas en la materia, incluyendo bibliotecas de presentación en fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991).

Los "fragmentos funcionales" de los anticuerpos de unión son los fragmentos que retienen la unión a antígeno con la misma afinidad sustancialmente que la molécula de cadena completa de la que se derivan.

Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más de aproximadamente un 95 % en peso de anticuerpo, determinado por el método de Lowry y más preferentemente más de aproximadamente un 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria o (3) hasta la homogeneidad mediante una SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o preferentemente, una tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en el interior de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Habitualmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

La expresión "anticuerpo marcado detectablemente" se refiere a un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo que retiene la especificidad de unión por un BCMA o un fragmento del mismo), que tiene un marcador detectable unido. El marcador detectable normalmente se une mediante conjugación química, pero cuando el marcador es un polipéptido, podría unirse alternativamente mediante técnicas de ingeniería genética. Los métodos para la producción de proteínas marcadas detectablemente son bien conocidos en la técnica. Los marcadores detectables pueden seleccionarse de una variedad de tales marcadores conocidos en la técnica, incluyendo, aunque no de forma limitativa, haptenos, radioisótopos, fluoróforos, marcadores paramagnéticos, enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante) u otras fracciones o compuestos que emiten una señal detectable (por ejemplo, radiactividad, fluorescencia, color) o emiten una señal detectable tras la exposición del marcador a su sustrato. Se conocen diversos pares de marcador/sustrato detectables (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante/diaminobencidina, avidina/estreptavidina, luciferasa/luciferina)), métodos para marcar anticuerpos y métodos para usar anticuerpos marcados (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, eds. (Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York)).

En una técnica, un inmunógeno que comprende el polipéptido se inyecta inicialmente en cualquiera de una amplia variedad de mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras). A continuación, pueden purificarse anticuerpos específicos para el polipéptido a partir de tales antisueros mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad usando el polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal antiBCMA. En otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal que reconoce un fragmento del polipéptido de BCMA.

Una "muestra biológica" abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas a partir de un individuo y puede utilizarse en un ensayo de diagnóstico o de supervisión. La definición abarca sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólidas, tales como un espécimen de biopsia o cultivos tisulares o células derivadas a partir de la progenie de los mismos. La definición incluye también muestras biológicas que se han manipulado de alguna manera después de su obtención, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento respecto de determinados componentes, tales como polinucleótidos. La expresión "muestra biológica" abarca una muestra clínica y también incluye, sin limitación, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, fluido biológico y muestras de tejido. La muestra puede estar pretratada según sea necesario mediante dilución en una solución tampón adecuada o concentrada, si se desea. Puede usarse cualquiera de varias soluciones acuosas de tampón convencionales, empleando uno de una diversidad de tampones, tal como fosfato, Tris o similares, preferentemente, a pH fisiológico. Las muestras biológicas pueden derivarse de pacientes utilizando técnicas bien conocidas, tales como la venopunción, punción lumbar, muestra de fluido, tal como saliva u orina o biopsia de tejidos y similares.

Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "correlacionado con" o "asociado con" se refieren a los niveles de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica de un sujeto que tiene una correlación estadísticamente significativa con un estado fisiológico, por ejemplo, estado o extensión de la enfermedad, respuesta al tratamiento y supervivencia. La fuerza de la correlación entre los niveles de BCMA o de un fragmento del mismo y la presencia o ausencia de un estado fisiológico particular puede determinarse mediante una prueba estadística de significación. Los métodos para determinar la fuerza de la correlación entre el nivel de expresión de un gen expresado diferencialmente y un estado fisiológico particular asignando una puntuación estadística a la correlación se revisan en Holloway et al. (2002) Nature Genetics Suppl. 32:481-89, Churchill (2002) Nature Genetics Suppl. 32:490-95, Quackenbush (2002) Nature Genetics Suppl. 32: 496-501; Slonim (2002) Nature Genetics Suppl. 32:502-08; y Chuaqui et al. (2002) Nature Genetics Suppl. 32:509-514.

Un "conjugado" se refiere a cualquier molécula, por ejemplo, anticuerpo unido o unido covalentemente o no covalentemente a otra molécula, por ejemplo, un hapteno, molécula pequeña o marcador, incluyendo proteínas de fusión, así como moléculas que contienen tanto aminoácidos o porciones de proteínas y porciones de no proteínas. Los conjugados pueden sintetizarse mediante una variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, síntesis en fase sólida, síntesis en fase de solución, técnicas sintéticas de química orgánica o una combinación de estas técnicas. La elección de síntesis dependerá de la molécula particular a generarse.

Los términos "individuo", "sujeto", y "paciente", utilizados indistintamente en el presente documento, se refieren a un mamífero, incluyendo, aunque no de forma limitativa, murinos, simios, seres humanos, animales de granja mamíferos, animales deportivos mamíferos y mascotas mamíferas. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto humano.

El término "mamífero" se refiere a cualquier organismo clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, deportivos o de compañía, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. En algunas realizaciones, el mamífero en el presente documento es un ser humano.

B. Métodos de supervisión del estado inmunitario de un sujeto

Los presentes inventores han descubierto que los niveles de BCMA o los niveles de un fragmento del mismo se correlacionan con el estado inmunitario de un sujeto. Como tal, los niveles de polipéptido de BCMA o los niveles de un fragmento del mismo están disminuidos en muestras biológicas obtenidas de sujetos con sistemas inmunitarios deteriorados y aumentados en muestras biológicas obtenidas de sujetos que sufren una infección o una enfermedad. Por consiguiente, unas realizaciones particulares de la invención proporcionan métodos para la supervisión del estado inmunitario de un sujeto, así como para la supervisión de la respuesta del sujeto al tratamiento, basadas en el nivel de polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica obtenida de un paciente, incluyendo, por ejemplo, un torrente sanguíneo del paciente, suero, médula ósea o tejido, en diferentes momentos. Una variedad de métodos de determinación de los niveles de BCMA se conocen y están disponibles en la técnica. En determinadas realizaciones, estos implican el uso de un agente aglutinante de BCMA, tal como un anticuerpo específico de BCMA. Como se analiza en otra parte del presente documento, existe una variedad de formatos de ensayo conocida por los expertos en la técnica y adecuada para utilizar un agente aglutinante para detectar marcadores de polipéptidos en una muestra. Por ejemplo, ensayos ELISA, ensayos de flujo lateral, etc.; véase también, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

En general, una afección que conduce al deterioro del sistema inmunitario se supervisa mediante la presencia de al menos 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 1000 veces o niveles inferiores de BCMA en comparación con los de un sujeto de control normal. En general, una estado infeccioso o de enfermedad se supervisa mediante la presencia de al menos 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 1000 veces o niveles superiores de BCMA en comparación con los de un sujeto de control normal.

Los métodos de supervisión del estado inmunitario de un sujeto comprenden: (a) detectar una cantidad de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica, por ejemplo, suero, obtenida de un sujeto; y (b) comparar la cantidad de polipéptido de BCMA o de fragmento del mismo detectado en (a) con un valor límite predeterminado o con una cantidad detectada en una muestra de suero de control, en donde una cantidad disminuida del polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en la muestra biológica del sujeto, en comparación con el valor límite predeterminado o cantidad en la muestra de suero de control es indicativa de un sistema inmunitario deteriorado y una cantidad aumentada del polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en la muestra biológica del sujeto, en comparación con el valor límite predeterminado o cantidad en la muestra de suero de control indica que el sujeto está en mayor riesgo o sufre una infección o una enfermedad, en donde la muestra biológica es una muestra de suero o plasma o sobrenadante obtenido de un cultivo de las células mononucleares de médula ósea o de células mononucleares de sangre periférica del sujeto.

En otros aspectos, los métodos de supervisión del estado inmunitario de un sujeto comprenden: (a) detectar una cantidad de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica, por ejemplo, suero, obtenida de un sujeto; y (b) comparar la cantidad de polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo detectado en (a) con un valor límite predeterminado o con una cantidad detectada en una muestra de suero de control, en donde una cantidad disminuida del polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en la muestra biológica del sujeto, en comparación con el valor límite predeterminado o cantidad en la muestra de suero de control es indicativa de un sistema inmunitario deteriorado, en donde la muestra biológica es una muestra de suero o plasma o sobrenadante obtenido de un cultivo de las células mononucleares de médula ósea o de células mononucleares de sangre periférica del sujeto.

En otros aspectos más, los métodos de supervisión del estado inmunitario de un sujeto comprenden: (a) detectar una cantidad de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica obtenida de un sujeto en un momento inicial; (b) detectar una cantidad de BCMA o de un fragmento del mismo en la muestra biológica obtenida del sujeto en un momento posterior; y (c) comparar la cantidad del polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo detectado en (a) con la cantidad de polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo detectado en (b), en donde una cantidad disminuida del polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo detectado en (b) en comparación con la cantidad de polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo detectado en (a) indica que el sujeto está respondiendo al tratamiento y en donde una cantidad aumentada o sin cambios del polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo detectado en (b) en comparación con la cantidad del polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo detectada en (a) indica que el sujeto no está respondiendo al tratamiento, en donde la muestra biológica es una muestra de suero o sobrenadante obtenido de un cultivo de las células mononucleares de médula ósea o de células mononucleares de sangre periférica del sujeto.

En algunos aspectos, el estado inmunitario de un sujeto puede determinarse (a) poniendo en contacto una muestra biológica obtenida de un sujeto con un agente aglutinante de BCMA; (b) detectando en la muestra un nivel de polipéptido de BCMA que se une al agente aglutinante; y (c) comparando el nivel del polipéptido de BCMA con un valor límite predeterminado o con el valor obtenido de un sujeto de control normal. En determinadas realizaciones, el valor límite predeterminado para la detección del deterioro del sistema inmunitario y/o una infección o estado de enfermedad es la señal media promedio obtenida cuando se incuba el anticuerpo inmovilizado con muestras de pacientes que no sufren un deterioro del sistema inmunitario y que no sufren una infección o estado de enfermedad.

En diversas realizaciones, la muestra biológica incluye, sin limitación, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, fluido biológico y muestras de tejido. En determinadas realizaciones, la muestra biológica es un sobrenadante obtenido de un cultivo de las células del sujeto. En algunos aspectos, las células son las células mononucleares de médula ósea del sujeto (BMMC, por sus siglas en inglés). En otros aspectos, las células son las células mononucleares de sangre periférica del sujeto.

En realizaciones particulares, la detección implica medir los niveles de ARNm de BCMA presentes en la muestra biológica. En otras realizaciones, la detección implica determinar los niveles de polipéptido de BCMA presentes en la muestra biológica. En algunas realizaciones, la detección se realiza usando uno o más cebadores específicos para BCMA. En otras realizaciones, la detección se realiza utilizando un anticuerpo específico para BCMA o un fragmento del mismo.

En determinadas realizaciones, una muestra que genera una señal que es estadísticamente más fuerte que el valor límite predeterminado se considera positiva para una infección o afección de enfermedad, si bien una muestra que genera una señal que es estadísticamente más débil que el valor límite predeterminado se considera positiva para un sistema inmunitario deteriorado. En determinadas realizaciones, la muestra genera una señal que es de hasta aproximadamente dos desviaciones estándar, hasta aproximadamente tres desviaciones estándar, hasta aproximadamente cinco desviaciones estándar, hasta aproximadamente diez desviaciones estándar, hasta aproximadamente veinte desviaciones estándar, hasta aproximadamente treinta desviaciones estándar, hasta aproximadamente cuarenta desviaciones estándar, hasta aproximadamente cincuenta desviaciones estándar, hasta aproximadamente sesenta desviaciones estándar, hasta aproximadamente setenta desviaciones estándar, hasta aproximadamente ochenta desviaciones estándar, hasta aproximadamente noventa desviaciones estándar o hasta aproximadamente cien desviaciones estándar por encima del valor límite predeterminado. En otras realizaciones, la muestra genera una señal que es de hasta aproximadamente dos desviaciones estándar, hasta aproximadamente tres desviaciones estándar, hasta aproximadamente cinco desviaciones estándar, hasta aproximadamente diez desviaciones estándar, hasta aproximadamente veinte desviaciones estándar, hasta aproximadamente treinta desviaciones estándar, hasta aproximadamente cuarenta desviaciones estándar, hasta aproximadamente cincuenta desviaciones estándar, hasta aproximadamente sesenta desviaciones estándar, hasta aproximadamente setenta desviaciones estándar, hasta aproximadamente ochenta desviaciones estándar, hasta aproximadamente noventa desviaciones estándar o hasta aproximadamente cien desviaciones estándar por debajo del valor límite predeterminado.

En otras realizaciones, el valor límite se determina utilizando una curva de eficacia diagnóstica, de acuerdo con el método de Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, págs. 106-7. Brevemente, en estas realizaciones, el valor límite puede determinarse a partir de un gráfico de pares de tasas positivas verdaderas (es decir, sensibilidad) y tasas positivas falsas (100 %-especificidad) que corresponden a cada valor límite posible para el resultado de prueba diagnóstica. El valor límite en el gráfico que está más próximo al extremo superior izquierdo (es decir, el valor que abarca el área mayor) es el valor límite más exacto y una muestra que genera una señal que es mayor que el valor límite determinado mediante este método puede considerarse positiva. Como alternativa, el valor límite puede desplazarse a la izquierda por el gráfico, para minimizar la tasa positiva falsa o a la derecha, para minimizar la tasa negativa falsa. En general, una muestra que genera una señal que es mayor que el valor límite determinado mediante este método se considera positiva para una infección o afección de enfermedad, si bien una muestra que genera una señal que es tres desviaciones estándar por debajo del valor límite predeterminado se considera positiva para un sistema inmunitario deteriorado.

En algunas realizaciones, el ensayo implica el uso de un agente aglutinante de BCMA inmovilizado sobre un soporte sólido para unirse y eliminar el polipéptido de BCMA del resto de la muestra. A continuación, el polipéptido de BCMA unido puede detectarse utilizando un reactivo de detección que contiene un grupo indicador que se une específicamente al complejo de agente aglutinante/polipéptido. Tales reactivos de detección pueden comprender, por ejemplo, un agente aglutinante que se une específicamente al polipéptido de BCMA o un anticuerpo u otro agente que se une específicamente al agente aglutinante, tal como una antiinmunoglobulina, proteína G5 proteína A o una lectina. En algunas realizaciones, el agente de detección de BCMA, por ejemplo, un anticuerpo, se une a biotina, que reconoce y se une específicamente a un agente aglutinante de estreptavidina o avidina.

En determinadas realizaciones, el ensayo se realiza en un formato de flujo lateral o de prueba de tira, como se analiza en otra parte del presente documento, en donde el agente aglutinante de BCMA, por ejemplo, un anticuerpo, se inmoviliza en una membrana, tal como nitrocelulosa. En la prueba de flujo lateral, los polipéptidos de BCMA dentro de la muestra se unen al agente aglutinante inmovilizado según pasa la muestra a través de la membrana. A continuación, un segundo agente aglutinante marcado se une al complejo de agente aglutinante-polipéptido de BCMA según fluye una solución que contiene el segundo agente aglutinante a través de la membrana. A continuación, la detección del segundo agente aglutinante unido puede realizarse como se ha descrito anteriormente. En el formato de prueba de tira, un extremo de la membrana a la que se une el agente aglutinante de BCMA se sumerge en una solución que contiene la muestra. La muestra migra a lo largo de la membrana a través de una región que contiene un segundo agente aglutinante y al área del agente aglutinante inmovilizado. La concentración del segundo agente aglutinante en el área de anticuerpo inmovilizado indica el estado inmunitario de un sujeto.

Se proporcionan métodos similares para determinar la respuesta del estado inmunitario de un sujeto al tratamiento. Dado que los niveles de BCMA séricos se correlacionan con el estado inmunitario, la respuesta al tratamiento o a la terapia se supervisa comparando los niveles de BCMA en el suero de un sujeto (u otra muestra biológica) en diferentes momentos durante el ciclo de un régimen de tratamiento. Por tanto, la presente invención proporciona un método rápido y fiable de supervisión del estado inmunitario de un sujeto y de la respuesta al tratamiento del estado inmunitario, usando, por ejemplo, una muestra de suero o plasma obtenida del torrente sanguíneo del sujeto. En realizaciones particulares, el método se practica mediante un ensayo ELISA, ensayo de flujo lateral o ensayo de prueba de tira utilizando un anticuerpo específico para BCMA.

La divulgación además proporciona sistemas y kits para supervisar el estado inmunitario de un sujeto, que comprenden un reactivo adecuado para determinar los niveles de polipéptido de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra biológica obtenida del sujeto, en donde la muestra biológica es una muestra de suero o plasma o sobrenadante obtenido de un cultivo de las células mononucleares de médula ósea o de células mononucleares de sangre periférica del sujeto. En algunos aspectos, el kit incluye reactivos para realizar ensayos ELISA, de flujo lateral o de prueba de tira, tales como un anticuerpo específico para BCMA. Los sistemas de detección y kits se describen con más detalle a continuación.

C. Sistemas de detección y kits

Se proporcionan sistemas de detección y kits para supervisar el estado inmunitario de un sujeto. Puede utilizarse un sistema de detección o kit para supervisar el estado inmunitario de un sujeto utilizando una muestra biológica, por ejemplo, suero, de un sujeto. El kit de diagnóstico podría incluir el método para la detección de una reacción antígenoanticuerpo además del material. El método de detección se selecciona preferentemente del grupo que consiste en citometría de flujo, inmunohistoquímica y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo enzimático (EIA), inmunoensayo de fluorescencia (FIA), inmunoensayo de luminiscencia (LIA), ensayo de flujo lateral y ensayo de tira. La reactividad del material de reconocimiento de antígenos podría confirmarse utilizando un dispositivo que detecta una reacción enzimática, fluorescencia, luminiscencia o radiación. En algunas realizaciones, la supervisión del estado inmunitario de un sujeto puede realizarse con un kit de citometría de flujo, kit de inmunohistoquímica, kit ELISA o kit de flujo lateral o de tira que incluye el anticuerpo antiBCMA o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

En alguna realización, la supervisión del estado inmunitario de un sujeto puede realizarse con un kit de citometría de flujo, kit de inmunohistoquímica, kit ELISA o kit de flujo lateral o de tira que incluye un anticuerpo que es específico para BCMA o un fragmento del mismo.

Un kit o sistema puede comprender incluir uno o más de los siguientes componentes: 1) uno o más estándares que comprende(n) uno o más del (de los) biomarcador(es) de la invención, tal como BCMA o un fragmento del mismo; 2) un agente aglutinante, tal como un anticuerpo o una pluralidad de anticuerpos, que son específicos para el (los) biomarcador(es) que se va(n) a ensayar para utilizar el kit; 3) instrucciones escritas; 4) diluyentes para muestras y los estándares; 5) un tampón de lavado; 6 ) reactivos de colores; 7) solución de parada; y 8) un portador, tal como un portador de anticuerpo, por ejemplo, un dispositivo de flujo lateral o una microplaca con anticuerpo unido o perlas de poliestireno.

El principio del ensayo es utilizar la técnica de inmunoensayo enzimático de sándwich cuantitativa en donde un anticuerpo monoclonal o policlonal selectivo para un biomarcador se reviste previamente sobre un portador, tal como una microplaca en sus pocillos. A continuación, los estándares y la muestra se pipetean en los pocillos y cualquiera del biomarcador que está presente se une a este anticuerpo inmovilizado. A continuación, los pocillos se lavan con tampón de lavado y se añade a los pocillos un anticuerpo monoclonal o policlonal ligado a enzimas que es específico para el biomarcador. Se realiza de nuevo un lavado y a continuación, se añade solución de sustrato a los pocillos. Posteriormente, se desarrolla color en proporción a la cantidad de polipéptido de la invención que se une en la primera etapa. El desarrollo de color se detiene utilizando una solución de parada y la intensidad del color se mide mediante un lector de microplacas.

En otras realizaciones, la supervisión del estado inmunitario de un sujeto puede llevarse a cabo utilizando, por ejemplo, un ensayo de flujo lateral. Tales ensayos de flujo lateral tienen el potencial de ser un método rentable, rápido, simple y sensible, por ejemplo, para ensayos de supervisión en el sitio. El ensayo de flujo lateral comprende un portador que permite que se produzca un flujo lateral, en donde la muestra o el reactivo de detección se desplaza de una localización sobre el portador a otra. Existen muchos formatos de ensayos de flujo lateral adecuados para usar en los métodos abarcados por la invención y el experto en la materia sabrá fácilmente cómo seleccionar y optimizar un formato particular. Un ejemplo de una prueba de tira de flujo lateral comprende, por ejemplo, los siguientes componentes: una almohadilla de muestra; una almohadilla absorbente en la que se aplica la muestra de prueba; una almohadilla de conjugado o reactivo que contiene anticuerpos específicos contra el analito diana y conjugado con partículas de color (normalmente partículas de oro coloidal o microesferas de látex); una membrana de reacción, habitualmente una membrana hidrófoba de nitrocelulosa o de acetato de celulosa sobre la que se inmovilizan anticuerpos antianalitos diana en una línea a través de la membrana como zona de captura o línea de prueba (también puede estar presente una zona de control, que contiene anticuerpos específicos para los anticuerpos conjugados); y una mecha o reservorio de desechos, una almohadilla absorbente adicional diseñada para extraer la muestra a través de la membrana de reacción mediante acción capilar y recogerla.

Hay una serie de variaciones en la tecnología de flujo lateral. La zona de captura en la membrana puede contener antígenos inmovilizados o enzimas, dependiendo del analito diana, en lugar de anticuerpos. También es posible aplicar múltiples zonas de captura para crear una prueba múltiple. Por ejemplo, en realizaciones particulares, las tiras de prueba son capaces de detectar BCMA o un fragmento del mismo y por separado en la misma muestra biomarcadores adicionales de una enfermedad específica, por ejemplo, mieloma múltiple, se contemplan por ejemplo, p2M, IL-6 , proteína reactiva con C y proteína monoclonal sérica. Los inmunoensayos de flujo lateral son fáciles de usar por operadores no entrenados y generalmente producen un resultado en 15 minutos. Son muy estables y robustos, tienen una larga vida útil y generalmente no requieren refrigeración. También son relativamente asequibles de producir. Estos rasgos los hacen ideales para su uso en el consultorio y para analizar muestras en el exterior, así como en el laboratorio.

Aunque la mayoría de los inmunoensayos de flujo solo son capaces de proporcionar un resultado cuantitativo, es posible obtener algún grado de cuantificación midiendo la cantidad de conjugado unida a la zona de captura. Esto puede realizarse utilizando un lector específico para medir la intensidad de la línea de prueba de color. Por ejemplo, la Neogen Corporation ha desarrollado el lector de flujo lateral Accuscan™ para usar con su gama de kits de ensayo Reveal® y Charm Sciences suministra también un lector para su gama de tiras de prueba Rosa®. También se han desarrollado técnicas más sofisticadas, tales como los conjugados marcados con tinte fluorescente, para mejorar el potencial cuantitativo de los ensayos de flujo lateral.

Un sistema de detección en un kit puede incluir, por ejemplo, en una cantidad suficiente para al menos un ensayo, una composición de anticuerpo policlonal o una composición de anticuerpo monoclonal que se une a BCMA o a un fragmento del mismo, como un reactivo envasado. Las instrucciones de uso del reactivo envasado normalmente también se incluyen.

Un sistema de detección en forma de kit también puede incluir, por ejemplo, un medio para combinar la muestra de prueba con un sistema tamponador (Reactivo 1) que contiene controladores de viscosidad y estabilizantes en un vaso de reacción y que mezcla la solución. Un sistema de detección en forma de kit también puede incluir un medio para leer un parámetro del vaso de reacción con la muestra y el tampón y medios adicionales para combinar la mezcla de la muestra de prueba y el tampón con un ligando marcado con fluorescencia (Reactivo 2) con dicha sustancia biológica en el vaso de reacción, mezclado la solución para producir una solución de ensayo. Asimismo, el Reactivo 2 puede sumistrarse al vaso de reacción sin volumen de dilución adicional de la solución de ensayo.

Como se utiliza en el presente documento, el término "envase" se refiere a una matriz o material sólido, tal como vidrio, plástico, papel, papel de aluminio y similares, capaces de contener dentro de límites fijos una composición de anticuerpos o una composición de anticuerpos monoclonales. Por tanto, por ejemplo, un envase puede ser un vial de vidrio utilizado para contener cantidades de miligramos de un polipéptido contemplado o puede ser un pocillo de placa de microtitulación a la que se han fijado operativamente cantidades de microgramos de un polipéptido contemplado o anticuerpo.

Las "instrucciones de uso" normalmente incluyen una expresión tangible que describe la concentración de reactivo o al menos un parámetro del método de ensayo, tal como las cantidades relativas de reactivo y muestra a mezclarse, períodos de tiempo de mantenimiento para mezclas de reactivo/muestra, temperatura, condiciones de tampón y similares.

En realizaciones particulares, un sistema de detección incluye adicionalmente un marcador o medios indicadores capaces de señalizar la formación de un complejo que contiene un polipéptido o una molécula de anticuerpo de la presente invención.

"Complejo" como se utiliza en el presente documento se refiere al producto de una reacción de unión específica, tal como una reacción de anticuerpo-antígeno o de receptor-ligando. Los complejos ilustrativos son productos de inmunorreacción.

Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "marcador" y "medios indicadores" en sus diferentes formas gramaticales se refieren a átomos y moléculas individuales que están implicados directa o indirectamente en la producción de una señal detectable para indicar la presencia de un complejo. Cualesquier marcador o medios indicadores puede(n) unirse o incorporarse a una proteína expresada, polipéptido o molécula de anticuerpo que sea parte de una composición de anticuerpos o de anticuerpos monoclonales o usarse separadamente y esos átomos o moléculas pueden utilizarse solos o junto con reactivos adicionales, tales marcadores son en sí bien conocidos en la química de diagnóstico clínico y constituyen una parte de esta divulgación solo en tanto se utilicen con métodos y/o sistemas de proteínas novedosos.

Los medios de marcaje pueden ser un agente marcador fluorescente que se une químicamente a anticuerpos o antígenos sin desnaturalizarlos para formar un fluorocromo (tinte), que es un indicador inmunofluorescente útil. Los agentes de marcaje fluorescente adecuados son fluorocromos tales como isocianato de fluoresceína (FIC, por sus siglas en inglés), isotiocianato de fluoresceína (FITC, por sus siglas en inglés), cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo (DANSC, por sus siglas en inglés), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC, por sus siglas en inglés), lisamina, cloruro de sulfonilo rodamina 8200 (RB 200 SC) y similares. Una descripción de la técnicas de análisis de inmunofluorescencia se encuentra en DeLucca, "Immunofluorescence Analysis", en Antibody As a Tool, Marchalonis, et al., eds., John Wiley and Sons, Ltd., págs. 189-231 (1982).

En determinadas realizaciones, el grupo indicador es una enzima, tal como peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés), glucosa oxidasa o similares. En tales casos donde el grupo indicador principal es una enzima, tal como HRP o glucosa oxidasa, se requieren reactivos adicionales para visualizar el hecho de que se haya formado un complejo de receptor-ligando (inmunorreactivo). Tales reactivos adicionales para HRP incluyen peróxido de hidrógeno y un tinte de oxidación precursor, tal como diaminobencidina. Un reactivo adicional útil con la glucosa oxidasa es el ácido 2,2'-amino-di-(3-etil-benztiazolina-G-sulfónico) (ABTS).

En otras realizaciones, el grupo indicador es una proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés).

Los elementos radiactivos también son agentes marcadores útiles y se utilizan de forma ilustrativa en el presente documento. Un agente de radiomarcaje ilustrativo es un elemento radiactivo que produce emisiones de rayos gamma. Los elementos que emiten rayos gamma por sí mismos, tales como 124I, 125I, 128I, 132I y 51Cr representan una clase de grupos indicadores de elementos radiactivos que producen emisiones de rayos gamma. Se prefiere particularmente el 125I. Otro grupo de medios marcadores útiles son los elementos tales como 11C, 18F, 15O y 13N, que emiten positrones por sí mismos. Los positrones emitidos de este modo producen rayos gamma tras encontrarse con electrones presentes en el cuerpo del animal. También es útil un emisor de beta, tal como 111indio o 3H.

La unión de marcadores, es decir, el marcaje de polipéptidos y proteínas, es bien conocida en la técnica. Por ejemplo, las moléculas de anticuerpos producidas por un hibridoma pueden marcarse mediante la incorporación metabólica de aminoácidos que contengan radioisótopos proporcionados como un componente del medio de cultivo. Véase, por ejemplo, Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981). Las técnicas de conjugación o acoplamiento de proteínas a través de grupos funcionales activados son particularmente aplicables. Véanse, por ejemplo, Aurameas, et al., Scand. J. Immunol., Vol. 8 Supl. 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech., 3:889-894 (1984) y la patente de Estados Unidos n.° 4.493.795.

Los sistemas o kits de detección pueden utilizarse en un formato "ELISA" para detectar, por ejemplo, la presencia o cantidad de BCMA o de un fragmento del mismo en una muestra de fluido corporal, tal como el torrente sanguíneo, plasma, suero, médula ósea o tejido, etc. "ELISA" se refiere a un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas que emplea un anticuerpo o un antígeno unido a una fase sólida y un conjugado de enzima-antígeno o de enzimaanticuerpo para detectar y cuantificar la cantidad de un antígeno o de un anticuerpo presente en una muestra. Por tanto, por ejemplo, un polipéptido, una composición de moléculas de anticuerpo o una composición de moléculas de anticuerpos monoclonales puede fijarse en una matriz sólida para formar un soporte sólido que comprende un envase en los sistemas de diagnóstico sujeto. El reactivo se fija normalmente en una matriz sólida mediante adsorción desde un medio acuoso, aunque pueden utilizarse otros modos de fijación, bien conocidos para los expertos en la técnica.

También son bien conocidas en la técnica matrices sólidas útiles. Tales materiales son insolubles en agua e incluyen dextrano reticulado; agarosa; perlas de perlas de poliestireno de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 5 milímetros de diámetro; cloruro de polivinilo, poliestireno, poliacrilamida reticulada, redes a base de nitrocelulosa o nailon tales como láminas, tiras o palas; o tubos, placas o los pocillos de una placa de microtitulación tales como las hechas de poliestireno o cloruro de polivinilo.

Las especies de reactivos, agente aglutinante específico marcado o reactivo de amplificación de cualquier sistema de detección descrito en el presente documento, pueden proporcionarse en solución, como una dispersión líquida o como un polvo sustancialmente seco, por ejemplo, en forma liofilizada. Cuando el indicador significa que es una enzima, el sustrato de la enzima puede proporcionarse también en un envase separado de un sistema. También pueden incluirse un soporte sólido tal como la placa de microtitulación descrita anteriormente y uno o más tampones, como elementos envasados por separado en este sistema de ensayo de detección.

Los materiales de envase analizados en el presente documento en relación con los sistemas de detección son los utilizados habitualmente en los sistemas de diagnóstico. Tales materiales incluyen botellas de vidrio y plástico (por ejemplo, polietileno, polipropileno y policarbonato), viales, sobres de plástico y laminados de plástico-papel de aluminio y similares. En algunas realizaciones, es útil un sistema de detección para ensayar la presencia de BCMA o de un fragmento del mismo. En determinadas realizaciones, tal sistema comprende, en forma de kit, un envase que contiene un anticuerpo para BCMA o un fragmento del mismo.

Ejemplos

Ejemplo 1: Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para la determinación de concentraciones de BCMA en suero y líquido sobrenadante a partir de cultivos de BMMC

Las muestras de suero y sobrenadante se analizaron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de BCMA, obtenido de R&D Systems, Mineápolis, Minnesota, Estados Unidos (catálogo n.° DY193E). Las muestras de suero se diluyeron 1:50 o 1:500 y el ensayo ELISA se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las placas de ELISA se analizaron utilizando un lector de placas pQuant (Biotek Industries, Winooski, Vermont, Estados Unidos) establecido en 450 nm con el software KC Junior. Los valores representan la media de muestras triplicadas en cada espécimen. Este kit ELISA de BCMA no reacciona de forma cruzada con APRIL o BAFF humanos recombinantes, TACI/Fc humano recombinante o BCMA/Fc de ratón recombinante o BCMA de ratón.

Experimento de bloqueo de anticuerpo (Ac) antiBCMA policlonal

Los estándares de antígenos de maduración de linfocitos B se incubaron con otro Ac antiBCMA humano de cabra policlonal (catálogo n.° AF193; R&D Systems) o Ac de control en concentración elevada (400 ng/ml) o baja (40 ng/ml) durante la noche a 4 °C. El Ac IgG de cabra policlonal se utilizó como un control de isotipo (catálogo n.° AB-108-C; R&D Systems). Los presentes inventores también ensayaron la capacidad de este Ac antiBCMA policlonal para bloquear la detección de BCMA del suero del Paciente de MM 1056, siguiendo una incubación durante la noche y los niveles de BCMA se calcularon utilizando el protocolo de ELISA de BCMA descrito anteriormente.

Detección de BCMA con un Ac antiBCMA monoclonal

Los estándares de antígenos de maduración de linfocitos B o el suero (diluido 1:50 O 1:500) de pacientes de MM se incubó(aron) utilizando un Ac antiBCMA humano monoclonal murino (catálogo n.° WH0000608M1; Sigma-Aldrich), en lugar del "Ac de captura" policlonal utilizado en el ELISA de BCMA. A continuación, las muestras se ensayaron de acuerdo con el protocolo de ELISA de BCMA.

Estudios de xenoinjertos de MM

Se obtuvieron ratones SCID de seis semanas de edad CB17 de Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, Estados Unidos). Los estudios de animales se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee. Para el tumor de LAGk-2 que expresa CD38 y CD138, una biopsia de MO (en inglés, BM) de un paciente de MM que muestra la paraproteína IgGK se implantó en la extremidad posterior de un ratón SCID (Campbell y Berenson, 2008). Los sueros de ratones que contienen el xenoinjerto no mostraron IgG humana o cadenas ligeras k libres; y por tanto, este xenoinjerto se caracterizó como no secretor. Sin embargo, se observaron cadenas k en el citosol de células tumorales utilizando tinción inmunohistoquímica (IHC, por sus siglas en inglés). El tumor LAGk-1A se desarrolló a partir de un paciente con un MM que produce IgGK resistente a lenalidomida (Campbell y Berenson, 2008). El tumor LAGA-1 se desarrolló a partir de un paciente de MM que mostró la paraproteína IgGA (Campbell y Berenson, 2008). Se extirparon los xenoinjertos, se seccionaron en piezas de 20-40 mm3 y se implantaron en el músculo. Siete días tras el implante del tumor, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento. Los animales se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron 2,5 cm de diámetro.

Se utilizó el inhibidor de proteosoma (IP) bortezomib (Millennium Pharmaceuticals, Cambridge, Massachusetts, Estados Unidos) como una solución madre de 1 mg/ml y se diluyó utilizando cloruro sódico (NaCl) al 0,9 %. Se administró Bortezomib i.v. a 0,75 mg/kg dos veces semanalmente. Se disolvió Ciclofosfamida (Florida Infusion, Palm Harbor, Florida, Estados Unidos) de una solución madre de 20 mg/ml con NaCl y se administró a 10 mg/kg por vía oral mediante sonda una vez semanalmente. Se disolvió Melphalan (Sigma-Aldrich) a 3 mg en 100 j l de Ácido-EtOH (47 |jl concentrado HCl y 1 ml EtOH al 100 %) y se diluyeron a 1 ml con solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) para generar una solución madre de 3 mg/ml. El fármaco se administró mediante inyección intraperitoneal (i.p.) dos veces semanalmente en una dosis de 3 mg/kg.

Los tumores se midieron utilizando calibres estándar y se aplicó la fórmula para un volumen elipsoide (4/3n x [anchura/2]2 x [longitud/2]). Las curvas de crecimiento tumoral y de IgG se analizaron en términos de las medias y el error típico de los grupos de tratamiento.

Los ratones se sangraron semanalmente a través del seno retroorbitario para determinar los niveles de IgG humana y de BCMA. Las muestras se centrifugaron a 10.000 rpm durante 5 min y se recogió el suero. El kit ELISA de IgG humana (Bethyl Laboratories, Montgomery, Tejas, Estados Unidos) se utilizó de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se determinó la absorbancia en 450 nm con una longitud de onda de referencia de 550 nm en un espectrofotómetro de microplacas jQuant con el software KC Junior (Bio-Tek Instruments, Winooski, Vermont, Estados Unidos). Se utilizó el kit ELISA de BCMA humano (R&D Systems) para determinar los niveles de proteína sérica.

Análisis inmunohistoquímico

La expresión de la proteína BCMA se determinó en MM y en BMMC normales y en los xenoinjertos de MM humanos de los inventores. Para los xenoinjertos, se cortaron secciones de 5 jm después de la fijación en paraformaldehído al 4% . Para las BMMC, las células se fijaron en paraformaldehído al 1% y se citocentrifugaron 1 x 105 células/portaobjetos. Los portaobjetos se bloquearon con Tween-20 PBS (PBST) al 0,05 % y albúmina de suero bovino al 3 % (BSA) durante 1 h a temperatura ambiente (TA). Las muestras se expusieron al Ac de antiBCMA humano (5 jg/m l) a 4 °C durante la noche. Los portaobjetos se lavaron tres veces con TBST y se trataron con peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpos antirratón, anticonejo o anticabra (KPL, Gaithersburg, Maryland, Estados Unidos) diluida 1:500 en TBST a TA durante 2 h. Los portaobjetos se lavaron tres veces en TBST y se colocaron en tampón de 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) durante 5 min y se detectó color utilizando un kit de AEC (Vector Laboratories, Burlingame, California, Estados Unidos). Para la tinción de la cadena ligera, se resuspendieron BMMC en 100 j l de PBS y se citocentrifugaron sobre portaobjetos. Las muestras se bloquearon con BSA al 3 % antes de que el Ac se añadiera para evitar la unión no específica. Se añadieron Ac anti-cadena ligera A humana de cabra (Sigma-Aldrich), Ac de anti-cadena ligera k humana (Sigma-Aldrich) o Ac de control de isotipo (R&D System) a las muestras correspondientes. Estos anticuerpos se incubaron durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, los anticuerpos se lavaron con tampón TBST 0,05 mol/l. A continuación, las muestras se trataron con H2O2 metanol al 10% antes del Ac secundario. A continuación, las muestras se incubaron con Ac anticabra de conejo marcado con peroxidasa (KPL) durante 2 h a TA y a continuación, se lavaron. El sustrato de peroxidasa (Vector Laboratories) se añadió a las muestras durante 30 min. Las células se tiñeron con hematoxilina durante 1 min y se montaron las muestras. La expresión de BCMA y de las cadenas ligeras A y k se determinó utilizando un microscopio óptico (Olympus BX51; Olympus, San Diego, California, Estados Unidos). La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) se realizó sobre las BMMC utilizando procedimientos de tinción estándar.

Análisis estadísticos

La significación estadística de las diferencias observadas en los estudios de sobrenadante, suero e injerto se determinó usando una prueba t de Student. El nivel de significación mínima fue p < 0,05. El análisis estadístico se determinó ^usando PRiSm ^{versión 4.03 de GRAPHPAD para Windows (GraphPad Software, San Diego, California, Estados}Unidos).

Ejemplo 2: Se encuentra BCMA en el suero de sujetos de control humanos y de un paciente con una IgG baja

Se obtuvo suero de pacientes con IgG baja y de sujetos de control sanos humanos y se analizó en cuanto a la presencia de BCMA. Un sujeto con niveles de IgG bajos tuvo niveles de BCMA séricos bajos (14,6 ng/ml) en comparación con los niveles de BCMA séricos (mediana=36,0 ng/ml; intervalo=13,45 ng/ml-958,1 ng/ml) en sujetos de control (N=104).

Ejemplo 3: Niveles de IgG séricos de pacientes con MM IgA que han logrado una remisión completa basada en sus niveles de BCMA séricos

Se obtuvo suero de pacientes con mieloma múltiple (MM) de IgA que han logrado una remisión completa (RC) y se analizaron los niveles de IgG y BCMA séricos. Los niveles de IgG de pacientes con MM IgA que han logrado la RC con mieloma no mensurable se correlacionan con sus niveles de BCMA séricos. Los pacientes de MM IgA (N=23) que están en RC que muestran BCMA séricos bajos (<10 ng/ml; p<0,0001) tienen niveles de IgG significativamente disminuidos (mediana=319,0 mg/dl) en comparación con niveles de IgG (mediana=535,0 mg/dl) entre pacientes de MM IgG (N=40) que están en RC y muestran BCMA séricos mayores (>10 ng/ml; p<0,0001).

Ejemplo 4: Niveles de IgG séricos de pacientes con MM IgG que han logrado una remisión completa basada en sus niveles de BCMA séricos

Se obtuvo suero de pacientes con MM IgG que han logrado RC y se analizaron los niveles de IgG y BCMA séricos. Los niveles de IgG de pacientes con MM IgG que han logrado la RC con mieloma no mensurable se correlacionan con sus niveles de BCMA séricos. Los pacientes de MM IgG (N=47) que están en RC que muestran BCMA séricos bajos (<10 ng/ml; p<0,0001) tienen niveles de IgG significativamente disminuidos (mediana=402,0 mg/dl) en comparación con niveles de IgG (mediana=643,5 mg/dl) entre pacientes de MM IgG (N=84) que están en RC y muestran BCMA séricos mayores (>10 ng/ml; p<0 ,0001).

Ejemplo 5: Niveles de IgA séricos de pacientes con MM IgG que han logrado una remisión completa basada en sus niveles de BCMA séricos

Se obtuvo suero de pacientes con MM IgG que han logrado RC y se analizaron los niveles de IgA y BCMA séricos. Los niveles de IgA no implicados normales de pacientes con MM IgG que han logrado la RC se correlacionan con sus niveles de BCMA séricos. Los pacientes de MM IgG (N=47) que están en RC y de niveles de BCMA séricos bajos (<10 ng/ml; p<0,0001) tienen niveles de IgA significativamente disminuidos (mediana=26,0 mg/dl) en comparación con niveles de IgA (mediana=61,0 mg/dl) en pacientes de MM IgG (N=84) que están en RC y muestran BCMA séricos mayores (>10 ng/ml; p<0 ,0o01).

Ejemplo 6: Niveles de IgM séricos de pacientes con MM IgG que han logrado una remisión completa basada en sus niveles de BCMA séricos

Se obtuvo suero de pacientes con MM IgG que han logrado RC y se analizaron los niveles de IgM y BCMA séricos. Los niveles de IgM no implicados normales de pacientes con MM IgG que han logrado la RC se correlacionan con sus niveles de BCMA séricos. Los pacientes de MM IgG (N=47) que están en RC y que muestran BCMA séricos bajos (<10 ng/ml; p<0,0001) tienen niveles de IgM significativamente disminuidos (mediana=11,0 mg/dl) en comparación con niveles de IgM (mediana=32,5 mg/dl) en pacientes de MM IgG (N=84) que están en RC y muestran BCMA séricos mayores (>10 ng/ml; p<0 ,0001).

Ejemplo 7: Niveles de BCMA séricos de pacientes basados en el diagnóstico de inmunodeficiencia

Se obtuvo suero de pacientes con enfermedades de inmunodeficiencia y de sujetos de control sanos humanos y los niveles de BCMA séricos se analizaron y compararon. Los niveles de BCMA séricos fueron sustancialmente inferiores en pacientes con inmunodeficiencia (x La , CVID, deficiencia de IgG, deficiencia de IgA, deficiencia de IgM, síndrome de hiperIgM, PRH o enfermedad de Crohn), en comparación con los niveles de BCMA séricos en sujetos de control.

Ejemplo 8: Niveles de BCMA séricos de pacientes con inmunodeficiencia frente a donantes sanos normales

Se obtuvo suero de pacientes con enfermedades de inmunodeficiencia y de donantes sanos normales y los niveles de BCMA séricos se analizaron y compararon. Los niveles de BCMA séricos de pacientes con inmunodeficiencia (N=68) fueron significativamente inferiores (7,3 ng/ml (intervalo; 0,84 ng/ml -189,5 ng/ml); p<0,0001) en comparación con los niveles de BCMA séricos (35,2 ng/ml (intervalo; 12,2 ng/ml - 958,1 ng/ml); p<0,0001) en donantes sanos normales (N=119).

Ejemplo 9: Niveles de BCMA séricos de pacientes basados en el diagnóstico de inmunodeficiencia

Se obtuvo suero de pacientes con enfermedades de inmunodeficiencia y de sujetos de control sanos humanos y los niveles de BCMA séricos se analizaron y compararon. Los niveles de BCMA séricos fueron sustancialmente inferiores en pacientes con inmunodeficiencia (XLA, CVID, CVID linfoma, CVID linfoma de Tx, deficiencia de IgG, deficiencia de IgA, deficiencia de IgM, síndrome de hiperIgM, PI3KD, LRBA/LRBA o timoma), en comparación con los niveles de BCMA séricos en sujetos de control.

Ejemplo 10: Niveles de BCMA séricos de pacientes basados en el diagnóstico de inmunodeficiencia

Se obtuvo suero de pacientes con enfermedades de inmunodeficiencia y de sujetos de control sanos humanos y los niveles de BCMA séricos se analizaron y compararon. Los niveles de BCMA séricos fueron sustancialmente inferiores

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de supervisión del estado inmunitario de un sujeto, que comprende:

(a) detectar una cantidad de polipéptido de BCMA en una muestra biológica que se ha obtenido del sujeto; y (b) comparar la cantidad de polipéptido de BCMA detectado en (a) con un valor límite predeterminado o con una cantidad detectada en una muestra de suero de control, en donde una cantidad disminuida del polipéptido de BCMA en la muestra biológica del sujeto, en comparación con el valor límite predeterminado o con la cantidad en la muestra de suero o plasma de control, es indicativa de un sistema inmunitario deteriorado como resultado de una enfermedad de inmunodeficiencia seleccionada del grupo que consiste en: agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (XLA), deficiencia inmunitaria variable común (CVID), deficiencia de IgG, deficiencia de IgM o síndrome de hiperIgM, en donde la muestra biológica es una muestra de suero o plasma o sobrenadante obtenido de un cultivo de las células mononucleares de médula ósea o de células mononucleares de sangre periférica del sujeto y en donde el polipéptido de BCMA comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 75, un 80 o un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de BCMA o un fragmento del mismo se detecta utilizando un sistema de detección seleccionado del grupo que consiste en: una inmunohistoquímica, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo enzimático (ElA), inmunoensayo de fluorescencia (FIA), inmunoensayo de luminiscencia (LIA), ensayo de flujo lateral o ensayo de tira.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el sistema de detección es un ensayo de flujo lateral.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la detección se realiza utilizando un anticuerpo específico para el polipéptido de BCMA.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo específico para el polipéptido de BCMA es un anticuerpo monoclonal o policlonal.

6. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la cantidad de polipéptido de BCMA en la muestra biológica del sujeto es al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces o inferior, en comparación con el valor límite predeterminado o con la cantidad en la muestra de suero o plasma de control.