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ES2870907T3 - Sistema de transposón, kit que lo comprende y sus usos - Google Patents

Sistema de transposón, kit que lo comprende y sus usos Download PDF

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ES2870907T3
ES2870907T3 ES16874806T ES16874806T ES2870907T3 ES 2870907 T3 ES2870907 T3 ES 2870907T3 ES 16874806 T ES16874806 T ES 16874806T ES 16874806 T ES16874806 T ES 16874806T ES 2870907 T3 ES2870907 T3 ES 2870907T3
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ES
Spain
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promoter
cell
vector
dna sequence
exogenous dna
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ES16874806T
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Sareina Chiung-Yuan Wu
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Genomefrontier Therapeutics Inc
Original Assignee
Genomefrontier Therapeutics Inc
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Abstract

Un método in vitro para integrar una secuencia de ADN exógeno en el genoma de una célula, comprendiendo dicho método: (i) obtener un sistema de transposón que incluye un primer vector que contiene: una primera repetición invertida que tiene una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO:1, la secuencia de ADN exógeno cadena abajo de la primera repetición invertida, y una segunda repetición invertida cadena abajo de la secuencia de ADN exógeno, teniendo la segunda repetición invertida una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO:2, y un segundo vector que contiene un promotor unido operativamente a un ácido nucleico que codifica una transposasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; y (ii) introducir el primer vector y el segundo vector en la célula, por lo que la secuencia de ADN exógeno se integra en el genoma de la célula, en el que el primer vector es un minicírculo de ADN que carece de las secuencias procariotas requeridas para la replicación bacteriana, y en el que la transposasa se expresa en la célula y cataliza la escisión de la secuencia de ADN exógeno del primer vector y la integración del ácido nucleico exógeno escindido en el genoma de la célula.

Description

DESCRIPCIÓN
Sistema de transposón, kit que lo comprende y sus usos
Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
La presente descripción se refiere, en general, a sistemas, kits y métodos para modificar células para que porten genes de interés; y a los usos de las células modificadas como agentes terapéuticos para tratar sujetos que lo necesiten.
2. Descripción de la técnica relacionada
El transposón PiggyBac (PB) es un elemento genético móvil que se transpone con eficacia entre vectores y cromosomas a través de un mecanismo de "corte y pegado". Durante la transposición, la PB transposasa reconoce secuencias repetidas terminales invertidas ("inverted terminal repeat sequences", ITRs) específicas de transposón ubicada en ambos extremos del vector de transposón y mueve los contenidos desde los sitios originales y los integra de modo eficaz en sitios cromosómicos TTAA. La poderosa actividad del sistema de transposón PB permite mover con eficacia genes de interés entre las dos ITRs en el vector de PB hacia los genomas diana.
Las características exclusivas de los transposones PB incluyen: (1) no hay límite de carga; se ha indicado que el transposón PB puede movilizar fragmentos de ADN de hasta 100 kilobases hacia el interior de las células diana; (2) el proceso de transposición es reversible; los genomas que contienen un vector de PB insertado pueden ser transfectados de modo transitorio con un vector que solo exprese la PB transposasa, para eliminar los transposones del genoma; y (3) los usos del transposón PB no se limita a una especie específica; el transposón PG específico de TTAA es un transposón muy útil para la modificación genética de una amplia diversidad de especies, por ejemplo, células de insecto y células de mamífero. Además, en comparación con los vectores virales, el transposón PB tiene baja inmunogenicidad.
El sistema inmunitario desempeña un papel crucial en la salud humana. La deficiencia o disfunción del sistema inmunitario disminuye la capacidad del cuerpo para eliminar células corporales anómalas y patógenos invasores, provocando una vulnerabilidad frente a tumores e infecciones. Por otra parte, cuando el sistema inmunitario es demasiado activo, entonces el cuerpo ataca y daña a sus propios tejidos y, por consiguiente, esto conduce al desarrollo de una enfermedad autoinmunitaria y a inflamación. Por tanto, la regulación de la expresión, la función o la interacción de las células inmunitarias, por ejemplo, introduciendo un gen exógeno (i) para sobrerregular o infrarregular la expresión génica de las células inmunitarias, o (ii) para potenciar o suprimir la función de las células inmunitarias, puede proporcionar un medio potencial para prevenir y/o tratar enfermedades relacionadas con la inmunidad. Sin embargo, es difícil que las células inmunitarias expresen constantemente un gen exógeno, lo cual limita su uso en la terapia celular.
Por consiguiente, en la técnica relacionada es necesario un sistema de expresión y métodos mejorados que permitan que una secuencia de ADN exógeno, por ejemplo, un gen, sea expresada de modo eficaz y constante en las células inmunitarias, las cuales puede emplearse posteriormente para una terapia celular para prevenir o tratar enfermedades y/o trastornos relacionados con la inmunidad.
Resumen
Un objeto de la invención es un método in vitro para integrar una secuencia de ADN exógeno en el genoma de una célula. El método se realiza (i) obteniendo un sistema de transposón que incluye (a) un primer vector que contiene una primera repetición invertida que tiene una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO:1, la secuencia de ADN exógeno cadena abajo de la primera repetición invertida, y una segunda repetición invertida cadena abajo de la secuencia de ADN exógeno, teniendo la segunda repetición invertida una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO:2, y (b) un segundo vector que contiene un promotor unido operativamente a un ácido nucleico que codifica una transposasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; y (ii) introducir el primer vector y el segundo vector en la célula. Según la invención, el primer vector es un minicírculo de ADN que carece de las secuencias procariotas requeridas para la replicación bacteriana. La secuencia de ADN exógeno se integra en el genoma de la célula en virtud de la transposasa, que se expresa en la célula y cataliza la escisión de la secuencia de ADN exógeno del primer vector y la integración del ácido nucleico exógeno escindido en el genoma de la célula.
También se describe un kit para la integración de una secuencia de ADN exógeno en el genoma de una célula. El kit contiene (i) un recipiente; (ii) un sistema de transposón que incluye (a) un primer vector que contiene una primera repetición invertida que tiene una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO:1, una segunda repetición invertida que tiene una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO:2 cadena abajo de la primera repetición invertida, y un sitio de clonación entre la primera repetición invertida y la segunda repetición invertida para introducir la secuencia de ADN exógeno, y (b) un segundo vector que contiene un promotor unido operativamente a un ácido nucleico que codifica una transposasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; y (iii) unas instrucciones asociadas con el recipiente y que indican cómo se usa el sistema de transposón. Según la invención, el primer vector es un minicírculo de ADN que carece de las secuencias procariotas requeridas para la replicación bacteriana. La transposasa cataliza la escisión de la secuencia de ADN exógeno del primer vector y la integración de la secuencia de ADN exógeno escindida en el genoma de la célula.
Además, la presente descripción describe un método para tratar un sujeto que padece o que se sospecha que padece una enfermedad relacionada con la inmunidad. El método incluye integrar una secuencia de ADN exógeno en el genoma de una célula inmunitaria usando el método in vitro descrito anteriormente, preferiblemente con el kit también descrito anteriormente, para producir una célula inmunitaria modificada, y administrar una cantidad eficaz de la célula inmunitaria modificada al sujeto para mejorar o aliviar los síntomas de la enfermedad relacionada con la inmunidad.
Muchas de las consiguientes características y ventajas de la presente descripción se entenderán mejor remitiéndose a la siguiente descripción detallada, considerada en conexión con los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A es un histograma que muestra el número de colonias resistentes a la higromicina de células HEK293 cotransfectadas con el plásmido auxiliar indicado y un donante de ADN (forma circular) producido mediante el método de digestión con enzimas/acoplamiento;
La figura 1B es un histograma que muestra el número de colonias resistentes a la higromicina de células HEK293 cotransfectadas con el plásmido auxiliar indicado y un donante de ADN (forma lineal) producido mediante el método de digestión con enzimas/acoplamiento;
La figura 1C es un histograma que muestra el número de colonias resistentes a la higromicina de células HEK293 cotransfectadas con el plásmido auxiliar indicado y un donante de ADN producido mediante un kit disponible en el mercado según el ejemplo 1 que aparece a continuación;
La figura 2A es un histograma que muestra el número de colonias resistentes a la higromicina de células T Jurkat cotransfectadas con el plásmido auxiliar indicado y un donante de ADN producido mediante el método de digestión con enzimas/acoplamiento;
La figura 2B es un histograma que muestra el número de colonias resistentes a la higromicina de células T Jurkat cotransfectadas con el plásmido auxiliar indicado y un donante de ADN producido mediante un kit disponible en el mercado según el ejemplo 2 que aparece a continuación; y
La figura 3 es un histograma que muestra la eficacia de transposición del donante de ADN indicado y un plásmido auxiliar cotransfectados en células T humanas primarias según el ejemplo 3 que aparece a continuación.
Descripción detallada
Se pretende que la descripción detallada proporcionada a continuación en conexión con los dibujos adjuntos sea una descripción de los presentes ejemplos y no se pretende que represente las únicas formas en las que el presente ejemplo pueda construirse o utilizarse. La descripción indica las funciones del ejemplo y la secuencia de etapas para construir y ejecutar el ejemplo. Sin embargo, pueden lograrse las mismas funciones y secuencias, o funciones y secuencias equivalentes, mediante diferentes ejemplos.
1. Definiciones
Por comodidad, ciertos términos y expresiones empleados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas se recogen en este punto. A menos que se indique lo contrario, las terminologías científicas y técnicas empleadas en la presente descripción tendrán los significados que se entienden habitualmente y que emplean los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que los términos en singular incluyen sus formas en plural, y los términos en plural incluirán el singular. De modo específico, tal como se emplean en la presente y en las reivindicaciones, las formas en singular "el/la" y "un/una" incluyen la referencia al plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, tal como se emplean en la presente y en las reivindicaciones, las expresiones "al menos uno" y "uno o más" tienen el mismo significado e incluyen uno, dos, tres o más.
Independientemente de que los parámetros e intervalos numéricos que indican el alcance amplio de la invención sean aproximaciones, los valores numéricos ofrecidos en los ejemplos específicos se indican de la manera más precisa posible. Sin embargo, cualquier valor numérico contiene inherentemente ciertos errores que surgen indefectiblemente de la desviación estándar que se encuentra en las respectivas mediciones del ensayo. Además, tal como se emplea en la presente, el término "aproximadamente" en general significa dentro del 10 %, 5 %, 1 % o 0,5 % de un intervalo o valor dado. Como alternativa, el término "aproximadamente" significa un error estándar aceptable del promedio, cuando lo consideren los expertos en la técnica. Fuera de los ejemplos de funcionamiento/trabajo, o a menos que se indique expresamente lo contrario, debe entenderse que todos los intervalos numéricos, cantidades, valores y porcentajes, tales como los que aparecen para cantidades de materiales, duraciones de tiempo, temperaturas, condiciones de ejecución, proporciones de cantidades y similares descritos en la presente, están modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos indicados en la presente descripción y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar si se desea. Como mínimo, cada parámetro numérico debe considerarse al menos a la luz del número de dígitos significativos indicados y aplicando las técnicas de redondeo habituales.
Tal como se emplean en la presente, el término "transposón" o la expresión "elemento transponible" se refieren a un polinucleótido que es capaz de cambiar su posición dentro de un genoma mediante su escisión desde un polinucleótido donante (por ejemplo, un vector) e integrándose en un sitio diana (por ejemplo, un ADN extracromosómico o genómico de la célula). Un transposón es un polinucleótido que incluye una secuencia de ácido nucleico flanqueada por secuencias de nucleótidos de acción en cis; en el que al menos una secuencia de nucleótidos de acción en cis está colocada 5' a la secuencia de ácido nucleico, y al menos una secuencia de nucleótidos de acción en cis está colocada 3' a la secuencia del ácido nucleico. Las secuencias de nucleótidos de acción en cis incluyen al menos una repetición invertida ("inverted repeat", IR) en cada extremo del transposón, a la cual se une una transposasa, preferiblemente un miembro de la familia piggyBac de transposasas de mamífero. En ciertas realizaciones preferidas, el transposón es un micro-piggyBac de polilla.
Tal como se emplea en la presente, el término "transposasa" se refiere a un polipéptido que cataliza la escisión de un transposón de un polinucleótido donante, por ejemplo, una construcción de minicírculo, y la posterior integración del transposón en el ADN genómico o extracromosómico de una célula diana. Preferiblemente, la transposasa se une a una secuencia repetida invertida.
Tal como se emplea en la presente, el término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos de cualquier longitud. Así, por ejemplo, los términos péptido, oligopéptido, proteína, anticuerpo y enzima se incluyen dentro de la definición de polipéptido. El término "polipéptido" también incluye las modificaciones postraduccionales del polipéptido, por ejemplo, la glicosilación (por ejemplo, la adición de un sacárido), la acetilación, la fosforilación y similares.
El término "vector", tal como se emplea en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otra molécula de ácido nucleico a la cual se ha unido. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a bacterias, plásmidos, fagos, cósmidos, episomas, virus y fragmentos de ADN insertables, es decir, fragmentos capaces de ser insertados en el genoma de una célula huésped mediante recombinación homóloga. Tal como se emplea en la presente, el término "plásmido" se refiere a un ADN bicatenario circular capaz de aceptar un fragmento de ADN extraño y capaz de replicarse en células procariotas o eucariotas.
El término "minicírculo" y las expresiones "minicírculo de ADN" y "secuencia de ácido nucleico de minicírculo" son intercambiables y se emplean para indicar una secuencia de ácido nucleico generalmente exenta de cualquier secuencia del esqueleto de un vector/plásmido necesaria para la replicación, tal como el gen de resistencia a antibióticos de procariotas y el origen de la replicación procariota. Los minicírculos pueden generarse in vivo a partir de plásmidos bacterianos mediante recombinación intramolecular específica de sitio entre los sitios de reconocimiento de recombinasa en el plásmido, produciendo un vector de minicírculo de ADN exento del ADN del esqueleto del plásmido bacteriano. Según una realización de la presente descripción, el presente minicírculo se prepara mediante el método de digestión con enzimas/acoplamiento. Según otra realización de la presente descripción, el presente minicírculo se prepara mediante un kit disponible en el mercado, concretamente, el kit Minicircle DNA Production (System Biosciences, CA, EE. UU.).
Tal como se emplea en la presente, el término "introducir" se refiere a la introducción de un polinucleótido (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de minicírculo o el vector auxiliar del presente sistema de transposón) en una célula o un organismo. El ácido nucleico del polinucleótido puede estar en forma de ARN o ADN desnudo, asociado con diversas proteínas, o incorporado en un vector. El término "introducir", tal como se emplea en la presente, pretende transmitir el significado más amplio posible e incluye la introducción, por ejemplo, mediante un método de transfección (introduciendo un polinucleótido en células eucariotas mediante un tratamiento físico y/o químico), un método de transformación (introduciendo un polinucleótido en células procariotas mediante un tratamiento físico y/o químico), un método viral/método de transducción viral (introduciendo un polinucleótido en células eucariotas y/o procariotas mediante un virus o un vector viral), un método de conjugación (introduciendo un polinucleótido desde una célula a otra mediante contacto directo entre las células o mediante un puente citoplásmico entre las células), y un método de fusión (fusionando dos células, que incluye la fusión de células homotípica y la fusión de células heterotípica).
El término "modificar", tal como se emplea en la presente, se refiere a cualquier manipulación de una célula que produzca un cambio detectable en la célula, y la manipulación incluye, pero no se limita a insertar un polinucleótido y/o un polipéptido heterólogo/homólogo a la célula, y mutar un polinucleótido y/o un polipéptido nativo a la célula.
El término "transposición", tal como se emplea en la presente, se refiere a un proceso de redisposición genética complejo que implica el movimiento o el copiado de un polinucleótido (transposón) desde una localización y su inserción en otra, que a menudo se produce dentro de un genoma, o entre genomas, construcciones de ADN (tales como plásmidos, bácmidos y cósmidos) o genoma y construcciones de ADN. Según las realizaciones de la presente descripción, la transposición se produce entre el genoma y la construcción de ADN, en el que el polinucleótido (por ejemplo, el módulo de expresión del presente sistema de transposón) se transfiere desde la secuencia de minicírculo de ácido nucleico del presente sistema de transposón al genoma de células huésped (por ejemplo, las células inmunitarias).
La expresión "eficacia de transposición", tal como se emplea en la presente, se refiere al número de células huésped que contienen el polinucleótido introducido, dentro de una población de células huésped. En general, la eficacia de transposición puede determinarse transfectando un polinucleótido que codifica un gen indicador, por ejemplo, p-gal, a una población de células huésped. Por tanto, la eficacia de transfección puede determinarse ensayando el producto génico codificado por el polinucleótido introducido, por ejemplo, midiendo el número de células que tienen actividad p-gal. Según una realización de la presente descripción, el polipéptido introducido es un gen de resistencia a la higromicina y, por consiguiente, la eficacia de transposición puede determinarse midiendo el número de células resistentes a la higromicina.
Tal como se emplea en la presente, la expresión "célula inmunitaria" se refiere a células que desempeñan un papel en la respuesta inmunitaria. Las células inmunitarias son de origen hematopoyético e incluyen linfocitos, tales como células B y células T; células asesinas naturales; células mieloides, tales como monocitos, macrófagos, eosinófilos, mastocitos, basófilos y granulocitos.
La expresión "enfermedad relacionada con la inmunidad", tal como se emplea en la presente, se refiere a una enfermedad y/o afección en la que el sistema inmunitario está implicado en la patogénesis de la enfermedad, o en la que una estimulación o inhibición apropiada del sistema inmunitario puede dar como resultado un tratamiento y/o una protección frente a la enfermedad. Los ejemplos de enfermedad relacionada con la inmunidad que pueden tratarse mediante la presente invención incluyen, pero no se limitan a un tumor, una enfermedad infecciosa, una alergia, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad del injerto contra el huésped, o una enfermedad inflamatoria.
El término "sujeto" se refiera a un mamífero, que incluye la especie humana, que puede tratarse con los métodos de la presente invención. El término "sujeto" pretende indicar el género masculino y femenino, a menos que se indique específicamente un género.
2. Descripción de la invención
En general, la presente descripción se refiere a sistemas, métodos y/o kits para modificar células para que porten genes de interés (por ejemplo, genes de proteínas terapéuticas). Las células modificadas después se usan como agente terapéutico para tratar un paciente que está padeciendo una enfermedad y/o trastorno que puede tratarse mediante los productos de los genes de interés.
Tal como se mencionó anteriormente, se proporciona un método in vitro para integrar una secuencia de ADN exógeno en el genoma de una célula. La secuencia de ADN exógeno puede codificar una proteína de resistencia a un antibiótico, un ARNip, una proteína indicadora, una citoquina, una quinasa, un antígeno, un receptor específico de antígeno, un receptor de citoquinas, o un polipéptido suicida. Por ejemplo, la secuencia de ADN exógeno puede codificar un receptor específico para un antígeno asociado a tumor. Una célula T modificada mediante el método es capaz de reconocer y matar específicamente las células tumorales que expresan el antígeno asociado a tumor. En otro ejemplo, la secuencia de ADN exógeno codifica una proteína de resistencia a la higromicina, de modo que puede establecerse una línea celular resistente a la higromicina. Como alternativa, la secuencia de ADN exógeno puede no poseer ninguna función biológica y puede emplearse para interrumpir la función de otro gen insertándose ella misma en un gen esencial, interrumpiendo con ello su función. Por ejemplo, la secuencia de ADN exógeno puede codificar un ARN antisentido para el silenciamiento de genes de receptor específico de células T ("T cell specific receptor", TCR) o PD-1.
El método descrito anteriormente se realiza obteniendo, en primer lugar, un sistema de transposón.
El sistema de transposón incluye un primer vector que contiene una primera repetición invertida que tiene una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO:1, una secuencia de ADN exógeno cadena abajo de la primera repetición invertida, y una segunda repetición invertida cadena abajo de la secuencia de ADN exógeno, teniendo la segunda repetición invertida una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO:2. El primer vector puede incluir además un promotor no procariota unido operativamente a la secuencia de ADN exógeno. El promotor no procariota puede ser, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus, el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor del virus de simio 40, el promotor del virus de tumor mamario de ratón, el promotor de fosfoglicerato quinasa, el promotor de beta-actina de pollo, el promotor del factor de alargamiento 1 -alfa, el promotor de H1 humano, y el promotor de U6. Como ejemplo, el primer vector incluye además un potenciador, un silenciador o un aislante.
Según la invención, el primer vector es un minicírculo de ADN que carece de las secuencias procariotas requeridas para la replicación bacteriana. El minicírculo de ADN puede tener una longitud de 500-1.500 pb exclusivas de la secuencia de ADN exógeno. Por ejemplo, el minicírculo de ADN puede tener una longitud de 700-1.200 pb o de 800­ 1.000 pb exclusivas de la secuencia de ADN exógeno.
En general, el ADN procariota se considera un antígeno estimulante de la inmunidad, que puede suscitar una respuesta inmunitaria en un huésped que conduzca a una disminución en la eficacia de expresión del ADN exógeno portado por el primer vector. Por consiguiente, la falta de secuencias procariotas en el minicírculo de ADN hace que el presente sistema de transposón sea más eficaz en términos de introducir y expresar el ADN exógeno en una célula huésped, por ejemplo, una célula eucariota, en comparación con otros sistemas de transposón/expresión que incluyen secuencias de ADN procariota. Además, el sistema de transposón descrito anteriormente tiene un tamaño menor en comparación con el tamaño de los sistemas de transposón/expresión típicos, debido a la ausencia de secuencia de ADN procariota en el minicírculo de ADN.
El sistema de transposón también incluye un segundo vector, concretamente, un plásmido auxiliar que contiene un promotor unido operativamente a un ácido nucleico que codifica una transposasa. La transposasa reconoce y se une a la primera repetición invertida y la segunda repetición invertida en el primer vector. La transposasa puede ser, por ejemplo, ThyPLGMH, mycPBasa, TPLGMH o HAhyPBasa. En una realización concreta, la transposasa tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, que es codificada por SEQ ID NO:3. El vector auxiliar puede prepararse según métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Yaa-Jyuhn James Meir et al. (A versatile, highly efficient, and potentially safer piggyBac transposon system for mammalian genome manipulations, FASEB, 2013:27, 4429-4443).
El promotor en el segundo vector se selecciona del promotor de citomegalovirus, el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor del virus de simio 40, el promotor del virus de tumor mamario de ratón, el promotor de fosfoglicerato quinasa, el promotor de beta-actina de pollo, el promotor del factor de alargamiento 1 -alfa, el promotor de H1 humano, y el promotor de U6. En una realización concreta, el promotor es el promotor de citomegalovirus. Para realizar el método, el primer vector y el segundo vector se introducen en una célula. Esto puede lograrse usando técnicas que incluyen, pero no se limitan a coprecipitación con fosfato de calcio, electroporación, nucleofección, compresión de células ("cell squeezing", compresión suave de la membrana celular), sonoporación (induce la formación de poros en la membrana celular mediante ultrasonido de alta intensidad), transfección óptica (se genera un orificio diminuto en la membrana celular mediante un láser muy enfocado), impalefección (se inserta en una célula ADN unido a la superficie de una nanofibra), pistola de genes (se "dispara" al núcleo celular ADN acoplado a una nanopartícula de un sólido inerte), magnetofección (emplea la fuerza magnética para transportar ADN hacia el interior de las células diana), transducción viral (emplea virus como portadores para transportar ADN hacia el interior de las células diana), o transfección a través de un dendrímero, un liposoma, o un polímero catiónico. En un ejemplo, el sistema de transposón se introduce en una célula a través de un método químico no liposómico, concretamente, transfección FuGENE® HD. En otro ejemplo, el sistema de transposón se introduce en una célula mediante nucleofección. En una realización concreta del método, el primer vector del sistema de transposón se linealiza, por ejemplo, usando una enzima de restricción, antes de introducirlo en una célula.
El primer vector y el segundo vector se introducen en la célula en una proporción que varía de 2:1 a 1:1 en peso. Según una realización, el ADN exógeno se introduce en una célula epitelial, y la proporción entre el primer vector, por ejemplo, minicírculo de ADN, y el segundo vector es de 2:1 a 1:1 en peso. Según otra realización, el ADN exógeno se introduce en una célula T inmortal, y la proporción entre la secuencia de minicírculo de ADN y el vector auxiliar es de aproximadamente 2:1 a 1:1 en peso. En otra realización, el ADN exógeno se introduce en una célula T primaria, y la proporción entre la secuencia de minicírculo de ADN y el vector auxiliar es de aproximadamente 2:1 a 1:1 en peso.
La secuencia del ADN exógeno se integra en el genoma de la célula en virtud de la transposasa, que es expresada en la célula por el segundo vector y cataliza la escisión de la secuencia de ADN exógeno desde el primer vector y la integración del ADN exógeno escindido en el genoma de la célula.
La célula usada en el anterior método puede ser una célula inmunitaria. De modo más específico, la célula inmunitaria puede ser una célula T, una célula B, una célula dendrítica, un macrófago o un mastocito.
En otro aspecto, la célula es una célula madre. La célula madre puede derivarse, por ejemplo, de médula ósea, tejido adiposo, sangre periférica, sangre de cordón umbilical o pulpa dental. En un método concreto, la célula es una célula humana.
Para realizar el anterior método, se proporciona un kit para integrar una secuencia de ADN exógeno en el genoma de una célula. El kit contiene un recipiente, que comprende el presente sistema de transposón descrito anteriormente, y unas instrucciones asociadas con el recipiente y que indican cómo usar el presente sistema de transposón. Tal como se mencionó anteriormente, el presente sistema de transposón incluye un primer y un segundo vector.
El primer vector incluye una primera repetición invertida que tiene una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO:1, una segunda repetición invertida que tiene una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO:2 cadena abajo de la primera repetición invertida, y un sitio de clonación entre la primera repetición invertida y la segunda repetición invertida para introducir una secuencia de ADN exógeno.
El primer vector en el kit puede incluir además un promotor no procariota cadena abajo de la primera repetición invertida y cadena arriba del sitio de clonación. El ADN exógeno puede insertarse en el sitio de clonación de modo que el promotor no procariota esté unido operativamente a la secuencia de ADN exógeno. El promotor no procariota puede ser, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus, el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor del virus de simio 40, el promotor del virus de tumor mamario de ratón, el promotor de fosfoglicerato quinasa, el promotor de beta-actina de pollo, el promotor del factor de alargamiento 1 -alfa, el promotor de H1 humano, y el promotor de U6. En un ejemplo, el primer vector incluye además un potenciador, un silenciador o un aislante.
El kit también incluye un segundo vector, concretamente, un plásmido auxiliar que contiene un promotor unido operativamente a un ácido nucleico que codifica una transposasa. La transposasa puede ser, por ejemplo, ThyPLGMH, mycPBasa, TPLGMH o HAhyPBasa. En una realización concreta, la transposasa tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.
El segundo vector en el kit, al igual que el segundo vector usado en el método in vitro indicado anteriormente en la presente, contiene un promotor seleccionado del promotor de citomegalovirus, el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor del virus de simio 40, el promotor del virus de tumor mamario de ratón, el promotor de fosfoglicerato quinasa, el promotor de beta-actina de pollo, el promotor del factor de alargamiento 1 -alfa, el promotor de H1 humano, y el promotor de U6. En una realización concreta, el promotor es el promotor de citomegalovirus. Tal como se emplea en la presente, "instrucciones" incluye un panfleto, una grabación, un diagrama o cualquier otro medio de expresión (por ejemplo, cinta, CD, VCD o DVD) que pueda usarse para comunicar o enseñar al usuario a utilizar el presente sistema de transposón. Las instrucciones pueden fijarse al recipiente o se envasan independientemente del recipiente que comprende el presente sistema de transposón.
El kit descrito en la presente puede incluir además una disolución tampón para estabilizar el sistema de transposón y/o para realizar la transfección de células. Las disoluciones tampón pueden ser, por ejemplo, disolución salina tamponada con fosfato, disolución salina con base de Tris, tampón Tris-EDTA, tampón ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetansulfónico, o tampón ácido (N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetansulfónico (BES).
Tal como se mencionó anteriormente, se describe un método para tratar un sujeto que padece o que se sospecha que padece una enfermedad relacionada con la inmunidad. El método incluye modificar células con la ayuda del kit descrito anteriormente para transportar un gen adecuado para el tratamiento de la enfermedad relacionada con la inmunidad, y administrar una cantidad eficaz de las células modificadas para el tratamiento de la enfermedad relacionada con la inmunidad. En un ejemplo, el gen es un receptor de antígeno quimérico ("chimeric antigen receptor", CAR) contra CD19 para modificar células T CAR para tratar la leucemia linfoblástica aguda.
El sujeto que padece o que se sospecha que padece una enfermedad relacionada con la inmunidad es un animal mamífero, que incluye un ser humano, un ratón, una rata, un conejo, un mono y un cerdo. En un aspecto específico, el sujeto es un ser humano. En el caso en que el sujeto que se está tratando sea un ser humano, la célula inmunitaria introducida/transferida del presente método se deriva preferiblemente del propio sujeto. Como alternativa, la célula inmunitaria introducida/transferida del presente método se deriva de un donante.
Según algunos aspectos de la presente descripción, el presente método es útil para tratar una enfermedad de inmunosupresión, tal como un tumor o una enfermedad infecciosa. En estas realizaciones, el presente sistema de transposón puede comprender un gen potenciador de la inmunidad para potenciar la respuesta inmunitaria en el sujeto.
Según otros aspectos de la presente descripción, el presente método es útil para tratar una enfermedad provocada por una respuesta inmunitaria hiperactiva (por ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria) o una respuesta inmunitaria inapropiada (por ejemplo, alergia, enfermedad del injerto contra el huésped, o una enfermedad inflamatoria). En los aspectos, el presente sistema de transposón que comprende un gen inmunosupresor es capaz de inhibir la respuesta inmunitaria en el sujeto.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para aclarar ciertos aspectos de la presente invención y para ayudar a los expertos en la técnica a practicar la invención. Estos ejemplos no deben considerarse de ninguna manera que limiten el alcance de la invención.
Ejemplos
Materiales y métodos
Cultivo celular
Se usaron la línea de células de riñón embrionario humano 293 (HEK 293), linfocitos T inmortales JK humanos (T Jurkat) y células T humanas primarias en el presente estudio. Las células HEK293 se cultivaron en medio MEM que contenía FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM, 1x aminoácidos no esenciales, 1x penicilina/estreptomicina, y piruvato de sodio 1 mM. Las células T Jurkat y las células T humanas primarias se cultivaron en medio in RPMI1640 que contenía L-glutamina 2 mM, FBS al 10 %, piruvato de sodio 1 mM, y aminoácidos no esenciales 0,1 mM. Todas las células se mantuvieron a 37 °C con CO2 al 5 %.
Producción del medio acondicionado
Las células Jurkat se cultivaron en un medio fresco a una densidad de 2 x 106/mL durante 24 h, después el medio de cultivo se recogió, se filtró y se usó como el medio acondicionado.
Generación de plásmidos y/o construcciones de expresión
pBS-módulo
El fragmento de ADN que contiene el gen de resistencia a higromicina conducido por el promotor de SV40 se escindió del vector pcDNA3.1_hygro_LacZ (Invitrogen). Después de una digestión con Xmnl y Sapl, el fragmento de ADN se clonó en el sitio Smal de pBlueScript SKII para completar la construcción de pBS-hygro. Para insertar también el gen de resistencia a kanamicina y el origen de la replicación ColE1, el fragmento Apol_AfllII de pZErO-2.1 (Invitrogen) se clonó en el sitio EcoRV de pBS-hygro para completar la construcción del pBS-módulo.
mini-piggyBac_largo
El pBS-módulo se digirió con las enzimas de restricción Smal y EcoRV, seguido de la inserción del fragmento digerido en pXLBaclIPUbnlsEGFP, que se deriva de pBSII-ITR1. La construcción producida de este modo, minipiggyBac_largo, tiene repeticiones terminales (TR) de 308 pb y 238 pb en sus extremos 5' y 3', respectivamente. La forma lineal de mini-piggyBac_largo se prepara digiriendo el mini-piggyBac_largo con Xmnl.
mini-piggyBac_corto
La construcción mini-piggyBac_largo se digirió con Pcil y Acll, se rellenó con Klenow (NE Biolabs) y se autoacopló con ADN ligasa T4 (NE Biolabs) para producir mini-piggyBac_corto, que no contiene el gen de resistencia a la ampicilina y el origen de la replicación f1.
La forma lineal de mini-piggyBac_corto se prepara digiriendo el mini-piggyBac_corto con Bgl I.
micro-piggyBac_largo
Se obtuvieron los dominios de repetición terminales ("terminal repeat domains", TRD) de piggyBac corto (concretamente, 746~808 3' LTR y 1426~ 1460 5' LTR como en pXL-Bacll) a partir de una mezcla de PCR que consistía en las siguientes parejas de cebadores: pB-11-Kpnl (SEQ ID NO:5), pB-5-directo (SEQ ID NO:6), pB-6-inverso (SEQ ID NO:7), y pB-12-Sacl (SEQ ID NO:8). El amplicón resultante que contenía ambos TRD 67 pb 5' y 40 pb 3' con sitios de restricción Swal y Xho I intermedios se clonó en pBS-SKII a través de los sitios de restricción Kpn I y Sac I para obtener pPBendAATT. El módulo de expresión obtenido del pBS-módulo descrito anteriormente se insertó entre los TRD de piggyback corto en pPBendAATT a través del sitio Xho I con extremos romos para producir micro-piggyBac_largo.
La forma lineal de micro-piggyBac_largo se prepara digiriendo el micro-piggyBac_largo con Xmnl.
micro-piggyBac_corto
El micro-piggyBac_largo se digirió con Acc65I y AflIII para eliminar el gen de resistencia a la ampicilina y el origen de la replicación f1. Se formaron extremos romos en el fragmento de ADN remanente, seguido de un autoacoplamiento para generar la construcción de micro-piggyBac_corto, que no contiene el gen de resistencia a la ampicilina y el origen de la replicación f1. Esta construcción también se denomina módulo de minicírculo.
La forma lineal de micro-piggyBac_corto se prepara digiriendo micro-piggyBac_corto con Xmnl.
Minicírculo-micro PB-módulo
Como alternativa, el micro-piggyBac_corto, es decir, el módulo de minicírculo, puede prepararse usando el kit de producción de microcírculos de ADN MC-Easy Circle. En este método, el micro-piggyBac_largo se digirió con Kpnl, Sacl y Xmnl, se formaron extremos romos en el fragmento Kpnl-Sacl (3993 pb) que contiene las repeticiones invertidas izquierda (microL) y derecha (microR) de micro-piggyBac y se insertó en el sitio EcoRV de pMC.BESPX-MCS1 para producir pMC-microPB-módulo. El microcírculo-microPB-módulo se preparó a partir de pMC-microPB-módulo usando el kit de producción de microcírculos de ADN MC-Easy Circle siguiendo el protocolo del fabricante. El minicírculo-microPB-módulo producido de esta forma no contiene el gen de resistencia a la ampicilina y el origen de la replicación f1.
Plásmido auxiliar
Los plásmidos auxiliares pCMV-ThyPLGMH, pCMV-mycPBasa, pCMV-TPLGMH y pCMV-HAhyPBasa se construyeron según el protocolo descrito en Yaa-Jyuhn James Meir et al. (A versatile, highly efficient, and potentially safer piggyBac transposon system for mammalian genome manipulations, FASEB, 2013:27, 4429-4443).
Ensayos de transposición
Células HEK293
Se recolectaron células al 80 % de confluencia y se sembraron en pocillos individuales de placas de 24 pocillos a una densidad de 1 x 105 células/pocillo 18 horas antes de la transfección. Para cada transfección, un total de 300 ng de mezcla de ADN se transfectó usando Fugene 6 (Roche, Florencia, SC). Cada mezcla de ADN contenía 100 ng de plásmido auxiliar (concretamente, pCMV-ThyPLGMH, pCMV-mycPBasa, pCMV-TPLGMH o pCMV-HAhyPBasa), diversas cantidades de donante de ADN (concretamente, mini-piggyBac_largo, mini-piggyBac_corto, micropiggyBac_largo, micro-piggyBac_corto, pMC-microPB-módulo o minicírculo-microPB-módulo; la cantidad del donante más pequeño se ajustó a 100 ng) y pcDNA3.1 para un total de 300 ng de ADN. Para cada reacción de transfección, una quinta parte de las células transfectadas se trasladaron a placas de 100 mm, seguido de una selección con higromicina durante 14 días. Para contar los clones, las células se fijaron con PBS que contenía paraformaldehído al 4 % durante 10 min y después se tiñeron con azul de metileno al 0,2 % durante 1 hora. Después de 14 días de selección con higromicina, solo se contaron las colonias con un diámetro de 0,5 mm.
Células T Jurkat
Las células se sembraron a 1 x 106/mL 24 horas antes de la nucleofección. Para cada reacción de nucleofección, se usó un total de 6 pg de ADN para transfectar 1 x 106 células. Cada mezcla de ADN contenía 2,5 pg de plásmido auxiliar (concretamente, pCMV-ThyPLGMH, pCMV-mycPBasa, pCMV-TPLGMH o pCMV-HAhyPBasa), diversas cantidades de donante de ADN (concretamente, mini-piggyBac_largo, mini-piggyBac_corto, micro-piggyBac_largo, micro-piggyBac_corto, pMC-microPB-módulo o minicírculo-microPB-módulo; la cantidad del donante más pequeño se ajustó a 2,0 pg) y pcDNA3.1 para un total de 6 pg de ADN. Veinticuatro horas después de la nucleofección, 30 células vivas en 50 pL del medio acondicionado descrito anteriormente con 1,2 mg de higromicina se sembraron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Cada dos a tres días, se añadió suavemente un volumen igual de medio acondicionado a cada pocillo sin alterar los agrupamientos de células. Para cada reacción, un total de 10.200 células vivas se sometieron a una selección con higromicina. Se determinó la actividad de transposición contando el número total de agrupamientos de células para cada reacción bajo un microscopio óptico 6 o 7 días después de la selección con higromicina.
Células T primarias
Un día antes de la nucleofección, se descongelaron células primarias humanas (CD8+CD45RA+) en medio RPMI completo. Después de un cultivo durante la noche, las células se recolectaron y se sometieron a nucleofección. Para cada reacción de nucleofección, se usó un total de 2,2 pg de ADN para transfectar 1 x 105 células en 20 pl de tampón de nucleofección ALL-IN-ONE (GF1001, GenomeFrontier, Biosciences). Cada mezcla de ADN contenía 0,8 pg de plásmido auxiliar (concretamente, pCMV-HAhyPBasa o pCMV-ThyPLGMH), diversas cantidades de plásmido donante (concretamente, mini-piggyBac_largo, mini-piggyBac_corto, micro-piggyBac_largo o micro-piggyBac_corto; la cantidad del donante más grande se ajustó a 1,4 pg) y pcDNA3.1 para una cantidad total de 2,2 pg de ADN. Veinticuatro horas después de la nucleofección, el total de células transfectadas en cada reacción se cultivó en 500 ul de medio RPMI 1640 completo con la adición de estímulos (IL-2 (50 ug/ml) y PHA) e higromicina (1,0 mg/ml). Se determinó la actividad de transposición contando el número total de células supervivientes 22 días después de la selección con higromicina.
Ejemplo 1: Actividad de transposición en células HEK293
En este ejemplo, se analizan las actividades de transposición de donantes de ADN y del plásmido auxiliar. Los resultados se muestran en las figuras 1A-1C.
Tal como se muestra en la figura 1A, independientemente del donante de ADN que fuera cotransfectado, las células transfectadas con pCMV-ThyPLGMH fueron células más resistentes a la higromicina, en comparación con las transfectadas con pcDNA3.1, pCMV-TPLGMH o pCMV-mycPBasa. Los datos indican que ThyPLGMH mostró la actividad de transposición más potente entre las transposasas ensayadas. Con respecto al donante de ADN, los cuatro donantes de ADN (concretamente, mini-piggyBac_largo, mini-piggyBac_corto, micro-piggyBac_largo y micropiggyBac_corto) mostraron una actividad de transposición similar en células HEK293 (figura 1A). De forma sorprendente, cuando los donantes de ADN se transfectaron en células HEK293 en su forma linealizada, la actividad de transposición de micro-piggyBac (concretamente, micro-piggyBac_corto o micro-piggyBac_largo) fue obviamente mayor que la de mini-piggyBac (concretamente, mini-piggyBac_corto o mini-piggyBac_largo) (figura 1B), y micropiggyBac_corto mostró la actividad de transposición más potente.
La actividad de transposición se examinó más a fondo usando el minicírculo preparado con el kit de producción de microcírculos de ADN MC-Easy Circle. Los datos que se muestran en la figura 1C indican que la actividad de minicírculo-microPB-módulo fue aproximadamente 2,7 veces mayor que la de pMC-microPB-módulo cuando se cotransfectan con pCMV-ThyPLGMH.
Tomados conjuntamente, estos datos indican que la actividad de transposición disminuye a medida que aumenta la longitud total o el TRD del donante de ADN, y que ThyPLGMH posee una actividad de transposición más alta que otras transposasas ensayadas. Por consiguiente, en comparación con otros donantes de ADN y plásmidos auxiliares, la combinación de pCMV-ThyPLGMH y minicírculo de micro-piggyBac (concretamente, micropiggyBac_corto o minicírculo-microPB-módulo) produjo la eficacia de transposición más alta en células HEK293. Ejemplo 2: Actividad de transposición en células T Jurkat
La actividad de transposición de pCMV-ThyPLGMH y minicírculo de micro-piggyBac se examinó más a fondo en células T Jurkat. Los resultados se muestran en las figuras 2A-2B.
Tal como se muestra en la figura 2A, el número de colonias resistentes a la higromicina obtenidas a partir de las células cotransfectadas con pCMV-ThyPLGMH y micro-piggyBac_corto fue significativamente mayor que a partir de las células cotransfectadas con otros donantes de ADN y plásmidos auxiliares.
De modo similar al descubrimiento mostrado en la figura 1C, la combinación de pCMV-ThyPLGMH y minicírculomicroPB-módulo produjo la mayor eficacia de transposición, en comparación con otras combinaciones de donante de ADN/plásmido auxiliar (figura 2B).
Ejemplo 3: Actividad de transposición en células T humanas primarias
Además de las líneas celulares descritas anteriormente, concretamente células HEK293 y células T Jurkat, se analizó más a fondo la actividad de transposición de donantes de ADN y plásmidos auxiliares específicos en células T humanas primarias.
Tal como se muestra en la figura 3, se observó la mejor actividad de transposición en células T primarias humanas en células transfectadas con pCMV-ThyPLGMH con la forma corta o larga de micro-piggyBac, es decir, micropiggyBac_corto o micro-piggyBac_largo.
En conclusión, la presente descripción proporciona un sistema de transposón y un método para integrar un gen exógeno en el genoma de una célula, en especial en una célula inmunitaria. En comparación con las combinaciones de otros donantes de ADN y plásmidos auxiliares, la combinación de pCMV-ThyPLGMH y minicírculo de micropiggyBac (producido mediante el método de digestión con enzimas/acoplamiento (concretamente, micropiggyBac_corto) o producido mediante el kit de producción de minicírculos de ADN MC-Easy Circle (concretamente, minicírculo-microPB-módulo)) o micro-piggyBac_largo produciría la eficacia de transposición más alta. Por consiguiente, la presente descripción proporciona un medio potencial para tratar diferentes enfermedades (por ejemplo, una enfermedad relacionada con la inmunidad) a través del transporte eficaz de un gen terapéutico al interior del sujeto que lo necesita.

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Un método in vitro para integrar una secuencia de ADN exógeno en el genoma de una célula, comprendiendo dicho método:
    (i) obtener un sistema de transposón que incluye
    un primer vector que contiene:
    una primera repetición invertida que tiene una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO:1, la secuencia de ADN exógeno cadena abajo de la primera repetición invertida, y
    una segunda repetición invertida cadena abajo de la secuencia de ADN exógeno, teniendo la segunda repetición invertida una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO:2, y
    un segundo vector que contiene un promotor unido operativamente a un ácido nucleico que codifica una transposasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; y
    (ii) introducir el primer vector y el segundo vector en la célula,
    por lo que la secuencia de ADN exógeno se integra en el genoma de la célula, en el que el primer vector es un minicírculo de ADN que carece de las secuencias procariotas requeridas para la replicación bacteriana, y en el que la transposasa se expresa en la célula y cataliza la escisión de la secuencia de ADN exógeno del primer vector y la integración del ácido nucleico exógeno escindido en el genoma de la célula.
  2. 2. - El método de la reivindicación 1, en el que la secuencia de ADN exógeno codifica una proteína de resistencia a antibióticos, un ARNip, una proteína indicadora, una citoquina, una quinasa, un antígeno, un receptor específico de antígeno, un receptor de citoquinas, o un polipéptido suicida, en el que el primer vector preferiblemente comprende además un promotor no procariota unido operativamente a la secuencia de ADN exógeno, y opcionalmente comprende además un potenciador, un silenciador o un aislante, también preferiblemente en el que el promotor no procariota se selecciona del grupo que consiste en el promotor de citomegalovirus, el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor del virus de simio 40, el promotor del virus de tumor mamario de ratón, el promotor de fosfoglicerato quinasa, el promotor de beta-actina de pollo, el promotor del factor de alargamiento 1 -alfa, el promotor de H1 humano, y el promotor de U6.
  3. 3. - El método de la reivindicación 1, en el que el promotor en el segundo vector se selecciona del grupo que consiste en el promotor de citomegalovirus, el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor del virus de simio 40, el promotor del virus de tumor mamario de ratón, el promotor de fosfoglicerato quinasa, el promotor de beta-actina de pollo, el promotor del factor de alargamiento 1 -alfa, el promotor de H1 humano, y el promotor de U6.
  4. 4. - El método de la reivindicación 1, en el que la célula es una célula inmunitaria seleccionada del grupo que consiste en una célula T, una célula B, una célula dendrítica, un macrófago o un mastocito, o es una célula madre derivada de médula ósea, tejido adiposo, sangre periférica, sangre de cordón umbilical o pulpa dental, y en el que la célula es preferiblemente una célula humana.
  5. 5. - El método de la reivindicación 1, que comprende además linealizar el primer vector antes de la etapa de introducción.
  6. 6. - El método de la reivindicación 1, en el que el primer vector y el segundo vector se introducen en la célula mediante coprecipitación con fosfato de calcio, electroporación, nucleofección, compresión de células, sonoporación, transfección óptica, impalefección, pistola de genes, magnetofección, transducción viral, o transfección a través de un dendrímero, un liposoma o un polímero catiónico.
  7. 7. - Un kit para integrar una secuencia de ADN exógeno en el genoma de una célula, comprendiendo dicho kit: un recipiente;
    un sistema de transposón que incluye
    un primer vector que contiene:
    una primera repetición invertida que tiene una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO:1, una segunda repetición invertida que tiene una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO:2 cadena abajo de la primera repetición invertida, y
    un sitio de clonación entre la primera repetición invertida y la segunda repetición invertida para introducir la secuencia de ADN exógeno, y
    un segundo vector que contiene un promotor unido operativamente a un ácido nucleico que codifica una transposasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4;
    e instrucciones asociadas con el recipiente y que indican cómo usar el sistema de transposón;
    en el que el primer vector es un minicírculo de ADN que carece de las secuencias procariotas requeridas para la replicación bacteriana, y en el que la transposasa cataliza la escisión de la secuencia de ADN exógeno del primer vector y la integración de la secuencia de ADN exógeno escindida en el genoma de la célula.
  8. 8. - El kit de la reivindicación 7, en el que el promotor en el segundo vector se selecciona del grupo que consiste en el promotor de citomegalovirus, el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor del virus de simio 40, el promotor del virus de tumor mamario de ratón, el promotor de fosfoglicerato quinasa, el promotor de beta-actina de pollo, el promotor del factor de alargamiento 1 -alfa, el promotor de H1 humano, y el promotor de U6.
  9. 9. - El kit de la reivindicación 7, en el que el primer vector comprende además un promotor no procariota cadena abajo de la primera repetición invertida y cadena arriba del sitio de clonación, en el que el promotor no procariota se selecciona del grupo que consiste en el promotor de citomegalovirus, el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor del virus de simio 40, el promotor del virus de tumor mamario de ratón, el promotor de fosfoglicerato quinasa, el promotor de beta-actina de pollo, el promotor del factor de alargamiento 1 -alfa, el promotor de H1 humano, y el promotor de U6.
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