ES2887076T3 - Terapia génica para trastornos neurometabólicos - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un vector de virus adenoasociado (vector de AAV) que tiene una cápside de serotipo 1 y que codifica una esfingomielinasa ácida, para uso en un método para tratar la enfermedad de Niemann Pick A en un mamífero, en donde el método comprende administrar la composición a los núcleos cerebelosos profundos del sistema nervioso central del mamífero, de modo que el vector haga contacto con un extremo axónico, en donde el vector transduce una célula ubicada en un sitio distal en el sistema nervioso central, y en donde la esfingomielinasa ácida codificada se traduce.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia génica para trastornos neurometabólicos

La presente solicitud reivindica la prioridad en virtud del título 35 del Código de los Estados Unidos, § 119(e) de la solicitud provisional de los EE. UU. núm. 601677.057, presentada el 2 de mayo de 2005, y la solicitud provisional de los EE. UU. núm. 601605.800, presentada el 31 de mayo de 2005.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con composiciones y métodos para tratar trastornos que afectan al sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés) y en particular, la médula espinal. La invención se relaciona, además, con composiciones que comprenden vectores víricos tales como vectores de virus adenoasociado (AAV, por sus siglas en inglés), y métodos de administración de estas.

Antecedentes de la invención

Un grupo de trastornos metabólicos conocidos como enfermedades de almacenamiento lisosómico (LSD, por sus siglas en inglés) incluye más de cuarenta trastornos genéticos, muchos de los cuales implican defectos genéticos en diversas hidrolasas lisosómicas. Las enfermedades de almacenamiento lisosómico representativas y las enzimas defectuosas asociadas se indican en la Tabla 1.

Tabla 1

La característica distintiva de la LSD es la acumulación anormal de metabolitos en los lisosomas, lo que conduce a la formación de grandes cantidades de lisosomas distendidos en el pericarion. Uno de los principales retos al tratar la LSD (a diferencia de tratar una enzimopatía específica del hígado) es la necesidad de revertir la patología de almacenamiento lisosómico en múltiples tejidos separados. Algunas LSD se pueden tratar de manera eficaz mediante infusión intravenosa de la enzima faltante, conocida como terapia reemplazo enzimático (ERT, por sus siglas en inglés). Por ejemplo, los pacientes con Gaucher tipo 1 presentan solo enfermedad visceral y responden favorablemente a la ERT con glucocerebrosidasa recombinante (Cerezyme®, Genzyme Corp.). Sin embargo, los pacientes con enfermedad metabólica que afecta al SNC (p. ej., enfermedad de Gaucher tipo 2 o 3) no responden a la ERT intravenosa porque la barrera hematoencefálica (BBB, por sus siglas en inglés) impide que la enzima de reemplazo ingrese al cerebro. Además, los intentos de introducir una enzima de reemplazo en el cerebro mediante inyección directa no han tenido éxito, en parte, debido a la citotoxicidad enzimática a altas concentraciones locales (observaciones no publicadas) y tasas de difusión parenquimatosa limitadas en el cerebro (Pardridge, Peptide Drug Delivery to the Brain, Raven Press, 1991).

La enfermedad de Alzheimer (AD, por sus siglas en inglés) es un trastorno que afecta al sistema nervioso central (CNS) caracterizado por la acumulación de péptido p-amiloide (Ap) debido al catabolismo disminuido de Ap. A medida que el Ap se acumula, se aglomera en placas extracelulares, lo que provoca la alteración de la función sinóptica y la pérdida de neuronas. La patología conduce a demencia, pérdida de la coordinación y la muerte.

La terapia génica es una modalidad de tratamiento emergente para trastornos que afectan al CNS, incluidas LSD y la enfermedad de Alzheimer. En esta estrategia, la restauración de la vía metabólica normal y la corrección de la patología se producen al transducir células afectadas con un vector que lleva una versión sana o una versión modificada del gen.

La terapia génica en el CNS ha sido facilitada por el desarrollo de vectores víricos capaces de infectar de manera eficaz neuronas posmitóticas. Para acceder a una revisión de los vectores víricos para el suministro génico al CNS, ver Davidson et al. (2003) Nature Rev., 4:353-364. Los vectores de virus adenoasociado (AAV) se consideran óptimos para la terapia génica en el CNS debido a que tienen un perfil de toxicidad e inmunogenicidad favorable, son capaces de transducir células neuronales y son capaces de mediar la expresión a largo plazo en el CNS (Kaplitt et al. (1994) Nat. Genet., 8:148-154; Bartlett et al. (1998) Hum. Gene Ther., 9:1181-1186; y Passini et al. (2002) J. Neurosci., 22:6437-6446);

Un producto de transgén terapéutico, p. ej., una enzima, se puede secretar mediante células transducidas y posteriormente ser captado por otras células, en las que después alivia la patología. Este proceso se conoce como corrección cruzada (Neufeld et al. (1970) Science, 169:141-146). Sin embargo, la corrección de la patología, tal como la patología de almacenamiento en el contexto de LSD, típicamente está confinada a los alrededores cercanos al sitio de la inyección debido a la difusión parenquimatosa limitada del vector inyectado y del producto de transgén secretado (Taylor et al. (1997) Nat. Med., 3:771-774; Skorupa et al. (1999) Exp. Neurol., 160:17-27). Por lo tanto, la neuropatología que afecta a múltiples regiones cerebrales requiere un suministro de vector extendido, al usar múltiples inyecciones distribuidas espacialmente, especialmente en un cerebro grande tal como el humano. Esto aumenta significativamente el riesgo de daño cerebral. Además, puede ser difícil acceder quirúrgicamente a algunas regiones del cerebro. Por lo tanto, serían beneficiosos otros modos de transporte de vectores dentro del CNS, además de la difusión.

Cuando se administran a los extremos axónicos, algunos virus se internalizan y transportan retrógradamente a lo largo del axón hasta el núcleo. Las neuronas en una región cerebral están interconectadas mediante axones a las regiones cerebrales distales y proporcionan así un sistema de transporte para el suministro de vectores. Estudios con adenovirus, HSV y virus de la seudorrabia han utilizado las propiedades de transporte de estos virus para suministrar genes a estructuras distales dentro del cerebro (Soudas et al. (2001) FASEB J., 15:2283-2285; Breakefield et al. (1991) New Biol., 3:203-218; y deFalco et al. (2001) Science, 291:2608-2613).

Varios grupos han notificado que la transducción del cerebro mediante el serotipo 2 de AAV (AAV2, por sus siglas en inglés) se limita al sitio de la inyección intracraneal (Kaplitt et al. (1994) Nat. Genet., 8:148-154; Passini et al. (2002) J. Neurosci., 22:6437-6446; y Chamberlin et al. (1998) Brain Res., 793:169-175). Un informe reciente sugiere que el transporte axónico retrógrado de AAV2 también puede producirse en circuitos selectos del cerebro de rata normal (Kaspar et al. (2002) Mol. Ther., 5:50-56). Sin embargo, se desconoce cuáles parámetros específicos fueron responsables del transporte axónico observado y si se produciría un transporte axónico suficiente y eficaz en una neurona enferma que está en un estado de disfunción celular. De hecho, se ha notificado que lesiones observadas en neuronas con LSD interfieren o incluso bloquean el transporte axónico (revisado en Walkley (1998) Brain Pathol., 8:175-193), lo que sugiere que las neuronas comprometidas por la enfermedad no soportarían el transporte de AAV a lo largo de sus axones.

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de desarrollar nuevos métodos terapéuticos para tratar trastornos metabólicos que afectan al CNS.

Compendio de la invención

La descripción en la presente memoria se relaciona con métodos y composiciones para tratar o prevenir trastornos metabólicos, tales como enfermedades de almacenamiento lisosómico (LSD) o función de almacenamiento de colesterol anormal que se caracterizan por o se asocian con un riesgo de diminución de la función del CNS.

La descripción en la presente memoria también se relaciona con métodos y composiciones para tratar o prevenir trastornos que afectan al sistema nervioso central (CNS), tales como la enfermedad de Alzheimer, que se caracterizan por o se asocian con un riesgo de diminución de la función del CNS.

La descripción en la presente memoria se relaciona, además, con métodos para el suministro dirigido mínimamente invasivo de un transgén a regiones seleccionadas en el cerebro de un sujeto afectado.

La presente invención proporciona una composición que comprende un vector de virus adenoasociado (vector de AAV) que tiene una cápside de serotipo 1 y que codifica una esfingomielinasa ácida, para uso en un método para tratar la enfermedad de Niemann Pick A en un mamífero, en donde el método comprende administrar la composición a los núcleos cerebelosos profundos del sistema nervioso central del mamífero, de modo que el vector haga contacto con un extremo axónico, en donde el vector transduce una célula ubicada en un sitio distal en el sistema nervioso central, y en donde se traduce la esfingomielinasa ácida codificada. Se establecen aspectos y realizaciones adicionales de la presente invención en las reivindicaciones adjuntas.

Las ventajas adicionales de la invención se establecerán, en parte, en la siguiente descripción y se entenderán, en parte, a partir de la descripción, o pueden aprenderse al poner en práctica la invención.

Se administró a ratones con esfingomielinasa ácida (ASM, por sus siglas en inglés) inactivada, un modelo de la enfermedad de Niemann-Pick Tipo A, un vector de AAV2 que llevaba el gen de ASM humano (AAV-ASM) mediante una única inyección intracraneal en un hemisferio del cerebro. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento y la demostración de que la inyección de AAV-ASM de alto valor cuantitativo en el cerebro enfermo da como resultado la expresión de AAV-ASM en múltiples sitios distales en un patrón en consonancia con la organización topográfica de las neuronas de proyección que inervan el sitio de la inyección. La invención se basa, además, en parte, en el descubrimiento y la demostración de la corrección extendida de la patología de almacenamiento lisosómico en el sitio de la inyección y sitios distales a los que se transporta AAV-ASM y donde se expresa ASM.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para corregir la patología de almacenamiento de colesterol e iniciar la recuperación funcional en el ratón ASMKO después de la inyección unilateral, o alternativamente, bilateral dentro de los núcleos cerebelosos profundos.

La descripción proporciona, además, los métodos indicados anteriormente en donde el transgén se suministra en un vector de AAV recombinante seleccionado del grupo que consiste en el serotipo AAV3/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7 y AAV2/8. En la composición de la invención, el vector de AAV tiene una cápside de serotipo 1. Solo con fines ilustrativos, los vectores recombinantes codifican proteína ASM humana funcional en un modelo de ratón.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención se relaciona con métodos para tratar trastornos neurometabólicos en mamíferos. Las poblaciones tratadas mediante los métodos de la descripción incluyen, pero no se limitan a, pacientes que padecen o están en riesgo de desarrollar una LSD, tales como trastornos indicados en la Tabla 1, particularmente, si dicha enfermedad afecta al CNS. En la presente invención, la enfermedad es enfermedad de Niemann-Pick A. También se describen en la presente memoria instancias en donde la enfermedad es enfermedad de Niemann-Pick A y/o la patología de almacenamiento de colesterol secundaria asociada comúnmente con NPA.

En un aspecto, los métodos descritos incluyen administrar al CNS de un sujeto afectado un vector vírico de AAV que lleva un transgén que codifica un producto terapéutico y permitir que el transgén se exprese dentro del CNS distalmente desde el sitio de administración a un nivel terapéutico. Además, el vector puede comprender un polinucleótido que codifica una molécula biológicamente activa eficaz para tratar el trastorno del CNS. Dichas moléculas biológicamente activas pueden comprender péptidos que incluyen, pero no se limitan a, versiones naturales o mutadas de proteínas de longitud completa, versiones naturales o mutadas de fragmentos de proteínas, polipéptidos, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos sintéticos tales como moléculas Fab'. Las moléculas biológicamente activas también pueden comprender nucleótidos que incluyen polinucleótidos de ADN monocatenarios o bicatenarios y polinucleótidos de ARN monocatenarios o bicatenarios. Para acceder a una revisión de tecnologías de nucleótido ilustrativas que se pueden usar para poner en práctica los métodos descritos en la presente memoria, ver Kurreck, (2003) J., Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 [tecnologías antisentido]; Yu et al., (2002) PNAS 99(9), 6047­ 6052 [tecnologías de interferencia por ARN]; y Elbashir et al., (2001) Genes Dev., 15(2):188-200 [tecnología de ARNip].

En una realización ilustrativa, la administración se logra mediante inyección intraparenquimatosa directa de una disolución de vector de AAV de alto valor cuantitativo en el cerebro enfermo. A continuación, el transgén se expresa distalmente, contralateralmente o ipsilateralmente, con respecto al sitio de la administración a un nivel terapéutico de al menos 2, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 mm desde el sitio de la administración.

En otro aspecto, la descripción se relaciona con un método para suministrar un genoma de AAV recombinante al núcleo de una neurona afectada por una enfermedad in vivo. En algunas instancias, la patología celular exhibida por la neurona es la de una enfermedad de almacenamiento lisosómico tal como los trastornos indicados en la Tabla 1. En la presente invención, la enfermedad es enfermedad de Niemann-Pick A. En algunas instancias de las descripciones, la patología celular exhibida es la de la enfermedad de Alzheimer. El método para suministrar un genoma de AAV recombinante al núcleo de una neurona afectada por una enfermedad comprende poner en contacto un extremo axónico de la neurona afectada por la enfermedad con una composición que comprende una partícula vírica de AAV que comprende el genoma de AAV recombinante y permitir que la partícula vírica sea endocitosada y retrógradamente transportada intracelularmente a lo largo del axón hasta el núcleo de la neurona. La concentración del vector en la composición es al menos: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x109 tu/ml); o (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1010 iu/ml). En ciertas realizaciones, la neurona es una neurona de proyección y/o la distancia del extremo axónico al núcleo de la neurona es de al menos 2, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mm.

La presente descripción se relaciona con métodos y composiciones para suministrar un transgén a la región de la médula espinal y/o el tronco encefálico de un sujeto al administrar un vector vírico neurotrópico recombinante que contiene el transgén a al menos una región de la región de los núcleos cerebelosos profundos (DCN, por sus siglas en inglés) del cerebro del sujeto. El suministro vírico se hace en condiciones que favorecen la expresión del transgén en la región de la médula espinal y/o el tronco encefálico. En la presente invención, la enfermedad es enfermedad de Niemann-Pick A. En otras instancias, la patología celular exhibida es la de la enfermedad de Alzheimer.

En otro aspecto, la descripción se relaciona con métodos y composiciones para suministrar un transgén a la médula espinal de un sujeto al administrar un vector vírico neurotrópico recombinante que contiene el transgén a la región de la corteza motora del cerebro del sujeto. El suministro del vector vírico se hace en condiciones que favorecen la expresión del transgén en la médula espinal. Las motoneuronas internalizan los vectores víricos administrados a la región de la corteza motora a través de su región de soma y se expresa el transgén. El transgén expresado después puede someterse a transporte anterógrado hasta la porción terminal del axón de la motoneurona, que está presente en la médula espinal. Debido a la naturaleza de la corteza motora, los vectores víricos administrados a esta región del cerebro también pueden ser internalizados por terminales del axón de motoneuronas. El vector vírico también puede someterse a transporte retrógrado a lo largo del axón de la motoneurona y expresarse en el soma de la motoneurona. En la presente invención, la enfermedad es enfermedad de Niemann-Pick A. En otras instancias, la patología celular exhibida es la de la enfermedad de Alzheimer.

En otro aspecto, la descripción se relaciona con un método para suministrar un producto de transgén terapéutico a una célula diana del CNS, que es una neurona o una célula glial, en un mamífero afectado por un trastorno neurometabólico, p. ej., una LSD que afecta al CNS. El método incluye poner en contacto un extremo axónico de una neurona con una composición que contiene un vector de AAV que lleva al menos una parte de un gen que codifica un producto de transgén terapéutico, permitir que la partícula vírica sea endocitosada y retrógradamente transportada intracelularmente a lo largo del axón hasta el núcleo de la neurona; permitir que el producto de transgén terapéutico sea expresado y secretado por la neurona, y permitir que la célula diana capte el producto de transgén terapéutico, en donde el producto de transgén terapéutico alivia de este modo la patología en la célula diana. En ciertas realizaciones, la concentración del vector en la composición es al menos: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x109 tu/ml); o (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1010 iu/ml).

En los métodos descritos en la presente memoria, el transgén terapéutico codifica una molécula biológicamente activa, cuya expresión en el CNS da como resultado una corrección al menos parcial de la neuropatología. En algunas instancias, el producto de transgén terapéutico es una hidrolasa lisosómica. En la presente invención, la hidrolasa lisosómica es ASM. En otras instancias, el transgén terapéutico es una metaloendopeptidasa, p. ej., neprilisina.

Ha de comprenderse que tanto la descripción general que antecede como la descripción detallada que sigue son solamente ilustrativas y explicativas y no son restrictivas de la invención como se reivindica.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A ilustra una representación de una sección transversal del cerebro de ratón ASMKO, a las 5 o 15 semanas después de una inyección de 2 gl de AAV-ASM de alto valor cuantitativo (9,3 x 1012 gp/ml) en el hipocampo. El sitio de la inyección se muestra mediante una línea vertical; la expresión de ARNm de ASM, según se detecta mediate hibridación in situ, se representa por los círculos más pequeños; y la expresión de la proteína ASM, según se detecta mediante tinción inmunohistoquímica, se representa mediante los círculos sombreados más grandes. El patrón de expresión dio como resultado un área extendida de corrección de la patología (representada por el sombreado claro) en el hipocampo y las regiones de la corteza en ambos hemisferios del cerebro.

La Figura 1B ilustra el transporte axónico de AAV a regiones distales del cerebro de ratón después de una inyección de AAV de alto valor cuantitativo en el hipocampo como se describe para la Figura 1A. La inyección en el hipocampo (10) dio como resultado el transporte axónico del vector vírico a través del circuito intrahipocámpico hasta el hipocampo contralateral (20) y a través del circuito entorrinal dentado a la corteza entorrinal (30). El sitio de la inyección se muestra mediante una línea vertical.

La Figura 1C es un diagrama esquemático que muestra las conexiones de los circuitos intrahipocámpico y entorrinal dentado en el cerebro de ratón. La inyección en el hipocampo (10) da como resultado la infección y transducción de somas ubicados en el área de la asta de Amón 3 (CA3) y en la capa celular granular dentada (G). Además, un subconjunto del vector de AAV inyectado infecta los extremos axónicos de las neuronas de proyección que inervan el sitio de la inyección, se somete a transporte axónico retrógrado y suministra el transgén al campo CA3 (CA3) y el hilio (H) en la parte contralateral del hipocampo (20), e ipsilateralmente en la corteza entorrinal (30).

La Figura 2A ilustra una representación de una sección transversal del cerebro de ratón ASMKO, a las 5 o 15 semanas después de una inyección intrahipocámpica de AAV-ASM de alto valor cuantitativo como se describe en la Figura 1 A. La expresión de ARNm de ASM, según se detecta mediate hibridación in situ, se representa por los círculos más pequeños; y la expresión de la proteína ASM, según se detecta mediante tinción inmunohistoquímica, se representa mediante los círculos sombreados más grandes. La inyección dio como resultado que el ARNm y la proteína ASM se detectaron en el septo. Este patrón de expresión dio como resultado un área extendida de corrección de la patología (representada por el sombreado claro).

La Figura 2B ilustra el transporte axónico de AAV a regiones distales del cerebro de ratón, después de una inyección de alto valor cuantitativo en el hipocampo como se describe para la Figura 1 A. La inyección en el hipocampo (10) dio como resultado el transporte axónico del vector vírico a través del circuito septohipocámpico desde el sitio de la inyección (representado mediante una línea vertical) hasta el septo (40).

La Figura 2C es un diagrama esquemático que muestra las conexiones del circuito septohipocámpico. La inyección en el hipocampo dio como resultado la transducción a somas ubicados en el campo CA3 (11). Además, un subconjunto del vector de AAV infecta los extremos axónicos de las neuronas de proyección que inervan el sitio de la inyección, se somete a transporte axónico retrógrado y suministra el transgén al septo medial (40).

La Figura 3 ilustra el transporte axónico de AAV en el circuito nigroestriatal, después de una inyección de alto valor cuantitativo de AAV en el cuerpo estriado (50) del cerebro de ratón. El transporte axónico de AAV se produce desde el sitio de la inyección (representado mediante una línea vertical) hasta la sustancia negra (60).

La Figura 4 ilustra el transporte axónico de AAV en el circuito medulocerebeloso, después de una inyección de alto valor cuantitativo de AAV-ASM en el cerebelo (70) del cerebro de ratón ASMKO. El transporte axónico de AAV2 se produce desde el sitio de la inyección (representado mediante una línea vertical) hasta el bulbo raquídeo (80).

La Figura 5 ilustra el transporte axónico de AAV en los circuitos intrahipocámpico, nigroestriatal y entorrinal dentado después de una inyección de alto valor cuantitativo de AAV7-ASM en el hipocampo ipsilateral (10). Se detectaron células transducidas, según se determinó mediante hibridación in situ, a lo largo de todo el eje rostral-caudal del hipocampo contralateral (90), septo medial (40) y corteza entorrinal (100) después de la inyección de AAV7-ASM en el hipocampo ipsilateral (representado mediante una línea vertical).

Las Figuras 6A a 6E muestran la tinción inmunopositiva de ASM humana en secciones cerebelosas sagitales después de la inyección de diferentes vectores de serotipo de AAV [(A)2/1, (B)2/2, (C)2/5, (D)2/7 y (E)2/8] que codifican ASM humana en los núcleos cerebelosos profundos de ratones ASMKO.

Las Figuras 7A a 7E demuestran el transporte de hASM a la médula espinal desde los núcleos cerebelosos profundos. Este efecto se observó en ratones tratados con AAV2/2-ASM, AAV2/5 -ASM, AAV2/7-ASM & AAV2/8-ASM (A) ampliación 10X de hASM; (B) ampliación 40X de hASM; (C) hASM confocal; (D) ChAT confocal; y (E) hASM y ChAT confocales.

La Figura 8 muestra los niveles en homogeneizado de tejido cerebelosos después de la inyección de diferentes vectores de serotipo de AAV (2/1,2/2, 2/5, 2/7 y 2/8) que codifican ASM humana en los núcleos cerebelosos profundos (n=5/grupo). Los grupos no conectados mediante la misma letra son significativamente diferentes (p<0,0001).

Las Figuras 9A a G muestran la tinción inmunopositiva de calbindina en secciones cerebelosas sagitales después de la inyección de diferentes vectores de serotipo de AAV [(A)2/1, (B)2/2, (C)2/5, (D)2/7 y (E)2/8] que codifican ASM humana en los núcleos cerebelosos profundos de ratones ASMKO.

Las Figuras 10A y 10B muestran el rendimiento según rotarod con aceleración y balanceo (a las 14 semanas de vida) en ratones ASMKO (inyectados con AAV-pgal), WT y ASMKO tratados con AAV-ASM (n=8/grupo). Los grupos no conectados mediante la misma letra son significativamente diferentes. Los ratones inyectados con AAV2/1-ASM y AAV2/8-ASM demostraron una latencia significativamente (p<0,0009) más prolongada a la caída que los ratones ASMKO inyectados con AAV2/1 -pgal en la prueba de rotarod con aceleración. Para la prueba de rotarod con balanceo, los ratones inyectados con AA2/1-ASM demostraron una latencia significativamente (p<0,0001) más prolongada a la caída que los ratones inyectados con AAV2/1-pgal.

Las Figuras 11A y 11B muestran el rendimiento según Rotarod en ratones ASMKO (n=8), WT (n=8) y tratados bilateralmente con AAV-ASM (n=5/grupo) (a las 20 semanas de vida). Para ambas pruebas con aceleración y balanceo, los ratones tratados con AAV-ASM tuvieron un rendimiento significativamente mejor (p <0,001) que los ratones ASMKO tratados con AAV2/1-pgal. El rendimiento de ratones inyectados con AAV2/1-ASM fue indistinguible de los ratones naturales en ambas pruebas con aceleración y balanceo.

La Figura 12 muestra los niveles de esfingomielina cerebral (a las 20 semanas de vida) en ratones ASMKO inyectados bilateralmente con AAV1-pgal o con los serotipos 1 y 2 de AAV que codifican hASM. Los cerebros se dividieron en 5 secciones rostrocaudales (SI = la más rostral y S5 = la más caudal. Un asterisco indica que el punto de datos es significativamente diferente con respecto a ratones ASMKO (p<0,01).

La Figura 13A ilustra las conexiones entre las regiones de los núcleos cerebelosos profundos (medial, interpuesta y lateral) y las regiones de la médula espinal (cervical, torácica, lumbar y sacral). La Figura 13B ilustra las conexiones entre las regiones de los núcleos cerebelosos profundos (medial, interpuesta y lateral) y las regiones del tronco encefálico (mesencéfalo, protuberancia y bulbo raquídeo). Las conexiones se representan mediante flechas, que comienzan en la región del soma de una neurona y terminan en la región terminal del axón de la neurona. Por ejemplo, las tres regiones de los DCN tienen cada una neuronas con somas que envían axones que terminal en la región cervical de la médula espinal, mientras que la región cervical de la médula espinal tiene somas que envían axones hasta terminar en las regiones medial o interpuesta de los DCN.

La Figura 14 ilustra la distribución de la proteína verde fluorescente en el tronco encefálico, o motoneuronas superiores, después del suministro por los DCN de AAV que codifica la proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés).

La Figura 15 ilustra la distribución de la proteína verde fluorescente en las regiones de la médula espinal, después del suministro por los DCN de AAV que codifica la proteína verde fluorescente (GFP).

La Figura 16 muestra la distribución de GFP dentro del cerebro de ratón después del suministro bilateral de un vector de AAV1 que expresa GFP a los núcleos cerebelosos profundos (DCN). Además de los DCN, también se observó tinción positiva para GFP en los bulbos olfativos, la corteza cerebral, el tálamo, el tronco encefálico, la corteza cerebelosa y la médula espinal. Todas estas áreas reciben proyecciones desde y/o envían proyecciones hacia los DCN.

Descripción detallada de la invención

A efectos de que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, primero se definen ciertos términos. A lo largo de la descripción detallada se establecen definiciones adicionales.

El término "transgén" se refiere a un polinucleótido que se introduce en una célula de y es capaz de traducirse y/o expresarse en condiciones apropiadas y confiere una propiedad deseada a una célula en la cual se introdujo o conduce de cualquier otra manera a un resultado terapéutico deseado.

Los términos "partículas de genoma (gp)" o "equivalentes de genoma", según se usan en referencia a un valor cuantitativo vírico, hacen referencia al número de viriones que contienen el genoma de ADN de AAV recombinante, independientemente de la infectividad o funcionalidad. El número de partículas de genoma en una preparación de vector particular se puede medir mediante procedimientos tales como los descritos en los Ejemplos en la presente memoria o, por ejemplo, en Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.

Los términos "unidad de infección (ui)", "partícula infecciosa" o "unidad de replicación", según se usan en referencia a un valor cuantitativo vírico, hacen referencia al número de partículas de vector de AAV recombinante infecciosas y competentes para replicación, según se mide mediante el ensayo de centro infeccioso, también conocido como ensayo de centro de replicación, como se describe, por ejemplo, en McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973.

El término "unidad de transducción (ut)", según se usa en referencia a un valor cuantitativo vírico, se refiere al número de partículas de vector de AAV recombinante infecciosas que causan la producción de un producto de transgén funcional, según se mide en ensayos funcionales tales como los descritos en los Ejemplos en la presente memoria o, por ejemplo, en Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; o en Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (ensayo LFU).

Los términos "terapéutico/a", "cantidad terapéuticamente eficaz" y sus similares se refieren a tal cantidad de un compuesto que da como resultado la prevención o el retraso de la aparición o la mejora de síntomas de en un sujeto o un logro de un desenlace biológico deseado, tales como la corrección de una neuropatología, p. ej., patología celular asociada con una enfermedad de almacenamiento lisosómico tal como la descrita en la presente memoria o en Walkley (1998) Cerebral Pathol., 8:175-193. El término "corrección terapéutica" se refiere a tal grado de corrección que da como resultado la prevención o el retraso de la aparición o la mejora de síntomas en un sujeto. La cantidad eficaz se puede determinar mediante métodos conocidos en la técnica y como se describe en las secciones posteriores.

Métodos y composiciones

Los ratones ASMKO son un modelo aceptado de los tipos A y B de la enfermedad de Niemann-Pick (Horinouchi et al. (1995) Nat. Genetics, 10:288-293; Jin et al. (2002) J. Clin. Invest., 109:1183-1191; y Otterbach (1995) Cell, 81:1053-1061). La enfermedad de Niemann-Pick (NPD, por sus siglas en inglés) se clasifica como una enfermedad de almacenamiento lisosómico y es un trastorno neurometabólico heredado caracterizado por una deficiencia genética de esfingomielinasa ácida (ASM; esfingomielina colinafosfohidrolasa, EC 3.1.3.12). La falta de proteína ASM funcional da como resultado la acumulación de sustrato de esfingomielina dentro de los lisosomas de neuronas y glía en todo el cerebro. Esto conduce a la formación de grandes cantidades de lisosomas distendidos en el pericarion, que son una característica distintiva y el fenotipo celular primario de la NPD tipo A. La presencia de lisosomas distendidos se correlaciona con la pérdida de la función celular normal y una evolución neurodegenerativa progresiva que conduce a la muerte del individuo afectado en la niñez temprana (The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases, eds. Scriver et al., McGraw-Hill, Nueva York, 2001, págs. 3589-3610). También se asocian fenotipos celulares secundarios (p. ej., anomalías metabólicas adicionales) con esta enfermedad, particularmente, la acumulación de nivel elevado de colesterol en el compartimiento lisosómico. La esfingomielina tiene una potente afinidad por el colesterol, lo que da como resultado el secuestro de grandes cantidades de colesterol en los lisosomas de ratones ASMKO y pacientes humanos (Leventhal et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:44976-44983; Slotte (1997) Subcell. Biochem., 28:277-293; y Viana et al. (1990) J. Med. Genet., 27:499-504.)

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento y la demostración de que la inyección intrahipocámpica de AAV-ASM de alto valor cuantitativo en los cerebros enfermos de ratones ASMKO da como resultado la expresión de ARNm y proteína de ASM distalmente con respecto al sitio de la inyección en un patrón en consonancia con la organización topográfica de las neuronas de proyección que inervan el sitio de la inyección. Además de la expresión contundente en el sitio de la inyección, también se detectan el ARNm de ASM y la proteína en varias regiones distales fuera del hipocampo ipsilateral (inyectado), específicamente, en la circunvolución dentada y CA3 contralateral del hipocampo, y el septo medial y la corteza entorrinal. La invención se basa, además, en parte, en el descubrimiento y la demostración de la corrección extendida de la patología de almacenamiento lisosómico en los sitios distales, lo que permite así un mayor volumen de corrección a través de una cantidad menor de sitios de inyección.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención se relaciona con métodos para tratar trastornos neurometabólicos en mamíferos. Las poblaciones tratadas mediante los métodos de la descripción incluyen, pero no se limitan a, pacientes que padecen o están en riesgo de desarrollar un trastorno neurometabólico, p. ej., una LSD, tal como las enfermedades indicadas en la Tabla 1, particularmente, si dicha enfermedad afecta al CNS. En la presente invención, la enfermedad es enfermedad de Niemann-Pick de tipo A. En ciertas instancias, los trastornos neurometabólicos pueden excluir las enfermedades de Alzheimer, Parkinson, Huntington, Tay Sachs, Lesch-Nyan y Creutzfeldt-Jakob. Sin embargo, los métodos de la descripción utilizan una metaloendopeptidasa como transgén terapéutico, son específicamente útiles para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados con amiloide.

En algunas realizaciones, el método de tratar un trastorno neurometabólico comprende la administración de un vector de AAV de alto valor cuantitativo que lleva un transgén terapéutico, para que el producto del transgén se exprese a un nivel terapéutico en un segundo sitio dentro del CNS distal con respecto al primer sitio. En algunas realizaciones, el valor cuantitativo vírico de la composición es al menos: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x109 tu/ml); o (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1010 iu/ml). En realizaciones adicionales, la administración se logra mediante inyección intraparenquimatosa directa de una disolución de vector de AAV de alto valor cuantitativo en el cerebro enfermo, a continuación, el transgén se expresa distalmente, contralateralmente o ipsilateralmente, con respecto al sitio de la administración a un nivel terapéutico de al menos 2, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 mm desde el sitio de la administración.

La distancia entre los sitios primero y segundo se define como la región de distancia mínima entre el sitio de administración (primer sitio) y el límite de la transducción detectable del sitio distal (segundo sitio) según se mide al usar procedimientos conocidos en la técnica o como se describe en los Ejemplos, p. ej., hibridación in situ. Algunas neuronas en el CNS de mamíferos más grandes pueden extenderse por grandes distancias en virtud de sus proyecciones axónicas. Por ejemplo, en seres humanos, algunos axones pueden extenderse por una distancia de 1000 mm o mayor. Por lo tanto, en varios métodos de la invención, el AAV se puede transportar axónicamente a lo largo de toda la longitud del axón a una distancia tal para alcanzar y transducir el soma original.

Un sitio de administración del vector dentro del CNS se elige en función de la región diana deseada de la neuropatología y la topología de los circuitos cerebrales implicados, siempre que un sitio de administración y la región diana tengan conexiones axónicas. La región diana se puede definir, por ejemplo, al usar coordinadas estereotáxicas en 3-D. En algunas realizaciones, el sitio de administración se elige de manera que al menos 0,1, 0,5, 1,5 o 10 % de la cantidad total del vector inyectado se suministre distalmente en la región diana de al menos 1,200, 500 o 1000 mm3. Un sitio de administración se puede ubicar en una región inervada por neuronas de proyección que conectan regiones distales del cerebro. Por ejemplo, la sustancia negra y el área tegmentaria ventral envían proyecciones densas al globo pálido y el putamen (conocidos colectivamente como el cuerpo estriado). Las neuronas dentro de la sustancia negra y el tegmento ventral pueden ser diana de la transducción mediante transporte retrógrado de AAV después de la inyección en el cuerpo estriado. Como ejemplo adicional, el hipocampo recibe proyecciones axónicas bien definidas, predecibles desde otras regiones del cerebro. Otros sitios de administración pueden localizarse, por ejemplo, en la médula espinal, el tronco encefálico (bulbo raquídeo y protuberancia), el mesencéfalo, el cerebelo (incluidos los núcleos cerebelosos profundos), el diencéfalo (tálamo, hipotálamo), el telencéfalo (cuerpo estriado, corteza cerebral o, dentro de la corteza, los lóbulo occipital, temporal, parietal o frontal), o combinaciones de estos.

Para la identificación de estructuras en el cerebro humano, ver, p. ej., The Human Brain: Surface, Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI, and Blood Supply, 2da ed., eds. Deuteron et al., Springer Vela, 1999; Atlas of the Human Brain, eds. Mai et al., Academic Press; 1997; y Co-Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain: 3-Dimensional Proportional System: An Approach to Cerebral Imaging, eds. Tamarack et al., Thyme Medical Pub., 1988. Para la identificación de estructuras en el cerebro de ratón, ver, p. ej., The Mouse Brain in Sterotaxic Coordinates, 2nd ed., Academic Press, 2000. Si se desea, la estructura cerebral humana se puede correlacionar con estructuras similares en el cerebro de otro mamífero. Por ejemplo, la mayoría de los mamíferos, incluidos los seres humanos y roedores, muestran una organización topográfica similar de las proyecciones entorrinales-hipocámpicas, con neuronas en la parte lateral de la corteza entorrinal lateral y medial que se proyectan hacia la parte dorsal o polo septal del hipocampo, mientras que la proyección hacia el hipocampo ventral se origina principalmente desde neuronas en partes mediales de la corteza entorrinal (Principles of Neural Science, 4ta ed., eds Kandel et al., McGraw-Hill, 1991; The Rat Nervous System, 2da ed., ed. Paxinos, Academic Press, 1995). Además, las células de la capa II de la corteza entorrinal se proyectan hacia la circunvolución dentada y terminan en los dos tercios más externos de la capa molecular de la circunvolución dentada. Los axones de las células de la capa III se proyectan bilateralmente hacia las áreas CA1 y CA3 de la asta de Amón del hipocampo, y terminan en la capa molecular de estrato lacunosum.

El segundo sitio (diana) se puede ubicar en cualquier región del CNS, incluido el cerebro y la médula espinal, que contiene neuronas que se proyectan hacia el primer sitio (administración). En algunas realizaciones, el segundo sitio está en una región del CNS elegida entre la sustancia negra, el bulbo raquídeo o la médula espinal.

Para suministrar el vector específicamente hacia una región particular del sistema nervioso central, especialmente, hacia una región particular del cerebro, se puede administrar mediante microinyección estereotáxica. Por ejemplo, el día de la cirugía, la base de marco estereotáxico se fijará al lugar en los pacientes (atornillada al cráneo). Se tomarán imágenes del cerebro con la base de marco estereotáxica (compatible con MRI con marcadores fiduciales) al usar MRI de alta resolución. Las imágenes de MRI después se transferirán a un ordenador que ejecuta el software estereotáxico. Se usará una serie de imágenes coronales, sagitales y axiales para determinar el sitio diana para la inyección del vector y la trayectoria. El software traduce directamente la trayectoria a coordenadas tridimensionales apropiadas para el marco estereotáxico. Se perforan orificios de trepanación por encima del sitio de entrada y el aparato estereotáxico se localiza con la aguja implantada a la profundidad dada. A continuación, se inyectará el vector en un portador farmacéuticamente aceptable. Después, el vector de AAV se administra mediante inyección directa al sitio diana primario y se transporta retrógradamente a sitios diana distales a través de axones. Se pueden usar vías de administración adicionales, p. ej., aplicación cortical superficial con visualización directa u otra aplicación no estereotáxica.

Los expertos en la técnica determinarán el volumen total de material que se va a administrar y la cantidad total de partículas de vector que se va a administrar en función de aspectos conocidos de la terapia génica. La eficacia y la seguridad terapéuticas pueden someterse a prueba en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, existe una variedad de modelos animales que están bien caracterizados para LSD, p. ej., como se describe en la presente memoria o en Watson et al. (2001) Methods Mol. Med., 76:383-403; o Jeyakumar et al. (2002) Neuropath. Appl. Neurobiol., 28:343-357.

En ratones experimentales, el volumen total de disolución de AAV inyectada es, por ejemplo, entre 1 y 5 pl. Para otros mamíferos, incluido el cerebro humano, los volúmenes y tasas de suministro se pueden ajustar a escala de manera apropiada. Por ejemplo, se ha demostrado que se pueden inyectar volúmenes de 150 pl de manera segura en el cerebro de primates (Janson et al. (2002) Hum. Gene Ther., 13:1391-1412). El tratamiento puede consistir en una única inyección por sitio diana o se puede repetir a lo largo de la vía de la inyección, si es necesario. Se pueden usar múltiples sitios de inyección. Por ejemplo, en algunas realizaciones, además del primer sitio de administración, una composición que comprende AAV que lleva un transgén se administra a otro sitio que puede ser contralateral o ipsilateral con respecto al primer sitio de administración.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para suministrar un genoma de AAV recombinante a través de transporte axónico retrógrado al núcleo de una neurona afectada por una enfermedad in vivo. En algunas instancias, la patología celular exhibida por una neurona es la de una LSD tal como las indicadas en la Tabla 1 (ver, p. ej., Walkley (1998) Brain Pathol., 8:175-193). En la presente invención, la enfermedad es enfermedad de Niemann-Pick A. El método para suministrar un genoma de AAV recombinante al núcleo de una neurona afectada por una enfermedad comprende poner en contacto un extremo axónico de la neurona afectada por la enfermedad con una composición que comprende una partícula vírica de AAV que comprende el genoma de AAV recombinante y permitir que la partícula vírica sea endocitosada y retrógradamente transportada intracelularmente a lo largo del axón hasta el núcleo de la neurona, en donde la concentración de los genomas de AAV en la composición es al menos: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x109 tu/ml); o (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1010 iu/ml). En ciertas realizaciones, la neurona es una neurona de proyección y/o la distancia del extremo axónico al núcleo de la neurona es de al menos 2, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mm. En varias realizaciones, el genoma de AAV se transporta a lo largo de toda la longitud del axón, a distancias variables que dependen de la longitud del axón. En seres humanos, estas distancias pueden ser tanto como 1000 mm o mayores.

En otro aspecto, la descripción proporciona un método para suministrar un producto de transgén a una célula diana del CNS, que es una neurona o una célula glial, en un mamífero afectado por un trastorno, por ejemplo, una LSD como se indica en la Tabla 1. El método comprende poner en contacto un extremo axónico de una neurona con una composición que comprende un vector de AAV que lleva al menos una parte de un gen que codifica un producto de transgén terapéutico; permitir que las partículas víricas sean endocitosadas y retrógradamente transportadas intracelularmente a lo largo del axón hasta el núcleo de la neurona; permitir que el producto de transgén sea expresado y secretado por la neurona; y permitir que la segunda célula capte el producto de transgén, en donde el producto de transgén alivia de este modo la patología en la segunda célula. En algunas realizaciones, la concentración del vector de AAV en la composición es al menos: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x109 tu/ml); o (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1010 iu/ml). Por ejemplo, las células transducidas pueden secretar hidrolasas lisosómicas y posteriormente otra célula puede tomarlas a través de endocitosis mediada por el receptor de manosa-6-fosfato, la segunda célula puede ser transducida o no transducida (Sando et al. (1977) Cell, 12:619-627; Taylor et al. (1997) Nat. Med., 3:771-774; Miranda et al. (2000) Gene Ther., 7:1768-1776; y Jin et al. (2002) J. Clin. Invest., 109:1183-1191).

En los métodos de la descripción, se puede usar AAV de cualquier serotipo, siempre que el vector sea capaz de someterse a transporte axónico retrógrado en un cerebro afectado por una enfermedad. El serotipo del vector vírico usado en ciertas instancias de la descripción se selecciona del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 y AAV8 (ver, p. ej., Gao et al. (2002) PNAS, 99:11854-11859; y Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). Se puede usar otro serotipo además de los indicados en la presente memoria. Además, también se puede utilizar vectores de AAV seudotipificados en los métodos descritos en la presente memoria. Los vectores de AAV seudotipificados son aquellos que contienen el genoma de un serotipo de AAV en la cápside de un segundo serotipo de AAV; por ejemplo, un vector de AAV que contiene la cápside de AAV2 y el genoma de AAV1 o un vector de AAV que contiene la cápside de AAV5 y el genoma de AAV 2. (Auricchio et al., (2001) Hum. Mol. Genet., 10(26):3075-81.) Sin embargo, se puede excluir AAV5 específicamente de los métodos de la descripción que utilizan una metaloendopeptidasa, p. ej., neprilisina, como un transgén terapéutico. La composición de la invención comprende un vector de AAV que tiene una cápside de serotipo 1.

Los vectores de AAV se derivan de parvovirus de ADN monocatenario (ss, por sus siglas en inglés) que no son patógenos para mamíferos (divulgado en Muzyscka (1992) Curr. Top. Microb. Immunol., 158:97-129). A grandes rasgos, de los vectores basados en AAV se extraen los genes víricos de rep y cap que representan el 96 % del genoma vírico, quedan las dos repeticiones terminales invertidas (ITR, por sus siglas en inglés) de 145 pares de bases (bp) flanqueadoras, que se usan para iniciar la replicación, el empaquetamiento y la integración del ADN vírico. En ausencia de un virus auxiliar, el AAV natural se integra en el genoma de la célula hospedante humana con especificidad para sitio preferencial en el cromosoma 19q 13,3 o puede permanecer expresado episómicamente. Una única partícula de AAV puede alojar hasta 5 kb de ADNmc y, por lo tanto, quedan aproximadamente 4,5 kb para un transgén y elementos reguladores, lo que es típicamente suficiente. Sin embargo, los sistemas de transempalme como se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos núm. 6.544.785, pueden casi duplicar este límite.

En una instancia ilustrativa, el AAV es AAV2 o AAV1. El virus adenoasociado de muchos serotipos, especialmente AAV2, se ha estudiado exhaustivamente y caracterizado como vectores para terapia génica. Los expertos en la técnica estarán familiarizados con la preparación de vectores para terapia génica basados en AAV funcionales. Se pueden encontrar numerosas referencias a varios métodos de producción, purificación y preparación de AAV para la administración a sujetos humanos en el amplio corpus de literatura publicada (ver, p. ej., Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). Además, la terapia génica basada en AAV dirigida a células del CNS se ha descrito en las patentes de los Estados Unidos núms. 6.180.613 y 6.503.888.

En ciertos métodos de la invención, el vector comprende un transgén funcionalmente enlazado a un promotor. El transgén codifica una molécula biológicamente activa, cuya expresión en el CNS da como resultado una corrección al menos parcial de la neuropatología. En algunas instancias, el transgén codifica una hidrolasa lisosómica. En la presente invención, la hidrolasa lisosómica es ASM. Las secuencias genómicas y de ADNc funcional de ASM humana se han publicado (ver, p. ej., las patentes de los Estados Unidos núms. 5.773.278 y 6.541.218). Se pueden usar otras hidrolasas lisosómicas para enfermedades apropiadas, por ejemplo, como se indican en la Tabla 1.

También se describen en la presente memoria métodos para tratar la enfermedad de Alzheimer en mamíferos, incluidos seres humanos. En tales métodos, el transgén codifica una metaloendopeptidasa. La metaloendopeptidasa puede ser, por ejemplo, la enzima degradante de beta amiloide neprilisina (EC 3.4.24.11; número de acceso a secuencia, p. ej., P08473 (SWISS-PROT)), la enzima degradante de insulina insulisina (EC 3.4.24.56; número de acceso a secuencia, p. ej., P14735 (SWISS-PROT)), o la timet oligopeptidasa (EC 3.4.24.15; número de acceso a secuencia, p. ej., P52888 (SWISS-p Ro T)).

El nivel de expresión del transgén en células eucariotas se determina en gran medida mediante el promotor de transcripción dentro del casete de expresión del transgén. En algunas realizaciones, se usan promotores que muestran actividad a largo plazo y son específicos para tejidos e incluso para células. Los ejemplos no limitantes de promotores incluyen, pero no se limitan a, el promotor de citomegalovirus (CMV) (Kaplitt et al. (1994) Nat. Genet., 8:148-154), el promotor de CMV/p3-globina humana (Mandel et al. (1998) J. Neurosci., 18:4271-4284), el promotor de GFAP (Xu et al. (2001) Gene Ther., 8:1323-1332), el promotor de enolasa específico para neuronas (NSE, por sus siglas en inglés) de 1,8 kb (Klein et al. (1998) Exp. Neurol., 150:183-194), el promotor de beta actina de pollo (CBA, por sus siglas en inglés) (Miyazaki (1989) Gene, 79:269-277) y el promotor de p-glucuronidasa (GUSB) (Shipley et al. (1991) Genetics, 10:1009-1018). Para prolongar la expresión, además, se pueden enlazar funcionalmente otros elementos reguladores al transgén, tales como, p. ej., el elemento postregulador del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE, por sus siglas en inglés) (Donello et al. (1998) J. Virol., 72, 5085-5092) o el sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH, por sus siglas en inglés).

Para algunas aplicaciones de terapia génica al CNS, será necesario controlar la actividad transcripcional. Con este fin, se puede lograr la regulación farmacológica de la expresión génica con vectores de AAV al incluir varios elementos reguladores y promotores sensibles a fármaco como se describen, por ejemplo, en Habermaet al. (1998) Gene Ther., 5:1604-16011; y Ye et al. (1995) Science, 283:88-91.

Se pueden producir preparaciones de AAV con alto valor cuantitativo al usar técnicas conocidas en la técnica, p. ej., como se describen en la patente de los Estados Unidos núm. 5.658.776 y en Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003.

Los siguientes ejemplos no limitan de ningún modo la invención.

Ejemplos

Valoración de vectores recombinantes

Se midieron los valores del vector de AAV según el número de copias de genoma (partículas de genoma por mililitro). Las concentraciones de partículas de genoma se basaron en PCR Taqman® del ADN del vector según se informó anteriormente (Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278). A grandes rasgos, se trató AAV-ASM purificada con tampón de digestión de cápside (50mM Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA, SDS al 0,5 %, 1,0 mg/ml de proteinasa K) a 50 °C durante 1 hora para liberar el ADN del vector. Las muestras de ADN se sometieron a reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) con cebadores que se aparearon con secuencias específicas en el ADN del vector, tales como la región promotora, el transgén o la secuencia de poli A. Los resultados de la PCR después se cuantificaron mediante un software en tiempo real Taqman®, tal como el proporcionado por el sistema detector de secuencias Prism 7700 de Perkin Elmer-Applied Biosystems (Foster City, CA).

Los vectores que llevan un gen marcador que se puede someter a ensayo tal como el gen de p-galactosidasa o proteína verde fluorescente (GFP) se pueden valorar al uar un ensayo de infectividad. Las células susceptibles (p. ej., células HeLa o COS) se transducen con el AAV y se lleva a cabo un ensayo para determinar la expresión génica tal como la tinción de células transducidas con vector con p-galactosidasa con X-gal (5-bromo-4cloro-3-indolil-p-D-galactopiranósido) o microscopía de fluorescencia para células transducidas con GFP. Por ejemplo, el ensayo se lleva a cabo de la siguiente manera: Se colocan en placas 4 x104 células HeLa en cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos al usar medios de crecimiento normales. Después del acoplamiento, es decir, aproximadamente 24 horas más tarde, las células se infectan con Ad tipo 5 a una multiplicidad de infección (MOI, por sus siglas en inglés) de 10 y se transducen con diluciones en serie del vector empaquetado y se incuban a 37 °C. Uno a tres días más tarde, antes de que se observen efectos citopatógenos extendidos, se lleva a cabo el ensayo apropiado con las células (p. ej., tinción con X-gal o microscopía de fluorescencia). Si se usa un gen indicador tal como p-galactosidasa, las células se fijan en paraformaldehído al 2 %, glutaraldehído al 0,5 % y se tiñen para determinar la actividad de p-galactosidasa al usar X-gal. Las diluciones de vector que proporcionan células bien separadas se cuentan. Cada célula positiva representa 1 unidad de transducción (tu) de vector.

Corrección de patología de LSD en el cerebro de ratón

Ratones ASMKO de diez semanas de vida contienen patología de NPD significativa en el sistema nervioso central. La identificación de mutantes recesivos homocigóticos se verificó mediante PCR. Se anestesiaron dieciséis ratones ASMKO de 10 semanas de vida con isoflurano y se montaron en un marco estereotáxico, se hizo una incisión para exponer el cráneo subyacente y se hizo un solo orificio de perforación en un hemisferio de cada ratón. Se inyectaron dos microlitros de AAV2-CMV-ASM de alto valor cuantitativo (9,3 x1012 gp/ml) (Targeted Genetics, Seattle, WA) en el hipocampo en una coordenada estereotáxica final de 2,0 mm rostral con respecto a la superficie temporal, 1,5 mm a la derecha de la línea media y 2,0 mm ventral con respecto a la superficie pial. Estas coordenadas hipocámpicas garantizaban que el vector de AAV2 estuviera expuesto a neuronas en la circunvolución dentada del área 3 (CA3) de la asta de Amón, así como a extremos axónicos de neuronas de proyección del hipocampo contralateral, el septo medial y la corteza entorrinal. Las inyecciones se llevaron a cabo a una tasa de 0,2 pl/minuto, y se administró un total de 1,86 x1010 partículas genómicas en cada cerebro.

Los ratones se evaluaron mediante rotarod con aceleración y balanceo para la motricidad en el Smartrod (AccuScan) al usar métodos conocidos en la técnica y reproducidos en Sleat et al. (2004) J. Neurosci. 24:9117-9126, las Figuras 10A/B y las Figuras 11A/B muestran gráficamente los resultados de las pruebas de rotarod como una medición de la recuperación de la motricidad.

Estos ratones después se sacrificaron a las 5 (n = 8) o 15 (n = 8) semanas después de la inyección (pi). Se analizaron ocho cerebros (n = 4 cada uno a las 5 y 15 semanas pi) para determinar la distribución de ARNm y proteína de ASM, y la reducción de los niveles suprafisiológicos de colesterol en los lisosomas. Los 8 cerebros restantes (n=4 cada uno a las 5 y 15 semanas pi) se procesaron para histopatología para analizar la corrección de lisosomas acumulados y distendidos, que es el método más directo y preciso para determinar la corrección de la patología de almacenamiento para LSD.

Se detectó transducción contundente en el hipocampo inyectado (ipsilateral) a las 5 y 15 semanas pi. La capa de células granulares y el hilio de la circunvolución dentada y las capas de células piramidales y del estrato oriens de CA3 se transdujeron extensamente mediante el vector de AAV2. Este impresionante patrón de transducción se extendió a otras regiones del hipocampo ipsilateral, tales como el subículo y el área 1 (CA1) y 2 (CA2) de la asta de Amón. La inmunofluorescencia con un anticuerpo monoclonal anti-ASM humana confirmó la presencia de proteína ASM en muchas células. El patrón proteico global fue similar al patrón de ARNm, con alguna extensión localizada adicional de proteína.

El ARNm y proteína de ASM humana también se detectó en regiones fuera del hipocampo ipsilateral en ambos puntos de tiempo. La circunvolución dentada y CA3 contralateral y el septo medial y la corteza entorrinal fueron positivos para la hibridación in situ y la inmunofluorescencia (Figuras 1A y 2A). El patrón de transducción en estos sitios distales estuvo en consonancia con la organización topográfica de las neuronas de proyección que inervan el sitio de la inyección (Figuras 1B y 2B). Esto demostró que AAV2 se sometió a transporte axónico retrógrado en los circuitos intrahipocámpicos, septohipocámpicos y entorrinodentados de cerebros ASMKO, y que el vector vírico se dirigió al núcleo después del transporte hasta los axones (Figuras 1C y 2C). El patrón de transducción no respalda la difusión parenquimatosa como la razón para el transporte de AAV2 a estos sitios distales. Si se hubiese producido tal difusión, las estructuras entre los sitios inyectado y distales habrían estado expuestas al virus migrante. Pero estas estructuras intermedias fueron negativas para la hibridación in situ. Por ejemplo, el cuerpo estriado que posee un tropismo natural intenso por AAV2, fue negativo para la transferencia génica a pesar de estar en el trayecto directo entre el hipocampo y el septo medial. Por lo tanto, la transferencia génica hasta los sitios distales debe haber surgido por transporte axónico retrógrado, lo que indica que una neurona de proyección afectada puede funcionar como un sistema de transporte eficaz para el movimiento de AAV2 a través de un cerebro enfermo.

La capacidad de ASM para corregir las anomalías del colesterol en el cerebro de ASMKO se investigó adicionalmente. La filipina es una molécula autofluorescente aislada a partir de Streptomyces filipinensis que se une a complejos de colesterol (Leventhal et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:44976-44983; y Sarna et al. (2001) Eur. J. Neurosci., 13:1-9). Los cerebros de ASMKO no inyectados tenían niveles altos de tinción de filipina debido a estos complejos de colesterol abundantes, mientras que el cerebro de ratón normal no produjo tinción de filipina.

La inyección de AAV2-CMV-ASM dio como resultados la pérdida completa de la tinción de filipina a lo largo del hipocampo ipsilateral y contralateral, el septo y corteza entorrinal a las 5 y 15 semanas pi en ratones ASMKO (Figuras 1A y 2A). Esto contrastó de manera marcada con los testigos ASMKO de la misma edad no inyectados, donde se detectaron niveles altos de tinción de filipina en estas mismas estructuras. La pérdida de tinción de filipina en cerebros inyectados con AAV2 demuestra que se corrigió un fenotipo celular secundario (p. ej., defecto metabólico) de la enfermedad por ASM. Esto sugiere claramente que la proteína ASM se dirigió al lisosoma e interactuó con el complejo de esfingomielina-colesterol. Esta interacción probablemente resultó en la liberación de colesterol desde la esfingomielina, y el posterior ingreso del colesterol en sus vías biológicas normales (tales como la degradación o translocación a la membrana plasmática (Leventhal et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:44976-44983)).

La pérdida de tinción de filipina se observó en todas las capas celulares y subcampos de los circuitos intrahipocámpico, septohipocámpico y entorrinodentado. El área de corrección del colesterol fue bastante mayor y más extensa que la del patrón de la proteína ASM. Esto indica que, después del transporte axónico retrógrado de AAV2, las neuronas de proyección pueden haber funcionado como "bombas de enzima" y secretado proteína ASM en el tejido circundante. Significativamente, se necesita solo una pequeña cantidad de ASM para tener un efecto terapéutico sobre la acumulación de colesterol dentro de las células afectadas por ASMKO, una cantidad por debajo del límite de detección del protocolo inmunofluorescente.

También se evaluó si el transporte axónico del vector de AAV2-ASM da como resultado la corrección del fenotipo celular primario de la NPD. Secciones de cerebro para histopatología de un micrón de espesor demostraron una reducción notable de la patología lisosómica acumulada y distendida en cerebros inyectados con AAV2-CMV-ASM a las 5 semanas pi (Tabla 2). La corrección de la patología que da como resultado la restauración parcial o completa de la arquitectura celular normal se produjo en todas las regiones de los hemisferios ipsilateral y contralateral del hipocampo. El septo medial y la corteza entorrinal también mostraron una reducción sustancial en las lesiones por almacenamiento. De manera similar a los datos de filipina, la cantidad de células corregidas fue mayor y más extensa que el patrón de la proteína ASM. La corrección de la patología fue evidente dentro de regiones que se sabe que se proyectan hacia el hipocampo, incluidos los circuitos intrahipocámpico, septohipocámpico y entorrinodentado. En general, el volumen de corrección fue 30-35 mm3 o más en el hipocampo contralateral, 5-8 mm3 o más en la corteza entorrinal ipsilateral, 1-2 mm3 o más en la corteza entorrinal contralateral y 2-3 mm3 o más en el septo medial. Esto respalda aun más que el transporte axónico del vector vírico fue responsable de este efecto terapéutico, porque las estructuras cercanas (que no contribuyen a estos circuitos) se habrían corregido si la distribución vírica estuviese mediada meramente por difusión (ver, "cuerpo estriado ipsilateral" y "cuerpo estriado contralateral" en la Tabla 2).

Para demostrar que la corrección de la patología fue específica para ASM, se inyectó a un grupo adicional de ratones ASMKO con un vector testigo que lleva un gen indicador, AAV2-CMV-p-gal (n = 2 cada una a las 5 y 15 semanas pi) y se procesó para histopatología. En los cuatro cerebros, las células permanecieron inundadas con lisosomas distendidos, y contenían otras anomalías tales como hinchazón citoplasmática y capas celulares desorganizadas.

Tabla 2

Por lo tanto, según la presente invención, una única inyección de vector de AAV2 de alto valor cuantitativo es suficiente para transferir el gen de ASM a estructuras que inervan el hipocampo afectado por ASMKO. La cantidad de estructuras positivas para el vector de AAV2 fue mayor que la demostrada por un estudio reciente en el hipocampo de rata normal, que mostró transporte axónico solo en el circuito entorrinodentado (Kaspar et al. (2002) Mol. Ther., 5:50-56). Los resultados descritos en la presente memoria demuestran que el transporte axónico puede producirse en neuronas de proyección afectadas por una patología de almacenamiento y que este modo de transporte resulta en el aclaramiento de la patología de almacenamiento en estructuras proximales y múltiples regiones distales con respecto al sitio de inyección. También demostramos que el transporte axónico no se limita solo a estos circuitos asociados con el hipocampo. El transporte axónico retrógrado se produce en los circuitos nigroestriatal (Figura 3) y medulocerebeloso (Figura 4). Esto demuestra que el transporte axónico de AAV2 en neuronas comprometidas por la enfermedad es una propiedad general del vector vírico.

Un estudio similar se llevó a cabo con AAV1-ASM en las concentraciones de 1-4x1013 gp/ml y AAV7-ASM en la concentración de 8,4x1012 gp/ml. Aunque AAV1 no exhibió transporte axónico retrógrado detectable, AAV7 sí se sometió a transporte axónico retrógrado, de manera similar a AAV2, y produjo corrección de la patología por LSD en regiones distales (ver la Figura 5).

Inyección de AAV en el cerebelo

Se anestesiaron ratones ASMKO con isoflurano y se montaron en un marco estereotáxico. La superficie temporal se ubicó como punto de referencia para determinar la ubicación de perforación para la inyección en la región de los núcleos cerebelosos profundos del cerebelo. Después de ubicado, se hizo una incisión para exponer el cráneo subyacente y se hizo un solo orificio de perforación en el cráneo sin perforar la superficie del cerebro. Se introdujo una jeringa Hamilton en el cerebro a través del orificio y se inyectó AAV2-CMV-ASM en los núcleos cerebelosos profundos a una tasa de 0,5 microlitros por segundo. Se inyectaron tres microlitros para una dosis total de 1 x 1010 partículas de genoma. Los ratones se sacrificaron 7 semanas después de la inyección. Los cerebros y las médulas espinales se evaluaron para determinar la expresión de ARNm de ASM, la expresión de proteína ASM, la tinción de filipina y la tinción de calbindina.

La filipina es una molécula autofluorescente que se une a complejos de colesterol. Los ratones ASMKO no tratados tienen niveles altos de tinción de filipina debido a abundantes complejos de colesterol, que se acumulan como resultado de su enfermedad. En cambio, los cerebros de ratón normal no exhiben tinción de filipina.

La calbindina es un marcador de células de Purkinje, que se encuentran en el cerebelo y participan en movimientos coordinados. En el ratón ASMKO, las células de Purkinje mueren estos ratones a medida que envejeces, lo que resulta en un comportamiento de disminución del movimiento coordinado. Esta pérdida de células de Purkinje y la pérdida correlativa del comportamiento de movimiento coordinado no se observan en ratones normales.

Después de la inyección de AAV2 en el núcleo cerebeloso profundo, el cerebelo fue positivo para el ARNm de ASM, la proteína ASM y la tinción de calbindina. Estos resultados demuestran la capacidad de AAV2 para transducir el cerebelo después de la inyección en los núcleos cerebelosos profundos. Además, la transducción cerebelosa y la expresión de ASM resultante evitó la muerte de las células de Purkinje como se evidenció por la presencia de tinción de calbindina en los ratones tratados. En ratones tratados con AAV-ASM, la expresión de la proteína hASM también se observó a lo largo del tronco encefálico, el tálamo y el mesencéfalo. La expresión de la proteína hASM en estas regiones se superpuso con el aclaramiento regional de la tinción de filipina/colesterol. En general, en el cerebelo hubo una relación positiva entre los niveles de proteína ASM, el aclaramiento de filipina y la supervivencia de las células de Purkinje.

También se detectaron ARNm de ASM y proteína ASM fuera del cerebelo. Específicamente, la médula espinal fue positiva para la expresión de ARNm de ASM como se evidenció mediante hibridación in situ. La médula espinal también fue positiva para la proteína ASM como se evidenció mediante inmunofluorescencia específica para ASM. Estos resultados indican que la médula espinal se transdujo después de la inyección distal del vector de AAV en los núcleos cerebelosos profundos. Este patrón de transducción estuvo en consonancia con la organización topográfica de las neuronas de proyección que inervan la región de los núcleos cerebelosos. Estos resultados indican que el vector de AAV2 fue captado por células de la médula espinal distales y se expresó.

Tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (Ejemplo de referencia)

La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la acumulación de péptido pamiloide (Ap) debido al catabolismo disminuido de Ap. A medida que el Ap se acumula, se aglomera en placas extracelulares, lo que provoca la alteración de la función sináptica y la pérdida de neuronas. La patología conduce a demencia, pérdida de la coordinación y la muerte.

La neprilisina es una metaloendopeptidasa de zinc unida a la membrana de 97 kD que es la enzima limitante de tasa en la degradación normal de Ap. La introducción de neprilisina puede desacelerar la progresión de la enfermedad al eliminar concentraciones de Ap antes de la aglomeración. De hecho, se ha mostrado que la neprilisina degrada formas oligoméricas de Ap y eliminar así las placas existentes en un modelo animal de AD (Kanemitsu et al. (2003) Neurosci. Lett., 350:113-116). Los ratones con neprilisina inactivada exhiben niveles altos de Ap (Iwata et al. (2001) J. Neurosci., 24:991-998.). Los inhibidores de neprilisina, tales como tiorfán y fosforamidón, aumentan los niveles de Ap en el cerebro de ratón (Iwata et al. (2000) Nat. Med., 6:143-150). Además, se encontraron niveles de ARNm de neprilisina disminuidos en áreas de alta carga de placa amiloide en cerebros humanos, lo que demuestra adicionalmente el vínculo entre la neprilisina y la AD (Yasojima et al. (2001) Neurosci. Lett., 297:97-100).

Las áreas del cerebro más afectadas por la AD son el hipocampo, la corteza, el cerebelo, el cuerpo estriado y el tálamo (ver, p. ej., Iwata et al. (2001) supra; Yasojima et al. (2001) supra). Estas son las mismas áreas del cerebro que muestran transporte axónico retrógrado eficaz con AAV.

Por consiguiente, se puede usar AAV para suministrar transgenes terapéuticos a regiones de alta carga de placa mediante inyección directa y posterior translocación del virus a través de circuitos cerebrales a nuestros sitios diana. La transferencia génica mediada por vector vírico de neprilisina fue eficaz para tratar modelos de ratón de AD (Marr et al. (2003) J. Neurosci., 23:1992-1996; Marr et al. (2004) J. Mol. Neurosci., 22:5-11; Iwata et al. (2004) J. Neurosci., 24:991-998). Un informe reciente mostró que AAV5-neprilisina eliminó Ap de los extremos presinápticos del hipocampo en ratones con deficiencia de neprilisina, lo que desaceleró la formación de placas en las sinapsis (Iwata et al. (2004) supra). En este informa, se halló neprilsina en el hipocampo contralateral, pero todavía se desconoce si esto se debe al transporte retrógrado del virus o al transporte anterógrado de la proteína expresada.

Corrección de la patología de almacenamiento de colesterol

El siguiente experimento evaluó la capacidad relativa de vectores de serotipo AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7 y AAV2/8 recombinantes que codifican ASM humana (hASM) para expresar la proteína hASM, corregir la patología de almacenamiento de colesterol, someterse al transporte, rescatar a las células de Purkinje e iniciar la recuperación funcional en el ratón ASMKO después de la inyección unilateral dentro de los núcleos cerebelosos profundos. Un grupo adicional de ratones ASMKO recibió inyecciones bilaterales en los DCN para evaluar si una mayor extensión/expresión de la proteína del transgén aumentaría la recuperación de funcional del comportamiento.

Se criaron sesenta y seis ratones macho con inactivación de esfingomielinasa ácida (ASMKO) homocigóticos (-/-) y dieciséis controles macho naturales de la misma camada a partir de apareamientos heterocigóticos (+/-). Los ratones se sometieron a genotipificación mediante PCR según el procedimiento descrito en Gal et al. (1975) N Engl J Med:293:632-636. Los ratones de la colonia original se retrocruzaron con la cepa C57/B16. Los animales se alojaron con un ciclo de 12:12 horas de luz:oscuridad y se les proporcionó alimento y agua ad libitum. Todos los procedimientos se llevaron a cabo según un protocolo aprobado por el Institutional Animal Care and Use Committee.

Después de anestesiarlos con isoflurano, se inyectó unilateralmente a los ratones (~7 semanas de vida) en los núcleos cerebelosos profundos (DCN) (A-P: -5,75 desde la superficie temporal, M-L: -1,8 desde la superficie temporal, D-V: -2,6 desde la dura, barra incisiva: 0,0) con uno de los siguientes vectores de serotipo de AAV (n=8/vector): AAV1-CMV-Pgal, AAV1-CMV-ASM, AAV2-CMV-ASM, AAV5-CMV-ASM, AAV7-CMV-ASM y AAV8-CMV-ASM. Los vectores se suministraron con una jeringa Hamilton de 10 gl montada en una bomba de jeringa a una tasa de 0,5 gl/minuto para un total de 1,86 x 1010 partículas de genoma por cerebro. El volumen de inyección final para cada vector fue 4 gl. Una hora antes y veinticuatro horas después de la cirugía se dio ketoprofeno a los ratones (5 mg/kg; SC) para la analgesia. Los ratones se sacrificaron 7 semanas después de la inyección (14 semanas de vida). En el momento del sacrificio, se administró una sobredosis de eutasol a los ratones (150 mg/kg; IP) y rápidamente se decapitaron (n=5/grupo) o perfundieron transcárdicamente (n=3/grupo). Los cerebros de ratones decapitados se extrajeron rápidamente, se ultracongelaron en nitrógeno líquido, se disecaron en 3 secciones (hemisferio cerebral derecho, hemisferio cerebral izquierdo y cerebelo) homogeneizadas y se analizaron para determinar hASM por ELISA. Los cerebros y médulas espinales de los ratones perfundidos se procesaron para determinar la expresión de la proteína ASM humana, la acumulación de colesterol según se detecta mediante tinción de filipina y la supervivencia de células de Purkinje con tinción de calbindina en secciones de vibratomo de 50 gm.

Al usar un protocolo similar, se inyectó bilateralmente a ratones ASMKO (~7 semanas de vida) con AAV2/1 -pgal (n=8), AAV2/1-ASM (n=5) y AAV2/2-ASM (n=5) y sacrificaron a las 20 semanas de vida después de someterse a la prueba de rotarod. Los cerebros se ultracongelaron en nitrógeno líquido, se bisecaron en la línea media y después se dividieron en cinco secciones (S1, S2, S3, S4 y S5) al usar una matriz cerebral de ratón (ASI Instruments, Inc, MI.) Las secciones 1-4 estaban a aproximadamente 2 mm de distancia, donde S1 fue la más rostral y S4 la más caudal. La sección 5 contenía solo cerebelo. El hemisferio derecho se usó para cuantificar los niveles de esfingomielina en el cerebro y el izquierdo para los niveles de hASM.

Se clonó el ADNc de ASM humana de longitud completa bajo el control de promotor inmediato-temprano de citomegalovirus (CMV) humano, con una secuencia de poliadenilación de SV40 y un intrón híbrido, en un plásmido que contenía It R del serotipo 2 de AAV (AAV2 ITR), Jin et al. (2002) J Clin Invest. 109:1183-1191. Se produjeron vectores híbridos mediante triple transfección al usar una serie de plásmidos auxiliares que contenían dominios codificantes de cápside específica para serotipo además de los genes de replicación de AAV tipo 2. Esta estrategia permite el empaquetamiento de los vectores de AAV2 ITR en cada virión específico para serotipo Rabinowitz, et al. (2002) J Virol. 76:791-801. Con esta estrategia, se usó el genoma recombinante de hASM para generar una serie de vectores de rAAV-hASM de varios serotipos, incluidos AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7 y AAV2/8. Los vectores de AAV recombinantes se purificaron mediante cromatografía de intercambio iónico (Serotipos 2/1,2/2 y 2/5). O'Riordan, et al. (2000) J Gene Med 2: 444-54 o centrifugación de CsCl (serotipos 2/8 y 2/7) Rabinowitz et al. (2002) J. Urrol.

76:791-801. El valor cuantitativo final de las partículas de virión de AAV-ASM (partículas resistentes a ADNasa) se determinó mediante PCR TaqMan de la secuencia de CMV. Clark et al. (1999) Hum. Gene Therapy 10:1031-1039.

Los anticuerpos para ASM humana son específicos para seres humanos y no hacen reacción cruzada con ASM de ratón. Se incubaron placas Coster (Corning, NY) 9018 recubiertas (100 gl/pocillo) con anticuerpo monoclonal para ASM humana recombinante (rhASM, por sus siglas en inglés) (2 gg/ml) diluido en tampón de carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) durante la noche a 2-8 °C. El exceso de anticuerpo de recubrimiento se retiró y se agregó diluyente de bloqueo (KPL, Inc., MD) durante 1 h a 37 °C. Las placas se lavaron con una lavadora de microplaca (Molecular Devices, CA) para dos ciclos. Los estándares, testigos y muestras diluidos en tampón de dilución estándar (PBS, Tween al 0,05 %, HP-BSA al 1 %) se pipetearon por duplicado y se dejaron incubar durante 1 h a 37 °C. Las placas se lavaron según se describió anteriormente. Se agregaron cien microlitros de anticuerpo para ASM humana recombinante (rhASM) biotinilado (diluido 1:20K en tampón de dilución estándar) a cada pocillo, se dejaron incubar durante 1 h a 37 °C y después se retiraron con una lavadora de microplaca. A continuación, se agregó estreptavidina - HRP (Pierce Biotechnology, Inc., IL) diluida 1:10K (100 gl/pocillo) y se dejó incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron como se describió anteriormente y después se incubaron con SureBlue TMB (KPL, Inc., MD) durante 15 minutos a 36-38 °C. La reacción se detuvo con disolución de terminación (KPL, Inc., MD) y después se leyeron los valores de absorbancia a 450 nm con un lector de placa Spectra Max 340 (Molecular Devices, CA). El análisis de datos se completó al usar el programa informático Softmax Pro 4.3 (Molecular Devices, CA).

La concentración de proteína para cada muestra se determinó con un kit de ensayo de proteína por BCA (Pierce Biotechnology, Inc., IL) al usar seroalbúmina bovina como estándar.

Los ratones se perfundieron transcárdicamente con fijador que contenía paraformaldehído al 2 %, glutaraldehído al 0,03 %, CaCl2 al 0,002 % en tampón de acetato de sodio 0,1 M a pH 6,5 y posteriormente se sometieron a perfusión con el mismo fijador a pH 8,5. Los cerebros y médulas espinales de ratón se disecaron y posfijaron durante la noche a 4 °C en fijador de pH 8,5 sin glutaraldehído. Los tejidos se lavaron en tampón de fosfato de potasio 0,1 M, pH 7,4, se embebieron en agar al 3,5 % y se cortaron en secciones sagitales de 50 gm con un vibratomo.

Los cerebros y médulas espinales se dividieron en secciones sagitalmente con vibratomo en intervalos de 50 gm. Las secciones se procesaron para inmunofluorescencia con anticuerpos primarios contra ASM humana (1:200). Las secciones se incubaron en suero de burro al 10 %, Triton X-100 al 0,3 % en PBS durante 1 hora, posteriormente se sometieron a incubación con anti-ASM humana biotinilado de ratón en suero de burro al 2 %, Triton X-100 al 0,2 % en PBS durante 72 horas. Después del lavado, la señal se amplificó al usar un kit de Tyramide Signal Amplification (PerkinElmer, Boston MA). La proteína ASM humana se visualizó con un microscopio fluorescente Nikon y las imágenes se capturaron con una cámara SPOT y con el programa informático Adobe Photoshop.

El complejo de filipina (Sigma, St. Louis, MO) primero se diluyó en metanol al 100 % para una concentración madre de 1 mg/ml. La disolución madre es estable durante 4 semanas a -20° C. Después del lavado con PBS, las secciones se incubaron en la oscuridad durante tres horas en una disolución de filipina 10 gg/ml en PBS recientemente preparada. Las secciones se lavaron después tres veces con PBS. Los depósitos de colesterol se visualizaron bajo un filtro ultravioleta en un microscopio de fluorescencia.

Los cerebros se procesaron para inmunofluorescencia al usar anticuerpos primarios dirigidos contra la proteína de unión a calcio, calbindina. Las secciones se lavaron con tampón de fosfato de potasio (KPB) y después se enjugaron con disolución salina tamponada con fosfato de potasio (KPBS). A continuación, las secciones se bloquearon en suero de burro al 5 %, Triton X-100 al 0,25 % en KPBS durante hasta 3 horas y después se incubaron en suero de burro al 5 %, Triton X-100 al 0,2 % y anti-calbindina de ratón (1:2500, Sigma, St. Louis, MO) en KPBS. Después de 72 horas a 4° C, las secciones se enjuagaron con KPBS con Triton X-100 al 0,1 % tres veces. Se agregó anticuerpo secundario de burro anti-CY3 de ratón (1:333, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) en KPBS Triton X-100 al 0,1 % durante 90 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron con KPB y después se montaron sobre portaobjetos recubiertos con gel. Las células positivas para calbindina se visualizaron bajo epifluorescencia. Para cuantificar las células de Purkinje del cerebelo, se seleccionaron cuatro secciones mediales cerebelosas frontales de cada animal. Las células de Purkinje inmunopositivas para calbindina se vieron con un microscopio fluorescente y los somas se contaron a una ampliación de 20X. Cada lóbulo se contó por separado. Se contaron dos planos focales separados por lóbulo. Solo se contaron las células en foco para garantizar que ninguna célula se contase dos veces.

Las secciones de vibratomo de cincuenta (50) gm se procesaron primero para inmunofluorescencia con anticuerpos dirigidos contra ASM humana, según se describió anteriormente. Las secciones después se lavaron en PBS y se tiñeron con colina acetiltransferasa (ChAT; policlonal de conejo, 1:500, Chemicon International, Temecula, CA) con el protocolo señalado anteriormente para calbindina. Sin embargo, en lugar de usar un anticuerpo secundario para CY3, se usó uno de burro anti-FITC de conejo (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA). La tinción se visualizó primero bajo epifluorescencia y más adelante se adquirieron imágenes con un microscopio confocal.

La tinción de filipina se cuantificó de la siguiente manera. Se capturaron imágenes emparejadas por exposición al usar un microscopio de epifluorescencia vertical de campo abierto Nikon E600 equipado con una cámara digital SPOT. Se tomaron imágenes del grupo AAV2/1- p-gal primero y dicha exposición se usó para adquirir todas las imágenes adicionales. Cada imagen analizada representa un plano sagital medial a lo largo de la longitud de cada mitad de cerebro. Se llevó a cabo un análisis morfométrico con el programa informático Metamorph (Universal Imaging Corporation). Se determinó el umbral de las imágenes de AAV2/1- p-gal; una vez establecido, el umbral se usó en todas las imágenes. El usuario seleccionó manualmente las siguientes regiones y se analizaron por separado: cerebelo, protuberancia, bulbo raquídeo, mesencéfalo, corteza cerebral, hipocampo, tálamo, hipotálamo y cuerpo estriado. La intensidad integrada se midió en cada región y todas las mediciones (n= 3/grupo) de un grupo dado de animales se usaron para generar promedios. La reducción en el colesterol en los animales tratados después se calculó como el porcentaje de disminución de la intensidad integrada en comparación con los ratones con inactivación inyectados con p-gal.

Se observó inmunotinción positiva para hASM a lo largo de todo el cerebelo (Figura 6, Tabla 3), protuberancia, bulbo raquídeo y médula espinal (Figura 7) después de la inyección unilateral de AAV-ASM dentro de los núcleos cerebelosos profundos.

Tabla 3

Dentro del cerebelo, los ratones tratados con AAV2/1-ASM tenían el nivel más extenso (es decir, extendido entre los lóbulos dentro de la misma sección sagital) de expresión de hASM, mientras que los ratones tratados con AAV2/2-ASM tenían el nivel más restringido de expresión de proteína ASM humana. La expresión de la proteína ASM humana en ratones tratados con AAV2/5-ASM, AAV2/7-ASM, y AAV2/8-ASM fue intermedia entre estos dos grupos. La extensión medial - lateral entre secciones sagitales fue máxima en ratones tratados con los serotipos 1 y 8 y mínima en ratones inyectados con el serotipo 2. Los serotipos 5 y 7 iniciaron patrones de extensión medial -lateral intermedios entre los serotipos 1 y 2. Cada capa del cerebelo (es decir, molecular, Purkinje y granular) se transdujo mediante cada serotipo de AAV; sin embargo, se evidenció una afinidad mayor por la capa molecular en todos los serotipos. La transducción de células de Purkinje fue máxima en ratones tratados con los serotipos 1 y 5. Los ratones inyectados con el serotipo 7 tuvieron la menor cantidad de células de Purkinje transducidas. Los ratones tratados con el serotipo 8 también tuvieron pocas células de Purkinje transducidas, pero tuvieron menos expresión de ASM dentro de la capa granular en comparación con los serotipos 1, 2, 5 y 7. Las células de Purkinje transducidas con ASM parecían tener una citoestructura sana. El análisis cuantitativo de la expresión de la proteína hASM mediada por AAV mediante ELISA en los homogeneizados de tejido cerebeloso respalda los hallazgos inmunohistoquímicos. Los ratones inyectados con los serotipos 1 y 8 demostraron niveles significativamente (p <0,0001) más altos de proteína hASM en el cerebelo en comparación con todos los otros ratones (Figura 8). Los niveles de hASM en el cerebelo de ratones inyectados con los serotipos 2, 5 y 7 no estuvieron por encima de los niveles naturales (WT, por sus siglas en inglés) (es decir, de fondo). Como se esperaba, no se detectó ASM humana en ratones naturales, el anticuerpo para hASM usados en el ELISA es específico para seres humanos.

Una ausencia de proteína ASM funcional da como resultado la acumulación lisosómica de esfingomielina y los defectos metabólicos secundarios posteriores tales como tráfico de colesterol anormal. Sarna et al. Eur. J. Neurosci. 13:1873-1880 y Leventhal et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:44976-4498. La acumulación de colesterol libre en el cerebro de ratón ASMKO se visualiza al usar filipina, una molécula autofluorescente aislada de streptomyces filipinensis. Los cerebros de ratón natural no se tiñen positivamente para filipina. En todos los ratones tratados con AAV (excepto con AAV2/1-pgal) el aclaramiento de la tinción de filipina (Tabla 4) se superpuso con áreas que fueron positivas para la inmunotinción de hASM, lo que indica que cada vector de serotipo es capaz de generar un producto de transgén funcional.

Tabla 4

Como se demostró anteriormente (Passini et al. (2003) en "Society for Neuroscience" New Orleans, LA), el aclaramiento de la filipina también se produjo en áreas conectadas anatómicamente con el sitio de la inyección, pero no hubo tinción positiva para hASM. El análisis por MetaMorph indicó que se produjo una reducción en la tinción de filipina a lo largo de todo el eje rostral caudal. En el cerebelo y el tronco encefálico, la filipina se redujo máximamente en ratones tratados con AAV2/1 -ASM y AAV2/8-ASM, mientras que, en el diencéfalo y la corteza cerebral, los ratones inyectados con AAV2/8-ASM tuvieron el mejor nivel general de aclaramiento de filipina (Tabla 4). Sin embargo, estos resultados indican que el nivel de hASM necesario para corregir la patología de almacenamiento de colesterol en el CNS de ratón ASMKo es mínimo (es decir, por debajo del límite de detección por inmunofluorescencia de hASM).

Tabla 5

Estudios histológicos indican que el cerebelo del ratón ASMKO sufre un deterioro rápido. Más específicamente, las células de Purkinje mueren progresivamente entre las 8 y 20 semanas de vida (Sarna et al. (2001) Eur. J. Neurosci.

13:1813-1880 y Stewart et al. (2002) en "Society for Neuroscience" Orland, FL). La calbindina es un marcador de célula de Purkinje ampliamente aceptado. La tinción positiva de calbindina en ratones tratados con AAV-ASM sugeriría que la expresión mediada por AAV de hASM es terapéutica. En general, los resultados obtenidos indican que la expresión de hASM mediada por AAV en el cerebelo evita la muerte de células de Purkinje en el ratón ASMKO (Tabla 5, Figura 9). Como se esperaba, la supervivencia de las células de Purkinje no se produjo en los lóbulos I-III; los ratones se inyectaron a las 7 semanas de vida y a las 8 semanas la mayoría de estas células ya había muerto. La supervivencia de células de Purkinje en los lóbulos IV/V fue máxima en ratones tratados con el serotipo 1. En el lóbulo VI, no se observó supervivencia de células de Purkinje significativa en ratones tratados con AAV. En el lóbulo VII, solo los ratones tratados con el serotipo 5 exhibieron supervivencia de células de Purkinje significativa. En el lóbulo VIII, nuevamente los ratones tratados con el serotipo 5, así como el serotipo 2 exhibieron supervivencia de células de Purkinje significativa. En los lóbulos IX y X, no hubo diferencias significativas entre los ratones WT y KO (o entre los ratones tratados con AAV) en los recuentos de células de Purkinje. Esto se esperaba, porque a las 14 semanas de vida (es decir, la edad del sacrificio) las células de Purkinje en estos lóbulos todavía son viables en ratones ASMKO. En todos los lóbulos, la supervivencia de las células de Purkinje fue máxima en ratones tratados con los serotipos 1, 2 y 5 y mínima en ratones tratados con los serotipos 7 y 8, la supervivencia de las células de Purkinje (basada en la tinción de calbindina) en los lóbulos cerebelosos anteriores fue la más alta en ratones que se inyectaron con el serotipo 1.

Recuentos de células de Purkinje en los lóbulos cerebelosos I-X en ratones WT y ASMKO después de la inyección intracerebelosa de diferentes serotipos de AAV (n=3/serotipo; 2/1,2/2, 2/5, 2/7 y 2/8) que codifican ASM humana en los núcleos cerebelosos profundos de ratones ASMKO. Los números que aparecen en negrita y cursiva son significativamente diferentes de los ratones KO (es decir, ratones tratados con AAV2/1-pgal) p <0,01

En la prueba de rotarod con aceleración, los ratones inyectados unilateralmente con AAV2/1-ASM y AAV2/8-ASM demostraron una latencia significativamente (p<0,0009) más prolongada a la caída que los ratones ASMKO inyectados con AAV2/1-pgal (Figura 10). Los ratones inyectados con el serotipo AA2/1-ASM no fueron significativamente diferentes de los ratones naturales. Los ratones inyectados con AAV2/2-ASM y AAV2/5-ASM exhibieron una tendencia a la latencia más prolongada a la caída que los ratones ASMKO inyectados con AAV2/1 -pgal; mientras que, los ratones inyectados con AAV2/7-ASM no lo hicieron. Para la prueba de rotarod con balanceo, solo los ratones inyectados con AA2/1-ASM demostraron una latencia significativamente (p<0,0001) más prolongada a la caída que los ratones inyectados con AA2/1-pgal. En este caso, los ratones naturales tuvieron un rendimiento significativamente mejor que los ratones inyectados con AA2/1-ASM (Figura 10). Los ratones ASMKO que recibieron inyección bilateral de AAV2/1-ASM o AAV2/2-ASM tuvieron un rendimiento significativamente mejor (p <0,001) que los ratones ASMKO tratados con AAV2/1-pgal para ambas pruebas con aceleración y balanceo (Figura 11). Los ratones inyectados bilateralmente con AAV2/1-ASM tuvieron un rendimiento similar a los ratones naturales en ambas pruebas.

Un modo de determinar si AAV genera hASM que es funcionalmente activa dentro del CNS de ASMKO es evaluar su influencia sobre la patología de almacenamiento de colesterol, un defecto metabólico secundario de la enfermedad de NPA. En todos los ratones tratados con AAV (excepto con AAV2/1-pgal), la corrección de la patología de almacenamiento de colesterol se superpuso con áreas que fueron positivas para la inmunotinción de hASM, lo que indica que cada vector de serotipo es capaz de generar un producto de transgén funcional. Como se demostró anteriormente, la corrección del metabolismo anormal del colesterol también se produjo en áreas conectadas anatómicamente con el sitio de la inyección, pero también en regiones en las que no hubo tinción positiva para hASM, lo que sugiere que el nivel de hASM requerido para la corrección de la patología de almacenamiento de colesterol es mínimo. En consonancia con los resultados histoquímicos y bioquímicos de hASM obtenidos, los ratones tratados con los serotipos 1 y 8 demostraron una reducción marcada en la patología de almacenamiento de colesterol. Los ratones tratados con los serotipos 2, 5 y 7 también mostraron una reducción en la patología de almacenamiento de colesterol, pero no en la misma medida que los ratones tratados con los serotipos 1 y 8.

Aunque los cambios en la patología de almacenamiento de colesterol son ilustrativos, una medición más directa de la actividad enzimática de hASM es a través del análisis de los niveles de esfingomielina, que es el sustrato primario acumulado en los tejidos de mamíferos con enfermedad de Niemann-Pick. El tejido cerebral de ratones que recibieron inyecciones bilaterales de los serotipos 1 y 2 de AAV se sometieron a ensayo para determinar los niveles de esfingomielina (SPM, por sus siglas en inglés) (el procedimiento de homogeneización de tejido para la detección de SPM no es compatible con la detección de hASM.) Se observó una reducción significativa (p<0,01) en el contenido de SPM en tejido en el cerebelo en ratones tratados con ambos serotipos 1 y 2 (Figura 12). Los niveles de contenido de SPM en tejido también se redujeron significativamente en las secciones 2, 3 y 4 (cada sección está a 2 mm de la siguiente) en ratones inyectados con el serotipo 1, pero no en ratones inyectados con el serotipo 2.

Los ratones ASMKO que recibieron inyecciones intracerebelosas bilaterales de los serotipos 1 y 2 de AAV que codificaban hASM exhibieron una reducción significativa en el almacenamiento de esfingomielina dentro del cerebelo. Como se observa con la acumulación del almacenamiento de colesterol, también se produjo una reducción significative en el almacenamiento de esfingomielina en regiones fuera del cerebelo en ratones ASMKO tratados bilateralmente con AAV1.

En general, estos resultados indican que AAV1 se prefiere con respecto a los serotipos 2, 5, 7 y 8 en su capacidad relativa para iniciar la expresión enzimática, corregir la patología de almacenamiento en el cerebro, prevenir la neurodegeneración (al prevenir, por ejemplo, la muerte de células de Purkinje) y mejorar los resultados funcionales motores. Además, los DCN se pueden aprovechar como sitio de inyección para maximizar la expresión enzimática a lo largo del CNS.

Para evaluar la distribución de la expresión del transgén después de la inyección de vectores de AAV en los DCN, se inyectaron G93A SOD1 (ratón mutante SOD1G93A, denominado en la presente memoria ratón SOD1) con vectores de AAV recombinantes que codificaban la proteína verde fluorescente (GFP). Un grupo de ratones se inyectó con el serotipo 1 de AAV que codificaba la proteína verde fluorescente (AAV1 -GFP), mientras que otro grupo se inyectó con el serotipo 2 de AAV que codificaba la proteína verde fluorescente (AAV2-GFP).

Los ratones se inyectaron bilateralmente en los DCN con los vectores de AAV recombinantes al usar métodos similares a los descritos anteriormente. La dosis fue aproximadamente 2,0 e10 gc/ml inyectados por sitio. Los ratones se sacrificaron aproximadamente 110 días después de su nacimiento y su cerebro y médula espinal se analizaron para determinar la tinción de GFP.

Se observó distribución de la proteína verde fluorescente en el tronco encefálico (ver Figura 14) y en las regiones de la médula espinal (ver Figura 15) después del suministro por los DCN de AAV que codificaba la proteína verde fluorescente (GFP). También se observó tinción de GFP en los DCN, así como en los bulbos olfativos, la corteza cerebral, el tálamo, el tronco encefálico, la corteza cerebelosa y la médula espinal. Todas estas áreas reciben proyecciones desde y/o envían proyecciones hacia los DCN (ver la Figura 16).

La memoria descriptiva se entiende en mayor profundidad en virtud de las enseñanzas de las referencias mencionadas dentro de la memoria descriptiva. Las realizaciones dentro de la memoria descriptiva proporcionan una ilustración de realizaciones de la invención y no deben interpretarse como un límite al alcance de la invención. El experto en la técnica reconocerá sin inconvenientes que la invención abarca muchas otras realizaciones.

La mención de cualesquiera referencias en la presente memoria no es un reconocimiento de que dichas referencias constituyen técnica anterior de la presente invención.

A menos que se indique de cualquier otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, cultivo celular, condiciones de tratamiento, entre otros, usados en la memoria descriptiva, deberán entenderse como modificados en todas las instancias por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique de cualquier otra manera lo contrario, los parámetros numéricos son aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se buscan obtener mediante la presente invención. A menos que se indique de cualquier otra manera, el término "al menos" que precede a una serie de elementos deberá entenderse que hace referencia a cada elemento en la serie.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un vector de virus adenoasociado (vector de AAV) que tiene una cápside de serotipo 1 y que codifica una esfingomielinasa ácida, para uso en un método para tratar la enfermedad de Niemann Pick A en un mamífero, en donde el método comprende administrar la composición a los núcleos cerebelosos profundos del sistema nervioso central del mamífero, de modo que el vector haga contacto con un extremo axónico, en donde el vector transduce una célula ubicada en un sitio distal en el sistema nervioso central, y en donde la esfingomielinasa ácida codificada se traduce.

2. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde la molécula biológicamente activa traducida se expresa.

3. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde el sitio distal es la médula espinal.

4. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde el mamífero es un ser humano.

5. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde el sitio distal es contralateral con respecto al sitio de administración.

6. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde el vector de AAV es de AAV2/1.

7. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde el método comprende, además, la administración de una composición a un segundo sitio de administración en el sistema nervioso central del mamífero, dicha composición comprende un vector de AAV que comprende un polinucleótido que codifica una esfingomielinasa ácida.

8. La composición para su uso según la reivindicación 7, en donde el segundo sitio administración es contralateral con respecto al primer sitio de administración.

9. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde la distancia entre el sitio de administración y el sitio distal es al menos 2 mm.

10. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde la concentración del vector de AAV en la composición es al menos 5 x 1012 gp/ml.