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ES2896080T3 - Procedimiento en columna totalmente escalable de preparación de VAAr - Google Patents

Procedimiento en columna totalmente escalable de preparación de VAAr Download PDF

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ES2896080T3
ES2896080T3 ES17776783T ES17776783T ES2896080T3 ES 2896080 T3 ES2896080 T3 ES 2896080T3 ES 17776783 T ES17776783 T ES 17776783T ES 17776783 T ES17776783 T ES 17776783T ES 2896080 T3 ES2896080 T3 ES 2896080T3
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Guang Qu
Younghoon Oh
Lin Lu
John Fraser Wright
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Spark Therapeutics Inc
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Abstract

Procedimiento para purificar partículas de vector adenoasociado recombinante (VAAr), en el que dicho procedimiento comprende las etapas siguientes: (a) recolectar las células y el sobrenadante de cultivo celular que comprende partículas de vector VAAr para producir un recolectado; (b) opcionalmente concentrar dicho recolectado producido en la etapa (a) para producir un recolectado concentrado; (c) lisar dicho recolectado producido en la etapa (a) o dicho recolectado concentrado producido en la etapa (b) para producir un lisado; (d) tratar el lisado producido en la etapa (c) para reducir el ácido nucleico contaminante en el lisado, produciendo de esta manera un lisado con una cantidad reducida de ácido nucleico; (e) filtrar dicho lisado con una cantidad reducida de ácido nucleico producido en la etapa (d) para producir un lisado clarificado, y opcionalmente diluir dicho lisado clarificado para producir un lisado clarificado diluido; (f) someter dicho lisado clarificado o lisado clarificado diluido producido en la etapa (e) a cromatografía de columna de intercambio aniónico o a cromatografía de columna de intercambio catiónico para producir un eluido de columna que comprende partículas de vector VAAr, y opcionalmente concentrar dicho eluido de columna para producir un eluido de columna concentrado; (g) someter dicho eluido de columna o dicho eluido de columna concentrado producido en la etapa (f) a cromatografía de columna de exclusión por tamaño para producir un segundo eluido de columna que comprende partículas de vector VAAr, separando de esta manera las partículas de vector VAAr respecto de las impurezas de proteínas, y opcionalmente diluir dicho segundo eluido de columna para producir un segundo eluido de columna diluido; (h) someter dicho segundo eluido de columna o dicho segundo eluido de columna diluido producido en la etapa (g) a cromatografía de columna de intercambio catiónico en el caso de que en la etapa (f) dicho lisado clarificado o lisado clarificado diluido producido en la etapa (e) se haya sometido a cromatografía de intercambio aniónico o a cromatografía de columna de intercambio aniónico en el caso de que en la etapa (f) dicho lisado clarificado o lisado clarificado diluido producido en la etapa (e) se haya sometido a cromatografía de intercambio catiónico para producir un tercer eluido de columna que comprende partículas de vector VAAr, separando de esta manera partículas de vector VAAr respecto de impurezas de proteínas u otras impurezas de producción, y opcionalmente concentrar dicho tercer eluido de columna para producir un tercer eluido de columna concentrado; y (i) filtrar dicho tercer eluido de columna o dicho tercer eluido de columna concentrado producido en la etapa (h), produciendo de esta manera partículas de vector VAAr purificadas.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento en columna totalmente escalable de preparación de VAAr
Introducción
La administración génica es un procedimiento prometedor para el tratamiento de las enfermedades adquiridas y hereditarias. Se han descrito varios sistemas basados en virus con fines de transferencia génica, incluyendo sistemas basados en virus adenoasociados (VAA).
Un VAA es un parvovirus ADN dependiente de ayudante que pertenece al género Dependovirus. El VAA requiere las funciones de un virus ayudante, por ejemplo, adenovirus, virus herpes o Vaccinia, para que se produzca una infección productiva. En ausencia de las funciones de un virus ayudante, VAA establece un estado latente mediante la inserción de su genoma en un cromosoma de la célula huésped. La infección posterior por un virus ayudante rescata el genoma vírico integrado, que a continuación puede replicarse para producir progenie de VAA infecciosa.
El VAA presenta un espectro de huéspedes amplio y es capaz de replicarse en células de cualquier especie en presencia de un virus ayudante adecuado. Por ejemplo, el VAA humano se replicará en células caninas coinfectadas con un adenovirus canino. El VAA no se ha asociado a ninguna enfermedad humana o animal y aparentemente no afecta adversamente a las propiedades biológicas de la célula huésped tras la integración.
Los vectores VAA pueden manipularse para portar una secuencia de ácido nucleico heterólogo de interés (por ejemplo, un gen seleccionado codificante de una proteína terapéutica, un ácido nucleico inhibidor, tal como una molécula antisentido, un ribozima, un ARNmi, etc.) mediante deleción, en su totalidad o en parte, de la parte interna del genoma de VAA y la inserción de la secuencia de ácido nucleico entre las repeticiones terminales invertidas (RTI). Las RTI se mantienen funcionales en dichos vectores, permitiendo la replicación y empaquetamiento del VAAr que contiene la secuencia de ácido nucleico heteróloga de interés. La secuencia de ácido nucleico heteróloga también se une típicamente a una secuencia de promotor capaz de regular la expresión del ácido nucleico en las células diana del paciente. También pueden incluirse señales de terminación, tales como sitios de poliadenilación, en el vector.
La construcción de vectores VAA recombinantes (VAAr) infecciosos se ha descrito en varias publicaciones. Véanse, por ejemplo, las patentes US n° 5.173.414 y n° 5.139.941; números de publicación de patente internacional n° WO 92/01070 y n°WO 93/03769; Lebkowski et al. Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996, 1988; Vincent et al. Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press), 1990; Carter, B. J., Current Opinion in Biotechnology 3:533-539, 1992; Muzyczka, N., Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129, 1992 y Kotin, R. M., Human Gene Therapy 5:793-801, 1994.
Los vectores de virus adenoasociado (VAA) recombinante se han mostrado muy prometedores para la terapia en varios ensayos clínicos de fase temprana realizados por múltiples grupos. El desarrollado de esta nueva clase de producto biológico hacia la autorización implicará mejoras en la caracterización del vector y en los procedimientos de control de calidad, incluyendo una mejor comprensión de cómo el diseño del vector y los parámetros del procedimiento de preparación afectan a los perfiles de impurezas en los vectores de grado clínico.
Un objetivo importante en el diseño de los sistemas de producción y purificación de VAAr es la implementación de estrategias para minimizar/controlar la generación de impurezas relacionadas con la producción, tales como proteínas, ácidos nucleicos e impurezas relacionadas con el vector, incluyendo especies de VAA de tipo salvaje (VAAwt)/de tipo pseudosalvaje e impurezas de ADN residual encapsidadas en VAA. La eliminación de impurezas en los vectores VAA resulta complicada debido al modo en que se producen los vectores VAAr. En un procedimiento de producción, los vectores VAAr se producen mediante un procedimiento de transfección transitoria mediante la utilización de tres plásmidos. Se introducen cantidades significativas de ADN plasmídico en las células para producir vectores VAAr. Además, al liberar los vectores VAAr a partir de las células productoras, se liberan simultáneamente proteínas y ácidos nucleicos celulares. Considerando que los vectores VAAr representan solo aproximadamente 1% de la biomasa, resulta muy problemático purificar los vectores VAAr hasta un nivel de pureza que permita la utilización como producto clínico de terapia génica humana. (Smith PH Wright JF. Qu G. et al., Mo. Therapy, 7:8348, 2003; Chadeuf G. et al, Mo. Therapy 12:744, 2005. Report from the CHMP gene therapy expert group meeting. Agencia Europea de Medicamentos Em EA/CHMP 2005, 183989/2004).
El desarrollo de procedimientos de preparación para purificar VAA recombinante como producto para tratar enfermedades humanas debería conseguir los objetivos siguientes: 1) pureza, potencia y seguridad consistentes del vector; 2) escalabilidad del procedimiento de preparación, y 3) coste de fabricación aceptable. Los procedimientos actuales de purificación de vector VAA escalables "de estándar industrial" no consiguen adecuadamente la eliminación de impurezas, que resulta importante para cumplir el primer objetivo indicado anteriormente (pureza, potencia y seguridad consistentes del vector). Además, el fracaso en la eliminación adecuada de impurezas mediante la utilización de los procedimientos actuales de purificación escalable de estándar industrial se ha producido porque: 1) el desarrollo de procedimientos de purificación de productos víricos, tales como VAA recombinante, para aplicaciones diferentes de vacunas (en las que típicamente se busca una respuesta inmunitaria, en lugar de evitarla) es relativamente nuevo; 2) muchos grupos participantes en el desarrollo de procedimiento de purificación escalable para los vectores VAA no han sido conscientes de los niveles elevados de impurezas relacionadas con el vector y/o han asumido que tales impurezas no contribuirán a una inmunogenicidad clínicamente significativa del vector, y 3) resulta técnicamente problemático desarrollar procedimientos de purificación escalable adecuados para la fabricación a escala industrial de vectores VAAr.
Descripción resumida
La presente invención se define mediante las reivindicaciones. Según la invención, proporcionada en la presente memoria, en algunos aspectos es un procedimiento para purificar partículas de vector adenoasociado recombinante (VAAr), en el que el procedimiento comprende las etapas de: (a) recolectar células y/o sobrenadante de cultivo celular que comprende partículas de vector VAAr para producir una recolección, (b) concentrar opcionalmente la recolección producida en la etapa (a) a fin de producir una recolección concentrada, (c) lisar la recolección producida en la etapa (a) o la recolección concentrada producida en la etapa (b) a fin de producir un lisado, (d) tratar el lisado para reducir el ácido nucleico contaminante en el lisado, produciendo de esta manera un lisado con cantidad reducida de ácidos nucleicos, (e) filtrar el lisado con cantidad reducida de ácidos nucleicos producido en la etapa (d), a fin de producir un lisado clarificado, y opcionalmente diluir el lisado clarificado para producir un lisado clarificado diluido, (f) someter el lisado clarificado o el lisado clarificado diluido producido en la etapa (e) a cromatografía de columna de intercambio aniónico o de columna de intercambio catiónico para producir un eluido de columna que comprende partículas de vector VAAr, y opcionalmente concentrar el eluido de columna para producir un eluido de columna concentrado, (g) someter el eluido de columna o el eluido de columna concentrado producido en la etapa (f) a cromatografía de columna de exclusión por tamaño a fin de producir un segundo eluido de columna que comprende partículas de vector VAAr, separando de esta manera partículas de vector VAAr respecto de impurezas proteicas, y opcionalmente diluir el segundo eluido de columna para producir un segundo eluido de columna diluido, (h) someter el segundo eluido de columna o el segundo eluido de columna diluido producido en la etapa (g) a cromatografía de columna de intercambio catiónico en el caso de que en la etapa (f) dicho lisado clarificado o lisado clarificado diluido producido en la etapa (e) se haya sometido a cromatografía de intercambio aniónico, o a cromatografía de columna de intercambio aniónico en el caso de que en la etapa (f) dicho lisado clarificado o lisado clarificado diluido producido en la etapa (e) se haya sometido a cromatografía de intercambio catiónico, a fin de producir un tercer eluido de columna que comprende partículas de vector VAAr, separando de esta manera las partículas de vector VAAr respecto de proteínas u otras impurezas de producción, y opcionalmente concentrar el tercer eluido de columna para producir un tercer eluido de columna concentrado, y (i) filtrar el tercer eluido de columna o el tercer eluido de columna concentrado producido en la etapa (h), produciendo de esta manera partículas de vector VAAr purificadas. Los aspectos siguientes se refieren a una o más etapas, (a) a (h), anteriormente.
En determinados aspectos, la etapa (f) comprende someter el lisado clarificado o lisado clarificado diluido producido en la etapa (e) a cromatografía de intercambio aniónico, y la etapa (h) comprende someter el segundo eluido de columna o el segundo eluido de columna diluido producido en la etapa (g) a cromatografía de columna de intercambio catiónico. En determinados aspectos, la etapa (f) comprende someter el lisado clarificado o lisado clarificado diluido producido en la etapa (e) a cromatografía de intercambio catiónico, y la etapa (h) comprende someter el segundo eluido de columna o el segundo eluido de columna diluido producido en la etapa (g) a cromatografía de columna de intercambio aniónico.
En algunos aspectos, la concentración de la etapa (b) y/o (f) y/o (h) es mediante ultrafiltración/diafiltración, opcionalmente mediante filtración de flujo tangencial. En algunos aspectos, la concentración de la etapa (b) reduce el volumen de las células recolectadas y del sobrenadante de cultivo celular en aproximadamente entre 2 y 10 veces. En determinados aspectos, la concentración de la etapa (f) reduce el volumen del eluido de columna en aproximadamente entre 5 y 20 veces. En algunos aspectos, el lisado del recolectado producido en la etapa (a) o el recolectado concentrado producido en la etapa (b) es mediante microfluidización.
En determinados aspectos, después de la etapa (b) y antes de la etapa (c), el procedimiento comprende una etapa (b)(i). En determinados aspectos, la etapa (b)(i) comprende reducir la cantidad de ácidos nucleicos contaminantes en el lisado. En algunos aspectos, la etapa (b)(i) comprende tratar el lisado con una nucleasa, reduciendo de esta manera cantidad de ácidos nucleicos contaminantes. En determinados aspectos, la nucleasa comprende benzonasa.
En algunos aspectos, la filtración del lisado clarificado o del lisado clarificado diluido de la etapa (e) se realiza con un filtro que presenta un diámetro de poro de entre aproximadamente 0.1 y 0.8 micrómetros, ambos inclusive. En determinados aspectos, la dilución del lisado clarificado o del lisado clarificado diluido de la etapa (e) es con una solución acuosa tamponada de acetato.
En algunos aspectos, la dilución del segundo eluido de columna de la etapa (g) es con una solución acuosa tamponada de acetato. En determinados aspectos, la solución acuosa tamponada de acetato presenta un pH de entre aproximadamente 4.0 y 7.0, ambos inclusive.
En algunos aspectos, las partículas de vector VAAr se formulan con un surfactante para producir una formulación de vector VAA. En determinados aspectos, las partículas de vector VAAr que resultan de la etapa (i) se formulan con un surfactante para producir una formulación de vector VAA.
En algunos aspectos, la cromatografía de columna de intercambio catiónico o aniónico de la etapa (f) comprende cromatografía de columna modulada con polietilenglicol (PEG). En determinados aspectos, la cromatografía de columna de intercambio catiónico o aniónico de la etapa (f) comprende el lavado de la columna con una solución de PEG antes de la elución de las partículas de vector VAAr de la columna. En determinados aspectos, el PEG en la solución de PEG presenta un peso molecular medio comprendido en el intervalo comprendido entre aproximadamente 1,000 y 50,000, ambos inclusive. En algunos aspectos, la columna de intercambio catiónico o aniónico de la etapa (e) comprende el lavado de la columna con una solución acuosa de surfactante antes de la elución de las partículas de vector VAAr de la columna. En determinados aspectos, la cromatografía de columna de intercambio catiónico o aniónico de la etapa (h) comprende el lavado de la columna con una solución de surfactante antes de la elución de las partículas de vector VAAr de la columna. En algunos aspectos, una solución de PEG y/o la solución de surfactante comprende un tampón acuoso de Tris-Cl/NaCl o un tampón acuoso de fosfato/NaCl. En determinados aspectos, el tampón de NaCl comprende entre aproximadamente 20 y 250 mM de NaCl, ambos inclusive, o entre aproximadamente 50 y 200 mM de NaCl, ambos inclusive.
En algunos aspectos, las partículas de vector VAAr se eluyen de la columna de intercambio catiónico o aniónico de la etapa (f) en un tampón acuoso de Tris-Cl/NaCl. En determinados aspectos, el tampón de Tris-Cl/NaCl comprende 50 a 200 mM de NaCl. En determinados aspectos, las partículas de vector VAAr se eluyen de la columna de intercambio catiónico o aniónico de la etapa (h) en un tampón acuoso de fosfato/NaCl. En algunos aspectos, el tampón de fosfato/NaCl comprende entre aproximadamente 100 y 500 mM de NaCl, ambos inclusive. En determinados aspectos, la columna de intercambio catiónico de la etapa (f) comprende un grupo funcional de amonio cuaternario. En determinados aspectos, el grupo funcional de amonio cuaternario comprende una polietilenimina cuaternizada.
En determinados aspectos, la columna de exclusión por tamaño, por ejemplo, de la etapa (g), presenta un intervalo de separación (de pesos moleculares) comprendido entre aproximadamente 10,000 y 600,000, ambos inclusive. En algunos aspectos, la columna de intercambio catiónico de la etapa (h) comprende un ácido sulfónico. En algunos aspectos, la columna de intercambio catiónico de la etapa (h) comprende sulfopropilo.
En determinados aspectos, los procedimientos divulgados en la presente memoria excluyen una etapa de ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio.
En determinados aspectos, las partículas de vector VAAr comprenden un transgén que codifica un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste en un ARNip, una molécula antisentido, ARNmi, un ribozima y un ARNhc. En algunos casos, las partículas de vector VAAr comprenden un transgén que codifica un producto génico seleccionado de entre el grupo que consiste en insulina, glucagón, hormona de crecimiento (HC), hormona paratiroidea (HPT), factor liberador de hormona del crecimiento (FHC), hormona folículo-estimulante (HFE), hormona luteinizante (HL), gonadotropina coriónica humana (GCh), factor de crecimiento vascular endotelial (FCVE), angiopoyetinas, angiostatina, factor estimulante de colonias de granulocitos (FECG), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento del tejido conectivo (FCTC), factor de crecimiento fibroblástico básico (FCFb), factor de crecimiento fibroblástico ácido (FCFa), factor de crecimiento epidérmico (FCE), factor a de crecimiento transformante (FCTa), factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP), factores I y II de crecimiento insulínico (FCI-I y FCI-II), TGFp, activinas, inhibinas, proteína morfogénica ósea (PMO), factor de crecimiento nervioso (FCN), factor neurotrófico derivado del cerebro (FNDC), neurotrofinas NT-3 y NT4/5, factor neurotrófico ciliar (FNTC), factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales (FNDG), neurturina, agrina, netrina-1 y netrina-2, factor de crecimiento de hepatocitos (FCH), efrinas, noggina, Sonic hedgehog y tirosina hidroxilasa.
En algunos aspectos, las partículas de vector VAAr comprenden un transgén que codifica un producto génico seleccionado de entre el grupo que consiste en trombopoyetina (TPO), interleuquina (IL1 a IL-17), proteína quimioatrayente de monocitos, factor inhibidor de leucemia, factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos, ligando Fas, factores a y p de necrosis tumoral, interferones a, p y y, factor de células madre, ligando flk-2/flt3, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena sencilla, receptores de células T, receptores de células T quiméricos, receptores de células T de cadena sencilla, moléculas del CMH de clase I y de clase II.
En determinados aspectos, las partículas de vector VAAr comprenden un transgén codificante de una proteína útiles para la corrección de errores innatos del metabolismo seleccionados de entre el grupo que consiste en carbamoil sintetasa I, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, arginosuccinato liasa, arginasa, fumarilacetacetato hidrolasa, fenilalanina hidroxilasa, antitripsina alfa-1, glucosa-6-fosfatasa, porfobilinógeno desaminasa, factor V, factor VIII, factor IX, cistatión beta-sintasa, cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada, albúmina, isovaleril-CoA deshidrogenasa, propionil-CoA carboxilasa, metil-malonil-CoA mutasa, glutaril-CoA deshidrogenasa, insulina, beta-glucosidasa, piruvato carboxilasa, fosforilasa hepática, fosforilasa quinasa, glicina descarboxilasa, RPE65, proteína H, proteína T, una secuencia reguladora transmembranal de la fibrosis quística (RTFQ) y una secuencia de ADNc de distrofina. En algunos aspectos, las partículas de vector VAAr comprenden un transgén que codifica Factor VIII o Factor IX.
En determinados aspectos, un procedimiento descrito en la presente memoria recupera aproximadamente entre 40% y 70% de las partículas de vector VAAr totales a partir del recolectado producido en la etapa (a) o el recolectado concentrado producido en la etapa (b). En algunos aspectos, un procedimiento descrito en la presente memoria produce partículas de vector VAAr que presentan una pureza mayor que las partículas de vector VAAr producidas o purificadas mediante purificación de columna de afinidad de VAA. En algunos aspectos, un procedimiento descrito en la presente memoria produce partículas de vector VAAr que presentan una pureza mayor que las partículas de vector VAAr producidas o purificadas mediante purificación de columna de afinidad de VAA con una purificación de columna de intercambio aniónico. En determinados aspectos, un procedimiento descrito en la presente memoria produce partículas de vector VAAr que presentan una pureza mayor que las partículas de vector VAAr producidas o purificadas mediante purificación de columna de afinidad de VAA combinada con una purificación de columna de intercambio aniónico y una purificación de intercambio catiónico.
En determinados aspectos, las partículas de vector VAAr (por ejemplo, partículas de vector de VAAr verdaderas) se derivan de un VAA seleccionado de entre el grupo que consiste en VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9 y VAA10, VAA tyr-3, (3YAF, véase, por ejemplo el documento n° US 8.445.267) cápside de VAA con modificaciones peptídicas, tales como un péptido de reconocimiento celular.
En algunos aspectos, las partículas de vector VAA verdaderas se encuentran presentes al final (por ejemplo, tercer eluido de columna de la etapa (h) a una concentración de aproximadamente 100 mg/ml). En algunos aspectos, las partículas de vector VAAr verdaderas se encuentran presentes al final (por ejemplo, tercer eluido de columna de la etapa (h) a una concentración de 1015 partículas por ml o más, 1016 partículas por ml o más, o por ejemplo 1017 partículas por ml o más.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra un esquema de purificación de VAA de todas las columnas representativo con columnas de cromatografía aniónica, de filtración en gel (exclusión por tamaño) y de cromatografía catiónica. AIEX-cromatografía de intercambio aniónico; UF/DF- Ultrafiltración/Diafiltración; SEC- cromatografía de exclusión por tamaño y CIEX, cromatografía de intercambio catiónico. El esquema también puede llevarse a cabo en orden inverso.
La figura 2 muestra diversas opciones de diseño para desarrollar un procedimiento de purificación de VAA basado en columnas.
La figura 3 muestra los resultados comparativos de la purificación de VAA con cuatro esquemas de purificación (1 a 4) diferentes: (1) AVB (columna de afinidad de VAA basada en anticuerpos) y combinaciones de diferentes columnas: (2) AVB (columna de afinidad de VAA) en combinación con AIEX y CIEX, (3) AVB (columna de afinidad de VAA) en combinación con AIEX, y (4) AIEX en combinación con exclusión por tamaño CET y cromatografía CIEX. Los resultados muestran que las impurezas son menores en el esquema de purificación (4) que en los esquemas (1) y (2) y también probablemente inferiores que en el esquema (3). UF/DF- se utilizó la ultrafiltración/diafiltración para la concentración tal como se muestra, aunque opcionalmente se incluye en el esquema de purificación de VAA de columna.
Descripción detallada
La presente exposición proporciona una plataforma de purificación de vector virus adenoasociado (VAA) recombinante (VAAr) que incluye características únicas que lo distinguen de los procedimientos de purificación de vector VAA escalables del "estándar industrial" actual: 1) un procedimiento en plataforma modular que puede utilizarse para la purificación de diferentes serotipos/variantes de cápside del vector VAA, incluyendo la eliminación de impurezas del procedimiento e impurezas relacionadas con la producción, 2) una combinación única de etapas de cromatografía y etapas de procedimiento que proporcionan una escalabilidad inesperada para la purificación de muchos serotipos/pseudotipos diferentes de vectores VAAr.
Entre las impurezas se incluyen impurezas relacionadas con la producción del vector VAA, que incluyen proteínas, ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN), componentes celulares tales como componentes intracelulares y membranales que son impurezas diferentes de los vectores VAA. La expresión "impurezas relacionadas con la producción del vector" se refiere a cualesquiera componentes liberados durante el procedimiento de producción de VAA.
Los vectores VAA verdaderos se refieren a partículas de vector VAA que comprenden el ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, el transgén) que son capaces de infectar las células diana. La expresión excluye las cápsides de VAA vacías, los vectores VAA que no presentan insertos completos en el genoma empaquetado o vectores VAA que contienen ácidos nucleicos contaminantes del huésped. En determinados aspectos, los vectores VAA verdaderos se refiere a partículas de vector VAA que también carecen de secuencias contaminantes de plásmido en el genoma del vector empaquetado.
Las expresiones "cápsides vacías" y "partículas vacías" se refiere a una partícula o virión VAA que incluye una cubierta de cápside de VAA, aunque carece en su totalidad o en parte del genoma que comprende la secuencia heteróloga de ácido nucleico flanqueada en un lado o en ambos lados por RTI del VAA. Dichas cápsides vacías no funcionan transfiriendo la secuencia heteróloga de ácido nucleico al interior de la célula o células huésped dentro de un organismo.
El término "vector" se refiere a una molécula portadora pequeña de ácido nucleico, un plásmido, un virus (por ejemplo, un vector VAA) u otro vehículo que puede manipularse mediante inserción o incorporación de un ácido nucleico. Pueden utilizarse vectores para la manipulación genética (es decir, "vectores de clonación") para introducir/transferir polinucleótidos al interior de las células y para transcribir o traducir el polinucleótido insertado en las células. Un "vector de expresión" es un vector que contiene un gen o secuencia de ácido nucleico con las regiones reguladoras necesarias para la expresión en una célula huésped. Una secuencia de ácido nucleico de un vector generalmente contiene por lo menos un origen de replicación para la propagación en una célula, y opcionalmente elementos adicionales, tales como una secuencia heteróloga de ácido nucleico, un elemento de control de la expresión (por ejemplo, un promotor o un intensificador), intrón, repeticiones terminales invertidas (RTI), un marcador seleccionable opcional y una señal de poliadenilación.
Un vector VAA se deriva de un virus adenoasociado. Los vectores VAA resultan útiles como vectores de terapia génica, ya que pueden penetrar en las células e introducir ácidos nucleicos/material genético de manera que el ácido nucleico/material genético puede mantenerse establemente en las células. Además, dichos virus pueden introducir ácidos nucleicos/material genético en sitios específicos, por ejemplo, tal como un sitio específico en el cromosoma 19. Debido a que los VAA no están asociados a enfermedad patogénica en el ser humano, los vectores VAA son capaces de transportar secuencias heterólogas de ácido nucleico (por ejemplo, proteínas y agentes terapéuticos) a pacientes humanos sin causar patogénesis o enfermedad de VAA sustancial.
El término "recombinante" como modificador de vector, tal como vectores VAAr, así como un modificador de secuencias, tales como polinucleótidos y polipéptidos recombinantes, se refiere a que las composiciones han sido manipuladas (es decir, construidas) de una manera que generalmente no se observa en la naturaleza. Un ejemplo particular de un vector VAA recombinante sería en el que el ácido nucleico que normalmente no está presente en el genoma del VAA de tipo salvaje se inserta dentro del genoma vírico. Un ejemplo sería un ácido nucleico (por ejemplo, un gen) codificante de una secuencia proteica o polinucleótida terapéutica que se clona en un vector, con o sin regiones 5', 3' y/o de intrón con las que normalmente está asociado el gen dentro del genoma del VAA. Aunque el término "recombinante" no siempre se utiliza en la presente memoria en referencia a vectores VAA, así como secuencias tales como polinucleótidos, las formas recombinantes, incluyendo vectores VAA, polinucleótidos, etc., se encuentran expresamente incluidas a pesar de cualquier omisión de este tipo.
Un "vector VAAr" se deriva del genoma de tipo salvaje de un virus, tal como un VAA, mediante la utilización de procedimientos moleculares para eliminar el genoma de tipo salvaje respecto del genoma del VAA, y la sustitución por un ácido nucleico (heterólogo) no nativo, tal como un ácido nucleico codificante de una secuencia proteica o polinucleótida terapéutica. Típicamente, para el VAA, se retienen en el vector VAAr una o ambas secuencias de repetición terminal invertida (RTI) del genoma del VAA. Un VAAr se distingue de un genoma de VAA en que la totalidad o una parte del genoma del VAA ha sido sustituido por una secuencia no nativa con respecto al ácido nucleico genómico del VAA, tal como con un ácido nucleico heterólogo codificante de una secuencia proteica o polinucleótida terapéutica. Por lo tanto, la incorporación de una secuencia no nativa define el VAA como un vector VAA "recombinante", que puede denominarse "vector VAAr".
Una secuencia de vector VAA recombinante puede empaquetarse, en la presente memoria se hace referencia a una "partícula" para la posterior infección (transducción) de una célula, ex vivo, in vitro o in vivo. En el caso de que una secuencia de vector recombinante se encapside o se empaquete en una partícula de VAA, la partícula también puede denominarse "VAAr" o "partícula de VAAr" o "virión VAAr". Dichos VAAr, partículas de VAAr y viriones de VAAr incluyen proteínas que encapsidan o empaquetan el genoma del vector. Entre los ejemplos particulares se incluyen, en el caso del VAA, proteínas de cápside.
Un "genoma" de vector se refiere a la parte de la secuencia de plásmido recombinante que finalmente se empaqueta o se encapsida para formar una partícula de VAAr. En los casos en que se utilicen plásmidos recombinantes para construir o preparar vectores de VAA recombinante, el genoma del vector VAA no incluye la parte del "plásmido" que no corresponde a la secuencia genómica del vector del plásmido recombinante. Dicha parte genómica no vector del plásmido recombinante se denomina "esqueleto plasmídico", que resulta importante para la clonación y la amplificación del plásmido, un procedimiento que resulta necesario para la propagación y producción del virus recombinante, aunque el mismo no resulta empaquetado o encapsidado en partículas de VAAr. De esta manera, un "genoma" de vector se refiere al ácido nucleico que resulta empaquetado o encapsidado por el VAAr.
La expresión "funciones ayudantes de VAA" se refiere a las secuencias codificantes (proteínas) derivadas del VAA que pueden expresarse para proporcionar productos génicos del VAA y vectores de VAA que, a su vez, funcionan en trans para la replicación y empaquetamiento productivos del VAA. De esta manera, entre las funciones ayudantes de VAA se incluyen ambos marcos de lectura (ORF, por sus siglas en inglés) principales del VAA: rep y cap. Los productos de expresión Rep se ha demostrado que poseen muchas funciones, incluyendo, entre otras: reconocimiento, unión y realización de muescas del origen de replicación del ADN del VAA, actividad de ADN helicasa, y modulación y transcripción a partir de promotores del VAA (u otros promotores heterólogos). Los productos de expresión Cap (cápsides) suministran funciones de empaquetamiento necesarias. Las funciones adyuvantes del VAA se utilizan para complementar las funciones del VAA en trans que faltan de los genomas del vector VAA.
Un "constructo ayudante de VAA" se refiere de manera general a una secuencia de ácido nucleico que incluye secuencias de nucleótidos que proporcionan funciones del VAA delecionadas de un vector VAA que se utilizan para producir un vector VAA transductor para el transporte de una secuencia de ácido nucleico de interés, mediante terapia génica en un sujeto, por ejemplo. Los constructos ayudantes de VAA se utilizan comúnmente para proporcionar la expresión transitoria de los genes rep y/o cap del VAA para complementar funciones faltantes del VAA que resultan necesarias para la replicación del vector VAA. Los constructos ayudantes generalmente no presentan los RTI del VAA y tampoco pueden replicarse o empaquetarse. Los constructos ayudantes de VAA pueden encontrarse en forma de un plásmido, fago, trasposón, cósmido, virus o virión. Se han descrito varios constructos ayudantes de VAA, tales como los plásmidos pVAA/Ad y pIM29+45, que codifican ambos productos de expresión, Rep y Cap (véase, por ejemplo, Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828, 1989 y McCarty et al. J. Virol.
65:2936-2945, 1991). Se han descrito otros varios vectores que codifican los productos de expresión Rep y/o Cap (véase, por ejemplo, las patentes US n° 5.139.941 y n° 6.376.237).
La expresión "funciones accesorias" se refiere a funciones víricas no derivadas de VAA y/o celulares de las que es dependiente el VAA para la replicación. La expresión incluye proteínas y ARN que resultan necesarios en la replicación del VAA, incluyendo fracciones que participan en la activación de la transcripción génica del VAA, el corte y empalme de ARNm del VAA específico de estadio, la replicación del ADN del VAA, la síntesis de productos de expresión Cap y el empaquetamiento en cápside del VAA. Las funciones accesorias de base vírica pueden derivarse de cualquiera de los virus ayudantes conocidos, tales como adenovirus, herpesvirus (diferentes del virus del herpes simplex de tipo 1) y el virus Vaccinia.
La expresión "vector de función accesoria" se refiere de manera general a una molécula de ácido nucleico que incluye secuencias polinucleótidas que proporcionan funciones accesorias. Dichas secuencias pueden encontrarse en un vector de función accesoria y transfectarse en una célula huésped adecuada. El vector de función accesoria es capaz de prestar soporte a la producción del virión VAAr en la célula huésped. Los vectores de función accesoria pueden encontrarse en forma de un plásmido, fago, trasposón o cósmido. Además, el complemento total de genes de adenovirus no resulta necesario para las funciones accesorias. Por ejemplo, los mutantes de adenovirus incapaces de replicación del ADN y síntesis génica tardía se ha informado que son permisivos de replicación del VAA (Ito et al., J. Gen. Virol. 9:243, 1970; Ishibashi et al., Virology 45:317, 1971). De manera similar, los mutantes en las regiones E2B y E3 se ha demostrado que apoyan la replicación del VAA, indicando que las regiones E2B y E3 probablemente no participan en la provisión de funciones accesorias (Carter et al., Virology 126:505, 1983). Los adenovirus defectuosos en la región E1, o que presentan una región E4 delecionada, no pueden apoyar la replicación del VAA. De esta manera, las regiones E1A y E4 aparentemente resultan necesarias para la replicación del VAA, directa o indirectamente (Laughlin et al., J. Virol. 41:868, 1982; Janik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925, 1981; Carter et al., Virology 126:505, 1983). Entre otros adenovirus mutantes caracterizados se incluyen: E1B (Laughlin et al., supra, 1982; Janik et al., supra, 1981; Ostrove et al., Virology 104:502, 1980); E2A (Handa et al., J. Gen. Virol. 29:239, 1975; Strauss et al., J. Virol. 17:140, 1976; Myers et al., J. Virol. 35:665, 1980; Jay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927, 1981; Myers et al., J. Biol. Chem. 256:567, 1981); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, en: I CRC Handbook of Parvoviruses (P Tijssen ed., 1990)); E3 (Carter et al., supra, 1983) y E4 (Carter et al., supra, 1983; Carter (1995)). Los estudios de las funciones accesorias proporcionadas por adenovirus que presentan mutaciones en la región codificante de E1B han producido resultados conflictivos, aunque E1B55k puede resultar necesario para la producción del virión VAA, mientras que E1B19k no lo es (Samulski et al., J. Virol. 62:206-210, 1988). Además, la publicación de patente internacional n° WO 97/17458 y Matshushita et al., Gene Therapy 5:938-945, 1998, describen vectores de función accesoria codificantes de diversos genes de adenovirus. Los vectores a modo de ejemplo de función accesoria comprenden una región codificante de ARN de adenovirus VA, una región codificante ORF6 de E4 de adenovirus, una región codificante de E2A de 72 kD de adenovirus, una región codificante E1A de adenovirus y una región E1B de adenovirus que no presenta una región codificante intacta de E1B55k. Dichos vectores de función accesoria se indican en, por ejemplo, la publicación de patente internacional n° WO 01/83797.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "serotipo" es una distinción utilizada para referirse a un VAA que presenta una cápside que es serológicamente diferente de otros serotipos de VAA. La diferencia serológica se determina a partir de la falta de reactividad cruzada entre anticuerpos de un VAA con respecto a otro VAA. Las diferencias de reactividad cruzada habitualmente se deben a diferencias en las secuencias proteicas de cápside/determinantes antigénicos (por ejemplo, debido a diferencias en las secuencias de VP1, VP2 y/o VP3 de los serotipos de VAA).
Bajo la definición tradicional, un serotipo se refiere a que el virus de interés ha sido sometido a ensayo contra suero específico para todos los serotipos existentes y caracterizados para actividad neutralizadora y no se ha encontrado ningún anticuerpo que neutralice el virus de interés. A medida que se identifican más aislados de virus naturales y/o se generan mutantes de cápside, podrán encontrarse o no diferencias serológicas con cualquiera de los serotipos actualmente existentes. De esta manera, en casos en que el nuevo virus (por ejemplo, VAA) no presente ninguna diferencia serológica, dicho nuevo virus (por ejemplo, VAA) sería un subgrupo o variante del serotipo correspondiente. En muchos casos, los ensayos de serología para actividad neutralizadora todavía no se han llevado a cabo en virus mutantes con modificaciones de la secuencia de la cápside para determinar si son de otro serotipo según la definición tradicional de serotipo. De acuerdo con lo anterior, en aras de la conveniencia y para evitar repeticiones, el término "serotipo" se refiere en sentido amplio a virus serológicamente diferentes (por ejemplo, VAA), así como a virus (por ejemplo, VAA) que no son serológicamente diferentes que pueden encontrarse dentro de un subgrupo o una variante de un serotipo dado.
Entre los vectores VAAr se incluyen cualquier cepa vírica o serotipo. A título de ejemplo no limitativo, un plásmido VAAr o genoma de vector o partícula (cápside) puede estar basado en cualquier serotipo de VAA, tal como VAA-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11, por ejemplo. Dichos vectores pueden estar basados en la misma cepa o serotipo (o subgrupo o variante), o pueden ser diferentes entre sí. A título de ejemplo no limitativo, un plásmido de VAAr o genoma de vector o partícula (cápside) basado en un genoma de un serotipo puede ser idéntico a una o más de las proteínas de cápside que empaquetan el vector. Además, un plásmido VAAr o genoma de vector puede estar basado en un genoma de serotipo de VAA (por ejemplo, VAA2) diferente de una o más de las proteínas de cápside que empaquetan el genoma del vector, en cuyo caso por lo menos una de las tres proteínas de cápside podría ser un VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11, o variante de la misma, por ejemplo. Por lo tanto, entre los vectores VAAr se incluyen secuencias génicas/proteicas idénticas a las secuencias génicas/proteicas características de un serotipo particular, así como serotipos mixtos.
En diversos aspectos a modo de ejemplo, un vector VAAr incluye o consiste en una secuencia de cápside por lo menos 70% o más (por ejemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, etc.) idéntica a una o más proteínas de cápside de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10 o VAA11. En diversos aspectos a modo de ejemplo, un vector VAAr incluye o consiste en una secuencia por lo menos 70% o más (por ejemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, etc.) idéntica a una o más RTI de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10 o VAA11.
Pueden construirse VAAr, tal como VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10 y VAA11, y secuencias variantes, híbridas y quiméricas de las mismas, mediante la utilización de técnicas recombinantes que son conocidas por el experto en la materia, para incluir una o más secuencias polinucleótidas heterólogas (transgenes) flanqueadas por una o más secuencias de RTI del VAA funcionales. Dichos vectores presentan uno o más de los genes de VAA de tipo salvaje delecionados en su totalidad o en parte, aunque conservan por lo menos una secuencia o secuencias de RTI flanqueante funcional, según resulta necesario para el rescate, replicación y empaquetamiento del vector recombinante en una partícula de vector VAAr. Por lo tanto, un genoma de vector VAAr incluiría secuencias requeridas en cis para la replicación y el empaquetamiento (por ejemplo, secuencias de RTI funcionales).
Las expresiones "ácido nucleico" y "polinucleótido" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para referirse a todas las formas de ácidos nucleicos u oligonucleótidos, incluyendo el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN). Entre los ácidos nucleicos se incluyen el ADN genómico, ADNc y ADN antisentido, y ARNm procesado o no procesado, ARNr, ARNt y ADN o ARN inhibidor (ARNi, por ejemplo, ARN(hc) de horquilla corto, microARN (miARN), ARN(ip) pequeño o interfiriente pequeño, ARN de corte y empalme en trans o ARN antisentido). Entre los ácidos nucleicos se incluyen polinucleótidos naturales, sintéticos y deliberadamente modificados o alterados. Los ácidos nucleicos pueden ser sencillos, dobles, o triples, lineales o circulares, y pueden ser de cualquier longitud. Al comentar los ácidos nucleicos, puede describirse en la presente memoria una secuencia o estructura de un polinucleótido particular según la convención normal de proporcionar la secuencia en la dirección 5' a 3'.
Una secuencia de ácidos nucleicos "heteróloga" se refiere a un polinucleótido insertado en un plásmido o vector VAA con fines de transferencia/transporte mediado por vector del polinucleótido al interior de una célula. Las secuencias de ácido nucleico heterólogas son diferentes del ácido nucleico del VAA, es decir, son no nativas con respecto al ácido nucleico del VAA. Una vez transferidas/transportadas al interior de la célula, una secuencia de ácido nucleico heteróloga, contenida dentro del vector, puede expresarse (por ejemplo, transcribirse y traducirse, en caso apropiado). Alternativamente, un polinucleótido heterólogo transferido/transportado al interior de una célula, contenido dentro del vector, no necesita expresarse. Aunque el término "heterólogo" no siempre se utiliza en la presente memoria en referencia a secuencias de ácido nucleico y polinucleótidos, la referencia a una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido incluso en ausencia del modificador "heterólogo" pretende incluir secuencias de ácido nucleico heterólogas y polinucleótidos a pesar de la omisión.
Los "polipéptidos", "proteínas" y "péptidos" codificados por la "secuencia de ácido nucleico" incluyen secuencias nativas de longitud completa, al igual que con proteínas naturales, así como subsecuencias funcionales, formas modificadas o variantes de secuencia, con la condición de que la subsecuencia, forma modificada o variante retenga cierto grado de funcionalidad de la proteína de longitud completa nativa. Dichos polipéptidos, proteínas y péptidos codificados por las secuencias de ácido nucleico pueden ser idénticas, aunque ello no es necesario, a la proteína endógena que es defectuosa o cuya expresión resulta insuficiente o deficiente en el mamífero tratado.
Un "transgén" se utiliza en la presente memoria para referirse convenientemente a un ácido nucleico (por ejemplo, heterólogo) que se pretende introducir o que se ha introducido en una célula u organismo. Los transgenes incluyen cualquier ácido nucleico, tal como un ácido nucleico heterólogo codificante de una secuencia proteica o polinucleótida terapéutica.
En una célula que presenta un transgén, el transgén ha sido introducido/transferido mediante una "transducción" o "transfección" de la célula con un plásmido o un vector VAA. Los términos "transducir" y "transfectar" se refieren a la introducción de una molécula, tal como un ácido nucleico, en una célula huésped (por ejemplo, HEK293) o células de un organismo. El transgén puede estar o no integrado en el ácido nucleico genómico de la célula receptora. En el caso de que el ácido nucleico introducido se integre en el ácido nucleico (ADN genómico) de la célula u organismo receptor, puede mantenerse establemente en esa célula u organismo y pasarse posteriormente o heredarse en las células u organismos de la progenie de la célula o células receptoras de un organismo.
Una "célula huésped" denota, por ejemplo, microorganismos, células de levadura, células de insecto y células de mamífero, que pueden utilizarse, o que han sido utilizadas, como receptores de un plásmido vector de VAA, constructo ayudante de VAA, un vector de función accesoria u otro ADN de transferencia. La expresión incluye la progenie de la célula original que ha sido transfectada. De esta manera, una "célula huésped" se refiere de manera general a una célula que ha sido transfectada con una secuencia de ADN exógena. Se entiende que la progenie de una única célula parental puede no ser necesariamente idéntico completamente en morfología o en el complemento de ADN genómico o total al pariente original, debido a mutación natural, accidental o deliberada. Entre las células huésped a modo de ejemplo se incluyen células renales embrionarias humanas (HEK), tales como HEK293.
Una "célula transducida" es una célula en la que se ha introducido un transgén. De acuerdo con lo anterior, una célula "transducida" se refiere a un cambio genético en una célula tras la incorporación de una molécula exógena, por ejemplo un ácido nucleico (por ejemplo, un transgén) en la célula. De esta manera, una célula "transducida" es una célula, o progenie de la misma, en la que se ha introducido un ácido nucleico exógeno. La célula o células pueden propagarse (cultivarse) y la proteína introducida expresarse, o el ácido nucleico transcribirse, o el vector, tal como vAAr, producirse, en la célula. Para los usos y procedimientos de la terapia génica, la célula transducida puede encontrarse en un sujeto.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "estable" en referencia a una célula, o "establemente integrado", se refiere a que las secuencias de ácidos nucleicos, tales como un marcador o secuencia de ácido nucleico heteróloga, o plásmido o vector, seleccionable, se ha insertado en un cromosoma (por ejemplo, mediante recombinación homóloga, unión terminal no homóloga, transfección, etc.) o se mantiene en la célula u organismo huésped receptor extracromosómicamente y se mantiene en el cromosoma o se mantiene extracromosómicamente durante un periodo de tiempo. En el caso de células en cultivo, las secuencias de ácidos nucleicos, tales como una secuencia de ácidos nucleicos heterólogos, o un plásmido o un vector, insertadas en un cromosoma pueden mantenerse durante el curso de una pluralidad de pases celulares.
Una "línea celular" se refiere a una población de células capaz de crecimiento y división continuas o prolongadas in vitro bajo condiciones de cultivo apropiadas. Pueden derivarse líneas celulares, aunque no resulta necesario, poblaciones clonales a partir de una única célula progenitora. En líneas celulares pueden producirse cambios espontáneos o inducidos de cariotipo durante el almacenamiento o la transferencia de dichas poblaciones clonales, así como durante pases prolongados en un cultivo de tejido. De esta manera, las células de progenie derivadas de la línea celular pueden no ser exactamente idénticas a las células o cultivos ancestrales. Una línea celular a modo de ejemplo aplicable a los procedimientos de purificación de la exposición es HEK293.
Un "elemento de control de la expresión" se refiere a una o más secuencias de ácidos nucleicos que influyen sobre la expresión de un ácido nucleico operablemente ligado. Elementos de control, incluyendo elementos de control de la expresión, tal como se indican en la presente memoria, tales como promotores e intensificadores. Los vectores VAAr pueden incluir uno o más "elementos de control de la expresión". Típicamente, dichos elementos se incluyen para facilitar la transcripción apropiada de polinucleótidos heterólogos y, en caso apropiado, la traducción (por ejemplo, un promotor, intensificador, señal de corte y empalme para intrones, mantenimiento del marco de lectura apropiado del gen para permitir la traducción dentro del marco de lectura del ARNm y codones de parada, etc.). Dichos elementos típicamente actúan en cis, se denominan elementos "de acción en cis", aunque también pueden actuar en trans.
El control de la expresión puede llevarse a cabo al nivel de la transcripción, traducción, corte y empalme, estabilidad del mensaje, etc. Típicamente, un elemento de control de la expresión que modula la transcripción se encuentra yuxtapuesto próximo al extremo 5' (es decir, "cadena arriba") de un ácido nucleico transcrito. Los elementos de control de la expresión también pueden encontrarse localizados en el extremo 3' (es decir, "cadena abajo") de la secuencia transcrita o dentro del transcrito (por ejemplo, en un intrón). Los elementos de control de la expresión pueden estar situados contiguos o a cierta distancia de la secuencia transcrita (por ejemplo, 1 a 10, 10 a 25, 25 a 50, 50 a 100, 100 a 500 o más nucleótidos respecto del polinucleótido), incluso a distancias considerables. Sin embargo, debido a las limitaciones de longitud de los vectores VAAr, los elementos de control de la expresión típicamente se encontrarán entre 1 y 1000 nucleótidos del ácido nucleico transcrito.
Funcionalmente, la expresión del ácido nucleico operablemente ligado es por lo menos en parte controlable por el elemento (por ejemplo, promotor), de manera que el elemento modula la transcripción del ácido nucleico y, según resulte apropiado, la traducción del transcrito. Un ejemplo específico de un elemento de control de la expresión es un promotor, que habitualmente está situado en el lado 5' de la secuencia transcrita. Un promotor típicamente incrementa la cantidad expresada del ácido nucleico operablemente ligado en comparación con la cantidad expresada en caso de no haber promotor.
Un "intensificador" tal como se utiliza en la presente memoria puede referirse a una secuencia que se localiza contiguamente a la secuencia de ácido nucleico, tal como el marcador seleccionable, o los elementos intensificadores de secuencia de ácido nucleico heteróloga se localizan típicamente cadena arriba de un elemento promotor, aunque también funcionan y pueden estar localizados cadena abajo o dentro de una secuencia. Por lo tanto, un elemento intensificador puede estar situado cadena arriba o cadena abajo, por ejemplo, a menos de 100 pares de bases, 200 pares de bases o 300 o más pares de bases del marcador seleccionable, y/o ácido nucleico heterólogo codificante de una secuencia proteica o polinucleótida terapéutica. Los elementos intensificadores típicamente incrementan la expresión de un ácido nucleico operablemente ligado a un nivel superior a la expresión proporcionada por un elemento promotor.
La expresión "operablemente ligado" se refiere a que las secuencias reguladoras necesarias para la expresión de una secuencia de ácido nucleico están situadas en las posiciones apropiadas respecto a la secuencia de manera que producen la expresión de la secuencia de ácido nucleico. Dicha misma definición en ocasiones se aplica a la disposición de secuencias de ácidos nucleicos y elementos de control de la transcripción (por ejemplo, promotores, intensificadores y elementos de terminación) en un vector de expresión, por ejemplo, el vector VAAr.
En el ejemplo de un elemento de control de la expresión en ligamiento operable con un ácido nucleico, la relación permite que el elemento de control module la expresión del ácido nucleico. Más específicamente, por ejemplo, la referencia a que dos secuencias de ADN están operablemente ligadas significa que los dos ADN están dispuestos (en cis o en trans) en una relación mediante la que por lo menos una de las secuencias de ADN es capaz de ejercer un efecto fisiológico sobre la otra secuencia.
De acuerdo con lo anterior, entre los elementos adicionales para vectores se incluyen, aunque sin limitación, un elemento de control de la expresión (por ejemplo, promotor/intensificador), una señal de terminación de la transcripción o codón de parada, regiones 5' o 3' no traducidas (por ejemplo, secuencias de poliadenilación (poliA)) que flanquean una secuencia, tal como una o más copias de una secuencia RTI de VAA, o un intrón.
Entre los elementos adicionales se incluyen, por ejemplo, secuencias polinucleótidas de carga o de relleno, por ejemplo para mejorar el empaquetamiento y reducir la presencia de ácido nucleico contaminante. Los vectores VAA típicamente aceptan insertos de ADN con un intervalo de tamaño que es generalmente de entre aproximadamente 4 kb y aproximadamente 5.2 kb, o ligeramente superior. De esta manera, para secuencias más cortas, se incluye un relleno o carga a fin de ajustar la longitud a prácticamente el tamaño normal o al tamaño normal de la secuencia genómica vírica aceptable para el empaquetamiento del vector en una partícula de VAAr. En diversos aspectos, una secuencia de ácido nucleico carga/relleno es un segmento no traducido (no codificante de proteína) de ácido nucleico. Para una secuencia de ácido nucleico de menos de 4.7 kb, la secuencia polinucleótida de carga o relleno presenta una longitud que, combinada (por ejemplo, insertada en un vector) con la secuencia, presenta una longitud total de entre aproximadamente 3.0-5.5 kb o de entre aproximadamente 4.0 y 5.0 kb, o de entre aproximadamente 4.3 y 4.8 kb.
Una "proteína terapéutica" en un aspecto es un péptido o proteína que puede aliviar o reducir los síntomas que resultan de una cantidad insuficiente, la ausencia o un defecto en una proteína en una célula o sujeto. Una proteína "terapéutica" codificada por un transgén puede proporcionar un beneficio al sujeto, por ejemplo, para corregir un defecto genético, para corregir una deficiencia génica (de expresión o funcional), etc.
Entre los ejemplos no limitativos de ácidos nucleicos heterólogos codificantes de productos génicos (por ejemplo, proteínas terapéuticas) que resultan útiles según la exposición se incluyen los que pueden utilizarse en el tratamiento de una enfermedad o trastorno, incluyendo, aunque sin limitación, la "hemostasis" o trastornos de la coagulación sanguínea, tales como hemofilia A, pacientes de hemofilia A con anticuerpos inhibidores, hemofilia B, deficiencias en los factores de coagulación VII, VIII, IX y X, XI, V, XII, II, factor de von Willebrand, deficiencia combinada FV/FVIII, talasemia, deficiencia en vitamina K epóxido reductasa C1, deficiencia en gammacarboxilasa, anemia, sangrado asociado a traumatismo, lesión, trombosis, trombocitopenia, ictus, coagulopatía, coagulación intravascular diseminada (CID), sobre-anticoagulación asociada a heparina, heparina de bajo peso molecular, pentasacárido, warfarina, antitrombóticos de molécula pequeña (es decir, inhibidores de FXa) y trastornos plaquetarios, tales como el síndrome de Bernard Soulier, trombolastemia de Glanzman y deficiencia del pool de almacenamiento.
Las moléculas de ácido nucleico, vectores tales como vectores de clonación, de expresión (por ejemplo, genomas de vector) y plásmidos, pueden prepararse mediante la utilización de procedimientos de tecnología de DNA recombinante. La disponibilidad de información de secuencia de nucleótidos permite la preparación de moléculas de ácidos nucleicos mediante una diversidad de medios. Por ejemplo, puede prepararse un ácido nucleico heterólogo codificante de factor IX (FIX) que comprende un vector o plásmido utilizando diversas técnicas de clonación estándar, tecnología de DNA recombinante, mediante expresión celular o traducción in vitro y síntesis química. La pureza de los polinucleótidos puede determinarse mediante secuenciación, electroforesis en gel y similares. Por ejemplo, pueden aislarse ácidos nucleicos mediante la utilización de hibridación o técnicas de cribado de bases de datos en un ordenador. Entre dichas técnicas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas: (1) hibridación de ADN genómico o bibliotecas de ADNc con sondas para detectar secuencias de nucleótidos homólogas, (2) cribado de anticuerpos para detectar polipéptidos que presentan características estructurales compartidas, por ejemplo mediante la utilización de una biblioteca de expresión, (3) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ADN genómico o ADNc mediante la utilización de cebadores capaces de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico de interés, (4) búsquedas de ordenador en bases de datos de secuencias para secuencias relacionadas, y (5) cribado diferencial de una biblioteca de ácidos nucleicos substraída.
El término "aislado", utilizado como modificador de una composición, se refiere a que las composiciones se preparan manualmente o se separan, por completo o por lo menos en parte, de su medio in vivo natural. Generalmente, las composiciones aisladas se encuentran sustancialmente libres de uno o más materiales con los que se asocian normalmente en la naturaleza, por ejemplo, una o más proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos o membranas celulares.
Con respecto a la proteína, la expresión "proteína aislada" o "proteína aislada y purificada" se utiliza en ocasiones en la presente memoria. Dicha expresión se refiere principalmente a una proteína producida mediante expresión de una molécula de ácido nucleico. Alternativamente, dicha expresión puede referirse a una proteína que ha sido suficientemente separada de otras proteínas con las que se encontraría asociada naturalmente, de manera que existe en forma "sustancialmente pura".
El término "aislado" no excluye las combinaciones producidas manualmente, por ejemplo, un VAAr recombinante y una formulación farmacéutica. El término "aislado" tampoco excluye formas físicas alternativas de la composición, tales como híbridos/quimeras, multímeros/oligómeros, modificaciones (por ejemplo, fosforilación, glucosilación o lipidación) o formas derivatizadas, o formas expresadas en células huésped producidas manualmente.
La expresión "sustancialmente puro" se refiere a una preparación que comprende por lo menos 50% a 60% en peso del compuesto de interés (por ejemplo, ácido nucleico, oligonucleótido, proteína, etc.). La preparación puede comprender por lo menos 75% en peso, o aproximadamente 90% a 99% en peso, del compuesto de interés. La pureza se mide mediante procedimientos apropiados al compuesto de interés (por ejemplo, procedimientos cromatográficos, electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida, análisis de HPLC, y similares).
La expresión "que consiste esencialmente en" en referencia a una secuencia de nucleótido o secuencia de aminoácidos particulares se refiere a una secuencia que presenta las propiedades de una secuencia dada. Por ejemplo, en el caso de que se utilice en referencia a una secuencia de aminoácidos, la expresión incluye la secuencia de por sí y modificaciones moleculares que no afectarían a las características básicas y nuevas de la secuencia.
Procedimientos conocidos de la técnica para la generación de viriones de VAAr: por ejemplo, la transfección mediante la utilización de secuencias de vector VAA y ayudantes de VAA junto con la coinfección con un virus ayudante VAA (por ejemplo, adenovirus, herpesvirus o virus Vaccinia) o la transfección con un vector VAA recombinante, un vector ayudante VAA y un vector de función accesoria. Los procedimientos no limitativos para generar viriones VAAr se describen en, por ejemplo, las patentes US n° 6.001.650 y n° 6.004.797. Tras la producción de vector VAAr recombinante (es decir, la generación de vector en sistemas de cultivo celular), los viriones de VAAr pueden obtenerse a partir de las células huésped y sobrenadante de cultivo celular y purificarse tal como se indica en la presente memoria.
Como etapa inicial, típicamente las células huésped que producen los viriones de VAAr pueden recolectarse, opcionalmente en combinación con la recolección del sobrenadante de cultivo celular en el que se han cultivado las células huésped productoras de los viriones VAAr. En procedimientos en la presente memoria, las células recolectadas y opcionalmente el sobrenadante de cultivo celular pueden utilizarse sin modificación, según resulte apropiado, o concentrados. Además, en el caso de que la infección se utilice para expresar funciones accesorias, pueden inactivarse virus ayudantes residuales. Por ejemplo, pueden inactivarse adenovirus mediante calentamiento hasta temperaturas de aproximadamente 60°C, por ejemplo, 20 minutos o más, que inactiva únicamente el virus ayudante, ya que el VAA es estable frente al calor, mientras que el adenovirus ayudante es lábil al calor.
El sobrenadante y las células recolectadas se lisan mediante disrupción de las células, por ejemplo mediante microfluidización, para liberar las partículas de VAAr. Posteriormente, una nucleasa, tal como benzonasa, puede añadirse para degradar el ADN contaminante. Típicamente, el lisado resultante se clarifica para eliminar los residuos celulares, tal como la filtración, la centrifugación, para producir un lisado celular clarificado. En un ejemplo particular, el lisado se filtra con un filtro de tamaño de poro de diámetro micrométrico (por ejemplo, a través de un filtro de 0,45 pm y/o de 0,2 pm), para producir un lisado clarificado.
El lisado clarificado contiene partículas de VAA (vectores VAAr auténticos y cápsides vacías de VAA) e impurezas relacionadas con la producción del vector VAA, tales como componentes celulares solubles de células huésped que pueden incluir proteínas celulares, lípidos y/o ácidos nucleicos, y componentes del medio de cultivo celular. A continuación, el lisado clarificado se somete a etapas de purificación adicionales para purificar partículas de VAA (incluyendo vectores VAAr verdaderos) respecto de impurezas mediante la utilización de cromatografía. El lisado clarificado puede diluirse con un tampón apropiado antes de la primera etapa de la cromatografía.
Típicamente se utiliza una pluralidad de etapas secuenciales de cromatografía para purificar las partículas de VAAr. Dichos procedimientos típicamente excluyen una etapa de ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio.
Tal como se divulga en la presente memoria, una primera etapa de cromatografía puede ser de cromatografía de intercambio aniónico o de cromatografía de intercambio catiónico. En el caso de que la primera etapa de cromatografía sea de cromatografía de intercambio aniónico, la tercera etapa de cromatografía puede ser de cromatografía de intercambio catiónico. De esta manera, en un procedimiento de purificación de VAAr, la purificación se lleva a cabo mediante cromatografía de intercambio aniónico, seguido de la purificación mediante cromatografía de exclusión por tamaño, seguido de la purificación mediante cromatografía de intercambio catiónico.
En el caso de que la primera etapa de cromatografía sea de cromatografía de intercambio catiónico, la tercera etapa de cromatografía puede ser de cromatografía de intercambio aniónico. De esta manera, en un procedimiento de purificación de VAAr, la purificación se lleva a cabo mediante cromatografía de intercambio catiónico, seguido de la purificación mediante cromatografía de exclusión por tamaño, seguido de la purificación mediante cromatografía de intercambio aniónico.
La cromatografía de intercambio aniónico funciona separando las partículas de VAA respecto de proteínas, componentes celulares y otros componentes presentes en el lisado clarificado y/o eluido de columna de la cromatografía de exclusión por tamaño. Entre las resinas de intercambio aniónico se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las basadas en resinas de poliamina y en otras resinas. Entre los ejemplos de resinas de intercambio aniónico fuertes se incluyen los basados generalmente en el átomo de nitrógeno cuaternizado, incluyendo, aunque sin limitación, resinas de sal de amonio cuaternario, tales como resinas de trialquilbencil-amonio. Entre las cromatografías de intercambio adecuadas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, MACRO PREP Q (intercambiador aniónico fuerte disponible por BioRad, Hercules, Calif.); UNOSPHERE Q (intercambiador aniónico fuerte disponible por BioRad, Hercules, Calif.); POROS 50HQ (intercambiador aniónico fuerte disponible por Applied Biosystems, Foster City, Calif.); POROS 50D (intercambiador aniónico débil disponible por Applied Biosystems, Foster City, Calif.); POROS 50PI (intercambiador aniónico débil disponible por Applied Biosystems, Foster City, Calif.); SOURCE 30Q (intercambiador aniónico fuerte disponible por Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.); DEAE SEPHAROSE (intercambiador aniónico débil disponible por Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.); Q SEPHAROSE (intercambiador aniónico fuerte disponible por Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.). Entre las resinas de intercambio aniónico adicionales a modo de ejemplo se incluyen aminoetilo (AE), dietilaminoetilo (DEAE), dietilaminopropilo (DEPE) y aminoetilo cuaternario (q A e ).
La cromatografía de intercambio catiónico funciona separando adicionalmente las partículas de VAA respecto de componentes celulares y otros componentes presentes en el lisado clarificado y/o eluido de columna de la cromatografía de exclusión por tamaño. Entre los ejemplos de resinas de intercambio catiónico fuertes capaces de unión a viriones de VAAr en un amplio intervalo de pH se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, cualesquiera resinas de base ácido sulfónico indicadas por la presencia del grupo funcional sulfonato, incluyendo sulfonatos con sustitución de arilo y alquilo, tales como las resinas sulfopropilo o sulfoetilo. Entre las matrices representativa se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, POROS HS, POROS HS 50, POROS SP, POROS S (intercambiadores catiónicos fuertes disponibles por Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Entre los ejemplos adicionales se incluyen las familias comerciales de resinas DOWEx ®, AMBERLITE® y AMBERLYST® disponibles por Aldrich Chemical Company (Milliwaukee, WI). Entre las resinas de intercambio catiónico débil se incluyen, aunque sin limitación, las resinas basadas en ácido carboxílico. Entre las resinas de intercambio catiónico a modo de ejemplo se incluyen las resinas carboximetilo (CM), fosfo (basado en el grupo funcional fosfato), metilsulfonato (S) y sulfopropilo (SP).
El medio cromatográfico, tal como de intercambio catiónico, de intercambio aniónico y de exclusión por tamaño, puede equilibrarse, lavarse y eluirse con diversos tampones bajo diversas condiciones, tales como pH y volúmenes de tampón.
La cromatografía de intercambio catiónico puede equilibrarse mediante la utilización de tampones estándares y siguiendo las especificaciones del fabricante. Por ejemplo, el medio cromatográfico puede equilibrarse con un tampón de acetato, a entre 5 y 50 mM, o a entre 10 y 40 mM, tal como a entre 10 y 30 mM, y cloruro sódico. Después de la equilibración, se carga a continuación la muestra. Seguidamente, el medio cromatográfico se lava por lo menos una vez, o más, por ejemplo, entre 2 y 5 veces. La elución del medio cromatográfico se lleva a cabo mediante un tampón de alta concentración salina, por lo menos una vez, aunque la elución puede llevarse a cabo 2 o más veces con el mismo tampón o un tampón de concentración salina más alta.
Los tampones y soluciones de equilibración típicos para lavados y eluciones para la cromatografía de intercambio catiónico se encuentran a un pH apropiado, de entre aproximadamente 3 y 8, más típicamente de entre aproximadamente 4 y 6, tal como pH 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5 a 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 o 6.0 o cualquier pH comprendido en los intervalos indicados o entre los mismos.
Los tampones y soluciones de equilibración apropiados para lavados y eluciones para columnas de intercambio catiónico son conocidos en la técnica y generalmente son aniónicos. Entre dichos tampones se incluyen, aunque sin limitación, tampones con los iones tampón siguientes: fosfato, acetato, citrato, borato o sulfato.
En un aspecto, el medio de cromatografía de intercambio catiónico en primer lugar se equilibra, se aplica la muestra y se lava con una concentración salina baja, por ejemplo, entre 10 y 100 mM de NaCl, tal como 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 60 a 100 mM, o cualquier concentración igual a dichos valores o comprendida dentro de dichos intervalos. Después de la aplicación de la muestra, el medio cromatográfico puede tratarse con una concentración salina más alta a fin de eluir impurezas, tales como una concentración de NaCl más alta, o con otro tampón con una fuerza iónica más alta. Un ejemplo para la utilización como el segundo tampón es un tampón de acetato con una concentración de NaCl de entre 100 mM y 200 mM, o cualquier concentración en o dentro de dichos intervalos. Después de la elución de impurezas adicionales de la columna, para eluir las partículas de VAA, puede incrementarse la fuerza iónica del tampón utilizando una sal, tal como NaCl, KCl, sulfato, formato o acetato, y recuperarse.
En las soluciones de lavado de medio de cromatografía de intercambio aniónico, puede incluirse polietilenglicol (PEG). Lo anterior se denomina cromatografía de columna modulada con polietilenglicol (PEG). Las soluciones de lavado de PEG pueden aplicarse al medio de cromatografía de intercambio aniónico antes de la elución de las partículas de vector VAA.
Los tampones y soluciones de equilibración típicos para lavados y eluciones para la cromatografía de intercambio aniónico presentan un pH apropiado comprendido entre aproximadamente 5 y 12, más típicamente entre aproximadamente 6 y 10, y todavía más típicamente entre aproximadamente 7 y 9.5, tal como pH 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 - 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5 - 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, o cualquier pH en o entre los intervalos indicados.
Los tampones y soluciones de equilibración apropiados para lavados y eluciones para columnas de intercambio aniónico son conocidos de la técnica y generalmente son de naturaleza catiónica o zwiteriónica. Entre dichos tampones se incluyen, aunque sin limitación, tampones con los iones tampón siguientes: N-metilpiperazina, piperazina, Bis-Tris, Bis-Tris propano, trietanolamina, Tris, N-metildietilanoma, 1,3-diaminopropano, etanolamina, ácido acético y similares. Para eluir la muestra, se incrementa la fuerza iónica del tampón de partida utilizando una sal, tal como NaCl, KCl, sulfato, formato o acetato.
En un aspecto, el medio de cromatografía de intercambio aniónico en primer lugar se equilibra, se aplica la muestra y se lava con una concentración salina baja, por ejemplo, entre 10 y 100 mM de NaCl, tal como 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 60 a 100 mM, o cualquier concentración igual a dichos valores o comprendida dentro de dichos intervalos. Después de la aplicación de la muestra, el medio cromatográfico puede tratarse con una concentración salina más alta a fin de eluir impurezas, tales como una concentración de NaCl más alta, o con otro tampón con una fuerza iónica más alta. Un ejemplo para la utilización como el segundo tampón es un tampón a base de Tris con una concentración de NaCl de entre 100 mM y 200 mM, o cualquier concentración en o dentro de dichos intervalos establecidos. Después de la elución de las impurezas adicionales de la columna, pueden recuperarse las partículas de VAA utilizando una concentración salina más alta.
En las soluciones de lavado de medio de cromatografía de intercambio aniónico, puede incluirse polietilenglicol (PEG). Lo anterior se denomina cromatografía de columna modulada con polietilenglicol (PEG). Las soluciones de lavado de PEG pueden aplicarse al medio de cromatografía de intercambio aniónico antes de la elución de las partículas de vector VAA.
Típicamente, el PEG en dichas soluciones de lavado presenta un peso molecular medio comprendido en el intervalo comprendido entre aproximadamente 1,000 y 50,000, ambos inclusive. Las cantidades típicas de PEG en dichas soluciones de lavado se encuentran comprendidas entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 20% de PEG o cualquier cantidad en o dentro de dichos intervalos establecidos, o entre aproximadamente 1% y aproximadamente 10% de PEG, o cualquier cantidad en o dentro de dichos intervalos establecidos.
Los medios de cromatografía de exclusión por tamaño pueden equilibrarse mediante la utilización de tampones estándares y siguiendo las especificaciones del fabricante. Por ejemplo, los medios cromatográficos pueden equilibrarse con un tampón fosfato, por ejemplo, a entre 1 y 5 mM, entre 5 y 50 mM, o entre 5 y 25 mM, y cloruro sódico, por ejemplo, a entre 25 y 50 mM, entre 50 y 100 mM, entre 100 y 150 mM o entre 125 y 175 mM.
Después de la equilibración, se carga a continuación la muestra. Seguidamente, se recupera el flujo eluido que contiene las partículas de VAA. Pueden añadirse volúmenes adicionales de tampón (por ejemplo, tampón fosfato), basándose en la cantidad de medios cromatográficos y/o el tamaño de la columna, para la recuperación de las partículas de VAA.
En aspectos particulares, los medios de cromatografía de exclusión por tamaño presentan un intervalo de separación (de pesos moleculares) comprendido entre aproximadamente 10,000 y 600,000, ambos inclusive. Entre las resinas (medios) particulares apropiados para la cromatografía de exclusión por tamaños se incluyen, aunque sin limitación, partículas o perlas de celulosa porosa, agarosa entrecruzada (sefarosa), dextrano entrecruzado (Sephadex), estireno-divinilbenceno (Dianon HP-20), poliacrilamida (Bio Gel), metacrílico (Toyopearl) y vidrio de poro controlado.
Pueden añadirse volúmenes de tampón para la elución, basándose en la cantidad de medios cromatográficos y/o el tamaño de la columna, para conseguir la recuperación de las partículas de VAA. Los volúmenes típicos son de entre 1 y 10 volúmenes de columna.
El eluido de columna se recoge tras la elución o eluciones/flujo eluido de cada una de las etapas cromatográficas. El VAA puede detectarse en las fracciones mediante la utilización de técnicas estándares, tales como la monitorización de la absorción de UV a entre 260 y 280 nm.
La utilización de medios de cromatografía de intercambio catiónico o aniónico, la naturaleza de los medios utilizados (es decir, intercambiadores iónicos fuertes o débiles) y las condiciones de concentración salina, tampón utilizado y pH, pueden variar según la cápside de VAA (es decir, el serotipo o pseudotipo de la cápside del vAa ). Aunque la estructura de la cápside de VAA típicamente comparte características, tales como el tamaño y forma, las cápsides pueden presentar diferentes secuencias de aminoácidos que resultan en sutiles diferencias de topología molecular y distribución de las cargas superficiales. De esta manera, las variantes de secuencia de cápside se espera que puedan purificarse mediante los procedimientos de la exposición, y pueden determinarse procedimientos relevantes de una manera sistemática utilizando medios cromatográficos y estudios de cribado de tampones, para determinar si se utilizarán condiciones diferentes para una variante de cápside de VAA para la purificación de las partículas de VAA.
Los eluidos que comprenden partículas de VAA de cualquiera de las etapas de cromatografía aniónica, de exclusión por tamaño o de intercambio catiónico tal como se indican en la presente memoria, si se desea, pueden concentrarse eficientemente mediante ultrafiltración/diafiltración. La reducción de volumen puede ser controlada por el experto en la materia. En ejemplo no limitativos particulares, la reducción de volumen conseguida es de entre aproximadamente 1 y 20 veces, ambos inclusive. De esta manera, una reducción de factor 1 reduce el volumen a la mitad, por ejemplo, 1000 ml se concentran a 500 ml. Una reducción de 10 veces reduce el volumen en un factor de 10, por ejemplo, 2000 ml se concentran a 200 ml. Una reducción de 20 veces reduce el volumen en un factor de 20, por ejemplo, 2000 ml se concentran a 100 ml.
Un ejemplo no limitativo de ultrafiltración/diafiltración es la filtración de flujo tangencial (FFT). Por ejemplo, una membrana de fibra hueca con un tamaño de poro nominal correspondiente a un valor de corte de peso molecular de 100 kDa, de manera que pueden prepararse grandes cantidades de vector VAA en caso de encontrarse presentes en mayores volúmenes de eluido.
Los procedimientos de la exposición consiguen una recuperación sustancial de las partículas de VAA. Por ejemplo, los procedimientos de la exposición consiguen una recuperación de partículas de VAA de aproximadamente 40% a 70% de las partículas de vector VAAr totales de las células huésped y del sobrenadante de cultivo de células huésped recolectados. En otro ejemplo, las partículas de VAA se encuentran presentes en el eluido final (por ejemplo, tercera columna) a una concentración de aproximadamente 100 mg/ml. Las partículas de vector VAA pueden encontrarse presentes en el eluido final (por ejemplo, tercera columna) a una concentración de 1015 partículas por ml, o más, 1016 partículas por ml, 1017 partículas por ml.
Alternativamente, en el caso de que las concentraciones de partículas de vector VAA sean inferiores, pueden concentrarse partículas de VAA purificadas. Por ejemplo, las partículas de VAA purificadas pueden concentrarse a 1015 partículas por ml mediante ultrafiltración/diafiltración (por ejemplo, FFT). En el caso de que se deseen concentraciones más altas de vector, las partículas de VAA purificadas pueden concentrarse a 1016 partículas por ml mediante ultrafiltración/diafiltración (por ejemplo, FFT) o incluso más.
La combinación de la purificación de partículas de VAA a partir de lisados celulares clarificados mediante un procedimiento cromatográfico de todas las columnas y la concentración (en caso necesario) de las partículas de VAA purificadas mediante ultrafiltración/diafiltración (por ejemplo, FFT), proporciona grandes cantidades de vector VAAr recombinante altamente purificado.
En otros aspectos, los viriones de VAAr con genomas empaquetados (es decir, partículas de vector VAAr verdaderas) se encuentran "sustancialmente libres de impurezas de ácidos nucleicos encapsidadas en VAA" en el caso de que por lo menos aproximadamente 60% o más de los viriones sean viriones de VAAr con genomas empaquetados (es decir, partículas de vector VAAr verdadero). La producción de viriones de VAAr con genomas empaquetados (es decir, partículas de vector VAAr verdadero) sustancialmente libres de impurezas de ácidos nucleicos encapsidadas en VAA puede ser de entre aproximadamente 40% y aproximadamente 20% o menos, de entre aproximadamente 20% y aproximadamente 10% o menos, de entre aproximadamente 10% y aproximadamente 5% o menos, de entre aproximadamente 5% y aproximadamente 1%, o de menos de 1% o menos del producto comprende impurezas de ácidos nucleicos encapsidados en VAA.
Los procedimientos para determinar el título infeccioso de vector VAA que contiene un transgén son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Zhen et al., Hum. Gene Ther. 15:709, 2004). Los procedimientos para someter a ensayo cápsides vacías y partículas de vector VAA con genomas empaquetados son conocidos (véase, por ejemplo, Grimm et al., Gene Therapy 6:1322-1330, 1999; Sommer et al., Molec. Ther. 7:122-128, 2003).
Con el fin de determinar la cápside degradada/desnaturalizada, los VAA purificados pueden someterse a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, que consiste en cualquier gel capaz de separar las tres proteínas de cápside, por ejemplo, un gel en gradiente, haciendo migrar la muestra en el gel hasta su separación, y transfiriendo el gel a membranas de nilón o nitrocelulosa. Los anticuerpos anticápside de VAA se utilizan a continuación como anticuerpos primarios que se unen a proteínas de cápside desnaturalizadas (véase, por ejemplo, Wobus et al., J. Virol. 74:9281-9293, 2000). Un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario contiene un medio para detectar el anticuerpo primario. La unión entre los anticuerpos primarios y secundarios se detecta semicuantitativamente para determinar la cantidad de cápsides.
Tal como se utiliza en la presente memoria, las formas singulares "un", "una", "el" o "la" incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un vector VAA", o "partícula de VAA", incluye una pluralidad de dichos vectores VAA y partículas de VAA, y la referencia a "una célula" o "célula huésped" incluye una pluralidad de células y células huésped.
El término "aproximadamente" tal como se utiliza en la presente memoria significa valores que se encuentran dentro del 10% (siendo mayor o siendo menor) de un valor de referencia.
Tal como se utiliza en la presente memoria, todos los valores numéricos o intervalos numéricos incluyen los números enteros dentro de dichos intervalos y las fracciones de los valores o los números enteros dentro de los intervalos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, a título ilustrativo, la referencia a 80% o más de identidad, incluye 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% etc., así como 81.1%, 81.2%, 81.3%, 81.4%, 81.5%, etc., 82.1%, 82.2%, 82.3%, 82.4%, 82.5%, etc.,
La referencia a un número entero con más que (mayor) o menos que incluye cualquier número mayor o menor al número de referencia, respectivamente. De esta manera, por ejemplo, la referencia a inferior a 100, incluye 99, 98, 97, etc., bajando hasta el número uno (1), e inferior a 10, incluye 9, 8, 7, etc. bajando hasta el número uno (1).
Tal como se utiliza en la presente memoria, todos los valores o intervalos numéricos son inclusivos. Además, todos los valores o intervalos numéricos incluyen fracciones de los valores y números enteros dentro de dichos intervalos y fracciones de los números enteros dentro de dichos intervalos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, a título ilustrativo, la referencia a un intervalo numérico, tal como 1 a 10, incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, así como 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, etc.. Por lo tanto, la referencia a un intervalo de 1 a 50 incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc., hasta e incluyendo 50, así como 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, etc., 2.1,2.2, 2.3, 2.4, 2.5, etc.
La referencia a una serie de intervalos incluye intervalos que combinan los valores de los límites de diferentes intervalos dentro de la serie. De esta manera, a título ilustrativo de la referencia a una serie de intervalos, por ejemplo, de 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300­ 400, 400-500, 500-750, 750-1,000, 1,000-1,500, 1,500-2,000, 2,000-2,500, 2,500-3,000, 3,000-3,500, 3,500-4,000, 4,000-4,500, 4,500-5,000, 5,500-6,000, 6,000-7,000, 7,000-8,000, o 8,000-9,000, incluye los intervalos de 10-50, 50-100, 100-1,000, 1,000-3,000, 2,000-4,000, etc.
Los ejemplos siguientes pretenden ser ilustrativos y no limitativos del alcance de la invención reivindicada.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para purificar partículas de vector adenoasociado recombinante (VAAr), en el que dicho procedimiento comprende las etapas siguientes:
(a) recolectar las células y el sobrenadante de cultivo celular que comprende partículas de vector VAAr para producir un recolectado;
(b) opcionalmente concentrar dicho recolectado producido en la etapa (a) para producir un recolectado concentrado;
(c) lisar dicho recolectado producido en la etapa (a) o dicho recolectado concentrado producido en la etapa (b) para producir un lisado;
(d) tratar el lisado producido en la etapa (c) para reducir el ácido nucleico contaminante en el lisado, produciendo de esta manera un lisado con una cantidad reducida de ácido nucleico;
(e) filtrar dicho lisado con una cantidad reducida de ácido nucleico producido en la etapa (d) para producir un lisado clarificado, y opcionalmente diluir dicho lisado clarificado para producir un lisado clarificado diluido; (f) someter dicho lisado clarificado o lisado clarificado diluido producido en la etapa (e) a cromatografía de columna de intercambio aniónico o a cromatografía de columna de intercambio catiónico para producir un eluido de columna que comprende partículas de vector VAAr, y opcionalmente concentrar dicho eluido de columna para producir un eluido de columna concentrado;
(g) someter dicho eluido de columna o dicho eluido de columna concentrado producido en la etapa (f) a cromatografía de columna de exclusión por tamaño para producir un segundo eluido de columna que comprende partículas de vector VAAr, separando de esta manera las partículas de vector VAAr respecto de las impurezas de proteínas, y opcionalmente diluir dicho segundo eluido de columna para producir un segundo eluido de columna diluido;
(h) someter dicho segundo eluido de columna o dicho segundo eluido de columna diluido producido en la etapa (g) a cromatografía de columna de intercambio catiónico en el caso de que en la etapa (f) dicho lisado clarificado o lisado clarificado diluido producido en la etapa (e) se haya sometido a cromatografía de intercambio aniónico o a cromatografía de columna de intercambio aniónico en el caso de que en la etapa (f) dicho lisado clarificado o lisado clarificado diluido producido en la etapa (e) se haya sometido a cromatografía de intercambio catiónico para producir un tercer eluido de columna que comprende partículas de vector VAAr, separando de esta manera partículas de vector VAAr respecto de impurezas de proteínas u otras impurezas de producción, y opcionalmente concentrar dicho tercer eluido de columna para producir un tercer eluido de columna concentrado; y
(i) filtrar dicho tercer eluido de columna o dicho tercer eluido de columna concentrado producido en la etapa (h) , produciendo de esta manera partículas de vector VAAr purificadas.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que:
(i) dicha concentración de la etapa (b) y/o la etapa (f) y/o la etapa (h) es mediante ultrafiltración/diafiltración, opcionalmente mediante filtración de flujo tangencial;
(ii) dicha concentración de la etapa (b) reduce el volumen de dichas células recolectadas y de sobrenadante de cultivo celular en aproximadamente 2 a 10 veces;
(iii) dicha concentración de la etapa (f) reduce el volumen de dicho eluido de columna en aproximadamente 5 a 20 veces;
(iv) dicho lisado de dicho recolectado producido en la etapa (a) o dicho recolectado concentrado producido en la etapa (b) es mediante microfluidización;
(v) la etapa (d) comprende el tratamiento con una nucleasa, reduciendo de esta manera el ácido nucleico contaminante;
(vi) dicha filtración de dicho lisado clarificado o de dicho lisado clarificado diluido de la etapa (e) es mediante un filtro que presenta un diámetro de poro de entre aproximadamente 0.1 y 0.8 micrómetros, ambos inclusive; (vii) dicha dilución de dicho lisado clarificado o de dicho lisado clarificado diluido de la etapa (e) es con una solución acuosa tamponada de acetato;
(viii) dicha dilución de dicho segundo eluido de columna de la etapa (g) es con una solución acuosa tamponada de acetato, en la que dicha solución acuosa tamponada de acetato preferentemente presenta un pH de entre aproximadamente 4.0 y 7.0, ambos inclusive;
(ix) dichas partículas de vector VAAr que resultan de la etapa (i) se formulan con un surfactante para producir una formulación de vector VAA;
(x) dicha cromatografía de columna de intercambio aniónico de la etapa (f) o de la etapa (h) comprende cromatografía de columna modulada con polietilenglicol (PEG);
(xi) dicha cromatografía de columna de intercambio aniónico de la etapa (f) o de la etapa (h) comprende el lavado de dicha columna con una solución acuosa de surfactante antes de la elución de dichas partículas de vector VAAr de la columna;
(xii) dicha cromatografía de columna de intercambio catiónico de la etapa (f) o de la etapa (h) comprende el lavado de dicha columna con una solución de surfactante antes de la elución de dichas partículas de vector VAAr de la columna;
(xiii) dichas partículas de vector VAAr se eluyen de dicha cromatografía de columna de intercambio aniónico de la etapa (f) o de la etapa (h) en un tampón acuoso de Tris-Cl/NaCl;
(xiv) dichas partículas de vector VAAr se eluyen de dicha cromatografía de columna de intercambio catiónico de la etapa (f) o de la etapa (h) en un tampón acuoso de fosfato/NaCl;
(xv) dicha cromatografía de columna de intercambio aniónico de la etapa (f) o de la etapa (h) comprende un grupo funcional de amonio cuaternario, tal como polietilenimina cuaternizada;
(xvi) dicha cromatografía de columna de exclusión por tamaño de la etapa (g) presenta un intervalo de separación (peso molecular) de entre aproximadamente 10,000 y 600,000, ambos inclusive; o
(xvii) dicha cromatografía de columna de intercambio catiónico de la etapa (f) o de la etapa (h) comprende un ácido sulfónico o grupo funcional, tal como sulfopropilo.
3. Procedimiento según la reivindicación 2 (v), en el que la nucleasa comprende benzonasa.
4. Procedimiento según la reivindicación 2 (x), en el que dicha cromatografía de columna de intercambio aniónico de la etapa (f) o de la etapa (h) comprende el lavado de dicha columna con una solución de PEG antes de la elución de dichas partículas de vector VAAr de la columna.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el PEG en dicha solución de PEG presenta un peso molecular medio en un intervalo comprendido entre aproximadamente 1,000 y 50,000, ambos inclusive.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 (xi), 2 (xii), 4 o 5, en el que dicha solución de PEG y/o dicha solución de surfactante comprende un tampón acuoso de Tris-Cl/NaCl o un tampón acuoso de fosfato/NaCl.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho tampón de NaCl comprende entre aproximadamente 20 y 250 mM de NaCl, ambos inclusive, o entre aproximadamente 50 y 200 mM de NaCl, ambos inclusive.
8. Procedimiento según la reivindicación 2 (xiii), en el que dicho tampón de Tris-Cl/NaCl comprende entre 50 y 200 mM de NaCl.
9. Procedimiento según la reivindicación 2 (xiv), en el que dicho tampón de fosfato/NaCl comprende entre aproximadamente 100 y 500 mM de NaCl, ambos inclusive.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el procedimiento excluye una etapa de ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio.
11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que:
(a) dichas partículas de vector VAAr comprenden un transgén que codifica un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste en una molécula de ARNip, una molécula antisentido, un miARN, un ribozima y un ARNhc,
(b) dichas partículas de vector VAAr comprenden un transgén que codifica un producto génico seleccionado de entre el grupo que consiste en insulina, glucagón, hormona de crecimiento (HC), hormona paratiroidea (HPT), factor liberador de hormona del crecimiento (FHC), hormona folículo-estimulante (HFE), hormona luteinizante (HL), gonadotropina coriónica humana (GCh), factor de crecimiento vascular endotelial (FCVE), angiopoyetinas, angiostatina, factor estimulante de colonias de granulocitos (FECG), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento del tejido conectivo (FCTC), factor de crecimiento fibroblástico básico (FCFb), factor de crecimiento fibroblástico ácido (FCFa), factor de crecimiento epidérmico (FCE), factor a de crecimiento transformante (FCTa), factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP), factores I y II de crecimiento insulínico (FCI-I y FCI-II), TGFp, activinas, inhibinas, proteína morfogénica ósea (PMO), factor de crecimiento nervioso (FCN), factor neurotrófico derivado del cerebro (FNDC), neurotrofinas NT-3 y NT4/5, factor neurotrófico ciliar (FNTC), factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales (FNDG), neurturina, agrina, netrina-1 y netrina-2, factor de crecimiento de hepatocitos (FCH), efrinas, noggina, Sonic hedgehog y tirosina hidroxilasa,
(c) dichas partículas de vector VAAr comprenden un transgén que codifica un producto génico seleccionado de entre el grupo que consiste en trombopoyetina (TpO), interleuquina (IL-1 a IL-17), proteína quimioatrayente de monocitos, factor inhibidor de leucemia, factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos, ligando Fas, factores a y p de necrosis tumoral, interferones a, p y y, factor de células madre, ligando flk-2/flt3, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena sencilla, receptores de células T, receptores de células T quiméricos, receptores de células T de cadena sencilla, moléculas del CMH de clase I y de clase II,
(d) dichas partículas de vector VAAr comprenden un transgén codificante de una proteína útiles para la corrección de errores innatos del metabolismo seleccionados de entre el grupo que consiste en carbamoil sintetasa I, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, arginosuccinato liasa, arginasa, fumarilacetacetato hidrolasa, fenilalanina hidroxilasa, antitripsina alfa-1, glucosa-6-fosfatasa, porfobilinógeno desaminasa, factor V, factor VIII, factor Ix, cistatión beta-sintasa, cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada, albúmina, isovaleril-CoA deshidrogenasa, propionil-CoA carboxilasa, metil-malonil-CoA mutasa, glutaril-CoA deshidrogenasa, insulina, beta-glucosidasa, piruvato carboxilasa, fosforilasa hepática, fosforilasa quinasa, glicina descarboxilasa, RPE65, proteína H, proteína T, una secuencia reguladora transmembranal de la fibrosis quística (RTFQ) y una secuencia de ADNc de distrofina, y/o
(e) dichas partículas de vector VAAr comprenden un transgén que codifica Factor VIII o Factor IX.
12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que:
(a) el procedimiento recupera aproximadamente entre 40% y 70% de las partículas totales de vector VAAr a partir del recolectado producido en la etapa (a) o dicho recolectado concentrado producido en la etapa (b),
(b) el procedimiento produce partículas de vector VAAr que presentan una pureza mayor que las partículas de vector VAAr producidas o purificadas mediante purificación de columna de afinidad de VAA,
(c) el procedimiento produce partículas de vector VAAr que presentan una mayor pureza que las partículas de vector VAAr producidas o purificadas mediante una columna de afinidad de VAA combinada con una purificación de columna de intercambio aniónico, y/o
(d) el procedimiento produce partículas de vector VAAr que presentan una mayor pureza que las partículas de vector VAAr producidas o purificadas mediante una columna de afinidad de VAA combinada con una columna de intercambio aniónico y una purificación de intercambio catiónico.
13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dichas partículas de vector VAAr se derivan de un VAA seleccionado de entre el grupo que consiste en VAA1, VAA2, VAa 3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9 y VAA10.
14. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha cromatografía de columna de intercambio aniónico de la etapa (f) o de la etapa (h) comprende una cromatografía de columna modulada con polietilenglicol (PEG),
15. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha columna de intercambio catiónico de la etapa (f) o de la etapa (h) comprende el lavado de dicha columna con una solución de surfactante antes de la elución de dichas partículas de vector VAAr de la columna.
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