ES2890882T3

ES2890882T3 - Composiciones y procedimientos para detectar el virus del Nilo occidental

Info

Publication number: ES2890882T3
Application number: ES17162596T
Authority: ES
Inventors: Jeffery Linnen; Reinhold B Pollner; Wen Wu; Geoffrey G Dennis; Paul M Darby
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 2002-10-16
Filing date: 2003-10-16
Publication date: 2022-01-24
Anticipated expiration: 2023-10-16
Also published as: EP2366803B8; CA3081071A1; CA2501946A1; EP1583949B1; WO2004036190A9; CA2868618A1; US7732169B2; EP1583949A4; EP2366803B1; JP2006502747A; CA2957200A1; US20040259108A1; WO2004036190A3; EP2366803A2; CA2501946C; EP1583949A2; EP2977470A1; EP3241915B1; CA2868618C; AU2003298605A1

Abstract

Sonda de ensayo de hibridación para detectar un ácido nucleico del Virus del Nilo occidental (VNO), que comprende: una secuencia de sonda que comprende una secuencia de bases nucleotídicas complementaria a la diana y, opcionalmente, una o más secuencias de bases nucleotídicas que no son complementarias a dicho ácido nucleico que se va a detectar, en la que dicha secuencia de bases nucleotídicas complementaria a la diana consiste en 18-22 bases nucleotídicas contiguas contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 103 o el complemento de la misma, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 % de diferencias de bases nucleotídicas, y en la que dicha sonda de ensayo de hibridación tiene una longitud de hasta 22 bases nucleotídicas.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para detectar el virus del Nilo occidental

Solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 60/418,891, presentada el 16 de octubre de 2002; la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 60/429,006, presentada el 25 de noviembre de 2002; y la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 60/449,810, presentada el 24 de febrero de 2003.

Sector de la invención

La presente invención se refiere al sector de la biotecnología. Más específicamente, la presente invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar los ácidos nucleicos de flavivirus, tales como el virus del Nilo occidental. Interés del gobierno en la invención

Ciertos aspectos de la presente invención dada a conocer en la presente memoria descriptiva se realizaron con el apoyo del gobierno en virtud del contrato N01-HB-07148 con el National Heart, Lung and Blood Institute de los National Institutes of Health. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre estos aspectos de la presente invención.

Estado de la técnica anterior

El virus del Nilo occidental (VNO) es un virus de ARN que infecta principalmente a las aves y los mosquitos culex, con los seres humanos y los caballos actúan como huéspedes fortuitos. La amplificación del virus en un ciclo ave-mosquito-ave comienza cuando los mosquitos adultos emergen a principios de la primavera y continúa hasta el otoño. Este intervalo de tiempo coincide con la incidencia de enfermedades en los seres humanos, que alcanza su punto máximo a finales del verano y principios del otoño. Desde que se detectó por primera vez en Nueva York en 1999, el virus se ha propagado rápidamente por la mayor parte de los Estados Unidos.

De hecho, durante los primeros nueve meses de 2002, se notificaron un total de más de 2.500 casos humanos con pruebas de laboratorio de infección reciente por el VNO en 32 estados y el Distrito de Columbia. Se notificaron un total de más de 120 muertes humanas, con una mediana de edad de los fallecidos de 79 años. Además, hubo informes de casi 5.000 cuervos muertos y otras casi 4.000 aves muertas con infección por VNO en los Estados Unidos. De los más de 3.000 mamíferos detectados con infección por VNO, más del 99 % eran caballos. También se notificaron, aproximadamente, 3.400 mosquitos de piscinas positivos para VNO.

La mayoría de las infecciones humanas por el virus no son clínicamente evidentes. En general, solo 1 de cada 150 infecciones da como resultado una enfermedad neurológica grave, tal como meningitis (inflamación de la médula espinal) o encefalitis (inflamación del cerebro). Entre los síntomas más leves, que generalmente duran de 3 a 6 días y se notifican de manera más común en relación con la infección por el VNO, se incluyen fiebre de inicio repentino, a menudo acompañada de malestar general, anorexia, náuseas, vómitos, dolor ocular, dolor de cabeza, mialgia, erupción cutánea y linfadenopatía. El período de incubación del VNO, aunque no se conoce con precisión, probablemente oscila entre 3 y 14 días. Un análisis de las tasas de ataque por millón de personas durante el brote de la ciudad de Nueva York de 1999 mostró que la incidencia de enfermedad neurológica grave fue más de 40 veces mayor en las personas de, como mínimo, 80 años en comparación con las personas de hasta 19 años. De este modo, la edad avanzada es un factor de riesgo importante de enfermedad neurológica grave.

Además de la transmisión por mosquitos, se ha relacionado la transmisión con la transfusión de sangre y el trasplante de órganos. Por ejemplo, cuatro receptores de órganos trasplantados de un solo donante en los EE. UU. se infectaron con el virus del Nilo occidental a mediados de 2002. Tres de los receptores desarrollaron encefalitis, y uno de los tres murió como resultado de la misma. El cuarto receptor desarrolló síntomas leves de infección vírica sin encefalitis, pero también dio positivo para el virus. El donante de órganos, que resultó herido en un accidente automovilístico, recibió numerosas transfusiones de productos sanguíneos antes de morir. No se sabía que hubiera estado enfermo antes del accidente, y una muestra de su sangre tomada antes de cualquiera de las transfusiones no mostró evidencias del virus del Nilo occidental. En un caso separado, una madre lactante cuya leche materna contenía VNO y un paciente de trasplante de hígado masculino recibieron una transfusión de sangre de un donante común y ambos desarrollaron infecciones por el virus del Nilo occidental. Una muestra de sangre almacenada de ese donante dio positivo para el VNO, lo que nuevamente sugiere una fuente común del virus infeccioso.

El virus del Nilo occidental es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo clasificado taxonómicamente en la familia Flaviviridae, en el género Flavivirus. Por consiguiente, el virus es miembro del serocomplejo del virus de la encefalitis japonesa, que contiene diversos virus de importancia médica asociados con la encefalitis humana: encefalitis japonesa, encefalitis de St. Louis, encefalitis del valle de Murray y virus Kunjin (un subtipo australiano del virus del Nilo occidental). El tamaño del genoma viral es de, aproximadamente, 11 kb. Están disponibles las secuencias del genoma completo de las cepas del virus del Nilo occidental aisladas de Estados Unidos, Europa y Oriente Medio (véase Lanciotti et al., en Virology 2002, 20 de junio; 298 (1): 96-105).

Se han descrito pruebas basadas en ácidos nucleicos para el VNO. Por ejemplo, Shi et al., en J. Clifa. Microbiol. 39: 1264 (2001) han descrito una prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real para ácidos nucleicos de VNO. Por ejemplo, la Patente PCT WO01/79546 describe sondas fluorescentes y cebadores para la detección e identificación por RT-PCT de flavivirus específicos. En Briese et al., en Lancet 2000, 6 de mayo; 355 (9215): 1614-5, se estableció un procedimiento de RT-PCR para la detección del VNO en el líquido cefalorraquídeo. Lanciotti et al., en J. Clin. Microbiol. 38: 4066 (2001) han descrito una prueba basada en TaqMan para la detección de ARN del VNO en muestras humanas, grupos de mosquitos y muestras de tejido aviar. La patente PCT WO01/79546 describe sondas fluorescentes y cebadores para la detección e identificación por RT-PCT de flavivirus específicos. También se ha descrito la PCR semianidada para la detección del VNO en muestras de líquido cefalorraquídeo. Sin embargo, a pesar de la disponibilidad de estas pruebas basadas en PCR, sigue existiendo la necesidad de una prueba de detección del VNO que se adapte específicamente a las necesidades de los laboratorios de pruebas clínicas. El procedimiento debería prestarse particularmente a un cribado de alto rendimiento que puede ser necesario para analizar un gran número de muestras de sangre o tejido clínicas y donadas.

Características de la invención

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a una sonda de ensayo de hibridación para detectar un ácido nucleico. Esta sonda de ensayo de hibridación incluye una secuencia de sonda que tiene una secuencia de bases nucleotídicas complementaria a la diana y, opcionalmente, una o más secuencias de bases nucleotídicas que no son complementarias a dicho ácido nucleico que se va a detectar, en la que dicha secuencia de bases nucleotídicas complementaria a la diana consiste en 18-22 bases nucleotídicas contiguas contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 103 o el complemento de la misma, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 % de diferencias de bases nucleotídicas, y en la que dicha sonda de ensayo de hibridación tiene una longitud de hasta 22 bases nucleotídicas. En una realización preferente, la secuencia de sonda se selecciona entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 106, la SEQ ID NO: 107, la SEQ ID NO: 108, la SEQ ID NO: 109, la SEQ ID NO: 110, la SEQ ID NO: 111 y la SEQ iD NO: 114. Aún más preferentemente, la sonda de ensayo de hibridación incluye las secuencias de bases nucleotídicas opcionales que no son complementarias al ácido nucleico que se va a detectar. Incluso aún más preferentemente, la sonda de ensayo de hibridación incluye un marcador detectable. Por ejemplo, la sonda puede incluir un resto fluoróforo y un resto desactivador. En este caso, la sonda de ensayo de hibridación puede ser una baliza molecular. Una baliza molecular de ejemplo puede incluir una secuencia de bases complementaria a la diana que consiste en cualquiera de la SEQ ID NO: 179, la SEQ ID NO: 180 o la SEQ ID NO: 181. También dado a conocer en la presente memoria descriptiva, la sonda de ensayo de hibridación consiste en 18-52 bases contiguas contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 103 o el complemento de la misma, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases y tiene una longitud de hasta 52 bases. Cuando este es el caso, la secuencia de bases complementaria a la diana puede consistir en 18-22 bases contiguas contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 103 o el complemento de la misma, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases, y la sonda de ensayo de hibridación puede tener una longitud de hasta 22 bases. En una realización, la sonda de la presente invención puede tener la secuencia de la SEQ ID NO: 116. En otra realización, la secuencia de sonda puede ser cualquiera de la SEQ ID NO: 114, la SEQ ID NO: 111, la SEQ ID NO: 110, la SEQ ID NO: 109, la SEQ ID NO: 108, la SEQ ID NO: 107 o la SEQ ID NO: 106.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit que contiene la sonda de ensayo de hibridación, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y que incluye, opcionalmente, cebadores u otros oligonucleótidos auxiliares para amplificar el ácido nucleico diana del VNO que se va a detectar.

También se dan a conocer en la presente memoria descriptiva kits que comprenden cebadores, en los que la secuencia complementaria a la diana terminal del primer cebador puede tener una longitud de hasta 35 bases y la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador puede tener una longitud de hasta 22 bases. Cuando el primer cebador tiene una longitud de hasta 24 bases, la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador puede tener una longitud de hasta 22 bases. El primer cebador puede incluir una secuencia en el sentido de 5’ del primer cebador, tal como una secuencia promotora de la a Rn polimerasa T7. Cuando la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del primer cebador tiene una longitud de hasta 24 bases, y cuando la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador tiene una longitud de hasta 22 bases, la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del primer cebador puede ser cualquiera de la SEQ ID NO: 75, la SEQ ID NO: 76 y la SEQ ID NO: 77, y la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador puede ser cualquiera de la SEQ ID nO: 60, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70 y la SEQ ID NO: 71. Cuando la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ dada a conocer en la presente memoria descriptiva del primer cebador tiene una longitud de hasta 24 bases, y cuando la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador tiene hasta 35 bases de longitud, la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del primer cebador incluye 22 bases contiguas contenidas dentro de la SEQ ID NO: 74, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases. Cuando este es el caso, la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador puede tener hasta 22 bases de longitud. Alternativamente, el primer cebador puede incluir una secuencia en el sentido de 5’ del primer cebador, tal como una secuencia promotora de la ARN polimerasa T7.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una sonda de ensayo de hibridación para detectar un ácido nucleico. La sonda de ensayo de hibridación dada a conocer incluye una secuencia de sonda que tiene una secuencia de bases complementaria a la diana y, opcionalmente, una o más secuencias de bases que no son complementarias al ácido nucleico que se va a detectar. La secuencia de bases complementaria a la diana consiste en 10-20 bases contiguas contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 99 o el complemento de la misma, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases. Finalmente, la sonda de ensayo de hibridación dada a conocer puede tener una longitud de hasta 100 bases. También se da a conocer en la presente memoria descriptiva que la longitud de la sonda de ensayo de hibridación es de hasta 30 bases. Aún más preferentemente, la secuencia de sonda incluye las secuencias de bases opcionales que no son complementarias al ácido nucleico que se va a detectar. Según una primera versión de esta realización, se incluye, además, un marcador detectable. Según una segunda versión de esta realización, se incluye, además, un resto fluoróforo y un resto desactivador, y la sonda de ensayo de hibridación es una baliza molecular. Además, en la presente memoria descriptiva se da a conocer una sonda de ensayo de hibridación, en la que la longitud de la sonda de ensayo de hibridación es de hasta 30 bases, la secuencia de sonda consiste en 10-20 bases contiguas contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 99 o el complemento de la misma, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases, y no incluye las secuencias de bases opcionales que no son complementarias a los ácidos nucleicos de ^vN^o. La sonda de ensayo de hibridación puede tener una longitud de hasta 20 bases. Cuando la longitud de la sonda de ensayo de hibridación es de hasta 30 bases, la secuencia de bases complementaria a la diana consiste en 19-20 bases contiguas contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 99 o el complemento de la misma, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases. También se da a conocer en la presente memoria descriptiva que la secuencia de sonda consiste en 19-20 bases contiguas contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 99 o el complemento de la misma, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases, y no incluye las secuencias de bases opcionales que no son complementarias al ácido nucleico que se va a detectar. La sonda de ensayo de hibridación dada a conocer en la presente memoria descriptiva puede incluir, además, un marcador detectable, tal como un marcador quimioluminiscente o un marcador fluorescente. La secuencia de bases complementaria a la diana puede consistir en 19-20 bases contiguas contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 99 o el complemento de la misma, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases, y la sonda de ensayo de hibridación tiene una longitud de hasta 20 bases. Por ejemplo, la secuencia de sonda puede ser la SEQ ID NO: 100. Cuando la longitud de la sonda de ensayo de hibridación es de hasta 30 bases, y cuando la secuencia de sonda incluye las secuencias de bases opcionales que no son complementarias al ácido nucleico que se va a detectar, la secuencia de bases complementaria a la diana puede ser cualquiera de la SEQ ID. NO: 164, la SEQ ID NO: 165, la SEQ ID NO: 166, la SEQ ID NO: 167, la SEQ ID NO: 168, la SEQ ID NO: 169 o la SEQ ID NO: 170.

Además, en la presente memoria descriptiva se da a conocer un kit para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana que puede estar presente en una muestra biológica. Este kit contiene un primer cebador que incluye una secuencia complementaria a la diana terminal 3’ y, opcionalmente, una secuencia en el sentido de 5’ del primer cebador que no es complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana que se va a amplificar. La secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del primer cebador incluye 22 bases contiguas contenidas dentro de la SEQ ID NO: 52, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases. El kit contiene, además, un segundo cebador que incluye una secuencia complementaria a la diana terminal 3’ y, opcionalmente, una secuencia en el sentido de 5’ del segundo cebador que no es complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana que se va a amplificar. La secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador incluye 22 bases contiguas contenidas dentro de la SEQ ID NO: 41, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases. El primer cebador y el segundo cebador pueden tener, cada uno, hasta 60 bases de longitud. Otra posibilidad dada a conocer en la presente memoria descriptiva es que la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del primer cebador y la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador tengan, cada una, una longitud de hasta 35 bases. Cuando este es el caso, la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del primer cebador tiene, preferentemente, hasta 26 bases de longitud. Cuando la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del primer cebador y la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador tienen, cada una, hasta 35 bases de longitud, la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador puede tener hasta 23 bases de longitud. También se da a conocer en la presente memoria descriptiva que, cuando la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del primer cebador tiene una longitud de hasta 26 bases, y la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador tiene una longitud de hasta 23 bases. La secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del primer cebador se puede seleccionar entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 53, la SEQ ID NO: 54 y la SEQ ID NO: 55, y la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador se puede seleccionar entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 43, la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 50 y la SEQ ID NO: 51. La secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador puede tener hasta 23 bases de longitud. Cuando este es el caso, el primer cebador puede incluir una secuencia en el sentido de 5’ del primer cebador, tal como una secuencia promotora de la ARN polimerasa T7.

La presente invención se refiere, además, a una sonda de ensayo de hibridación para detectar un ácido nucleico. La sonda de ensayo de hibridación tiene una secuencia de sonda que incluye una secuencia de bases complementaria a la diana y, opcionalmente, una o más secuencias de bases que no son complementarias al ácido nucleico que se va a detectar. La secuencia de bases complementaria a la diana consiste en 13-37 bases contiguas contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 95 o el complemento de la misma, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases. En términos generales, la sonda de ensayo de hibridación puede tener una longitud de hasta 100 bases. Una posibilidad dada a conocer en la presente memoria descriptiva es que la longitud de la sonda de ensayo de hibridación sea de hasta 37 bases. La sonda de ensayo de hibridación puede incluir las secuencias de bases opcionales que no son complementarias al ácido nucleico que se va a detectar. Aún más preferentemente, la sonda de ensayo de hibridación incluye, además, un marcador detectable. Por ejemplo, la sonda de ensayo de hibridación puede incluir, además, un resto fluoróforo y un resto desactivador. En este caso, la sonda de ensayo de hibridación puede ser una baliza molecular. En una sonda de ensayo de hibridación diferente dada a conocer en la presente memoria descriptiva, la secuencia de sonda consiste en 13-20 bases contiguas contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 95 o el complemento de la misma, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases, y no incluye las secuencias de bases opcionales que no son complementarias al ácido nucleico que se va a detectar. Cuando la longitud de la sonda de ensayo de hibridación es de hasta 37 bases, la secuencia de bases complementaria a la diana consiste en 13-20 bases contiguas contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 95 o el complemento de la misma, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y de ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases. La secuencia de sonda puede consistir en 20 bases contiguas contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 95 o el complemento de la misma, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases y no incluye las secuencias de bases opcionales que no son complementarias al ácido nucleico que se va a detectar. La sonda de ensayo de hibridación puede incluir, además, un marcador detectable, tal como un marcador quimioluminiscente o un marcador fluorescente. Cuando la longitud de la sonda de ensayo de hibridación es de hasta 37 bases, y cuando la secuencia de bases complementaria a la diana consiste en 13-20 bases contiguas contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 95 o el complemento de la misma, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases, la secuencia de sonda puede no incluir las secuencias de bases opcionales que no son complementarias al ácido nucleico que se va a detectar y la sonda de ensayo de hibridación tiene una longitud de hasta 20 bases. Por ejemplo, la secuencia de sonda puede ser la SEQ ID NO: 98. En términos generales, cuando la longitud de la sonda de ensayo de hibridación es de hasta 37 bases, la secuencia de bases complementaria a la diana puede ser, por ejemplo, cualquiera de la SEQ ID NO: 154, la SEQ ID NO: 155, la SEQ ID NO: 156, la SEQ ID NO: 157 o la SEQ ID NO: 158.

La presente invención también se refiere a un kit para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana que puede estar presente en una muestra biológica. El kit contiene un primer cebador que incluye una secuencia complementaria a la diana terminal 3’ y, opcionalmente, una secuencia en el sentido de 5’ del primer cebador que no es complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana que se va a amplificar. La secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del primer cebador incluye 20 bases contiguas contenidas dentro de la SEQ ID NO: 16, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases. El kit contiene, además, un segundo cebador que incluye una secuencia complementaria a la diana terminal 3’ de hasta 30 bases de longitud y, opcionalmente, una secuencia en el sentido de 5’ del segundo cebador que no es complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana que se va a amplificar. La secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador incluye 20 bases contiguas contenidas dentro de la SEQ ID NO: 1, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases. El primer cebador y el segundo cebador pueden tener, cada uno, hasta 60 bases de longitud. La secuencia complementaria a la diana terminal del primer cebador puede tener una longitud de hasta 35 bases. La secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del primer cebador puede tener una longitud de hasta 24 bases. La secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador puede tener una longitud de hasta 24 bases. Cuando la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del primer cebador tiene una longitud de hasta 24 bases, la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador tiene, preferentemente, una longitud de hasta 24 bases. La secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador puede tener hasta 26 bases de longitud e incluye 20 bases contiguas contenidas dentro de la SEQ ID NO: 2, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases. La secuencia complementaria a la diana terminal del primer cebador puede tener una longitud de hasta 24 bases y la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador puede tener una longitud de hasta 24 bases. La secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador puede tener hasta 24 bases de longitud. La secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del primer cebador puede ser cualquiera de la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 25, la SEQ ID NO: 26 o la SEQ ID NO: 28. La secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del primer cebador puede tener hasta 24 bases de longitud, y la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador tiene una longitud de hasta 26 bases e incluye 20 bases contiguas contenidas dentro de la SEQ ID NO: 2, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 %, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases, la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador es cualquiera de la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 15. Alternativamente, cuando la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del primer cebador es cualquiera de la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 25, la SEQ ID NO: 26 o la SEQ ID NO: 28, la secuencia complementaria a la diana terminal 3’ del segundo cebador puede ser cualquiera de la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 15. El primer cebador puede incluir una secuencia en el sentido de 5’ del primer cebador, tal como una secuencia promotora de la ARN polimerasa T7.

Definiciones

Los siguientes términos tienen los siguientes significados para el propósito de la presente invención, a menos que se indique expresamente lo contrario en la presente memoria descriptiva.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, una “muestra biológica” es cualquier tejido o material que contiene polinucleótidos obtenido de una muestra humana, animal o ambiental. Entre las muestras biológicas, según la presente invención, se incluyen sangre periférica, plasma, suero u otro fluido corporal, médula ósea u otro órgano, tejidos de biopsia u otros materiales de origen biológico. Una muestra biológica se puede tratar para alterar la estructura celular o tisular, liberando de esta manera componentes intracelulares en una solución que puede contener enzimas, tampones, sales, detergentes y similares.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “polinucleótido” significa ARN o ADN, junto con cualquier análogo de nucleótido sintético u otras moléculas que pueden estar presentes en la secuencia y que no evitan la hibridación del polinucleótido con una segunda molécula que tiene una secuencia complementaria.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, un “marcador detectable” es una especie química que puede detectarse o puede conducir a una respuesta detectable. Los marcadores detectables, según la presente invención, se pueden unir a sondas polinucleotídicas directa o indirectamente, e incluyen radioisótopos, enzimas, haptenos, cromóforos, tales como colorantes o partículas que proporcionan un color detectable (por ejemplo, perlas de látex o partículas metálicas), compuestos luminiscentes (por ejemplo, restos bioluminiscentes, fosforescentes o quimioluminiscentes) y compuestos fluorescentes.

Un “marcador detectable homogéneo” se refiere a un marcador que puede detectarse de forma homogénea, determinando si el marcador está en una sonda hibridada con una secuencia diana. Es decir, se pueden detectar marcadores detectables homogéneos sin eliminar físicamente las formas hibridadas de las no hibridadas del marcador o la sonda marcada. Son preferentes los marcadores detectables homogéneos cuando se utilizan sondas marcadas para detectar ácidos nucleicos de VNO. Se han descrito en detalle ejemplos de marcadores homogéneos por Arnold et al., Patente US5,283,174; Woodhead et al., Patente US5,656,207; y Nelson et al., Patente US5,658,737. Entre los marcadores preferentes para su utilización en ensayos homogéneos se incluyen compuestos quimioluminiscentes (por ejemplo, véase Woodhead et al., Patente US5,656,207; Nelson et al., Patente US5,658,737; y Arnold, Jr., et al., Patente US5,639,604). Los marcadores quimioluminiscentes preferentes son compuestos de éster de acridinio (“AE”, acridinium ester), tales como AE estándar o derivados del mismo (por ejemplo, naftil-AE, orto-AE, 1 -metil-AE o 3-metil-AE, 2,7-dimetil-AE, 4,5-dimetil-AE, orto-dibromo-AE, orto-dimetil-AE, meta-dimetil-AE, orto-metoxi-AE, orto-metoxi(cinamil)-AE, orto-metil-AE, orto-fluoro-AE, 1-metil-orto-fluoro-AE o 3-metil-orto-fluoro-AE, 1-metil-meta-difluoro-AE o 3-metil-meta-difluoro-AE y 2-metil-AE).

Un “ensayo homogéneo” se refiere a un procedimiento de detección que no requiere la separación física de la sonda hibridada de la sonda no hibridada antes de determinar el grado de hibridación de la sonda específica. Ensayos homogéneos de ejemplo, tales como los dados a conocer en la presente memoria descriptiva, pueden utilizar balizas moleculares u otras sondas de autoinforme que emiten señales fluorescentes cuando se hibridan con una diana apropiada, marcadores de éster de acridinio quimioluminiscentes que pueden destruirse selectivamente por medios químicos a menos que estén presentes en un dúplex híbrido y otros marcadores detectables de forma homogénea que resultarán familiares a los que tengan un nivel normal de experiencia en la materia.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “amplificación” se refiere a un procedimiento in vitro para obtener múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico diana, su complemento o fragmentos de los mismos. Por “ácido nucleico diana” o “diana” se entiende un ácido nucleico que contiene una secuencia de ácido nucleico diana. En general, una secuencia de ácido nucleico diana que se va a amplificar se situará entre dos cebadores dispuestos de manera opuesta e incluirá la porción del ácido nucleico diana que es completamente complementaria a cada uno de los cebadores.

Por “secuencia de ácido nucleico diana” o “secuencia diana” o “región diana” se entiende una secuencia de desoxirribonucleótido o ribonucleótido específica que comprende toda o parte de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico monocatenario, y la secuencia de desoxirribonucleótido o ribonucleótido complementaria a la misma.

Por “amplificación asociada a la transcripción” se entiende cualquier tipo de amplificación de ácido nucleico que utiliza una ARN polimerasa para producir múltiples transcritos de A^rN a partir de una plantilla de ácido nucleico. Un ejemplo de un procedimiento de amplificación asociado a la transcripción, denominado “amplificación mediada por transcripción” (TMA, Transcription Mediated Amplification), utiliza generalmente una ARN polimerasa, una ADN polimerasa, desoxirribonucleósidos trifosfato, ribonucleósidos trifosfato y un oligonucleótido complementario promotor-plantilla, y, opcionalmente, puede incluir uno o más oligonucleótidos análogos. Las variaciones de TMA son bien conocidas en la técnica, tal como se da a conocer en detalle en Burg et al., Patente US5,437,990; Kacian et al., Patentes US5,399,491 y US5,554,516; Kacian et al., Patente WO 93/22461; Gingeras et al., Patente WO 88/01302; Gingeras et al., Patente WO 88/10315; Malek et al., Patente US5,130,238; Urdea et al., Patentes US4,868,105 y US5,124,246; McDonough et al., Patente WO 94/03472; y Ryder et al., Patente WO 95/03430. Son preferentes los procedimientos de Kacian et al., para llevar a cabo procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos del tipo dado a conocer en la presente memoria descriptiva.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, un “oligonucleótido” u “oligómero” es una cadena polimérica de, como mínimo, dos, generalmente entre, aproximadamente, cinco y, aproximadamente, 100 subunidades químicas, comprendiendo cada subunidad un resto de base nucleotídica, un resto de azúcar y un resto de enlace que se une las subunidades en una configuración espacial lineal. Los restos de bases nucleotídicas comunes son guanina (G), adenina (A), citosina (C), timina (T) y uracilo (U), aunque los expertos en la materia conocen bien otras bases nucleotídicas raras o modificadas capaces de formar puentes de hidrógeno. Los oligonucleótidos pueden incluir, opcionalmente, análogos de cualquiera de los restos de azúcar, los restos de base y los constituyentes de la cadena principal. Los oligonucleótidos preferentes de la presente invención están en un intervalo de tamaño de, aproximadamente, 10 a, aproximadamente, 100 residuos. Los oligonucleótidos se pueden purificar a partir de fuentes naturales pero, preferentemente, se sintetizan utilizando cualquiera de una variedad de procedimientos enzimáticos o químicos bien conocidos.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, una “sonda” es un oligonucleótido que se hibrida específicamente con una secuencia diana en un ácido nucleico, preferentemente en un ácido nucleico amplificado, en condiciones que promueven la hibridación, para formar un híbrido detectable. Una sonda puede contener, opcionalmente, un resto detectable que puede estar unido al extremo o a los extremos de la sonda o puede ser interno. Los nucleótidos de la sonda que se combinan con el polinucleótido diana no necesitan ser estrictamente contiguos, como puede ser el caso de un resto detectable interno a la secuencia de la sonda. La detección puede ser directa (es decir, como resultado de una sonda que se hibrida directamente con la secuencia diana o el ácido nucleico amplificado) o indirecta (es decir, como resultado de una sonda que se hibrida con una estructura molecular intermedia que une la sonda a la secuencia diana o al ácido nucleico amplificado). La “diana” de una sonda generalmente se refiere a una secuencia contenida dentro de una secuencia de ácido nucleico amplificada que se hibrida específicamente, como mínimo, con una porción de un oligonucleótido sonda utilizando enlaces de hidrógeno estándar (es decir, emparejamiento de bases). Una sonda puede comprender secuencias específicas de la diana y, opcionalmente, otras secuencias que no son complementarias a la secuencia diana que se va a detectar. Estas secuencias no complementarias pueden comprender una secuencia promotora, un sitio de reconocimiento de endonucleasas de restricción o secuencias que contribuyen a la conformación tridimensional de la sonda (por ejemplo, tal como se describe en Lizardi et al., Patentes US5,118,801 y US5,312,728). Las secuencias que son “suficientemente complementarias” permiten la hibridación estable de un oligonucleótido sonda con una secuencia diana que no es completamente complementaria a la secuencia específica de la diana de la sonda.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, un “cebador de amplificación” es un oligonucleótido que se hibrida con un ácido nucleico diana, o su complemento, y participa en una reacción de amplificación de ácido nucleico. Por ejemplo, los cebadores de amplificación, o más simplemente “cebadores”, pueden ser oligonucleótidos modificados opcionalmente que son capaces de hibridarse con un ácido nucleico plantilla y que tienen un extremo 3’ que puede extenderse mediante una actividad de ADN polimerasa. En general, un cebador tendrá una secuencia complementaria a VNO en el sentido de 3’ y, opcionalmente, una secuencia en el sentido de 5’ que no es complementaria a los ácidos nucleicos de VNO. La secuencia en el sentido de 5’ opcional puede, por ejemplo, servir como un promotor de la ARN polimerasa o contener sitios escindibles por endonucleasas de restricción.

Por “sustancialmente homólogo”, “sustancialmente correspondiente” o “que corresponde sustancialmente” se entiende que el oligonucleótido en cuestión tiene una secuencia de bases que contiene una región, como mínimo, de 10 bases contiguas que tiene, como mínimo, el 70 % de homología, preferentemente, como mínimo, el 80 % de homología, más preferentemente, como mínimo, el 90 % de homología y, de la manera más preferente, el 100 % de homología con una región, como mínimo, de 10 bases contiguas presente en una secuencia de bases de referencia (excluyendo los equivalentes de ARN y ADN). Los expertos en la materia apreciarán fácilmente las modificaciones que podrían realizarse en las condiciones del ensayo de hibridación en diversos porcentajes de homología para permitir la hibridación del oligonucleótido con la secuencia diana mientras se previenen niveles inaceptables de hibridación no específica. El grado de similitud se determina comparando el orden de las nucleobases que componen las dos secuencias y no tiene en cuenta otras diferencias estructurales que puedan existir entre las dos secuencias, siempre que las diferencias estructurales no impidan el enlace de hidrógeno con bases complementarias. El grado de homología entre dos secuencias también se puede expresar en términos del número de emparejamientos erróneos presentes en cada conjunto, como mínimo, de 10 bases contiguas que se comparan, que pueden oscilar entre 0-2 diferencias de bases.

Por “sustancialmente complementario” se entiende que el oligonucleótido en cuestión tiene una secuencia de bases que contiene una región, como mínimo, de 10 bases contiguas que tiene, como mínimo, el 70 % de complementariedad, preferentemente, como mínimo, el 80 % de complementariedad, más preferentemente, como mínimo, el 90 % de complementariedad y, de la manera más preferente, el 100 % complementariedad con una región, como mínimo, de 10 bases contiguas presente en una secuencia de ácido nucleico diana (excluyendo equivalentes de ARN y ADN). (Los expertos en la materia apreciarán fácilmente las modificaciones que podrían realizarse en las condiciones del ensayo de hibridación en diversos porcentajes de complementariedad para permitir la hibridación del oligonucleótido con la secuencia diana mientras se previenen niveles inaceptables de hibridación no específica). El grado de complementariedad se determina comparando el orden de las nucleobases que componen las dos secuencias y no tiene en cuenta otras diferencias estructurales que puedan existir entre las dos secuencias, siempre que las diferencias estructurales no impidan el enlace de hidrógeno con bases complementarias. El grado de complementariedad entre dos secuencias también se puede expresar en términos del número de emparejamientos erróneos presentes en cada conjunto, como mínimo, de 10 bases contiguas que se comparan, que pueden oscilar entre 0-2 emparejamientos erróneos.

Por “suficientemente complementario” se entiende una secuencia de bases de ácido nucleico contigua que es capaz de hibridarse con otra secuencia de bases mediante enlaces de hidrógeno entre una serie de bases complementarias. Las secuencias de bases complementarias pueden ser complementarias en cada posición de la secuencia de bases de un oligonucleótido utilizando un emparejamiento de bases estándar (por ejemplo, emparejamiento de G:C, A:T o A:U) o pueden contener uno o más residuos que no son complementarios utilizando enlaces de hidrógeno estándar (incluyendo “nucleótidos” abásicos), pero en el que la secuencia de bases complementaria completa es capaz de hibridarse específicamente con otra secuencia de bases en condiciones de hibridación apropiadas. Las bases contiguas tienen, preferentemente, como mínimo, aproximadamente, el 80 %, más preferentemente, como mínimo, aproximadamente, el 90 % y, de la manera más preferente, aproximadamente, el 100 % de complementariedad con una secuencia a la que se pretende que se hibride específicamente un oligonucleótido. Las condiciones de hibridación apropiadas son bien conocidas por los expertos en la materia, pueden predecirse fácilmente basándose en la composición de la secuencia de bases, o pueden determinarse empíricamente utilizando pruebas de rutina (por ejemplo, véase Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) en los apartados 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 y 11.47-11.57 particularmente en los apartados 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 y 11.55-11.57).

Por “oligonucleótido de captura” se entiende, como mínimo, un oligonucleótido de ácido nucleico que proporciona un medio para unir específicamente una secuencia diana y un oligonucleótido inmovilizado debido a la hibridación de pares de bases. Un oligonucleótido de captura incluye, preferentemente, dos regiones de unión: una región de unión a la secuencia diana y una región de unión a la sonda inmovilizada, normalmente contiguas en el mismo oligonucleótido, aunque el oligonucleótido de captura puede incluir una región de unión a la secuencia diana y una región de unión a la sonda inmovilizada que están presentes en dos oligonucleótidos diferentes unidos por uno o más enlazadores. Por ejemplo, una región de unión a la sonda inmovilizada puede estar presente en un primer oligonucleótido, la región de unión a la secuencia diana puede estar presente en un segundo oligonucleótido y los dos oligonucleótidos diferentes se unen mediante enlaces de hidrógeno con un enlazador que es un tercer oligonucleótido que contiene secuencias que se hibridan específicamente con las secuencias del primer y segundo oligonucleótidos.

Por “sonda inmovilizada” o “ácido nucleico inmovilizado” se entiende un ácido nucleico que une, directa o indirectamente, un oligonucleótido de captura a un soporte inmovilizado. Una sonda inmovilizada es un oligonucleótido unido a un soporte sólido que facilita la separación de la secuencia diana unida del material no unido en una muestra.

Por “separar” o “purificar” se entiende que uno o más componentes de la muestra biológica se eliminan de uno o más otros componentes de la muestra. Los componentes de la muestra incluyen ácidos nucleicos en una fase de solución generalmente acuosa que también puede incluir materiales tales como proteínas, carbohidratos, lípidos y sondas marcadas. Preferentemente, la etapa de separación o purificación elimina, como mínimo, el 70 %, aproximadamente, más preferentemente, como mínimo, el 90 %, aproximadamente, e incluso más preferentemente, como mínimo, el 95 %, aproximadamente, de los otros componentes presentes en la muestra.

Por “equivalentes de ARN y ADN” o “bases equivalentes de ARN y ADN” se entienden moléculas, tales como ARN y ADN, que tienen las mismas propiedades de hibridación de pares de bases complementarias. Los equivalentes de ARN y ADN tienen diferentes restos de azúcar (es decir, ribosa frente a desoxirribosa) y pueden diferir por la presencia de uracilo en el ARN y timina en el ADN. Las diferencias entre los equivalentes de ARN y a Dn no contribuyen a las diferencias en la homología, dado que los equivalentes tienen el mismo grado de complementariedad con una secuencia particular.

Por “que consiste esencialmente en” se entiende que se pueden incluir uno o más componentes, una o más composiciones o una o más etapas del procedimiento adicionales que no cambian materialmente las características básicas y novedosas de la presente invención en las composiciones o kits o procedimientos de la presente invención. Entre dichas características se incluyen la capacidad de detectar selectivamente ácidos nucleicos de VNO en muestras biológicas tales como sangre completa o plasma. Cualquier componente o componentes, composición o composiciones o etapa o etapas del procedimiento que tenga un efecto material sobre las características básicas y novedosas de la presente invención quedaría fuera de esta expresión.

Descripción breve de los dibujos

La figura 1 es un diagrama esquemático que ilustra los diversos polinucleótidos que se pueden utilizar para detectar una región diana dentro del ácido nucleico de VNO (representado por una línea horizontal gruesa). Las posiciones de los siguientes ácidos nucleicos se muestran en relación con la región diana: “Oligonucleótido de captura” se refiere al ácido nucleico utilizado para hibridar con y capturar el ácido nucleico diana antes de la amplificación, en el que “T” se refiere a una secuencia de cola utilizada para hibridar un oligonucleótido inmovilizado que tiene una secuencia complementaria (no mostrada); El “cebador no T7” y el “promotor T7-cebador” representan dos cebadores de amplificación utilizados para llevar a cabo la TMA, en los que “P” indica la secuencia promotora del promotor T7-cebador; y “Sonda” se refiere a la sonda utilizada para detectar el ácido nucleico amplificado.

La figura 2 muestra una serie de gráficos de líneas que representan señales de hibridación de sonda específicas, medidas en unidades de luz relativas (eje y) frente a niveles crecientes de diana de entrada (eje x). Los oligonucleótidos diana utilizados en el procedimiento tenían las secuencias de la SEQ ID NO: 148 (•), la SEQ ID NO: 150 (♦), la SEQ ID NO: 151 (■) y la SEQ ID NO: 152 (▲).

La figura 3 es un gráfico de líneas que relaciona la cantidad de entrada estándar de VNO en una reacción de amplificación de ácido nucleico en tiempo real (eje x) y el tiempo de aparición de la señal fluorescente medida por encima de un umbral de fondo (eje y).

Descripción detallada de la invención

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer composiciones, procedimientos y kits para detectar selectivamente los ácidos nucleicos de flavivirus, tales como el virus del Nilo occidental (VNO), en muestras biológicas tales como sangre, suero, plasma u otros fluidos o tejidos corporales. Las sondas, cebadores y procedimientos de la presente invención se pueden utilizar en aplicaciones de diagnóstico o para cribar sangre y productos sanguíneos u otros tejidos donados que pueden contener partículas infecciosas.

Introducción y características generales

La presente invención incluye composiciones (oligonucleótidos de captura de ácidos nucleicos, oligonucleótidos de amplificación y sondas), procedimientos y kits que son particularmente útiles para detectar ácidos nucleicos de VNO en una muestra biológica. Para diseñar secuencias de oligonucleótidos apropiadas para estas utilizaciones, en primer lugar, se compararon las secuencias conocidas de ácidos nucleicos de VNO para identificar regiones candidatas del genoma viral que podrían servir como reactivos en un ensayo de diagnóstico. Como resultado de estas comparaciones, se seleccionaron tres regiones diferentes del genoma del VNO como dianas para la detección utilizando los oligonucleótidos de captura, cebadores y sondas que se muestran esquemáticamente en la figura 1. Se eligieron porciones de secuencias que contenían relativamente pocas variantes entre las secuencias comparadas como puntos de partida para diseñar oligonucleótidos sintéticos adecuados para su utilización en la captura, amplificación y detección de las secuencias amplificadas.

Basándose en estos análisis, se diseñaron el oligonucleótido de captura, el cebador de amplificación y las secuencias de sonda que se presentan a continuación. Aquellos que tengan un nivel normal de experiencia en la técnica apreciarán que cualquier secuencia de cebador específica para VNO u otra diana de flavivirus, con una secuencia del promotor T7 o sin la misma, se puede utilizar como cebadores en los diversos procedimientos de amplificación in vitro basados en cebadores descritos a continuación. También se contempla que los oligonucleótidos que tienen las secuencias dadas a conocer en la presente memoria descriptiva podrían tener funciones alternativas en ensayos para detectar ácidos nucleicos de VNO. Por ejemplo, los oligonucleótidos de captura dados a conocer en la presente memoria descriptiva podrían servir como sondas de hibridación, las sondas de hibridación dadas a conocer en la presente memoria descriptiva se podrían utilizar como cebadores de amplificación y los cebadores de amplificación dados a conocer en la presente memoria descriptiva se podrían utilizar como sondas de hibridación en ensayos de detección alternativos.

Los cebadores de amplificación dados a conocer en la presente memoria descriptiva se contemplan particularmente como componentes de reacciones de amplificación multiplex en las que se pueden producir diversas especies de amplicones a partir de una variedad de cebadores específicos de la diana. Por ejemplo, se contempla que ciertos cebadores específicos de VNO preferentes dados a conocer en la presente memoria descriptiva se puedan utilizar en reacciones de amplificación multiplex que son capaces de amplificar polinucleótidos de virus no relacionados, sin comprometer sustancialmente las sensibilidades de esos ensayos. Entre los ejemplos particulares de estos virus no relacionados se incluyen VIH-1, VIH-2, VHC y VHB.

Procedimientos de amplificación útiles

Entre los procedimientos de amplificación útiles en relación con la presente invención se incluyen: amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos (NASBA, Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA, Strand Displacement Amplification) y procedimientos de amplificación que utilizan la autorreplicación de moléculas de polinucleótidos y enzimas de replicación, tales como el ARN MDV-1 y la enzima Q-beta. Los procedimientos para llevar a cabo estas diversas técnicas de amplificación, respectivamente, se pueden encontrar en la Patente US5,399,441, la Patente EP 0 525 882, la Patente US4,965,188, la Patente US5,455,166, la Patente US5,472,840 y en Lizardi et al., BioTechnology 6: 1197 (1988).

En una realización muy preferente de la presente invención, las secuencias de ácido nucleico de VNO se amplifican utilizando un protocolo de TMA. Según este protocolo, la transcriptasa inversa que proporciona la actividad de ADN polimerasa también posee una actividad de ARNasa H endógena. Uno de los cebadores utilizados en este procedimiento contiene una secuencia promotora situada en el sentido de 5’ de una secuencia que es complementaria a una cadena de un ácido nucleico diana que se va a amplificar. En la primera etapa de la amplificación, un promotor-cebador se hibrida con el ARN diana del VNO en un sitio definido. La transcriptasa inversa crea una copia de ADN complementaria del ARN diana por extensión desde el extremo 3’ del promotor-cebador. Después de la interacción de un cebador de cadena opuesta con la cadena de ADN recién sintetizada, se sintetiza una segunda cadena de ADN desde el extremo del cebador mediante la transcriptasa inversa, creando de esta manera una molécula de ADN de doble cadena. La ARN polimerasa reconoce la secuencia promotora en esta plantilla de ADN de doble cadena e inicia la transcripción. Cada uno de los amplicones de ARN recién sintetizados vuelve a entrar en el proceso de TMA y sirve como plantilla para una nueva ronda de replicación, lo que conduce a una expansión exponencial del amplicón de ARN. Dado que cada una de las plantillas de ADN puede producir 100-1000 copias de amplicones de ARN, esta expansión puede dar como resultado la producción de 10 mil millones de amplicones en menos de una hora. Todo el proceso es autocatalítico y se realiza a temperatura constante.

Características estructurales de los cebadores

Tal como se ha indicado anteriormente, un “cebador” se refiere a un oligonucleótido modificado opcionalmente que es capaz de participar en una reacción de amplificación de ácido nucleico. Los cebadores preferentes son capaces de hibridarse con un ácido nucleico plantilla y tienen un extremo 3’ que puede extenderse mediante una actividad de ADN polimerasa. La región 5’ del cebador puede no ser complementaria del ácido nucleico diana. Si la región 5’ no complementaria incluye una secuencia promotora, se denomina “promotor-cebador”. Los expertos en la materia apreciarán que cualquier oligonucleótido que pueda funcionar como cebador (es decir, un oligonucleótido que se hibride específicamente con una secuencia diana y tenga un extremo 3’ capaz de extenderse mediante una actividad de ADN polimerasa) se puede modificar para incluir una secuencia promotora 5’ y, de este modo, podría funcionar como un promotor-cebador. De manera similar, cualquier promotor-cebador se puede modificar mediante la eliminación o síntesis sin una secuencia promotora y seguir funcionando como cebador.

Los restos de bases nucleotídicas de los cebadores se pueden modificar (por ejemplo, mediante la adición de grupos propino), siempre que el resto de las bases modificadas conserve la capacidad de formar una asociación no covalente con G, A, C, T o U, y siempre que un oligonucleótido que comprende, como mínimo, un resto de base nucleotídica modificado o un análogo no esté impedido estéricamente para hibridarse con un ácido nucleico monocatenario. Tal como se indica a continuación en relación con la composición química de sondas útiles, las bases nitrogenadas de los cebadores, según la presente invención, pueden ser bases convencionales (A, G, C, T, U), análogos conocidos de las mismas (por ejemplo, inosina o 'T' que tiene hipoxantina como su resto de base; véase The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., ed., 11th ed., 1992), derivados conocidos de bases púricas o pirimidínicas (por ejemplo, N4-metil desoxigaunosina, deaza-purinas o aza-purinas y deaza-pirimidinas o aza-pirimidinas, bases pirimidínicas que tienen grupos sustituyentes en la posición 5 o 6, bases púricas que tienen un sustituyente alterado o de sustitución en las posiciones 2, 6 u 8, 2-amino-6-metilaminopurina, O6-metilguanina, 4-tio-pirimidinas, 4-amino-pirimidinas, 4-dimetilhidrazina-pirimidinas y O4-alquilpirimidinas (véase Cook, Patente WO 93/13121) y residuos “abásicos” en los que la cadena principal no incluye una base nitrogenada para uno o más residuos del polímero (véase Arnold et al., Patente US5,585,481). Entre los restos de azúcar comunes que comprenden la cadena principal del cebador se incluyen ribosa y desoxirribosa, aunque también se pueden utilizar 2'-O-metil ribosa (OMe), azúcares halogenados y otros restos de azúcar modificados. Por lo general, el grupo de enlace de la cadena principal del cebador es un resto que contiene fósforo, más comúnmente un enlace fosfodiéster, aunque se encuentran otros enlaces, tales como, por ejemplo, fosforotioatos, metilfosfonatos y enlaces que no contienen fósforo, tales como enlaces de tipo péptido, encontrados en los “ácidos nucleicos peptídicos” (PNA, peptide nucleic acids) que también están destinados a su utilización en el ensayo dado a conocer en la presente memoria descriptiva.

Sistemas de marcado de sondas útiles y restos detectables

Esencialmente, cualquier sistema de marcado y detección que se pueda utilizar para registrar la hibridación de ácido nucleico específico se puede utilizar junto con la presente invención. Entre la colección de marcadores útiles se incluyen radiomarcadores, enzimas, haptenos, oligonucleótidos enlazados, moléculas quimioluminiscentes, restos fluorescentes (solos o en combinación con restos “desactivadores”) y restos activos redox que son susceptibles de procedimientos de detección electrónica. Entre las moléculas quimioluminiscentes preferentes se incluyen ésteres de acridinio del tipo dado a conocer por Arnold et al., en la Patente US5,283,174 para su utilización en conexión con un ensayo de protección homogénea, y del tipo dado a conocer por Woodhead et al., en la Patente US5,656,207 para utilización en conexión con ensayos que cuantifican múltiples dianas en una única reacción. Los enfoques preferentes de marcado electrónico y detección se dan a conocer en las Patentes US5,591,578 y 5,770,369, y la Patente WO 98/57158. Entre los restos activos redox útiles como marcadores en la presente invención se incluyen metales de transición, tales como Cd, Mg, Cu, Co, Pd, Zn, Fe y Ru.

Los marcadores detectables particularmente preferentes para las sondas, según la presente invención, son detectables en sistemas de ensayo homogéneos (es decir, en los que, en una mezcla, la sonda marcada unida exhibe un cambio detectable, tal como estabilidad o degradación diferencial, en comparación con la sonda marcada no unida). Aunque otros marcadores detectables de forma homogénea, tales como los marcadores fluorescentes y los marcadores detectables electrónicamente, están destinados a ser utilizados en la práctica de la presente invención, un marcador preferente para su utilización en ensayos homogéneos es un compuesto quimioluminiscente (por ejemplo, tal como el descrito por Woodhead et al., en la Patente US5,656,207; por Nelson et al., en la Patente US5,658,737; o por Arnold et al., en la Patente US5,639,604). Entre los marcadores quimioluminiscentes particularmente preferentes se incluyen compuestos de éster de acridinio (“AE”), tales como AE estándar o sus derivados, tales como naftil-AE, orto-AE, 1-metil-AE o 3-metil-AE, 2,7-dimetil-AE, 4,5-dimetil-AE, orto-dibromo-AE, orto-dimetil-AE, meta-dimetil-AE, orto-metoxi-AE, orto-metoxi(cinamil)-AE, orto-metil-AE, orto-fluoro-AE, 1-metil-orto-fluoro-AE o 3-metil-orto-fluoro-AE, 1-metil-meta-difluoro-AE o 3-metil-meta-difluoro-AE y 2-metil-AE.

En algunas aplicaciones, las sondas que presentan, como mínimo, cierto grado de autocomplementariedad son deseables para facilitar la detección de los dúplex sonda:diana en una muestra de prueba sin requerir en primer lugar la eliminación de la sonda sin hibridar antes de la detección. A modo de ejemplo, las estructuras denominadas “antorchas moleculares” están diseñadas para incluir distintas regiones de autocomplementariedad (denominadas “el dominio de unión a la diana” y “el dominio de cierre de la diana”) que están conectadas por una región de unión y que se hibridan entre sí en condiciones de ensayo de hibridación predeterminadas. Cuando se exponen a condiciones desnaturalizantes, las dos regiones complementarias (que pueden ser total o parcialmente complementarias) de la antorcha molecular se funden, dejando el dominio de unión a la diana disponible para la hibridación con una secuencia diana cuando se restablecen las condiciones predeterminadas del ensayo de hibridación. Las antorchas moleculares están diseñadas para que el dominio de unión a la diana favorezca la hibridación con la secuencia de la diana sobre el dominio de cierre de la diana. El dominio de unión a la diana y el dominio de cierre de la diana de una antorcha molecular incluyen marcadores que interactúan (por ejemplo, fluorescente/desactivador) situados de modo que se produzca una señal diferente cuando la antorcha molecular se autohibrida en lugar de cuando la antorcha molecular se hibrida con un ácido nucleico diana, lo que permite la detección de los dúplex sonda:diana en una muestra de prueba en presencia de una sonda no hibridada que tiene un marcador viable asociado con la misma. Las antorchas moleculares se describen en su totalidad en la Patente US6,361,945.

Otro ejemplo de una sonda de ensayo de hibridación autocomplementaria que se puede utilizar junto con la presente invención es una estructura comúnmente denominada “baliza molecular”. Las balizas moleculares comprenden moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia complementaria a la diana, un par de afinidad (o brazos de ácido nucleico) que mantienen la sonda en una conformación cerrada en ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana, y un par marcador que interactúa cuando la sonda está en una conformación cerrada. La hibridación del ácido nucleico diana y la secuencia complementaria a la diana separa los miembros del par de afinidad, cambiando de esta manera la sonda a una conformación abierta. El cambio a la conformación abierta es detectable debido a la interacción reducida del par de marcadores, que puede ser, por ejemplo, un fluoróforo y un desactivador (por ejemplo, DABCYL y EDANS). Las balizas moleculares se describen en su totalidad en la Patente US5,925,517. Pueden crearse balizas moleculares útiles para detectar secuencias de ácido nucleico específicas de VNO añadiendo a cualquier extremo de una de las secuencias de sonda dadas a conocer en la presente memoria descriptiva, un primer brazo de ácido nucleico que comprende un fluoróforo y un segundo brazo de ácido nucleico que comprende un resto desactivador. En esta configuración, la secuencia de sonda específica de VNO dada a conocer en la presente memoria descriptiva sirve como la porción de “bucle” complementaria a la diana de la baliza molecular resultante.

Las balizas moleculares, preferentemente, se marcan con un par interactivo de marcadores detectables. Los ejemplos de marcadores detectables que son preferentes como miembros de un par interactivo de marcadores interactúan entre sí mediante mecanismos de transferencia de energía FRET o no FRET. La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET, fluorescence resonance energy transfe/) implica la transmisión sin radiación de cuantos de energía desde el sitio de absorción al sitio de su utilización en la molécula, o sistema de moléculas, por interacción de resonancia entre cromóforos, a distancias considerablemente mayores que las distancias interatómicas, sin conversión a energía térmica, y sin que el donante y el aceptor entren en colisión cinética. El “donante” es el resto que absorbe inicialmente la energía y el “aceptor” es el resto al que se transfiere posteriormente la energía. Además de FRET, existen, como mínimo, otros tres procesos de transferencia de energía “no FRET” mediante los cuales la energía de excitación se puede transferir de un donante a una molécula aceptora.

Cuando dos marcadores se mantienen lo suficientemente cerca para que la energía emitida por un marcador pueda ser recibida o absorbida por el segundo marcador, ya sea mediante un mecanismo FRET o no FRET, se dice que los dos marcadores están en “relación de transferencia de energía” entre sí. Este es el caso, por ejemplo, cuando una baliza molecular se mantiene en estado cerrado mediante la formación de un dúplex de tallo, y la emisión fluorescente desde un fluoróforo unido a un brazo de la sonda se desactiva mediante un resto desactivador en el brazo opuesto.

Los restos marcadores muy preferentes para las balizas moleculares de la presente invención incluyen un fluoróforo y un segundo resto que tiene propiedades de extinción de la fluorescencia (es decir, un “desactivador”). En esta realización, la señal característica es probablemente la fluorescencia de una longitud de onda particular, pero alternativamente podría ser una señal de luz visible. Cuando está involucrada la fluorescencia, los cambios en la emisión se deben, preferentemente, a FRET, o a modos de transferencia de energía radiativa o no FRET. Cuando una baliza molecular que tiene un par de marcadores interactivos en estado cerrado se estimula por una frecuencia de luz apropiada, se genera una señal fluorescente en un primer nivel, que puede ser muy bajo. Cuando esta misma sonda está en estado abierto y se estimula por una frecuencia de luz apropiada, los restos fluoróforo y desactivador están lo suficientemente separados entre sí para que la transferencia de energía entre ellos quede sustancialmente excluida. En esa condición, el resto desactivador no puede desactivar la fluorescencia del resto fluoróforo. Si el fluoróforo se estimula por energía luminosa de una longitud de onda apropiada, se generará una señal fluorescente de un segundo nivel, superior al primer nivel. La diferencia entre los dos niveles de fluorescencia es detectable y medible. Utilizando restos fluoróforo y desactivador de esta manera, la baliza molecular solo está “encendida” en la conformación “abierta” e indica que la sonda está unida a la diana emanando una señal fácilmente detectable. El estado conformacional de la sonda altera la señal generada a partir de la sonda regulando la interacción entre los restos del marcador.

Entre los ejemplos de pares de marcadores de donante/aceptor que se pueden utilizar en relación con la presente invención, sin intentar distinguir los pares FRET de los no F^rE^t, se incluyen fluoresceína/tetrametilrrodamina, IAEDANS/fluororesceína, EDANS/D^aB^cYL, cumarina/DABCYL, fluoresceína/fluoresceína, BODIPY FL/BODIPY FL, fluoresceína/DABCYL, amarillo lucifer/DABCYL, BODIPY/DABCYL, eosina/DABCYL, eritrosina/DABCYL, tetrametilrrodamina/DABCYL, rojo Texas/DABCYL, CY5/BH1, CY3/BH1, CY3/BH2 y fluoresceína/colorante QSY7. Aquellos que tengan un nivel normal de experiencia en la técnica entenderán que, cuando los colorantes donantes y aceptores son diferentes, la transferencia de energía se puede detectar mediante la aparición de fluorescencia sensibilizada del aceptor o mediante la extinción de la fluorescencia del donante. Cuando las especies donante y aceptora son las mismas, la energía puede detectarse mediante la despolarización por fluorescencia resultante. Los aceptores no fluorescentes tales como DABCYL y los colorantes QSY 7 eliminan de manera ventajosa el problema potencial de la fluorescencia de fondo resultante de la excitación directa (es decir, no sensibilizada) del aceptor. Entre los restos de fluoróforo preferentes que se pueden utilizar como un miembro de un par donante-aceptor se incluyen fluoresceína, ROX y los colorantes CY (tales como CY5). Entre los restos desactivadores muy preferentes que se pueden utilizar como el otro miembro de un par donante-aceptor se incluyen DABCYL y los restos BLACK Ho LE Qu ENCHER que están disponibles en Biosearch Technologies, Inc., (Novato, California).

Las técnicas sintéticas y los procedimientos para enlazar marcadores a ácidos nucleicos y detectar marcadores son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989), capítulo 10; Nelson et al., Patente US5,658,737; Woodhead et al., Patente US5,656,207; Hogan et al., Patente US5,547,842; Arnold et al., Patente US5,283,174; Kourilsky et al., Patente US4,581,333), y Becker et al., Patente EP 0747706.

Composición química de las sondas.

Las sondas, según la presente invención, comprenden polinucleótidos o análogos de polinucleótidos y, opcionalmente, pueden portar un marcador detectable unido covalentemente a los mismos. Los nucleósidos o análogos de nucleósidos de la sonda comprenden bases heterocíclicas nitrogenadas, o análogos de bases, en los que los nucleósidos están unidos entre sí, por ejemplo, mediante enlaces fosfodiéster para formar un polinucleótido. Por consiguiente, una sonda puede comprender ácido ribonucleico (ARN) y/o ácido desoxirribonucleico (ADN) convencionales, pero también puede comprender análogos químicos de estas moléculas. La “cadena principal” de una sonda puede estar formada por una variedad de enlaces conocidos en la técnica, entre los que se incluyen uno o más enlaces azúcar-fosfodiéster, enlaces péptido-ácido nucleico (a veces denominados “ácidos nucleicos peptídicos” como se describen por Hyldig-Nielsen et al., Patente WO 95/32305), enlaces fosforotioato, enlaces metilfosfonato o combinaciones de los mismos. Los restos de azúcar de la sonda pueden ser ribosa o desoxirribosa, o compuestos similares que tienen sustituciones conocidas, tales como, por ejemplo, 2'-O-metil ribosa y sustituciones 2' de haluro (por ejemplo, 2'-F). Las bases nitrogenadas pueden ser bases convencionales (A, G, C, T, U), análogos conocidos de las mismas (por ejemplo, inosina o “T”; véase The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., Ed., 11a ed., 1992), derivados conocidos de bases púricas o pirimidínicas (por ejemplo, N4-metil desoxigaunosina, deaza-purinas o aza-purinas y deaza-pirimidinas o aza-pirimidinas, bases pirimidínicas que tienen grupos sustituyentes en la posición 5 o 6, bases púricas que tienen un sustituyente alterado o sustituido en las posiciones 2, 6 u 8, 2-amino-6-metilaminopurina, O6-metilguanina, 4-tio-pirimidinas, 4-amino-pirimidinas, 4-dimetilhidrazina-pirimidinas y O4-alquilo-pirimidinas (véase Cook, Patente WO 93/13121) y residuos “abásicos” en los que la cadena principal no incluye una base nitrogenada para uno o más residuos del polímero (véase Arnold et al., Patente US5,585,481). Una sonda puede comprender solo azúcares, bases y enlaces convencionales que se encuentran en el ARN y el ADN, o puede incluir tanto componentes como sustituciones convencionales (por ejemplo, bases convencionales unidas mediante una cadena principal metoxi o un ácido nucleico que incluye bases convencionales y uno o más análogos de bases).

Aunque se pueden utilizar sondas de oligonucleótidos de diferentes longitudes y composición de bases para detectar ácidos nucleicos de VNO, las sondas preferentes en la presente invención tienen longitudes de hasta 100 nucleótidos y, más preferentemente, tienen longitudes de hasta 60 nucleótidos. Los intervalos de longitud preferentes para los oligonucleótidos de la presente invención son de 10 a 100 bases de longitud o, más preferentemente, de 15 a 50 bases de longitud, o aún más preferentemente de 15 a 30 bases de longitud. Sin embargo, las secuencias de sonda específicas descritas a continuación también pueden proporcionarse en un vector o transcrito de clonación de ácido nucleico u otro ácido nucleico más largo y aún se pueden utilizar para detectar ácidos nucleicos de VNO.

Selección de cebadores de amplificación y sondas de detección específicas para el VNO

En la presente memoria descriptiva se describen pautas útiles para diseñar cebadores de amplificación y sondas con las características deseadas. Los sitios óptimos para amplificar y sondar ácidos nucleicos de VNO contienen dos, y preferentemente tres, regiones conservadas cada una de más de, aproximadamente, 15 bases de longitud, dentro de, aproximadamente, 200 bases de secuencia contigua. El grado de amplificación observado con un conjunto de cebadores o promotores-cebadores depende de varios factores, incluida la capacidad de los oligonucleótidos para hibridarse con sus secuencias complementarias y su capacidad para extenderse enzimáticamente. Debido a que el alcance y la especificidad de las reacciones de hibridación se ven afectados por una serie de factores, la manipulación de esos factores determinará la sensibilidad y especificidad exactas de un oligonucleótido particular, ya sea perfectamente complementario a su diana o no. Los expertos en la materia conocen los efectos de las diferentes condiciones de ensayo, y están descritos por Hogan et al., en la Patente US5,840,488.

La longitud de la secuencia de ácido nucleico diana y, por consiguiente, la longitud de la secuencia de cebador o la secuencia de sonda pueden ser importantes. En algunos casos, puede haber diversas secuencias de una región diana particular, que varían en ubicación y longitud, que producirán cebadores o sondas que tienen las características de hibridación deseadas. Si bien es posible que los ácidos nucleicos que no son perfectamente complementarios se hibriden, normalmente, el tramo más largo de la secuencia de bases perfectamente homóloga determinará principalmente la estabilidad del híbrido.

Los cebadores de amplificación y las sondas se deben situar para minimizar la estabilidad del híbrido oligonucleótido:ácido nucleico no diana (es decir, ácido nucleico con secuencia similar al ácido nucleico diana). Es preferente que los cebadores de amplificación y las sondas de detección sean capaces de distinguir entre las secuencias diana y no diana. Al diseñar cebadores y sondas, las diferencias en estos valores de Tm deben ser tan grandes como sea posible (por ejemplo, como mínimo, 2 °C y, preferentemente, 5 °C).

El grado de extensión no específica (cebador-dímero o copia no diana) también puede afectar a la eficacia de la amplificación. Por esta razón, los cebadores se seleccionan para que tengan baja autocomplementariedad o complementariedad cruzada, particularmente en los extremos 3’ de la secuencia. Se evitan los fragmentos largos de homopolímeros y el alto contenido de GC para reducir la extensión espuria del cebador. El software informático disponible en el mercado puede ayudar en este aspecto del diseño. Entre los programas informáticos disponibles se incluyen MacDNASISm 2.0 (Hitachi Software Engineering American Ltd.) y OLIGO ver. 6.6 (Molecular Biology Insights; Cascade, Colorado).

Aquellos que tengan un nivel normal de experiencia en la técnica apreciarán que la hibridación implica la asociación de dos cadenas simples de ácido nucleico complementario para formar una cadena doble unida por enlaces de hidrógeno. Está implícito que, si una de las dos cadenas está total o parcialmente involucrada en un híbrido, entonces esa cadena será menos capaz de participar en la formación de un nuevo híbrido. Diseñando cebadores y sondas de modo que porciones sustanciales de las secuencias de interés sean monocatenarias, la velocidad y el grado de hibridación pueden aumentarse en gran medida. Si la diana es una secuencia genómica integrada, entonces se dará de forma natural en una forma bicatenaria (como es el caso del producto de la reacción en cadena de la polimerasa). Estas dianas de doble cadena inhiben naturalmente la hibridación con una sonda y requieren la desnaturalización antes de la etapa de hibridación.

La velocidad a la que un polinucleótido se hibrida con su diana es una medida de la estabilidad térmica de la estructura secundaria de la diana en la región de unión de la diana. La medida estándar de la velocidad de hibridación es el C0Í1/2 que se mide como moles de nucleótido por litro multiplicado por segundos. De este modo, es la concentración de sonda multiplicada por el tiempo en el que se produce el 50 % de la hibridación máxima a esa concentración. Este valor se determina hibridando diversas cantidades de polinucleótido con una cantidad constante de diana durante un tiempo fijo. El ^ 1/2 se encuentra gráficamente mediante procedimientos estándar familiares para aquellos que tienen un nivel normal de experiencia en la técnica.

Cebadores de amplificación preferentes

Los cebadores útiles para llevar a cabo reacciones de amplificación pueden tener diferentes longitudes para adaptarse a la presencia de secuencias extrañas que no participan en la unión a la diana y que pueden no afectar sustancialmente a los procedimientos de amplificación o detección. Por ejemplo, los promotores-cebadores útiles para realizar reacciones de amplificación, según la presente invención, tienen, como mínimo, una secuencia mínima que se hibrida con el ácido nucleico diana de VNO, y una secuencia promotora situada en el sentido de 5’ de esa secuencia mínima. Sin embargo, la inserción de secuencias entre la secuencia de unión a la diana y la secuencia promotora podría cambiar la longitud del cebador sin comprometer su utilidad en la reacción de amplificación. Además, las longitudes de los cebadores de amplificación y las sondas de detección son cuestiones de elección, siempre que las secuencias de estos oligonucleótidos se ajusten a los requisitos mínimos esenciales para hibridar la secuencia complementaria deseada.

Las tablas 1 y 2 presentan ejemplos específicos de secuencias de oligonucleótidos que se utilizaron como cebadores para amplificar ácidos nucleicos de VNO en la región no codificante 5'. La tabla 1 presenta las secuencias de cebadores que eran complementarias a las secuencias de VNO en una cadena de ácido nucleico. Todos los cebadores ilustrativos presentados en la tabla 1 tienen secuencias complementarias a la diana contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 1. Diferentes subconjuntos de cebadores preferentes tienen secuencias complementarias a la diana contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3. Es preferente que uno de los cebadores utilizados en el procedimiento de amplificación tenga una secuencia complementaria a la diana que se encuentre dentro de uno de estos dominios. La tabla 2 presenta las secuencias de los cebadores complementarios a la diana del VNO y las secuencias completas de los promotores-cebadores que se utilizaron durante el desarrollo de la presente invención. Todos los cebadores ilustrativos presentados en la tabla 2 tienen secuencias complementarias a la diana contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 16, una característica que es preferente actualmente para uno de los cebadores utilizados en el procedimiento de amplificación. En particular, las secuencias de oligonucleótidos de la tabla 1 y la tabla 2 son complementarias a cadenas opuestas del ácido nucleico de VNO.

Los cebadores útiles para amplificar la región no codificante 5’ del VNO pueden incluir análogos de nucleótidos. Por ejemplo, los cebadores de la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5 difieren entre sí por la sustitución por un análogo de base de hipoxantina de una base de adenina en la posición 11. De forma similar, los cebadores de la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7 también difieren por la presencia de este análogo de base, al igual que los cebadores de cadena opuesta identificados por la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22. Esto ilustra cómo las nucleobases en los cebadores pueden sustituirse por bases modificadas o análogos de nucleobase.

Tabla 1

La tabla 2 presenta las secuencias de oligonucleótidos complementarios a la diana del VNO y las correspondientes secuencias de promotor-cebador que se utilizaron para amplificar las secuencias de ácido nucleico de VNO en la región no codificante 5’ del genoma viral. Tal como se ha indicado anteriormente, todos los promotores-cebadores incluían secuencias complementarias a una secuencia diana de VNO en sus extremos 3’ y una secuencia del promotor T7 en sus extremos 5'. Los cebadores identificados por las SEQ ID NO: 29-40 en la tabla 2 son promotores-cebadores correspondientes a los cebadores complementarios de VNO identificados como las SEQ ID NO: 17-28, respectivamente.

Tabla 2

Los conjuntos preferentes de cebadores para amplificar secuencias de VNO en la región no codificante 5’ incluyen un primer cebador que se hibrida con una secuencia diana de VNO (tal como uno de los cebadores enumerados en la tabla 2) y un segundo cebador que es complementario a la secuencia de un producto de extensión del primer cebador (tal como una de las secuencias del cebador enumeradas en la tabla 1). En una realización muy preferente, el primer cebador es un promotor-cebador que incluye una secuencia del promotor T7 en su extremo 5’.

Las tablas 3 y 4 presentan ejemplos específicos de secuencias de oligonucleótidos que se utilizaron como cebadores para amplificar ácidos nucleicos de VNO en la región 3000 del genoma viral. La tabla 3 presenta las secuencias de cebadores que eran complementarias a las secuencias de VNO en una cadena de ácido nucleico. Todos los cebadores ilustrativos presentados en la tabla 3 tienen secuencias complementarias a la diana contenidas dentro de la secuencia de la ^sE^qID NO: 41, una característica que es preferente actualmente para uno de los cebadores utilizados en el procedimiento de amplificación. La tabla 4 presenta las secuencias de los cebadores complementarios a la diana del VNO y las secuencias completas de los cebadores-promotores que se utilizaron durante el desarrollo de la presente invención. Todos los cebadores ilustrativos presentados en la tabla 4 tienen secuencias complementarias a la diana contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 52, una característica que es preferente actualmente para uno de los cebadores utilizados en el procedimiento de amplificación. En particular, las secuencias de oligonucleótidos de la tabla 3 y la tabla 4 son complementarias a cadenas opuestas del ácido nucleico de VNO.

Los cebadores útiles para amplificar la región 3000 de VNO pueden incluir análogos de nucleótidos. Por ejemplo, los cebadores de la SeQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 47 y la SEQ ID NO: 48 difieren entre sí por la sustitución por un análogo de base de hipoxantina de la base existente en diferentes posiciones individuales dentro de la secuencia del cebador. De forma similar, los cebadores de la SEQ ID NO: 43 y la SEQ ID NO: 49 también difieren por la presencia de este análogo de base, al igual que los cebadores identificados por la SEQ ID NO: 45 y la SEQ ID NO: 50 y la SEQ ID NO: 51. Esto ilustra que las nucleobases en los cebadores pueden estar sustituidas por bases modificadas o análogos de nucleobase.

Tabla 3

La tabla 4 presenta las secuencias de oligonucleótidos complementarios a la diana del VNO y las correspondientes secuencias de promotor-cebador que se utilizaron para amplificar secuencias de ácido nucleico de VNO en la región 3000 del genoma viral. Tal como se indicó anteriormente, todos los promotores-cebadores incluían secuencias complementarias a una secuencia diana de VNO en sus extremos 3’ y una secuencia del promotor T7 en sus extremos 5'.

Tabla 4

Los conjuntos preferentes de cebadores para amplificar secuencias de VNO en la región 3000 del genoma viral incluyen un primer cebador que se hibrida con una secuencia diana de VNO (tal como uno de los cebadores enumerados en la tabla 4) y un segundo cebador que es complementario a la secuencia de un producto de extensión del primer cebador (tal como una de las secuencias del cebador enumeradas en la tabla 3). En una realización muy preferente, el primer cebador es un promotor-cebador que incluye una secuencia del promotor T7 en su extremo 5’.

Las tablas 5 y 6 presentan ejemplos específicos de secuencias de oligonucleótidos que se utilizaron como cebadores para amplificar ácidos nucleicos de VNO en la región no codificante 3’ del genoma viral. La tabla 5 presenta las secuencias de cebadores que eran complementarias a las secuencias de VNO en una cadena de ácido nucleico. Todos los cebadores ilustrativos presentados en la tabla 5 tienen secuencias complementarias a la diana contenidas dentro de la secuencia de la ^sE^qID NO: 59, una característica que es preferente actualmente para uno de los cebadores utilizados en el procedimiento de amplificación. La tabla 6 presenta las secuencias de los cebadores complementarios a la diana del VNO y las secuencias completas de los cebadores-promotores que se utilizaron durante el desarrollo de la presente invención. Todos los cebadores ilustrativos presentados en la tabla 6 tienen secuencias complementarias a la diana contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 72. Diferentes subconjuntos de cebadores preferentes tienen secuencias complementarias a la diana contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 73 o la SEQ ID NO: 74. Es preferente que uno de los cebadores utilizados en el procedimiento de amplificación tenga una secuencia complementaria a la diana que se encuentre dentro de uno de estos dominios. En particular, las secuencias de oligonucleótidos de la tabla 5 y la tabla 6 son complementarias a cadenas opuestas del ácido nucleico de VNO.

Los cebadores útiles para amplificar la región no codificante 3’ del VNO pueden incluir análogos de nucleótidos. Por ejemplo, los cebadores de la SEQ ID NO: 60 y la SEQ ID NO: 61 difieren entre sí por la sustitución por un análogo de base de hipoxantina de una base de timina en la posición 1. De forma similar, los cebadores de la SEQ ID NO: 64 y la SEQ ID NO: 65 también se difieren por la presencia de este análogo de base, en este caso sustituyendo a la citosina. Asimismo, las secuencias de cebadores complementarias de VNO de la SEQ ID NO: 83 y la s Eq ID NO: 82, junto con las correspondientes secuencias de promotor-cebador, también contienen sustituciones de análogos de bases de hipoxantina. Esto ilustra, además, que las nucleobases en los cebadores pueden estar sustituidas por bases modificadas o análogos de nucleobase.

Tabla 5

La tabla 6 presenta las secuencias de oligonucleótidos complementarios a la diana del VNO y las correspondientes secuencias de promotor-cebador que se utilizaron para amplificar secuencias de ácido nucleico de VNO en la región no codificante 3’ del genoma viral. Tal como se ha indicado anteriormente, todos los promotores-cebadores incluían secuencias complementarias a una secuencia diana de VNO en sus extremos 3’ y una secuencia del promotor T7 en sus extremos 5'.

Tabla 6

Los conjuntos preferentes de cebadores para amplificar secuencias de VNO en la región no codificante 3’ incluyen un primer cebador que se hibrida con una secuencia diana de VNO (tal como uno de los cebadores enumerados en la tabla 6) y un segundo cebador que es complementario a la secuencia de un producto de extensión del primer cebador (tal como una de las secuencias del cebador enumeradas en la tabla 5). En una realización muy preferente, el primer cebador es un cebador-promotor que incluye una secuencia del promotor T7 en su extremo 5’. Los cebadores identificados por las SEQ ID NO: 84-92 en la tabla 6 son promotores-cebadores correspondientes a los cebadores complementarios de VNO identificados como las SEQ ID NO: 75-83, respectivamente.

Sondas de detección preferentes

Otro aspecto de la presente invención se refiere a oligonucleótidos que se pueden utilizar como sondas de hibridación para detectar ácidos nucleicos de VNO. Los procedimientos para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana presente en el ácido nucleico de VNO pueden incluir una etapa adicional opcional para detectar amplicones. Este procedimiento para detectar ácidos nucleicos de VNO incluye una etapa para poner en contacto una muestra de prueba con una sonda de ensayo de hibridación que se hibrida preferentemente con la secuencia de ácido nucleico diana, o el complemento de la misma, en condiciones de hibridación rigurosas, formando de esta manera un dúplex sonda: diana que es estable para la detección. A continuación, hay una etapa para determinar si el híbrido está presente en la muestra de prueba como una indicación de la presencia o ausencia de ácidos nucleicos de VNO en la muestra de prueba. Esto puede implicar la detección del dúplex sonda:diana y, preferentemente, implicar sistemas de ensayo homogéneos.

Las sondas de ensayo de hibridación útiles para detectar secuencias de ácido nucleico de VNO incluyen una secuencia de bases sustancialmente complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana de VNO. De este modo, las sondas de la presente invención se hibridan una cadena de una secuencia de ácido nucleico diana de VNO, o el complemento de la misma. Estas sondas pueden tener, opcionalmente, bases adicionales fuera de la región de ácido nucleico diana que pueden ser o no complementarias con el ácido nucleico de VNO.

Las sondas preferentes son suficientemente homólogas al ácido nucleico diana para hibridarse en condiciones de hibridación rigurosas correspondientes a, aproximadamente, 60 °C cuando la concentración de sal está en el intervalo de 0,6-0,9 M. Entre las sales preferentes se incluyen cloruro de litio, pero se pueden utilizar también otras sales, tales como cloruro de sodio y citrato de sodio en la solución de hibridación. Las condiciones de hibridación de ejemplo de alta rigurosidad se proporcionan alternativamente mediante tampón de fosfato de sodio 0,48 M, dodecilsulfato de sodio al 0,1 % y ^eD^tA y EGTA cada uno a 1 mM, o mediante LiCl 0,6 M, laurilsulfato de litio al 1 %, succinato de litio 60 mM y ^eD^tA y ^eG^tA cada uno a 10 mM.

Las sondas, según la presente invención, tienen secuencias complementarias o correspondientes a uno de tres dominios diferentes del genoma del VNO. Tal como se reitera a continuación, estos dominios fueron: (1) la región no codificante/región de la cápside 5’, (2) la región 3000 y (3) la región no codificante 3’. Ciertas sondas que son preferentes para detectar secuencias de ácido nucleico de VNO tienen una secuencia de sonda, que incluye la secuencia de bases complementaria a la diana junto con cualquier secuencia de bases que no sea complementaria al ácido nucleico que se va a detectar, en el intervalo de longitud de 10-100 nucleótidos. Ciertas sondas específicas que son preferentes para detectar secuencias de ácido nucleico de VNO tienen secuencias complementarias a la diana en el intervalo de longitud de 12-87, 10-20, 13-37 o 17-23 nucleótidos. Por supuesto, estas secuencias complementarias a la diana pueden ser secuencias lineales o pueden estar contenidas en la estructura de una baliza molecular u otra construcción que tenga una o más secuencias de ácido nucleico opcionales que no sean complementarias a la secuencia diana del VNO que se va a detectar. Tal como se ha indicado anteriormente, las sondas pueden estar producidas de ADN, ARN, una combinación de ADN y ARN, un análogo de ácido nucleico o contener uno o más nucleósidos modificados (por ejemplo, un ribonucleósido que tiene una sustitución de 2'-O-metilo por el resto ribofuranosilo).

En pocas palabras, entre las sondas preferentes para detectar ácidos nucleicos diana de interés en relación con la presente invención se incluyen secuencias que están contenidas dentro de uno o más de los varios dominios de sonda definidos o los complementos de los mismos, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos, hasta un 10 % de bases mal emparejadas, e incluso hasta un 20 % de bases mal emparejadas. Por ejemplo, entre las sondas de ensayo de hibridación preferentes para detectar ácidos nucleicos flavivirales, tales como los ácidos nucleicos de VNO, en la región no codificante 5’ se pueden incluir secuencias complementarias a la diana de bases contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 93, o dentro de uno de los subdominios definidos por la SEQ ID NO: 94 o la SEQ ID NO: 95. Entre las sondas de ensayo de hibridación preferentes para detectar ácidos nucleicos flavivirales, tales como los ácidos nucleicos de VNO, en la región 3000 se incluyen secuencias de bases complementarias a la diana contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 99. Entre las sondas de ensayo de hibridación preferentes útiles para detectar ácidos nucleicos flavivirales, tales como los ácidos nucleicos de VNO, en la región no codificante 3’ se incluyen secuencias complementarias a la diana de bases contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 101, o dentro de los subdominios definidos por la SEQ ID NO: 102 o la SEQ ID NO: 103. Las secuencias opcionales que no son complementarias a la secuencia de ácido nucleico que se va a detectar pueden unirse a la secuencia complementaria a la diana de la sonda.

Haciendo referencia en particular a la posibilidad de diferencias de bases que pueden distinguir secuencias de sonda útiles de una región diana definida que contenga la secuencia de bases complementaria de esa sonda complementaria a la diana, debe tenerse en cuenta que la posición de base 12 de la sonda que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 114 (ocupada por una T) difiere de la posición correspondiente en las secuencias de dominio definidas por la SEQ ID NO: 101, la SEQ iD NO: 102 y la SEQ ID NO: 103 (todas las cuales tienen una C en la posición correspondiente).

Ciertas sondas preferentes, según la presente invención, incluyen un marcador detectable en una realización, este marcador es un éster de acridinio unido a la sonda por medio de un enlazador no nucleotídico. Por ejemplo, las sondas de detección se pueden marcar con compuestos de éster de acridinio quimioluminiscentes que se unen a través de un enlazador sustancialmente tal como se describe en la Patente US5,585,481 y en la Patente US5,639,604, particularmente, tal como se describe en la columna 10, línea 6 a la columna 11, línea 3, y en el ejemplo 8.

La tabla 7 presenta las secuencias de bases de algunas de las sondas de hibridación que se utilizaron para detectar amplicones de VNO de cada una de las tres regiones diana de VNO. Dado que las sondas alternativas para detectar secuencias de ácido nucleico de VNO se pueden hibridar con la cadena de sentido opuesto de VNO, la presente invención también incluye oligonucleótidos que son complementarios a las secuencias presentadas en la tabla.

Tabla 7

Secuencias de polinucleótidos de sondas de detección del VNO

Tal como se ha indicado anteriormente, se puede utilizar cualquier número de estructuras de cadena principal diferentes como un armazón para las secuencias de nucleobase de las sondas de hibridación de la presente invención. En ciertas realizaciones muy preferentes, la secuencia de sonda utilizada para detectar amplicones de VNO incluye una cadena principal de metoxi o, como mínimo, un enlace metoxi en la cadena principal de ácido nucleico.

Selección y utilización de oligonucleótidos de captura

Los oligonucleótidos de captura preferentes incluyen una primera secuencia que es complementaria a una secuencia de VNO (es decir, una “secuencia diana de VNO”) unida covalentemente a una segunda secuencia (es decir, una secuencia de “cola”) que sirve como diana para la inmovilización sobre un soporte sólido. Se puede utilizar cualquier cadena principal para unir la secuencia de bases de un oligonucleótido de captura. En determinadas realizaciones preferentes, el oligonucleótido de captura incluye, como mínimo, un enlace metoxi en la cadena principal. La secuencia de cola, que está, preferentemente, en el extremo 3’ de un oligonucleótido de captura, se utiliza para hibridarse con una secuencia de bases complementaria para proporcionar un medio para capturar el ácido nucleico de VNO diana hibridado, con preferencia frente a otros componentes en la muestra biológica.

Aunque se puede utilizar en la secuencia de cola cualquier secuencia de bases que se hibride con una secuencia de bases complementaria, es preferente que la secuencia de hibridación abarque una longitud de, aproximadamente, 5-50 residuos de nucleótidos. Las secuencias de cola particularmente preferentes son sustancialmente homopoliméricas, conteniendo de, aproximadamente, 10 a, aproximadamente, 40 residuos de nucleótidos, o más preferentemente de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 30 residuos. Un oligonucleótido de captura, según la presente invención, puede incluir una primera secuencia que se une específicamente a un polinucleótido diana del VNO y una segunda secuencia que se une específicamente a un tramo de oligo(dT) inmovilizado en un soporte sólido.

Utilizando los componentes ilustrados en la figura 1, un ensayo para detectar secuencias de VNO en una muestra biológica incluye las etapas de capturar el ácido nucleico diana utilizando el oligonucleótido de captura, amplificar la región diana capturada utilizando, como mínimo, dos cebadores y detectar el ácido nucleico amplificado, en primer lugar, hibridando la sonda marcada con una secuencia contenida en el ácido nucleico amplificado y, a continuación, detectando una señal resultante a partir de la sonda marcada unida.

La etapa de captura utiliza, preferentemente, un oligonucleótido de captura en el que, en condiciones de hibridación, una porción del oligonucleótido de captura se hibrida específicamente con una secuencia en el ácido nucleico diana y una porción de cola sirve como un componente de un par de unión, tal como un ligando (por ejemplo, un par de unión biotina-avidina) que permite que la región diana se separe de otros componentes de la muestra. Preferentemente, la porción de cola del oligonucleótido de captura es una secuencia que se hibrida con una secuencia complementaria inmovilizada en una partícula de soporte sólida. Preferentemente, en primer lugar, el oligonucleótido de captura y el ácido nucleico diana están en solución para aprovechar la cinética de hibridación en fase de solución. La hibridación produce un complejo de oligonucleótido de captura:ácido nucleico diana que puede unirse a una sonda inmovilizada mediante la hibridación de la porción de cola del oligonucleótido de captura con una secuencia inmovilizada complementaria. De este modo, se forma un complejo que comprende un ácido nucleico diana, un oligonucleótido de captura y una sonda inmovilizada en condiciones de hibridación. Preferentemente, la sonda inmovilizada es una secuencia repetitiva y, más preferentemente, una secuencia homopolimérica (por ejemplo, poli-A; poli-T, poli-C o poli-G), que es complementaria a la secuencia de cola y está unida a un soporte sólido. Por ejemplo, si la porción de cola del oligonucleótido de captura contiene una secuencia poli-A, entonces la sonda inmovilizada contendría una secuencia poli-T, aunque se puede utilizar cualquier combinación de secuencias complementarias. El oligonucleótido de captura también puede contener residuos “espaciadores”, que son una o más bases ubicadas entre la secuencia de bases que se hibrida con la diana y la secuencia de bases de la cola que se hibrida con la sonda inmovilizada. Se puede utilizar cualquier soporte sólido para unir el complejo de ácido nucleico diana: oligonucleotídico de captura. Los soportes útiles pueden ser matrices o partículas libres en solución (por ejemplo, nitrocelulosa, nailon, vidrio, poliacrilato, polímeros mixtos, poliestireno, silano polipropileno y, preferentemente, partículas magnéticamente atraíbles). Los procedimientos para unir una sonda inmovilizada al soporte sólido son bien conocidos. El soporte es, preferentemente, una partícula que se puede recuperar de la solución utilizando procedimientos estándar (por ejemplo, centrifugación, atracción magnética de partículas magnéticas y similares). Los soportes preferentes son partículas paramagnéticas monodispersas (es decir, de tamaño uniforme ±, aproximadamente, el 5 %).

La recuperación del complejo de ácido nucleico diana:oligonucleótido de captura:sonda inmovilizada concentra eficazmente el ácido nucleico diana (en relación con su concentración en la muestra biológica) y purifica el ácido nucleico diana de los inhibidores de amplificación que pueden estar presentes en la muestra biológica. El ácido nucleico diana capturado puede lavarse una o más veces, purificando adicionalmente la diana, por ejemplo, resuspendiendo las partículas con el complejo de ácido nucleico diana unido:oligonucleótido de captura:sonda inmovilizada en una solución de lavado y, a continuación, recuperando las partículas con el complejo de la solución de lavado tal como se ha descrito anteriormente. En una realización preferente, la etapa de captura se lleva a cabo hibridando secuencialmente el oligonucleótido de captura con el ácido nucleico diana y a continuación, ajustando las condiciones de hibridación para permitir la hibridación de la porción de cola del oligonucleótido de captura con una secuencia complementaria inmovilizada (por ejemplo, tal como se describe en la Patente WO 98/50583). Una vez completada la etapa de captura y cualquier etapa de lavado opcional, se puede amplificar el ácido nucleico diana. Para limitar el número de etapas de manipulación, opcionalmente, el ácido nucleico diana se puede amplificar sin liberarlo del oligonucleótido de captura.

Los oligonucleótidos de captura útiles pueden contener emparejamientos erróneos con las secuencias indicadas anteriormente, siempre que las secuencias mal emparejadas se hibriden con el ácido nucleico de VNO que contiene la secuencia que se va a amplificar. Cada oligonucleótido de captura descrito en la presente memoria descriptiva incluía una de las secuencias complementarias de VNO presentadas en la tabla 8 unida a una cola de poli-(dA) en su extremo 3’. Todos los oligonucleótidos de captura también incluían tres nucleótidos de timidina opcionales interpuestos entre la secuencia complementaria de VNO y la cola de poli-(dA). No se cree que la presencia de estos nucleótidos de timidina sea esencial para el éxito del procedimiento de captura. Los tres nucleótidos de timidina y la cola de poli-(dA) se sintetizaron utilizando precursores de ADN, mientras que las porciones complementarias de VNO de los oligonucleótidos se sintetizaron utilizando análogos de nucleótidos 2'-OMe.

Tabla 8

Procedimientos preferentes para amplificar y detectar secuencias de polinucleótidos de VNO

Los procedimientos preferentes de la presente invención se describen e ilustran mediante los ejemplos que se presentan a continuación. La figura 1 ilustra esquemáticamente un sistema que se puede utilizar para detectar una región diana del genoma del VNO (mostrado por una línea horizontal continua y gruesa). Este sistema incluye cuatro oligonucleótidos (mostrados por las líneas continuas más cortas): un oligonucleótido de captura que incluye una secuencia que se hibrida específicamente con una secuencia de VNO en la región diana y una cola (“T”) que se hibrida con una secuencia complementaria inmovilizada sobre un soporte sólido para capturar la región diana presente en una muestra biológica; un promotor T7-cebador que incluye una secuencia que se hibrida específicamente con una secuencia de VNO en la región diana y una secuencia de promotor T7 (“P”) que, cuando es de doble cadena, sirve como promotor funcional para la A^rN polimerasa T7; un cebador que no es de T7 que incluye una secuencia que se hibrida específicamente con un ADNc de primera cadena elaborado a partir de la secuencia de la región diana utilizando el promotor T7-cebador; y una sonda marcada que incluye una secuencia que se hibrida específicamente con una porción de la región diana que se amplifica utilizando los dos cebadores. Tal como se ha indicado anteriormente, la amplificación de la región diana capturada utilizando los dos cebadores puede conseguirse mediante cualquiera de una variedad de reacciones de amplificación de ácido nucleico conocidas que serán familiares para aquellos que tengan un nivel normal de experiencia en la técnica. En una realización preferente, se utiliza una reacción de amplificación asociada a la transcripción, tal como TMA. En esta realización, se producen muchas cadenas de ácido nucleico a partir de una única copia del ácido nucleico diana, lo que permite de este modo la detección de la diana mediante la detección de sondas que están unidas a las secuencias amplificadas. Preferentemente, la amplificación asociada a la transcripción utiliza dos tipos de cebadores (uno que se denomina promotor-cebador porque contiene una secuencia promotora, marcada como “P” en la figura 1, para una ARN polimerasa) dos enzimas (una transcriptasa inversa y una ARN polimerasa) y sustratos (desoxirribonucleósidos trifosfato, ribonucleósidos trifosfato) con sales y tampones apropiados en solución para producir múltiples transcritos de ARN a partir de una plantilla de ácido nucleico.

Con referencia a la figura 1, durante la amplificación mediada por transcripción, el ácido nucleico diana capturado se hibrida con un primer cebador que se muestra como un promotor T7-cebador. Utilizando la transcriptasa inversa, se sintetiza una cadena de ADN complementaria a partir del promotor T7-cebador utilizando el ADN diana como plantilla. Un segundo cebador, que se muestra como un cebador no T7, se hibrida con la cadena de ADN recién sintetizada y se extiende mediante la acción de una transcriptasa inversa para formar un dúplex de ADN, formando de esta manera una región del promotor T7 de doble cadena. A continuación, la ARN polimerasa T7 genera múltiples transcritos de ARN utilizando este promotor T7 funcional. El mecanismo autocatalítico de TMA utiliza etapas repetitivas de hibridación y polimerización después de una etapa de síntesis de ADNc utilizando los transcritos de ARN como plantillas para producir transcritos adicionales, amplificando de esta manera las secuencias de ácido nucleico específicas de la región diana.

La etapa de detección utiliza, como mínimo, una sonda de detección que se enlaza específicamente a los transcritos o amplicones de ARN amplificado descritos anteriormente. Preferentemente, la sonda de detección está marcada con un marcador que se puede detectar utilizando un sistema de detección homogéneo. Por ejemplo, la sonda marcada se puede marcar con un compuesto de éster de acridinio a partir del cual se puede producir y detectar una señal quimioluminiscente, tal como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, la sonda marcada puede comprender un resto fluoróforo o restos fluoróforo y desactivador. Una baliza molecular es una realización de dicha sonda marcada que se puede utilizar en un sistema de detección homogéneo.

Kits para detectar ácidos nucleicos de VNO

La presente invención también incluye kits para realizar reacciones de amplificación de polinucleótidos utilizando plantillas de ácidos nucleicos virales. Ciertos kits preferentes contendrán una sonda de ensayo de hibridación que incluye una secuencia de bases complementaria a la diana y que, opcionalmente, incluye cebadores u otros oligonucleótidos auxiliares para amplificar la diana que se va a detectar. Otros kits preferentes contendrán un par de cebadores oligonucleotídicos que se pueden utilizar para amplificar ácidos nucleicos diana en una reacción de amplificación in vitro. Los kits de ejemplo incluyen un primer y un segundo oligonucleótidos de amplificación que son complementarios a cadenas opuestas de una secuencia de ácido nucleico de VNO que se va a amplificar. Los kits pueden contener, además, una o más sondas de detección de oligonucleótidos. Otros kits adicionales, según la presente invención, pueden incluir adicionalmente oligonucleótidos de captura para purificar ácidos nucleicos plantilla de VNO de otras especies antes de la amplificación.

Los principios generales de la presente invención pueden apreciarse más completamente con referencia a los siguientes ejemplos, que no constituyen limitación.

El ejemplo 1 describe procedimientos que identificaron algunas de las sondas de hibridación que posteriormente se utilizaron en ensayos para detectar ácidos nucleicos de VNO. Más particularmente, los siguientes procedimientos identificaron sondas que eran capaces de hibridarse con ácidos nucleicos correspondientes a uno de tres dominios de VNO diferentes. Estos dominios fueron: (1) la región no codificante/región de la cápside 5’ (NC/C 5'), (2) la región 3000 (región NS 1/NS2a) y (3) la región no codificante 3’ (NC 3’). Seis oligonucleótidos sintéticos sirvieron como dianas para unir las sondas.

Ejemplo 1

Sondas de olionucleótidos para detectar el VNO

Se prepararon oligonucleótidos diana sintéticos del VNO que tenían las secuencias presentadas en la tabla 9, según procedimientos de laboratorio estándar utilizando análogos de nucleótidos 2'-OMe para imitar una estructura de ARN. Las sondas para hibridar estas dianas sintéticas de VNO tenían las secuencias dadas en la tabla 7 y también se prepararon utilizando análogos de nucleótidos 2'-OMe.

Tabla 9

Secuencias diana sintéticas

Las reacciones de hibridación incluyeron, aproximadamente, 1 x 106 ULR de sonda marcada con AE que tenía una actividad específica de, aproximadamente, 2 x 10'ULR/pmol y, aproximadamente, 0,5 pmoles de oligonucleótido diana sintético del VNO. Las reacciones de control negativo omitieron el oligonucleótido diana del VNO. Las sondas enumeradas en la tabla 7 se marcaron, cada una, con un resto AE unido a la estructura oligonucleotídica mediante un enlazador no nucleotídico dispuesto internamente según procedimientos descritos en las Patentes US5,585,481 y US5,639,604, incorporadas como referencia anteriormente. El enlazador de la sonda de la SEQ ID NO: 96 se ubicó alternativamente entre las posiciones 5 y 6, entre las posiciones 9 y 10, entre las posiciones 13 y 14 o entre las posiciones 16 y 17. El enlazador de la sonda de la SEQ ID NO: 97 se ubicó entre las posiciones 9 y 10. El enlazador de la sonda de la SEQ ID NO: 98 se ubicó alternativamente entre las posiciones 6 y 7, entre las posiciones 9 y 10 o entre las posiciones 11 y 12. El enlazador de la sonda de la SEQ ID NO: 100 se ubicó alternativamente entre las posiciones 6 y 7, entre las posiciones 9 y 10, entre las posiciones 11 y 12 o entre las posiciones 13 y 14. El enlazador de la sonda de la SEQ ID NO: 105 se ubicó alternativamente entre las posiciones 12 y 13 o entre las posiciones 13 y 14. El enlazador de la sonda de la SEQ ID NO: 106 se ubicó entre las posiciones 14 y 15. El enlazador de la sonda de la SEQ ID NO: 107 se ubicó alternativamente entre las posiciones 6 y 7 o entre las posiciones 7 y 8. El enlazador de la sonda de la SEQ ID NO: 108 se ubicó alternativamente entre las posiciones 6 y 7 o entre las posiciones 12 y 13. El enlazador de la sonda de la SEQ ID NO: 109 se ubicó alternativamente entre las posiciones 5 y 6 o entre las posiciones 11 y 12. El enlazador de la sonda de la SEQ ID NO: 110 se ubicó entre las posiciones 11 y 12. El enlazador de la sonda de la SEQ ID NO: 111 se ubicó alternativamente entre las posiciones 9 y 10, entre las posiciones 10 y 11, entre las posiciones 12 y 13 o entre las posiciones 13 y 14. El enlazador de la sonda de la SEQ ID NO: 112 se ubicó alternativamente entre las posiciones 7 y 8, entre las posiciones 8 y 9, entre las posiciones 10 y 11 o entre las posiciones 11 y 12. El enlazador de la sonda de la SEQ ID NO: 113 se ubicó alternativamente entre las posiciones 7 y 8, entre las posiciones 8 y 9 o entre las posiciones 9 y 10. El enlazador de la sonda de la SEQ ID NO: 114 se ubicó entre las posiciones 6 y 7. El enlazador de la sonda de la SEQ ID NO: 115 se ubicó alternativamente entre las posiciones 12 y 13, entre las posiciones 13 y 14 o entre las posiciones 15 y 16. El enlazador de la sonda de la SEQ ID NO: 116 se ubicó alternativamente entre las posiciones 5 y 6, entre las posiciones 10 y 11 o entre las posiciones 12 y 13. La utilización de todas estas diferentes posiciones del enlazador confirmó la versatilidad de esta técnica de marcado. Las hibridaciones de la sonda se llevaron a cabo a 62 °C durante 15 minutos en volúmenes de 50 pl de una solución tamponada con succinato que incluía, aproximadamente, 300 mM de LiCl y, aproximadamente, un 0,75 % (p/v) de laurilsulfato de litio. Las reacciones de hibridación fueron seguidas por la adición de 63 pl de tetraborato de sodio 0,15 M (pH 8,5) y TRITON X-100 al 1 % (Union Carbide Corporation; Danbury, Conneticut). Estas mezclas se incubaron en primer lugar a 62 °C durante 10 minutos para inactivar el marcador quimioluminiscente unido a la sonda no hibridada, y se enfriaron brevemente a 4 °C antes de leer la señal de hibridación. La quimioluminiscencia debida a la sonda hibridada en cada muestra se ensayó utilizando un lector de microplacas de luminiscencia LUMISTAR GALAXY (BMG Labtechnologies Inc.; Durham, Carolina del Norte) configurado para la inyección automática de ácido nítrico 1 mM y peróxido de hidrógeno al 0,1 % (v/v), seguida de la inyección de una solución que contiene hidróxido de sodio 1 N. Los resultados de las reacciones quimioluminiscentes se midieron en unidades de luz relativas (ULR). Los resultados representativos de este procedimiento se resumen en la tabla 10 para cada una de las tres regiones diana diferentes. Los valores numéricos que se muestran en la tabla indican la relación señal/ruido promedio (Prom. S/R) calculada a partir de uno o dos ensayos, en el que cada ensayo incluyó cuatro repeticiones.

Tabla 10

Los resultados presentados en la tabla 10 mostraron que cada sonda probada en el procedimiento dio una fuerte señal de hibridación después de la interacción con la secuencia diana de VNO. Los valores numéricos presentados en la tabla son para las sondas de la SEQ ID NO: 95 y la SEQ ID NO: 109 que tienen sus marcadores unidos entre las posiciones de nucleobase 5 y 6, para las sondas de la SEQ ID NO: 104 y la SEQ ID NO: 108 que tienen sus marcadores unidos entre las posiciones de nucleobase 6 y 7, para las sondas de la SEQ ID NO: 97, y la SEQ ID NO: 100 que tienen sus marcadores unidos entre las posiciones de nucleobase 9 y 10, para las sondas de la SEQ ID NO: 111 y la SEQ ID NO: 116 que tienen sus marcadores unidos entre las posiciones de nucleobase 10 y 11, para las sondas de la SEQ ID NO: 98 y la SEQ ID NO: 110 que tienen sus marcadores entre las posiciones de nucleobase 11 y 12, para la sonda de la SEQ ID NO: 105 que tiene su marcador unido entre las posiciones de nucleobase 12 y 13 y para la sonda de la SEQ ID NO: 106 que tiene su marcador unido entre las posiciones 14 y 15. Sin embargo, todas las sondas utilizadas en el procedimiento dieron valores de S/R sustancialmente superiores a 10 cuando se hibridaron, como mínimo, con una de las dianas sintéticas. De hecho, el posicionamiento de cualquier marcador detectable unido a cualquiera de las sondas descritas en la presente memoria descriptiva puede variarse y quedar aún dentro del alcance de la presente invención. Cada una de las sondas que tiene uno de los marcadores situados de forma alternativa descritos anteriormente de manera particular, representa una realización preferente de la sonda de la presente invención.

Aunque los resultados numéricos no se presentan en la tabla 10, también se probaron sondas adicionales y se demostró que se hibridaban con ácidos nucleicos diana sintéticos de VNO con muy buenos resultados. Más específicamente, la hibridación de las sondas que tienen la secuencia de la SEQ ID NO: 112 con una diana de VNO sintética que tiene la secuencia de CUUUGUUCACCCAGUCCUCCUG (SEQ ID NO: 194) dio relaciones señal/ruido tan elevadas como, aproximadamente, 1100. La hibridación de las sondas que tenían la secuencia de la SEQ ID NO: 113 con la misma secuencia diana sintética dio relaciones señal/ruido tan elevadas como, aproximadamente, 1.050. La hibridación de las sondas que tienen la secuencia 115 con una diana sintética que tenía la secuencia de ACAUGGAUCACUUCGCGGCUUUG (SEQ ID NO: 196) dio relaciones señal/ruido tan elevadas como, aproximadamente, 1480. Una sonda que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 107, que tenía su enlazador ubicado entre las posiciones 7 y 8, se hibridó con una diana de VNO sintética que tenía la secuencia de CCAGUCCUCCUGGGGUUGAGUCGCAGGGCA (SEQ ID NO: 193) y dio una relación señal/ruido de, aproximadamente, 1.000. Por consiguiente, cada una de las secuencias de sonda anteriores representa una realización preferente de la presente invención y se encuentra dentro de, como mínimo, uno de los dominios de sonda extendidos definidos en la presente memoria descriptiva.

Se probaron, además, otras sondas de hibridación mediante el mismo procedimiento y se descubrió que daban buenos resultados. De nuevo, todas las sondas y dianas se sintetizaron utilizando análogos de nucleótidos 2'-OMe. Las sondas se marcaron con marcadores de éster de acridinio quimioluminiscentes unidos a las sondas mediante enlazadores no nucleotídicos, tal como se ha descrito anteriormente. Más particularmente, una sonda que tenía la secuencia de CCCTGCGACTCAACCCC (SEQ ID NO: 189), que tenía su enlazador ubicado entre las posiciones 11 y 12, se hibridó con una diana sintética de VNO que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 193 y dio una relación señal/ruido de, aproximadamente, 180. Una sonda que tenía la secuencia de CCTGCGACTCAACCCC (SEQ ID NO: 190), que tenía su enlazador ubicado entre las posiciones 13 y 14, se hibridó con una diana sintética de VNO que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 193 y dio una relación señal/ruido de, aproximadamente, 160. Una sonda que tenía la secuencia de CCTGCGACTCAACCC (SEQ ID NO: 191), que tenía su enlazador ubicado entre las posiciones 11 y 12, se hibridó con una diana sintética de VNO que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 193 y dio una relación señal/ruido de, aproximadamente, 190. Las sondas que tenían la secuencia de AGGAGGACTGGGTGAACAA (SEQ ID NO: 192), con marcadores ubicados alternativamente entre las posiciones 7 y 8 o las posiciones 8 y 9, se hibridaron con una diana de VNO sintética que tenía la secuencia de GAUCACUUCGCAGCUUUGUUCACCCAGUCCUCCUGG (SEQ ID NO: 195) y dieron relaciones señal/ruido de, aproximadamente, 200. De nuevo, cada una de las secuencias de sonda anteriores representa una realización preferente de la presente invención y se encuentra dentro de, como mínimo, uno de los dominios de sonda extendidos definidos en la presente memoria descriptiva.

La posibilidad de emparejamientos erróneos entre una secuencia diana del VNO y una sonda de hibridación sustancialmente complementaria se ilustró utilizando una de las sondas descritas anteriormente y una colección de dianas sintéticas que representan secuencias variantes de origen natural. Más específicamente, las muestras que contenían la sonda marcada con AE de la SEQ ID NO: 111 descrita anteriormente se hibridaron con oligonucleótidos diana sintéticos que contenían porciones sustancialmente complementarias de las secuencias virales identificadas por los números de acceso de GenBank AF297856 (SEQ ID NO: 150), AF260969 (SEQ ID NO: 151) y AF297847 (SEQ ID NO: 152). Cada diana se emparejó erróneamente con la sonda de hibridación marcada en una posición diferente, lo que significa que la sonda y la diana no eran complementarias en la posición del emparejamiento erróneo. La diana estándar de la SEQ ID NO: 148 era completamente complementaria a la sonda, por lo que se utilizó como control positivo. La capacidad de la sonda para hibridarse con cada una de las dianas se evaluó mediante el procedimiento descrito anteriormente en función del nivel de entrada de la diana.

Tal como se ilustra en la figura 2, la sonda de hibridación detectó claramente las dianas que no eran completamente complementarias a la secuencia de sonda. Esta rigurosa prueba demostró que los emparejamientos erróneos entre la sonda de hibridación y su diana podían tolerarse sin comprometer la capacidad de la sonda para detectar la diana. De hecho, las sondas de la presente invención pueden contener, de manera permisible, hasta un 10 %, e incluso hasta un 20 % de emparejamientos erróneos de bases con la diana sin comprometer sustancialmente la capacidad de la sonda para detectar la diana. Dicho de otra manera, la secuencia de bases complementaria a la diana incluida en las sondas de hibridación de la presente invención puede diferir, de manera permisible, de la secuencia de dominio extendido a partir de la que se derivó hasta en un 10 %, o incluso hasta en un 20 % de las posiciones de las bases. De este modo, las sondas de hibridación y los cebadores que son útiles para detectar el VNO tendrán secuencias de bases complementarias a la diana que tenían un intervalo de longitud específico y, de manera permisible, pueden contener equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta, aproximadamente, un 10 %, o incluso hasta un 20 %. % de diferencias de bases cuando se comparan con una secuencia especificada que de otro modo contiene la secuencia de sonda o cebador. Por ejemplo, una sonda de hibridación útil para detectar una de las secuencias de flavivirus variantes descritas anteriormente puede tener una secuencia de bases complementaria a la diana que consiste en 18 bases contiguas contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 103 o la SEQ ID NO: 111 o los complementos de las mismas, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 % de diferencias de bases, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases.

Las sondas de ensayo de hibridación que tenían las secuencias presentadas en la tabla 7 se utilizaron posteriormente para demostrar que una variedad de cebadores de amplificación y oligonucleótidos de captura podían detectar ácidos nucleicos de VNO en muestras biológicas. Las sondas que tenían estas secuencias o sus complementos, que permiten la presencia de equivalentes de ARN y ADN y sustituciones de análogos de nucleótidos, representan, cada una, realizaciones particularmente preferentes de la presente invención.

Los cebadores útiles, según la presente invención, también exhiben flexibilidad con respecto a la presencia de emparejamientos erróneos con una diana que de otro modo sería complementaria. Esto se debe a que el mecanismo de amplificación de la amplificación del ácido nucleico requiere solo la unión transitoria del cebador para producir un primer amplicón que contendrá una coincidencia exacta para la unión del cebador complementario en un ciclo de amplificación posterior. Por consiguiente, y de manera similar a la posibilidad de diferencias de bases o emparejamientos erróneos en las secuencias de sonda de hibridación, los cebadores que son útiles para amplificar las secuencias de ácido nucleico de los flavivirus, tales como el VNO, tendrán una secuencia de bases complementaria a la diana terminal 3’ dentro de un intervalo de longitud especificado, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 % de diferencias de bases, o incluso hasta un 20 % de diferencias de bases cuando se comparan con una secuencia especificada que de otro modo contiene la secuencia del cebador.

Las combinaciones de cebadores preferentes para amplificar ácidos nucleicos de VNO se identificaron en una serie de procedimientos que utilizaban viriones de VNO como fuente de plantillas de ácidos nucleicos. Se seleccionaron los promotores-cebadores y los cebadores de cadena opuesta que se describen a continuación. Aunque estos procedimientos se llevaron a cabo de manera particular utilizando un protocolo de amplificación mediada por transcripción (TMA) los cebadores dados a conocer en la presente memoria descriptiva se pueden utilizar para producir amplicones mediante procedimientos alternativos de amplificación de ácido nucleico in vitro que serán familiares para aquellos que tengan un nivel normal de experiencia en la técnica.

El ejemplo 2 describe los procedimientos que identificaron cebadores de amplificación útiles para la región no codificante 5’ del virus del Nilo occidental.

Ejemplo 2

Identificación de cebadores de amplificación

Un lisado viral sirvió como fuente de secuencias plantilla de VNO en reacciones de amplificación que utilizaban pares de cebadores. Las reacciones de TMA se llevaron a cabo esencialmente como describen Kacian et al., en la Patente US5,399,491. Cada promotor-cebador incluía una secuencia del promotor T7 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA (SEQ ID NO: 153) en el sentido de 5’ de una secuencia complementaria de VNO. Se llevaron a cabo reacciones de amplificación para diversas combinaciones de cebadores utilizando 5 pl o 1,4 pl de una dilución 1:10.000 de un lisado viral de la cepa NY99 del VNO como fuente de la plantilla de VNO (cada reacción contenía menos de 1 equivalente viral de UFP), y 10 pmoles de cada cebador en 100 pl de tampón de reacción. El lisado viral se obtuvo de los Centers for Disease Control, National Center for Infectious Disease, Division of Vector-Borne Infectious Disease, Fort Collins, Colorado. Los ácidos nucleicos se sometieron a procesamiento de muestras y captura de diana antes de la amplificación, esencialmente según los procedimientos dados a conocer en la Patente PCT/US2000/18685, excepto porque la plantilla se capturó utilizando oligonucleótidos específicos del VNO en lugar de oligonucleótidos específicos del VIH. Se utilizaron en combinación conjuntos de oligonucleótidos de captura que tenían las secuencias de la SEQ ID NO: 117, la SEQ ID NO: 118 y la SEQ ID NO: 119 o las secuencias de la SEQ ID NO: 120, la SEQ ID NO: 126 y la SEQ ID NO: 130, cada uno a un nivel de 2-5 pmoles/reacción para ensayos realizados utilizando 5 pl de lisado viral como fuente de ácidos nucleicos plantilla. En una ligera variación de este procedimiento, los oligonucleótidos de captura que tenían las secuencias de la SEQ ID NO: 120, la SEQ ID NO: 118 y la SEQ ID NO: 119 se utilizaron en combinación, cada uno a un nivel de 2-5 pmoles/reacción para ensayos realizados utilizando 1,4 zip de lisado viral como fuente de ácidos nucleicos plantilla. Los ácidos nucleicos diana y los cebadores se calentaron a 60 °C durante 10 minutos y, a continuación, se enfriaron a 42 °C para facilitar la hibridación del cebador. A continuación, se añadieron a las mezclas la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV) (5.600 unidades/reacción) y la ARN polimerasa T7 (3.500 unidades/reacción). Las reacciones de amplificación finales contenían 50 mM de Tris HCl (pH 8,2 a 8,5), 35 mM de KCl, 4 mM de GTP, 4 mM de ATP, 4 mM de UTP, 4 mM de CTP, 1 mM de dATP, 1 mM de dTTP, 1 mM de dCTP, 1 mM de dGTP, 20 mM de MgCl2, 20 mM de N-acetil-L-cisteína y glicerol al 5 % (p/v). Después de una hora de incubación a 42 °C, toda la reacción de amplificación de 100 pl se sometió a un ensayo de hibridación esencialmente tal como se ha descrito en el ejemplo 1 utilizando la sonda de la SEQ ID NO: 98 (véase tabla 10). Más particularmente, la sonda se marcó con éster de acridinio hasta una actividad específica de, aproximadamente, 2 x 108 ULR/pmol y, a continuación, se utilizó en una cantidad equivalente a 2 x 106 ULR para cada reacción de hibridación. Los ensayos se llevaron a cabo utilizando 10 repaticiones. Para que se considere un resultado positivo, la señal quimioluminiscente que indica la hibridación de la sonda debe haber excedido las 50.000 ULR en un ensayo, o la relación señal-ruido (en la que el ruido de fondo se midió en una reacción de control de amplificación negativa) debe haber sido, como mínimo, 10.

Las tablas 11 y 12 presentan los resultados de los procedimientos de amplificación que se realizaron respectivamente utilizando cantidades de plantillas de VNO contenidas en 5 pl y 1,4 pl de lisado viral y diferentes combinaciones de cebadores de amplificación. Los resultados de las últimas columnas de las tablas muestran el número de ensayos positivos y el número de ensayos repetidos utilizados en los procedimientos.

Tabla 11

Los resultados presentados en la tabla 11 mostraron que muchas de las combinaciones de cebadores dieron niveles muy altos de detectabilidad de VNO, incluso a niveles de plantilla inferiores a 1 UFP de equivalentes virales por reacción. Incluso las combinaciones de cebadores que dieron niveles bajos pero medibles de detectabilidad de VNO en los resultados presentados en la tabla indicaron una amplificación exitosa de plantillas de VNO y establecieron la combinación como un componente útil de un ensayo de amplificación de ácido nucleico de VNO. Es importante destacar que los resultados de estos procedimientos mostraron que cada uno de los cebadores complementarios a una cadena del ácido nucleico de VNO podría emparejarse, como mínimo, con uno de los cebadores complementarios a la cadena opuesta del ácido nucleico de VNO para dar como resultado un ensayo basado en amplificación altamente sensible.

Tabla 12

Los resultados presentados en la tabla 12 ilustran, además, cómo los oligonucleótidos de captura, sondas y cebadores descritos anteriormente podrían utilizarse en un ensayo altamente sensible para detectar ácidos nucleicos de VNO a niveles muy bajos de plantilla de entrada.

El ejemplo 3 describe los procedimientos que identificaron cebadores útiles para amplificar ácidos nucleicos de la región 3000 del virus del Nilo occidental.

Ejemplo 3

Identificación de cebadores de amplificación

Se llevaron a cabo reacciones de amplificación que utilizaban conjuntos emparejados de cebadores específicos para la región 3000 de VNO, esencialmente tal como se ha descrito en el ejemplo 2, excepto porque los promotores-cebadores que tenían las secuencias complementarias al VNO presentadas en la tabla 4 se utilizaron en combinación con cebadores de cadena opuesta que tenían las secuencias presentadas en la tabla 3. Se llevaron a cabo reacciones de amplificación para las diversas combinaciones de cebadores utilizando 5 pl o 1,4 pl de una dilución 1:10.000 del lisado viral descrito anteriormente (cada reacción contenía menos de 1 ^uF^pde equivalentes virales). Los ácidos nucleicos se sometieron al procesamiento de muestras, según el ejemplo 2, utilizando combinaciones de oligonucleótidos de captura que incluían las secuencias complementarias a la diana de la SEQ ID NO: 117, la SEQ ID NO: 118 y la SEQ ID NO.119 o las secuencias complementarias a la diana de la SEQ ID NO: 120, la SEQ ID NO: 126 y la SEQ ID NO: 130. Cada oligonucleótido de captura se utilizó a un nivel de 2-5 pmoles/reacción en la etapa de captura de la diana. Los ácidos nucleicos diana y los cebadores se calentaron a 60 °C durante 10 minutos y a continuación, se enfriaron a 42 °C y se llevaron a cabo reacciones de amplificación, tal como se ha descrito anteriormente. Al final de las reacciones de amplificación, todos los volúmenes de reacción se sometieron a un ensayo de hibridación utilizando una sonda que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 100 (véase tabla 10). Más particularmente, la sonda se marcó con éster de acridinio hasta una actividad específica de, aproximadamente, 2 x 108 ULR/pmol y a continuación, se utilizó en una cantidad equivalente a, aproximadamente, 1 x 106 a 1 x 107 ULR para cada reacción de hibridación. Los ensayos se llevaron a cabo utilizando 10 repeticiones. Para que se considere un resultado positivo, la señal quimioluminiscente que indica la hibridación de la sonda debe haber superado las 50.000 ULR en un ensayo.

La tabla 13 presenta los resultados de los procedimientos de amplificación que se llevaron a cabo utilizando diferentes combinaciones de cebadores para amplificar los ácidos nucleicos de la región 3.000 del VNO. Los resultados de la última columna de la tabla muestran el número de ensayos positivos y el número de ensayos repetidos utilizados en el procedimiento. A menos que se indique lo contrario, todas las reacciones se llevaron a cabo utilizando 5 pl de lisado de VNO como fuente de ácidos nucleicos virales.

Tabla 13

Los resultados presentados en la tabla 13 mostraron que muchas de las combinaciones de cebadores enumeradas eran útiles para crear ensayos altamente sensibles que implicaban la amplificación de ácidos nucleicos de VNO. De hecho, se contempla que cualquiera de los cebadores enumerados complementarios a una cadena se puede utilizar en combinación con cualquiera de los cebadores enumerados complementarios a la cadena opuesta para amplificar ácidos nucleicos de VNO a cierto nivel de plantilla de entrada.

El ejemplo 4 describe los procedimientos que identificaron cebadores útiles para amplificar ácidos nucleicos de la región no codificante 3’ del virus del Nilo occidental.

Ejemplo 4

Identificación de cebadores de amplificación

Se llevaron a cabo reacciones de amplificación que utilizan conjuntos emparejados de cebadores específicos para la región no codificante 3’ de VNO esencialmente como se ha descrito en el ejemplo anterior, excepto porque se utilizaron los promotores-cebadores que tenían las secuencias complementarias de VNO presentadas en la tabla 6 en combinación con los cebadores de cadena opuesta que tenían las secuencias presentadas en la tabla 5. Se llevaron a cabo reacciones de amplificación para las diversas combinaciones de cebadores utilizando 1,4 pl o 0,14 pl de una dilución 1:10.000 del lisado viral descrito anteriormente (cada reacción contenía menos de 1 UFP de equivalentes virales). Los ácidos nucleicos se sometieron al procesamiento de muestras utilizando oligonucleótidos de captura que tenían las secuencias complementarias a la diana de la SEQ ID NO: 118, la SEQ ID NO: 119 y la SEQ ID NO: 120 en combinación, cada uno a un nivel de 2-5 pmoles/reacción. Los ácidos nucleicos diana y los cebadores se calentaron a 60 °C durante 10 minutos y a continuación, se enfriaron a 42 °C y se llevaron a cabo reacciones de amplificación tal como se ha descrito anteriormente. Al final de las reacciones de amplificación, todos los volúmenes de reacción se sometieron a un ensayo de hibridación utilizando una sonda que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 104 (véase tabla 10). Más particularmente, la sonda se marcó con éster de acridinio hasta una actividad específica de, aproximadamente, 2 x 108 ULR/pmol y, a continuación, se utilizó en una cantidad equivalente a, aproximadamente, 1 x 106 a 1 x 107 ULR para cada reacción de hibridación. Los ensayos se llevarona a cabo utilizando 10 repeticiones. Para que se considere un resultado positivo, la señal quimioluminiscente que indica la hibridación de la sonda debe haber superado las 50.000 ULR en un ensayo.

La tabla 14 presenta los resultados de los procedimientos de amplificación que se llevaron a cabo utilizando diferentes combinaciones de cebadores. Los resultados de las últimas columnas de la tabla muestran el número de ensayos positivos y el número de ensayos repetidos utilizados en los procedimientos.

Tabla 14

Los resultados presentados en la tabla 14 mostraron que las combinaciones de cebadores enumeradas eran útiles para crear ensayos altamente sensibles que implicaban la amplificación de ácidos nucleicos de VNO. De hecho, se contempla que cualquiera de los cebadores enumerados complementarios a una cadena se puede utilizar en combinación con cualquiera de los cebadores enumerados complementarios a la cadena opuesta para amplificar ácidos nucleicos de VNO a cierto nivel de plantilla de entrada.

En particular, en todos los casos excepto en uno solo, otros promotores-cebadores que se utilizaron en combinación con los cebadores de cadena opuesta enumerados en la tabla 14 dieron 0 pruebas positivas/10 al nivel de entrada de diana indicado. Más particularmente, los promotor T7cebadores de que incluían secuencias complementarias de VNO proporcionadas por los siguientes oligonucleótidos no dieron buenos resultados cuando se probaron utilizando las condiciones dadas anteriormente cuando se probaron en combinación con cada uno de los cebadores de cadena opuesta enumerados en la tabla 14: SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 81. Si todos los cebadores fueran equivalentes, entonces se habrían esperado resultados medibles al utilizar estos cebadores, y ese no era el caso en que los procedimientos de amplificación con extraordinaria sensibilidad estuvieran contenidos dentro de los dominios altamente preferentes de la SEQ ID NO: 73 y la SEQ ID NO: 74.

Para demostrar adicionalmente la flexibilidad en el diseño del ensayo, se llevaron a cabo procedimientos adicionales para mostrar cómo se podría utilizar más de un cebador del mismo sentido en la reacción de amplificación sin comprometer la sensibilidad del ensayo. De hecho, la capacidad de utilizar más de un cebador del mismo sentido en el ensayo representa una estrategia para detectar variantes genéticas del VNO.

Se llevaron a cabo reacciones para amplificar y detectar VNO en la región no codificante 3’ sustancialmente tal como se ha descrito anteriormente, con las siguientes modificaciones menores. Los oligonucleótidos de captura utilizados en el procedimiento incluyeron las secuencias complementarias a la diana de la SEQ ID NO: 134, la SEQ ID NO: 131 y la SEQ ID NO: 127. Un promotor-cebador que incluía la secuencia complementaria a la diana de la SEQ ID NO: 76 estaba presente en todas las reacciones de amplificación. Excepto como se indica en la tabla de resultados, todas las reacciones incluyeron un cebador que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 64 en combinación con un segundo cebador del mismo sentido que se hibridó con la misma cadena de ácido nucleico de VNO. En un caso, el cebador que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 68 y el promotor-cebador de la SEQ ID NO: 85, que incluía la secuencia complementaria a la diana de la SEQ ID NO: 76, se utilizaron para amplificar ácidos nucleicos de VNO en ausencia de un tercer cebador. Se utilizó una sonda que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 111 en todos los casos para detectar la producción de amplicones. Las reacciones se llevaron a cabo en 10 repeticiones y se cebaron utilizando 0,33 pl de la dilución 1:10.000 del lisado viral descrito anteriormente (aproximadamente 10-20 copias de la diana viral por reacción). Para que se considere un resultado positivo, la señal quimioluminiscente que indica la hibridación de la sonda debe haber superado las 50.000 ULR en un ensayo. En particular, estos ensayos incluyeron, además, una plantilla de control interno del VIH-1 y cebadores que no afectaron sustancialmente a la amplificación o detección de la diana del VNO.

Los resultados presentados en la tabla 15 mostraron que cada una de las combinaciones de cebadores probadas facilitó la amplificación y detección de ácidos nucleicos de VNO.

Tabla 15

Para ilustrar adicionalmente la flexibilidad en el diseño del ensayo, se llevó a cabo otro procedimiento utilizando el mismo conjunto de oligonucleótidos de captura y utilizando múltiples cebadores para generar amplicones de VNO, pero utilizando diferentes sondas de hibridación en la etapa de detección. Más específicamente, los oligonucleótidos de captura utilizados en el procedimiento incluían las secuencias complementarias a la diana de la SEQ ID NO: 134, la SEQ ID NO: 131 y la ^sE^qID NO: 127. Se utilizó un promotor-cebador que tenía la secuencia complementaria al VNO de la SEQ ID NO: 76 en combinación con cebadores de cadena opuesta que tenían las secuencias de la SEQ ID NO: 64 y la SEQ ID NO: 68. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo utilizando 1,4 pl del lisado viral descrito anteriormente como fuente de plantilla. Las reacciones de detección se llevaron a cabo tal como se ha descrito anteriormente utilizando cualquiera de dos sondas diferentes, una que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 107 y la otra que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 114, habiéndose descrito cada una de estas sondas anteriormente. Los resultados de estos procedimientos dieron 10/10 positivos utilizando la sonda de la SEQ ID NO: 107, y 18/18 positivos utilizando la sonda de la SEQ ID NO: 114. Esto confirmó la utilidad de las sondas de hibridación y demostró, además, cómo los elementos del procedimiento de amplificación y detección podrían combinarse para dar como resultado ensayos sensibles. En particular, se descubrió que la sonda de la SEQ ID. NO: 114 en otros procedimientos dio resultados excepcionalmente reproducibles, incluso cuando las muestras biológicas sometidas a pruebas se prepararon mediante procedimientos ligeramente diferentes. Tal como se ha indicado anteriormente, la secuencia de sonda de la SEQ ID NO: 114 difiere ligeramente de la secuencia correspondiente contenida en los dominios de sonda definidos por la SEQ ID NO: 101, la SEQ ID NO: 102 y la SEQ ID NO: 103.

El siguiente ejemplo describe los procedimientos utilizados para probar los oligonucleótidos de captura de VNO candidatos. Además de la captura de diana específica del VNO, el cebador de amplificación y las sondas descritas en este procedimiento, las reacciones también probaron el efecto de incluir oligonucleótidos de captura específicos para analitos de VIH-1, VHC y VHB.

Ejemplo 5

Detección de secuencias diana de VNO utilizando diferentes oligonucleótidos de captura

Se dispersaron alícuotas del lisado de VNO utilizado en los procedimientos descritos anteriormente en 400 |j.l de reactivo de lisis/captura que contenía, aproximadamente, 4 pmoles de cada oligonucleótido de captura y, aproximadamente, 40 |xg de partículas paramagnéticas de 0,7-1,05 |j. (Seradyn, Indianapolis, Indiana) unidas covalentemente a poli-(dT14). Los oligonucleótidos de captura utilizados en el procedimiento tenían las secuencias dadas en la tabla 8. El reactivo de lisis/captura incluía, además, una plantilla de control de amplificación interna de VIH-1, oligonucleótidos de captura específicos de VIH-1, VHC y VHB, y una solución tamponada con HEPES 100 mM que contenía laurilsulfato de litio 294 mM, cloruro de litio 730 mM e hidróxido de litio 50 mM. Tal como se ha indicado anteriormente, se interpuso una secuencia espaciadora 5'-TTT-3’ entre la secuencia complementaria de VNO y la región de la cola de oligo-(dA) para cada uno de los oligonucleótidos de captura mostrados en la tabla 8. Las mezclas se calentaron a 55-60 °C durante, aproximadamente, 15-30 minutos y a continuación, se enfriaron a temperatura ambiente para permitir la hibridación. Se aplicó un campo magnético para recoger los complejos de partículas que contenían el oligonucleótido de captura inmovilizado y el ADN de VNO utilizando procedimientos tales como los descritos por Wang en la Patente uS4,895,650. Las partículas se lavaron dos veces con 1 ml de un tampón de lavado (HEPES 10 mM, NaOH 6,5 mM, EDTA 1 mM, etanol al 0,3 % (v/v), metil-parabeno al 0,02 % (p/v), propilparabeno al 0,01 % (p/v), NaCl 150 mM, laurilsulfato de sodio al 0,1 % (p/v)). A continuación, las partículas lavadas se resuspendieron en 75 |j.l del reactivo de amplificación descrito en el ejemplo 2. Este reactivo incluía sales, nucleótidos, ribonucleótidos, cebadores específicos de VNO. Algunos ensayos incluyeron, además, cebadores capaces de amplificar una plantilla de control interno del VIH-1. A continuación, se amplificó el ácido nucleico diana de VNO y se detectaron los productos de amplificación utilizando un ensayo de protección homogéneo, esencialmente tal como se ha descrito en el ejemplo 1 utilizando la sonda de hibridación de la SEQ ID NO: 98 (véase tabla 10). Las reacciones que dieron señales positivas cuando se hibridaron con una sonda específica para el amplicón de control interno, o con una sonda específica para el amplicón de VNO, se puntuaron como reacciones válidas. Para que se considere positiva la presencia de amplicones de VNO en una serie válida, la hibridación de la sonda indicadora de la señal quimioluminiscente debe haber superado las 50.000 ULR en un ensayo.

La tabla 16 presenta resultados de muestra que correlacionan la identidad del oligonucleótido o de los oligonucleótidos de captura específicos de VNO y la capacidad del sistema para amplificar y detectar las secuencias de VNO de manera eficiente. Para conseguir un resultado positivo en las reacciones de amplificación, el oligonucleótido de captura de VNO debe haber sido capaz de actuar en cooperación con los cebadores de amplificación y la sonda o las sondas para capturar los ácidos nucleicos plantilla de VNO, amplificar los ácidos nucleicos plantilla de VNO y a continuación, detectar los ácidos nucleicos amplificados.

En particular, los promotores-cebadores utilizados en este procedimiento y enumerados en la tabla 16 se identifican por la secuencia completa que incluía el promotor T7. Sin embargo, debe entenderse que las porciones complementarias al VNO de los promotores-cebadores representan secuencias esenciales para realizar reacciones de amplificación mediante protocolos alternativos, tales como la reacción en cadena de la polimerasa, siendo la secuencia promotora opcional. De este modo, debe entenderse que algunos de los cebadores enumerados en la tabla 16 poseían secuencias promotoras opcionales, y que los cebadores correspondientes que no incluyen el promotor opcional representan las secuencias complementarias al VNO esenciales. Estas últimas secuencias complementarias al VNO son útiles junto con cebadores de cadena opuesta para amplificar ácidos nucleicos de VNO.

Tabla 16

Los resultados presentados en la tabla 16 confirmaron que sustancialmente todos los oligonucleótidos de captura que se probaron, solos o en combinación, fueron útiles en el ensayo de detección del VNO.

Como la cepa NY99 que se utilizó en los ejemplos anteriores, la cepa de Uganda del virus del Nilo occidental es una de las más de 100 cepas conocidas del virus del Nilo occidental. Según la secuenciación y el análisis filogenético, los virus conocidos se han dividido en dos linajes: linaje 1 y linaje 2. Los datos epidemiológicos indican que las cepas del linaje 2, que se han aislado de casos humanos asintomáticos o febriles leves, son algo menos virulentas que las cepas del linaje 1. Las cepas del linaje 1 se han asociado con epidemias en las que ha habido casos de encefalitis humana y muertes.

Una ventaja clave de los sistemas de amplificación descritos anteriormente se demostró utilizando un “panel de aptitud” de la cepa de Uganda del virus del Nilo occidental (un ejemplo de una cepa del linaje 2). Aquellos que tengan un nivel normal de experiencia en la técnica apreciarán que esta cepa está relacionada sólo lejanamente a nivel de ácido nucleico con la cepa NY99 (un ejemplo de una cepa del linaje 1) que predomina en los Estados Unidos. De este modo, si un ensayo puede detectar las cepas NY99 y de Uganda del VNO representa una prueba muy estricta de utilidad en un entorno clínico.

El ejemplo 6 describe los procedimientos utilizados para demostrar que la cepa de Uganda del virus del Nilo occidental se detectó mediante los mismos ensayos que detectaron la cepa NY99.

Ejemplo 6

Amplificación y detección de la cepa de Uganda del virus del Nilo occidental

Se obtuvo de Boston Biomedica Inc. (Massachussets) un panel de aptitud de muestras que contenían cantidades conocidas de la cepa de Uganda del VNO en volúmenes de 800 a 1.000 pl de un derivado de suero humano . Este panel consistía en una pluralidad de miembros, cada uno de los cuales contenía 0, 30, 100, 1.000 o 10.000 copias/ml del ARN de la cepa de Uganda del VNO. Los procedimientos de captura, amplificación y detección de la diana se realizaron esencialmente tal como se ha descrito en los ejemplos anteriores. En este ejemplo, se utilizaron los oligonucleótidos de captura que tenían las secuencias complementarias a la diana de la SEQ ID NO: 120, la SEQ ID NO: 130 y la SEQ ID NO: 126 en combinación entre sí. En un procedimiento preliminar, se utilizó uno de los miembros del panel que contenía 10.000 copias/ml del ARN viral para crear una serie de diluciones que contenían 10, 30, 100 o 300 copias del ácido nucleico viral. Las reacciones de amplificación y detección se realizaron utilizando los reactivos oligonucleotídicos enumerados en la tabla 17. En el presente caso, el marcador de la sonda que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 98 estaba ubicado entre las posiciones 11 y 12; el marcador de la sonda que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 100 estaba ubicado entre las posiciones 9 y 10; y el marcador de la sonda que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 104 estaba ubicado entre las posiciones 6 y 7. Cuando se utilizaron miembros del panel para realizar pruebas sin dilución previa, se utilizó una alícuota de 500 pl para una reacción que amplificó la región 3000 de la diana y el volumen restante del miembro del panel (que asciende a menos de 500 pl) se utilizó en una reacción que amplificó la región no codificante 3’. La prueba se restringió a estas dos regiones porque los volúmenes de los miembros del panel sin diluir eran limitantes. Los resultados positivos se puntuaron cuando la relación señal-ruido fue, como mínimo, de 10.

Tabla 17

La tabla 18 presenta los resultados numéricos de este procedimiento. La precisión entre los resultados de cada serie de reacciones realizadas en un solo nivel diana se determinó calculando un coeficiente de variabilidad. (%CV).

Tabla 18

Los resultados presentados en la tabla 18 confirmaron que cada una de las tres regiones diana diferentes en la cepa de VNO de Uganda podría amplificarse y detectarse de manera altamente sensible utilizando los mismos reactivos oligonucleotídicos que se habían utilizado para amplificar y detectar la cepa NY99. Cada uno de los diferentes sistemas de amplificación detectó ácidos nucleicos virales en el 100 % de las muestras hasta 30 copias/ml. Los sistemas para detectar dianas en la región 3000 y la región no codificante 3’ detectaron ácidos nucleicos virales en el 100 % de las muestras hasta 10 copias/ml. Debido a que se utilizaron muestras de 0,5 ml de las diversas diluciones en los procedimientos de detección, el número de copias de ARN viral/reacción fue la mitad del número de copias de ARN viral/ml. Los resultados positivos que indican que se detectó la diana viral cuando las muestras de origen contenían 10 copias/ml del ARN viral significaron que el ensayo detectó 5 copias del ARN viral. En particular, las reacciones que amplificaron los ácidos nucleicos en la región 3000 y la región no codificante 3’ dieron de manera ventajosa lecturas de % de CV bajo, lo que indica altos niveles de precisión en las reacciones de amplificación.

Tabla 19

Los resultados en la tabla 19 mostraron que los ensayos para amplificar y detectar secuencias en las regiones 3000 y no codificante 3’ del virus del Nilo occidental detectaron la cepa de Uganda de la diana de ARN viral hasta 15 copias/reacción, o menos, sin dar ningún resultado falso positivo. Estos descubrimientos fueron consistentes con los resultados presentados en la tabla 18.

Para ilustrar adicionalmente cómo los oligonucleótidos descritos en la presente memoria descriptiva podrían combinarse para producir ensayos altamente sensibles, se utilizaron diferentes combinaciones de oligonucleótidos de captura, cebadores y una sonda para amplificar y detectar la cepa de Uganda del virus del Nilo occidental. Se utilizaron procedimientos similares a los descritos anteriormente, excepto porque se utilizaron oligonucleótidos de captura que incluían las secuencias complementarias a la diana de la SEQ ID NO: 117, la SEQ ID NO: 134 y la SEQ ID NO: 128, el promotor-cebador de la SEQ ID NO: 85 incluía la secuencia complementaria a la diana de la SEQ ID NO: 76, el cebador de cadena opuesta tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 64, y se utilizó como sonda el oligonucleótido descrito anteriormente que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 111. Además, las muestras que contenían 3, 1, 0,3 y 0,1 copias/ml del virus se analizaron en 20 repeticiones para generar datos para cuantificar con precisión la sensibilidad del ensayo. Se utilizó el análisis de regresión utilizando la función Probit en el software SAS® System (versión 8.02) (Cary, Carolina del Norte) para calcular los niveles de detección del 95 % y el 50 %. Las reacciones no válidas no se volvieron a probar y no se incluyeron en el análisis de sensibilidad analítica.

Tabla 20

Los resultados presentados en la tabla 20 mostraron nuevamente que la cepa de Uganda del virus del Nilo occidental se detectó con una sensibilidad excelente en el ensayo amplificado. Más específicamente, el análisis de los resultados predijo una detección del 95 %, utilizando el ensayo de amplificación de ácido nucleico y el sistema de detección de punto final, hasta, aproximadamente, 7-13 copias virales/ml, una cantidad correspondiente a, aproximadamente, 4-7 copias/reacción.

Para ilustrar de forma adicional la versatilidad de los sistemas de detección de analitos descritos anteriormente, se supervisó la producción de amplicones en función del tiempo en los procedimientos de amplificación en “tiempo real”. Las balizas moleculares específicas de amplicón que se incluyeron en las reacciones de amplificación proporcionaron un medio para la supervisión continua de la síntesis de amplicones. Las emisiones fluorescentes que aumentaron con el tiempo indicaron la producción de amplicones que se hibridaron con la baliza molecular y provocaron una transición detectable a la conformación “abierta” de la sonda.

Las balizas moleculares comprenden moléculas de ácido nucleico que tenían una secuencia complementaria a la diana, un par de afinidad (o “brazos” de ácido nucleico) que interactúan para formar una estructura de “tallo” mediante el emparejamiento de bases complementarias en ausencia de una diana (es decir, la conformación “cerrada”), y un par de marcadores que interactúan cuando la sonda está en la conformación cerrada. Aquellos que tengan un nivel normal de experiencia en la técnica entenderán que la secuencia de complemento de la diana contenida dentro de la estructura de una baliza molecular está generalmente en forma de una región de “bucle” monocatenario de la sonda. La hibridación del ácido nucleico diana y la secuencia complementaria a la diana de la sonda hace que los miembros del par de afinidad se separen, cambiando de esta manera la sonda a la conformación abierta. Este cambio es detectable en virtud de la interacción reducida entre los miembros del par marcador, que pueden ser, por ejemplo, un fluoróforo y un desactivador. Las balizas moleculares se describen completamente en la Patente US5,925,517.

Se utilizó software disponible en el mercado para analizar los resultados dependientes del tiempo obtenidos utilizando balizas moleculares que eran específicas para amplicones derivados de: (1) la región no codificante 5’, (2) la región 3000 y (3) la región no codificante 3’. Los resultados de estos análisis indicaron una relación sustancialmente lineal entre el número de copias diana incluidas en una reacción de amplificación y el momento en el que la señal fluorescente excedió un umbral de fondo (es decir, “tiempo de aparición” por encima del fondo), tal como se ilustra en la figura 3. Tal como lo confirman los resultados presentados a continuación, estos procedimientos fueron útiles para cuantificar las cantidades de analito diana en un intervalo muy amplio. Más particularmente, cuando se utilizan cantidades conocidas de polinucleótidos de analito como patrones de calibración, es posible determinar la cantidad de analito presente en una muestra de prueba comparando el tiempo de aparición medido con el gráfico estándar.

El hecho de que la reacción de amplificación utilizada en los procedimientos descritos a continuación funcionara a temperatura constante y sin interrupción para una etapa de detección separada, de modo que la amplificación y la detección tuvieran lugar simultáneamente, imponía requisitos estrictos a las balizas moleculares. Más específicamente, el éxito en el procedimiento requirió que la baliza molecular se una al amplicón sin inhibir la utilización posterior del amplicón como plantilla en el mecanismo de amplificación exponencial. De hecho, el descubrimiento de que una reacción de amplificación podría desarrollarse eficazmente en presencia de una baliza molecular indicó que la interacción de la sonda con su diana no inhibía ni envenenaba irreversiblemente la reacción de amplificación.

El ejemplo 7 describe procedimientos en los que se utilizaron sondas de baliza molecular, cada una marcada con un par interactivo de fluoróforo/desactivador, para supervisar la producción de amplicones dependiente del tiempo en reacciones de TMA. Aunque las balizas moleculares descritas en este ejemplo se hibridaron con sólo una cadena del producto de ácido nucleico amplificado, también se esperaría que las secuencias de sonda complementarias se hibridaran con la cadena de ácido nucleico opuesta y, de este modo, estuvieran dentro del alcance de la presente invención.

Ejemplo 7

Supervisión en tiempo real de la producción de amplicones

Se sintetizaron balizas moleculares que tenían especificidad de unión para los diferentes amplicones de VNO mediante la química estándar de triéster de fosfito en fase sólida utilizando vidrio de poro controlado (CPG, del inglés controlled pore glass) unido en 3’ al desactivador y fosforamidita marcada con fluoróforo en 5' en un sintetizador automatizado EXPEDITE modelo 8909 de Perkin-Elmer (Foster City, California). Se utilizó fluoresceína como fluoróforo y DABCYL como desactivador para la construcción de las balizas moleculares. Todas las balizas moleculares se construyeron utilizando análogos de 2'-metoxi nucleótidos. Los reactivos CPG y fosforamidita se adquirieron de Glen Research Corporation (Sterling, Virginia). Después de la síntesis, las sondas se desprotegieron y se escindieron de la matriz de soporte sólido mediante tratamiento con hidróxido de amonio concentrado (30 %) durante dos horas a 60 °C. A continuación, las sondas se purificaron utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida seguida de HPLC utilizando procedimientos estándar que serán familiares para aquellos que tengan un nivel normal de experiencia en la técnica.

Las dianas de ácido nucleico utilizadas en los procedimientos de amplificación en tiempo real fueron transcritos de ARN sintetizados in vitro de concentración conocida. Las tres dianas de VNO sintetizadas in vitro (una diana de la región no codificante 5’, una diana de la región 3000 y una diana de la región no codificante 3’) contenían porciones del genoma de VNO que incluían secuencias correspondientes o complementarias a cada uno de los cebadores. Se utilizaron balizas moleculares a un nivel de, aproximadamente, 0,2 pmoles/pl (4 pmoles/reacción). Las reacciones para amplificar los ácidos nucleicos de VNO se llevaron a cabo utilizando desde un mínimo de 1,5 x 101 copias de plantilla/reacción hasta un máximo de 5 x 109 copias de plantilla/reacción.

Los tubos, que contenían 15 pl de una solución tamponada que incluía sales y reactivos, esencialmente tal como se ha descrito en el ejemplo 2, un polinucleótido diana y una baliza molecular, se cubrieron en primer lugar con 15 pl de aceite inerte para evitar la evaporación. A continuación, los tubos se incubaron en un bloque de calor seco durante 10 minutos a 60 °C para facilitar la hibridación del cebador. Los cebadores para amplificar la región no codificante 5’ de la diana de VNO tenían las secuencias complementarias a la diana de la SEQ ID NO: 28 (que estaba contenida dentro de la secuencia del promotor-cebador de la SEQ ID NO: 40) y la SEQ ID NO: 10. Los cebadores para amplificar la región 3000 de la diana de VNO tenían las secuencias complementarias a la diana de la SEQ ID NO: 53 (que estaba contenida dentro de la secuencia del promotor-cebador de la SEQ ID NO: 56) y la SEQ ID NO: 47. Los cebadores para amplificar la región no codificante 3’ de la diana de VNO tenían las secuencias complementarias a la diana de la SEQ ID NO: 76 (que estaba contenida dentro de la secuencia del promotor-cebador de la SEQ ID NO: 85) y tanto la SEQ ID NO: 64 como la SEQ ID NO: 68. Después de la etapa de incubación a 60 °C, los tubos se transfirieron a un bloque de calor a 42 °C y a continuación, se incubaron durante 10 minutos. Se añadieron a cada uno de los tubos alícuotas de cinco microlitros de un reactivo enzimático que incluía las enzimas tanto transcriptasa inversa del MMLV como ARN polimerasa T7 utilizando una pipeta de repetición. Los tubos se agitaron en vórtice brevemente y, a continuación, se transfirieron a un rotor ROTORGENE-2000 (Corbett Research; Sydney, Australia) que se había precalentado a 42 °C. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo a 42 °C, se tomaron lecturas de fluorescencia cada 30 segundos y los resultados se analizaron en tiempo real utilizando un software estándar que se incluyó con el instrumento ROTORGENE-2000.

Amplificación en la región 5’ no complementaria

La tabla 21 presenta las secuencias complementarias a la diana del VNO contenidas en las porciones de bucle de balizas moleculares que se utilizaron para supervisar la producción de amplicones correspondientes a la región no codificante 5’. De manera particular, la novena posición (ocupada por un residuo A) de la secuencia de bucle complementario a la diana de la SEQ ID NO: 158 no coincidió con el producto amplicón de la cepa de Uganda del virus del Nilo occidental. Todas las balizas moleculares específicas del VNO utilizadas en el procedimiento tenían secuencias complementarias a la diana que incluían entre 13 y 15 nucleótidos contiguos contenidos en las secuencias de la SEQ ID NO: 93 y la SEQ ⁱD NO: 95, que permitía la presencia de equivalentes de ARN y ADN. Las secuencias complementarias a la diana presentadas en la tabla 21 se incorporaron independientemente en las regiones de bucle de balizas moleculares.

Tabla 21

Las secuencias completas de las balizas moleculares que contenían las secuencias complementarias al VNO presentadas en la tabla 21 aparecen en la tabla 22. Con la excepción de la SEQ ID NO: 162, cada una de las balizas moleculares incluía una secuencia de brazo CCGAG 5’ y una secuencia de brazo CUCGG 3’ anexa a una secuencia complementaria a la diana del VNO que aparece en la tabla 21. La baliza molecular que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 162 incluía una secuencia de brazo GGCAC 5’ y una secuencia de brazo GUGCC 3’ anexa a la porción de bucle de la sonda. De manera particular, la porción de bucle de la baliza molecular que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 161 incluía una secuencia complementaria a la diana del VNO y un único residuo C anexo al 3’ de la misma, que no era complementaria a la diana del VNO. En todos los casos, las secuencias complementarias al VNO se situaron como regiones de bucle dentro de las estructuras de la baliza molecular. De este modo, la última posición (ocupada por un residuo C) de la secuencia de bucle de la baliza molecular que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 161 no coincidió con la secuencia diana del amplicón, y la novena posición de la secuencia de bucle (ocupada por un residuo A) en la baliza molecular que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 163 se emparejó erróneamente con el producto amplicón de la cepa de Uganda del virus del Nilo occidental. Cada una de las balizas moleculares utilizadas en el procedimiento incluía un fluoróforo de fluoresceína en su extremo 5’ y un resto desactivador DABCYL en su extremo 3’. Las secuencias correspondientes a estructuras de brazos complementarios se representan mediante subrayado en la tabla 22.

Tabla 22

Los resultados presentados en las tablas 23-25 confirmaron que las reacciones de amplificación que incluían una de las balizas moleculares específicas de VNO producían, de manera deseable, una señal fluorescente que aumentaba con el tiempo hasta alcanzar un nivel umbral de detectabilidad. Debido a que se utilizaron diferentes cantidades de plantilla de VNO para probar las diversas sondas en diferentes procedimientos, los resultados de estos procedimientos se presentan en tablas separadas bajo las cuales se agrupan cantidades diana similares. Todos los resultados se basaron en reacciones que se llevaron a cabo por duplicado o triplicado. Con la excepción de una única baliza molecular probada en este procedimiento (datos no mostrados), cada una de las sondas dio, como mínimo, algún nivel de detección de analito dependiente del tiempo. No se intentó verificar la integridad del marcado fluorescente o la síntesis de la sonda en el caso de la sonda no funcional, por lo que no se determinó la razón por la que esta sonda no dio buenos resultados.

De manera significativa, las diferentes balizas moleculares probadas en el procedimiento se comportaron de manera algo diferente en el formato de ensayo en tiempo real. Por ejemplo, las reacciones que incluían una baliza molecular que tenía la secuencia complementaria a la diana de la SEQ ID NO: 155 dieron una detección extremadamente rápida de números elevados de diana y una fuerte relación lineal entre la señal fluorescente y la cantidad diana en un gráfico logarítmico sobre el intervalo completo de niveles de entrada de diana probados (véase la figura 3). Los coeficientes de variación (CV) para las lecturas de tiempo de aparición obtenidas utilizando esta sonda (véase la tabla 23) fueron del 3,3 % o menos, lo que indica niveles muy elevados de precisión entre los puntos de datos. Las reacciones que incluían una baliza molecular que tenía la secuencia complementaria a la diana de la SEQ ID NO: 158 exhibieron una cinética de detección algo más lenta, pero de manera ventajosa fueron capaces de distinguir entre sí niveles bajos de diana (véase la tabla 24). Estas características de las sondas se reprodujeron cuando se llevaron a cabo reacciones en paralelo utilizando balizas moleculares que contenían las secuencias complementarias a la diana de la SEQ ID NO: 155 y la SEQ ID NO: 158. Tal como se indica en la tabla 24, 32,2 minutos distinguieron el tiempo de aparición para las reacciones que incluían 15 y 1,5 x 107 copias de la plantilla de VNO, y 10,7 minutos distinguieron completamente el tiempo de aparición para las reacciones que incluyeron 15 y 150 copias de la plantilla de VNO cuando se utilizó la baliza molecular que contenía la secuencia complementaria al VNO de la SEQ ID NO: 158. Debería ser evidente que la pendiente de la línea que relaciona el número de copias de la diana y el tiempo de aparición utilizando esta sonda fue particularmente ventajosa en el intervalo de niveles de diana bajo. Las reacciones que incluían una baliza molecular que tenía la secuencia complementaria a la diana de la SEQ ID NO: 157 produjeron una relación sustancialmente lineal entre el número de copias de entrada de la diana y el tiempo de aparición, pero exhibieron una pendiente algo más plana en comparación con la sonda que incluía la secuencia complementaria a la diana de la SEQ ID NO: 158. Las reacciones que incluían una baliza molecular que tenía la secuencia complementaria a la diana de la SEQ ID NO: 156 se llevaron a cabo utilizando niveles de la diana de VNO tan bajos como, aproximadamente, 4 copias/reacción (véase la tabla 25), y exhibieron una fuerte relación lineal, aunque de nuevo algo plana, entre el tiempo de aparición medido y el número de copias de la diana en el intervalo de 4 - 4,23x103 en un gráfico, tal como el que se ilustra en la figura 3. De hecho, una diferencia de casi 6 minutos distinguió las mediciones del tiempo de aparición para las reacciones llevadas a cabo en estos extremos cuando se utilizó una sonda que comprendía la secuencia complementaria a la diana de la SEQ ID NO: 156.

Tabla 23

Tabla 24

Tabla 25

Amplificación en la región 3000

La tabla 26 presenta las secuencias complementarias a la diana del VNO contenidas en las porciones de bucle de balizas moleculares que se utilizaron para supervisar la producción de amplicones correspondientes a la región 3000. Todas las balizas moleculares específicas de VNO tenían secuencias complementarias a la diana que incluían de 10 a 20 bases contiguas contenidas en la SEQ ID NO: 99, que permitían la presencia de análogos de nucleótidos y equivalentes de ARN y ADN. Las secuencias complementarias a la diana presentadas en la tabla 26 se incorporaron independientemente en las regiones de bucle de balizas moleculares.

Tabla 26

Las secuencias completas de las balizas moleculares que contenían las secuencias complementarias al VNO presentadas en la tabla 26 aparecen en la tabla 27. Cada una de las balizas moleculares incluía una secuencia de brazo CCGAG 5’ y una secuencia de brazo CUCGG 3’ anexa a su secuencia complementaria a la diana del VNO. Además, cada una de las balizas moleculares utilizadas en el procedimiento incluía un fluoróforo de fluoresceína en su extremo 5’ y un resto desactivador DABCYL en su extremo 3’. Las secuencias correspondientes a estructuras de brazos complementarios se representan en la tabla 27 mediante subrayado.

Tabla 27

Los resultados presentados en la tabla 28 confirmaron que las reacciones de amplificación que incluían una de las balizas moleculares específicas de VNO producían de manera deseable una señal fluorescente que aumentaba con el tiempo hasta alcanzar un nivel umbral de detectabilidad. Nuevamente, las diferentes balizas moleculares se comportaron de manera algo diferente en el formato de ensayo en tiempo real. Por ejemplo, las reacciones que incluían una baliza molecular que tenía la secuencia complementaria a la diana de la SEQ. ID NO:167 proporcionaron una cinética de detección extraordinariamente rápida y una fuerte relación lineal entre la señal fluorescente y la cantidad de diana en un gráfico logarítmico sobre el intervalo completo de niveles de entrada de diana probados. Los coeficientes de variación (CV) para las lecturas de tiempo de aparición obtenidas utilizando esta sonda fueron del 1,8 % o menos, lo que indica niveles muy elevados de precisión entre los puntos de datos. Las reacciones que incluían una baliza molecular que tenía la secuencia complementaria a la diana de la SEQ ID NO: 165 exhibieron diferentes características de respuesta que eran algo menos lineales en todo el intervalo de niveles de entrada de diana probados. Sin embargo, se descubrió que el ajuste de curva convencional de los resultados numéricos obtenidos utilizando esta sonda produjo una curva que tenía un valor R2 mayor que 0,99 con una pendiente que era sustancialmente mayor en niveles bajos de entrada de diana, en comparación con niveles elevados de entrada de diana. Esto permitió de manera ventajosa una cuantificación más precisa de pequeñas diferencias entre números bajos de copias de diana.

Tabla 28

Amplificación en la región no codificante 3’

La tabla 29 presenta las secuencias complementarias a la diana del VNO contenidas en las porciones de bucle de balizas moleculares que se utilizaron para supervisar la producción de amplicones correspondientes a la región no codificante 3’. Las secuencias complementarias a la diana contenidas dentro de las balizas moleculares probadas en este procedimiento incluían 12-18 nucleótidos contiguos contenidos dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 101, más preferentemente, dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 102 o, aún más preferentemente, dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 103 o dentro de la secuencia de TAGACGGTGCTGCCTGCG (SEQ ID NO: 178), que permitía la presencia de análogos de nucleótidos y equivalentes de ARN y ADN.

Las secuencias complementarias a la diana presentadas en la tabla 29 se incorporaron independientemente en las regiones de bucle de balizas moleculares.

Tabla 29

Las secuencias completas de las balizas moleculares que contenían las secuencias de bucle complementarias al VNO presentadas en la tabla 29 aparecen en la tabla 30. Cada una de las balizas moleculares incluía una secuencia de brazo CCGAG 5’ y una secuencia de brazo CUCGG 3’ anexa a su secuencia complementaria a la diana del VNO. Además, cada una de las balizas moleculares utilizadas en el procedimiento incluía un fluoróforo de fluoresceína en su extremo 5’ y un resto desactivador DABCYL en su extremo 3’.

Tabla 30

Los resultados presentados en la tabla 31 confirmaron de nuevo que las reacciones de amplificación que incluían una de las balizas moleculares específicas de VNO producían, de manera deseable, una señal fluorescente que aumentaba con el tiempo hasta alcanzar un nivel umbral de detectabilidad. En particular, algunos de los resultados presentados en la tabla 31 se obtuvieron en diferentes experimentos. No obstante, debe quedar claro que algunas de las sondas, tales como la que incluyó la secuencia complementaria a la diana de la SEQ ID NO: 182, detectaron de manera ventajosa la diana del VNO con cinética rápida, mientras que otras sondas, tales como la que incluyó la secuencia complementaria a la diana de la SEQ ID NO: 179, exhibieron una cinética de detección más lenta. Cada especie de sonda será útil en una aplicación particular diferente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Sonda de ensayo de hibridación para detectar un ácido nucleico del Virus del Nilo occidental (VNO), que comprende: una secuencia de sonda que comprende una secuencia de bases nucleotídicas complementaria a la diana y, opcionalmente, una o más secuencias de bases nucleotídicas que no son complementarias a dicho ácido nucleico que se va a detectar, en la que dicha secuencia de bases nucleotídicas complementaria a la diana consiste en 18-22 bases nucleotídicas contiguas contenidas dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 103 o el complemento de la misma, permitiendo la presencia de equivalentes de ARN y ADN, análogos de nucleótidos y hasta un 10 % de diferencias de bases nucleotídicas, y en la que dicha sonda de ensayo de hibridación tiene una longitud de hasta 22 bases nucleotídicas.

2. Sonda de ensayo de hibridación, según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de sonda se selecciona entre el grupo que consiste en la s Eq ID NO: 106, la SEQ ID NO: 107, la SEQ ID NO: 108, la SEQ ID NO: 109, la SEQ ID NO: 110, la SEQ ID NO: 111 y la SEQ ID NO: 114.

3. Sonda de ensayo de hibridación, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicha sonda de ensayo de hibridación comprende dicha una o más secuencias de bases nucleotídicas opcionales que no son complementarias a dicho ácido nucleico que se va a detectar.

4. Sonda de ensayo de hibridación, según la reivindicación 3, que comprende, además, un marcador detectable.

5. Sonda de ensayo de hibridación, según la reivindicación 4, en la que dicho marcador detectable se selecciona entre el grupo que consiste en un marcador quimioluminiscente y un marcador fluorescente.

6. Sonda de ensayo de hibridación, según la reivindicación 3, que comprende, además, un resto fluoróforo y un resto desactivador, siendo dicha sonda de ensayo de hibridación una baliza molecular.

7. Sonda de ensayo de hibridación, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicha secuencia de sonda no comprende dicha una o más secuencias de bases nucleotídicas opcionales que no son complementarias a dicho ácido nucleico que se va a detectar.

8. Procedimiento para detectar un ácido nucleico del VNO que comprende:

(i) poner en contacto una muestra de prueba con la sonda de ensayo de hibridación, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en condiciones de hibridación rigurosas, formando de esta manera un dúplex sonda:diana que es estable para la detección; y

(ii) determinar si el híbrido está presente en la muestra de prueba como una indicación de la presencia o ausencia de ácidos nucleicos del VNO en la muestra de prueba.

9. Procedimiento, según la reivindicación 8, que comprende, además, detectar el dúplex sonda:diana.

10. Procedimiento, según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que la muestra de prueba es una muestra biológica seleccionada entre sangre, suero, plasma u otro fluido o tejido corporal.

11. Kit que contiene la sonda de ensayo de hibridación, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y que incluye, opcionalmente, cebadores u otros oligonucleótidos auxiliares para amplificar el ácido nucleico diana del VNO que se va a detectar.

12. Kit, según la reivindicación 11, que contiene un par de cebadores oligonucleotídicos para amplificar ácidos nucleicos diana en una reacción de amplificación in vitro.

13. Kit, según la reivindicación 12, que incluye un primer y un segundo oligonucleótidos de amplificación que son complementarios a cadenas opuestas de una secuencia de ácido nucleico del VNO que se va a amplificar.

14. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que contiene, además, oligonucleótidos de captura para purificar ácidos nucleicos plantilla del VNO de otras especies antes de la amplificación.

15. Utilización de la sonda de ensayo de hibridación, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o del kit, según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, para detectar ácido nucleico del VNO.