ES2897575T3

ES2897575T3 - Método y sistema para formar imágenes de una hebra molecular

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Publication number: ES2897575T3
Application number: ES14731835T
Authority: ES
Inventors: Gijs Jan Lodewijk Wuite; Erwin Johannes Gerard Peterman; Iddo Heller; Gerrit Sitters; Andrea Candelli; Stefan Walter Hell
Original assignee: Lumicks DSM Holding BV
Current assignee: Lumicks DSM Holding BV
Priority date: 2013-06-03
Filing date: 2014-06-02
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2034-06-02
Also published as: WO2014196854A1; EP3004848A1; EP3957983A1; US20160139050A1; US9766180B2; EP3004848B1; EP3957983B1

Abstract

Método para obtener imágenes de una hebra molecular (MS), el método comprende - proporcionar un volumen de muestra (SV) que comprende la hebra (MS) con perlas de captura (BD) unidas en extremos opuestos de la hebra (MS); y - proporcionar un haz de excitación (EB) que tiene un foco de excitación (EF) en el volumen de muestra (SV) en el que una excitación de un fluoróforo (FL) en la hebra (MS) por el foco de excitación (EF) da como resultado una respuesta de fluorescencia (FR) cuando el foco de excitación (EF) coincide con el fluoróforo (FL); caracterizado porque el método comprende además las siguientes etapas: - explorar el foco de excitación (EF) en el volumen de muestra (SV) a lo largo de una línea de exploración unidimensional (SL); - proporcionar trampas ópticas (OT), capturar las perlas de captura (BD) en los extremos de la hebra (MS) en el volumen de muestra (SV) y extender la hebra (MS) entre las trampas ópticas (OT) para formar una línea de captura dimensional (LL) paralela a la línea de exploración unidimensional (SL); - alinear la línea de captura unidimensional (LL) para que coincida con la línea de exploración unidimensional (SL) para que el foco de excitación de exploración (EF) coincida con la hebra (MS); y - registrar la respuesta de fluorescencia (FR) en función de una pluralidad de posiciones de exploración distintas (X0) del foco de excitación (EF) a lo largo de la línea de exploración unidimensional (SL).

Description

DESCRIPCIÓN

Método y sistema para formar imágenes de una hebra molecular

Campo técnico y antecedentes

La presente divulgación se refiere a un método y sistema para formar imágenes de una hebra molecular, por ejemplo, un complejo molecular como el ADN.

La interacción entre ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN y ARN) y proteínas juega un papel importante en la biología molecular de la célula, siendo el núcleo de la replicación, transcripción, organización y reparación del ADN. No solo es importante comprender estos procesos para comprender la vida en sí misma; también se desea para generar conocimientos clave sobre los mecanismos de la enfermedad. La microscopía de fluorescencia y la espectroscopía de fuerza con pinzas ópticas son dos pilares de la investigación de una sola molécula.

Las pinzas ópticas se utilizan para medir las propiedades mecánicas y estructurales globales de los complejos ADN-proteína. Estas medidas pueden estar relacionadas con emisiones fluorescentes coincidentes. Por ejemplo, Lang et al. (Nat. Methods 1,2004, 133-139) describen la captura óptica coincidente y simultáneo y la fluorescencia de una sola molécula en los que se sondean las transiciones mecánicas en la estructura del ADN analizando las fluctuaciones en la intensidad de la fluorescencia dentro de un volumen confocal fijo.

La microscopía de fluorescencia puede proporcionar información estructural local. Por ejemplo, Candelli et al. (Phys. Chem. Chem. Phys., 2011, 13, 7263-7272) describen un método que integra la captura óptica con microfluidos y microscopía de fluorescencia de molécula única para estudiar interacciones de proteínas heterogéneas/complejas. Esta combinación de microscopía de fluorescencia de campo amplio y pinzas ópticas permite la localización de proteínas marcadas en ADN estirado ópticamente con una precisión inferior a 10 nm (nanómetros) a tensiones superiores a 1 pN (pico-Newton).

El documento US 2011/0201509 A1 de Tegenfeldt divulga un método para el mapeo de la relación AT/GC local a lo largo del ADN en el que el ADN se desnaturaliza para fundir parcialmente una molécula de ADN de doble hebra dependiendo, por ejemplo, en temperatura. El método incluye teñir el ADN con un tinte fluorescente, cuya emisión es sensible a si el ADN es de cadena sencilla o de cadena doble. El ADN se introduce con un flujo en un dispositivo de nanocanales que, si es necesario, estira el ADN para evitar la superposición de diferentes segmentos de la molécula. La herramienta básica para observar el patrón resultante del ADN es la microscopía de fluorescencia estándar limitada por difracción. Una vez que se adquieren películas sin procesar de moléculas desnaturalizadas, se utiliza un programa de software para alinear el patrón de fluorescencia del código de barras en las imágenes en función del tiempo.

El documento US 2012/0002031 A1 de Pertsinidis divulga un microscopio que proporciona una resolución subnanométrica en mediciones de distancias a escala molecular utilizando ópticas de formación de imágenes de fluorescencia de campo lejano. Este rendimiento se logra mediante el control de retroalimentación de la posición de las moléculas fluorescentes individuales, lo que permite la recolección de > 106 fotones bloqueados en la misma posición. El sistema de formación de imágenes se calibra mediante el barrido de línea de un emisor fluorescente y la corrección de imperfecciones a escalas de píxeles y subpíxeles comparando la posición de la imagen de fluorescencia y el desplazamiento conocido de la muestra, utilizando una etapa de traducción piezoeléctrica de precisión sub-nm. Se ilustra una disposición de muestra en la que un extremo de una molécula de ADN se une a una superficie y el otro extremo se mantiene en una trampa óptica.

El documento US 2011/0300490 A1 de Rachet et al. se refiere a configuraciones de fotolitografía y microscopía de alta resolución de campo grande que operan con luz policromática. Incluye el uso de una pluralidad de microespejos de enfoque. Su principal aplicación dirigida en el dominio de la microscopía de alta resolución sería la microscopía confocal de barrido paralelo, con especial énfasis en las aplicaciones de luz policromática.

El documento WO 2005/0114151 A1 describe un sistema de medición para medir una respuesta que ocurre en una célula o similar cuando, por ejemplo, una célula o una biomolécula es estimulada por una fuerza o estimulada por una sustancia química. La figura 11 de esta técnica anterior ilustra un diagrama que muestra el estado en el que el sistema de microscopio de la figura 10 mantiene dos partículas finas y se miden el alargamiento del ADN y la interacción con la proteína del ADN.

Todavía existe el deseo de un método y sistema que proporcione un control y una precisión mejorados para la formación de imágenes de una hebra molecular.

Resumen

La presente invención está dirigida a un método y sistema para obtener imágenes de una hebra molecular como se define en las reivindicaciones independientes 1 y 11 adjuntas. Se definen realizaciones particulares en las reivindicaciones dependientes adjuntas.

Un primer aspecto de la presente divulgación proporciona un método para obtener imágenes de una hebra molecular con perlas de captura unidas en extremos opuestos de la hebra, el método comprende proporcionar un volumen de muestra que comprende la hebra que proporciona un haz de excitación que tiene un foco de excitación en el volumen de muestra en el que una excitación de un fluoróforo en la hebra por el foco de excitación da como resultado una respuesta de fluorescencia cuando el foco de excitación coincide (es decir, se superpone) con el fluoróforo; explorar el foco de excitación en el volumen de la muestra a lo largo de una línea de exploración unidimensional; proporcionar trampas ópticas, capturarlas perlas de captura en los extremos de la hebra en el volumen de muestra y extender la hebra entre las trampas ópticas para formar una línea de captura unidimensional paralela a la línea de exploración unidimensional; alinear la línea de captura para que coincida con la línea de exploración unidimensional para que el foco de excitación de exploración coincida con la hebra; y registrar la respuesta de fluorescencia en función de una pluralidad de posiciones de exploración distintas del foco de excitación a lo largo de la línea de exploración unidimensional.

Al extender la hebra molecular a lo largo de una línea de captura recta (unidimensional), explorar un haz de sonda a lo largo de una línea de exploración paralela a la línea de captura unidimensional y alinear la línea de captura unidimensional y la línea de exploración unidimensional para que coincida, se pueden obtener imágenes de hebra molecular con precisión de una manera controlada y reproducible. Se reconoce que la captura y la exploración unidimensionales están diseñados específicamente para obtener imágenes de una hebra molecular que puede considerarse un objeto unidimensional para fines de imágenes. Debido a que solo se explora la dimensión de la hebra molecular, la exploración se puede controlar mejor, la imagen es más precisa y más rápida. En contraste, la técnica anterior de, por ejemplo, los documentos US 2011/0201509 A1 y US 2012/0002031 A1 se basan esencialmente en imágenes de fluorescencia bidimensionales y no en una línea de exploración unidimensional. La mención de la microscopía STED no implica una exploración unidimensional a lo largo de una línea de captura o de otro modo. En particular, se observa que STED se usa convencionalmente para producir imágenes bidimensionales como se describe, por ejemplo, en los artículos de Donnert et al. (PNAS, parte 103, No. 31, por ejemplo, 11440) y Gael Moneran et al. (Optics Express, parte 18, No. 2, página, 1302).

El uso de una línea de exploración unidimensional también proporciona ventajas adicionales. Por ejemplo, al explorar repetidamente el foco de excitación hacia adelante y hacia atrás a lo largo de la línea de exploración, la respuesta de fluorescencia se puede registrar en función de que la señal se puede integrar en múltiples exploraciones para aumentar la señal. Alternativamente o adicionalmente, la señal también se puede registrar en función del tiempo para rastrear los cambios de la cadena molecular o del complejo molecular.

Al proporcionar un segundo haz que disminuye la dispersión espacial de los fluoróforos excitados mediante el agotamiento de la emisión estimulada (STED) del fluoróforo, la resolución de la formación de imágenes se puede mejorar más allá del límite de difracción, por ejemplo, también dependiendo de la potencia en el haz STED (ver más abajo). Sin embargo, el tamaño de enfoque efectivo más pequeño puede proporcionar dificultades adicionales en la alineación del haz. Al proporcionar al perfil de agotamiento una franja o plano de intensidad mínima que se extiende en una dirección perpendicular a la línea de captura, a diferencia de un perfil de agotamiento en forma de rosquilla redonda, se puede disminuir la sensibilidad a la desalineación del haz, en particular para la exploración unidimensional de la hebra que se describe actualmente. Al tener un perfil STED en forma de línea o plano perpendicular a la dirección de la hebra extendida, las fluctuaciones en el posicionamiento del haz y/o hebra en dicha dirección perpendicular pueden tener una influencia menor o insignificante sobre la señal de fluorescencia.

Mediante el uso de trampas ópticas para sujetar la hebra molecular, se mejora el control de la alineación. Las trampas ópticas están alineadas para que la línea de captura unidimensional entre las perlas capturadas coincida con la línea de exploración unidimensional. Ventajosamente, las trampas ópticas que sostienen los extremos opuestos de la hebra pueden usarse para manipular libremente el ángulo y la posición de la línea de captura unidimensional en un espacio tridimensional. En particular, las trampas ópticas con la hebra entre ellas se pueden colocar para que sean paralelas y coincidan completamente con una línea de exploración unidimensional.

Se observa que ni los nanocanales del documento US 2011/0201509 A1 ni la trampa óptica única del documento US 2012/0002031 A1 permiten la manipulación libre de la hebra en un espacio tridimensional. Si bien el documento US 2011/0201509 A1 menciona pinzas ópticas, no se detalla cuántas o por qué deberían implementarse. Por ejemplo, la fuerza y/o el calor generado por las pinzas ópticas pueden influir en la desnaturalización en la que se basa esta técnica anterior (esto también se aplicaría a un punto focal de exploración).

Un método para la alineación (en Z) comprende grabar una serie de imágenes bidimensionales de la hebra teñida para diferentes posiciones axiales de las trampas ópticas con respecto a la línea de exploración. Los inventores encuentran que al minimizar el grosor de la línea de la hebra (XY) en las imágenes y/o al maximizar el contraste de la hebra en las imágenes mientras se varía la posición del plano del objeto con respecto a la línea de captura (en Z), se puede encontrar una superposición óptima entre la línea de captura y la línea de exploración. Ventajosamente, las trampas ópticas pueden permitir además ajustar y medir la fuerza de tracción ejercida sobre el cordón. Los inventores encuentran que al ejercer una fuerza de tracción en la hebra lo suficientemente grande como para suprimir las fluctuaciones brownianas por debajo de la resolución de la imagen (en el caso del ADN Lambda, de una longitud de 16.4 de más de 5 pN, preferiblemente más de 10 pN, la resolución de la imagen (Medio máximo de ancho completo de la señal grabada - FWHM) se puede mejorar, en particular, la resolución se puede optimizar junto con la mejora del haz STED.

Sin desear ceñirse a ninguna teoría, los inventores reconocen que la resolución final puede depender de la resolución óptica (potencia STED, longitud de onda de la luz utilizada, tipo de tamaño del microagujero del lente objetivo, etc.); en la rigidez de la hebra (la longitud de la hebra, estructura molecular, etc.); en la posición de las características de la imagen a lo largo de la hebra; y sobre la tensión (temperatura, rigidez de trampas, etc.). Por ejemplo, la fluctuación térmica de la hebra desenfoca las imágenes de las características de la hebra. Este desenfoque deteriora la resolución efectiva de las imágenes a un valor que es peor que la resolución óptica. La resolución efectiva se puede mejorar aplicando tensión a la hebra para suprimir sus fluctuaciones térmicas. En particular, para mejorar la resolución efectiva de las imágenes de la hebra a un valor mejor que el límite de difracción (por ejemplo, mediante la técnica STED), los inventores encuentran que es necesario ejercer una fuerza de tracción. Se observa que la FWHM efectiva (= resolución) disminuye con la tensión. La resolución es solo por difracción limitada a alta tensión. Por ejemplo, la precisión de la localización puede mejorar con la tensión hasta una precisión de aproximadamente 10 nm. La precisión de localización puede ser mejor que el límite de difracción. Se observa que existe una diferencia importante entre “resolución” y “precisión de localización”: la resolución se refiere directamente a la distancia más cercana entre dos objetos con imágenes para los cuales uno puede todavía distinguir esos dos objetos. La precisión de la localización, por otro lado, se relaciona con la precisión con la que se puede localizar la posición de un objeto promediando múltiples medidas de su ubicación con una determinada resolución. Este promedio permite localizar con una precisión superior a la resolución. La diferencia crucial es que la localización solo funciona para objetos aislados. Si un segundo objeto está presente a una distancia más cercana que la resolución, y los dos objetos se visualizan al mismo tiempo, entonces uno ya no puede distinguir los dos objetos y, por lo tanto, no puede localizarlos. La presente técnica permite distinguir dos objetos que están más cerca del límite de difracción, con la condición de que se pueda aplicar una tensión lo suficientemente grande como para suprimir las fluctuaciones térmicas de la hebra. Se apreciará que esto es bastante diferente de las técnicas conocidas, por ejemplo, como se describe en el artículo mencionado anteriormente de Candelli et al., y proporciona una clave para la capacidad de ir a densidades más altas de objetos en el ADN.

Actualmente se reconoce que la precisión de localización de los fluoróforos y/o la resolución temporal se puede mejorar mediante una exploración lateral 1D usando una forma STED (forma STED de raya o rosquilla). Sin desear ceñirse a la teoría, los inventores encuentran que la precisión de localización ^ X de una característica (por ejemplo, proteína fluorescente en una hebra de ADN) debido a escalas de ruido de recuento de fotones como, ^ X a FWHM/^W^otones en el que FWHM es la resolución de imagen (ancho completo, la mitad máxima de las características registradas) y Nfotones es el número de fotones registrados de la función. Si se obtiene una imagen de un fluoróforo mediante STED explorado por ID, Nfotones se escala como FWHM, asumiendo la misma amplitud máxima. Cuando esta escala se incluye en la fórmula anterior, obtenemos ^X a FWHM/VFWHM = VFWHM. En consecuencia, los inventores encuentran que al disminuir la FWHM, se puede mejorar la precisión de localización, o mejorar la resolución temporal para una precisión de localización dada porque se necesitan menos fotones para obtener la misma precisión. Por el contrario, cuando se utiliza exploración 2D con una dona STED y localización 2D, Nfotones se escala como FWHM2, por lo tanto, ^ X a FWHM/V FWHM2 a 1, es decir, independiente de FWHM, y no se espera una mejora en la precisión de localización de los fluoróforos y/o resolución temporal.

Mediante el uso de una configuración confocal, se puede filtrar la luz de fondo que se origina lejos del plano focal (plano del objeto). Capturando y extendiendo toda la hebra en el plano focal, la hebra se puede visualizar sin mover el plano focal con un rechazo de fondo mejorado, por ejemplo, proteínas etiquetadas (fluoróforos) en el fondo. De manera ventajosa, la hebra no tiene que moverse a otra ubicación donde no hay proteínas presentes en solución, o estas proteínas no necesitan ser eliminadas. Esto permite mediciones de la hebra en concentraciones más altas de proteínas marcadas, por ejemplo, un factor 100 veces mayor que con imágenes de campo amplio, imitando mejor las condiciones in vivo.

Un segundo aspecto de la presente divulgación proporciona un sistema para obtener imágenes de una hebra molecular, el sistema comprende una celda de muestra dispuesta para proporcionar un volumen de muestra que comprende la hebra; una fuente de luz de excitación dispuesta para proporcionar un haz de excitación que tiene un foco de excitación en el volumen de muestra en el que una excitación de un fluoróforo en la hebra por el foco de excitación da como resultado una respuesta de fluorescencia cuando el foco de excitación coincide con el fluoróforo; un escáner de haz dispuesto para explorar el foco de excitación en el volumen de muestra a lo largo de una línea de exploración unidimensional; una trampa dispuesta para capturar un extremo de la hebra en el volumen de muestra y extender la hebra a lo largo de una línea de captura unidimensional paralela a la línea de exploración; en el que la trampa comprende una fuente de luz de captura y una óptica de haz de captura dispuesta para proporcionar trampas ópticas que capturan perlas unidas en extremos opuestos de la hebra, en el que las trampas ópticas están dispuestas para formar la línea de captura unidimensional entre las perlas; un alineador de haz dispuesto para alinear la línea de captura unidimensional para que coincida (es decir, se superponga) con la línea de exploración unidimensional para que el foco de excitación de exploración coincida con la hebra; y un detector de fluorescencia dispuesto para registrar la respuesta de fluorescencia en función de una pluralidad de posiciones de exploración distintas del foco de excitación a lo largo de la línea de exploración unidimensional; y un procesador programado para proporcionar un modo de exploración en el que el procesador controla la trampa para extender la hebra a lo largo de una línea de captura unidimensional en la primera dirección; el procesador controla el alineador de haz para que la línea de captura unidimensional coincida con la línea de exploración unidimensional; el procesador controla el escáner de haz para explorar el foco de excitación a lo largo de la línea de exploración unidimensional; el procesador recibe la respuesta de fluorescencia registrada del detector de fluorescencia; y el procesador almacena la respuesta de fluorescencia en función de la posición del foco de excitación a lo largo de la línea de exploración unidimensional.

El sistema está dispuesto para realizar el método de acuerdo con el primer aspecto para proporcionar ventajas similares.

Breve descripción de los dibujos

Estas y otras características, aspectos y ventajas del aparato, los sistemas y los métodos de la presente divulgación se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción, las reivindicaciones adjuntas y los dibujos adjuntos en los que:

La Figura 1A ilustra una realización de un sistema y método para formar imágenes de una hebra molecular;

La Figura 1B muestra una ilustración de la hebra sujeta por trampas ópticas;

La Figura 2 ilustra imágenes fluorescentes para alinear la hebra;

La Figura 3A muestra una realización de un instrumento de pinzas ópticas.

La Figura 3B muestra una realización de un microscopio confocal;

La Figura 4A-B muestra realizaciones para realizar STED;

La Figura 5A-B ilustra la influencia de la fuerza de tensión en la resolución de la imagen usando STED;

La Figura 6A-C muestra los efectos de inclinar una ventana de muestra;

La Figura 7A muestra una configuración esquemática de un sistema de flujo;

La Figura 7B muestra esquemáticamente una pluralidad de flujos laminares separados;

La Figura 8 muestra una realización de un sistema que puede programarse para formar imágenes de un complejo de hebra molecular;

La Figura 9A-H ilustra datos experimentales de espectroscopía de fuerza y microscopía de fluorescencia confocal; La Figura 10A-I ilustra la caracterización de la nanoscopia STED de proteínas en ADN estirado ópticamente;

La Figura 11A-D ilustra la caracterización de la precisión de localización;

La Figura 12A-F ilustra la dinámica de unión y difusión de TFAM en ADN ópticamente estirado;

La Figura 13A-C ilustra la nanoscopia STED de ADN que está densamente recubierto con TFAM.

Descripción de realizaciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos (incluidos los términos técnicos y científicos) utilizados en este documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece esta invención como se lee en el contexto de la descripción y los dibujos. Se entenderá además que los términos, como los definidos en los diccionarios de uso común, deben interpretarse como si tuvieran un significado que sea consistente con su significado en el contexto del arte pertinente y no se interpretarán en un sentido idealizado o demasiado formal a menos que sea expresamente así definido en el presente documento. En algunos casos, se pueden omitir descripciones detalladas de dispositivos y métodos bien conocidos para no oscurecer la descripción de los sistemas y métodos presentes. La terminología utilizada para describir realizaciones particulares no pretende limitar la invención. Como se usa en el presente documento, las formas singulares “un”, “una” y “el” pretenden incluir las formas plurales también, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término “y/o” incluye todas y cada una de las combinaciones de uno o más de los elementos enumerados asociados. Se entenderá que los términos “comprende” y/o “que comprende” especifican la presencia de características indicadas, pero no excluyen la presencia o adición de una o más características adicionales. Se entenderá además que cuando una etapa particular de un método se denomina posterior a otra etapa, puede seguir directamente a dicha otra etapa o se pueden llevar a cabo uno o más etapas intermedias antes de llevar a cabo la etapa particular, a menos que se especifique lo contrario.

Asimismo, se entenderá que cuando se describe una conexión entre estructuras o componentes, esta conexión puede establecerse directamente o mediante estructuras o componentes intermedios a menos que se especifique lo contrario.

Se observa que, por coherencia, se utilizará un sistema de coordenadas cartesiano tridimensional con coordenadas X, Y, Z a lo largo de la descripción. El eje X se define como el eje paralelo a la hebra molecular o la línea de captura. El término “hebra” como en “hebra molecular” se refiere a una estructura o complejo esencialmente unidimensional, tal como una hebra de ADN que puede disponerse a lo largo del eje X. Por supuesto, la aplicación de la divulgación no está restringida al ADN, pero también se pueden imaginar aplicaciones a otras moléculas lineales o ensamblajes moleculares, que incluyen, pero no se limitan a, proteínas, polisacáridos, polímeros orgánicos, nanotubos de carbono y materiales inorgánicos fibrosos. Cuando se obtienen imágenes de la hebra molecular, también se pueden obtener imágenes de las moléculas que se unen a la hebra (por ejemplo, proteínas). El plano XY es el plano del objeto que se va a captar y generalmente es transversal a los haces entrantes y se capta en el detector. El eje Z es perpendicular al plano del objeto. El sistema de coordenadas XYZ se utiliza con fines ilustrativos únicamente para explicar mejor el posicionamiento y la orientación relativos. Por supuesto, también se pueden usar otros marcos de referencia y sistemas de coordenadas sin apartarse del presente alcance de la presente invención, que se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Un aspecto de la presente divulgación proporciona un método e instrumento que permite el estudio de interacciones ácido nucleico-proteína en tiempo real en condiciones de la vida real (ADN densamente cubierto con proteínas y alta concentración de proteínas presentes en solución). Permite la visualización directa de interacciones ADN-proteína en tiempo real, a nivel de molécula única, con resolución de sub-difracción, en condiciones similares al entorno celular. Con este método, los investigadores pueden manipular y medir las propiedades mecánicas y estructurales de los complejos de ADN-proteína, al mismo tiempo que realizan una visualización de súper resolución, lo que permite distinguir entidades en separaciones por debajo del límite de difracción y localizar estas entidades con una resolución espacio-temporal mejorada.

Las ventajas proporcionadas por la práctica de las presentes enseñanzas pueden incluir:

- La capacidad de visualizar y localizar proteínas individuales marcadas con fluorescencia unidas a una sola molécula de ADN mantenida suspendida en solución. Las proteínas individuales en el ADN se pueden resolver con una resolución por debajo de 50 nm: una mejora de al menos 6 veces con respecto a la microscopía de fluorescencia convencional en las mismas condiciones

- La posibilidad de realizar experimentos en condiciones que imiten la situación celular real, como una densa cobertura de proteína de ADN y altas concentraciones de proteína en solución, sin pérdida de señal o resolución;

- Las moléculas de ADN individuales se pueden manipular con alta precisión (resolución de fuerza sub-pico-Newton), mientras que su extensión se puede controlar con precisión nanométrica;

- El uso de exploración de línea rápida a lo largo del ADN permite obtener imágenes de alta velocidad, lo que permite la observación de la dinámica de las proteínas en el ADN a una resolución de tiempo alta (por ejemplo, menos de 50 ms).

Esta metodología no solo mejora la calidad de los datos obtenidos, sino que también hace posible una nueva clase de experimentos de relevancia biológica. Permite cerrar la brecha entre los experimentos idealizados de una sola molécula (baja concentración de proteínas en soluciones y pocas proteínas unidas al ADN) y experimentos realistas in vivo, por ejemplo, alta densidad de proteínas en el ADN en solución. La combinación de diferentes tecnologías de investigación en una plataforma integrada puede proporcionar el futuro de la investigación biológica cuantitativa, centrada en desentrañar los mecanismos completos y detallados de las interacciones ADN-proteína. En un ejemplo, los métodos divulgados actualmente combinan el campo de microscopía de superresolución con el campo de espectroscopía de fuerza de una sola molécula. Esta combinación no solo mejora drásticamente la calidad de los datos obtenidos, de hecho, permite una nueva clase de experimentos de relevancia biológica: el método permite la experimentación a alta densidad de proteínas, como se encuentra en la célula, pero con la resolución y funcionalidad de técnicas de una sola molécula (medición de fuerza). Esta nueva capacidad permite al método cerrar la brecha entre los experimentos idealizados de una sola molécula y los experimentos realistas in vivo. Esta importante combinación de campos de investigación puede formar el futuro de la investigación biológica cuantitativa centrada en desentrañar el funcionamiento completo y detallado de los procesos celulares.

La combinación de la espectroscopia de fuerza con la nanoscopia de superresolución representa una etapa que puede vincular la biofísica con la biología. Este vínculo puede ampliar la relevancia biológica y el impacto del campo, por ejemplo, porque: (i) la microscopía STED puede permitir la obtención de imágenes de proteínas individuales en el ADN en un tampón con concentraciones de proteínas que son comparables a las concentraciones de muchas proteínas asociadas al ADN en las células; (ii) La nanoscopia STED puede permitir la resolución de proteínas individuales en el ADN que están separadas por debajo del límite de difracción. Esto supera la necesidad de aplicar las condiciones artificiales de molécula única de ADN escasamente recubierto para distinguir proteínas individuales; (iii) La nanoscopia STED en ADN estirado ópticamente proporciona una resolución de tiempo alta. La exploración 1D a lo largo del ADN con la técnica de superresolución de fotón eficiente STED permite observar la dinámica espacial rápida de las interacciones ADN-proteína. El método abre muchas oportunidades interesantes para desentrañar cuantitativamente procesos biológicos esenciales como la replicación del ADN, la organización del a Dn y la reparación del ADN, en condiciones biológicamente relevantes. En conclusión, el método proporciona un hito conceptual y metodológico en la investigación de las ciencias de la vida que puede conducir a conocimientos cuantitativos y más realistas sobre el funcionamiento de las células.

La invención se describe más detalladamente a continuación con referencia a los dibujos adjuntos, en los que se muestran realizaciones de la invención. Sin embargo, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, esta invención puede realizarse de muchas formas diferentes y no debe interpretarse como limitada a las realizaciones expuestas en el presente documento. Más bien, estas realizaciones se proporcionan para que esta descripción sea minuciosa y completa, y transmita completamente el alcance de la invención a los expertos en la técnica. Se pretende que la divulgación de los ejemplos de realización se lea en relación con los dibujos adjuntos, que deben considerarse parte de la descripción escrita completa. En los dibujos, los tamaños absolutos y relativos de los sistemas, componentes, capas y regiones pueden exagerarse para mayor claridad. Las realizaciones pueden describirse con referencia a ilustraciones esquemáticas y/o en sección transversal de realizaciones y estructuras intermedias posiblemente idealizadas de la invención. En la descripción y los dibujos, los números similares se refieren a elementos similares en todas partes. Los términos relativos, así como los derivados de los mismos, deben interpretarse para referirse a la orientación como se describe a continuación o como se muestra en el dibujo en discusión. Estos términos relativos son por conveniencia de la descripción y no requieren que el sistema se construya u opere en una orientación particular a menos que se indique lo contrario.

La figura 1A ilustra una realización de un sistema y método para formar imágenes de una hebra molecular. La figura 1B muestra una ilustración de la cadena molecular MS.

El método comprende proporcionar un volumen de muestra SV que comprende la hebra MS. El método comprende además proporcionar un haz de excitación EB que tiene un foco de excitación EF en el volumen de muestra SV en el que una excitación de un fluoróforo FL en la hebra MS por el foco de excitación EF da como resultado una respuesta de fluorescencia FR cuando el foco de excitación EF coincide con el fluoróforo FL. El método comprende además explorar el foco de excitación EF en el volumen de muestra SV a lo largo de una línea SL de exploración unidimensional. El método comprende además capturar un extremo de la hebra MS en el volumen de muestra SV y extender la hebra MS a lo largo de una línea de captura unidimensional LL paralela a la línea de exploración SL. El método comprende además alinear la línea de captura LL para que coincida con la línea SL de exploración para que el foco de excitación de exploración EF coincida con la hebra MS. El método comprende además registrar la respuesta de fluorescencia FR en función de una pluralidad de posiciones de exploración distintas X0 del foco de excitación EF a lo largo de la línea de exploración SL.

En una realización, el método comprende además proporcionar un haz de agotamiento DB que tiene un foco de agotamiento DF con un perfil de agotamiento que coincide con un perfil de excitación del foco de excitación EF y que provoca el agotamiento de la emisión estimulada STED de la excitación del fluoróforo FL de acuerdo con el perfil de agotamiento. El perfil de agotamiento tiene una intensidad mínima en un centro del foco de excitación EF para reducir un tamaño de perfil de los fluoróforos excitados (es decir, el perfil de emisión de fluorescencia espontánea) mediante el agotamiento de la emisión estimulada STED. La microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED) es un proceso que proporciona una superresolución desactivando selectivamente los fluoróforos. De esta manera, el límite de difracción de la microscopía convencional se puede evitar para lograr una mejor resolución.

El método comprende proporcionar trampas ópticas OT que capturan perlas BD unidas en extremos opuestos de la hebra MS. Las trampas ópticas OT están dispuestas para formar la línea de captura LL entre las perlas BD y se utilizan para facilitar la alineación de la línea de captura LL para que coincida con la línea de exploración SL.

En una realización, las perlas BD tienen un diámetro mayor que la cintura del láser de captura, típicamente más de 2 pm, preferiblemente más de 3 mm. Las perlas relativamente grandes, es decir, las microesferas se pueden usar ventajosamente para separar espacialmente las etiquetas fluorescentes en la hebra MS, por ejemplo, complejos de ADN-proteína de los haces de captura TB. Esta separación puede prevenir el fotoblanqueo debido a la presencia simultánea de excitación de fluorescencia y haces de captura. Alternativamente o adicionalmente, también se puede usar la separación temporal entre los haces de captura Tb y el haz de excitación EB, es decir, los haces de captura TB y el haz de excitación EB pueden encenderse y apagarse alternativamente en contrafase entre sí como se describe, por ejemplo, en WO 2007/038260 A2. Alternativamente, o, además, el fotoblanqueo se puede reducir mediante el uso de enfoques de relajación triplete y/o el uso de tampones del sistema oxidativo reductor (ROXS).

En una realización, la respuesta de fluorescencia FR se registra en un plano de imagen IP. El plano de imagen IP es un plano focal conjugado OP * de un plano de objeto OP en el volumen de muestra SV. El plano de objeto OP se extiende en la primera dirección X y una segunda dirección Y. El foco de excitación EF y la línea de captura LL están alineados para coincidir con el plano de objeto OP. Se proporciona un microagujero espacial en el plano de imagen IP. El microagujero espacial se alinea para coincidir con un punto focal conjugado EF * del foco de excitación EF para pasar la respuesta de fluorescencia FR a través del microagujero espacial a un detector de fluorescencia FD.

El plano de objeto OP de un microscopio es un plano focal conjugado de un plano de imagen IP del microscopio, es decir, donde se registra la imagen del objeto. En óptica, un plano focal conjugado de un plano dado, OP, es un plano OP * tal que los puntos en OP se visualizan en OP *. Al colocar un microagujero espacial en el plano de la imagen, se puede filtrar la luz que no se origina en el plano del objeto, es decir, alejada del plano focal del foco puntual. De esta manera se puede lograr una mejor discriminación de profundidad (Z).

Mediante el uso de iluminación de enfoque puntual, se ilumina una parte específica del volumen de muestra, por ejemplo, en comparación con la iluminación de campo amplio. De esta manera se puede obtener una señal más alta debido a una mayor intensidad en el foco y/o la señal resultante se puede correlacionar con la posición del foco. En los presentes ejemplos, un fluoróforo se ilumina mediante luz de excitación que se enfoca en la hebra molecular.

La microscopía confocal típicamente comprende el uso de iluminación de foco puntual del volumen de muestra y un microagujero espacial colocado en el plano focal conjugado del foco puntual. Esta configuración puede mejorar la resolución de la imagen y la discriminación de profundidad. Si bien la microscopía confocal se usa típicamente para explorar y reconstruir estructuras tridimensionales, la presente divulgación proporciona una exploración unidimensional de la hebra MS.

En una realización, el foco de excitación EF se explora repetidamente hacia adelante y hacia atrás a lo largo de la línea de exploración. La respuesta de fluorescencia FR puede distinguirse entre la pluralidad de posiciones de exploración distintas X0 a lo largo de la línea de exploración SL e integrarse en exploraciones múltiples y/o registrarse en función del tiempo.

El método se puede ejecutar mediante un sistema para obtener imágenes de una MS de hebra molecular. El sistema comprende una celda de muestra SC dispuesta para proporcionar un volumen de muestra SV que comprende la hebra MS. El sistema comprende además una fuente de luz de excitación EL dispuesta para proporcionar un haz de excitación EB que tiene un foco de excitación EF en el volumen de muestra SV en el que una excitación de un fluoróforo FL en la hebra MS por el foco de excitación EF da como resultado una respuesta de fluorescencia FR cuando el foco de excitación EF coincide con el fluoróforo FL. El sistema comprende además un escáner de haz M3 dispuesto para explorar el foco de excitación EF en el volumen de muestra SV a lo largo de una línea de exploración unidimensional SL. El sistema comprende además una trampa TL dispuesta para capturar un extremo de la hebra MS en el volumen de muestra SV y extender la hebra MS a lo largo de una línea de captura unidimensional LL paralela a la línea de exploración SL. El sistema comprende además un alineador de haz (por ejemplo, formado por el espejo de dirección M3 junto con los telescopios T1 y/o T3) dispuesto para alinear la línea de captura LL para que coincida con la línea de exploración SL para que el foco de excitación de exploración EF coincida con la hebra Ms . El sistema comprende además un detector de fluorescencia FD dispuesto para registrar la respuesta de fluorescencia FR en función de una pluralidad de posiciones de exploración distintas X0 del foco de excitación EF a lo largo de la línea de exploración SL. El sistema comprende además una CPU de procesador de ordenador programada para proporcionar un modo de exploración.

En el modo de exploración, la CPU del procesador controla la trampa TL para extender la hebra MS a lo largo de una línea de captura unidimensional LL en la primera dirección X. En el modo de exploración, el procesador controla el alineador de haz para que la línea de captura LL coincida con la línea de exploración SL. En el modo de exploración, el procesador controla el escáner de haz M3 para explorar el foco de excitación EF a lo largo de la línea de exploración SL. En el modo de exploración, el procesador recibe la respuesta de fluorescencia registrada FR del detector de fluorescencia FD. En el modo de exploración, el procesador almacena la respuesta de fluorescencia FR en función de una posición X0 del foco de excitación EF a lo largo de la línea de exploración SL.

El programa para ejecutar dichas instrucciones puede, por ejemplo, almacenarse en una memoria accesible al procesador. La memoria puede, por ejemplo, ser una memoria de acceso aleatorio y/o un portador de datos. En una realización, se proporciona un medio de almacenamiento informático codificado con un programa informático, el programa comprende instrucciones que, si son ejecutadas por una o más computadoras vinculadas a un sistema como se describe, hacen que una o más computadoras controlen el sistema para realizar operaciones que comprenden uno o más más métodos como se describe en este documento, por ejemplo, la exploración de la hebra molecular y/o alineación de la hebra molecular.

En una realización, el sistema comprende además una fuente de luz de agotamiento DL y ópticas de haz de agotamiento M3, T3. La fuente de luz de agotamiento DL y la óptica de haz de agotamiento M3, T3 están dispuestas para proporcionar un haz de agotamiento DB que tiene un foco de agotamiento DF con un perfil de agotamiento que coincide con un perfil de excitación del foco de excitación EF y que provoca el agotamiento de la emisión estimulada STED de la excitación del fluoróforo FL de acuerdo con el perfil de agotamiento. El perfil de agotamiento tiene una intensidad mínima en un centro del foco de excitación EF para reducir un tamaño del perfil de fluoróforos excitados por el agotamiento de la emisión estimulada STED.

En una realización, el sistema comprende un modelador de foco de agotamiento PP dispuesto para dar forma al perfil de agotamiento en el que el perfil de agotamiento comprende un plano de intensidad mínima que se extiende perpendicular a la línea de captura LL. El modelador de enfoque de agotamiento PP puede, por ejemplo, comprender una placa de fase dispuesta en el haz de agotamiento DB para dar forma al perfil de enfoque de agotamiento, por ejemplo, como se explica en un artículo de Klar et al. (Physical Review E, Volumen 64, 066613, “Breaking Abbe's diffraction resolution limit in fluorescence microscopy with stimulated emission depletion beams of various shapes"). También se pueden contemplar otros medios además de una placa de fase para lograr un perfil de enfoque STEd en forma de línea o plano, por ejemplo, cruzar dos haces STED coherentes desde diferentes direcciones para proporcionar un patrón de interferencia en forma de línea entre los haces.

La trampa comprende una fuente de luz de captura TL y ópticas de haz de captura (por ejemplo, telescopio, espejos giratorios, detectores de haz de captura) dispuestas para proporcionar trampas ópticas OT que capturan perlas BD unidas en extremos opuestos de la hebra MS. En uso, las trampas ópticas OT están dispuestas a lo largo de la primera dirección X para formar la línea de captura LL entre las perlas BD. El procesador está programado para proporcionar un modo de alineación. En el modo de alineación, el procesador controla el escáner de haz y la trampa y recibe del detector de fluorescencia (FD) una primera imagen de fluorescencia de la hebra MS explorando el foco de excitación EF en un plano de objeto OP. En el modo de alineación, el procesador controla el movimiento de las trampas ópticas OT con respecto a la línea de exploración SL en una dirección Z perpendicular al plano del objeto. A continuación, el procesador recibe del detector de fluorescencia FD una segunda imagen de fluorescencia de la hebra en el plano del objeto OP. El procesador (CPU) compara la primera y la segunda imagen de fluorescencia y está programado para repetir el movimiento de la línea de captura LL en relación con la línea de exploración SL en la misma dirección Z cuando la segunda imagen de fluorescencia en comparación con la primera imagen de fluorescencia tiene un grosor de línea reducido de la hebra MS y/o un mayor contraste. En principio, para alinear en la dirección Z, no es necesario explorar, por ejemplo, se puede utilizar una posición X, Y fija en la hebra de ADN y maximizar la intensidad.

Un fluoróforo (o fluorocromo) es un compuesto químico fluorescente que puede volver a emitir luz tras la excitación de la luz. El fluoróforo absorbe típicamente energía luminosa de una longitud de onda específica y reemite luz a una longitud de onda más larga. En una realización, la hebra molecular comprende y/o se une a un fluoróforo para proporcionar una visualización conveniente de la hebra. En una realización, se usa una solución de tinción fluorescente para teñir la hebra molecular. Un ejemplo de solución de tinción es SYTOX ® Green. La tinción de ácido nucleico SYTOX® Green (número CAS: 194100-76-0) es una tinción de ácido nucleico de alta afinidad. Otro ejemplo es SYTOX® Orange. También se pueden utilizar otras tinciones de ADN o tintes intercalados, como proteínas fluorescentes (como GFP, YFP, mCherry), puntos cuánticos, nano diamantes, tintes orgánicos (como los de las series Alexa Fluor®, Attotec o Cy®-dye). Por ejemplo, después de una breve incubación con tinción de ácido nucleico SYTOX® Green, los ácidos nucleicos emiten una fluorescencia verde brillante cuando se excitan, por ejemplo, con una fuente de luz de 450-490 nm. Ventajosamente, tiene un aumento de fluorescencia > 500 veces tras la unión del ácido nucleico. También se pueden usar otras soluciones de tinción conocidas o por desarrollar. Alternativamente o en adición a una solución de tinción, la hebra molecular también puede ser fluorescente en sí misma, por ejemplo, comprender una o más partes fluorescentes. Alternativamente o adicionalmente, reactivos fluorescentes a estudiar, por ejemplo, proteínas fluorescentes, pueden unirse a la cadena molecular. Por tanto, la hebra puede formar imágenes directamente a través de su propia fluorescencia o indirectamente mediante moléculas fluorescentes que incluyen fluoróforos que se unen a las mismas.

En la realización mostrada, los haces TB, EB, FR y DB se combinan o dividen utilizando espejos dicroicos D1, D4, D7. Por supuesto, también se pueden usar otros medios para combinar/dividir los haces, por ejemplo, fibras y/o ópticas de difracción/refracción como prismas y rejillas. En la realización mostrada, los haces de captura TB se detectan mediante el detector TD de haz de captura, por ejemplo, para determinar una fuerza ejercida sobre la hebra. Dicho detector también puede omitirse o apagarse una vez que el hilo queda capturado.

En una realización, alinear la línea de captura LL para que coincida con la línea de exploración SL comprende grabar una primera imagen de fluorescencia F1 de la hebra MS explorando el foco de excitación EF en un plano de objeto X, Y; mover la línea de captura con respecto a la línea de exploración en una dirección Z perpendicular al plano del objeto X, Y; y registrar una segunda imagen de fluorescencia F2 de la hebra del plano del objeto X, Y. En una realización, se comparan las imágenes de fluorescencia primera y segunda F1, F2; y la línea de captura LL se mueve de nuevo con respecto a la línea de exploración SL en la misma dirección Z cuando la segunda imagen de fluorescencia F2 en comparación con la primera imagen de fluorescencia F1 tiene un grosor de línea disminuido de la hebra MS y/o un mayor contraste. Alternativamente, la línea de captura LL se mueve de nuevo con respecto a la línea de exploración SL en una dirección opuesta - Z cuando la segunda imagen de fluorescencia F2 en comparación con la primera imagen de fluorescencia F1 tiene un grosor de línea aumentado de la hebra MS y/o un contraste más bajo.

El grosor de la línea se puede calcular, por ejemplo, como la mitad máxima de ancho completo (FWHM) de la respuesta de fluorescencia FR en función de una coordenada Y transversal a la dirección de longitud X de la hebra MS en las imágenes de fluorescencia F1, F2. La respuesta de fluorescencia FR puede integrarse opcionalmente a través de múltiples coordenadas X de la hebra MS para mejorar la precisión. También se pueden usar otras métricas para evaluar el grosor de la línea, por ejemplo, una desviación estándar. El espesor también se puede calcular ajustando la fluorescencia a un perfil, por ejemplo, ajuste gaussiano.

En una realización, el contraste se puede calcular examinando una derivada de la respuesta de fluorescencia FR a lo largo de cualquier dirección de la imagen, por ejemplo, X y/o Y. Normalmente, un contraste más alto da como resultado una derivada más alta. También se pueden utilizar otros métodos para calcular un contraste y/o grosor de línea. Alternativamente o adicionalmente, también se puede usar una respuesta de fluorescencia máxima y/o integrada FR como una medida de la alineación. Por ejemplo, una respuesta de fluorescencia máxima y/o total más alta FR de la hebra MS puede corresponder a una mejor alineación. En una realización, la hebra se alinea maximizando el brillo absoluto de píxeles.

En una realización, para que el plano de formación de imágenes confocal/STED coincida con el plano donde se coloca la hebra molecular, la posición de una lente en el telescopio T1 (Figura 3A) puede controlarse utilizando una platina motorizada. Al mover la lente a lo largo del eje óptico del láser de captura, es posible mover la posición de las trampas ópticas y, por lo tanto, de las microesferas y la hebra molecular dentro de la muestra. Normalmente, el ADN es la hebra molecular y para la visualización se utiliza una sustancia química fluorescente como SYTOX®-orange. En una realización, la muestra se ilumina y se adquieren imágenes de la hebra molecular mientras se mueve la lente de la trampa óptica para desplazar la hebra molecular en la dirección z. Se analiza el perfil de ancho en cada desplazamiento de la lente. En una realización, cuando el plano z del ADN y el plano de formación de imágenes del aparato coinciden, se observa un mínimo de la anchura.

La figura 3A muestra una realización de una trampa óptica para capturarla hebra molecular en el volumen de muestra. La presente realización proporciona pinzas ópticas para capturar un extremo de la hebra MS. Las pinzas ópticas utilizan un rayo láser enfocado (la trampa óptica) para proporcionar una fuerza atractiva o repulsiva, dependiendo del desajuste del índice de refracción para sostener y mover un objeto microscópico, típicamente una microesfera dieléctrica o una perla BD.

La presente realización proporciona una fuente de luz trampa TL para proporcionar un haz trampa TB. En este caso, la fuente de luz trampa TL tiene una longitud de onda de 1064 nm, pero también se pueden utilizar otras longitudes de onda. Preferiblemente, la longitud de onda se elige para interferir mínimamente con la excitación del fluoróforo. El rayo TB entra en un primer telescopio T1 para agrandar el haz. El haz se divide en dos polarizaciones, por ejemplo, usando cubos polarizadores. Mediante el uso de polarizaciones separadas para los dos haces de captura t B, estos pueden distinguirse y medirse por separado detrás de la muestra. Las dos polarizaciones golpean espejos de dirección de haz controlable de rotación separados M1 y M2. Los dos haces polarizados se recombinan y se envían a un segundo telescopio T2. El segundo telescopio T2 puede reducir las variaciones de ángulo de los rayos que pueden resultar de los espejos de dirección del haz M1 y M2. Se observa que el telescopio toma imágenes de los espejos de dirección en el plano focal posterior del objetivo. Por lo tanto, la rotación de los espejos provocará solo un cambio de ángulo (pivote) del haz a través del objetivo (no un cambio de posición). De esta manera se puede lograr una exploración homogénea de la muestra. El primer y/o segundo telescopios T1, T2 también se pueden usar para colimar los rayos captadores y/o cambiar una posición del plano focal de los rayos captadores en el volumen de muestra SV, por ejemplo, moviendo una lente del telescopio T1 como lo indica la flecha. De esta manera, la posición de la línea de captura Ll en el volumen de muestra SV se puede ajustar en una dirección Z mediante uno o ambos telescopios T1, T2, mientras que una dirección X y/o Y se puede ajustar mediante los espejos de dirección del haz M1 y M2.

Después del segundo telescopio T2, los haces de captura son reflejados por el espejo dicroico D2 y transmitidos por el espejo dicroico D 1 para ser enfocados en la muestra en la línea de captura LL o plano focal por el lente objetivo OB y re-colimados después de la muestra por lente condensadora CL. A continuación, los haces de captura son redirigidos por el espejo dicroico D3 y se vuelven a dividir en polarizaciones separadas para proyectarlos en dispositivos sensibles a la posición (PSD). En una realización, un dispositivo sensible a la posición (PSD) es un sensor de posición óptico, que puede medir la posición de un punto de luz en una o dos dimensiones en una superficie de sensor. En una realización, la posición de las perlas BD se determina usando interferometría de plano focal posterior (BFP). En la interferometría b Fp , la luz dispersada por la perla interfiere con la otra luz del haz de captura en el plano focal posterior del condensador (por ejemplo, la lente del condensador CL). Se puede inferir una posición de la perla en la trampa a partir de este patrón de interferencia en el detector. A partir de la posición de la perla en la trampa, se puede calcular una fuerza ejercida sobre el cordón. En una realización en la que las perlas son más grandes que el foco, toda la luz viaja a través de la perla y la perla funciona como una lente y desplaza el haz (total) si se desplaza del foco de captura.

Alternativamente o adicionalmente de la detección de BFP, las perlas también pueden formarse imágenes usando una iluminación y una cámara regulares. Por ejemplo, en la realización mostrada, se usa una fuente de luz LED para iluminar las perlas y la imagen resultante se muestra en una cámara CCD como se muestra en la imagen 12 insertada.

La figura 3B muestra una realización de un microscopio confocal. Una fuente de luz de excitación EL proporciona un haz de excitación EB. En el presente ejemplo, el haz de excitación EB tiene una longitud de onda de 640 nm. Alternativamente, también se pueden usar otras longitudes de onda, por ejemplo, dependiente de una longitud de onda de excitación de un fluoróforo específico del que se va a obtener la imagen. El haz de excitación EB es transmitido por el espejo dicroico D7 y dirigido al espejo de dirección del haz M3. Opcionalmente, se inserta una placa de cuarto de onda QWP en el haz para proporcionar un haz polarizado circularmente. El haz de excitación EB entra en el telescopio T3 que puede usarse para aumentar el diámetro del haz y/o cambiar una posición focal del foco de excitación en la muestra, por ejemplo, moviendo una lente del telescopio T3 como lo indica la flecha. Alternativamente o adicionalmente, la colimación se puede realizar en un acoplamiento de fibra. De esta manera, por ejemplo, diferentes colores/haces se pueden colimar de forma independiente. El haz de excitación EB se refleja hacia la lente OB del objetivo mediante el espejo dicroico D1. Se observa que este mismo espejo dicroico puede transmitir los rayos de captura TB y/o la luz del lEd mostrado en la Figura 3A. El haz de excitación Eb se enfoca en el volumen de la muestra para formar un foco de excitación. El foco de excitación se puede explorar en el volumen de la muestra, por ejemplo, por un escáner de haz, en este caso por el espejo de dirección del haz M3.

Cuando el foco de excitación se solapa con un fluoróforo, el fluoróforo puede emitir una respuesta fluorescente FR. En la presente realización, (parte de) la respuesta de fluorescencia FR viaja de regreso a través del sistema hasta que se encuentra con el espejo dicroico D7 que refleja el haz de respuesta de fluorescencia en un detector de fluorescencia FD. En este caso, el detector de fluorescencia FD comprende un fotodiodo de avalancha (APD). Un APD es un dispositivo electrónico semiconductor de alta sensibilidad que aprovecha el efecto fotoeléctrico para convertir la luz en electricidad. Alternativamente o adicionalmente de un APD, también podría usarse un tubo fotomultiplicador (PMT, no mostrado aquí). Un PMT multiplica la corriente producida por la luz incidente, en múltiples etapas de dinodo, lo que permite (por ejemplo) detectar fotones individuales cuando el flujo de luz incidente es bajo. En una realización, el detector de fluorescencia FD está acoplado con fibra. En una realización, se proporciona una lente (no mostrada) delante de la fibra para acoplar la luz de respuesta de fluorescencia a la fibra. Una apertura de entrada de la fibra puede funcionar para rechazar la luz desenfocada, es decir, la luz que no se origina en el plano focal del foco de excitación. De esta manera, la entrada de la fibra puede funcionar de forma similar a un microagujero en una configuración de microscopio confocal.

El detector de fluorescencia FD está conectado a una CPU de ordenador que registra la señal de respuesta de fluorescencia. Además, la CPU del ordenador también puede controlar directa o indirectamente una o más de las ópticas de dirección del haz, por ejemplo, escáner de haz M3 y/o una lente del telescopio T3, para mover el foco de excitación en el volumen de muestra SV. En un modo de exploración, la CPU del procesador puede, por ejemplo, estar programado para controlar el escáner de haz M3 para explorar la hebra MS a lo largo de la línea de exploración SL y registrar la respuesta de fluorescencia FR en función de una posición de exploración, correspondiente a una posición molecular en la hebra MS.

La figura 4A muestra una primera realización para realizar el agotamiento de la emisión estimulada (STED). La figura 4B muestra una segunda realización para realizar el agotamiento de la emisión estimulada (STED). En las realizaciones de STED, se añade una fuente de luz de agotamiento DL, por ejemplo, para proporcionar un haz de agotamiento DB. En la realización de la figura 4A, solo el haz de agotamiento DB se transmite a través de una placa de fase PP. En la realización de la figura 4B, el haz de excitación EB y el haz de agotamiento DB se envían a través de una fibra FI para alinear los haces. En esta realización, ambos haces se envían a través de una placa de fase PP. La placa de fase PP puede, por ejemplo, estar construido para retardar con la mitad de la placa de fase PP, la longitud de onda del haz de agotamiento DB en la mitad de una longitud de onda mientras se retarda la longitud de onda del haz de excitación EB en un número entero de longitudes de onda. En otras palabras, la mitad del rayo se retarda media longitud de onda con respecto a la otra mitad del rayo (ambos están retardados, pero con una diferencia de la mitad de longitud de onda.

El haz de agotamiento DB, por ejemplo, tiene una longitud de onda de 745 nm o cualquier otra longitud de onda adecuada para estimular el agotamiento de los fluoróforos que son llevados a un estado excitado por el haz de excitación Eb . El haz de agotamiento DB da como resultado un foco de agotamiento DF que se superpone con el foco de excitación para promover la emisión estimulada antes de que los fluoróforos excitados emitan la respuesta de fluorescencia. Normalmente, el haz de excitación EB y el haz de agotamiento DB comprenden luz pulsada. Preferiblemente, los pulsos de luz del haz de agotamiento DB se retrasan con respecto a los del haz de excitación EB, pero dentro del tiempo de vida fluorescente de los fluoróforos hasta la emisión espontánea de fluorescencia.

En una realización, el foco de agotamiento comprende un perfil de intensidad mínima en forma de línea orientado perpendicularmente a la línea de captura LL. En una realización, por ejemplo, como se muestra en las imágenes insertadas 13 y 14, el perfil de agotamiento del foco de agotamiento DF comprende un plano de intensidad mínima PLM que se extiende perpendicular a la línea de captura LL, es decir, la intensidad mínima se extiende en las direcciones Y y Z. El perfil de empobrecimiento en forma de línea o plano PLM tiene simetría doble (dos “lóbulos”) en XY en oposición a la simetría circular de, por ejemplo, un perfil de rosquilla. El perfil de agotamiento PLM también tiene una simetría doble en XZ. En una realización, el plano de intensidad mínima está curvado, por ejemplo, en forma de luna. Cuando el perfil de agotamiento tiene una intensidad mínima, el agotamiento de las moléculas excitadas es mínimo. En otras palabras, el perfil de excitación restante, después del agotamiento, es recíproco al perfil de agotamiento. Para el presente perfil de agotamiento con un plano de mínima intensidad PLM, esto significa que la excitación de las moléculas se agotará mínimamente a lo largo de dicho plano PLM. Se apreciará que debido a que el plano de intensidad mínima PLM se extiende perpendicular a la línea de captura LL, las fluctuaciones térmicas espaciales de la hebra dentro del plano PLM tendrán menos efecto sobre la emisión medida. Al aumentar la intensidad del enfoque de agotamiento DF, se puede estrechar el valle de la intensidad mínima PLM. Sin estar ligado a ninguna teoría, la dependencia no lineal del perfil de emisión restante de los fluoróforos de la intensidad del perfil de agotamiento puede usarse para superar la barrera de difracción.

En una realización, se obtiene un plano de intensidad mínima PLM por interferencia destructiva entre dos mitades de un haz o dos haces a lo largo de una línea en el foco (perpendicular a la línea de captura LL). En una realización, la interferencia destructiva se logra desplazando 180 grados una de las dos mitades de fase. En una realización, un frente de fase de un haz de agotamiento DB se divide en dos porciones por medio de una placa de fase PP. La placa de fase PP proporciona un cambio de fase relativo entre las dos mitades de 180 grados. Por ejemplo, la placa de fase PP comprende dos mitades en las que una mitad retrasa el frente de fase más que la otra mitad. La placa de fase puede basarse, por ejemplo, sobre refracción y/o reflexión. La imagen insertada 15 muestra una vista superior y lateral de una realización de una placa de fase PP. La mitad de la placa de fase es más gruesa que la otra mitad. La diferencia de espesor puede, por ejemplo, corresponder a un retardo de media longitud de onda de la luz del haz de excitación EB a través de la placa de fase PP.

La Figura 5A muestra una medición de la FWHM de una señal de fluoróforo en función de la fuerza de tensión TF de la hebra, en este caso la FWHM promedio de los ajustes gaussianos a los perfiles de intensidad obtenidos de las enzimas de restricción BsoBIAtto647N individuales en el ADN. Esta figura demuestra la importancia del control de la tensión en la hebra para lograr imágenes de alta resolución. Por ejemplo, las fluctuaciones térmicas del ADN suspendido pueden desenfocar las imágenes tomadas de proteínas unidas al ADN. Sin embargo, la amplitud de tales fluctuaciones se puede reducir aplicando tensión al ADN con pinzas ópticas. La figura muestra la FWHM medida de imágenes de fluoróforos individuales como función de la fuerza de tensión aplicada TF, revelando una pérdida de resolución efectiva a fuerzas por debajo de D5 pN. Los puntos de datos se describen mediante un modelo (línea) que convoluciona la resolución óptica con las fluctuaciones longitudinales estimadas del ADN. Las fluctuaciones calculadas se indican mediante la línea discontinua.

La Figura 5B muestra una exploración mejorada con STED de la respuesta de fluorescencia de una hebra mantenida por perlas a dos fuerzas de tensión diferentes en la hebra (ADN), 0.4 pN y 30 pN. En particular, la figura muestra el recuento de fotones PC en función de la posición molecular X en pm (micrómetros). Esta figura ilustra que la reducción de la tensión del ADN de 30 pN a 0.4 pN anula por completo la capacidad de la nanoscopia STED para resolver dos proteínas unidas al ADN en estrecha proximidad. De acuerdo con lo anterior, en una realización, las perlas capturadas ópticamente se unen a la hebra para capturarla hebra, en el que las perlas ejercen una fuerza de tracción sobre la hebra mayor de 5 pN, preferiblemente mayor de 10 pN. En una realización, la fuerza de tracción se aplica mediante estiramiento por flujo, por ejemplo, en combinación con una perla capturada.

La figura 6A muestra una disposición de una ventana de muestra SW que contiene un volumen de muestra SV inclinado en tres ángulos diferentes, por ejemplo, con respecto al haz de excitación entrante EB y/o haz de agotamiento DB enfocado por la lente OB del objetivo. La figura 6B muestra el foco de excitación resultante en el plano XZ para las tres disposiciones respectivas de la figura 6A. La figura 6C muestra el foco de excitación resultante en el plano XY para las tres disposiciones respectivas de la figura 6A. Se puede observar que, si la ventana de muestra SW se inclina incorrectamente con respecto a los haces entrantes, el tamaño y/o la forma del perfil de excitación pueden deteriorarse. Las imágenes se obtienen utilizando perlas de oro en una matriz de agarosa.

En una realización, el volumen de muestra SV está comprendido en una celda de muestra que comprende una ventana de muestra SW transparente a la excitación entrante y/o haces de agotamiento DB, EB. Una posición de la celda de muestra es impulsada por actuadores giratorios (no mostrados). La realización comprende además alinear la ventana de muestra SW para que sea perpendicular a los haces entrantes DB, EB para optimizar un perfil del foco de excitación y/o foco de agotamiento.

En una realización, la celda de flujo de microfluidos está conectada a una etapa motorizada con la capacidad de moverse linealmente en tres dimensiones independientes y rotar alrededor de dos ejes independientes. Se desea la posibilidad de mover la platina en tres dimensiones con respecto a la posición de la trampa para realizar un enfoque de captura y medición como se ilustra en la Figura 7B, en el que la celda de flujo se puede mover mientras las trampas se mantienen en su lugar. Se desea la posibilidad de rotar el eje alrededor de dos ejes para la integración STED. En particular, para STED se desea que el eje óptico del rayo láser STED entrante sea perpendicular al portaobjetos de vidrio inferior del chip microfluídico como se discutió anteriormente. En una realización, la hebra molecular, los objetos esféricos y uno o más de otros reactivos químicos se inyectan en la celda de flujo de microfluidos usando canales separados.

La Figura 7A muestra una configuración esquemática de una celda de flujo de microfluidos FC. La figura 7B muestra esquemáticamente una pluralidad de flujos laminares separados I-V en un volumen de muestra SV de la celda de flujo que fluye en la dirección FD. Debido a la naturaleza laminar de los flujos, los contenidos de los flujos adyacentes normalmente no se mezclan.

En una realización, la celda de muestra SC comprende una celda de flujo microfluídica FC en la que los canales de entrada separados IC de la celda de flujo FC proporcionan una pluralidad de flujos laminares separados I-V en un volumen de muestra SV de la celda de flujo FC. La trampa TL comprende trampas ópticas OT que capturan perlas BD unidas en extremos opuestos de la hebra MS. Las trampas ópticas OT están dispuestas para formar la línea de captura LL entre las perlas BD. Las trampas ópticas OT son móviles con respecto a los flujos laminares I-V, por ejemplo, moviendo la celda de flujo. En una realización, se proporciona un método para medir la interacción de un reactivo fluorescente con una cadena molecular MS. El método comprende proporcionar una celda de flujo microfluídica FC en la que los canales de entrada separados IC de la celda de flujo FC proporcionan una pluralidad de flujos laminares separados I-V en un volumen de muestra SV de la celda de flujo FC. Una disposición típica consiste en lo siguiente. Un primer flujo laminar I comprende una pluralidad de perlas Bd dispuestas para unirse a extremos opuestos de la hebra molecular MS. Un segundo flujo laminar II comprende una pluralidad de hebras moleculares MS. Un tercer flujo laminar III, IV comprende el reactivo RE, PR. El método comprende proporcionar trampas ópticas OT en el primer flujo laminar I y capturar al menos dos perlas BD con las trampas ópticas OT. El método comprende además mover las trampas ópticas OT al segundo flujo laminar II y unir las perlas BD a una hebra MS. El método comprende además mover las trampas ópticas OT al flujo laminar III y/o IV, y usar un método como se describe en este documento para registrar la respuesta de fluorescencia FR del reactivo RE y/o PR en función de la posición molecular a lo largo de la hebra MS.

En una realización, la cadena molecular MS es una cadena de ADN y el reactivo fluorescente PR comprende moléculas de proteína que proporcionan una señal fluorescente. Por consiguiente, se proporciona un método para medir la interacción de una o más moléculas de proteína con una hebra de ADN.

La figura 8 muestra una realización de un sistema que se puede programar para obtener imágenes de una hebra molecular de acuerdo con el presente método divulgado. La configuración experimental muestra las trayectorias de los haces y varios componentes. Captura óptica (1064 nm): Dos trampas ópticas polarizadas ortogonalmente se dirigen independientemente utilizando espejos de inclinación/inclinación (M1 y M2) y la fuerza que actúa sobre las microesferas (desplazamiento del haz de captura en el plano focal) se mide en dos PSD, por ejemplo, utilizando interferometría de plano retrofocal u otras técnicas de formación de imágenes. La distancia de microesfera a microesfera se obtiene a partir de imágenes de cámaras CMOS iluminadas con LED (875 nm). Fluorescencia: un sistema láser suministra STED (745 nm) y haces de excitación (640 nm, 543 nm y 467 nm, respectivamente, filtrados de un espectro supercontinuo (SC) utilizando un filtro sintonizable acústico-óptico AOTF). Estos haces se acoplan con fibra y se envían al escáner de espejo piezoeléctrico de inclinación/punta confocal (M3) después de combinarlos con dicroicos. La señal de fluorescencia no explorada (líneas discontinuas) se recopila en APD acoplados a fibra, mientras que la luz de excitación no explorada se puede detectar opcionalmente usando un PMT colocando un divisor de haz de película (BS) en la ruta común. Una franja STED está formada por una placa de fase binaria (PP) y, opcionalmente, los haces de excitación se pueden polarizar circularmente utilizando un retardador A/4 (QWP). Las estrellas indican planos conjugados con el objetivo y el plano focal posterior del condensador, respectivamente. D1-11 son espejos dicroicos y T1-T3 son telescopios.

Las ópticas de dirección del haz M1, M2, M3 pueden controlarse mediante un ordenador (no mostrado). También una o más de las lentes que forman los telescopios T1, T2, T3 pueden ser controladas por ordenador. Además, la celda de flujo puede ser controlada por ordenador. El cálculo puede recibir datos de uno o más de los dispositivos de formación de imágenes, por ejemplo, los PSD, CMOS, PMT y/o APD. La computadora se puede programar con un código de ordenador, por ejemplo, almacenado en una memoria del ordenador, cuyo código, cuando se ejecuta, recibe datos del sistema y controla el sistema y sus componentes para realizar un método para capturar, alinear y/o formar imágenes de una hebra molecular, como se describe en el presente documento.

En una realización, el microscopio y los microfluidos pueden ser los siguientes. La configuración comprende un microscopio invertido basado en un objetivo de inmersión en agua (CFI Plan Apo IR 60X WI, Nikon, NA 1.27) colocado en una platina vertical MVN80 (Newport Corporation) usando un adaptador. Una celda de flujo laminar de 5 canales (Micronit Microfluidics BV) está montada en una etapa XY automatizada (MS-2000, Applied Scientific Instrumentation), que permite la construcción y caracterización rápida e in situ de construcciones con mancuernas (normalmente, una construcción se crea en menos de un minuto), y facilita la transferencia rápida y completa del ADN anclado entre diferentes canales de flujo (lo que permite realizar experimentos de espectroscopía de fuerza y visualización en > 20 moléculas de ADN por hora). Se coloca una lente superior del condensador (P 1.40 OIL S1 11551004, Leica) en la parte superior de la celda de flujo. La celda de flujo y las microesferas se iluminan con un LED de 875 nm (LED-1115-ELC-875-19-5, IMM Photonics) y se obtienen imágenes en transmisión a una cámara CMOS (DCC1545M, Thorlabs).

En una realización, la captura óptica puede ser como sigue. La captura óptica se realiza utilizando un láser de fibra CW de 10 W (YLR-10-LP, IPG Photonics) con aislador óptico acoplado. Normalmente, se utiliza una potencia de salida de 3 W para capturar dos perlas. El rayo láser se expande utilizando lentes con distancias focales de 75 mm y 150 mm. Aquí, la lente de 75 mm se coloca en una platina lineal automatizada (AG-LS25, Newport) para modificar la colimación para alinear el ADN estirado ópticamente con el plano focal del sistema de imágenes confocal. Se utilizan dos cubos divisores de haz polarizador (10BC16PC.9, Newport) para dividir el láser de 1064 nm en dos trampas ópticas orientables de forma independiente y recombinarlas. Un espejo piezoeléctrico paso a paso de posicionamiento aproximado (AG-M100N, Newport) y un espejo piezoeléctrico preciso (aluminio Nano-MTA2X, Mad City Labs) se utilizan para dirigir el haz de las dos trampas. Dos lentes de 300 mm acoplan los rayos de captura en el objetivo. Las mediciones de fuerza se realizan mediante interferometría de plano retro-focal de la lente del condensador usando dos detectores sensibles a la posición (DL100-7PCBA3, Pacific Silicon Sensor) después de separar los dos haces polarizados usando un cubo divisor de haz polarizador. Dos espejos dicroicos (950DCSP, Chroma Technology Corporation) separan la luz de captura de la iluminación LED antes y después de la celda de flujo.

En una realización, la microscopía de fluorescencia confocal y STED puede ser como sigue. Se utiliza un único sistema láser (ALP-710-745-SC, Fianium Ltd, Southampton, Reino Unido) para la excitación de fluorescencia y STED. Este sistema llave en mano simplifica la implementación de STED (de doble color) y proporciona flexibilidad en la longitud de onda de excitación. Se seleccionan tres bandas de excitación (centradas en 467 nm, 543 nm y 640 nm, compatibles con una gama de tintes fluorescentes convencionales) de un espectro supercontinuo. Después de polarizar (prisma de Glan-Thompson PGT 1.08.05, Bernhard Halle Nachfl. GmbH) y filtrar el espectro supercontinuo usando un AOTF (AOTFnc-VIS-TN, AA Opto-Electronic), los tres haces se separan y filtran con espejos dicroicos apropiados. (F43-088 y F43-093, AHF Analysentechnik GmbH) y filtros (F94-640, F94-543 y F34-467, a Hf ). Los tres haces de excitación y el haz STED se acoplan en fibras monomodo (PMC-640 y PMC-460, Schafter & Kirchoff GmbH) utilizando acopladores de haz láser (60SMS-1-4-M15-26 y 60SMS-1-4- M15-37, Schafter & Kirchoff), y colimaron nuevamente (colimador 60FC-L-4- M20L-02, Schafter & Kirchoff of = 20mm achromats G052006000, Qioptiq). El ajuste fino del ángulo de polarización del haz de 745 nm antes del acoplamiento de la fibra se realiza utilizando un retardador A/2 acromático (RAC 4.2.10 L, Bernhard Halle). Los cuatro haces se combinan utilizando espejos dicroicos (F48-533, F33-632 y F73-726, AHF). La exploración del haz usando un espejo piezoeléctrico de inclinación/inclinación rápida (S-334.1SD, Physik Instrumente GmbH & Co) es seguido por una expansión del haz de 1: 3 y se combina con el láser de captura usando un espejo dicroico (F43-800, AHF). Todos los espejos (dicroicos) que se encuentran con el haz STED tienen al menos 6 mm de espesor y una planitud mejor que A/10. El haz STED pasa por una ventana de vidrio plano con una mitad con un revestimiento que proporciona una etapa de fase de 180 °. En la muestra, la distribución de intensidad focal resultante presenta idealmente una intensidad cero en el centro del foco, de modo que la emisión estimulada saturada solo se produce en la periferia de alta intensidad del haz STED. 12 Para la microscopía confocal, los haces de excitación se pueden polarizar circularmente usando un retardador A/4 (RAC 4.4.10, Schafter & Kirchoff). Para la detección confocal, la fluorescencia emitida se des-explora, separada de la excitación por espejos dicroicos (F48-640, F33-554 y F38-484, AHF), filtrados usando filtros de emisión apropiados (F42-652 & F47-686, F47- 586 y F37-510, AHF) y los fotones se cuentan utilizando APD acoplados a fibra (APD SPCM-AQRH-14-FC, fibras SPCM-QC9, Perkin Elmer). Las fibras multimodo sirven como microagujeros confocales que proporcionan rechazo de fondo, aumentando así la relación señal/fondo de modo que los fluoróforos individuales todavía se pueden resolver en el ADN incluso cuando hay altas concentraciones de proteínas marcadas en la solución. Debido a que el tamaño del orificio confocal es grande (~1.75 discos Airy), la resolución de imagen confocal esperada se establece mediante la distribución de intensidad focal del haz de excitación. Para bloquear el haz STED de las rutas de detección, se utiliza un filtro de emisión de fotones múltiples (F75-750, AHF).

En una realización, el control de hardware y la adquisición de datos pueden ser como sigue. Para la detección de fuerza, muestreamos los voltajes de salida de los PSD a 50 kHz utilizando una tarjeta de adquisición de datos (NI PCI-4472B, National Instruments). El recuento de fotones, la dirección del haz y la E/S digital se realizan usando una tarjeta multifunción (NI PCIe-6323, National Instruments). Toda la captura óptica, la detección de fuerza y la fluorescencia confocal y el hardware STED se controlan mediante software, escrito en LabVIEW™ 2010 (National Instruments), y los procedimientos estándar de calibración, construcción con mancuernas, caracterización mecánica y visualización están en gran parte automatizados. El software LabVIEW™ permite la automatización de muchos de los complejos procedimientos experimentales. Una capa de abstracción de hardware y un sistema de complemento permiten que el mismo software se ejecute en una variedad de instrumentos.

En una realización, la formación de imágenes de distribución de intensidad focal puede ser como sigue. Para facilitar la alineación y la optimización sencillas, se utiliza un tubo fotomultiplicador (PMT) para obtener imágenes directamente de la distribución de intensidad focal de los haces de excitación y STED. Se coloca un divisor de haz 50:50 (BP145B1, Thorlabs) en la trayectoria del haz, y la luz, dispersada por microesferas de Au (oro), se explora a través del foco usando una etapa piezoeléctrica (NanoLP200, Mad City Labs), se detecta usando un Pm T (MD 963 CPM DC, Perkin Elmer). Aquí, las nanopartículas de Au de 80 nm (EM.GC80/4, British Biocell International) se montan primero en un gel de agarosa al 2% (p/p) para evitar la formación de imágenes cerca de la interfaz vidrio-líquido donde los reflejos invaden la señal de las nanopartículas de Au.

La Figura 9 ilustra datos experimentales de espectroscopía de fuerza y microscopía de fluorescencia confocal. (a) Curva de fuerza-distancia experimental de un a Dn en PBS. La curva punteada muestra el modelo de cadena en forma de gusano calculado utilizando una longitud de persistencia de 55 nm, una longitud de contorno de 16.5 pm y un módulo de estiramiento de 1350 pN. El sobreestiramiento del ADN ocurre cerca de 65 pN. El recuadro muestra el ruido de fuerza en función del ancho de banda de medición. Los puntos indicados por el número de referencia 16 representan el ruido de fuerza medido en las perlas individuales, los puntos indicados por el número de referencia 17 indican el ruido de fuerza en la detección diferencial. Las curvas indican el ruido de fuerza calculado ab initio limitado por fluctuaciones térmicas, donde se calcularon las curvas grises y negras para la detección de una sola perla y la detección diferencial respectivamente, y las curvas sólidas y discontinuas se calcularon para microesferas de 3.2 pm y 0.9 pm de diámetro, respectivamente, (b) Imagen de microscopía confocal de AADN marcado con SYTOX® Orange entre dos microesferas de 3.2 pm (exc 543 nm). (c) -(e) Imágenes de microscopía confocal de EcoRVAtto647N (exc 640 nm), SYTOX® Orange (exc 543 nm) y proteínas marcadas con EGFP (exc 467 nm), respectivamente, (f) Imágenes multicolores simultáneas de SYTOX® Orange, SYTOX® Blue y BsoBI-Atto647N. (g, h) Imágenes de microscopía confocal de enzimas de restricción BsoBI-Atto647N individuales unidas específicamente a AADN estirado ópticamente en ausencia (g) y presencia (h) de una solución que contiene 100 nM de Atto647N-NHS libre (la concentración local en la celda de flujo se estima que es menor debido a la adsorción, aproximadamente 40 nM). Todas las barras de escala 1 um. La frecuencia de imagen típica para un campo de visión de 25 pm x 2 pm con un tiempo de permanencia de 100 ps por cada píxel de 75 nm es de 1 Hz.

La Figura 10 ilustra la caracterización de la nanoscopia STED de proteínas en ADN estirado ópticamente. (a, b) Distribución de la intensidad focal del punto de excitación de 640 nm graficado en XY y XZ, respectivamente. (c, d) Distribución de la intensidad focal de la franja STED de 745 nm graficada en XY y XZ. Las imágenes en (a) - (d) se adquirieron detectando la luz retrodifundida de microesferas de Au de 80 nm en un PMT. (e) Imagen de microscopía confocal de BsoBI-Atto647N en ADN estirado ópticamente. (La forma elíptica de las distribuciones de intensidad se debe probablemente a la polarización lineal de la luz de excitación, así como a aberraciones asociadas con la inclinación residual del cubreobjetos con respecto al eje de la lente de inmersión en agua de alta NA). (f) Imagen de microscopía STED posterior de BsoBI-Atto647N como se grafica en (e). Potencia STED 6 mW. (g) Muestra los perfiles de intensidad proyectados de las enzimas BsoBI-Atto647N como se indica mediante las líneas discontinuas en (e) y (f). (h) Escalado de resolución con potencia STED, que muestra la FWHM promedio de ajustes gaussianos a los perfiles de intensidad obtenidos de las enzimas de restricción BsoBI-Atto647N y EcoRV-Atto647N individuales en el ADN a una tensión de D5pN. Las barras de error muestran el error estándar de la media, (i) Muestra un gráfico de barras del número contado de fotones antes del fotoblanqueo para fluoróforos individuales en búferes TRIS (gris claro) y ROXS (gris oscuro) para potencias de STED de 0 mW, 6 mW y 16 mW. Cada barra representa la constante de desintegración exponencial ajustada a los histogramas del número de fotones contados de aproximadamente 30 fluoróforos (ver recuadro).

En una realización, se emplea STED para realizar imágenes de sub-difracción en pinzas ópticas. STED permite obtener imágenes rápidas en el ADN a una velocidad que, en última instancia, puede limitarse mediante la exploración de haz confocal y la velocidad de emisión de fluorescencia. En una realización, para STED, se usa una distribución de intensidad focal que presenta una línea central unidimensional de intensidad casi nula (en lugar de una distribución en forma de rosquilla). Las figuras 10a-d muestran las distribuciones de intensidad focal de los haces de excitación de 640 nm y STED de 745 nm. Al orientar la línea cero perpendicular al ADN estirado, la resolución espacial se mejora solo a lo largo del ADN. Ventajosamente, este esquema 1D-STED puede hacer que la exploración de línea 1D sea menos sensible a las fluctuaciones laterales del ADN, desalineación o desviación entre los sistemas de formación de imágenes de fluorescencia y de captura óptica que una rosquilla.

Las Figuras 10e y f muestran imágenes confocales y STED de enzimas de restricción BsoBI-Atto647N unidas específicamente a ADN estirado ópticamente. Se puede observar una mejora clara de la resolución a lo largo del ADN en la imagen STED, que se ilustra además en los perfiles de intensidad de la Figura 10g. Con una potencia STED relativamente baja, PSTED = 6 mW, se obtiene una mejora triple de la resolución espacial con respecto a las imágenes confocales. La escala de resolución con potencia STED se caracterizó además por la formación de imágenes de enzimas de restricción en ADN estirado ópticamente. La figura 10h muestra la mejora de la resolución con el aumento de PSTED- A PSTED = 26 mW, se obtuvo una resolución de 50 /- 5 nm FWHM, correspondiente a una mejora de resolución de 6 veces sobre la imagen confocal en las mismas condiciones (dada por los lentes de inmersión al agua y el medio acuoso). En particular, esta ganancia en resolución permite obtener imágenes de complejos de ADN-proteína en pinzas ópticas con una resolución comparable a la longitud de persistencia del ADN.

La figura 11 ilustra la caracterización de la precisión de localización. (a) Quimógrafo de EcoRV-Atto647N inmovilizado sobre ADN estirado ópticamente (las dimensiones del quimógrafo son 17.4 s por 750 nm). (b) Quimógrafo de TFAMAtto647N que se difunde sobre ADN estirado ópticamente (las dimensiones del quimógrafo son 9.6 s por 750 nm). El factor de transcripción A, mitocondrial (TFAM) es una proteína que en humanos está codificada por el gen TFAM. Se obtuvieron imágenes de los quimógrafos de (a) y (b) parcialmente mediante microscopía confocal y parcialmente mediante nanoscopia STED (PSTED = 6 mW). Las líneas rojas siguen los centros de las distribuciones de fotones y se obtuvieron ajustando gaussianos 1D a cada columna de píxeles. (c) Muestra la densidad espectral de potencia (PSD) para las posiciones rastreadas de las proteínas en el a Dn . Los cuadrados negros muestran la PSD para un solo TFAM-Atto647N que se difunde en el ADN. La línea discontinua indica el comportamiento 1/f2. Los círculos indican PSD promediados para BsoBI-Atto647N inmovilizado en ADN para imágenes confocales (azul, abierto) e imágenes STEd (rojo, relleno), (d) Muestra la precisión de localización Axrms en función de la potencia STED. Los círculos rojos muestran la precisión de localización obtenida a partir del seguimiento de proteínas inmovilizadas en el ADN, los triángulos negros muestran la precisión de localización ideal calculada para el mismo conjunto de datos y la línea discontinua indica la precisión de localización ideal óptima que asume que no hay pérdida en el brillo máximo de los fluoróforos al aumentar Potencia STED. En todos los experimentos, la tensión del ADN fue de ~ 5 pN.

La Figura 12 ilustra la dinámica de unión y difusión de TFAM en ADN estirado ópticamente. (a) Quimógrafos confocales. A medida que el ADN (a una tensión de D5 pN) se mueve hacia un canal con 50 nM de TFAM-Atto647N humano (la concentración estimada es menor debido a la adsorción, aproximadamente 5 nM), las moléculas de TFAM se unen al ADN y experimentan una difusión unidimensional a lo largo del ADN. (b) Quimografías de la dinámica de TFAM-Atto647N en imágenes de ADN estirado ópticamente en tampón ROXS. Inicialmente, el rayo STED está apagado (rectángulo azul). Después de □ 5s, el haz STED se enciende a 6 mW, como lo indican los rectángulos rojos.

La formación de imágenes en (a) y (b) se realizó a 10 ms por píxel de 25 nm, velocidad de línea de 90 Hz, se muestran promedios de 5 líneas. (c, d) Histogramas de la intensidad normalizada, la normalidad y el coeficiente de difusión, D, de TFAM-Atto647N en el ADN (N = 143) obtenidos tanto por STED como por imágenes confocales. Las barras azules indican TFAM inmediatamente después de unirse al ADN (N = 42), mientras que las barras rojas indican el conjunto de datos completo (N = 143), incluidos los filamentos TFAM y TFAM ya unidos. Los datos de intensidad de (c) se normalizaron a la intensidad de un solo fluoróforo. D se calculó ajustando el desplazamiento medio cuadrático (MSD) determinado a partir de trazos individuales (que constan de aproximadamente 150 /- 75 exploraciones lineales, con un mínimo de 50 líneas) a MSD = 2Dt desplazamiento. Las curvas en (d) indican distribuciones normalizadas de D calculadas para datos de difusión simulados con Dref = 0.08 pm2/s (punteado) y con un rango de constantes de difusión D = Dref/n donde n = 1,2,3.,.. , 12 (sólido), (e) Kymografía de un evento de oligomerización TFAMAtto647N (velocidad de línea 90 Hz, promedio de 5 líneas mostrado), (f) Análisis de MSD de las trayectorias I-III como se muestra en (e).

La Figura 13 ilustra una nanoscopia STED de ADN que está densamente recubierto con TFAM. (a) Imagen de microscopía confocal de filamentos TFAM-Atto647N a alta densidad en ADN. (b) Quimógrafo STED de la sección del ADN representada en (b). Potencia STED 16 mW. (c) Perfil de intensidad acumulada como se indica en (a) (línea superior) y (b) (línea inferior), comparando los perfiles confocal y STED.

Se apreciará que, aunque se mostraron realizaciones de ejemplo para métodos y sistemas para obtener imágenes de una hebra molecular, los expertos en la técnica también pueden contemplar formas alternativas que tengan el beneficio de la presente divulgación para lograr funciones y resultados similares. Por ejemplo, los componentes ópticos y/o eléctricos pueden combinarse o dividirse en uno o más componentes alternativos, por ejemplo, espejos curvos en lugar o además de lentes, diferentes detectores o fuentes de luz, etcétera. Los diversos elementos de las realizaciones discutidos y mostrados ofrecen ciertas ventajas, tales como alta precisión y control orientados a la formación de imágenes de hebras de tamaño de molécula unidimensional. Por supuesto, debe apreciarse que cualquiera de las realizaciones o procesos anteriores puede combinarse con una o más de otras realizaciones o procesos para proporcionar incluso más mejoras en la búsqueda y adaptación de diseños y ventajas. Se aprecia que esta divulgación ofrece ventajas particulares para el estudio de la biología molecular y, en general, se puede aplicar para cualquier aplicación en la que se obtenga una imagen de una hebra molecular. Aunque la presente divulgación proporciona ventajas específicas mediante el uso de STED, en particular 1D-STED, también se pueden contemplar otras técnicas de superresolución para combinarse con los sistemas y métodos presentes tales como PALM/STORM. Si bien el uso de trampas ópticas proporciona ventajas únicas en el control de la captura y alineación de la hebra, también se pueden utilizar alternativas para capturarla hebra. Por ejemplo, también se pueden emplear otros mecanismos de captura y extensión tales como pinzas magnéticas o estiramiento por flujo. También son posibles combinaciones, por ejemplo, un extremo de la hebra se puede sujetar mediante una trampa óptica o magnética mientras que la hebra se estira mediante estiramiento por flujo. La hebra también puede quedar capturada mediante la unión a una estructura más grande, como un portaobjetos de vidrio y estirado por flujo o un punto de unión incrustado en una bicapa lipídica soportada.

Si bien los presentes sistemas y métodos se han descrito así en particular detalle con referencia a realizaciones ejemplares específicas de los mismos, también debe apreciarse que los expertos en la técnica pueden idear numerosas modificaciones y realizaciones alternativas sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Por ejemplo, se considera que las realizaciones en las que se divulgan dispositivos o sistemas para disponer y/o construir para realizar un método o función especificados divulgan implícitamente el método o la función como tal y/o en combinación con otras realizaciones de métodos o sistemas divulgados. Además, se considera que las realizaciones de métodos revelan implícitamente su implementación en el hardware respectivo, cuando sea posible, en combinación con otras realizaciones de métodos o sistemas divulgados. Además, los métodos que se pueden incorporar como instrucciones de programa, por ejemplo, en un medio de almacenamiento no transitorio legible por ordenador, se consideran inherentemente divulgados como tal realización.

Finalmente, la discusión anterior está destinada a ser meramente ilustrativa de los sistemas y/o métodos presentes y no debe interpretarse como una limitación de las reivindicaciones adjuntas a ninguna realización particular o grupo de realizaciones. De acuerdo con lo anterior, la memoria descriptiva y los dibujos deben considerarse de manera ilustrativa y no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Al interpretar las reivindicaciones adjuntas, debe entenderse que la palabra “que comprende” no excluye la presencia de otros elementos o actos distintos de los enumerados en una reivindicación determinada; la palabra “un” o “una” que precede a un elemento no excluye la presencia de una pluralidad de tales elementos; cualquier signo de referencia en las reivindicaciones no limita su alcance; varios “medios” pueden estar representados por el mismo elemento o elementos diferentes o la estructura o función implementada; dentro del alcance de las reivindicaciones, cualquiera de los dispositivos descritos o partes de los mismos pueden combinarse o separarse en partes adicionales.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para obtener imágenes de una hebra molecular (MS), el método comprende

- proporcionar un volumen de muestra (SV) que comprende la hebra (MS) con perlas de captura (BD) unidas en extremos opuestos de la hebra (MS); y

- proporcionar un haz de excitación (EB) que tiene un foco de excitación (EF) en el volumen de muestra (SV) en el que una excitación de un fluoróforo (FL) en la hebra (MS) por el foco de excitación (EF) da como resultado una respuesta de fluorescencia (FR) cuando el foco de excitación (EF) coincide con el fluoróforo (FL); caracterizado porque el método comprende además las siguientes etapas:

- explorar el foco de excitación (EF) en el volumen de muestra (SV) a lo largo de una línea de exploración unidimensional (SL);

- proporcionar trampas ópticas (OT), capturar las perlas de captura (BD) en los extremos de la hebra (MS) en el volumen de muestra (SV) y extender la hebra (MS) entre las trampas ópticas (OT) para formar una línea de captura dimensional (LL) paralela a la línea de exploración unidimensional (SL);

- alinear la línea de captura unidimensional (LL) para que coincida con la línea de exploración unidimensional (SL) para que el foco de excitación de exploración (EF) coincida con la hebra (MS); y

- registrar la respuesta de fluorescencia (FR) en función de una pluralidad de posiciones de exploración distintas (X0) del foco de excitación (EF) a lo largo de la línea de exploración unidimensional (SL).

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende proporcionar un haz de agotamiento (DB) que tiene un foco de agotamiento (DF) con un perfil de agotamiento coincidente con un perfil de excitación del foco de excitación (EF) y que provoca el agotamiento de la emisión estimulada (STED) de la excitación. del fluoróforo (FL) de acuerdo con el perfil de agotamiento, en el que el perfil de agotamiento tiene una intensidad mínima en un centro del foco de excitación (EF) para reducir el área donde se produce la emisión fluorescente espontánea (agotamiento de la emisión estimulada - STED) en el que el perfil de agotamiento comprende una región de mínima intensidad (PLM) que coincide con la línea de captura unidimensional (LL).

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende proporcionar un haz de agotamiento (DB) que tiene un foco de agotamiento (DF) con un perfil de agotamiento coincidente con un perfil de excitación del foco de excitación (EF) y que provoca el agotamiento de la emisión estimulada (STED) de la excitación del fluoróforo (FL) de acuerdo con el perfil de agotamiento, en el que el perfil de agotamiento tiene una intensidad mínima en un centro del foco de excitación (EF) para reducir un tamaño de perfil de fluoróforos excitados por el agotamiento de emisión estimulada (STED) en el que el perfil de agotamiento comprende un plano de mínima intensidad (PLM) que se extiende perpendicular (Y, Z) a la línea de captura unidimensional (LL).

4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que las perlas capturadas ópticamente (BD) se unen a la hebra (MS) para capturar la hebra (MS), en el que las perlas (BD) ejercen una fuerza de tracción sobre la hebra (MS). para suprimir las fluctuaciones térmicas de la hebra a un valor por debajo del límite de difracción.

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las perlas (BD) tienen un diámetro mayor que la cintura de un haz de captura que captura las perlas.

6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la respuesta de fluorescencia (FR) se registra en un plano de imagen (IP) cuyo plano de imagen (IP) es un plano focal conjugado (OP*) de un plano de objeto (OP) en el volumen de muestra (SV), en el que el plano del objeto (OP) se extiende en la primera dirección (X) y en el que el foco de excitación (EF) y la línea de captura unidimensional (LL) están alineados para coincidir con el plano del objeto (OP) en el que se proporciona un microagujero espacial en el plano de la imagen (IP), en el que el microagujero espacial se alinea para coincidir con un punto focal conjugado (EF*) del foco de excitación (EF) para pasar la respuesta de fluorescencia (FR) a través del microagujero espacial para un detector de fluorescencia (FD).

7. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el foco de excitación (EF) se explora repetidamente hacia adelante y hacia atrás a lo largo de la línea de exploración unidimensional en el que la respuesta de fluorescencia (FR) se distingue entre la pluralidad de posiciones de exploración distintas (X0) a lo largo de la línea de exploración unidimensional (SL) y/o integrado en múltiples exploraciones y/o registrado en función del tiempo.

8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el volumen de muestra (SV) está comprendido en una celda de muestra (SC) que comprende una ventana de muestra (SW) transparente a los haces de excitación y/o agotamiento entrantes (DB, EB), en el que la celda de muestra (SC) comprende actuadores rotacionales para inclinar y/o rotar la celda de muestra (SC), en el que el método comprende además alinear la ventana de muestra (SW) para que sea perpendicular a los haces entrantes (DB, EB) para optimizar un perfil del foco de excitación (EF) y/o foco de agotamiento (DF).

9. Método para medir la interacción de un reactivo fluorescente (PR) con una hebra molecular (MS), el método comprende:

- proporcionar una celda de flujo microfluídica FC en la que los canales de entrada (IC) separados de la celda de flujo (FC) proporcionan una pluralidad de flujos laminares separados (IV) en un volumen de muestra (SV) de la celda de flujo (FC), en el que

o un primer flujo laminar (I) comprende una pluralidad de perlas (BD) dispuestas para unirse a extremos opuestos de la hebra molecular (MS);

o un segundo flujo laminar (II) comprende una pluralidad de hebras moleculares (MS); y

o un tercer flujo laminar (III, IV) comprende el reactivo (RE, PR);

- proporcionar una trampa óptica (OT) en el primer flujo laminar (I) y capturar una perla (BD) con la trampa óptica (OT);

- colocar la trampa óptica (OT) en el segundo flujo laminar (II) y unir la perla (BD) a una hebra (MS);

- posicionar la trampa óptica (OT) en el tercer flujo laminar (III, IV); y

- utilizar un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para registrar la respuesta de fluorescencia (FR) del reactivo (RE, PR).

10. Método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la hebra molecular (MS) es una hebra de ADN o ARN y el reactivo fluorescente (PR) comprende un reactivo que se asocia con la hebra molecular tal como moléculas de proteína.

11. Sistema para obtener imágenes de una hebra molecular (MS), el sistema comprende

- una celda de muestra (SC) dispuesta para proporcionar un volumen de muestra (SV) que comprende la hebra (MS); - una fuente de luz de excitación (EL) dispuesta para proporcionar un haz de excitación (EB) que tiene un foco de excitación (EF) en el volumen de muestra (SV) en el que una excitación de un fluoróforo (FL) en la hebra (MS) por el foco de excitación (EF) da como resultado una respuesta de fluorescencia (FR) cuando el foco de excitación (EF) coincide con el fluoróforo (FL);

- un escáner de haz (M3) dispuesto para explorar el foco de excitación (EF) en el volumen de muestra (SV) a lo largo de una línea de exploración unidimensional (SL);

- una trampa (TL) dispuesta para capturar un extremo de la hebra (MS) en el volumen de muestra (SV) y extender la hebra (MS) a lo largo de una línea de captura unidimensional (LL) paralela a la línea de exploración unidimensional (SL); en el que la trampa comprende una fuente de luz de captura (TL) y ópticas de haz de captura (M1, M2, T1) dispuestas para proporcionar trampas ópticas (OT), perlas de captura (BD) unidas en los extremos opuestos de la hebra (MS), en el que las trampas ópticas (OT) están dispuestas para formar la línea de captura unidimensional (LL) entre las perlas (BD);

- un alineador de haz (M1, M2, M3, T1, T3) dispuesto para alinear la línea de captura unidimensional (LL) para que coincida con la línea de exploración unidimensional (SL) para que el foco de excitación de exploración (EF) coincida con la hebra (MS); y

- un detector de fluorescencia (FD) dispuesto para registrar la respuesta de fluorescencia (FR) en función de una pluralidad de posiciones de exploración distintas (X0) del foco de excitación (EF) a lo largo de la línea de exploración unidimensional (SL); y

- un procesador (CPU) programado para proporcionar un modo de exploración en el que

o el procesador controla la trampa (TL) para extender la hebra (MS) a lo largo de una línea de captura unidimensional (LL) en la primera dirección (X);

o el procesador controla el alineador de haz (M1, M2, M3, T1, T3) para que la línea de captura unidimensional (LL) coincida con la línea de exploración unidimensional (SL);

o el procesador controla el escáner de haz (M3) para explorar el foco de excitación (EF) a lo largo de la línea de exploración unidimensional (SL);

o el procesador recibe la respuesta de fluorescencia registrada (FR) del detector de fluorescencia (FD); y o el procesador almacena la respuesta de fluorescencia (FR) en una o más posiciones (X0) del foco de excitación (EF) a lo largo de la línea de exploración unidimensional (SL).

12. Sistema de acuerdo con la reivindicación 11, que adicionalmente comprende

- una fuente de luz de agotamiento (DL) y ópticas de haz de agotamiento (M3, T3) dispuestas para proporcionar un haz de agotamiento (DB) que tiene un foco de agotamiento (DF) con un perfil de agotamiento coincidente con un perfil de excitación del foco de excitación (EF) y que causa el agotamiento de la emisión estimulada (STED) de la excitación del fluoróforo (FL) de acuerdo con el perfil de agotamiento, en el que el perfil de agotamiento tiene una intensidad mínima en un centro del foco de excitación (EF) para reducir un tamaño de perfil de fluoróforos excitados por el agotamiento de la emisión estimulada (STED);

- un modelador de enfoque de agotamiento (PP) dispuesto para dar forma al perfil de agotamiento en el que el perfil de agotamiento comprende un plano de intensidad mínima (PLM) que se extiende perpendicular (Y, Z) a la línea de captura unidimensional (LL).

13. Sistema de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en el que

- la celda de muestra (SC) comprende una celda de flujo de microfluidos FC en la que los canales de entrada (IC) separados de la celda de flujo (FC) proporcionan una pluralidad de flujos laminares (I-V) separados en un volumen de muestra (SV) de la celda de flujo (FC);

- la trampa (TL) comprende trampas ópticas (OT) que capturan perlas (BD) unidas en extremos opuestos de la hebra (MS), en el que las trampas ópticas (OT) están dispuestas para formar la línea de captura unidimensional (LL) entre las perlas (BD);

- en el que las trampas ópticas (OT) se pueden mover entre los flujos laminares (I-V).