ES2885551T3

ES2885551T3 - Agentes antiarrítmicos

Info

Publication number: ES2885551T3
Application number: ES15870900T
Authority: ES
Inventors: Jau-Nian Chen; Ohyun Kwon; Jie Huang; Hirohito Shimizu; Kui Lu; Johann Schredelseker; Yi Fan
Original assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Priority date: 2014-12-15
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2035-12-15
Also published as: US20220127226A1; EP3233895B1; WO2016100379A1; US20170362173A1; EP3233895A1; EP3233895A4

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un compuesto de estructura de Fórmula Ia o Ib: **(Ver fórmula)** en donde el compuesto es para usar en la potenciación de la captación del Ca2+ mitocondrial para modular la ritmicidad cardíaca en un sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Agentes antiarrítmicos

Antecedentes de la invención

A. Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para usar en la potenciación de la captación del Ca2+ mitocondrial y a un agente para usar en el tratamiento de una afección relacionada con la ritmicidad cardíaca o un trastorno cardíaco con una raíz en métodos reguladores de la manipulación aberrante del Ca2+.

B. Descripción de la técnica relacionada

Las enfermedades cardíacas son la principal causa de mortalidad en los países occidentales. Muchas de estas afecciones, incluyendo la hipertrofia, la insuficiencia cardíaca y las arritmias, tienen una raíz en la homeostasis aberrante del Ca2+. La identificación de dianas clínicamente relevantes y de agentes farmacológicos que puedan modular eficazmente la homeostasis cardíaca del Ca2+ puede conducir al desarrollo de una nueva estrategia terapéutica para las enfermedades cardíacas.

La presente invención aborda tales necesidades de dianas y agentes para regular la ritmicidad cardíaca.

Henry et al. (Journal of the American Chemical Society 136.34 (2014): 11890-11893) se refiere a fosfinas bicíclicas [2.2.1] pseudoenantioméricas derivadas de hidroxiprolina: síntesis asimétrica de (+)- y (-)-pirrolinas. Grace et al. (Cardiovascular research 45.1 (2000): 43-51) se refiere a los canales de calcio dependientes de la tensión y la acción de los fármacos antiarrítmicos. El documento WO 2007/113837 se refiere a variantes de VDAC (Voltage-Dependent Anion Channel, canal aniónico dependiente de la tensión) N-terminales y a usos de las mismas.

Sumario de la invención

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un compuesto de estructura de Fórmula Ia o Ib:

(R)-efsevin (S)-efsevin

Fórmula la Fórmula Ib

en donde el compuesto es para usar en la potenciación de la captación del Ca2+ mitocondrial para modular la ritmicidad cardíaca en un sujeto.

La invención también proporciona un agente para usar en el tratamiento de una afección relacionada con la arritmicidad cardíaca o un trastorno cardíaco con una raíz en la manipulación aberrante del Ca2+, en donde dicho tratamiento comprende regular la ritmicidad cardíaca en un sujeto, comprendiendo potenciar la captación del Ca2+ mitocondrial mediante: i) la inducción de la sobreexpresión de VDAC2 o VDAC1 en el sujeto para restablecer la contracción rítmica; o ii) la inducción de la sobreexpresión de VDAC2 o VDAC1 y/o del complejo MCU (Mitochondrial Ca2+ Uniporter, uniportador de Ca2+ mitocondrial) o MICU1; o iii) la inducción de la actividad transportadora del Ca2+ de VDAC2 o VDAC1, en donde el agente es el compuesto de Fórmula Ia o Ib:

La invención se define en las reivindicaciones 1 y 4. Los aspectos y realizaciones preferidas adicionales se definen en las reivindicaciones dependientes. Cualquier aspecto, realización y ejemplo de la presente divulgación que no caiga dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona simplemente con fines ilustrativos.

Aspectos de la divulgación

En el presente documento, se describen métodos de regulación de la ritmicidad cardíaca en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una composición que comprende un agente o compuesto que aumenta la actividad de VDAC2 o VDAC1. En algunos aspectos, el agente o compuesto se une a VDAC2 o VDAC1. En algunos aspectos, el agente o compuesto aumenta la actividad transportadora del Ca2+ de VDAC2.

El agente o compuesto desvelado en el presente documento puede ser cualquier agente o compuesto de las fórmulas descritas en el presente documento o compuestos descritos en el presente documento. En algunos aspectos, se pueden excluir uno o más compuestos específicos descritos en el presente documento.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, el compuesto está en una composición. En algunos aspectos, la composición comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, el sujeto padece un trastorno relacionado con la arritmicidad cardíaca o un trastorno cardíaco con una raíz en la manipulación aberrante del Ca2+. Tal trastorno incluye, por ejemplo, fibrilación cardíaca, arritmia, fibrilación auricular, síndrome del seno enfermo, Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica (TVPC) o miocardiopatía.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, la inducción de la sobreexpresión de VDAC2 o VDAC1 en el sujeto se realiza mediante terapia génica.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, el agente es un producto génico de VDAC2 o VDAC1.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, el agente es una proteína VDAC2 o VDAC1, o un ARN de VDAC2 o VDAC1.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, el agente es el compuesto de Fórmula I o un derivado del mismo, en donde el compuesto de Fórmula I comprende

en donde: R1 es grupo tosilo o mesilo; y en donde R2 es un grupo hidrocarbilo con o sin un heteroátomo, o en donde el éster carboxílico de R2 está unido a una 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) protegida con mono-N-Boc, y en donde el compuesto es eficaz para potenciar la captación del Ca2+ mitocondrial para modular la ritmicidad cardíaca en un sujeto, con la condición de que cuando R1 sea tosilo y R2 sea etilo, el compuesto esté en una forma opcionalmente activa (p. ej., esencialmente enantioméricamente pura) de fórmula Ia o fórmula Ib:

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, R2 es grupo metilo, etilo, alquilo C3-C6 corto o mentilo.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, R2 es un grupo alquilo o grupo arilo C1-C10 lineal o ramificado, acíclico o cíclico.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, el compuesto está en una forma opcionalmente activa (p. ej., esencialmente enantioméricamente pura).

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, el agente es efsevin.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, el efsevin es un enantiómero de efsevin.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, el compuesto de Fórmula I está en una composición.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, la composición comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, el agente es el compuesto de Fórmula II, en donde el compuesto de Fórmula II comprende:

o en donde el éster carboxílico está unido a una 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) protegida con mono-N-Boc.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, el compuesto de Fórmula II está en una composición.

En el presente documento, también se describe un compuesto antiarrítmico de estructura de Fórmula I o derivado del mismo:

en donde: R1 es grupo tosilo o mesilo; y en donde R2 es un grupo hidrocarbilo con o sin un heteroátomo, o en donde el éster carboxílico de R2 está unido a una 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) protegida con mono-N-Boc, y en donde el compuesto es eficaz para potenciar la captación del Ca2+ mitocondrial para modular la ritmicidad cardíaca en un sujeto, con la condición de que cuando R1 sea tosilo y R2 sea etilo, el compuesto esté en una forma opcionalmente activa (p.

ej., esencialmente enantioméricamente pura) de fórmula la o fórmula Ib:

(R)-efsevin (S)-efsevin

Fórmula la Fórmula Ib

En un aspecto adicional, algunos aspectos implican métodos de formación del compuesto de Fórmula I:

Fórmula I

donde R1 es grupo tosilo o mesilo; y R2 es un grupo hidrocarbilo con o sin un heteroátomo, o en donde el éster carboxílico de R2 está unido a una 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) protegida con mono-N-Boc, que comprenden hacer reaccionar

con

de acuerdo con una reacción del Esquema I

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, la reacción del Esquema I se lleva a cabo en condiciones de síntesis asimétricas.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, el método comprende además realizar la resolución quiral del compuesto de Fórmula I para producir enantiómeros R o S del compuesto en una forma opcionalmente activa (p. ej., esencialmente enantioméricamente pura).

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, la resolución quiral se realiza en una fase estacionaria quiral de HPLC (High Performance Liquid Chromatography, cromatografía líquida de alta resolución).

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, la resolución quiral se realiza haciendo reaccionar el compuesto con un agente quiral.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, el agente quiral es mentol.

En el presente documento, también se describe una composición que comprende el compuesto de Fórmula I o un derivado del mismo:

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, la composición está en una formulación adecuada para la administración a un sujeto.

En el presente documento, también se describe un método de formación de una composición que comprende proporcionar un compuesto de Fórmula I o un derivado del mismo en una cantidad eficaz y formar la composición, en donde el compuesto de Fórmula I comprende:

en donde: Ri es grupo tosilo o mesilo; y en donde R2 es un grupo hidrocarbilo con o sin un heteroátomo, o en donde el éster carboxílico de R2 está unido a una 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) protegida con mono-N-Boc, y en donde el compuesto es eficaz para potenciar la captación del Ca2+ mitocondrial para modular la ritmicidad cardíaca en un sujeto, con la condición de que cuando R1 sea tosilo y R2 sea etilo, el compuesto está en una forma opcionalmente activa (p. ej., esencialmente enantioméricamente pura) Fórmula Ia o Fórmula Ib:

En el presente documento, también se describe un compuesto antiarrítmico de estructura de Fórmula II:

En el presente documento, también se describe una composición que comprende el compuesto de Fórmula II: o en donde el éster carboxílico está unido a una 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) protegida con mono-N-Boc.

En el presente documento, también se describe un método de formación de una composición, que comprende proporcionar un compuesto de Fórmula II en una cantidad eficaz y formar la composición, en donde el compuesto de Fórmula II comprende:

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-G muestran los resultados de las pruebas que demuestran que efsevin restablece las contracciones cardíacas rítmicas en embriones de pez cebra temblorosos. (A,B) Fracción de acortamiento (FA) deducida de barridos lineales a través de las aurículas de corazones embrionarios Tg(myl7:GFP) a las 48 h de la fecundación. Se registraron sístoles y diástoles alternantes rítmicamente en los embriones de tipo silvestre tratados con vehículo o con efsevin y embriones tem tratados con efsevin, mientras que solo se registraron contracciones no sincronizadas esporádicas en los embriones tem tratados con vehículo. Aunque no se observó contracción cardíaca en tem, los corazones de tipo silvestre y tem tratados con efsevin tienen niveles de FA similares a los observados en los corazones de control. FA ventricular del tipo silvestre frente al tipo silvestre efsevin frente a tem + efsevin: 39 ± 0,6 %, n = 8 frente a 39 ± 1 %, n = 10 frente a 35 ± 3 %, n = 6; y FA auricular: 37 ± 1 %, n = 11 frente a 35 ± 2 %, n = 11 frente a 33 ± 2 %, n = 15. (C) Mientras que efsevin restableció una frecuencia cardíaca de 46 ± 2 latidos por minuto (lpm) en embriones tem, el mismo tratamiento no afecta a la frecuencia cardíaca en los embriones de tipo silvestre (126 ± 2 lpm en los embriones tratados con vehículo frente a 123 ± 3 lpm en los embriones de tipo silvestre tratados con efsevin). ***, p < 0,001 por ANOVA unidireccional. (D) Curva de dependencia de la dosis para el efsevin. Los embriones tem se trataron con diferentes concentraciones de efsevin a partir de las 24 h de la fecundación y se analizaron las contracciones cardíacas a las 48 h de la fecundación. (E-G) Los rastros representativos a lo largo del tiempo de los potenciales de campo locales para los embriones de tipo silvestre (E), tem (F) y tem (G) tratados con efsevin muestran claramente períodos de actividad eléctrica periódica regular, irregular y restablecida.

Las Figuras 2A-F muestran los resultados de las pruebas que demuestran que efsevin reduce los eventos arritmogénicos en los cardiomiocitos derivados de células ES (Embryonic Stem, madre embrionarias) (A-D). Gráfico representativo de transitorios rítmicos de Ca²⁺detectados en mESC-CM (mouse Embryonic Stem Cell-Conditioned Media, medios acondicionados para células madre embrionarias de ratón) del análisis de barrido lineal de transitorios de Ca²⁺en mESC-CM tras 10 días de diferenciación (A). T ras el tratamiento con Ca²⁺10 mM durante 10 minutos, el EB mostró un patrón irregular de transitorios de Ca²⁺(B). El tratamiento con efsevin restablece los transitorios regulares de Ca²⁺en condiciones de sobrecarga de Ca²⁺en mESC-CM (C). (D) Intervalos representados entre máximos de señales de Ca²⁺detectadas en mESC-CM antes del tratamiento (control), en Ca^2+ext10 mM (Ca²⁺) y en Ca^2+ext10 mM efsevin 10 pM (Ca²⁺+efsevin). (E, F) Intervalos representados de contracciones detectadas en EB antes del tratamiento (control), en Ca^2+ext10 mM (Ca²⁺) y en Ca^2+ext10 mM efsevin 10 pM (Ca²⁺+ efsevin) para ESC-CM de ratón (E) y Ca^2+ext5 mM (Ca²⁺) y en Ca^2+ext5 mM efsevin 5 pM (Ca²⁺+ efsevin) para ESC-CM de ser humano (F). ***, p < 0,001 por prueba F.

Las Figuras 3A-E muestran los resultados de las pruebas que demuestran que VDAC2 es una proteína diana de efsevin. (A) Estructuras de efsevin y dos derivados, OK-C125 y OK-C19. (B) Efsevin y OK-C125 restablecieron las contracciones rítmicas en la mayoría de los embriones temblorosos, mientras que OK-C19 no logró rescatar el fenotipo tembloroso. (C) Estructuras de compuestos unidos a enlazadores (indicados por el superíndice L). (D) Los compuestos efsevin^Ly OK-C125^Lconservaron su capacidad para restablecer las contracciones rítmicas en embriones inyectados con NCX1hMO, mientras que el derivado inactivo OK-C 19^Lseguía siendo incapaz de inducir la contracción rítmica. (E) Identificación mediante espectrometría de masas de VDAC 2, una banda de 32 kD extraída con perlas de afinidad de agarosa unidas covalentemente con efsevin (efsevin^LB) u OK-C125 (OK-C125^LB) que era sensible a la competencia con un efsevin^Llibre en exceso de 100 veces. La banda de 32 kD no se detectó en proteínas eluidas de perlas selladas con etanolamina sola (perlas^C) ni perlas unidas a OK-C19 (OK-C19^LB). Los péptidos identificados mediante espectrometría de masas (subrayados) representan el 30 % de la secuencia total (SEQ ID NO: 1).

Las Figuras 4A-F muestran los resultados de la prueba que demuestran que VDAC2 restablece las contracciones cardíacas rítmicas en tem. El análisis de hibridación in situ mostró que VDAC2 se expresa en los corazones embrionarios a las 36 h y las 48 h de la fecundación. (A) La inyección de 25 pg de ARNm de VDAC2 sintetizado in vitro restableció las contracciones cardíacas en el 52,9 ± 12,1 % (n = 78) de los embriones tem de un día de vida, en comparación con el 21,8 ± 5,1 % en hermanos no inyectados (n = 111). (B) Diagrama esquemático de la construcción myl7:VDAC2. (C) Si bien solo ~20 % de los embriones myl7:VDAC2;NCX1hMO tiene contracciones coordinadas (n = 116), el 52,3 ± 2,4 % de estos embriones establecieron contracciones rítmicas persistentes tras la inducción de TBF de VDAC2 (n = 154). (D) Como media, el 71,2 ± 8,8 % de los embriones tratados con efsevin tiene contracciones cardíacas coordinadas (n = 131). La atenuación con oligonucleótido antisentido morfolino de VDAC2 ((MO^VDAC2) atenúa la capacidad de efsevin para suprimir la fibrilación cardíaca en embriones tem (45,3 ± 7,4 % de embriones con contracciones coordinadas, n = 94). (E) El tratamiento con efsevin restablece las contracciones cardíacas coordinadas en el 76,2 ± 8,7 % de los embriones NCX1MO, solo el 54,1 ± 3,6 % de los embriones VDAC2^zfn/zfn;NCX1MO tiene contracciones coordinadas (n = 250). (F) Diagrama de los sitios diana de los dedos de zinc. VDAC2zfn/zfn porta una deleción de 34 pb en el exón 3 que da lugar a un codón de parada prematuro (asterisco).

Las Figuras 5A-5D muestran los resultados de las pruebas que demuestran que efsevin potencia la captación del Ca²⁺mitocondrial. Se transfectaron células HeLa con VDAC2 de pez cebra marcada con Flag (VDAC2^flag), se sometieron a inmunotinción frente al epítopo Flag y a contratinción para mitocondrias con MitoTracker Orange y para núcleos con DAPI. (A) Rastros representativos de matriz mitocondrial [Ca²⁺] ([Ca²⁺]^m) detectados por Rhod2. Las flechas indican la adición de Ca²⁺. Se evaluó la captación del Ca²⁺mitocondrial cuando se sobreexpresó VDAC2 (izquierda), cuando se trataron las células con efsevin 1 pM (centro) y una combinación de ambas a dosis subóptimas (derecha). Los rastros de control con rojo de rutenio (RuRed) muestran la especificidad mitocondrial de la señal. (B) Rastros representativos de cambios citosólicos de [Ca²⁺] ([Ca²⁺]^c) tras la aplicación de IP³7,5 pM en presencia (+) o ausencia (-) de RuRed. La captación del Ca²⁺mitocondrial se evaluó mediante la diferencia de las condiciones de - y RuRed normalizadas con respecto a la liberación total (n = 4; media ± ET). (C) Se estimularon MEF (Mouse Embryonic Fibroblasts, fibroblastos embrionarios de ratón) que sobreexpresaban la VDAC2 de pez cebra (policistrónico con mCherry) con ATP 1 pM en un tampón nominalmente libre de Ca²⁺. Se obtuvieron imágenes de los cambios en [Ca²⁺]^cy [Ca²⁺]^mutilizando fura2 y pericam inverso dirigido a mitocondrias, respectivamente. Los rastros negros y grises muestran los cursos de tiempo de [Ca²⁺]^c(en nM) y [Ca²⁺]^m(F0/F pericam mit.) en ausencia (izquierda) o presencia (derecha) de efsevin. (D) Gráficos de barras: medias de la población celular para la [Ca²⁺]^cmáxima (izquierda), la correspondiente [Ca²⁺]^m(centro) y el tiempo de acoplamiento (intervalo de tiempo entre las respuestas máximas de [Ca²⁺]^cy [Ca²⁺]^m) en presencia (negro, n = 24) o ausencia (gris, n = 28) de efsevin.

Las Figuras 6A-C muestran los efectos de efsevin en cardiomiocitos aislados. (A) Transitorios de Ca²⁺estimulados eléctricamente a 0,5 Hz (parte superior). La cuantificación normalizada de los parámetros transitorios de Ca²⁺no revela diferencias para la amplitud transitoria (tratados con efsevin al 98,6 ± 4,5 % de los tratados con vehículo) y el tiempo hasta el máximo (95 ± 3,9 %), pero una disminución significativa de la tasa de descomposición (82,8 ± 4 % de los tratados con vehículo para los tratados con efsevin) (panel inferior). (B) Representación de las chispas de Ca²⁺típicas de los cardiomiocitos tratados con vehículo y efsevin (parte superior). No se observaron diferencias para la frecuencia de chispas (101,1 ± 7,7 % para efsevin en comparación con los tratados con vehículo), amplitud máxima de las chispas (101,6 ± 2,5 %) y flujo de liberación de Ca²⁺(98,7 ± 2,8 %). Por el contrario, la fase de desintegración de la chispa única fue significativamente más rápida en las células tratadas con efsevin (82,5 ± 2,1 % de las tratadas con vehículo). Por consiguiente, la duración total de la chispa se redujo hasta el 85,7 ± 2 % y la anchura total se redujo hasta el 89,5 ± 1,4 % de las células tratadas con vehículo. *, p < 0,05; ***, p < 0,001. (C) Análisis cuantitativo de ondas de Ca²⁺espontáneas que abarcan más de la mitad de la célula completa. La adición de efsevin 1 pM redujo las ondas de Ca²⁺hasta aproximadamente la mitad. El aumento de la concentración de efsevin hasta 10 pM redujo aún más el número de ondas espontáneas de Ca²⁺y efsevin 25 pM bloqueó casi por completo la formación de ondas de Ca²⁺.

Las Figuras 7A-7E muestran los resultados de las pruebas que demuestran que las mitocondrias regulan la ritmicidad cardíaca a través de un mecanismo dependiente de VDAC2. MCU y MICU1 se expresan en los corazones de pez cebra en desarrollo. (A) La sobreexpresión de MCU es suficiente para restablecer las contracciones cardíacas coordinadas en los embriones tem (47,1 ± 1,6 % de los embriones, n = 112 frente al 18,3 ± 5,3 % de los hermanos no inyectados, n = 64), mientras que este efecto se atenúa significativamente cuando se inyecta junto con oligonucleótido antisentido morfolino dirigido a VDAC2 (27,1 ± 1,9 % de los embriones, n = 135). B) La sobreexpresión subóptima de MCU (MCU^S) y VDAC2 (VDAC2^S) en combinación es capaz de suprimir la fibrilación cardíaca en embriones tem (42,9 ± 2,6 % de los embriones, n = 129). (C) La capacidad de VDAC2 para restablecer las contracciones rítmicas en embriones tem (48,5 ± 3,5 % de los embriones, n = 111) se atenúa significativamente cuando MCU es atenuado por oligonucleótido antisentido (MO^MCU) (25,6 ± 2,4 % de los embriones, n = 115). (D) La sobreexpresión de MICU1 es suficiente para restablecer las contracciones cardíacas rítmicas en los embriones tem (49,3 ± 3,4 % de los embriones, n = 127 en comparación con el 16,8 ± 1,4 % de los hermanos no inyectados, n = 150). Este efecto es anulado por la atenuación de VDAC2 (MO^VDAC2, 25,3 ± 5,5 % de los embriones, n = 97). (E) La sobreexpresión subóptima de MICU1 (MICU1^S) y VDAC2 (VDAC2^S) en combinación es capaz de restablecer las contracciones cardíacas rítmicas en embriones tem (48,6 ± 6,0 %, n = 106). Las barras de error representan la D.T.; *p <0,05; ***p <0,001.

La Figura 8 muestra la administración local de Ca²⁺entre los receptores IP3 y VDAC2. Se estimularon MEF V1/V3DKO con ATP 100 |jM (izquierda) o tapsigargina 2 j M (Tg) (derecha). Se obtuvieron imágenes de los cambios en [Ca²⁺]^cy [Ca²⁺]^mutilizando fura 2 y pericam inverso dirigido a mitocondrias, respectivamente. Se muestran los rastros representativos obtenidos en 3 células.

Las Figuras 9A-G muestran que las mitocondrias regulan la ritmicidad cardíaca a través de un mecanismo dependiente de VDAC.

A) La inyección de 25 pg de ARNm de VDAC1 y VDAC2 sintetizado in vitro restableció las contracciones cardíacas en el 53,0 ± 10,2 % (n = 126) y el 52,9 ± 12,1 % (n = 78) de los embriones tem de un día de vida, respectivamente, en comparación con el 21,8 ± 5,1 % en hermanos no inyectados (n = 111).

(B) Si bien solo ~20 % de los embriones myl7:VDAC2;NCXlhMO tiene contracciones coordinadas (n = 116), el 52,3 ± 2,4 % de estos embriones establecieron contracciones rítmicas persistentes tras la inducción de TBF de VDAC2 (n = 154).

C) Como media, el 71,2 ± 8,8 % de los embriones tratados con efsevin tiene contracciones cardíacas coordinadas (n = 131). La atenuación del oligonucleótido antisentido morfolino de VDAC2 MO^VDAC2) o VDAC1 (MO^VDAC1) atenúa la capacidad de efsevin para suprimir la fibrilación cardíaca en embriones tem (45,3 ± 7,4 % y 46,9 ± 10,7 % de los embriones con contracciones coordinadas, n = 94 y 114, respectivamente). La atenuación de VDAC1/2 suprime simultáneamente además el efecto de efsevin (30,3 ± 6,3 %, n = 75).

D) El tratamiento con efsevin restablece las contracciones cardíacas coordinadas en el 76,2 ± 8,7 % de los embriones NCX1MO, solo el 54,1 ± 3,6 % de VDAC2^zfn/zfn; embriones NCX1MO y el 35,7 ± 7,1 % de VDAC2^zfn/zfn; VDAC1MO; los embriones NCX1MO tienen contracciones coordinadas (n = 250).

(E) La sobreexpresión de MCU es suficiente para restablecer las contracciones cardíacas coordinadas en los embriones tem (47,1 ± 1,6 % de los embriones, n = 112 frente al 18,3 ± 5,3 % de los hermanos no inyectados, n = 64), mientras que este efecto se atenúa significativamente cuando se inyecta junto con oligonucleótido antisentido morfolino dirigido a VDAC2 (27,1 ± 1,9 % de los embriones, n = 135).

F) La sobreexpresión subóptima de MCU (MCU^S) y VDAC2 (VDAC2^S) en combinación es capaz de suprimir la fibrilación cardíaca en embriones tem (42,9 ± 2,6 % de los embriones, n = 129).

G) La capacidad de VDAC2 para restablecer las contracciones rítmicas en embriones tem (48,5 ± 3,5 % de los embriones, n = 111) se atenúa significativamente cuando MCU es atenuado por oligonucleótido antisentido (MO^MCU) (25,6 ± 2,4 % de los embriones, n = 115). Las barras de error representan la D.T.; *p <0,05; ***p <0,001.

La Figura 10 muestra la resolución de (R)- y (S)-efsevin de una mezcla de (R)- y (S)-efsevin a través de la separación mediante HPLC.

La Figura 11 muestra la purificación de (R)-efsevin a través de la separación mediante HPLC.

La Figura 12 muestra la purificación de (S)-efsevin a través de la separación mediante HPLC.

La Figura 13 muestra la resolución de (R)- y (S)-efsevin de una mezcla racémica de efsevin a través de la separación mediante HPLC.

La Figura 14 muestra la RMN de ¹H (parte superior) y la RMN de ¹³C (parte inferior) del éster de mentol de (R)-efsevin.

La Figura 15 muestra la RMN de ¹H (parte superior) y la RMN de ¹³C (parte inferior) del éster de mentol de (S)-efsevin.

Las Figuras 16A y B muestran los compuestos activos que se encuentran a través de la genética química avanzada.

Descripción detallada de la invención

A. Definiciones

El término "cantidad eficaz", como se utiliza en el presente documento, es una cantidad de un agente que es suficiente para producir un cambio medible estadísticamente significativo de una condición de ritmicidad cardíaca en comparación con la condición de ritmicidad cardíaca sin usar el agente. Estas cantidades eficaces se pueden medir en ensayos clínicos y en estudios con animales. Tal cambio medible y positivo, estadísticamente significativo, de una condición de ritmicidad cardíaca utilizando el agente desvelado en el presente documento en comparación con la condición de ritmicidad cardíaca sin usar el agente se denomina "condición mejorada".

Como se utiliza en el presente documento, el término "agente" se refiere a un agente que es capaz de potenciar la captación del Ca2+ mitocondrial para efectuar la expresión de VDAC2 en un sujeto. En algunos aspectos, el término agente puede denominarse fármaco o compuesto "antiarrítmico".

Como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" como se usa en el presente documento es cualquier vertebrado. Los sujetos incluyen individuos que necesitan tratamiento con fármacos (p. ej., un agente desvelado en el presente documento tal como efsevin) (pacientes) e individuos que no necesitan tratamiento con fármacos (p. ej., voluntarios sanos normales). Los seres humanos son sujetos y pacientes preferidos.

"Tratar" o "tratamiento" se refiere a cualquier tratamiento de un trastorno o una enfermedad, tal como prevenir que se produzca el trastorno o la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto al trastorno o a la enfermedad, pero a quien no se ha diagnosticado el trastorno o la enfermedad; inhibir el trastorno o la enfermedad, p. ej., detener el desarrollo del trastorno o enfermedad, aliviar el trastorno o la enfermedad, provocar la regresión del trastorno o enfermedad, aliviar una afección provocada por la enfermedad o el trastorno, o reducir los síntomas de la enfermedad o trastorno.

Como se utiliza en el presente documento, el término "trastorno" generalmente se refiere a una afección relacionada con la arritmicidad cardíaca o un trastorno cardíaco con una raíz en la manipulación aberrante del Ca2+. Tal trastorno incluye, por ejemplo, fibrilación cardíaca, arritmia, fibrilación auricular, síndrome del seno enfermo, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica o miocardiopatía.

Como se utiliza en el presente documento, el término "derivado" se refiere a una forma del agente o compuesto desvelado en el presente documento, cuyo derivado es capaz de generar una especie o un resto activo in vitro o in vivo que tiene actividades antiarrítmicas tales como es el agente o compuesto desvelado en el presente documento. Los ejemplos no limitativos de tal "derivado" incluyen profármacos o metabolitos.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "ópticamente activo" se refiere al compuesto de Fórmula I desvelado en el presente documento que no es una mezcla racémica R/S 50/50 del compuesto de Fórmula I.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "esencialmente enantioméricamente puro" se refiere a la pureza del enantiómero S o R del compuesto de Fórmula I de aproximadamente el 60 %-aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 70 %-aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 80 %-aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 90 %-aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 95 %-aproximadamente el 100 %, p. ej., de aproximadamente el 75 %, de aproximadamente el 80 %, de aproximadamente el 85 % o de aproximadamente el 99 %.

Como se utiliza en el presente documento, el término "enantiómero" se refiere a un compuesto desvelado en el presente documento que es ópticamente activo o esencialmente enantioméricamente puro.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "que comprende" o el término "comprende" se usan en referencia a composiciones, métodos y respectivos componentes de los mismos, que son esenciales para la invención, pero abiertos a la inclusión de elementos no especificados, ya sean esenciales o no.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "que consiste esencialmente en" se refiere a aquellos elementos requeridos para un aspecto dado. La expresión permite la presencia de elementos adicionales que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas o funcionales de ese aspecto de la invención.

La expresión "que consiste en" se refiere a composiciones, métodos y componentes correspondientes de los mismos como se describe en el presente documento, que son exclusivos de cualquier elemento no mencionado en esa descripción del aspecto.

Como se utiliza en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, las referencias a "el método" incluyen uno o más métodos, y/o etapas del tipo que se describe en el presente documento y/o que serán evidentes para los expertos en la materia después de leer esta divulgación y así sucesivamente.

B. La captación del Ca2+ mitocondrial regula la ritmicidad cardíaca

En el presente documento, también se describe un método para regular la ritmicidad cardíaca en un sujeto, que comprende potenciar la captación del Ca2+ mitocondrial induciendo la sobreexpresión de VDAC2 o VDAC1 en el sujeto para restablecer la contracción rítmica, inducir la sobreexpresión del o activar el complejo VDAC (VDAC2 o VDAC1) y/o MCU (MCU o MICU1), o administrar al sujeto que lo necesite un agente eficaz para inducir la actividad transportadora del Ca2+ de VDAC2 o VDAC1.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, el sujeto padece un trastorno relacionado con la arritmicidad cardíaca o un trastorno cardíaco con una raíz en la manipulación aberrante del Ca2+. Tal trastorno incluye, por ejemplo, fibrilación cardíaca, arritmia, fibrilación auricular, síndrome del seno enfermo, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica o miocardiopatía.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, el agente es el compuesto de Fórmula I, que se describe con detalle más adelante. Para que la descripción sea concisa, aquí no se repite la descripción del compuesto de Fórmula I, pero se incorpora completamente como referencia en el presente documento.

C. Terapia génica

En algunos aspectos, la potenciación de la captación del Ca2+ mitocondrial se puede lograr mediante la sobreexpresión de VDAC2 o VDAC1 mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una secuencia génica codificante de VDAC2 o VDAC1 utilizando un vector vírico o no vírico. Los vectores para la transducción de una secuencia codificante de VDAC2 o VDAC1 son bien conocidos en la técnica. Aunque se puede utilizar la sobreexpresión utilizando un potente promotor inespecífico, tal como un promotor de CMV, puede resultar útil incluir un promotor específico del tejido o tipo celular en la construcción de expresión. Además, el tratamiento puede incluir la administración de vectores víricos que conduzcan a la sobreexpresión de proteínas VDAC2 o VDAC1 en células hospedadoras infectadas. Los vectores víricos son bien conocidos por los expertos en la materia.

Estos vectores se adaptan fácilmente para usarlos en los métodos descritos en el presente documento. Mediante la manipulación adecuada utilizando técnicas de ADN recombinante/biología molecular para introducir un segmento de ácido nucleico codificante de VDAC2 o VDAC1 unido operativamente en el vector de expresión/administración seleccionado, se pueden generar muchos vectores equivalentes para la práctica de los métodos descritos en el presente documento. Los expertos en la materia apreciarán que los genes clonados pueden manipularse fácilmente para alterar la secuencia de aminoácidos de una proteína.

El gen clonado para VDAC2 o VDAC1 se puede manipular mediante una variedad de técnicas bien conocidas para la mutagénesis in vitro, entre otras, para producir variantes de la proteína humana natural, denominadas en el presente documento muteínas, variantes o mutantes de VDAC2 o VDAC1, que se pueden utilizar de acuerdo con los métodos y las composiciones descritos en el presente documento. La variación en la estructura primaria de las muteínas de la proteína VDAC2 o VDAC1 útil en la invención, por ejemplo, puede incluir deleciones, adiciones y sustituciones. Las sustituciones pueden ser conservativas o no conservativas. Las diferencias entre la proteína natural y la muteína generalmente conservan las propiedades deseadas, mitigan o eliminan propiedades no deseadas y añaden propiedades nuevas o deseadas. La proteína VDAC2 o VDAC1 también puede ser un polipéptido de fusión, fusionado, por ejemplo, a un polipéptido que dirige el producto a una ubicación deseada o, por ejemplo, un marcador que facilite su purificación, si así se desea. También se contempla la fusión a una secuencia polipeptídica que aumente la estabilidad de la proteína VDAC2. Por ejemplo, la fusión a una proteína sérica, p. ej., albúmina sérica, puede aumentar la semivida circulante de una proteína VDAC2 o VDAC1. Se pueden diseñar marcadores y parejas de fusión para que sean escindibles, si así se desea. Otra modificación contemplada específicamente es la unión, p. ej., la unión covalente, a un polímero. En un aspecto, los polímeros tales como polietilenglicol (PEG) o metoxipolietilenglicol (mPEG) pueden aumentar la semivida in vivo de las proteínas a las que están conjugados. Los métodos de PEGilación de agentes polipeptídicos son bien conocidos por los expertos en la materia, pues son consideraciones de, por ejemplo, el tamaño del polímero de PEG que se vaya a utilizar. En otro aspecto, los polímeros biodegradables o absorbibles pueden proporcionar una liberación prolongada, a menudo localizada, de agentes polipeptídicos. Tales polímeros biocompatibles, bioabsorbibles sintéticos, que pueden liberar proteínas durante varias semanas o meses pueden incluir, por ejemplo, poli-a-hidroxiácidos (p. ej., polilactidas, poliglicólidos y sus copolímeros), polianhídridos, poliortoésteres, copolímeros de bloques segmentados de polietilenglicol y tereftalato de polibutileno (Polyactive™), polímeros derivados de tirosina o poli(éster-amidas). Se analizan polímeros bioabsorbibles adecuados para usar en la fabricación de implantes y materiales de administración de fármacos, p. ej., en las patentes de EE.UU. n.° 4.968.317; 5618563, entre otras y en "Biomedical Polymers" editado por S. W. Shalaby, Car1Hanser Verlag, Munich, Viena, Nueva York, 1994 y en muchas referencias citadas en las publicaciones anteriores. El polímero bioabsorbible particular que se debe seleccionar dependerá del paciente que se esté tratando en particular.

D. Compuesto antiarrítmicos

En el presente documento, también se describe un compuesto antiarrítmico de estructura de Fórmula I o un derivado del mismo:

Fórmula I

en donde: Ri es grupo tosilo o mesilo; y en donde R2 es un grupo hidrocarbilo con o sin un heteroátomo y en donde el compuesto es eficaz para potenciar la captación del Ca2+ mitocondrial para modular la ritmicidad cardíaca en un sujeto, con la condición de que cuando Ri sea tosilo y R2 sea etilo, el compuesto esté en una forma opcionalmente activa (p. ej., esencialmente enantioméricamente pura) de fórmula la o fórmula Ib:

Los ejemplos no limitativos de derivados de Fórmula I incluyen la Fórmula Ic:

Fórmula le

en donde: R1 es un grupo alcano, fenilo, heteroarilo o fenilo sustituido; R2 es un grupo fenilo, heteroarilo, fenilo sustituido o hidrocarbilo con o sin heteroátomo, y R3 es un alcoxi, amino o amino-éter. Los ejemplos no limitativos de un grupo fenilo sustituido es un grupo fenilo en donde uno o más hidrógenos se reemplazan por un alcano, amino, amino-éter o heteroátomo.

En algunos aspectos, R3 es un alcoxi, amino, amino-éter, grupo 2-aminoetoxietoxietilamino protegido con N-Boc o un grupo alquiloxi C1-C10 lineal o ramificado, acíclico o cíclico, ariloxi o grupo amino con o sin heteroátomo.

En algunos aspectos, el R1 es para-toílo, R2 es fenilo y R3 es etoxi.

En algunos aspectos, R3 es etoxi, mentiloxi o grupo 2-aminoetoxietoxietalamino protegido con N-Box.

En el presente documento, también se describe un método de formación del compuesto de Fórmula Ic:

Fórmula Ic

donde R1 es fenilo sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; y R2 es fenilo sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; y R3 es R3 es un alcoxi, amino, amino-éter, grupo 2-aminoetoxietoxietil-amino protegido con N-Boc o un grupo alquiloxi C1-C10 lineal o ramificado, acíclico o cíclico, ariloxi o grupo amino con o sin heteroátomo que comprende hacer reaccionar

con

de acuerdo con una reacción del Esquema I

para formar el compuesto de Fórmula Ic.

En algunos aspectos, el compuesto es uno cualquiera de, (Fig. 16A-B)

E. Método de síntesis

En el presente documento, también se describe un método de formación del compuesto de Fórmula I:

^{,N Ph}: COOR2

Fórmula I

donde Ri es grupo tosilo o mesilo; y R2 es un grupo hidrocarbilo con o sin un heteroátomo, que comprenden hacer reaccionar

con

de acuerdo con una reacción del Esquema I

para formar el compuesto de Fórmula I.

La descripción del compuesto de Fórmula I se ha proporcionado anteriormente en su totalidad. Para que la descripción sea concisa, aquí no se repite la descripción del compuesto de Fórmula I, pero se incorpora completamente como referencia en el presente documento.

F. Composiciones

En el presente documento, también se describe una composición que comprende un compuesto antiarrítmico de Fórmula I, que se ha descrito anteriormente. Para que la descripción sea concisa, aquí no se repite la descripción del compuesto de Fórmula I, pero se incorpora completamente como referencia en el presente documento.

En el presente documento, también se describe un método de formación de una composición, que comprende proporcionar un compuesto de Fórmula I en una cantidad eficaz y formar la composición.

El compuesto de Fórmula I se ha descrito anteriormente en su totalidad. Para que la descripción sea concisa, aquí no se repite la descripción del compuesto de Fórmula I, pero se incorpora completamente como referencia en el presente documento.

En algunos aspectos, opcionalmente en combinación con cualquiera o todos los diferentes aspectos desvelados en el presente documento, la composición está en una formulación adecuada para la administración a un sujeto para tratar o mejorar un trastorno relacionado con la arritmicidad cardíaca, p. ej., fibrilación cardíaca.

G. Formulaciones

El compuesto o la composición se pueden formular en cualquier formulación deseable. Tales formulaciones pueden incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable, que puede ser, p. ej., destacado o puede comprender un material polimérico.

En algunos aspectos, el vehículo desvelado en el presente documento puede ser un material polimérico. El material polimérico ilustrativo que se puede utilizar en el presente documento incluye, pero sin limitación, un polímero biocompatible o bioabsorbible que es uno o más de poli(^DL-láctido), poli(^L-láctido), poli(^L-láctido), poli(^L-láctido-co-^D,L-láctido), polimandelida, poliglicolida, poli(láctido-co-glicólido), poli(^{D L}-láctido-co-glicólido), poli(^L-láctido-co-glicólido), poli(éster-amida), poli(orto-ésteres), poli(ácido glicólico-co-carbonato de trimetileno), poli(^D,L-láctido-co-carbonato de trimetileno), poli(carbonato de trimetileno), poli(láctido-co-caprolactona), poli(glicólido-co-caprolactona), poli (éster de tirosina), polianhídrido, derivados de los mismos. En algunos aspectos, el material polimérico comprende una combinación de estos polímeros.

En algunos aspectos, el material polimérico comprende poli(^D,L-láctido-co-glicólido). En algunos aspectos, el material polimérico comprende poli(^D,L-láctido). En algunos aspectos, el material polimérico comprende poli(^L-láctido). Los polímeros ilustrativos adicionales incluyen, pero sin limitación, poli(D-láctido) (PDLA), polimandelida (PM), poliglicólido (PGA), poli(^L-láctido-co-D,L-láctido) (PlDLA), poli(^D,L-láctido) (pDlLA), poli(^D,L-láctido-co-glicólido) (PLGA) y poli(^L-láctido-co-glicólido) (PLLGA). Con respecto a PLLGA, el armazón del stent puede estar hecho de PLLGA con un % molar de GA de entre el 5-15 % molar. El PLLGA puede tener un % molar de (LA:GA) de 85:15 (o un intervalo de 82:18 a 88:12), 95:5 (o un intervalo de 93:7 a 97:3) o productos de PLLGA disponibles en el mercado identificados como PLLGA 85:15 o 95:5. Los ejemplos proporcionados anteriormente no son los únicos polímeros que se pueden utilizar. Se pueden proporcionar muchos otros ejemplos, tales como los que se encuentran en "Polymeric Biomaterials", segunda edición, editado por Severian Dumitriu; capítulo 4.

En algunos aspectos, también se pueden utilizar polímeros que sean más flexibles o que tengan un módulo inferior que los mencionados anteriormente. Los ejemplos de polímeros bioabsorbibles de módulo inferior incluyen, policaprolactona (PCL), poli(carbonato de trimetileno) (PTMC), polidioxanona (PDO), poli(3-hidrobutirato) (PHB), poli(4-hidroxibutirato) (P4HB), poli(hidroxialcanoato) (PHA) y poli(succinato de butileno) y mezclas y copolímeros de los mismos.

En aspectos ilustrativos, se pueden mezclar polímeros de módulo superior tales como PLLA o PLLGA con polímeros o copolímeros de módulo inferior con PLLA o PLGA. Los polímeros de módulo inferior mezclados dan lugar a una mezcla que tiene una mayor tenacidad a la fractura que el polímero de módulo alto. Los copolímeros de módulo bajo ilustrativos incluyen poli(^L-láctido)-b-policaprolactona (PLLA-b-PCL) o poli(^L-láctido)-co-policaprolactona (PLLA-co-PCL). La composición de una mezcla puede incluir el 1-5 % en peso de polímero de módulo bajo.

Más polímeros ilustrativos incluyen, pero sin limitación, polietilenimina (PEI) al menos parcialmente alquilada; poli(lisina) al menos parcialmente alquilada; poliornitina al menos parcialmente alquilada; poli(amidoamina) al menos parcialmente alquilada, homopolímeros y copolímeros de vinilamina al menos parcialmente alquilados; acrilato al menos parcialmente alquilado que contiene grupos amino, copolímeros de vinilamina que contienen grupos amino con monómeros hidrófobos, copolímeros de acrilato que contienen grupos amino con monómeros hidrófobos y polisacáridos naturales y modificados que contienen amino, poliacrilatos, polimetacriatos, poliureas, poliuretanos, poliolefinas, haluros de polivinilo, haluros de polivinilideno, éteres de polivinilo, polivinilaromáticos, ésteres de polivinilo, poliacrilonitrilos, resinas alquídicas, polisiloxanos y resinas epoxi y mezclas de los mismos. Ejemplos adicionales de polímeros biodegradables biocompatibles incluyen, sin limitación, policaprolactona, poli(^L-láctido), poli(^D,L-láctido), copolímeros de bloques de poli(^D,L-láctido-co-PEG), poli(^D,L-láctido-co-carbonato de trimetileno), poli(láctido-coglicólido), polidioxanona (PDS), poliortoéster, polianhídrido, poli(ácido glicólico-co-carbonato de trimetileno), polifosfoéster, polifosfoéster uretano, poli(aminoácidos), policianoacrilatos, poli(carbonato de trimetileno), poli(iminocarbonato), policarbonatos, poliuretanos, oxalatos de polialquileno, polifosfacenos, PHA-PEG y combinaciones de los mismos. El PHA puede incluir poli(a-hidroxiácidos), poli(p-hidroxiácido) tal como poli(3-hidroxibutirato) (PHB), poli(3-hidroxibutirato-co-valerato) (PHBV), poli(3-hidroxiproprionato) (PHP), poli(3-hidroxihexanoato) (PHH) o poli(4-hidroxiácido) tal como poli poli(4-hidroxibutirato), poli(4-hidroxivalerato), poli(4-hidroxihexanoato), poli(hidroxivalerato), poli(carbonatos de tirosina), poli(arilatos de tirosina), poli(éster-amida), polihidroxialcanoatos (PHA), poli(3-hidroxialcanoatos) tales como poli(3-hidroxipropanoato), poli(3-hidroxibutirato), poli(3-hidroxivalerato), poli(3-hidroxihexanoato), poli(3-hidroxiheptanoato) y poli(3-hidroxioctanoato), poli(4-hidroxialcanaoto) tal como poli(4-hidroxibutirato), poli(4-hidroxivalerato), poli(4-hidroxihexanoto), poli(4-hidroxiheptanoato), poli(4-hidroxioctanoato) y copolímeros que incluyen cualquiera de los monómeros de 3-hidroxialcanoato o 4-hidroxialcanoato descritos en el presente documento o mezclas de los mismos, poli(^D,L-láctido), poli(^L-láctido), poliglicolida, poli(^{D L}-láctido-co-glicólido), poli(^L-láctido-co-glicólido), policaprolactona, poli(láctido-cocaprolactona), poli(glicólido-co-caprolactona), poli(dioxanona), poli(orto-ésteres), poli(anhídridos), poli(carbonatos de tirosina) y derivados de los mismos, poli(éster de tirosina) y derivados de los mismos, poli(carbonatos de imino), poli(ácido glicólico-co-carbonato de trimetileno), polifosfoéster, polifosfoéster uretano, poli(aminoácidos), policianoacrilatos, poli(carbonato de trimetileno), poli(iminocarbonato), polifosfacenos, siliconas, poliésteres, poliolefinas, copolímeros de poliisobutileno y etileno-alfaolefina, polímeros y copolímeros acrílicos, polímeros y copolímeros de haluro de vinilo, tales como cloruro de polivinilo, éteres de polivinilo, tales como éter de polivinilmetilo, haluros de polivinilideno, tales como cloruro de polivinilideno, poliacrilonitrilo, cetonas de polivinilo, aromáticos de polivinilo, tales como poliestireno, ésteres de polivinilo, tales como acetato de polivinilo, copolímeros de monómeros de vinilo entre sí y olefinas, tales como copolímeros de etileno-metacrilato de metilo, copolímeros de acrilonitriloestireno, resinas ABS y copolímeros de etileno-acetato de vinilo, poliamidas, tales como Nailon 66 y policaprolactama, resinas alquídicas, policarbonatos, polioximetilenos, poliimidas, poliéteres, poli(sebacato de glicerilo), poli(fumarato de propileno), poli(metacrilato de n-butilo), poli(metacrilato de sec-butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de terc-butilo), poli(metacrilato de n-propilo), poli(metacrilato de isopropilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de metilo), resinas epoxídicas, poliuretanos, rayón, triacetato de rayón, acetato de celulosa, butirato de celulosa, butirato acetato de celulosa, celofán, nitrato de celulosa, propionato de celulosa, éteres de celulosa, carboximetilcelulosa, poliéteres tales como poli(etilenglicol) (PEG), copoli(éter-ésteres) (p. ej., poli(óxido de etileno-co-ácido láctico) (PEO/PLA)), óxidos de polialquileno tales como poli(óxido de etileno), poli(óxido de propileno), poli(éter-éster), oxalatos de polialquileno, polímero que contiene fosforilcolina, colina, poli(aspirina), polímeros y copolímeros de monómeros portadores de hidroxilo tales como metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), metacrilato de hidroxipropilo (HPMA), hidroxipropilmetacrilamida, acrilato de PEG (PEGA), metacrilato de PEG, polímeros de metacrilato que contienen 2-metacriloiloxietilfosforilcolina (MPC) y n-vinilpirrolidona (VP), monómeros portadores de ácido carboxílico tales como ácido metacrílico (MA), ácido acrílico (AA), alcoximetacrilato, alcoxiacrilato y metacrilato de 3-trimetilsililpropilo (TMSPMA), poli(estireno-isopreno-estireno)-PEG (SIS-PEG), poliestireno-PEG, poliisobutileno-PEG, policaprolactona-PEG (PCL-Pe G), PLA-PEG, poli(metacrilato de metilo), MED610, poli(metacrilato de metilo)-PEG (PMMA-PEG), polidimetilsiloxano-co-PEG (Pd Ms -PEG), poli(fluoruro de vinilideno)-PEG (PVDF-PEG), tensioactivos PLURONIC™ (óxido de polipropileno-co-polietilenglicol), poli(tetrametilenglicol), poli(pirrolidona de vinilo) hidroxi funcional, biomoléculas tales como colágeno, quitosano, alginato, fibrina, fibrinógeno, celulosa, almidón, dextrano, dextrina, ácido hialurónico, fragmentos y derivados de ácido hialurónico, heparina, fragmentos y derivados de heparina, glicosaminoglicano (GAG), derivados de GAG, polisacárido, elastina, miméticos de la proteína elastina o combinaciones de los mismos.

En algunos aspectos, se utiliza polietileno para construir al menos una parte del dispositivo. Por ejemplo, el polietileno se puede utilizar en un implante ortopédico sobre una superficie que está diseñada para entrar en contacto con otro implante, tal como en un reemplazo de articulación o cadera. El polietileno es muy duradero cuando entra en contacto con otros materiales. Cuando un implante de metal se mueve sobre una superficie de polietileno, como ocurre en la mayoría de los reemplazos de articulaciones, el contacto es muy suave y la cantidad de desgaste es mínima. Los pacientes que son más jóvenes o más activos pueden beneficiarse del polietileno por su resistencia al desgaste aún mayor. Esto se puede lograr a través de un proceso denominado reticulación, que crea uniones más fuertes entre los elementos que componen el polietileno. La cantidad adecuada de reticulación depende del tipo de implante. Por ejemplo, la superficie de un implante de cadera puede requerir un grado de reticulación diferente al de la superficie de un implante de rodilla.

Se pueden encontrar ejemplos adicionales de materiales poliméricos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.° 6.127.448 de Domb, la publicación de patente de EE.UU. n.° 2004/0148016 de Klein y Brazilo, la publicación de patente de EE.UU. n.° 2009/0169714 de Burghard et al., la patente de EE.UU. n.° 6.406.792 de Briquet et al., la publicación de patente de EE.UU. n.° 2008/0003256 de Martens et al.

H. Dosificación y administración

La posología puede ser determinada por un experto en la materia y también puede ser ajustada por cada médico en caso de cualquier complicación. Normalmente, la posología varía de 0,0005 mg/kg de peso corporal a 1 g/kg de peso corporal. En algunos aspectos, el intervalo posológico varía de 0,001 mg/kg de peso corporal a 0,5 g/kg de peso corporal, de 0,0005 mg/kg de peso corporal a 0,1 g/kg de peso corporal, de 0,001 mg/kg de peso corporal a 0,05 g/kg de peso corporal.

Como otra alternativa, las dosis se seleccionan para la administración localizada y no necesariamente se seleccionan por el peso corporal o para alcanzar un determinado nivel en suero, sino para lograr un efecto localizado, p. ej., como para una inyección localizada, implantación u otra administración localizada en el ojo.

La administración de las dosis enumeradas anteriormente se puede repetir durante un período de tiempo limitado. En algunos aspectos, las dosis se administran una vez al día o varias veces al día, por ejemplo, pero sin limitación, tres veces al día. En un aspecto preferido, las dosis mencionadas anteriormente se administran diariamente durante varias semanas o meses. La duración del tratamiento depende del progreso clínico del sujeto y de la capacidad de respuesta a la terapia. Se contemplan dosis de mantenimiento relativamente bajas, continuas, tras una dosis terapéutica inicial superior.

Los agentes útiles en los métodos y las composiciones descritos en el presente documento se pueden administrar por vía tópica, vía intravenosa (por bolo o infusión continua), vía oral, por inhalación, vía intraperitoneal, vía intramuscular, vía subcutánea, intracavidad, y se pueden administrar por medios peristálticos, si se desea o por otros medios conocidos por los expertos en la materia. Se prefiere que los agentes para los métodos descritos en el presente documento se administren por vía tópica en el ojo. Para el tratamiento de tumores, el agente se puede administrar sistémicamente o, como alternativa, se puede administrar directamente en el tumor, p. ej., por inyección intratumoral o por inyección en el suministro sanguíneo principal del tumor.

Las composiciones terapéuticas que contienen al menos un agente desvelado en el presente documento se pueden administrar convencionalmente en una dosis unitaria. La expresión "dosis unitaria", cuando se usa en referencia a una composición terapéutica, se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosis unitaria para el sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente fisiológicamente aceptable requerido, es decir, excipiente o vehículo.

Las composiciones se administran de una manera compatible con la forma farmacéutica y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad que se va a administrar y el momento dependen del sujeto que se vaya a tratar, la capacidad del sistema del sujeto de utilizar el principio activo y el grado de efecto terapéutico deseado. Se puede dirigir un agente por medio de un resto de direccionamiento, tal como, por ejemplo, un anticuerpo o tecnología de liposomas dirigidos.

Las cantidades exactas de principio activo que se necesitan administrar dependen del criterio del facultativo y son específicas para cada individuo. Sin embargo, los intervalos posológicos adecuados para la aplicación sistémica se desvelan en el presente documento y dependen de la vía de administración. Las pautas posológicas adecuadas también son variables, pero están tipificadas por una administración inicial seguida por dosis repetidas en uno o más intervalos por una inyección u otra administración posterior. Como alternativa, se contempla la infusión intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones en la sangre en los intervalos especificados para tratamientos in vivo.

Se puede adaptar un agente para sistemas de administración a base de catéteres, incluyendo globos recubiertos, stent liberadores de fármacos de liberación lenta u otros formatos liberadores de fármacos, liposomas de PEG microencapsulados o nanoperlas para la administración mediante intervención mecánica directa con o sin técnicas complementarias tales como ultrasonido, junto con un agente activo como se describe en el presente documento, disuelto o dispersado en los mismos como principio activo. En un aspecto preferido, la composición terapéutica no es inmunogénica cuando se administra a un mamífero o paciente humano con fines terapéuticos. Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "farmacéuticamente aceptable", "fisiológicamente tolerable" y variaciones gramaticales de las mismas, que se refieren a composiciones, vehículos, diluyentes y reactivos, se usan indistintamente y representan que los materiales tienen capacidad de administración en o sobre un mamífero sin la producción de efectos fisiológicos indeseables tales como náuseas, mareos, molestias gástricas y similares. Un vehículo farmacéuticamente aceptable no promoverá la aparición de una respuesta inmunitaria a un agente con el que se mezcla, a menos que se desee. La preparación de una composición farmacológica que contiene principios activos disueltos o dispersos en la misma es bien conocida en la materia y no necesita limitarse a la formulación. Normalmente, dichas composiciones se preparan como inyectables en forma de soluciones o suspensiones líquidas; sin embargo, también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensiones, en líquido antes de su uso. La preparación también se puede emulsionar o presentar como una composición de liposomas. El principio activo puede mezclarse con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo y en cantidades adecuadas para usar en los métodos terapéuticos descritos en el presente documento. Los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Adicionalmente, si se desea, la composición puede contener cantidades mínimas de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH y similares, que potencian la eficacia del principio activo. La composición terapéutica puede incluir sales farmacéuticamente aceptables de los componentes en la misma. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos, tales como acético, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína y similares. Los vehículos fisiológicamente tolerables son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de vehículos líquidos son soluciones acuosas estériles que no contienen materiales además de los principios activos y agua, o contienen un tampón tal como fosfato de sodio a un valor de pH fisiológico, solución salina fisiológica o ambos, tal como solución salina tamponada con fosfato. Adicionalmente, los vehículos acuosos pueden contener más de una sal tamponante, así como sales tales como cloruro de sodio y de potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos. Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas además de y excluyendo el agua. Los ejemplos de dichas fases líquidas adicionales son glicerina, aceites vegetales tales como aceite de semilla de algodón y emulsiones de agua y aceite. La cantidad de un agente activo utilizado en los métodos descritos en el presente documento que será eficaz en el tratamiento de un trastorno o una afección particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección, y se puede determinar mediante técnicas clínicas convencionales.

Ejemplos

Ejemplo 1

(Estudios sobre la captación del Ca2+ mitocondrial por el canal aniónico dependiente de la tensión 2 que regula la ritmicidad cardíaca)

A. Sumario

La regulación estricta de la homeostasis del Ca2+ es un requisito previo para una función cardíaca adecuada. Para analizar la red reguladora de la manipulación del Ca2+ cardíaco, los presentes inventores realizaron un cribado de supresores químicos en embriones temblorosos de pez cebra, que padecen defectos de extrusión del Ca2+. Se identificó efsevin en función de su potente actividad para restablecer las contracciones coordinadas en el temblor. Los presentes inventores demuestran que efsevin se une a VDAC2, potencia la captación del Ca2+ mitocondrial y acelera la transferencia del Ca2+ de las reservas intracelulares a las mitocondrias. En los cardiomiocitos, efsevin restringe los límites temporales y espaciales de las chispas de Ca2+ y, por lo tanto, inhibe las ondas de Ca2+ erráticas y las contracciones irregulares inducidas por la sobrecarga de Ca2+. Además, demuestran que la sobreexpresión de VDAC2 recapitula el efecto supresor de efsevin en embriones temblorosos, mientras que la deficiencia de VDAC2 atenúa el efecto de rescate de efsevin, y que VDAC2 funciona sinérgicamente con MCU para suprimir la fibrilación cardíaca en el temblor. En conjunto, estos hallazgos demuestran un papel modulador fundamental para la captación del Ca2+ mitocondrial dependiente de VDAC2 en la regulación de la ritmicidad cardíaca.

B. Introducción

Durante el desarrollo, los procesos celulares bien orquestados guían a las células de diferentes linajes para que se integren en el tubo cardíaco primitivo y establezcan contracciones rítmicas y coordinadas. Si bien se han identificado muchos genes y vías importantes para la morfogénesis cardíaca, los mecanismos moleculares que gobiernan la ritmicidad cardíaca embrionaria son poco conocidos. Los hallazgos de que las ondas de Ca2+ se desplazan a través del corazón poco después de la formación del tubo cardíaco primitivo (Chi et al., 2008, PLoS Biol 6, e109) y que la pérdida de función de proteínas clave reguladoras del Ca2+, tales como el canal de Ca2+ de tipo L, Na/K-ATPasa e intercambiador de sodio-calcio 1 (NCX1), afecta gravemente a la función cardíaca normal (Rottbauer et al., 2001, Dev Cell 1, 265-275; Shu et al., 2003, Development 130, 6165-6173; Ebert et al., 2005, Proc Natl Acad Sci, EE.UU., 102, 17705-17710; Langenbacher et al., 2005, Proc Natl Acad Sci, EE.UU., 102, 17699-17704), indican un papel esencial para la manipulación del Ca2+ en la regulación de la función cardíaca embrionaria.

La homeostasis del Ca2+ en las células del músculo cardíaco está estrechamente regulada a nivel temporal y espacial por una red subcelular en la que participan múltiples proteínas, vías y orgánulos. La liberación y recaptación del Ca2+ por el Retículo Sarcoplasmático (RS), la mayor reserva de Ca2+ en los cardiomiocitos, constituye el mecanismo principal que gobierna la contracción y relajación del corazón. El influjo de Ca2+ tras la activación del canal de Ca2+ de tipo L en la membrana plasmática induce la liberación de Ca2+ del RS a través de los canales del receptor de rianodina (RyR), lo que conduce a un aumento de la concentración de Ca2+ intracelular y a la contracción cardíaca. Durante la relajación diastólica, el Ca2+ es transferido de nuevo al RS por la bomba de Ca2+ del RS o se extruye de la célula a través de NCX1. Los defectos en la manipulación cardíaca del Ca2+ y la sobrecarga de Ca2+, por ejemplo, durante la isquemia/reperfusión cardíaca o en el síndrome de QT largo, son causas muy conocidas de disfunción contráctil y de muchos tipos de arritmias, incluyendo las posdespolarizaciones tempranas y tardías y la Torsade des pointes (Bers, 2002, Nature 415, 198-205; Choi et al., 2002, J Physiol 543, 615-631; Yano et al., 2008, Circ J 72, A22-30; Greiser et al., 2011, Cardiovasc Res 89, 722-733).

Se ha observado la interferencia del Ca2+ entre las mitocondrias y RE/RS en muchos tipos de células, y el canal aniónico dependiente de la tensión (VDAC) y el uniportador de Ca2+ mitocondrial (MCU) sirven como vías primarias para la entrada de Ca2+ a través de las membranas mitocondriales externas e internas, respectivamente (Rapizzi et al., 2002, J Cell Biol 159, 613-624; Bathori et al., J Biol Chem 2006, 281, 17347-17358; Shoshan-Barmatz et al., 2010, Mol Aspects Med 31, 227-285; Baughman et al., 2011, Nature 476, 341-345; De Stefani et al., 2011, Nature 476, 336 340). En el corazón, las mitocondrias están atadas al RS y están ubicadas muy cerca de los sitios de liberación de Ca2+ (Garcia-Perez et al., 2008, J Biol Chem 283, 32771-32780; Boncompagni et al., 2009, Mol Biol Cell 20, 1058 1067; Hayashi et al., 2009, J Cell Sci 122, 1005-1013). Esta arquitectura subcelular expone las mitocondrias cerca de los sitios de liberación de Ca2+ a una alta concentración local de Ca2+ que es suficiente para superar la baja afinidad de Ca2+ del MCU, y facilita la interferencia del Ca2+ entre el RS y las mitocondrias (Garcia-Perez et al., 2008; Dorn et al., 2010, Circ Res 107, 689-699; Kohlhaas et al., 2013, Cardiovasc Res 98, 259-268). El aumento de la concentración de Ca2+ mitocondrial potencia la producción de energía durante una mayor carga de trabajo y la desregulación de la señalización de Ca2+ mitocondrial del RS produce déficits energéticos y estrés oxidativo en el corazón y puede desencadenar la muerte celular programada (Brandes et al., 1997, Circ Res 80, 82-87; Maack et al., 2006, Circ Res 99, 172-182; Kohlhaas et al., 2013). Sin embargo, se requiere una investigación adicional sobre si la interferencia del Ca2+ mitocondrial del RS también contribuye de manera significativa a la señalización del Ca2+ cardíaco durante el acoplamiento de excitación-contracción.

En el pez cebra, el locus temblor (tem) codifica una isoforma cardíaca específica del intercambiador 1 de Na+/Ca2+, NCX1h (también conocido como slc8ala) (Ebert et al., 2005; Langenbacher et al., 2005). Los corazones tem mutantes carecen de transitorios de Ca2+ rítmicos y muestran señales de Ca2+ caóticas en el miocardio que conducen a contracciones no sincronizadas que se asemejan a la fibrilación cardíaca (Langenbacher et al., 2005). En este estudio, los inventores utilizaron tem como un modelo con animales para la disfunción cardíaca inducida por la manipulación aberrante del Ca2+ y adoptaron un enfoque genético químico para diseccionar la red reguladora del Ca2+ importante para mantener la ritmicidad cardíaca. Se identificó un compuesto sintético denominado efsevin a partir de un cribado de supresores debido a su potente capacidad para restablecer las contracciones coordinadas en tem. Utilizando enfoques bioquímicos y genéticos, los presentes inventores demuestran que efsevin interactúa con VDAC2 y potencia su actividad de transporte del Ca2+ mitocondrial, y modula espacial y temporalmente las señales de Ca2+ citosólico en los cardiomiocitos. El importante papel de la captación del Ca2+ mitocondrial en la regulación de la ritmicidad cardíaca se ve reforzado por el efecto supresor de la sobreexpresión de VDAC2 y MCU sobre la fibrilación cardíaca en tem.

C. Materiales y métodos

Cría de pez cebra y estirpes transgénicas.

Se mantuvieron y criaron peces cebra de la estirpe mutante temblorosa (temtc318) como se ha descrito anteriormente (Langenbacher et al., 2005). Se crearon estirpes transgénicas myl7:gCaMP4.1LA2124 y myl7:VDAC2LA2309 utilizando el Tol2kit (Esengil et al., 2007, Nat Chem Biol 3, 154-155; Kwan et al., 2007, Dev Dyn 236, 3088-3099; Shindo et al., 2010, PLoS One 5, e8897). Se creó el VDAC2LA2256 utilizando la matriz de dedos de zinc OZ523 y OZ524 generada por el Consorcio de dedos de zinc de pez cebra (Foley et al., 2009a, Nature protocols 4, 1855-1867; Foley et al., 2009b, PLoS One 4, e4348).

Molecular Biology.

Se adquirió ADNc de VDAC2 de longitud completa de Open Biosystems y se clonó en pCS2+ o pCS2+ 3XFLAG. Se amplificaron fragmentos de ADNc de longitud completa de MCU de pez cebra (número de acceso: JX424822) y MICU1 (JX42823) de embriones a los 2 d de la fecundación y se clonaron en pCS2+. Para la síntesis de ARNm, se linealizaron los plásmidos y se sintetizó el ARNm utilizando el kit SP6 mMESSAGE mMachine de acuerdo con el manual de los fabricantes (Ambion).

Inyecciones en pez cebra.

Se inyectaron ARNm de VDAC2 y oligonucleótidos antisentido morfolino (5'-GGGAACGGCCATTTTATCTGTTAAA-3') (Genetools) (SEQ ID NO: 9) en embriones en estadio de una célula recogidos de cruces de heterocigotos temtc318. Se analizó el rendimiento cardíaco mediante inspección visual 1 día después de la fecundación. Los embriones mutantes tem se identificaron mediante la observación del fenotipo de fibrilación a los 2-3 d de la fecundación o mediante el genotipado como se ha descrito anteriormente (Langenbacher et al., 2005).

Cribado químico.

Se seleccionaron compuestos químicos de una biblioteca sintética (Castellano et al., 2007, J Am Chem Soc 129, 5843 5845; Choi et al., 2011, Development 138, 1173-1181; Cruz et al., 2011, Proc Natl Acad Sci, EE.UU., 108, 6769-6774) y de Biomol International LP para determinar su capacidad para restablecer parcial o totalmente los latidos cardíacos persistentes en embriones tem. Se criaron 12 embriones recogidos de cruces de heterocigotos temtc318 en presencia de compuestos individuales a una concentración de 10 pM a partir de las 4 h de la fecundación (Choi et al., 2011). Se analizó la función cardíaca mediante inspección visual a los 1 y 2 d después de la fecundación. Los corazones de los embriones temtc318 manifiestan un movimiento caótico que se asemeja a la fibrilación cardíaca con contracciones intermitentes en raras ocasiones (Ebert et al., 2005; Langenbacher et al., 2005). Los compuestos que provocan contracciones cardíacas coordinadas persistentes se validaron en un gran número de embriones mutantes tem y morfantes NCX1h (> 500 embriones).

Imágenes cardíacas de pez cebra.

Se tomaron películas de corazones myl7:GFP marcados con GFP a 30 fotogramas por segundo. Se realizó el análisis de barrido lineal se realizó a lo largo de una línea a través de las aurículas o los ventrículos de estos corazones (Nguyen et al., 2009, Drug Discovery Today: Disease Models 5). Se dedujo la fracción de acortamiento de la proporción entre la anchura diastólica y sistólica, y se determinó la frecuencia cardíaca en latidos por minuto. Se analizaron los parámetros cardíacos en tremblortc318 y VDAC2LA2256 a los 2 d de la fecundación.

Mapeo óptico del pez cebra.

Se obtuvieron imágenes de embriones myl7:gCaAMP4.1 a las 36 h de la fecundación a una frecuencia de fotogramas de 30 ms/fotograma. El aislamiento electromecánico se logró mediante tnnt2MO (Milan et al., 2006, Development 133, 1125-1132). Se normalizó la intensidad de fluorescencia de cada píxel de un mapa 2D para generar mapas de calor y se obtuvieron líneas isócronas a intervalos de 33 ms identificando el gradiente espacial máximo para un punto de tiempo determinado (Chi et al., 2008).

Células madre embrionarias de ratón y humanas.

Se cultivaron y diferenciaron la estirpe de ESC de ratón E14Tg2a y la estirpe de ESC humana H9 como se ha descrito anteriormente (Blin et al., 2010, J Clin Invest 120, 1125-1139; Arshi et al., 2013, Sci Technol Adv Mater 2013, 025003). En el día 10 de diferenciación, se expusieron los EB de ratones con latido a una solución externa que contenía CaCb 10 mM durante 10 minutos antes del tratamiento con DMSO o efsevin (10 j M). Se diferenciaron EB humanos durante 15 días y se trataron con CaCb 5 mM durante 10 minutos antes del tratamiento con DMSO o efsevin (5 j M). Se obtuvieron imágenes de los EB con latido a una velocidad de 30 fotogramas/segundo y se analizaron mediante un software de detección del movimiento. Para el registro de calcio, se cargaron los EB con fluo-4 AM 10 j M en medio de cultivo durante 30 minutos a 37 °C. Se realizó un análisis de barrido lineal y se adquirieron señales fluorescentes mediante un microscopio confocal Zeiss LSM510.

Mediciones de matriz de microelectrodos.

Se colocaron embriones de tipo silvestre, tem y tem tratados con efsevin de dos días de vida en matrices de microelectrodos (MEA, MicroElectrode Arrays) sin revestir que contenían 120 electrodos de TiN integrados (30 jm de diámetro, 200 jm de separación entre electrodos). Se recogieron los potenciales de campo local (LFP, Local Field Potentials) en cada electrodo para tres ensayos por cada tipo de embrión durante un período de tres minutos a una frecuencia de muestreo de 1 kHz utilizando el sistema MEA2100-HS120 (Multichannel Systems, Reutiligen, Alemania). Se filtraron los datos brutos en paso bajo a una frecuencia de corte de 10 Hz utilizando un filtro Butterworth de tercer orden. El análisis de datos se llevó a cabo utilizando MC DataTool (Multichannel Systems) y Matlab (MathWorks).

Obtención de imágenes de Ca2+.

Se aislaron cardiomiocitos ventriculares murinos como se ha descrito previamente (Reuter et al., 2004, J Physiol 554, 779-789). Se cargaron células con fluo-4 AM 5 j M en una solución externa que contenía: NaCl 138,2 mM, KCl 4,6 mM, MgCl 1,2 mM, glucosa 15 mM, HEPES 20 mM durante 1 hora y se obtuvieron imágenes en una solución externa complementada con CaCb 2, 5 o 10 mM. Para el registro de chispas y transitorios de Ca²⁺, la solución externa contenía CaCl²2 mM. Para los transitorios de Ca²⁺, las células se estimularon en campo a 0,5 Hz con un pulso de 5 ms a un tensión del 20 % por encima del umbral de contracción. Para todas las mediciones, se añadió efsevin 2 horas antes del experimento real. Las imágenes se registraron en un microscopio confocal Zeiss LSM 5 Pascal. El análisis de datos se llevó a cabo utilizando Zeiss LSM Image Browser e ImageJ con el complemento SparkMaster (Picht et al., 2007, Am J Physiol Cell Physiol 293, C1073-1081). Las células se examinaron a simple vista antes y después de cada registro. Solo se incluyeron en el análisis aquellos registros de células de aspecto sano con bordes distintos, estrías uniformes y sin ampollas o granularidad en la membrana.

Bioquímica.

Para los ensayos de extracción, se unió 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) protegida con mono-N-Boc al éster carboxílico de efsevin y sus derivados a través del enlace amida. Tras eliminar el grupo Boc utilizando TFA, se acopló la amina primaria al ácido carboxílico de gel Affi-Gel 10 (Biorad). Se desvitelinizaron embriones de pez cebra de dos días de vida mediante centrifugación antes de ser lisados con tampón de lisis de Rubinfeld (Rubinfeld et al., 1993, Science 262, 1731-1734). El lisado se limpió previamente mediante incubación con gel Affi-Gel 10 para eliminar la unión inespecífica. Se incubó el lisado previamente limpiado con perlas de afinidad durante la noche. Se eluyeron las proteínas de las perlas de afinidad y se separaron sobre SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico). Se escindieron las bandas de proteínas de interés. Se deshidrataron tapones de gel en acetonitrilo (ACN) y se secaron completamente en un Speedvac. Se redujeron las muestras y se sometieron a alquilación con ditiotreitol 10 mM y solución de TCEP 10 mM en NH⁴HCO³50 mM (30 min a 56 °C) y yodoacetamida 100 mM (45 min a oscuras), respectivamente. Se lavaron los tapones de gel con NH⁴HCO³50 mM, se deshidrataron con ACN y se secaron en un Speedvac. A continuación, se hincharon fragmentos de gel en tampón de digestión que contenía NH⁴HCO³50 mM y 20,0 ng/pl de quimotripsina (25 °C, durante la noche). Se extrajeron péptidos con t Fa al 0,1 % en una solución de ACN al 50 %, se secaron y se volvieron a suspender en tampón LC A (ácido fórmico al 0,1 %, ACN al 2 %).

Análisis de espectrometría de masas y búsqueda en bases de datos.

Los péptidos extraídos se analizaron mediante LC/MS/MS (Liquid Chromatography with tandem Mass Spectrometry, cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem) de nano-flujo en un Thermo Orbitrap con nanobomba Eksigent especializada utilizando una columna de fase inversa (New Objective). El caudal fue de 200 nl/min para la separación: la fase móvil A contenía ácido fórmico al 0,1 %, ACN al 2 % en agua, y la fase móvil B contenía ácido fórmico al 0,1 %, agua al 20 % en ACN. El gradiente utilizado para los análisis fue lineal del 5 % de B al 50 % de B durante 60 min, a continuación, 95 % de B durante 15 min y finalmente manteniendo constante el 95 % de B durante 10 min. Los espectros se adquirieron en modo dependiente de los datos con exclusión dinámica, donde el instrumento selecciona los seis iones más abundantes en los espectros originales para la fragmentación. Los datos se buscaron en la base de datos del IPI de Danio rerio v3.45 utilizando el algoritmo SEQUEST en el programa de software BioWorks versión 3.3.1 SP1. Todos los espectros utilizados para la identificación tenían deltaCN > 0,1 y cumplían los siguientes criterios de Xcorr: >2 (+1), >3 (+2), >4 (+3) y >5 (+4). Las búsquedas requirieron una escisión completa con la enzima, <4 escisiones perdidas y se realizaron con las modificaciones diferenciales de carbamidometilación sobre la oxidación de cisteína y metionina.

Hibridación in situ.

La hibridación in situ se realizó como se ha descrito anteriormente (Chen et al., 1996, Development 122, 3809-3816). Se sintetizó sonda de ARN marcada con DIG utilizando el kit de marcaje de ARN de DIG (Roche).

Inmunotinción.

Se transfectaron células HeLa con un VDAC1 o VDAC2 de pez cebra marcado con FLAG en el extremo C-terminal en el plásmido pCS2+ utilizando Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen). Tras teñir con MitoTracker® Orange (Invitrogen), se fijaron las células en formaldehído al 3,7 % y se permeabilizaron con acetona. La inmunotinción se realizó utilizando el anticuerpo primario ANTI-FLAG® M2 (Sigma Aldrich) a 1:100 y el anticuerpo secundario anti-IgG1 de ratón-FITC (Southern Biotechnology Associates) a 1:200. Se montaron las células y se sometieron a contratinción utilizando Vectashield® Hard Set™ con DAPI (Vector Laboratories).

Ensayo de captación del Ca2+ de mitocondrias en células HeLa.

Se transfectaron células HeLa con VDAC2 de pez cebra utilizando Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen). 36 horas después de la transfección, las células se cargaron con Rhod2-AM 5 pM (Invitrogen), un indicador de Ca²⁺localizado preferentemente en las mitocondrias, durante 1 hora a 15 °C seguido de un período de desesterificación de 30 minutos a 37 °C. Después, las células se permeabilizaron con digitonina 100 pM durante 1 min a temperatura ambiente. Los cambios de fluorescencia en Rhod2 (por ejemplo: 544 nm, em: 590 nm) inmediatamente después de la adición de Ca²⁺(la concentración final de Ca²⁺libre se calcula en aproximadamente 10 pM utilizando WEBMAXC en http://web.stanford.edu/~cpatton/webmaxcS.htm) se controlaron en tampón interno (K-EGTA 5 mM, HEPES 20 mM, K-aspartato 100 mM, KCl 40 mM, MgCh 1 mM, ácido maleico 2 mM, ácido glutámico 2 mM, ácido pirúvico 5 mM, KH²PO⁴0,5 mM, MgATP 5 mM, pH ajustado a 7,2 con base Trizma) utilizando un lector de placas FLUOSTAR (BMG Labtech).

Ensayo de captación del Ca2+ de mitocondrias en MEF con desactivación doble de VDAC1/VDAC3 (V1/V3 DKO).

Se cultivaron MEF V1/V3 DKO como se ha descrito anteriormente (Roy et al., 2009a, EMBO Rep 10, 1341-1347). Se utilizaron MEF tratados con efsevin (15 pM durante 30 min) o tratados de forma simulada para las mediciones de [Ca²⁺]^cen suspensiones de células permeabilizadas o para obtener imágenes de [Ca²⁺]^msimultáneamente con [Ca²⁺]^cen células individuales intactas. La permeabilización de la membrana plasmática se realizó con digitonina (40 pM/ml), Se midieron los cambios en [Ca²⁺] en el tampón citoplasmático tras la adición de IP³(7,5 pM) en presencia o ausencia de rojo de rutenio (3 pM) mediante fura2 en un fluorómetro (Csordas et al., 2006, J Cell Biol 174, 915-921; Roy et al., 2009b, Mol Cell 33, 377-388). Para evitar la captación del Ca²⁺del retículo endoplasmático, se añadió tapsigargina 2 pM antes de IP³. Para obtener imágenes de [Ca²⁺]^my [Ca²⁺]^c, se transfectaron m Ef junto con plásmidos codificantes VDAC2 de pez cebra policistrónico con mCherry y pericam inverso dirigido a las mitocondrias durante 40 horas. Se clasificaron células para enriquecer las células transfectadas y se unieron a cubreobjetos de vidrio. En los últimos 10 minutos, del tratamiento con efsevin o tratamiento simulado, las células también se cargaron con fura2AM (2,5 p^) y posteriormente se transfirieron a la platina del microscopio. La estimulación con ATP 1 pM se llevó a cabo en un tampón nominalmente libre de Ca²⁺. Se obtuvieron imágenes de los cambios en [Ca²⁺]^cy [Ca²⁺]^mutilizando fura2 (proporción de ex: 340 nm a 380 nm) y pericam inverso dirigido a mitocondrias (ex: 495 nm), respectivamente (Csordas et al., 2010, Mol Cell 39, 121-132).

Estadística.

Todos los valores se expresan como la media ± ETM. Los valores de significación se calculan mediante el ensayo t de Student para muestras no relacionadas, a menos que se indique lo contrario.

Los datos del ensayo que no se muestran incluyen la siguiente información:

1) Un corazón de un embrión de pez cebra de tipo silvestre a los 2 d de la fecundación. Se pueden observar potentes contracciones rítmicas en la aurícula y el ventrículo.

2) Un corazón de un embrión tembloroso a los 2 d de la fecundación. Los embriones de la estirpe mutante temblorosa solo muestran contracciones no sincronizadas, locales, comparables con la fibrilación cardíaca. 3) Un corazón de un embrión tembloroso a los 2 d de la fecundación tratado con efsevin. El tratamiento de embriones temblorosos con efsevin restablece las contracciones rítmicas con una fracción de acortamiento auricular comparable a la de los embriones de tipo silvestre y aproximadamente el 40 % de la frecuencia cardíaca de tipo silvestre.

4) Un corazón de un embrión de pez cebra de tipo silvestre a los 2 d de la fecundación tratado con efsevin. El tratamiento de embriones de tipo silvestre con efsevin no afectó al rendimiento cardíaco, indicado por contracciones rítmicas, potentes, comparables a las de los embriones de tipo silvestre no tratados.

5) Mapa de calor de los transitorios de Ca2+ registrados en un corazón de tipo silvestre de un día de vida.

6) Mapa de calor de los transitorios de Ca2+ registrados en un corazón tembloroso de un día de vida.

7) Mapa de calor de los transitorios de Ca2+ registrados en un corazón tembloroso tratado con efsevin de un día de vida.

8) Un corazón de un embrión de pez cebra de tipo silvestre a los 1 d de la fecundación. Se pueden observar potentes contracciones rítmicas en la aurícula y el ventrículo.

9) Un corazón de un embrión de pez cebra de tipo silvestre inyectado con ARNm de VDAC2 de pez cebra a 1 d de la fecundación. Se pueden observar potentes contracciones rítmicas en la aurícula y el ventrículo.

10) Un corazón de un embrión tembloroso a 1 d de la fecundación. Los embriones temblorosos muestran solo contracciones no sincronizadas, locales, comparables a la fibrilación cardíaca.

11) Un corazón de un embrión tembloroso inyectado con ARNm de VDAC2 de pez cebra a 1 d de la fecundación. La sobreexpresión de ARNm de VDAC2 de pez cebra restablece las contracciones rítmicas en los embriones temblorosos.

12) Un corazón de un embrión Tg-VDAC2 a los 2 d de la fecundación inyectado con un morfolino dirigido a NCX1h. La atenuación con morfolino de NCX1h da lugar a un corazón fibrilante.

13) Un corazón de un morfante de NCX1h a los 2 d de la fecundación en los antecedentes genéticos de Tg-VDAC2. El tratamiento con TBF induce la expresión de VDAC2 y restablece las contracciones cardíacas coordinadas. 14) Un corazón de un embrión de pez cebra de tipo silvestre a los 2 d de la fecundación inyectado con un morfolino dirigido a VDAC2. La atenuación de VDAC2 con morfolino no tuvo efectos evidentes sobre el rendimiento cardíaco.

15) Un corazón de un embrión mutante tembloroso a los 2 d de la fecundación inyectado con un morfolino dirigido a VDAC2.

16) Un corazón de un embrión mutante tembloroso a los 2 d de la fecundación inyectado con un morfolino dirigido a VDAC2. El tratamiento con efsevin no puede restablecer las contracciones cardíacas coordinadas en ausencia de VDAC2.

D. Resultados y discusión

Identificación de un supresor químico de disfunción cardíaca tem

Los embriones homocigotos mutantes tem padecen defectos de extrusión del Ca2+ y manifiestan contracciones cardíacas caóticas que se asemejan a la fibrilación (Ebert et al., 2005; Langenbacher et al., 2005). Para diseccionar la red reguladora de la manipulación del Ca2+ en los cardiomiocitos e identificar los mecanismos que controlan la ritmicidad cardíaca embrionaria, los presentes inventores examinaron la biblioteca BioMol y una colección de compuestos sintéticos en busca de compuestos químicos capaces de restablecer los latidos del corazón, ya sea total o parcialmente, en embriones tem. Se identificó un compuesto de éster dihidropirrol-carboxílico denominado efsevin basándose en su capacidad para restablecer las contracciones cardíacas persistentes y rítmicas en embriones mutantes tem de una manera dependiente de la dosis (FIG. 1D). Para validar el efecto de efsevin, los presentes inventores evaluaron el rendimiento cardíaco de embriones de tipo silvestre, tem y tem tratados con efsevin (Nguyen et al., 2009). Los barridos lineales a través de las aurículas de corazones embrionarios de Tg(myl7:GFP) a las 48 h de la fecundación mostraron sístoles y diástoles rítmicamente alternas de embriones de tipo silvestre tratados con vehículo o con efsevin y embriones tem tratados con efsevin, mientras que solo se observaron contracciones no sincronizadas esporádicas en los embriones tem tratados con vehículo. La fracción de acortamiento de los corazones mutantes tem tratados con efsevin fue comparable a la de sus hermanos de tipo silvestre, y la frecuencia cardíaca se restableció a aproximadamente el 40 % de la observada en los controles (FlG. 1A-C). Se detectaron potenciales de campo locales periódicos que acompañaban a cada latido del corazón en los embriones de tipo silvestre y tem tratados con efsevin utilizando una matriz de microelectrodos (FIG. 1E-G). Asimismo, aunque solo se detectaron señales esporádicas de Ca2+ en los corazones tem, la obtención de imágenes de Ca2+ in vivo reveló ondas de Ca2+ constantes que se propagaban a través de corazones tem tratados con efsevin, demostrando que los cardiomiocitos están funcionalmente acoplados y que el tratamiento con efsevin restablece los transitorios de Ca2+ regulares en los corazones tem.

Efsevin suprime la contracción irregular inducida por la sobrecarga de Ca2+

A continuación, los presentes inventores examinaron si efsevin podía suprimir las respuestas arrítmicas inducidas por la homeostasis aberrante del Ca2+ en cardiomiocitos de mamíferos. Los cardiomiocitos derivados de células madre embrionarias de ratón (mESC-CM) establecen un patrón de contracción regular con transitorios rítmicos de Ca2+ (FIG.

2A, D, E). La imitación de la sobrecarga de Ca2+ aumentando los niveles de Ca2+ extracelular fue suficiente para interrumpir el ciclo normal de Ca2+ e inducir contracciones irregulares en mESC-CM (FIG. 2B, D, E). Notablemente, el tratamiento con efsevin restableció los transitorios de Ca2+ rítmicos y las contracciones cardíacas en estas células (FIG.2C-E). Se observó un efecto similar en cardiomiocitos derivados de células madre embrionarias humanas (hESC-CM) (FIG. 2F). En conjunto, estos hallazgos sugieren que efsevin se dirige a un mecanismo regulador del Ca2+ conservado fundamental para mantener la contracción cardíaca rítmica en los peces, ratones y seres humanos.

VDAC2 media el efecto supresor de efsevin en tem

Para identificar la proteína diana de efsevin, los presentes inventores generaron efsevin unido a un enlazador de 2-aminoetoxietoxietilamina protegido con N-Boc (efsevineL) (FIG. 3A y C). Este compuesto modificado conservaba la actividad de efsevin para restablecer las contracciones cardíacas en embriones deficientes en ncxlh (FIG. 3B y D) y se utilizó para crear perlas de agarosa conjugadas con efsevin (efsevinLB). Se detectó una especie de proteína de 32 kD a partir del lisado de pez cebra debido a su capacidad de unión a efsevinLB y OK-C125LB, un derivado de efsevin activo conjugado con perlas, pero no con perlas selladas con etanolamina sola o perlas conjugadas con un análogo de efsevin inactivo (OK-C19LB) (FIG. 3A-D). Asimismo, la preincubación del lisado de pez cebra con un exceso de efsevin impidió que la proteína de 32 kD se uniera a efsevinLB u OK-C125LB. El análisis de espectrometría de masas reveló que esta banda de 32 kD representa un homólogo de pez cebra del canal aniónico dependiente de la tensión 2 (VDAC2) mitocondrial (FIG.3E) mediante la identificación del péptido VDAC2 LTFDTTFSPn Tg K mediante análisis de iones de las series b e y (SEQ ID NO: 8).

VDAC2 se expresa en el corazón de pez cebra en desarrollo, como lo confirma el análisis de hibridación in situ de corazones embrionarios a las 36 h de la fecundación y 48 h de la fecundación, lo que lo convierte en un buen candidato para mediar el efecto de efsevin en la manipulación del Ca2+ cardíaco. Para examinar esta posibilidad, los presentes inventores inyectaron ARN de VDAC2 sintetizado in vitro en embriones tem y encontraron que la mayoría de estos embriones tenían contracciones cardíacas coordinadas similares a las de los sometidos al tratamiento con efsevin (FIG. 4A). Adicionalmente, generaron peces transgénicos myl7:VDAC2 en los que se puede inducir la expresión de VDAC2 en el corazón por tebufenozida (TBF) (FIG.4B). El análisis de hibridación in situ mostró que el tratamiento con TBF induce la expresión de VDAC2 en el corazón. La atenuación de NCX1h en embriones myl7:VDAC2 produce un movimiento cardíaco caótico similar a tem. Como el tratamiento con efsevin, la inducción de la expresión de VDAC2 mediante el tratamiento con TBF restableció las contracciones coordinadas y rítmicas en corazones myl7:VDAC2;NCX1h MO (FIG. 4C). En cambio, la atenuación de VDAC2 en corazones tem atenuó el efecto supresor de efsevin (FIG. 4D). Asimismo, los presentes inventores generaron embriones nuligénicos para VDAC2 mediante el enfoque de direccionamiento del gen de nucleasa de dedo de zinc (FIG. 4F). El análisis de hibridación in situ mostró la pérdida de transcripciones de VDAC2 en embriones VDAC2zfn/zfn (SEQ ID NO: 2-7). De modo similar al observado en embriones de atenuación con morfolino, los embriones homocigotos VDAC2LA2256 no presentan defectos morfológicos notables, pero el efecto supresor de efsevin se atenuó en embriones homocigotos VDAC2LA2256; NCX1MO (FIG. 4E). Estos hallazgos demuestran que VDAC2 es un mediador principal del efecto de efsevin sobre los corazones deficientes en ncxlh.

Efecto de efsevin dependiente de VDAC2 sobre la captación del Ca2+ mitocondrial

VDAC es un canal abundante ubicado en la membrana mitocondrial externa que sirve como pasaje principal para metabolitos e iones (Rapizzi et al., 2002; Bathori et al., 2006; Shoshan-Barmatz et al., 2010). En su estado cercano, VDAC favorece el flujo de Ca2+ (Tan et al., 2007, Biochim Biophys Acta 1768, 2510-2515). Para examinar si efsevin modularía la captación del Ca2+ mitocondrial a través de VDAC2, los presentes inventores transfectaron células HeLa con VDAC2. Se sometieron células HeLa transfectadas con VDAC2 de pez cebra marcado con FLAG (VDAC2flag) a inmunotinción frente al epítopo FLAG y a contratinción para mitocondrias con MitoTracker Orange y para núcleos con DAPI para confirmar la transfección. Los presentes inventores advirtieron un aumento de la captación del Ca2+ mitocondrial en células transfectadas con VDAC2 permeabilizadas y tratadas con efsevin tras la adición de Ca2+, y el tratamiento combinado mejoró aún más los niveles de Ca2+ mitocondrial (FIG. 5A).

Las mitocondrias están ubicadas muy cerca de los sitios de liberación del Ca2+ del RE/RS y existe una interferencia extensa entre los dos orgánulos (Garcia-Perez et al., 2008; Hayashi et al., 2009; Brown et al., 2010, Cardiovasc Res 88, 241-249; Dorn et al., 2010; Kohlhaas et al., 2013). Los presentes inventores examinaron si el Ca2+ liberado de las reservas intracelulares podría transportarse localmente a las mitocondrias a través de VDAC2 en MEF con desactivación doble de VDAC1/VDAC3 (V1/V3DKO), donde VDAC2 es la única isoterma de VDAC que se expresa (Roy et al., 2009a). Mientras que los tratamientos con ATP, un agonista ligado a IP3, y tapsigargina, un inhibidor de SERCA, estimularon una elevación citoplasmática global similar de [Ca²⁺] en células intactas, solo el ATP indujo un rápido aumento de [Ca²⁺] de la matriz mitocondrial (FIG. 8). Este hallazgo coincide con las observaciones obtenidas en otros tipos de células (Rizzuto et al., 1994, J Cell Biol 126, 1183-1194; Hajnoczky et al., 1995, Cell 82, 415-424) y sugiere que el Ca²⁺se transfirió localmente desde los receptores IP3 a las mitocondrias a través de VDAC2 en las asociaciones mitocondriales del RE cercanas. A continuación, los presentes inventores investigaron si este proceso se podría modular con efsevin. En MEF V1/V3DKO permeabilizados, el tratamiento con efsevin aumentó la cantidad de Ca²⁺transferida a las mitocondrias durante la liberación de Ca²⁺inducida por IP³ (FIG. 5B). También, en MEF V1/V3 DKO intactos, efsevin aceleró la transferencia de Ca²⁺liberado de las reservas intracelulares a las mitocondrias durante la estimulación con ATP (FIG. 5C y D).

Efsevin modula las chispas de Ca2+ y suprime las ondas de Ca2+ erráticas en los cardiomiocitos

A continuación, los presentes inventores examinaron el efecto de efsevin sobre las señales de Ca²⁺citosólico en cardiomiocitos murinos adultos aislados. Descubrieron que el tratamiento con efsevin indujo una cinética de inactivación más rápida sin afectar a la amplitud ni al tiempo hasta el máximo de los transitorios de Ca²⁺estimulados (FIG.6A). De forma análoga, el tratamiento con efsevin no alteró significativamente la frecuencia, la amplitud ni el flujo de liberación de Ca²⁺de chispas de Ca²⁺espontáneas, eventos de liberación de Ca²⁺locales, pero aceleró la fase de desintegración dando lugar a chispas con una duración más corta y una anchura más estrecha (FIG. 6B). Estos resultados indican que mediante la activación de la captación del Ca²⁺mitocondrial, efsevin acelera la eliminación del Ca²⁺del citosol en los cardiomiocitos y, por lo tanto, restringe las chispas citosólicas locales de Ca²⁺a un dominio más estrecho durante un período de tiempo más corto sin afectar a la carga de Ca²⁺del RS ni a la liberación de Ca²⁺del RyR. En condiciones de sobrecarga de Ca²⁺, las chispas individuales de Ca²⁺pueden desencadenar la apertura de las unidades de liberación de Ca²⁺vecinas y, por lo tanto, inducir la formación de ondas de Ca²⁺erráticas. El tratamiento con efsevin redujo significativamente el número de ondas de Ca²⁺que se propagan de una manera dependiente de la dosis (FIG. 6C), lo que demuestra un potente efecto supresor de efsevin sobre la propagación de las ondas de Ca²⁺inducidas por la sobrecarga de Ca²⁺y sugiere que efsevin podría servir como una herramienta farmacológica para manipular señales locales de Ca²⁺.

La captación del Ca2+ mitocondrial modula la ritmicidad cardíaca embrionaria

Los presentes inventores creen que el tratamiento con efsevin/la sobreexpresión de VDAC2 suprime las contracciones cardíacas arrítmicas asociadas con la manipulación de Ca²⁺aberrante al amortiguar el exceso de Ca²⁺en las mitocondrias. Por lo tanto, predicen que la activación de otras moléculas de captación del Ca²⁺mitocondrial también restablecería las contracciones coordinadas en tem. Para probar este modelo, los presentes inventores clonaron MCU y MICU1 de pez cebra, un transportador de Ca²⁺de la membrana mitocondrial interna y su regulador (Perocchi et al., 2010, Nature 467, 291-296; Baughman et al., 2011; De Stefani et al., 2011; Mallilankaraman et al., 2012, Cell 151, 630-644; Csordas et al., 2013, Cell Metab 17, 976-987). La hibridación in situ mostró que MCU y MICU1 se expresaron en el corazón de pez cebra en desarrollo, y sus niveles de expresión fueron comparables entre los corazones y embriones de tipo silvestre y tem con y sin tratamiento con efsevin. La sobreexpresión de MCU restableció las contracciones coordinadas en tem, de modo similar al observado con VDAC2 (FIG.7A). Adicionalmente, los embriones tem inyectados con concentraciones subóptimas de MCU o VDAC2 tenían un corazón fibrilante, pero los embriones que recibieron tanto VDAC2 como MCU a la concentración subóptima manifestaron contracciones coordinadas (FIG.

7B), demostrando un efecto sinérgico de estas proteínas. Asimismo, la sobreexpresión de MCU no logró suprimir el fenotipo tem en ausencia de actividad de VDAC2, y VDAC2 no pudo restablecer las contracciones coordinadas en tem sin MCU funcional (FIG. 7A, C). Se observaron resultados similares manipulando la actividad de MICU1 (FIG. 7D y E). En conjunto, estos hallazgos indican que los mecanismos de captación del Ca²⁺mitocondrial en las membranas mitocondriales externas e internas actúan de manera cooperativa para regular la ritmicidad cardíaca.

Las mitocondrias regulan la ritmicidad cardíaca a través de un mecanismo dependiente de VDAC

Las perlas de agarosa de afinidad unidas covalentemente con efsevin (efsevin^LB) extrajeron 2 especies de proteínas del lisado embrionario de pez cebra, de las cuales una, la banda superior de 32 kD, fue sensible a la competencia con un exceso de efsevin^Llibre de 100 veces. La banda de 32 kD no se detectó en las proteínas eluidas de perlas selladas con etanolamina sola (perlas^C) ni en perlas unidas a un derivado inactivo de efsevin, OK-C19^LB, pero se detectó en muestras eluidas de perlas unidas con un derivado biológicamente activo, OK-C125^LB. También para la extracción de OK-C125^LB, la banda de 32 kD fue nuevamente sensible a la competencia con efsevin libre. El análisis de hibridación in situ mostró que VDAC1, VDAC2 y MCU se expresan en corazones embrionarios a las 36 h de la fecundación y 48 h de la fecundación.

Las FIG. 9 A)-G) muestran que las mitocondrias regulan la ritmicidad cardíaca a través de un mecanismo dependiente de VDAC.

(B) Si bien solo ~20 % de los embriones myl7: VDAC2;NCX1hMO tiene contracciones coordinadas (n = 116), el 52,3 ± 2,4 % de estos embriones establecieron contracciones rítmicas persistentes tras la inducción de TBF de VDAC2 (n = 154).

C) Como media, el 71,2 ± 8,8 % de los embriones tratados con efsevin tiene contracciones cardíacas coordinadas (n = 131). La atenuación del oligonucleótido antisentido morfolino de VDAC2 MOVDAC2) o VDAC1 (MOVDAC1) atenúa la capacidad de efsevin para suprimir la fibrilación cardíaca en embriones tem (45,3 ± 7,4 % y 46,9 ± 10,7 % de los embriones con contracciones coordinadas, n = 94 y 114, respectivamente). La atenuación de VDAC1/2 suprime simultáneamente además el efecto de efsevin (30,3 ± 6,3 %, n = 75).

D) El tratamiento con efsevin restablece las contracciones cardíacas coordinadas en el 76,2 ± 8,7 % de los embriones NCX1MO, solo el 54,1 ± 3,6 % de los embriones VDAC2zfn/zfn; NCX1MO y el 35,7 ± 7,1 % de los embriones VDAC2zfn/zfn;VDAC1MO; NCX1MO tienen contracciones coordinadas (n = 250).

F) La sobreexpresión subóptima de MCU (MCUS) y VDAC2 (VDAC2S) en combinación es capaz de suprimir la fibrilación cardíaca en embriones tem (42,9 ± 2,6 % de los embriones, n = 129).

G) La capacidad de VDAC2 para restablecer las contracciones rítmicas en embriones tem (48,5 ± 3,5 % de los embriones, n = 111) se atenúa significativamente cuando MCU es atenuado por oligonucleótido antisentido (MOMCU) (25,6 ± 12,4 % de los embriones, n = 115). Las barras de error representan la D.T.; *p <0,05; ***p <0,001.

E. Conclusión

En resumen, los presentes inventores realizaron un cribado de supresores químicos en pez cebra para diseccionar la red reguladora fundamental para mantener las contracciones cardíacas rítmicas e identificar los mecanismos subyacentes a la disfunción cardíaca inducida por la manipulación aberrante del Ca2+. Demostraron que la activación de VDAC2 a través de la sobreexpresión o el tratamiento con efsevin restablece potencialmente las contracciones rítmicas en corazones de pez cebra deficientes en NCX1h y suprime eficazmente los eventos de Ca2+ arritmogénicos inducidos por la sobrecarga de Ca2+ y las contracciones irregulares en cardiomiocitos de ratón y ser humano. Los presentes inventores proporcionan evidencias de que la potenciación de la actividad de VDAC2 potencia la captación del Ca2+ mitocondrial, acelera la transferencia de Ca2+ desde las reservas intracelulares a las mitocondrias y restringe espacial y temporalmente las chispas de Ca2+ individuales en los cardiomiocitos. El papel crucial de las mitocondrias en la regulación de la ritmicidad cardíaca se ve reforzado por los hallazgos de que VDAC2 funciona en conjunto con MCU; estos genes tienen un fuerte efecto sinérgico en la supresión de la fibrilación cardíaca, y la pérdida de función de cualquiera de los genes anula el efecto de rescate del otro en tem.

Las funciones reguladoras del Ca2+ mitocondrial en el metabolismo cardíaco, la supervivencia y el destino celular se han estudiado extensamente (Brown et al., 2010; Dorn et al., 2010; Doenst et al., 2013, Circ Res 113, 709-724; Kasahara et al., 2013, Science 342, 734-737; Kohlhaas et al., 2013; Luo et al., 2013, Circ Res 113, 690-708). El presente estudio proporciona evidencias genéticas y fisiológicas que respaldan un papel adicional de las mitocondrias en la regulación de la ritmicidad cardíaca, y revela que VDAC2 es un modulador de la manipulación de Ca2+ en los cardiomiocitos. Los presentes hallazgos, junto con informes recientes de la interacción física entre VDAC2 y RyR2 (Min et al., 2012, Biochem J 447, 371-379) y la gran proximidad de las membranas mitocondriales externas e internas en los sitios de contacto entre las mitocondrias y el RS (Garcia-Perez et al., 2011, Am J Physiol Heart Circ Physiol 301, H1907-1915), sugieren un interesante modelo. Los presentes inventores proponen que las mitocondrias facilitan un mecanismo de depuración eficiente en el microdominio del Ca2+ que modula la manipulación del Ca2+ sin afectar a las señales globales de Ca2+ en los cardiomiocitos. En este modelo, el VDAC facilita la captación del Ca2+ mitocondrial a través del complejo MCU y, por lo tanto, controla la duración y la difusión del Ca2+ citosólico cerca de los sitios de liberación de Ca2+ para garantizar las contracciones cardíacas rítmicas. Este modelo coincide con la observación de los presentes inventores de que el tratamiento con efsevin induce una cinética de inactivación más rápida de los transitorios de Ca2+ citosólico sin afectar a la amplitud ni al tiempo para alcanzar el máximo en los cardiomiocitos, y los informes de que el bloqueo de la captación del Ca2+ mitocondrial tiene poco impacto en los transitorios de Ca2+ citosólico (Maack et al., 2006; Kohlhaas et al., 2010, Circulation 121, 1606-1613). El respaldo adicional para este modelo proviene de la observación de los máximos de Ca2+ en el OMM (Drago et al., 2012, Proc Natl Acad Sci, EE.UU., 109, 12986-12991) y el hallazgo de que la regulación a la baja de VDAC2 extiende las chispas de Ca2+ (Subedi et al., 2011, Cell Calcium 49, 136-143; Min et al., 2012) y que el bloqueo de la captación del Ca2+ mitocondrial por Ru360 conduce a un mayor número de ondas de Ca2+ de propagación espontánea (Seguchi et al., 2005, Cell Calcium 38, 1 9). Los estudios futuros sobre la cinética de la captación del Ca2+ mitocondrial dependiente de VDAC2 y la exploración de moléculas reguladoras potenciales para la actividad de VDAC2 proporcionarán información sobre cómo la interferencia entre el RS y las mitocondrias contribuye a la manipulación del Ca2+ y la ritmicidad cardíaca.

La manipulación aberrante de Ca2+ se asocia con muchas disfunciones cardíacas, incluyendo la arritmia. El establecimiento de modelos con animales para estudiar los mecanismos moleculares y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas son, por tanto, importantes necesidades preclínicas. El presente cribado de supresores químicos identificó un efecto potente de efsevin y su diana biológica VDAC2 sobre la manipulación del Ca2+ cardíaco y el restablecimiento de las contracciones cardíacas regulares en cardiomiocitos de peces, ratones y seres humanos. Este éxito indica que los mecanismos fundamentales que regulan la función cardíaca se conservan entre los vertebrados a pesar de la existencia de características específicas de la especie, y sugiere un nuevo paradigma de uso de modelos de enfermedad cardíaca con el pez cebra para la disección de vías genéticas fundamentales y el descubrimiento de nuevos enfoques terapéuticos. Los futuros estudios que examinen los efectos de efsevin en otros modelos de arritmia aclararían aún más el potencial de efsevin como herramienta farmacológica para tratar la arritmia cardíaca asociada con la manipulación aberrante del Ca2+.

Ejemplos 2-4

Síntesis de Efsevin: síntesis de (R)-Efsevin y (S)-Efsevin e identificación de (R)-efsevin como el antípoda activo para la actividad desfibriladora previamente informada de Efsevin

Ejemplo 2

(Resolución de (R)- y (S)-efsevin a través de la separación mediante HPLC en fase estacionaria quiral)

Se disolvió efsevin racémico (50 mg, 0,13 mmol) en DCM (0,2 ml) y se inyectó en un sistema Shimadzu CBM Lite utilizando una columna preparatoria REGIS (R,R)-DACH DNB 5/100 (25 cm x 30 mm) con DCM/hexanos (70:30) como eluyente a un caudal de 10,0 ml/min. (R)-efsevin se eluyó a los 75,78 min, y (S)-efsevin, a los 102,72 min (FIG. 10 13). Se recogieron las fracciones y se concentraron al vacío. El protocolo se repitió seis veces más, dando (R)-efsevin (158 mg) que se recristalizó con hexanos/EtOAc, dando cristales de (R)-efsevin (112 mg, > 99 % de ee).

El exceso enantiomérico se determinó mediante una columna analítica REGIS (R,R)-DACH DNB 5/100 (25 cm x 4,6 mm) con DCM/hexanos (60:40) como eluyente a un caudal de 2,0 ml/min.

Ejemplo 3

(Resolución de (R)-efsevin y (S)-efsevin mediante derivatización utilizando mentol)

Se disolvió efsevin racémico (500 mg, 1,35 mmol) en H²O/THF a 1:1 (34,0 ml) a temperatura ambiente. Se añadió hidróxido de litio monohidratado (141,2 mg, 3,37 mmol) a la mezcla de reacción. La reacción se dejó en agitación durante una noche a temperatura ambiente. La reacción se controló mediante TLC (Thin-Layer Chromatography, cromatografía de capa fina). Una vez completada, se enfrió la mezcla hasta 0 °C utilizando un baño de hielo y se acidificó a pH 1 con HCl ac. 1 N. La mezcla se extrajo con DCM (30 ml x 3). Se secó la capa orgánica combinada con Na²SO⁴y se concentró al vacío. El ácido carboxílico de efsevin resultante se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional.

Se disolvieron ácido carboxílico de efsevin racémico (1,35 mmol) y (-)-mentol (317,0 mg, 2,0 mmol) en DCM (1,0 ml), y se enfriaron hasta 0 °C utilizando un baño de hielo. Se disolvieron DCC (279,0 mg, 1,35 mmol) y DMAP (1,6 mg, 0,014 mmol) en DCM (1,0 ml), y se añadieron a la mezcla de reacción durante 1 h utilizando una bomba de jeringa. Después de la adición, se dejó calentar la mezcla de reacción hasta la temperatura ambiente retirando el baño de enfriamiento. Una vez completada, la mezcla se filtró a través de un lecho corto de celite y se concentró al vacío. El producto en bruto se purificó utilizando FCC (Flash Column Chromatography, cromatografía en columna ultrarrápida) sobre gel de sílice (EtOAc al 20 % en hexanos), produciendo dos ésteres de mentol de efsevin diastereoisoméricos (385,0 mg, 58 %). La cristalización selectiva en hexanos/EtOAc a 9:1 produjo éster de mentol de (R)-efsevin (180 mg) y éster de mentol de (S)-efsevin [200 mg con (R)-éster en trazas]. Ambos ésteres de mentol de (R)- y (S)-efsevin pueden hidrolizarse y esterificarse, dando (R)- y (S)-efsevin enantioméricamente puros. Véase (a) Jonas, R.; Wurziger, H. Tetrahedron 1987, 43, 4539-4547. (b) Ito, Y.; Miyake, T.; Hatano, S.; Shima, R.; Ohara, T.; Suginome, M. J. Org. Chem. 1998, 120, 11880-11893. (d)Yang, D.; Ye, X.-Y.; Xu, M. J. Org. Chem. 2000, 65, 2208-2217. (e) Holy, R.; Kovác, M.; Tichy, M.; Zavada, J.; Budesinsky, M.; Cisarova, I. Tetrahedron: Asymmetry 2005, 16, 2031-2038.

Éster de mentol de (R)-efsevin

RMN de ¹H (500 MHz, CDCl^a) (FIG. 14 [parte superior]) 87,34 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,22-7,16 (m, 5H), 7,09 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6,86 (c, J = 2,0 Hz, 1H), 5,74 (dt, J = 5,9, 1,9 Hz, 1H), 4,55 (td, J = 10,5, 3,9 Hz, 1H), 4,51 (dt, J = 16,9, 2,4 Hz, 2H), 2,35 (s, 3H), 1,87-1,82 (m, 1H), 1,63-1,59 (m, 1H), 1,54-1,51 (m, 2H), 1,41-1,35 (m, 1H), 1,05 (tt, J = 5,4, 3.1 Hz, 1H), 0,93-0,84 (m, 5H), 0,82-0,71 (m, 2H), 0,54 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 0,40 (d, J = 7,0 Hz, 3H)

RMN de ¹³C (125 MHz, CDCl^a) (FIG. 14 [parte inferior]) 8 161,6; 143,1; 139,2; 136,2; 136,1; 135,9; 129,4; 128,2; 128,01; 127,96; 127,0; 74,8; 68,8; 54,6; 46,8; 40,8; 34,1; 31,4; 25,0; 22,7; 22,0; 21,5; 21,0; 15,4.

Ejemplo 4

(Síntesis asimétrica catalítica de (S)-efsevin)

Se disolvió W-tosil-benzaldimina (5,67 g, 21,9 mmol) en benceno (175,0 ml) a temperatura ambiente. Se añadió exofenil Kwonphos (756,0 mg, 2,19 mmol) a la mezcla de reacción. A continuación, se añadió gota a gota alenoato de etilo (2,94 g, 26,3 mmol) a la mezcla de reacción. Se dejó agitar la reacción a temperatura ambiente y se controló mediante TLC. Una vez completada, la mezcla se concentró al vacío. La mezcla resultante se purificó utilizando FCC sobre gel de sílice (EtOAc al 20 % en hexanos), produciendo una mezcla a 23:77 de (R)- y (S)-efsevin (6,78 g, 90 %). La cristalización selectiva en hexanos/EtOAc a 4:1 dio efsevin racémico (3,12 g), dejando (S)-efsevin (3,66 g) en las aguas madres. Las aguas madres se recristalizaron en hexanos/EtOAc a 4:1, dando (S)-efsevin (2,1 g,> 99 % de ee)

A. Síntesis de éster de mentol de (S)-efsevin

Éster de mentol

de {S)-efsevin

Se disolvió (S)-efsevin (50 mg, 0,135 mmol) en H²O/THF a 1:1 (3,4 ml) a temperatura ambiente. Se añadió hidróxido de litio monohidratado (14,1 mg, 0,34 mmol) a la mezcla de reacción. La reacción se dejó en agitación durante una noche a temperatura ambiente. La reacción se controló mediante TLC (Thin-LayerChromatography, cromatografía de capa fina). Una vez completada, se enfrió la mezcla hasta 0 °C utilizando un baño de hielo y se acidificó a pH 1 con HCl ac. 1 N. La mezcla se extrajo con DCM (10 ml x 3). Se secó la capa orgánica combinada con Na2SO4 y se concentró al vacío. El ácido carboxílico resultante se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional.

Se disolvieron ácido carboxílico de (S)-efsevin (0,135 mmol) y (-)-mentol (31,7 mg, 0,2 mmol) en DCM (1,0 ml), y se enfriaron hasta 0 °C utilizando un baño de hielo. Se disolvieron DCC (27,9 mg, 0,135 mmol) y DMAP (0,2 mg, 0,0014 mmol) en DCM (1,0 ml), y se añadieron a la mezcla de reacción durante 1 h utilizando una bomba de jeringa. Después de la adición, se dejó calentar la mezcla de reacción hasta la temperatura ambiente retirando el baño de enfriamiento. Una vez completada, la mezcla se filtró a través de un lecho corto de celite y se concentró al vacío. El producto en bruto se purificó utilizando FCC sobre gel de sílice (EtOAc al 20 % en hexanos), produciendo éster de mentol de (S)-efsevin (50,0 mg, 77 %).

Éster de mentol de (S)-efsevin

RMN de ¹H (500 MHz, CDCl^a) (FIG. 15 [parte superior]) 87,39 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,22-7,17 (m, 5H), 7,12 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 6,74 (c, J = 2,0 Hz, 1H), 5,72 (dt, J = 5,8, 2,0 Hz, 1H), 4,54-4,49 (m, 2H), 4,35 (ddd, J = 16,9, 5,9, 2,0 Hz, 1H), 2,36 (s, 3H), 1,69-1,63 (m, 1H), 1,61-1,58 (m, 3H), 1,35-1,20 (m, 3H), 0,99-0,90 (m, 1H), 0,83 (d, J = 7,1 Hz, 3H), 0,80-0,71 (m, 4H), 0,61 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 0,51 (c, J = 11,8 Hz, 1H)

RMN de ¹³C (125 MHz, CDCl^a) (FIG. 15 [parte inferior]) 8 161,5; 143,2; 139,4; 136,5; 135,7; 134,9; 129,4; 128,2; 127,93; 127,86; 127,1; 75,0; 69,1; 54,9; 46,9; 40,2; 34,1; 31,2; 26,5; 23,6; 21,9; 21,5; 20,6; 16,5.

Ejemplos 5-7

Síntesis de biblioteca de cribado y cribado de pez cebra

A. Introducción

Los presentes inventores generaron una gran cantidad de diferentes moléculas pequeñas para cribar mutantes temblorosos del pez cebra, defectuosos en un gen intercambiador de calcio y sodio específico del corazón, NCX1h, a fin de estudiar la arritmia cardíaca inducida por la manipulación anormal de los iones de calcio. Para conseguir esto, el presente grupo construye una biblioteca diversa mediante la construcción de diferentes armazones tales como dihidropirroles (Zhu, et al., 2005, Tetrahedron., 61, 6276-6282), tetrahidropiridinas (Zhu, et al., 2003, J. Am. Chem. Soc., 125, 4716-4717), ciclohexenos (Tran, et al., 2007, J. Am. Chem. Soc., 129, 12632-12633), succinimidas bicíclicas, coumarinas (Henry, et al., 2007, Org. Lett., 9, 3069-3072), dioxaniídenos (Zhu, et al., 2005, Org. Lett., 7, 1387-1390.), dihidropironas (Creech, et al., 2008, Org. Lett., 10, 429-432) y pirenos (zhu, et al., 2005, Org. Lett., 7, 2977-2980) utilizando reacciones catalizadas por fosfina, reacciones catalizadas por fosfina combinadas con la adición de Michael o la secuencia de reacciones catalizadas por fosfina/reacciones de Tebbe/reacciones de Diels-Alder (véanse ejemplos no limitativos en las Fig. 18A-E). La biblioteca incluía una gran cantidad de análogos de efsevin, incluyendo: análogos con motivo de éster etílico mediante el uso de diferentes iminas como una de las parejas de acoplamiento de anulación; y análogos con sustitutos de meta-, para-metilo, sustitutos de halógeno y benzaldehído no sustituido para reaccionar con sustitutos de orto-, para-metilo y bencenosulfonamida sustituida con halógeno para la síntesis de iminas.

B. Información general

Se destilaron benceno y diclorometano nuevos a partir de CaH2. Se destiló nuevo THF a partir de sodio. Todos los demás reactivos se utilizaron tal como se recibieron de fuentes comerciales. Las reacciones se controlaron utilizando cromatografía de capa fina (TLC) realizada en placas de gel de sílice E. Merck de 0,25 mm (60F-254) y se visualizaron bajo luz UV o mediante tinción con permanganato. La cromatografía en columna ultrarrápida se realizó utilizando gel de sílice 60 de E. Merck (malla 230-400) y aire comprimido. Los espectros de RMN se obtuvieron en instrumentos Bruker ARX-400 o Bruker AXR-300 (como se indica), calibrados utilizando cloroformo residual no deuterado como referencia interna (7,26 y 77,0 ppm para espectros de RMN de 1H y 13C, respectivamente). Los datos espectrales de RMN de 1H se presentan de la siguiente manera: desplazamiento químico (8, ppm), multiplicidad, constante de acoplamiento (Hz) e integración. Los datos espectrales de 13C se presentan en términos de desplazamiento químico. Las siguientes abreviaturas se utilizan para indicar multiplicidades: s = singlete; d = doblete; t = triplete; c = cuadruplete; m = multiplete; a = ancho. El Affi-gel-10 se adquirió en BioRad. EDTA, EGTA, Glicina, NaF, fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) y la base Trizma se adquirieron en Sigma Chemicals. El kit Silver Stain y el gel de tris-glicina prefabricado se obtuvieron en Invitrogen. El cóctel de inhibidores de proteínas se adquirió en Roche. El Nonidet P-40 era de Fluka. Los procedimientos de filtración de resina se llevaron a cabo utilizando cartuchos de frita de PE de 70 p de Applied Separations (cat. n.° 2449).

Ejemplo 5

(Síntesis de N-sulfoniliminas y alenoatos)

Las N-sulfoniliminas para la biblioteca de cribado se sintetizaron a partir de los correspondientes aldehídos y sulfonamidas mediante el uso de TiCU, de acuerdo con el procedimiento de McKay, et al. (McKay, et al., 1981, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1,2435). El resto de la imina se sintetizó mediante la condensación de los correspondientes aldehídos con las sulfonamidas catalizadas por BF3OEt2 con la eliminación azeotrópica del agua (Dean-Stark), de acuerdo con el procedimiento de Jennings, et al. (Jennings, et al., 1991, Tetrahedron, 47, 5561). Se sintetizó buta-2,3-dienoato de etilo de acuerdo con el procedimiento de Lang, et al. (Lang, et al., 1984, Organic Syntheses., 62, 202).

Ejemplo 6

(Síntesis de dihidropirroles)

Los dihidropirroles para la biblioteca de cribado se sintetizaron de acuerdo con el siguiente procedimiento general. Se disolvieron PPh³(1 mmol) e imina (1 mmol) en benceno seco. Se añadió gota a gota buta-2,3-dienoato de etilo (1,2 mmol). Se calentó la mezcla hasta 40 °C y se agitó durante una noche (Esquema II). Se eliminó el disolvente al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida. (Acetato de etilo: Hexano=1:6-1:4).

Ejemplo 7

(Cribado de pez cebra)

Los presentes inventores cribaron la biblioteca mencionada anteriormente utilizando embriones de pez cebra mutantes temblorosos. Las células cardíacas de los embriones mutantes temblorosos no establecen una contracción sincronizada rítmica, sino que se contraen de forma independiente y crean un patrón de contracción caótico. Se cribó la capacidad de los compuestos para suprimir la fibrilación cardíaca y/o restablecer la contracción sincronizada rítmica. Brevemente, los presentes inventores trataron el embrión remojándolo en una solución 20 pM o inyectando compuestos tras 24 horas de la fecundación y observando el fenotipo tras 48 horas. Además, determinaron la Relación entre la Estructura y la Actividad (REA) entre las estructuras del compuesto activo y la capacidad de suprimir la fibrilación cardíaca y/o restablecer la contracción sincronizada rítmica.

C. Métodos

Remojo

Se recogieron huevos mutantes temblorosos de pez cebra tras la fecundación y se dispusieron en placas de 24 pocilios (20 embriones/pocillo) en 500 j l de tampón. T ras 24 horas de la fecundación a 29 °C, se añadió compuesto de prueba 20 jM y se utilizó tampón E3 como control de fondo. Tras 48 horas de la fecundación a 29 °C, se observaron los cambios fenotípicos utilizando un microscopio de disección de gran aumento.

Inyección con morfolino

Los huevos de pez cebra se recolectaron en etapas de 1 célula. Se inyectó en el embrión 1 nl de compuesto en tampón de Daneu y 1 nl de morfolino (1 mM) a NCX1h. Después de 24 horas, se dispuso el embrión en placas de 24 pocillos (veinte (20) embriones/pocillo) en 500 j l de tampón. Tras 48 horas de la fecundación a 29 °C, se observaron los cambios fenotípicos utilizando un microscopio de disección de gran aumento.

Inyección en mutantes temblorosos

Se recogieron huevos de mutantes temblorosos de pez cebra en etapas de 1 célula. Se inyectó 1 nl de compuesto en tampón de Daneu en el embrión. Después de 24 horas, se dispuso el embrión en placas de 24 pocillos (veinte (20) embriones/pocillo) en 500 j l de tampón. Tras 48 horas de la fecundación a 29 °C, se observaron los cambios fenotípicos utilizando un microscopio de disección de gran aumento.

D. Resultados

Análisis de la actividad

Se identificaron múltiples compuestos activos en la biblioteca con una actividad similar o mayor a la de efsevin (véanse ejemplos no limitativos en la Fig. 0A y 0B). La Tabla 1 muestra algunos de los compuestos más activos que se encuentran en los cribados.

TABLA 1

Las Tablas 2, 3 y 4 muestran resultados de cribado adicionales (véanse las Fig. 18A-D para las estructuras). La Tabla 2 muestra los resultados del cribado utilizando un mutante tembloroso remojado en compuestos de prueba 20 jM .

TABLA 2

continuación

La Tabla 3 muestra los resultados del cribado utilizando mutantes con morfolino.

TABLA 3

continuación

La Tabla 4 muestra los resultados del cribado utilizando inyección en mutantes temblorosos.

TABLA 4

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un compuesto de estructura de Fórmula Ia o Ib:

{R)-efsevin (S)-efsevin

Fórmula la Fórmula Ib

en donde el compuesto es para usar en la potenciación de la captación del Ca2+ mitocondrial para modular la ritmicidad cardíaca en un sujeto.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde el compuesto es de Fórmula Ia:

(S)-efsevin

Fórmula Ib

4. Un agente para usar en el tratamiento de una afección relacionada con la arritmicidad cardíaca o un trastorno cardíaco con una raíz en la manipulación aberrante del Ca2+, en donde dicho tratamiento comprende regular la ritmicidad cardíaca en un sujeto, comprendiendo potenciar la captación del Ca2+ mitocondrial mediante:

i) la inducción de la sobreexpresión de VDAC2 o VDAC1 en el sujeto para restablecer la contracción rítmica; ii) la inducción de la sobreexpresión de VDAC2 o VDAC1 y/o del complejo MCU o MICU1; o

iii) la inducción de la actividad transportadora del Ca2+ de VDAC2 o VDAC1, en donde el agente es el compuesto de Fórmula Ia o Ib:

C02Et

{R)-efsevin (S)-e-fsevin

Fórmula la Fórmula Ib

en donde el compuesto es para usar en la potenciación de la captación del Ca2+ mitocondrial para modular la ritmicidad cardíaca en un sujeto.

5. Un agente para usar de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el agente es un compuesto de Fórmula Ia:

6. Un agente para usar de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el agente es un compuesto de Fórmula Ib:

Ċ