ES2862187T3

ES2862187T3 - Composiciones terapéuticas y métodos para tumores malignos con moléculas de iARN dirigidas a Hsp47 y p21

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Publication number: ES2862187T3
Application number: ES15874364T
Authority: ES
Inventors: Wenbin Ying; Akihiro Yoneda; Yasuaki Tamura; Kenjirou Minomi; Bharat Majeti; Jihua Liu
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2015-12-28
Publication date: 2021-10-07
Anticipated expiration: 2035-12-28

Abstract

Composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento de cáncer de pulmón o cáncer pancreático, comprendiendo la composición nanopartículas que encapsulan moléculas de iARN, en la que las moléculas de iARN están dirigidas a Hsp47.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones terapéuticas y métodos para tumores malignos con moléculas de iARN dirigidas a Hsp47 y p21

Campo técnico de la invención

Esta invención se refiere a los campos de productos biofarmacéuticos y productos terapéuticos compuestos por moléculas basadas en ácido nucleico. Más particularmente, esta invención se refiere a métodos y a composiciones para suministrar agentes de interferencia de ARN para prevenir, tratar o mejorar los efectos de estados y enfermedades que implican tumores malignos.

Antecedentes de la invención

El crecimiento de tumores malignos está relacionado con la matriz extracelular (ECM). La chaperona molecular, proteína de “choque térmico” Hsp47, está implicada en la regulación de una red de transcripción génica de ECM.

La expresión de Hsp47 puede activarse en el cáncer de mama y otros cánceres. Reducir Hsp47 puede reducir el crecimiento de células de cáncer de mama y limitar el crecimiento tumoral.

Una expresión aumentada de Hsp47 puede ser un factor en desenlaces malos de supervivencia de pacientes con cáncer de mama. La expresión de Hsp47 puede fomentar la progresión del cáncer, en parte aumentando proteínas de ECM. Véase, por ejemplo, Cancer Res, 2015, 75(8), 1580-91.

Hsp47 puede expresarse altamente en cáncer pancreático. Hsp-47 puede ser un marcador específico útil para la detección de cáncer oral.

Hsp47 o una secuencia génica homóloga de la misma se divulga, por ejemplo, como n.° de registro de GenBank AB010273 (humano), X60676 (ratón) o M69246 (rata, gp46).

Se han divulgado agentes para suprimir Hsp47 para inhibir la fibrosis. Véanse, por ejemplo, los documentos US 8.173.170 B2 y US 8.710.209 B2. Sin embargo, existe información limitada referente al efecto de inhibir Hsp47 en el desarrollo, progresión y crecimiento de tumores malignos.

p21 es una proteína reguladora del ciclo celular que se codifica por el gen CDKN1A y pertenece a la familia de CIP/KIP. Esta proteína tiene la función de inhibir la progresión del ciclo celular en la fase G1 y la fase G2/M inhibiendo el efecto de un complejo de ciclina-CDK mediante la unión al complejo. Específicamente, el gen de p21 experimenta activación mediante p53, uno de los genes supresores de tumor. Se ha notificado que, tras la activación de p53 debido a daño del ADN o similar, p53 activa p21 de modo que el ciclo celular se detiene en la fase G1 y la fase G2/M.

p21 se sobreexpresa en una variedad de cánceres humanos incluyendo carcinomas de próstata, de cuello uterino, de mama y de célula escamosas y, en muchos casos, la regulación por incremento de p21 se correlaciona de manera positiva con el grado, la invasividad y la agresividad del de tumor. Véase, por ejemplo, Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, n.° 8, págs. 4291-96. Además, se ha notificado que la regulación por incremento de p21 está asociada con la tumorigenicidad y el mal pronóstico en muchas formas de cánceres, incluyendo cánceres de cerebro, de próstata, de ovarios, de mama y de células esofágicas. Véase, por ejemplo, Winters et al., Breast Cancer Research, 2003, vol. 5, n.° 6, págs. R242-R249. Además, la enfermedad puede ser enfermedades relacionadas con la edad, incluyendo aterosclerosis, enfermedad de Alzheimer, amiloidosis y artritis. Véase, por ejemplo, Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, n.° 8, págs. 4291-96. El documento WO 2009/033284 A1 comenta inhibidores de la biosíntesis del colágeno como agentes antitumorales.

Existe una necesidad urgente de métodos y composiciones para desarrollar terapias para pacientes con tumores malignos, tales como secuencias, compuestos y estructuras de ARNip para la inhibición de la expresión de Hsp47 y p21.

Lo que se necesita son métodos y composiciones para tumores malignos. Existe una necesidad continuada de moléculas de iARN dirigidas a Hsp47, p21 y otras estructuras y composiciones para prevenir, tratar o reducir tumores malignos.

Breve sumario

Esta invención se refiere al sorprendente descubrimiento de que el tamaño de tumores malignos puede reducirse in vivo mediante tratamiento con inhibidores de ARNip de Hsp47 e inhibidores de Hsp47 en combinación con inhibidores de p21.

Esta invención se refiere a métodos y a composiciones que incorporan compuestos terapéuticos basados en ácido nucleico para su uso en el suministro a diversos órganos para prevenir, tratar o mejorar estados y enfermedades de tumor maligno. En algunas realizaciones, esta divulgación proporciona composiciones de moléculas de interferencia de ARN (moléculas de iARN) para el silenciamiento génico de diversas dianas relacionadas con tumores malignos.

Esta divulgación puede proporcionar composiciones para el suministro de moléculas terapéuticas, así como métodos de uso de las mismas. Diversas composiciones farmacéuticas y basadas en ARN de esta divulgación pueden usarse en métodos para prevenir o tratar tumores malignos.

Esta invención se refiere a métodos y a composiciones para compuestos terapéuticos basados en ácido nucleico contra tumores malignos. En algunas realizaciones, esta divulgación proporciona moléculas de iARN, estructuras y composiciones que pueden silenciar la expresión de Hsp47, así como Hsp47 y p21. Las estructuras y composiciones de esta divulgación pueden usarse en la prevención, tratamiento o reducción del tamaño de tumores malignos.

En determinadas realizaciones, esta invención proporciona composiciones que comprenden moléculas de ácido nucleico bicatenario que son moléculas de iARN tales como ARNip o ARNhc para suprimir Hsp47, para su uso en la prevención, tratamiento o mejora de uno o más síntomas de cáncer de pulmón o cáncer pancreático. Realizaciones de esta divulgación también pueden proporcionar moléculas de iARN para suprimir p21.

En determinadas realizaciones, la molécula de ácido nucleico inhibidora puede ser una molécula de ácido nucleico antisentido, un ARN de interferencia pequeño (ARNip) o un ARN bicatenario (ARNbc).

Las moléculas de iARN comprendidas en composiciones de esta invención pueden ser activas para el silenciamiento génico, por ejemplo, un ARNbc que es activo para el silenciamiento génico, un ARNip, un microARN o un ARNhc activo para el silenciamiento génico, así como un ARN dirigido a ADN (ARNdA), un ARN de interacción con Piwi (ARNiP) y un ARNip asociado con repetición (ARNipar).

En realizaciones adicionales, métodos de esta divulgación pueden reducir la transcripción o translación de Hsp47 y/o p21 en tumores malignos.

En realizaciones particulares, esta divulgación incluye métodos para disminuir la expresión de Hsp47, o para disminuir la expresión de Hsp47 y p21 en una célula de tumor maligno, en los que la célula puede ser una célula humana, una célula neoplásica, una célula in vivo o una célula in vitro.

Realizaciones de esta divulgación también pueden proporcionar métodos para tratar a un sujeto que tiene un neoplasma, en los que las células cancerosas de neoplasma presentan niveles de expresión de Hsp47 aberrantes. Los métodos pueden implicar administrar al sujeto una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico inhibidora, en los que la molécula de ácido nucleico inhibidora reduce la expresión de Hsp47 o en los que una combinación de moléculas de iARN reducen la expresión de Hsp47 y p21, tratando de ese modo el neoplasma. En algunas realizaciones, los métodos de esta divulgación pueden disminuir el tamaño de un neoplasma, con respecto al tamaño del neoplasma antes del tratamiento o sin tratamiento.

En diversas realizaciones, puede suministrarse una molécula de ácido nucleico inhibidora en un liposoma, un polímero, una microesfera, una nanopartícula, un vector de terapia génica o un vector de ADN desnudo.

En aspectos adicionales, esta divulgación presenta métodos para tratar a un sujeto, por ejemplo un paciente humano, que tiene un neoplasma en el que las células cancerosas de neoplasma expresan Hsp47. En determinadas realizaciones, los métodos pueden incluir administrar al sujeto una cantidad eficaz de moléculas de ácido nucleico inhibidoras, en los que las moléculas de ácido nucleico inhibidoras son moléculas de ácido nucleico antisentido o moléculas de iARN o una combinación de las mismas, que inhiben la expresión de un polipéptido de Hsp47 o que inhiben la expresión tanto de un polipéptido de Hsp47 como de un polipéptido de p21.

En realizaciones particulares, una célula del neoplasma sobreexpresa Hsp47.

En determinadas realizaciones, el neoplasma puede ser un tumor maligno o cáncer de pulmón o cáncer pancreático.

Realizaciones de esta invención pueden proporcionar composiciones farmacéuticas para tratar cáncer de pulmón o cáncer pancreático, comprendiendo la composición nanopartículas que encapsulan moléculas de iARN en las que las moléculas de iARN están dirigidas a Hsp47. En algunas realizaciones, esta divulgación incluye métodos para distribuir un agente activo a un sujeto para tratar tumor maligno, comprendiendo el método administrar al sujeto la composición farmacéutica anterior.

En realizaciones adicionales, esta divulgación incluye composiciones farmacéuticas para tratar tumor maligno, comprendiendo la composición nanopartículas que encapsulan moléculas de iARN, en las que una porción de las moléculas de iARN están dirigidas a Hsp47 y una porción de las moléculas de iARN están dirigidas a p21.

Esta invención contempla además composiciones para su uso en métodos para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas de un cáncer de pulmón o cáncer pancreático en un mamífero que lo necesita, comprendiendo el método administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición que comprende moléculas de iARN activas en la reducción de la expresión de Hsp47.

En aspectos adicionales, esta divulgación incluye métodos para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas de un tumor maligno en un mamífero que lo necesita, comprendiendo el método administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende moléculas de iARN, en los que una porción de las moléculas de iARN son activas en la reducción de la expresión de Hsp47 y una porción de las moléculas de iARN son activas en la reducción de la expresión de p21.

En determinados aspectos, esta divulgación incluye métodos para reducir la tasa de crecimiento o proliferación de células madre cancerosas en un mamífero que lo necesita, comprendiendo el método administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende moléculas de iARN, en los que una porción de las moléculas de iARN son activas en la reducción de la expresión de Hsp47 y una porción de las moléculas de iARN son activas en la reducción de la expresión de p21.

Realizaciones adicionales de esta divulgación pueden proporcionar composiciones para su uso en la distribución de un agente activo para tratar un tumor maligno en un sujeto, en las que la composición comprende nanopartículas de liposoma. Las composiciones pueden usarse en métodos para distribuir un agente activo a un órgano de un sujeto para tratar tumor maligno.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: la figura 1 muestra los resultados de un estudio in vivo de un modelo de cáncer pancreático que se realizó para someter a prueba la inhibición del crecimiento tumoral usando Hsp47 como diana única. Tal como se muestra en la figura 1, para el grupo tratado con una formulación que contenía ARNip de Hsp47 (2M), los tumores crecieron lentamente, si es que crecieron en absoluto, durante el transcurso del estudio. No se examinó ninguna pérdida de peso corporal. Por el contrario, los tumores del grupo de control de vehículo se duplicaron en tan sólo 22 días. En conclusión, se observó que el ARNip de Hsp47 suprimía completamente el crecimiento tumoral a dosificaciones de 0,75 mpk, mostrando que la formulación que contiene el ARNip de Hsp47 era un potente producto terapéutico anticanceroso.

Figura 2: la figura 2 muestra la expresiones génicas de Hsp47, colágeno I y colágeno IV en líneas celulares de cáncer humanas.

Figura 3: la figura 3 muestra una muestra sin tratar para un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 4: la figura 4 muestra el efecto de un ARNip negativo a 10 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 5: la figura 5 muestra el efecto de un ARNip negativo a 50 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 6: la figura 6 muestra el efecto de un ARNip negativo a 100 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 7: la figura 7 muestra el efecto de un ARNip activo a 10 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 8: la figura 8 muestra el efecto de un ARNip activo a 50 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 9: la figura 9 muestra el efecto de un ARNip activo a 100 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 10: la figura 10 muestra los resultados de un ensayo de crecimiento en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47. El eje vertical es el número de células x 104 Los círculos negros son la muestra sin tratar. Las marcas X son el ARNip negativo. Las marcas de triángulos representan la muestra tratada con un ARNip activo dirigido a Hsp47.

Figura 11: la figura 11 muestra los resultados de un ensayo de exclusión de colorante en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47. El eje vertical es el porcentaje de células muertas. Los círculos blancos son la muestra tratada con un ARNip activo dirigido a Hsp47. Las marcas X son el ARNip negativo. Las marcas de círculos negros representan la muestra sin tratar.

Figura 12: la figura 12 muestra una muestra sin tratar en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon HCT116 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 13: la figura 13 muestra el efecto de un ARNip negativo a 10 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon HCT116 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 14: la figura 14 muestra el efecto de un ARNip activo a 10 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon HCT116 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 15: la figura 15 muestra los resultados de un ensayo de crecimiento en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon HCT116 con un ARNip dirigido a Hsp47. El eje vertical es el número de células x 104 Los círculos negros son la muestra sin tratar. Las marcas de círculos blancos en la curva ascendente son el ARNip negativo. Las marcas de círculos blancos en la curva plana representan la muestra tratada con un ARNip activo dirigido a Hsp47.

Figura 16: la figura 16 muestra los resultados de un ensayo de exclusión de colorante en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon HCT116 con un ARNip dirigido a Hsp47. El eje vertical es el porcentaje de células muertas. Los círculos blancos en la curva ascendente son la muestra tratada con un ARNip activo dirigido a Hsp47. Las marcas de círculos blancos en la curva plana son el ARNip negativo. Las marcas de círculos negros representan la muestra sin tratar.

Figura 17: la figura 17 muestra una muestra sin tratar en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 18: la figura 18 muestra el efecto de un ARNip negativo a 10 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 19: la figura 19 muestra el efecto de un ARNip negativo a 50 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 20: la figura 20 muestra el efecto de un ARNip negativo a 100 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 21: la figura 21 muestra el efecto de un ARNip activo a 10 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 22: la figura 22 muestra el efecto de un ARNip activo a 50 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 23: la figura 23 muestra el efecto de un ARNip activo a 100 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 24: la figura 24 muestra los resultados de un ensayo de crecimiento en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47. El eje vertical es el número de células x 104. Los círculos negros son la muestra sin tratar. Las marcas de círculos blancos son el ARNip negativo. Las marcas de triángulos representan la muestra tratada con un ARNip activo dirigido a Hsp47.

Figura 25: la figura 25 muestra los resultados de un ensayo de exclusión de colorante en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47. El eje vertical es el porcentaje de células muertas. Los círculos blancos son la muestra tratada con un ARNip activo dirigido a Hsp47. Las marcas X son el ARNip negativo. Las marcas de círculos negros representan la muestra sin tratar.

Figura 26: la figura 26 muestra una muestra sin tratar en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 27: la figura 27 muestra el efecto de un ARNip negativo a 10 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 28: la figura 28 muestra el efecto de un ARNip negativo a 50 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 29: la figura 29 muestra el efecto de un ARNip negativo a 100 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 30: la figura 30 muestra el efecto de un ARNip activo a 10 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 31: la figura 31 muestra el efecto de un ARNip activo a 50 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 32: la figura 32 muestra el efecto de un ARNip activo a 100 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47.

Figura 33: la figura 33 muestra los resultados de un ensayo de crecimiento en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47. El eje vertical es el número de células x 104 Los círculos negros son la muestra sin tratar. Las marcas de círculos blancos son el ARNip negativo. Las marcas X representan la muestra tratada con un ARNip activo dirigido a Hsp47.

Figura 34: la figura 34 muestra los resultados de un ensayo de exclusión de colorante en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47. El eje vertical es el porcentaje de células muertas. Los círculos blancos son la muestra tratada con un ARNip activo dirigido a Hsp47. Las marcas X son el ARNip negativo. Las marcas de cuadrados blancos representan la muestra sin tratar.

Figura 35: la figura 35 muestra los resultados de un método para detectar anexina V y PI en células de cáncer de colon SW480 transfectadas con un ARNip activo de Hsp47 en el día 2 tras la transfección del ARNip.

Figura 36: la figura 36 muestra los resultados de un método para detectar anexina V y PI en células de cáncer de colon HCT116 transfectadas con un ARNip activo de Hsp47 en el día 2 tras la transfección del ARNip.

Figura 37: la figura 37 muestra los resultados de un método para detectar la expresión de procaspasa 3 y proteína de Hsp47 en células de cáncer de colon SW480 transfectadas con un ARNip activo de Hsp47.

Figura 38: la figura 38 muestra los resultados de un método para detectar la expresión de procaspasa 3 y proteína de Hsp47 en células de cáncer hepático HepG2 transfectadas con un ARNip activo de Hsp47.

Figura 39: la figura 39 muestra los resultados de un método para detectar la expresión de procaspasa 3 y proteína de Hsp47 en células de cáncer de pulmón A549 transfectadas con un ARNip activo de Hsp47.

Figura 40: la figura 40 muestra los resultados de un método para detectar actividad caspasa 3/7 en células de cáncer de colon SW480 transfectadas con un ARNip de Hsp47 y un ARNip de p21. Estos datos muestran que el uso de una combinación de un ARNip de Hsp47 y un ARNip de p21 en células de cáncer de colon proporcionó aumentos inesperadamente ventajosos en los niveles de caspasas y que las células tienen una apoptosis sorprendentemente aumentada.

Descripción detallada de la invención

Esta invención proporciona métodos para usar composiciones terapéuticas que disminuyen la expresión de una molécula de ácido nucleico o polipéptido de Hsp47 para el tratamiento de una neoplasia en un sujeto. En determinadas realizaciones, esta invención proporciona métodos para usar composiciones terapéuticas que disminuyen la expresión de una molécula de ácido nucleico o polipéptido de Hsp47 y una molécula de ácido nucleico o polipéptido de p21 para el tratamiento de una neoplasia en un sujeto.

En aspectos adicionales, realizaciones de esta invención pueden proporcionar métodos y composiciones para reducir la tasa de crecimiento o proliferación de células madre cancerosas. Esta invención se refiere al efecto sorprendente de que el crecimiento o la proliferación de células madre cancerosas puede inhibirse in vivo mediante tratamiento con inhibidores de ARNip de Hsp47, e inhibidores de Hsp47 en combinación con inhibidores de p21.

Las composiciones terapéuticas de esta invención pueden incluir moléculas de ácido nucleico inhibidoras, incluyendo moléculas de iARN tales como ARNip, ARNhc y a Rn antisentido.

Esta invención abarca moléculas de iARN para suprimir ADN que codifica para Hsp47, ribozimas, ácidos nucleicos antisentido, polinucleótidos quiméricos de ADN/ARN y vectores para expresarlos y variantes negativas dominantes de Hsp47.

En general, después de diagnosticarse que un sujeto tiene una neoplasia, por ejemplo, un cáncer de pulmón o un cáncer pancreático, se selecciona un método de tratamiento que implica la supresión de Hsp47 o la supresión de Hsp47 y p21.

Los ejemplos de un agente que suprime Hsp47 tal como se usa en el presente documento incluyen un fármaco que suprime la producción y/o actividad de Hsp47 y un fármaco que fomenta la degradación y/o inactivación de Hsp47. Los ejemplos del fármaco que suprime la producción de Hsp47 incluyen una molécula de iARN, una ribozima, un ácido nucleico antisentido, un polinucleótido quimérico de ADN/ARN para ADN que codifica para Hsp47 o un vector que expresa los mismos.

Los ejemplos de un agente que suprime p21 tal como se usa en el presente documento incluyen un fármaco que suprime la producción y/o actividad de p21 y un fármaco que fomenta la degradación y/o inactivación de p21. Los ejemplos del fármaco que suprime la producción de p21 incluyen una molécula de iARN, una ribozima, un ácido nucleico antisentido, un polinucleótido quimérico de ADN/ARN para ADN que codifica para p21 o un vector que expresa los mismos.

Moléculas de iARN

Un experto habitual en la técnica entenderá que una secuencia notificada puede cambiar a lo largo del tiempo e incorporar cualquier cambio necesario en las moléculas de ácido nucleico en el presente documento en consecuencia.

Realizaciones de esta invención pueden proporcionar composiciones y métodos para el silenciamiento génico de la expresión de Hsp47 usando pequeñas moléculas de ácido nucleico. Realizaciones adicionales de esta invención pueden proporcionar composiciones y métodos para el silenciamiento génico de la expresión de Hsp47 y la expresión de p21 usando pequeñas moléculas de ácido nucleico.

Las moléculas de iARN de esta invención pueden ser activas para el silenciamiento génico, por ejemplo, un ARNbc que es activo para el silenciamiento génico, un ARNip, un microARN o un ARNhc activos para el silenciamiento génico, así como un ARN dirigido a ADN (ARNdA), un ARN de interacción con Piwi (ARNiP) y un ARNip asociado con repetición (ARNipar). Tales moléculas son capaces de mediar en la interferencia de ARN.

La composición y los métodos divulgados en el presente documento también pueden usarse en el tratamiento de diversas clases de tumores malignos en un sujeto.

Las moléculas de ácido nucleico y los métodos de esta invención pueden combinarse o usarse en combinación para regular por disminución la expresión de genes que codifican para Hsp47 y para regular por disminución la expresión de genes que codifican para Hsp47 y p21 en concierto.

Las composiciones y los métodos de esta invención pueden incluir moléculas de ácido nucleico, que pueden modular o regular la expresión de proteínas de Hsp47 y/o genes que codifican para las proteínas, o que pueden modular o regular la expresión de proteínas de Hsp47 y/o genes que codifican para las proteínas en combinación con proteínas de p21 y/o genes que codifican para las proteínas, así como proteínas y/o genes que codifican para las proteínas que están asociadas con el mantenimiento y/o desarrollo de enfermedades, así como estados o trastornos asociados con Hsp47, tales como tumor maligno.

Las composiciones y los métodos de esta invención se describen con referencia a secuencias a modo de ejemplo de Hsp47 y p21. Un experto habitual en la técnica entenderá que diversos aspectos y realizaciones de la invención se refieren a cualquier gen, secuencia o variante de Hsp47 o p21 relacionado, tal como genes homólogos y variantes de transcriptos, y polimorfismos, incluyendo polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) asociado con cualquiera de los genes de Hsp47 o p21.

Una molécula de iARN de esta invención puede dirigirse a Hsp47 o p21, y cualquier secuencia homóloga, por ejemplo, usando secuencias complementarias o incorporando pares de bases no canónicos, por ejemplo, apareamientos erróneos y/o pares de bases oscilantes, que pueden proporcionar secuencias diana adicionales.

En casos en los que se identifican apareamientos erróneos, pueden usarse pares de bases no canónicos, por ejemplo, apareamientos erróneos y/o bases oscilantes, para generar moléculas de ácido nucleico que seleccionan como diana más de una secuencia génica.

Por ejemplo, pueden usarse pares de bases no canónicos tales como pares de bases UU y CC para generar moléculas de ácido nucleico que son capaces de seleccionar como diana secuencias para diferentes dianas que comparten homología de secuencia. Por tanto, una molécula de iARN puede dirigirse a una secuencia de nucleótidos que está conservada entre genes homólogos y puede usarse una única molécula de iARN para inhibir la expresión de más de un gen.

En algunos aspectos, las composiciones y los métodos de esta invención incluyen moléculas de iARN que son activas contra cualquier porción de ARNm de Hsp47. La molécula de iARN puede incluir una secuencia complementaria a cualquier ARNm que codifica para una secuencia de Hsp47.

En aspectos adicionales, las composiciones y los métodos de esta invención incluyen moléculas de iARN que son activas contra cualquier porción de ARNm de p21. La molécula de iARN puede incluir una secuencia complementaria a cualquier ARNm que codifica para una secuencia de p21.

En algunas realizaciones, una molécula de iARN de esta divulgación puede tener actividad contra ARN de Hsp47, en la que la molécula de iARN incluye una secuencia complementaria a un ARN que tiene una secuencia que codifica para Hsp47 variante, por ejemplo, un gen de Hsp47 mutante que se sabe en la técnica que está asociado con tumor maligno.

En realizaciones adicionales, una molécula de iARN de esta invención puede incluir una secuencia de nucleótidos que puede mediar en el silenciamiento de la expresión génica de Hsp47 o p21.

Tal como se usa en el presente documento, la molécula de iARN designa cualquier molécula que provoca interferencia de ARN, incluyendo un ARN dúplex tal como ARNip (ARN de interferencia pequeño), miARN (microARN), ARNhc (ARN de horquilla corto), ARNdA (ARN dirigido a ADN), ARNiP (ARN de interacción con Piwi) o ARNipar (ARNip asociado con repetición) y formas modificadas de los mismos. Estas moléculas de iARN pueden estar comercialmente disponibles o pueden diseñarse y prepararse basándose en información de secuencia conocida, etc. El ácido nucleico antisentido incluye ARN, ADN, ANP o un complejo de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, el polinucleótido quimérico de ADN/ARN incluye un polinucleótido bicatenario compuesto por ADN y ARN que inhibe la expresión de un gen diana.

En una realización, los agentes de esta invención contienen ARNip como agente terapéutico. Una molécula de ARNip puede tener una longitud de desde aproximadamente 10-50 o más nucleótidos. Una molécula de ARNip puede tener una longitud de desde aproximadamente 15-45 nucleótidos. Una molécula de ARNip puede tener una longitud de desde aproximadamente 19-40 nucleótidos. Una molécula de ARNip puede tener una longitud de desde 19-23 nucleótidos. Una molécula de ARNip de esta invención puede mediar en iARN contra un ARNm diana. Herramientas y kits de diseño comercialmente disponibles, tales como los disponibles de Ambion, Inc. (Austin, TX) y el Whitehead Institute of Biomedical Research en MIT (Cambridge, MA), permiten el diseño y la producción de ARNip.

Métodos para tratar tumor maligno

Realizaciones de esta invención pueden proporcionar moléculas de iARN que pueden usarse para regular por disminución o inhibir la expresión de Hsp47 y/o proteínas de Hsp47, así como para regular por disminución o inhibir la expresión de p21 y/o proteínas de p21.

En algunas realizaciones, puede usarse una molécula de iARN de esta invención para regular por disminución o inhibir la expresión de Hsp47 y/o proteínas de Hsp47 que surgen de polimorfismos de haplotipo de Hsp47 que pueden estar asociados con una enfermedad o estado tal como tumor maligno.

Puede usarse la monitorización de niveles de proteína o ARNm de Hsp47 y/o niveles de proteína o ARNm de p21, para caracterizar el silenciamiento génico y para determinar la eficacia de compuestos y composiciones de esta invención y divulgación.

Las moléculas de iARN de esta divulgación pueden usarse de manera individual o en combinación con otros ARNip para modular la expresión de uno o más genes.

Las moléculas de iARN de esta divulgación pueden usarse de manera individual o en combinación o junto con otros fármacos conocidos para prevenir o tratar enfermedades o mejorar síntomas de estados o trastornos asociados con Hsp47, incluyendo tumor maligno.

Las moléculas de iARN de esta divulgación pueden usarse para modular o inhibir la expresión de Hsp47 o p21 de una manera específica de secuencia.

Las moléculas de iARN de esta divulgación pueden incluir una cadena guía para la que una serie de nucleótidos contiguos son al menos parcialmente complementarios a un ARNm de Hsp47 o un ARNm de p21.

En determinados aspectos, el tumor maligno puede tratarse mediante interferencia de ARN usando una o más molécula de iARN de esta divulgación.

El tratamiento de tumor maligno puede caracterizarse en modelos basados en células adecuados, así como en modelos de animales ex vivo o in vivo.

El tratamiento de tumor maligno puede caracterizarse determinando el nivel de ARNm de Hsp47 o el nivel de proteína de Hsp47 en células de tejido afectado y/o determinando el nivel de ARNm de p21 o el nivel de proteína de p21 en células de tejido afectado.

El tratamiento de tumor maligno puede caracterizarse mediante exploración médica no invasiva de un órgano o tejido afectado.

Realizaciones de esta divulgación pueden incluir métodos para prevenir, tratar o mejorar los síntomas de una enfermedad o estado asociado con Hsp47 en un sujeto que lo necesita.

En determinadas realizaciones, una combinación de un ARNip de Hsp47 y un ARNip de p21 puede proporcionar aumentos inesperadamente ventajosos en la muerte de células cancerosas. En realizaciones adicionales, una combinación de un ARNip de Hsp47 y un ARNip de p21 puede proporcionar disminuciones inesperadamente ventajosas en la proliferación de células cancerosas.

En algunas realizaciones, los métodos para prevenir, tratar o mejorar los síntomas de tumor maligno en un sujeto pueden incluir administrar al sujeto una molécula de iARN de esta divulgación para modular la expresión de un gen de Hsp47 y/o un gen de p21 en el sujeto u organismo.

En algunas realizaciones, esta divulgación contempla métodos para regular por disminución la expresión de un gen de Hsp47 en una célula u organismo, poniendo en contacto la célula o el organismo con una molécula de iARN de esta invención. En determinadas realizaciones, esta divulgación contempla métodos para regular por disminución la expresión de un gen de Hsp47 y un gen de p21 en una célula u organismo, poniendo en contacto la célula u organismo con dos o más moléculas de iARN de esta invención.

Las moléculas de ácido nucleico inhibidoras pueden ser oligómeros de nucleótidos que pueden emplearse como molécula de ácido nucleico monocatenario o bicatenario para disminuir la expresión génica. En un enfoque, la molécula de ácido nucleico inhibidora es un ARN bicatenario usado para silenciamiento mediado por interferencia de ARN (iARN) de la expresión génica. En una realización, se produce una molécula de ARN bicatenario (ARNbc) que incluye desde ocho hasta veinticinco (por ejemplo, 8, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25) nucleótidos consecutivos de un oligómero de nucleótidos de la invención. El ARNbc puede ser dos cadenas complementarias de ARN que han producido un dúplex, o una única cadena de ARN que ha producido un autodúplex (ARN(hc) de horquilla pequeña).

En algunas realizaciones, los ARNbc tienen aproximadamente 21 ó 22 pares de bases, pero pueden ser más cortos o más largos, de hasta aproximadamente 29 nucleótidos. Puede prepararse ARN bicatenario usando técnicas convencionales, por ejemplo, síntesis química o transcripción in vitro. Hay kits disponibles, por ejemplo, de Ambion (Austin, Tex.) y Epicentre (Madison, Wis.).

Se describen métodos para expresar ARNbc en células de mamífero en Brummelkamp et al. Science 296:550-553, 2002; Paddison et al. Genes & Devel. 16:948-958, 2002; Paul et al. Nature Biotechnol. 20:505-508, 2002; Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-5520, 2002; Yu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047-6052, 2002; Miyagishi et al., Nature Biotechnol. 20:497-500, 2002; y Lee et al., Nature Biotechnol. 20:500-5052002.

Una molécula de ácido nucleico inhibidora que “corresponde” a un gen de Hsp47 comprende al menos un fragmento del gen bicatenario, de tal manera que cada cadena de la molécula de ácido nucleico inhibidora bicatenaria es capaz de unirse a la cadena complementaria del gen de Hsp47 diana. La molécula de ácido nucleico inhibidora no necesita tener una correspondencia perfecta con la secuencia de Hsp47 de referencia.

En una realización, un ARNip tiene al menos aproximadamente el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o incluso el 99% de identidad de secuencia con el ácido nucleico diana. Por ejemplo, se considera que un dúplex de 19 pares de bases que tiene 1-2 apareamientos erróneos de pares de bases es útil en los métodos en los que se usan las composiciones de la invención. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico inhibidora muestra 1, 2, 3, 4, 5 o más apareamientos erróneos.

Las moléculas de ácido nucleico inhibidoras proporcionadas por la divulgación no se limitan a ARNip, sino que incluyen cualquier molécula de ácido nucleico suficiente para disminuir la expresión de una molécula de ácido nucleico o polipéptido de Hsp47 o p21. Las secuencias de ADN proporcionadas en el presente documento pueden usarse, por ejemplo, en el descubrimiento y desarrollo de moléculas de ácido nucleico antisentido terapéuticas para disminuir la expresión de la proteína codificada. La divulgación proporciona además ribozimas o moléculas de ARN catalíticas. Tales moléculas de ARN catalíticas pueden usarse para inhibir la expresión de una molécula de ácido nucleico diana in vivo. La inclusión de secuencias de ribozima dentro de un ARN antisentido confiere actividad de escisión de ARN a la molécula, aumentando de ese modo la actividad de los constructos. El diseño y uso de ribozimas específicas de ARN diana se describe en Haseloff et al., Nature 334:585-591, 1988 y el documento US 2003/0003469 A1.

En diversas realizaciones de esta divulgación, la molécula de ácido nucleico catalítica está formada en un motivo de cabeza de martillo o de horquilla. Se describen ejemplos de tales motivos de cabeza de martillo por Rossi et al., Aids Research and Human Retroviruses, 8:183, 1992. Se describen ejemplos de motivos de horquilla por Hampel et al., Biochemistry, 28:4929, 1989, y Hampel et al., Nucleic Acids Research, 18: 299, 1990. Los expertos en la técnica reconocerán que lo que se necesita en una molécula de ácido nucleico enzimática es un sitio de unión a sustrato específico que sea complementario a una o más de las regiones de ARN de gen diana y que tenga secuencias de nucleótidos dentro de, o que rodean a, ese sitio de unión a sustrato que confieren una actividad de escisión de ARN a la molécula.

La supresión de una diana puede determinarse mediante la supresión de la expresión o actividad de la proteína correspondiente en células, en comparación con células en las que no se usa el agente de supresión. La expresión de la proteína puede evaluarse mediante cualquier técnica conocida; los ejemplos de las mismas incluyen un método de inmunoprecipitación usando un anticuerpo, EIA, ELISA, IRA, IRMA, un método de inmunotransferencia de tipo Western, un método inmunohistoquímico, un método inmunocitoquímico, un método de citometría de flujo, diversos métodos de hibridación usando un ácido nucleico que se hibrida específicamente con un ácido nucleico que codifica para la proteína o un fragmento único de la misma, o un producto de transcripción (por ejemplo, ARNm) o producto de corte y empalme de dicho ácido nucleico, un método de transferencia de tipo Northern, un método de transferencia de tipo Southern y diversos métodos de PCR.

La actividad de la proteína puede evaluarse analizando una actividad conocida de la proteína incluyendo la unión a una proteína tal como, por ejemplo, Raf-1 (en particular, Raf-1 fosforilada) o EGFR (en particular, EGFR fosforilado) por medio de cualquier método conocido tal como, por ejemplo, un método de inmunoprecipitación, un método de inmunotransferencia de tipo Western, un método de análisis de masas, un método de precipitación o un método de resonancia de plasmón superficial (SPR).

En un aspecto, la divulgación presenta un vector que codifica para una molécula de ácido nucleico inhibidora de cualquiera de los aspectos anteriores. En una realización particular, el vector es un vector retroviral, adenoviral, de virus adenoasociado o lentiviral. En otra realización, el vector contiene un promotor adecuado para la expresión en una célula de mamífero.

La cantidad de componente que induce interferencia de ARN activo formulado en la composición de la presente invención puede ser una cantidad que no provoca un efecto adverso que supera el beneficio de la administración. Una cantidad de este tipo puede determinarse mediante una prueba in vitro usando células cultivadas o una prueba en un animal o mamífero de modelo tal como un ratón, una rata, un perro o un cerdo, etc., y tales métodos de prueba los conocen los expertos en la técnica.

La cantidad de principio activo formulada puede variar según la manera en la que se administra el agente o la composición. Por ejemplo, cuando se usa una pluralidad de unidades de la composición para una administración, la cantidad de principio activo que va a formularse en una unidad de la composición puede determinarse dividiendo la cantidad de principio activo necesaria para una administración entre dicha pluralidad de unidades.

Esta divulgación también se refiere a un procedimiento para producir un agente o una composición para suprimir Hsp47 o p21 y al uso de una composición que suprime Hsp47, o que suprime Hsp47 y p21, para reducir o contraer tumores malignos.

Interferencia de ARN

La interferencia de ARN (iARN) se refiere al silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia en animales mediado por ARN de interferencia pequeños (ARNip). Véase, por ejemplo, Zamore et al., Cell, 2000, vol.

101, págs. 25-33; Fire et al., Nature, 1998, vol. 391, págs. 806811; Sharp, Genes & Development, 1999, vol. 13, págs.

139-141.

Una respuesta de iARN en células puede activarse mediante un ARN bicatenario (ARNbc), aunque aún no se entiende totalmente el mecanismo. Determinados ARNbc en células pueden experimentar la acción de enzima Dicer, una enzima ribonucleasa III. Véase, por ejemplo, Zamore et al., Cell, 2000, vol. 101, págs. 25-33; Hammond et al., Nature, 2000, vol. 404, págs. 293-296. Dicer puede procesar el ARNbc para dar fragmentos más cortos de ARNbc, que son ARNip.

En general, los ARNip puede tener desde aproximadamente 21 hasta aproximadamente 23 nucleótidos de longitud e incluyen una región de dúplex de pares de bases de aproximadamente 19 nucleótidos de longitud.

iARN implica un complejo de endonucleasa conocido como complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Un ARNip tiene una cadena antisentido o guía que entra en el complejo RISC y media en la escisión de una diana de ARN monocatenario que tiene una secuencia complementaria a la cadena antisentido del dúplex de ARNip. La otra cadena del ARNip es la cadena pasajera. La escisión del ARN diana tiene lugar en el centro de la región complementaria a la cadena antisentido del dúplex de ARNip. Véase, por ejemplo, Elbashir et al., Genes & Development, 2001, vol. 15, págs. 188-200.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cadena sentido” se refiere a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNip que es parcial o totalmente complementaria a al menos una porción de una cadena antisentido correspondiente de la molécula de ARNip. La cadena sentido de una molécula de ARNip puede incluir una secuencia de ácido nucleico que tiene homología con una secuencia de ácido nucleico diana.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cadena antisentido” se refiere a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNip que es parcial o totalmente complementaria a al menos una porción de una secuencia de ácido nucleico diana. La cadena antisentido de una molécula de ARNip puede incluir una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a al menos una porción de una cadena sentido correspondiente de la molécula de ARNip.

Las moléculas de iARN pueden regular por disminución o silenciar la expresión génica mediando en la interferencia de ARN de una manera específica de secuencia. Véase, por ejemplo, Zamore et al., Cell, 2000, vol. 101, págs. 25-33; Elbashir et al., Nature, 2001, vol. 411, págs. 494-498; Kreutzer et al., documento WO2000/044895; Zernicka-Goetz et al., documento WO2001/36646; Fire et al., documento WO1999/032619; Plaetinck et al., documento WO2000/01846; Mello et al., documento WO2001/029058.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “ inhibir”, “regular por disminución” o “reducir” con respecto a la expresión génica significan que la expresión del gen, o el nivel de moléculas de ARNm que codifican para una o más proteínas, o la actividad de una o más de las proteínas codificadas, se reducen por debajo de lo observado en ausencia de una molécula de iARN o ARNip de esta invención. Por ejemplo, el nivel de expresión, nivel de ARNm o nivel de actividad de proteína codificada pueden reducirse en al menos el 1% o al menos el 10% o al menos el 20% o al menos el 50% o al menos el 90% o más con respecto al observado en ausencia de una molécula de iARN o ARNip de esta invención.

También pueden usarse moléculas de iARN para silenciar la expresión de genes virales y por tanto afectar a la replicación viral.

Pueden producirse moléculas de iARN a partir de cadenas de polinucleótido independientes: una cadena sentido o cadena pasajera, y una cadena antisentido o cadena guía. Las cadenas guía y pasajera son al menos parcialmente complementarias. La cadena guía y la cadena pasajera pueden formar una región de dúplex que tiene desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 49 pares de bases.

En algunas realizaciones, la región de dúplex de un ARNip puede tener 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ó 49 pares de bases.

En determinadas realizaciones, una molécula de iARN puede ser activa en un complejo RISC, con una longitud de región de dúplex activa para RISC.

En realizaciones adicionales, una molécula de iARN puede ser activa como sustrato de Dicer, para convertirse en una molécula de iARN que puede ser activa en un complejo RISC.

En algunos aspectos, una molécula de iARN puede tener porciones de secuencia guía y pasajera complementarias en extremos opuestos de una molécula larga, de modo que la molécula puede formar una región de dúplex con las porciones de secuencia complementarias, y las cadenas están unidas en un extremo de la región de dúplex mediante ligadores o bien nucleotídicos o bien no nucleotídicos. Por ejemplo, una disposición de horquilla, o una disposición de tallo y bucle. Las interacciones de ligadores con las cadenas pueden ser enlaces covalentes o interacciones no covalentes.

Una molécula de iARN de esta divulgación puede incluir un ligador nucleotídico, no nucleotídico o nucleotídico/no nucleotídico mixto que une la región sentido del ácido nucleico a la región antisentido del ácido nucleico. Un ligador nucleotídico puede ser un ligador de S2 nucleótidos de longitud, por ejemplo de aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 nucleótidos de longitud. El ligador nucleotídico puede ser un aptámero de ácido nucleico. Por “aptámero” o “aptámero de ácido nucleico” tal como se usa en el presente documento se hace referencia a una molécula de ácido nucleico que se une específicamente a una molécula diana en la que la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia que incluye una secuencia reconocida por la molécula diana en su entorno natural. Alternativamente, un aptámero puede ser una molécula de ácido nucleico que se une a una molécula diana, en la que la molécula diana no se une de manera natural a un ácido nucleico. Por ejemplo, el aptámero puede usarse para unirse a un dominio de unión a ligando de una proteína, impidiendo de ese modo la interacción del ligando que se produce de manera natural con la proteína. Véase, por ejemplo, Gold et al., Annu Rev Biochem, 1995, vol. 64, págs. 763-797; Brody et al., J. Biotechnol., 2000, vol. 74, págs. 5-13; Hermann et al., Science, 2000, vol. 287, págs. 820-825.

Los ejemplos de un ligador no nucleotídico incluyen un nucleótido abásico, poliéter, poliamina, poliamida, péptido, hidrato de carbono, lípido, poli(hidrato de carbono) u otros compuestos poliméricos, por ejemplo polietilenglicoles tales como los que tienen desde 2 hasta 100 unidades de etilenglicol. Se describen algunos ejemplos en Seela et al., Nucleic Acids Research, 1987, vol. 15, págs. 3113-3129; Cload et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, vol. 113, págs. 6324-6326; Jaeschke et al., Tetrahedron Lett., 1993, vol. 34, págs. 301; Arnold et al., documento WO1989/002439; Usman et al., documento WO1995/006731; Dudycz et al., documento WO1995/011910, y Ferentz et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, vol. 113, págs. 4000-4002.

Una molécula de iARN puede tener una o más proyecciones a partir de la región de dúplex. Las proyecciones, que son regiones monocatenarias sin apareamiento de bases, pueden tener de uno a ocho nucleótidos de longitud, o ser más largas. Una proyección puede ser una proyección en el extremo 3', en la que el extremo 3' de una cadena tiene una región monocatenaria de desde uno hasta ocho nucleótidos. Una proyección puede ser una proyección en el extremo 5', en la que el extremo 5' de una cadena tiene una región monocatenaria de desde uno hasta ocho nucleótidos.

Las proyecciones de una molécula de iARN pueden tener la misma longitud o pueden ser de longitudes diferentes. Una molécula de iARN puede tener uno o más extremos romos, en los que la región de dúplex termina sin proyección y las cadenas tienen apareamiento de bases con el extremo de la región de dúplex.

Una molécula de iARN de esta divulgación puede tener uno o más extremos romos o puede tener una o más proyecciones o puede tener una combinación de un extremo romo y un extremo con proyección.

Un extremo 5' de una cadena de una molécula de iARN puede estar en un extremo romo o puede estar en una proyección. Un extremo 3' de una cadena de una molécula de iARN puede estar en un extremo romo o puede estar en una proyección.

Un extremo 5' de una cadena de una molécula de iARN puede estar en un extremo romo, mientras que el extremo 3' está en una proyección. Un extremo 3' de una cadena de una molécula de iARN puede estar en un extremo romo, mientras que el extremo 5' está en una proyección.

En algunas realizaciones, ambos extremos de una molécula de iARN son extremos romos.

En realizaciones adicionales, ambos extremos de una molécula de iARN tienen una proyección.

Las proyecciones en los extremos 5' y 3' pueden ser de longitudes diferentes.

En determinadas realizaciones, una molécula de iARN puede tener un extremo romo en el que el extremo 5' de la cadena antisentido y el extremo 3' de la cadena sentido no tienen ningún nucleótido en proyección.

En realizaciones adicionales, una molécula de iARN puede tener un extremo romo en el que el extremo 3' de la cadena antisentido y el extremo 5' de la cadena sentido no tienen ningún nucleótido en proyección.

Una molécula de iARN puede tener apareamientos erróneos en el apareamiento de bases en la región de dúplex. Cualquier nucleótido en una proyección de una molécula de iARN puede ser un desoxirribonucleótido o un ribonucleótido.

Uno o más desoxirribonucleótidos pueden estar en el extremo 5', en el que el extremo 3' de la otra cadena de la molécula de iARN puede no tener una proyección o puede no tener una proyección de desoxirribonucleótidos.

Uno o más desoxirribonucleótidos pueden estar en el extremo 3', en el que el extremo 5' de la otra cadena de la molécula de iARN puede no tener una proyección o puede no tener una proyección de desoxirribonucleótidos.

En algunas realizaciones, uno o más o la totalidad de los nucleótidos de proyección de una molécula de iARN pueden ser 2'-desoxirribonucleótidos.

Moléculas de iARN de sustrato de Dicer

En algunos aspectos, una molécula de iARN puede tener una longitud adecuada como sustrato de Dicer, que puede procesarse para producir una molécula de iARN activa para RISC. Véase, por ejemplo, Rossi et al., documento US2005/0244858.

Un ARNbc de sustrato de Dicer puede tener una longitud suficiente de tal manera que se procesa mediante Dicer para producir una molécula de iARN activa y puede incluir además una o más de las siguientes propiedades: (i) el ARNbc de sustrato de Dicer puede ser asimétrico, por ejemplo, teniendo una proyección en 3' en la cadena antisentido, y (ii) el ARNbc de sustrato de Dicer puede tener un extremo 3' modificado en la cadena sentido para dirigir la orientación de unión a Dicer y el procesamiento del ARNbc para dar una molécula de iARN activa.

Moléculas de iARN para p21

En la tabla 1 se muestran ejemplos de moléculas de iARN de esta divulgación dirigidas a ARNm de p21.

Tabla 1: secuencias de moléculas de iARN para p21

Leyenda para la tabla 1: las mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U respectivamente. Las letras en minúsculas a, g, c, t representan 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y timidina respectivamente. mU es 2'-metoxi-U.

En la tabla 2 se muestran ejemplos de moléculas de iARN de esta divulgación dirigidas a ARNm de p21.

Tabla 2: secuencias de moléculas de iARN para p21

Leyenda para la tabla 2: las mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras en minúscula a, u, g, c, t se refieren a 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-U, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y desoxitimidina (dT = T = t) respectivamente. El subrayado se refiere a sustitución con 2'-OMe, por ejemplo, U. N es A, C, G, U, U, a, c, g, u, t o un nucleótido modificado, invertido o químicamente modificado.

Tal como se usa en el presente documento, la molécula de iARN designa cualquier molécula que provoca interferencia de ARN, incluyendo un ARN de dúplex tal como ARNip (ARN de interferencia pequeño), miARN (microARN), ARNhc (ARN de horquilla corto), ARNdA (ARN dirigido a a Dn ), ARNiP (ARN de interacción con Piwi) o ARNipar (ARNip asociado con repetición) y formas modificadas de los mismos. Estas moléculas de iARN pueden estar comercialmente disponibles o pueden diseñarse y prepararse basándose en información de secuencia conocida, etc. El ácido nucleico antisentido incluye ARN, ADN, ANP o un complejo de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, el polinucleótido quimérico de ADN/ARN incluye un polinucleótido bicatenario compuesto por ADN y ARN que inhibe la expresión de un gen diana.

En una realización, las composiciones de esta invención, para su uso tal como se define en las reivindicaciones, contienen ARNip como agente terapéutico. Una molécula de ARNip puede tener una longitud de desde aproximadamente 10-50 o más nucleótidos. Una molécula de ARNip puede tener una longitud de desde aproximadamente 15-45 nucleótidos. Una molécula de ARNip puede tener una longitud de desde aproximadamente 19-40 nucleótidos. Una molécula de ARNip puede tener una longitud de desde 19-23 nucleótidos. Una molécula de ARNip de esta invención puede mediar en ía Rn contra un ARNm diana. Herramientas y kits de diseño comercialmente disponibles, tales como los disponibles de Ambion, Inc. (Austin, TX) y el Whitehead Institute of Biomedical Research en MIT (Cambridge, MA) permiten el diseño y la producción de ARNip.

p21 está presente en diversos animales incluyendo humanos. Se encuentra información de secuencia para CDKN1A humano (p21) en: NM_000389.4, NM_078467.2, NM_001291549.1, NM_001220778.1, NM_001220777.1 (NP_001207707.1, NP_001278478.1, NP-001207706.1, NP_510867.1, NP_000380.1).

La secuencia de ácido nucleico de un ARNm de p21 diana de ejemplo se divulga en el número de registro de GenBank NM_000389.4 (CDKN1A), que tiene 2175 nucleótidos de longitud.

Moléculas de iARN dirigidas a Hsp47

En algunas realizaciones, esta invención proporciona composiciones que comprenden una gama de moléculas de iARN y composiciones para modular la expresión de proteína de choque térmico 47 (Hsp47), una chaperona molecular específica de colágeno para transporte intracelulary maduración.

En el documento US 8.710.209 se facilitan algunos ejemplos de ARNip para Hsp47.

Se han divulgado agentes para suprimir Hsp47 para inhibir la fibrosis. Véase, por ejemplo, el documento US 8.173.170 B2. Sin embargo, existe información limitada referente al efecto de inhibir Hsp47 en el desarrollo, progresión y crecimiento de tumor maligno.

En algunas realizaciones, cada cadena de una molécula de ARNip de esta invención puede tener desde 15 hasta 60 nucleótidos de longitud o desde 15 hasta 40 nucleótidos de longitud o desde 19 hasta 25 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones, esta invención proporciona una composición farmacéutica que contiene moléculas de iARN para tratar cáncer de pulmón o cáncer pancreático que son moléculas de iARN dirigidas a Hsp47.

En la tabla 3 se muestran ejemplos de moléculas de iARN de esta divulgación dirigidas a ARNm de Hsp47.

Tabla 3: secuencias de moléculas de iARN para Hsp47

Leyenda para la tabla 3: las mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U respectivamente. La minúscula d representa “desoxi”.

En la tabla 4 se muestran ejemplos adicionales de moléculas de iARN de esta divulgación dirigidas a ARNm de Hsp47.

Tabla 4: secuencias de moléculas de iARN y control para Hsp47

Leyenda para la tabla 4: designaciones: rX representa ribonucleótidos, mX representa 2’-O-metil-ribonucleótidos, 25rX representa ribonucleótidos con uniones 2’-5’, C3 representa un espaciador de 1,3-propanodiol, idAB representa 1,2-didesoxi-D-ribosa invertida, P representa un grupo fosfato en el extremo 3’-terminal.

Métodos de uso de moléculas de iARN

Las moléculas de ácido nucleico y moléculas de iARN comprendidas en composiciones para su uso en esta invención pueden suministrarse a una célula o tejido mediante aplicación directa de las moléculas o con las moléculas combinadas con un portador o un diluyente.

Las moléculas de ácido nucleico y moléculas de iARN comprendidas en composiciones para su uso en esta invención pueden suministrarse o administrarse a una célula, tejido, órgano o sujeto mediante aplicación directa de las moléculas con un portador o diluyente, o cualquier otro vehículo de suministro que actúa para ayudar, fomentar o facilitar la entrada en una célula, por ejemplo, secuencias virales, material viral o formulaciones lipídicas o de liposomas.

Las moléculas de ácido nucleico y moléculas de iARN comprendidas en composiciones para su uso en esta invención pueden complejarse con lípidos catiónicos, acondicionarse dentro de liposomas o suministrarse de otro modo a células o tejidos diana. El ácido nucleico o los complejos de ácido nucleico pueden administrarse localmente a tejidos relevantes ex vivo o in vivo mediante aplicación dérmica directa, aplicación transdérmica o inyección.

Los sistemas de suministro pueden incluir, por ejemplo, geles acuosos y no acuosos, cremas, emulsiones, microemulsiones, liposomas, pomadas, disoluciones acuosas y no acuosas, lociones, aerosoles, bases de hidrocarburos y polvos, y pueden contener excipientes tales como solubilizantes y potenciadores de la penetración.

Una molécula de ácido nucleico inhibidora o composición comprendida en composiciones para su uso en esta invención puede administrarse dentro de un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, en forma de dosificación unitaria. Puede emplearse la práctica farmacéutica convencional para proporcionar formulaciones o composiciones adecuadas para administrar los compuestos a pacientes que padecen una enfermedad que está provocada por una proliferación celular excesiva. La administración puede comenzar antes de que el paciente presente síntomas. Puede emplearse cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, la administración puede ser parenteral, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intratumoral, intramuscular, intracraneal, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intrahepática, intracapsular, intratecal, intracisternal, intraperitoneal, intranasal, aerosol, supositorio o administración oral. Por ejemplo, las formulaciones terapéuticas pueden estar en forma de disoluciones o suspensiones líquidas; para administración oral, las formulaciones pueden estar en forma de comprimidos o cápsulas; y para formulaciones intranasales, en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles.

Las composiciones y los métodos de esta divulgación pueden incluir un vector de expresión que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para al menos una molécula de iARN de esta invención de una manera que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico.

Las moléculas de ácido nucleico y moléculas de iARN comprendidas en composiciones para su uso en esta invención pueden expresarse a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN. Los vectores recombinantes pueden ser plásmidos de ADN o vectores virales. Pueden usarse vectores virales que proporcionan la expresión transitoria de moléculas de ácido nucleico.

Por ejemplo, el vector puede contener secuencias que codifican para ambas cadenas de una molécula de iARN de un dúplex, o una única molécula de ácido nucleico que es autocomplementaria y por tanto forma una molécula de iARN. Un vector de expresión puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica para dos o más moléculas de ácido nucleico.

Una molécula de ácido nucleico puede expresarse dentro de células a partir de promotores eucariotas. Los expertos en la técnica constatan que cualquier ácido nucleico puede expresarse en células eucariotas a partir del vector de ADN/ARN apropiado.

En algunos aspectos, puede usarse un constructo viral para introducir un constructo de expresión en el interior de una célula, para la transcripción de un constructo de ARNbc codificado por el constructo de expresión.

Pueden administrarse formulaciones lipídicas a animales mediante inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal, o por vía oral o mediante inhalación u otros métodos tal como se conoce en la técnica.

Se conocen formulaciones farmacéuticamente aceptables para administrar oligonucleótidos y pueden usarse.

En una realización del método anterior, la molécula de ácido nucleico inhibidora se administra a una dosificación de aproximadamente 5 a 500 mg/m2/día, por ejemplo, 5, 25, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 ó 300 mg/m2/día.

En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico inhibidoras de esta invención se administran de manera sistémica en dosificaciones de desde aproximadamente 1 hasta 100 mg/kg, por ejemplo, 1, 5, 10, 20, 25, 50, 75 ó 100 mg/kg.

En realizaciones adicionales, la dosificación puede oscilar desde aproximadamente 25 hasta 500 mg/m2/día.

Se encuentran métodos conocidos en la técnica para preparar formulaciones, por ejemplo, en “Remington: The Science and Practice of Pharmacy” Ed. A. R. Gennaro, Lippincourt Williams & Wilkins, Filadelfia, Pa., 2000.

Las formulaciones para administración parenteral pueden contener, por ejemplo, excipientes, agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal o naftalenos hidrogenados. Puede usarse polímero de lactida biocompatible y biodegradable, copolímero de lactida/glicolida o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno para controlar la liberación de los compuestos. Otros sistemas de suministro parenteral posiblemente útiles para moléculas de ácido nucleico inhibidoras incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. Las formulaciones para su inhalación pueden contener excipientes, por ejemplo, lactosa, o pueden ser disoluciones acuosas que contienen, por ejemplo, lauril éter de polioxietileno 9, glicocolato y desoxicolato, o pueden ser disoluciones aceitosas para su administración en forma de gotas nasales o como gel.

Las formulaciones pueden administrarse a pacientes humanos en cantidades terapéuticamente eficaces (por ejemplo, cantidades que impiden, eliminan o reducen un estado patológico) para proporcionar terapia para una enfermedad o estado neoplásico. La dosificación preferida de un oligómero de nucleótido de la invención puede depender de variables tales como el tipo y grado del trastorno, el estado de salud global del paciente particular, la formulación de los excipientes de compuesto y su vía de administración.

Una composición farmacéutica de esta divulgación puede ser eficaz en el tratamiento de una enfermedad asociada con Hsp47. Los ejemplos de las enfermedades incluyen una enfermedad debida a proliferación celular anómala y una enfermedad que presenta sobreexpresión de Hsp47.

Todos los métodos anteriores para reducir tumores malignos pueden ser o bien un método in vitro o bien un método in vivo. La dosificación puede determinarse mediante una prueba in vitro usando células cultivadas, etc., tal como se conoce en la técnica. Una cantidad eficaz puede ser una cantidad que reduce el tamaño del tumor en al menos el 10%, al menos el 20% o al menos el 30% o al menos el 40% o al menos el 50% o al menos el 60% o al menos el 70% o al menos el 80% o al menos el 90%, hasta el 100% del tamaño del tumor. Una cantidad eficaz puede ser una cantidad que reduce la proliferación de células cancerosas en al menos el 10%, al menos el 20% o al menos el 30% o al menos el 40% o al menos el 50% o al menos el 60% o al menos el 70% o al menos el 80% o al menos el 90% o hasta el 100% en comparación con el control.

Los ejemplos de la enfermedad debida a proliferación celular anómala incluyen tumores malignos, hiperplasia, queloide, síndrome de Cushing, aldosteronismo primario, eritroplasia, policitemia vera, leucoplasia, cicatriz hiperplásica, liquen plano y lentiginosis.

Los ejemplos de la enfermedad debida a sobreexpresión de Hsp47 incluyen tumor maligno.

Los ejemplos de cáncer incluyen sarcomas tales como fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, liposarcoma, rabdomiosarcoma, liomiosarcoma, angiosarcoma, sarcoma de Kaposi, linfangiosarcoma, sarcoma sinovial, condrosarcoma y osteosarcoma, carcinomas tales como tumor de cerebro, carcinoma de cabeza y cuello, carcinoma de mama, carcinoma de pulmón, carcinoma esofágico, carcinoma gástrico, carcinoma duodenal, carcinoma apendicular, carcinoma de colon, carcinoma rectal, carcinoma de hígado, carcinoma pancreático, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma de conductos biliares, carcinoma anal, carcinoma renal, carcinoma de uréter, carcinoma de vejiga, carcinoma de próstata, carcinoma de testículos, carcinoma uterino, carcinoma de ovarios, carcinoma de piel, leucemia y linfoma maligno.

El cáncer incluye neoplasia maligna epitelial y neoplasia maligna no epitelial. Un cáncer puede estar presente en cualquier sitio del organismo, por ejemplo, el cerebro, cabeza y cuello, tórax, extremidades, pulmón, corazón, timo, esófago, estómago, intestino delgado (duodeno, yeyuno, íleo), intestino grueso (colon, ciego, apéndice, recto), hígado, páncreas, vesícula biliar, riñón, conducto urinario, vesícula, próstata, testículos, útero, ovario, piel, músculo estriado, músculo liso, membrana sinovial, cartílago, hueso, tiroides, glándula suprarrenal, peritoneo, mesenterio, médula ósea, sangre, sistema vascular, sistema linfático tal como ganglios linfáticos, líquido linfático, etc.

En otra realización, el cáncer incluye células cancerosas que muestran proliferación independiente de hormonas o de factor del crecimiento. En realizaciones adicionales, un cáncer incluye células cancerosas que muestran sobreexpresión de Hsp47.

Nanopartículas

Realizaciones de esta divulgación pueden proporcionar composiciones de nanopartículas de liposoma. Las moléculas ionizables de esta divulgación pueden usarse para formar composiciones de liposomas, que pueden tener una bicapa de moléculas de tipo lípidos.

Una composición de nanopartículas puede tener una o más de las moléculas ionizables de esta divulgación en una estructura de liposoma, una estructura de bicapa, una micela, una estructura laminar o una mezcla de las mismas.

En algunas realizaciones, una composición puede incluir uno o más componentes de vehículo líquido. Un vehículo líquido adecuado para la administración de agentes activos de esta divulgación puede ser un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable. Un vehículo líquido puede incluir un disolvente orgánico o una combinación de agua y un disolvente orgánico.

Realizaciones de esta divulgación pueden proporcionar nanopartículas lipídicas que tienen un tamaño de desde 10 hasta 1000 nm. En algunas realizaciones, las nanopartículas de liposoma pueden tener un tamaño de desde 10 hasta En determinadas realizaciones, las nanopartículas de liposoma de esta divulgación pueden encapsular la molécula de iARN y conservar al menos el 80% de las moléculas de iARN encapsuladas después de 1 hora de exposición a suero humano.

Composiciones farmacéuticas

Esta divulgación contempla además métodos para distribuir un agente activo a un órgano de un sujeto para tratar tumor maligno administrando al sujeto una composición de esta invención. Los órganos que pueden tratarse incluyen pulmón, hígado, páncreas, colon, corazón, hueso, piel, intestino y articulaciones.

En algunas realizaciones, esta invención proporciona composiciones para su uso en métodos para tratar una enfermedad de cáncer de pulmón o cáncer pancreático administrando al sujeto la composición de esta invención.

En aspectos adicionales, esta invención proporciona una gama de formulaciones farmacéuticas tal como se definen en las reivindicaciones.

Una formulación farmacéutica en el presente documento puede incluir un agente activo, así como un portador de fármaco, o un lípido de esta invención, junto con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En general, los agentes activos de esta descripción incluyen ARNip, agentes activos para tumor maligno, así como cualquier fármaco de molécula pequeña.

Un portador de fármaco puede dirigir una composición para que alcance células estrelladas. Un portador de fármaco puede incluir un fármaco en su interior o estar unido al exterior de una sustancia que contiene fármaco o mezclado con un fármaco siempre que un derivado de retinoide y/o análogo de vitamina A esté incluido en el portador de fármaco, y esté expuesto al menos parcialmente en el exterior de la preparación. La composición o preparación puede estar cubierta con un material apropiado, tal como, por ejemplo, un recubrimiento entérico o un material que se disgrega a lo largo del tiempo, o puede incorporarse en un sistema de liberación de fármaco apropiado.

Una formulación farmacéutica de esta invención puede contener uno o más de cada uno de los siguientes: un agente tensioactivo, un diluyente, un excipiente, un conservante, un estabilizador, un colorante y un agente de suspensión.

Algunos portadores, diluyentes y componentes farmacéuticos para una formulación farmacéutica, así como métodos para formular y administrar los compuestos y las composiciones de esta invención, se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1990).

Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido ascórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico.

Los ejemplos de agentes tensioactivos incluyen alcoholes, ésteres, alcoholes alifáticos sulfatados.

Los ejemplos de excipientes incluyen sacarosa, glucosa, lactosa, almidón, celulosa cristalizada, manitol, silicato anhidro ligero, aluminato de magnesio, metasilicato-aluminato de magnesio, silicato de aluminio sintético, carbonato de calcio, carbonato ácido de sodio, hidrogenofosfato de calcio y carboximetilcelulosa de calcio.

Los ejemplos de agentes de suspensión incluyen aceite de coco, aceite de oliva, aceite de sésamo, aceite de cacahuete, soja, acetato-ftalato de celulosa, copolímero de acetato de metilo-metacrilato y ftalatos de ésteres.

Una formulación terapéutica de esta divulgación para el suministro de una o más moléculas activas para el silenciamiento génico puede administrarse a un mamífero que lo necesita. Una cantidad terapéuticamente eficaz de la formulación y el agente activo, que puede encapsularse en un liposoma, puede administrarse a un mamífero para prevenir o tratar tumor maligno.

La vía de administración puede ser local o sistémica.

Una formulación terapéuticamente eficaz de esta divulgación puede administrarse mediante diversas vías, incluyendo intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea y oral.

Las vías de administración pueden incluir, por ejemplo, administración parenteral, incluyendo inyecciones intramuscular, subcutánea, intravenosa, intramedular, así como inyecciones intratecal, intraventricular directa, intraperitoneal, intranasal o intraocular.

La formulación también puede administrarse en formas de dosificación de liberación sostenida o controlada, incluyendo inyecciones de depósito, bombas osmóticas y similares, para la administración prolongada y/o sincronizada, pulsada, a una tasa predeterminada.

La composición de la presente invención puede administrarse mediante diversas vías incluyendo vías tanto oral como parenteral, y ejemplos de las mismas incluyen, pero no se limitan a, vías oral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, local, intrapulmonar, al interior de las vías respiratorias, intratraqueal, intrabronquial, nasal, rectal, intraarterial, intraportal, intraventricular, intramedular, al interior de los ganglios linfáticos, intralinfática, intracerebral, intratecal, intracerebroventricular, transmucosa, percutánea, intranasal, intraperitoneal e intrauterina, y puede formularse para dar una forma de dosificación adecuada para cada vía de administración. Una forma de dosificación y método de formulación de este tipo pueden seleccionarse según sea apropiado de cualquier forma de dosificación y método conocidos. Véase, por ejemplo, Hyojun Yakuzaigaku, Standard Pharmaceutics, Ed. de Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003.

Los ejemplos de formas de dosificación adecuadas para administración oral incluyen, pero no se limitan a, polvo, gránulo, comprimido, cápsula, líquido, suspensión, emulsión, gel y jarabe, y los ejemplos de la forma de dosificación adecuados para administración parenteral incluyen inyecciones tales como una disolución inyectable, una suspensión inyectable, una emulsión inyectable y una inyección lista para usar. Las formulaciones para administración parenteral pueden ser una forma tal como una disolución o suspensión estéril, isotónica, acuosa o no acuosa.

Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua, incluyen disoluciones acuosas de la formulación activa en forma soluble en agua. Las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones para inyección aceitosas apropiadas. Las suspensiones para inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas.

Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de múltiples dosis, con un conservante añadido. Las formulaciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.

Además de las preparaciones descritas anteriormente, las formulaciones también pueden formularse como preparación de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, la formulación puede formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados, por ejemplo como emulsión en un aceite aceptable, o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como sal escasamente soluble.

Las composiciones y formulaciones de esta invención y divulgación también pueden formularse para su administración tópica y pueden aplicarse a la piel del sujeto usando cualquier procedimiento adecuado para la aplicación de un vehículo de administración tópica. Por ejemplo, la formulación puede aplicarse manualmente, usando un aplicador, o mediante un procedimiento que implica ambos. Tras la aplicación, puede hacerse que la formulación entre en la piel del sujeto, por ejemplo, frotando. La aplicación puede realizarse múltiples veces al día o una vez al día. Por ejemplo, la formulación puede aplicarse a la piel de un sujeto una vez al día, dos veces al día o múltiples veces al día, o puede aplicarse una vez cada dos días, una vez cada tres días o aproximadamente una vez por semana, una vez cada dos semanas o una vez cada varias semanas.

Las formulaciones o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden administrarse al sujeto mediante cualquier medio adecuado. Los ejemplos de métodos de administración incluyen, entre otros, (a) administración mediante inyección, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraorbital, intracapsular, intraespinal, intraesternal o similares, incluyendo administración mediante bomba de infusión; (b) administración de manera local tal como mediante inyección directamente en la zona renal o cardíaca, por ejemplo, mediante implantación de depósito; así como según consideren apropiado los expertos en la técnica para poner el compuesto activo en contacto con tejido vivo.

La formulación exacta, vía de administración y dosificación para las composiciones farmacéuticas pueden elegirse por el médico individual a la vista del estado del paciente. Véase, por ejemplo, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12a ed., sec. 1, 20l1. Normalmente, el intervalo de dosis de la composición administrada al paciente puede ser de desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 1000 mg/kg del peso corporal del paciente. La dosificación puede ser una única o una serie de dos o más administradas en el transcurso de uno o más días, según lo necesite el paciente. En casos en los que se han establecido dosificaciones para humanos para compuestos para al menos algún estado, las dosificaciones serán aproximadamente las mismas, o dosificaciones que son de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 500%, más preferiblemente de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 250% de la dosificación para humanos establecida. Cuando no se ha establecido ninguna dosificación para humanos, tal como será el caso para composiciones farmacéuticas recién descubiertas, puede deducirse una dosificación para humanos adecuada a partir de valores de DE50 o DI50, u otros valores apropiados derivados a partir de estudios in vitro o in vivo, según se cualifique mediante estudios de toxicidad y estudios de eficacia en animales.

Métodos para prevenir o tratar tumor maligno

La presente divulgación se refiere además a un método para controlar la actividad o el crecimiento de tumores malignos, incluyendo el método administrar una cantidad eficaz de la composición a un sujeto que lo necesita. La cantidad eficaz a la que se hace referencia en este caso, en un método para tratar tumor maligno, alivia sus síntomas o retrasa o detiene su progresión, y es preferiblemente una cantidad que previene la aparición o recidiva del tumor maligno, o lo cura. También es preferiblemente una cantidad que no provoca un efecto adverso que supera el beneficio de la administración. Una cantidad de este tipo puede determinarse según sea apropiado mediante una prueba in vitro usando células cultivadas o mediante una prueba en un animal o mamífero de modelo tal como un ratón, una rata, un perro o un cerdo, y tales métodos de prueba los conoce bien un experto en la técnica. Además, la dosis de los agentes activos en el portador y la dosis de los agentes activos usados en el método de la presente divulgación las conoce un experto en la técnica, o pueden determinarse según sea apropiado mediante las pruebas anteriormente mencionadas.

La frecuencia de administración depende de las propiedades de la composición usada y los estados anteriormente mencionados del sujeto, y puede ser una pluralidad de veces al día (es decir, 2, 3, 4, 5 o más veces al día), una vez al día, cada pocos días (es decir, cada 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días, etc.), unas pocas veces por semana (por ejemplo 2, 3, 4 veces, etc., por semana), cada dos semanas o cada pocas semanas (es decir, cada 2, 3, 4 semanas, etc.).

En algunas realizaciones, la presente divulgación también se refiere a un método para suministrar un fármaco a una célula de tumor maligno, usando el portador anterior. Este método incluye una etapa de administrar o añadir el portador que tiene la sustancia que va a suministrarse soportada sobre el mismo a un ser vivo o un medio, por ejemplo un medio de cultivo, que contiene una célula productora de matriz extracelular en el pulmón. Estas etapas pueden lograrse según sea apropiado según cualquier método conocido o un método descrito en esta invención. Además, el método anterior incluye un modo llevado a cabo in vitro y un modo en el que se selecciona como diana una célula de tumor maligno en el pulmón dentro del organismo.

Una formulación terapéuticamente eficaz de esta divulgación puede administrarse mediante administración sistémica que puede proporcionar una amplia biodistribución del agente activo.

Realizaciones de esta divulgación pueden proporcionar una formulación terapéutica, que incluye una molécula terapéutica de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

Una dosis eficaz de una formulación de esta invención puede administrarse desde 1 hasta 12 veces al día o una vez por semana. La duración de administración puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días o puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 ó 12 semanas.

Ejemplos

Ejemplo 1: se realizó un estudio in vivo para someter a prueba la inhibición del crecimiento tumoral con HSP47 como diana única. Se eligió un modelo de cáncer pancreático derivado de PANC-1 debido a su enriquecimiento de proteínas de colágeno, tal como se muestra en la tabla 5.

Tabla 5: estudio in vivo para someter a prueba la inhibición del crecimiento tumoral con HSP47 como diana única

Métodos de estudio:

Se inocularon células PANC-1 en el costado derecho de ratones desnudos atímicos hembra por vía subcutánea.

Se midió el tamaño del tumor y se calculó usando la fórmula: Volumen de tumor = longitud x anchura2/2. Cuando los tumores establecidos alcanzaron aproximadamente 200 mm3, se aleatorizaron los ratones y se asignaron a inyección de artículo de prueba.

Se inyectó una formulación que contenía ARNip de HSP47 (2 M) en el animal por vía intravenosa a 0,75 mg/kg, q1w y en total 4 dosis.

Se monitorizaron el peso corporal de los animales y los volúmenes de tumor dos veces por semana.

Resultados y conclusión: los tumores crecieron lentamente en este modelo de PANC-1, siendo el tiempo de duplicación de 22 días para el grupo de vehículo. No se examinó ninguna pérdida de peso corporal. Se observó que la formulación, que se basó en el compuesto 81 y contenía el ARNip de HSP47 (2 M), suprimía completamente el crecimiento tumoral a dosificaciones de 0,75 mpk. En conjunto, la supresión de Hsp47 inhibió el crecimiento tumoral, mostrando que la formulación era un potente producto terapéutico anticanceroso.

Resultados y conclusión: la figura 1 muestra los resultados de un estudio in vivo de un modelo de cáncer pancreático que se realizó para someter a prueba la inhibición del crecimiento tumoral usando Hsp47 como diana única. Tal como se muestra en la figura 1, para el grupo tratado con una formulación que contenía ARNip de Hsp47 (2 M), los volúmenes de tumor crecieron lentamente, si es que crecieron en absoluto, durante el transcurso del estudio. No se examinó ninguna pérdida de peso corporal. Por el contrario, los volúmenes de tumor del grupo de control de vehículo se duplicaron en tan sólo 22 días. En conclusión, se observó que el ARNip de Hsp47 suprimía completamente el crecimiento tumoral a dosificaciones de 0,75 mpk, mostrando que la formulación que contenía el ARNip de Hsp47 era un potente producto terapéutico anticanceroso.

Ejemplo 2: las expresiones génicas de Hsp47, colágeno I y colágeno IV en líneas celulares de cáncer humanas A549, MCF7, MDA-MB-231, HCT116, M7609, COLO230HSR, SW480, PANC-1, SW1990, MIA-PaCa-2, HepG2, HT1080 y HaLa se muestran en la figura 2. Las expresiones son pronunciadas en SW480 y HepG2.

Ejemplo 3: en las figuras 3-11 se muestran resultados de un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47.

La figura 3 muestra una muestra sin tratar para un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 4 muestra el efecto de un ARNip negativo a 10 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 5 muestra el efecto de un ARNip negativo a 50 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 6 muestra el efecto de un ARNip negativo a 100 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 7 muestra el efecto de un ARNip activo a 10 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 8 muestra el efecto de un ARNip activo a 50 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 9 muestra el efecto de un ARNip activo a 100 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47.

La comparación de las figuras 4 y 7, 5 y 8, y 6 y 9 muestra que el ARNip activo dirigido a Hsp47 suprime células de cáncer de colon SW480.

La figura 10 muestra los resultados de un ensayo de crecimiento en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47. El eje vertical es el número de células x 104. Los círculos negros son la muestra sin tratar. Las marcas X son el ARNip negativo. Las marcas de triángulos representan la muestra tratada con un ARNip activo dirigido a Hsp47.

La figura 11 muestra los resultados de un ensayo de exclusión de colorante en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47. El eje vertical es el porcentaje de células muertas. Los círculos blancos son la muestra tratada con un ARNip activo dirigido a Hsp47. Las marcas X son el ARNip negativo. Las marcas de círculos negros representan la muestra sin tratar.

Ejemplo 4: en las figuras 12-16 se muestran resultados de un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon HCT116 con un ARNip dirigido a Hsp47.

La figura 12 muestra una muestra sin tratar en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon HCT116 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 13 muestra el efecto de un ARNip negativo a 10 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon HCT116 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 14 muestra el efecto de un ARNip activo a 10 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon HCT116 con un ARNip dirigido a Hsp47. La comparación de las figuras 12, 13 y 14 muestra que el ARNip activo dirigido a Hsp47 suprime las células de cáncer de colon HCT116.

La figura 15 muestra los resultados de un ensayo de crecimiento en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon HCT116 con un ARNip dirigido a Hsp47. El eje vertical es el número de células x 104. Los círculos negros son la muestra sin tratar. Las marcas de círculos blancos en la curva ascendente son el ARNip negativo. Las marcas de círculos blancos en la curva plana representan la muestra tratada con un ARNip activo dirigido a Hsp47.

La figura 16 muestra los resultados de un ensayo de exclusión de colorante en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon HCT116 con un ARNip dirigido a Hsp47. El eje vertical es el porcentaje de células muertas. Los círculos blancos en la curva ascendente son la muestra tratada con un ARNip activo dirigido a Hsp47. Las marcas de círculos blancos en la curva plana son el ARNip negativo. Las marcas de círculos negros representan la muestra sin tratar.

Ejemplo 5: en las figuras 17-25 se muestran resultados de un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47.

La figura 17 muestra una muestra sin tratar en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 18 muestra el efecto de un ARNip negativo a 10 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 19 muestra el efecto de un ARNip negativo a 50 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 20 muestra el efecto de un ARNip negativo a 100 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 21 muestra el efecto de un ARNip activo a 10 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 22 muestra el efecto de un ARNip activo a 50 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 23 muestra el efecto de un ARNip activo a 100 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de colon SW480 con un ARNip dirigido a Hsp47.

La comparación de las figuras 18 y 21, 19 y 22, y 20 y 23 muestra que el ARNip activo dirigido a Hsp47 suprime las células de cáncer de pulmón A549.

La figura 24 muestra los resultados de un ensayo de crecimiento en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47. El eje vertical es el número de células x 104 Los círculos negros son la muestra sin tratar. Las marcas de círculos blancos son el ARNip negativo. Las marcas de triángulos representan la muestra tratada con un ARNip activo dirigido a Hsp47.

La figura 25 muestra los resultados de un ensayo de exclusión de colorante en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47. El eje vertical es el porcentaje de células muertas. Los círculos blancos son la muestra tratada con un ARNip activo dirigido a Hsp47. Las marcas X son el ARNip negativo. Las marcas de círculos negros representan la muestra sin tratar.

Ejemplo 6: en las figuras 26-34 se muestran resultados de un método para suprimir la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 con un ARNip dirigido a Hsp47.

La figura 26 muestra una muestra sin tratar en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 27 muestra el efecto de un ARNip negativo a 10 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 28 muestra el efecto de un ARNip negativo a 50 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 29 muestra el efecto de un ARNip negativo a 100 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 30 muestra el efecto de un ARNip activo a 10 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 31 muestra el efecto de un ARNip activo a 50 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47. La figura 32 muestra el efecto de un ARNip activo a 100 nM en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47.

La comparación de las figuras 27 y 30, 28 y 31, y 29 y 32 muestra que el ARNip activo dirigido a Hsp47 suprime las células de cáncer hepático HepG2.

La figura 33 muestra los resultados de un ensayo de crecimiento en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47. El eje vertical es el número de células x 104. Los círculos negros son la muestra sin tratar. Las marcas de círculos blancos son el ARNip negativo. Las marcas X representan la muestra tratada con un ARNip activo dirigido a Hsp47.

La figura 34 muestra los resultados de un ensayo de exclusión de colorante en un método para suprimir la proliferación de células de cáncer hepático HepG2 con un ARNip dirigido a Hsp47. El eje vertical es el porcentaje de células muertas. Los círculos blancos son la muestra tratada con un ARNip activo dirigido a Hsp47. Las marcas X son el ARNip negativo. Las marcas de cuadrados blancos representan la muestra sin tratar.

Ejemplo 7: en las figuras 35-36 se muestran resultados de un método para detectar anexina V y PI en células de cáncer de colon (SW480, HCT116) transfectadas con un ARNip de Hsp47.

La figura 35 muestra los resultados de un método para detectar anexina V y PI en células de cáncer de colon SW480 transfectadas con un ARNip activo de Hsp47 en el día 2 tras la transfección del ARNip. La figura 36 muestra los resultados de un método para detectar anexina V y PI en células de cáncer de colon HCT116 transfectadas con un ARNip activo de Hsp47 en el día 2 tras la transfección del ARNip.

Ejemplo 8: en las figuras 37-39 se muestran resultados de un método para detectar la expresión de procaspasa 3 y proteína de Hsp47 en células cancerosas transfectadas con un ARNip de Hsp47.

La figura 37 muestra los resultados de un método para detectar la expresión de procaspasa 3 y proteína de Hsp47 en células de cáncer de colon SW480 transfectadas con un ARNip activo de Hsp47. La figura 38 muestra los resultados de un método para detectar la expresión de procaspasa 3 y proteína de Hsp47 en células de cáncer hepático HepG2 transfectadas con un ARNip activo de Hsp47. La figura 39 muestra los resultados de un método para detectar la expresión de procaspasa 3 y proteína de Hsp47 en células de cáncer de pulmón A549 transfectadas con un ARNip activo de Hsp47.

Ejemplo 9: en la figura 40 se muestran resultados de un método para detectar actividad caspasa 3/7 en células de cáncer de colon (SW480) transfectadas con un ARNip de Hsp47 y un ARNip de p21. Estos datos muestran que el uso de una combinación de un ARNip de Hsp47 y un ARNip de p21 en células de cáncer de colon proporcionó aumentos inesperadamente ventajosos en los niveles de caspasas. Los aumentos sorprendentes en el nivel de caspasas en células cancerosas muestra que las células tienen apoptosis sorprendentemente aumentada.

Ejemplo 10: se realizó la transfección in vitro en una línea de células A549 para determinar la eficacia de silenciamiento de ARNip. Usando una formulación de esta invención que contenía moléculas de iARN, que están dirigidas a Hsp47, se observa un silenciamiento dependiente de la dosis para ARNm de Hsp47.

Protocolo para el silenciamiento in vitro: un día antes de la transfección, se siembran las células en una placa de 96 pocillos a 2 x 103 células por pocillo con 100 |il de DMEM (HyClone, # de cat. SH30243.01) que contienen FBS al 10% y se cultivan en una incubadora a 37°C que contiene una atmósfera humidificada de CO2 al 5% en aire. Antes de la transfección, se cambia el medio a 90 |il de medio de suero reducido Opti-MEM I (Life Technologies, # de cat. 31985 070) que contiene FBS al 2%. Se mezclan 0,2 |il de Lipofectamine RNAiMax (Life Technologies, # de cat. 13778-100) con 4,8 |il de Opti-MEM I durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se mezcla 1 |il de ARNip con 4 |il de Opti-MEM I y se combinan con la disolución de LF2000 y después se mezcla suavemente, sin vórtex. Se espera durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se incuba la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir que se formen los complejos de ARN-RNAiMax. Se añaden los 10 |il de complejos de ARN-RNAiMax a un pocillo y se agita suavemente la placa de manera manual. Se incuban las células en una incubadora a 37°C que contiene una atmósfera humidificada de CO2 al 5% en aire durante 2 horas. Se cambia el medio a medio de suero reducido MEM I nuevo (Life Technologies, # de cat. 31985-070) que contiene FBS al 2%. 24 horas después de la transfección, se lavan las células una vez con PBS helada. Se someten las células a lisis con 50 |il de tampón de lisis Cell-to-Ct (Life Technologies, # de cat. 4391851 C) durante 5-30 minutos a temperatura ambiente. Se añaden 5 |il de disolución de parada y se incuban durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se mide inmediatamente el nivel de ARNm mediante RT-qPCR con TAQMAN. Alternativamente, pueden congelarse las muestras a -80°C y someterse a ensayo en un momento posterior.

Ejemplo 11: eficacia de inhibición tumoral para ARNip de Hsp47. Se usa un modelo de xenoinjerto de cáncer pancreático con una dosis relativamente baja a 0,75 mg/kg de ARNip dirigido a Hsp47. Los ARNip combinados demuestran una eficacia de inhibición tumoral significativa e inesperadamente ventajosa en el día 28.

En este experimento, se obtienen líneas de células A549 y PANC-1 a partir de ATCC. Se mezcla bien la suspensión de células con BD Matrigel en hielo descongelado a una razón de 1:1 para su inyección. A cada ratón, ratones hembra desnudos atímicos, de 6 a 8 semanas, Charles River, se le inoculan por vía subcutánea en el costado derecho 0,1 ml de un inóculo de 2 x 106 células (A549) o 2,5 x 106 células (PANC-1) usando una jeringa y aguja 25 G (1 inóculo por ratón). Se anestesia a los ratones para la inoculación. En el día en el que los tumores establecidos alcanzan aproximadamente 250 - 350 mm3 (A549) o 150 - 250 mm3 (PANC-1) se someten los animales a inyección en bolo a través de la vena de la cola. Se sacrifican los animales mediante sobredosis de CO2 y se disecan los tumores en diferentes puntos de tiempo tras la dosificación. En primer lugar se pesan los tumores en húmedo y después se separan en tres partes para la medición del silenciamiento de Hsp47, biodistribución de ARNip y análisis de biomarcadores. Se ultracongelan las muestras en nitrógeno líquido y se almacenan a -80°C hasta que están listas para procesarse para el bioanálisis.

Ejemplo 12: evaluación de la eficacia de ARNip encapsulado en una formulación liposomal en un modelo de ratón de cáncer de pulmón A549 ortotópico.

Animales de experimentación: se usa un total de sesenta ratones nu/nu NCr macho, de 5-6 semanas de edad, en el estudio. Los animales de experimentación se reproducen y se crían en AntiCancer Inc. Se mantienen en un entorno con filtrado HEPA durante el periodo de experimentación. Las jaulas, la alimentación y los lechos se esterilizan en autoclave. Las dietas de los animales se obtienen de Harlan Teklad (Madison, WI).

Preparación de formulación liposomal: las formulaciones se preparan y se almacenan a 4°C. Se calientan hasta temperatura ambiente 10 minutos antes de inyectar a los ratones.

Modelo ortotópico de cáncer de pulmón humano A549 (SOI): en el día de SOI, se extirpan los tumores originales a partir del sitio subcutáneo de animales que portan xenoinjerto de tumor A549 y se colocan en medio RPMI-1640. Se retiran los tejidos necróticos y se cortan los tejidos viables en fragmentos de 1,5-2 mm3 Se anestesia a los animales con inhalación de isoflurano y se esteriliza la zona quirúrgica con yodo y alcohol. Se realiza una incisión transversal de aproximadamente 1,5 cm de longitud en la parte izquierda de la pared torácica del ratón usando un par de tijeras quirúrgicas. Se realiza una incisión intercostal entre la tercera y la cuarta costilla y se expone el pulmón izquierdo. Se trasplanta un fragmento de tumor A549 a la superficie del pulmón con una sutura quirúrgica 8-0 (nailon). Se cierra la pared torácica con una sutura quirúrgica 6-0 (seda). Vuelve a inflarse el pulmón mediante punción intratorácica usando una jeringa de 3 cc con una aguja 25 G X 1 A para extraer el aire restante en la cavidad torácica. Se cierra la pared torácica con una sutura de seda quirúrgica 6-0. Todos los procedimientos de la intervención descrita anteriormente se realizan con un microscopio de aumento 7 x (Olympus) bajo campanas de flujo laminar con filtración HEPA.

Tres días después de la implantación del tumor, se dividen aleatoriamente los ratones que portan tumor en grupos con diez ratones por grupo. Se inician los tratamientos para cada grupo de ratones tres días después de la implantación del tumor.

Criterio de valoración: se sacrifican los ratones de experimentación cuarenta y dos días después del inicio del tratamiento. Se escinden los tumores primarios y se pesan sobre una balanza electrónica para su análisis posterior.

Se evalúa la eficacia antitumoral de formulaciones contra cáncer de pulmón humano A549 comparando los pesos de tumor primario finales medidos en la autopsia entre cada uno de los grupos de tratamiento y el grupo de control de vehículo. Se mide el peso de tumor promedio en cada grupo.

Estimación de la toxicidad del compuesto: el peso corporal medio de los ratones en los grupos tratado y de control se mantiene dentro del intervalo normal durante todo el periodo del experimento. Tampoco se detectan otros síntomas de toxicidad mediante observación macroscópica de los ratones.

Conclusión: comparando los pesos de tumor finales que se obtienen al final del experimento, se concluye que el tratamiento con la formulación que contiene el ARNip de Hsp47 a 2 mg/kg en los grupos de tratamiento reduce de manera significativa y sorprendente el crecimiento tumoral y el volumen de tumor del cáncer de pulmón humano A549 en comparación con los controles. No se observa toxicidad.

Ejemplo 13: efecto de ARN de interferencia pequeño (ARNip) dirigido a Hsp47 sobre el crecimiento de células A549 en ratones desnudos y angiogénesis en un ensayo de membrana corioalantoidea (CAM). Se construyen tres pares de plásmido de ARNip de Hsp47 y plásmido no de silenciamiento y se transfectan al interior de células A549 mediante LIPOFECTAMINE 2000, respectivamente. Se selecciona el par más eficaz de plásmido de ARNip de Hsp47 mediante ELISA y RT-PCR en tiempo real. Se transfectan células A549 con el plásmido de ARNip de Hsp47 seleccionado, se transfectan células A549 con plásmido no de silenciamiento y se inoculan células A549 sin transfección en ratones desnudos, respectivamente. Se dividen aleatoriamente embriones de pollo en cuatro grupos y se trata la CAM mediante diferentes disoluciones durante 48 h: medios de cultivo DMEM como grupo de control negativo, sobrenadantes de cultivo de células A549 sin transfectar como grupo de control positivo, sobrenadantes de cultivo de células A549 con ARNip de Hsp47 como grupo de ARNip de Hsp47 y sobrenadantes de cultivo de células A549 con ARNip no de silenciamiento como grupo de ARNip no de silenciamiento. Se recogieron las CAM en el día 12 para ensayos microscópicos.

En comparación con el grupo de control, el plásmido de ARNip de Hsp47 induce la reducción de la secreción de Hsp47 mediante células A549 acompañada por la reducción de ARNm de Hsp47. En comparación con el grupo de ARNip no de silenciamiento, se reduce el volumen de tumor medio de xenoinjerto murino en el grupo de ARNip de Hsp47; se presenta el tiempo para que los xenoinjertos crezcan hasta 50 mm3. Se reduce el contenido de Hsp47 en el xenoinjerto. En ensayos de CAM, el contenido de Hsp47 es nulo en el grupo negativo, y en el grupo de ARNip de Hsp47 se reduce en un 20-70% en comparación con el grupo de ARNip no de silenciamiento o el grupo positivo; los puntos de ramificación de vasos de CAM en el grupo de ARNip de Hsp47 o el grupo de ARNip no de silenciamiento o grupo positivo se aumentan en comparación con el grupo negativo; la longitud de vasos total de CAM en el grupo de ARNip de Hsp47 se aumenta en comparación con el grupo negativo, mientras que en el grupo de ARNip no de silenciamiento o el grupo positivo se aumenta. En comparación con el grupo de control negativo, se aumenta la proliferación de microvasos cuando se añade el sobrenadante de cultivo celular con Hsp47 en el grupo de ARNip de Hsp47, se observan vasos proliferados significativos en el grupo de ARNip no de silenciamiento o el grupo positivo.

Ejemplo 14: cultivo celular. Se cultiva la línea celular de carcinoma de pulmón de células no pequeñas humana, A549, en medio F-12K (ATCC) complementado con FBS Al 10% (FBS, Invitrogen) a 37°C en una atmósfera humidificada con CO2 al 5%. Las células que expresan de manera estable ARNip de control, o de Hsp47, se generan transduciendo células A549TR con las partículas de transducción lentivirales respectivas según las instrucciones del fabricante (Sigma-Aldrich). Se seleccionan clones resistentes en puromicina 2,5 |ig/ml (Invivogen) durante 12 d, se aíslan usando cilindros de clonación y posteriormente se expanden y se mantienen en medio que contiene puromicina.

Ejemplo 15: los ARNip dirigidos a Hsp47 dan como resultado una profunda regresión del volumen de tumor in vivo.

Se usa una formulación lipídica para encapsular y suministrar ARNip en nanopartículas a xenoinjertos de células de cáncer de pulmón humanas A549 en ratones scid. Se someten los xenoinjertos a prueba para identificar la presencia de mutaciones de KRAS o niveles de expresión aberrantes en comparación con células normales. Cuando se establecen los tumores (>100 mm3), se tratan los ratones o bien con ARNip dirigido a Hsp47 o bien con ARNip de control (no específico) cada 2 días durante 2 semanas. Se detiene el ensayo cuando tiene que sacrificarse el grupo de control.

Resultados: el tratamiento con ARNip dirigido a Hsp47 previene la expansión tumoral y da como resultado una drástica reducción del volumen de tumor.

Se cortan los tumores que se recuperan en secciones y se visualizan mediante tinción con TUNEL. Los tumores tratados con ARNip dirigido a Hsp47 presentan niveles significativamente superiores de apoptosis. Se extrae ARN a partir de los tumores y se realiza PCR en tiempo real para examinar el silenciamiento específico de Hsp47.

Resultados: el tratamiento con ARNip dirigido a Hsp47 reduce drásticamente la expresión de Hsp47 in vivo.

Ejemplo 16: se encontró que los ARNip de esta divulgación dirigidos a p21 eran activos para el silenciamiento génico in vitro. Se encontró que las actividades dependientes de la dosis de los ARNip de p21 para el silenciamiento génico mostraban una CI50 por debajo de aproximadamente 3 picomolar (pM) y de hasta tan sólo 1 pM.

Se realizó la transfección in vitro en una línea de células A549 para determinar la eficacia de silenciamiento de ARNip. Se observó silenciamiento dependiente de la dosis para ARNm de p21 con los ARNip de la tabla 1, tal como se muestra en la tabla 6.

Tabla 6: silenciamiento dependiente de la dosis para ARNm de p21 en una línea de células A549

Tal como se muestra en la tabla 6, las actividades de los ARNip de p21 de la tabla 1 estaban en el intervalo de 0,3 10 pM, lo cual es adecuado para muchos usos, incluyendo como agente de fármaco que va a usarse in vivo.

Ejemplo 17: la estructura de los ARNip de p21 de esta divulgación que tienen desoxinucleótidos ubicados en la región semilla de la cadena antisentido del ARNip proporcionó de manera inesperada y ventajosa una actividad de silenciamiento génico aumentada.

Se realizó la transfección in vitro en una línea de células A549 para determinar la eficacia de silenciamiento para los ARNip de p21 basados en la estructura 1735' (SEQ ID NO: 57 y 71). Se observó silenciamiento dependiente de la dosis de ARNm de p21 con los ARNip de p21 basados en la estructura 1735' tal como se muestra en la tabla 7.

Tabla 7: silenciamiento dependiente de la dosis de ARNm de p21 en una línea de células A549 para los ARNip de p21 basados en la estructura 1735'

Tal como se muestra en la tabla 7, las actividades de los ARNip de p21 basados en la estructura 1735' que tienen tres desoxinucleótidos en la región semilla de la cadena antisentido se aumentaron de manera sorprendente e inesperada en hasta 300 veces, en comparación con un ARNip de p21 sin desoxinucleótidos en la región de dúplex.

Estos datos muestran que los ARNip de p21 que tienen una estructura con desoxinucleótidos en la región semilla de la cadena antisentido proporcionaron actividad de silenciamiento génico sorprendentemente aumentada en comparación con un ARNip de p21 sin desoxinucleótidos en la región de dúplex.

Las actividades mostradas en la tabla 7 para los ARNip de p21 que tienen tres desoxinucleótidos en la región semilla de la cadena antisentido estaban en el intervalo de 0,001 a 0,1 pM, lo cual es excepcionalmente adecuado para muchos usos, incluyendo como agente de fármaco que va a usarse in vivo.

Las realizaciones descritas en el presente documento no son limitativas y un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que pueden someterse a prueba combinaciones específicas de las modificaciones descritas en el presente documento sin experimentación excesiva dirigidas a la identificación de moléculas de ácido nucleico con actividad de iARN mejorada.

Se entiende que esta invención no se limita a la metodología, protocolos, materiales y reactivos particulares descritos, dado que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es únicamente con el propósito de describir realizaciones particulares y no se pretende que limite el alcance de la presente divulgación. Resultará fácilmente evidente para un experto en la técnica que pueden realizarse diversas sustituciones y modificaciones en la descripción divulgada en el presente documento.

Debe observarse que, tal como se usan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “una” y “el/la” incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Igualmente, los términos “un” (o “una”), “uno o más” y “al menos uno” pueden usarse de manera intercambiable en el presente documento. También debe observarse que los términos “comprende”, “que comprende”, “que contiene”, “que incluye” y “que tiene” pueden usarse de manera intercambiable y se interpretarán de manera expansiva y sin limitación.

Se pretende que la mención de intervalos de valores en el presente documento simplemente sirva como método abreviado de hacer referencia de manera individual a cada valor independiente que se encuentra dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor independiente está incorporado en la memoria descriptiva como si se mencionara de manera individual en el presente documento. Para los grupos de Markush, los expertos en la técnica reconocerán que esta descripción incluye los miembros individuales, así como subgrupos de los miembros del grupo de Markush.

Sin explicaciones adicionales, se cree que un experto en la técnica, basándose en la descripción anterior, puede usar la presente invención en todo su alcance. Por tanto, las siguientes realizaciones específicas deben interpretarse como meramente ilustrativas y no limitativas del resto de la divulgación de ninguna manera.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento de cáncer de pulmón o cáncer pancreático, comprendiendo la composición nanopartículas que encapsulan moléculas de iARN, en la que las moléculas de iARN están dirigidas a Hsp47.
2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 para el uso según la reivindicación 1, en la que:

I) la composición conserva al menos el 80% de la actividad de las moléculas de iARN encapsuladas después de 1 hora de exposición a suero humano;

II) las moléculas de iARN para tratar dicho cáncer son ARNip o ARNhc; o

III) la molécula de iARN comprende una región de dúplex, en la que la región de dúplex comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a una secuencia diana de ARNm de Hsp47.
3. Composición para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas de cáncer de pulmón o cáncer pancreático en un mamífero que lo necesita, comprendiendo el método administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición que comprende moléculas de iARN activas en la reducción de la expresión de Hsp47.
4. Composición según la reivindicación 3 para el uso según la reivindicación 3, en la que:

I) el mamífero es un humano, la Hsp47 es una Hsp47 humana;

II) dicho cáncer sobreexpresa Hsp47; o

III) las moléculas de iARN disminuyen la expresión de Hsp47 en el mamífero.
5. Composición según la reivindicación 3 para el uso según la reivindicación 3, en la que, en el método, la administración:

I) disminuye la expresión de Hsp47 en el mamífero en al menos el 5% durante al menos 5 días;

II) disminuye el volumen de dicho cáncer en el mamífero en al menos el 5%, o al menos el 10%, o al menos el 20%, o al menos el 30%, o al menos el 40%, o al menos el 50%;

III) reduce el crecimiento de dichas células cancerosas en el sujeto; o

IV) reduce el crecimiento para al menos el 2%, o al menos el 5%, o al menos el 10%, o al menos el 15%, o al menos el 20% de dichas células cancerosas en el sujeto.
6. Composición según la reivindicación 3 para el uso según la reivindicación 3, en la que el método reduce uno o más síntomas de dicho cáncer, o retrasa o termina la progresión de dicho cáncer.
7. Composición según la reivindicación 3 para el uso según la reivindicación 3, en la que las células cancerosas sobreexpresan proteína o ARN de Hsp47 de tipo natural.
8. Composición según la reivindicación 3 para el uso según la reivindicación 3, en la que:

I) dicho cáncer es un sarcoma seleccionado del grupo que consiste en adenocarcinoma de pulmón y carcinoma ductal del páncreas; o

II) dicho cáncer está ubicado en una región anatómica seleccionada del grupo de pulmón y páncreas, y cualquier combinación de los mismos.
9. Composición según la reivindicación 3 para el uso según la reivindicación 3, en la que, en el método, la administración:

I) se realiza desde 1 hasta 12 veces al día;

II) se realiza durante una duración de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días;

III) se realiza durante una duración de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 ó 12 semanas;

IV) es una dosis de desde 0,01 hasta 2 mg/kg de las moléculas de iARN al menos una vez al día durante un periodo de hasta doce semanas;

V) proporciona una AUC(O-última) media de desde 1 hasta 1000 ug*min/ml y una Cmáx media de desde 0,1 hasta 50 ug/ml para la molécula de iARN de Hsp47;

VI) es inyección intravenosa, inyección intradérmica, inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, oral, tópica, infusión o inhalación.
10. Composición para su uso en un método de tratamiento de cáncer de pulmón o cáncer pancreático en un sujeto, en la que la composición comprende nanopartículas de liposoma que encapsulan moléculas de iARN dirigidas a Hsp47.
11. Composición según la reivindicación 10 para el uso según la reivindicación 10, en la que dicho cáncer está ubicado en el pulmón o el páncreas.
12. Composición según la reivindicación 10 para el uso según la reivindicación 10, en la que la composición comprende nanopartículas de liposoma que tienen un tamaño de desde 10 hasta 1000 nm.
13. Composición según la reivindicación 10 para el uso según la reivindicación 10, en la que la composición comprende nanopartículas de liposoma que tienen un tamaño de desde 10 hasta 150 nm, preferiblemente, en la que las nanopartículas de liposoma conservan al menos el 80% de las moléculas de iARN encapsuladas después de 1 hora de exposición a suero humano.